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IMUNOLOGIA

Margherita Anna Barracco

barracco@mbox1.ufsc.br

Laboratório de Imunologia Aplicada a Aquicultura, Departamento de Biologia Celular,

Embriologia e Genética (BEG), Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC).

Patrícia Mirella da Silva

Université de Bretagne Occidentale; Institut Universitaire Européen de la Mer, LEMAR-

Laboratoire des Sciences de l'Environnement Marin (UMR 6539), Brest – França.

Título curto: Hemolinfa e sistema imune de Perna perna

Palavras –chave: sistema imune; hemolinfa; hemócitos; parâmetros hemato-imunológicos;

reações imune celulares; reações imune humorais; moluscos; bivalves; Perna perna.

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1. INTRODUÇÃO

Assim como outros invertebrados, o mexilhão Perna perna apresenta um sistema

imune inato e natural, diferentemente dos vertebrados que além deste, possuem ainda um

sistema imune adaptativo altamente específico e com memória imunológica. Este último

envolve a produção de uma infinidade de anticorpos e receptores celulares específicos,

capazes de reconhecer uma surpreendente variedade de antígenos (epítopos) e desencadear

respostas de defesa altamente complexas e eficientes. Por outro lado, a produção de células de

memória durante uma infecção primária garante uma proteção específica e eficaz contra uma

re-infecção pelo mesmo agente patogênico e constitui a base do mecanismo de vacinação nos

vertebrados. A ausência de memória imunológica em invertebrados inviabiliza, assim,

qualquer iniciativa de desenvolvimento de vacinas, na concepção clássica da palavra,

limitando sobremaneira a possibilidade de se prevenir e controlar infecções, neste vasto grupo

zoológico que representa mais de 95% das espécies animais viventes.

Embora os bivalves marinhos, incluindo o mexilhão P. perna, não possuam o sistema

imune adaptativo altamente específico dos vertebrados, estes são um grupo filogeneticamente

antigo e bem sucedido, capaz de sobreviver em equilíbrio e harmonia em um ambiente

aquático rico em microrganismos variados, incluindo bactérias, fungos, protozoários e

microalgas. Alguns destes microrganismos podem viver como comensais, outros fazem parte

de sua microbiota trazendo-lhes benefícios fisiológicos e outros, ainda, considerados

parasitas, podem ser nocivos provocando infecções e ameaçando sua sobrevivência. Os

bivalves marinhos devem, portanto, ter desenvolvido, durante a evolução, estratégias

eficientes de discriminação de microrganismos benéficos dos potencialmente nocivos e de

proteção contra estes últimos. Estas estratégias estão relacionadas à presença de concha, que

funciona como uma barreira mecânica muito eficiente e ao sistema imunológico, que assegura

a integridade corpórea dos bivalves quando estes são invadidos por microrganismos e

parasitas patogênicos e/ou oportunistas.

A hemolinfa dos bivalves e seu papel no sistema imune vêm despertando recentemente

grande interesse, devido principalmente às explosões epidêmicas, muitas vezes devastadoras.

O objetivo deste capítulo foi o de apresentar uma revisão do conhecimento sobre os aspectos

imunológicos do mexilhão P. perna, embora, em muitas ocasiões, houve a necessidade de se

compilar informações descritas para outras espécies de bivalves, principalmente mitilídeos,

devido a ausência das mesmas em P. perna.

2. SISTEMA CIRCULATÓRIO E CÉLULAS IMUNOCOMPETENTES

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O sistema circulatório dos moluscos bivalves, entre eles o de Perna perna, está

representado por um coração, artérias, veias e pelo líquido circulante ou sangue, denominado

hemolinfa. O coração está encerrado em uma cavidade pericárdica localizada na parte dorsal

do corpo e se compõe de um ventrículo e duas aurículas laterais. A hemolinfa é bombeada do

ventrículo para duas artérias principais, que se ramificam e que conduzem a hemolinfa através

de sub-ramos até espaços abertos, denominados seios, localizados nos tecidos e órgãos,

constituindo assim um sistema circulatório aberto. A hemolinfa pode retornar dos seios

hemolinfáticos ao coração através de um sistema venoso que passa primeiro pelos rins e

depois pelas brânquias, alcançando, em seguida as aurículas (Fig. 1).

A hemolinfa é composta de células circulantes ou hemócitos, que são os principais

efetores imune celulares, e o plasma, que contém uma série de moléculas, muitas das quais

participam das respostas imune humorais. Embora muitos dos mecanismos imunes celulares

nos quais participam os hemócitos já estejam caracterizados, falta ainda elucidar, com

precisão, em que local se dá a hematopoiese nos bivalves. A hipótese mais aceita, embora

ainda não confirmada, é a de que os hemócitos se formariam a partir da diferenciação de

células do tecido conjuntivo (Cheng, 1981; Hine, 1999). Por outro lado, a ontogênese dos

hemócitos também é um processo pouco elucidado.

A classificação dos hemócitos de bivalves é um tema particularmente controverso.

Dentre as classificações propostas, destacam-se as de Cheng (1981) e Hine (1999). De modo

simplificado, os autores reconhecem duas populações básicas de hemócitos em bivalves:

hemócitos granulares (HG), que apresentam grânulos em seu citoplasma e hemócitos hialinos

(HH) com poucos ou nenhuns grânulos no seu interior. O único grupo de bivalves que, até o

momento, parece ser uma exceção é o dos pectinídeos que não apresentam HG (Auffret,

1988; Vargas-Albores & Barracco, 2001). Os HH podem compreender dois subtipos

celulares: células indiferenciadas ou blásticas, com uma alta relação núcleo-citoplasma e

células basófilas maiores, semelhantes aos macrófagos. Já os HG formam um grupo celular,

que compreende vários subtipos, que são definidos de acordo com as características

morfológicas e tintoriais de seus grânulos. Alguns autores consideram os HH e os HG como

duas linhagens celulares distintas (Cheng, 1981; Auffret, 1988), enquanto outros sugerem que

os HH sejam originariam os HG por maturação (Hine, 1999).

Como esperado, a hemolinfa dos mexilhões Mytilus edulis e M. galloprovincialis

contém as duas categorias de hemócitos, HH e HG. Em M. edulis se reconhecem dois

subtipos de HG, um com grânulos pequenos e basófilos e outro com grânulos grandes e

acidófilos (Pipe et al., 1997). Estas células diferem ainda quanto às suas características

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ultraestruturais (Pipe et al., 1997), tipos de enzimas hidrolíticas e antígenos de superfície

(Hine, 1999). Da mesma forma, em M. galloprovincialis, foram identificados HG acidófilos,

basófilos e um terceiro tipo celular com os dois tipos de grânulos (Carballal et al., 1997a).

Estes resultados parecem indicar a existência de sub-populações distintas de HG ou que os

diferentes tipos de HG representem fases distintas de maturação de um mesmo tipo celular.

No que se refere ao mexilhão P. perna, Barracco et al. (1999) caracterizaram pela

primeira vez morfológica e funcionalmente os hemócitos desta espécie. Os autores também

distinguiram os dois tipos de hemócitos descritos nos outros mitilídeos. Os HG de P. perna

são células arredondadas ou ovóides (6-14 µm) com um núcleo excêntrico que se aderem e

espraiam sobre o vidro emitindo finos pseudópodos (Fig. 2C) e apresentam abundantes

grânulos citoplasmáticos acidófilos na coloração Giemsa (Fig. 2F, H). Ao contrário das outras

espécies de mexilhões, os autores não observaram HG com grânulos basófilos em P. perna. Já

os HH, são células que não contêm grânulos e cujo citoplasma é basófilo na coloração Giemsa

(Fig. 2D, E, G, H). Também emitem finos pseudópodos quando aderidos ao vidro (Fig. 2A,

B). Distinguem-se dois tipos de HH na hemolinfa de P. perna, células pequenas e

indiferenciadas (5-7 µm), com alta relação núcleo-citoplasma e células maiores (7-12 µm)

com um citoplasma mais abundante e núcleo geralmente polimórfico (Fig. 2H).

3. REAÇÕES IMUNE CELULARES: FAGOCITOSE E ENCAPSULAMENTO

Quando agentes infecciosos passam pela barreira externa do corpo do bivalve (concha

e epitélio), desencadeia-se um processo inflamatório onde os hemócitos movem-se em direção

ao estímulo, resultando em uma intensa infiltração hemocitária no tecido conjuntivo adjacente

às áreas infectadas. A resposta de defesa desencadeada pelos hemócitos contra os invasores

varia de acordo com seu tamanho. No caso de parasitas grandes ou metazoários, a reação

denomina-se encapsulamento. Neste caso, os hemócitos se depositam em várias camadas em

volta do parasita, formando cápsulas celulares onde o parasita aprisionado é posteriormente

destruído. No caso de microorganismos como bactérias e protozoários, a resposta é

geralmente a fagocitose. A fagocitose, primeira linha de defesa nos organismos metazoários,

envolve o reconhecimento do corpo estranho, o contato entre a superfície de ambas células e a

ingestão e degradação intracelular do microorganismo invasor. Os diversos mecanismos que

participam na sua destruição ou neutralização estão descritos abaixo. Dentre as células da

hemolinfa, os HG são, as de maior capacidade fagocítica (Vargas-Albores & Barracco, 2001).

O processo de fagocitose foi comprovado em várias espécies de bivalves, incluindo os

mexilhões M. edulis (Noël et al., 1993) e M galloprovincialis (Carballal et al., 1997b).

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No mexilhão P. perna, Barracco et al. (1999) confirmaram a capacidade dos hemócitos

em fagocitar leveduras Saccharomyces cerevisiae e zimosan (fragmentos da parede de

leveduras, ricos em ß-1,3-glicanas). Os HG foram mais eficientes na fagocitose que os HH,

em ambos casos, e foram capazes de manter uma alta capacidade fagocítica, mesmo quando

os animais eram expostos à altas concentrações de óleo diesel (Pires et al., 2003).

A formação de cápsulas em torno de parasitas metazoários foi descrita nos mexilhões,

M. edulis infectados pelos trematódeos Proctoeces maculatus (Feng, 1988) e Prosorhynchus

crucibulum (Santos & Coimbra, 1995) e em M. galloprovincialis infectados por P. maculatus

(Villalba et al., 1997).

Em P. perna infectados naturalmente pelo trematódeo Bucephalus sp. não houve

encapsulamento, nem destruição dos esporocistos deste parasita pelos hemócitos (Lima et al.,

2001; da Silva et al., 2002) (Fig. 3A). No entanto, em infecções severas e avançadas, foi

possível observar uma resposta inflamatória intensa, com aumento significativo da

porcentagem de hemócitos infiltrados no tecido conjuntivo (da Silva et al., 2002). Por outro

lado, quando os hemócitos de P. perna foram desafiados in vitro com cercárias e outras

formas intermediárias de Bucephalus sp., liberadas pelos esporocistos e fixadas com

formaldeído, os hemócitos foram capazes de aderir e encapsular estas formas larvais,

circundando-as com várias camadas celulares (Fig. 3B, C). Estes resultados parecem indicar

que em mexilhões naturalmente infectados por Bucephalus sp., as larvas do parasita poderiam

liberar fatores imunosupressores capazes de inibir o processo de encapsulamento, o que não

ocorreria nos ensaios in vitro com larvas fixadas. Ainda em P. perna, foram observados

ocasionalmente metazoários encapsulados, correspondendo aparentemente ao metacestódeo

Tylocephalum sp., tanto nas brânquias (Lima et al., 2001) como nas gônadas (Fig. 3D).

4. PROCESSOS LÍTICOS E MICROBICIDAS:

4.1 Enzimas degradativas e espécies reativas de oxigênio (ERO) e de nitrogênio

Dentre os processos de neutralização e degradação dos microrganismos em bivalves,

destacam-se as enzimas hidrolíticas lisossomais e outras classes de enzimas presentes

principalmente nos grânulos dos HG (Chu, 2000). Durante a fagocitose, pode ainda ocorrer a

liberação do conteúdo enzimático dos lisossomos para o plasma, a partir da degranulação dos

HG. Uma das enzimas liberadas é a lisozima, capaz de romper os polissacarídeos complexos

de paredes bacterianas.

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Além do vasto conjunto de enzimas degradativas, existem ainda em bivalves, outros

mecanismos de neutralização de organismos invasores. Quando microrganismos e parasitas

são fagocitados ou encapsulados pelos hemócitos, estas células sofrem um processo de

ativação e aumentam consideravelmente seu consumo de oxigênio, num processo chamado de

choque respiratório. Neste processo, que ocorre tanto nos vertebrados como nos

invertebrados, verifica-se a grande produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e de

nitrogênio, que são moléculas transitórias altamente tóxicas e microbicidas. Estes

oxidoradicais podem assim reagir com qualquer estrutura/molécula que esteja próxima,

funcionando como agentes microbicidas potentes, mas podendo também provocar danos

celulares importantes aos próprios fagócitos (Anderson, 1996). A produção de ERO inicia-se

com a ativação de um sistema enzimático, denominado NADPH oxidase, que está associado

às membranas dos fagócitos e catalisa a redução do oxigênio molecular para ânion superóxido

(O2-). Este, por sua vez, pode ser convertido espontaneamente ou através da enzima

superóxido dismutase (SOD) em peróxido de hidrogênio (H2O2) ou pode reagir com o óxido

nítrico (NO), produzindo peroxinitrito (ONOO-), composto extremamente tóxico, capaz de

provocar danos importantes às membranas celulares, proteínas e DNA. Já, o peróxido de

hidrogênio, sob a ação da enzima mieloperoxidase e em presença de cloro, pode gerar o ácido

hipocloroso (HOCl-) que é, por sua vez, um agente microbicida potente. Além destes

compostos, podem ainda ser geradas outras ERO, como o radical hidroxila (.OH) e o oxigênio

singlet (1O2) que também apresentam efeitos citotóxicos e microbicidas. Cabe, contudo,

salientar, que paralelamente a sua ação microbicida potente, estes oxidoradicais, podem

também acarretar danos importantes aos tecidos do próprio hospedeiro. Para neutralizar este

efeito, existem mecanismos de defesa antioxidantes, que podem ser tanto enzimáticos como

não enzimáticos e atuam na eliminação das ERO ou na transformação destes radicais em

produtos menos tóxicos. Os antioxidantes não enzimáticos, como as vitaminas C, E e o β-

caroteno, são exógenos, ou seja, necessitam ser absorvidos via alimentação. Já, os

antioxidantes enzimáticos são sintetizados pelo próprio organismo e incluem uma série de

enzimas, como a glutationa-peroxidase, a catalase e a já mencionada SOD (Anderson, 1996).

Em bivalves, a produção de ERO foi particularmente bem demonstrada nos mexilhões

M. edulis e M. galloprovincialis (vide revisão de Vargas-Albores & Barracco, 2001).

No que diz respeito ao mexilhão P. perna, a produção de ERO foi estudada nos

hemócitos deste bivalve durante o processo de fagocitose in vitro de zimosan (Barracco et al.,

1999) e após exposição destes animais a diferentes concentrações de óleo diesel (Pires et al.,

2003). Foi possível demonstrar uma surpreendente capacidade dos hemócitos em fagocitar

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estas partículas e de produzir espécies reativas de oxigênio (Fig. 4A-C). Por outro lado, a

exposição dos mexilhões a altas concentrações de óleo diesel não resultou em uma diminuição

significativa do índice fagocítico ou da capacidade de gerar O2- (Pires et al., 2003).

4.2 Peptídeos antimicrobianos (PAMs) .

Proteínas e peptídeos antimicrobianos constituem um dos componentes do sistema

imune inato dos vertebrados e invertebrados que vem recentemente despertando grande

interesse. Estes efetores imunológicos apresentam uma grande diversidade estrutural e de

propriedades biológicas, podendo apresentar uma atividade antimicrobiana rápida e potente

contra um amplo espectro de microrganismos. Podem atuar contra bactérias, fungos,

leveduras e, em alguns casos, até contra vírus e protozoários (vide revisão de Bulet et al.,

2004). Atualmente mais de 700 PAM foram descobertos em plantas, vertebrados e

invertebrados, sendo a maioria proveniente de insetos (vide revisão de Bachère et al., 2004;

Bulet et al., 2004). Os PAM são moléculas catiônicas e anfipáticas, sendo usualmente de

baixo peso molecular (abaixo de 10 kDa). Seu efeito microbicida manifesta-se geralmente por

uma ação sobre a membrana dos microrganismos, resultando na formação de poros, ou numa

desestabilização mais ampla da bicamada lipídica, sendo que ambos processos levam a um

desequilíbrio iônico ou ao extravasamento do conteúdo citosólico, causando a morte do

microrganismo. Alguns PAM podem ainda ser interiorizados, num processo mediado por

receptor, e interferir em alguns processos metabólicos, levando a morte do microrganismo

(Bachère et al., 2004; Bulet et al., 2004). Nos invertebrados, onde não existe um sistema

imune adaptativo com a alta especificidade e memória dos vertebrados, os PAM assumem,

assim, uma função crucial na prevenção e controle de infecções.

Em moluscos, os PAM foram descritos, apenas, muito recentemente, na hemolinfa dos

mexilhões M. edulis (Charlet et al., 1996) e M. galloprovincialis (Hubert et al., 1996; Mitta et

al.,1999a,b; 2000a,b). Nesta última espécie, a caracterização bioquímica, molecular e

funcional destes peptídeos foi realizada em grande detalhe. Foram identificados 3 grupos de

PAMs em M. galloprovincialis por abordagem bioquímica e clonagem molecular: defensinas,

mitilinas, miticinas. Todos são peptídeos catiônicos, ricos em cisteína e foram isolados a

partir dos hemócitos. Além destes, foi ainda identificado um outro peptídeo no plasma de M.

edulis, com atividade estritamente antifúngica, denominado mitimicina (Charlet et al., 1996).

As defensinas e miticinas atuam principalmente contra bactérias Gram(+) e fungos

filamentosos, enquanto as mitilinas apresentam um maior espectro de atividade, incluindo

também bactérias Gram(-) e vibrios marinhos (Mitta et al., 2000a). Os PAM de M.

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galloprovincialis são produzidos de forma constitutiva, não ocorrendo uma indução e resposta

sistêmica durante as infecções. São sintetizados nos hemócitos, sob forma de peptídeos

precursores e armazenados nos grânulos até o momento de atuar nas infecções. Cabe ainda

ressaltar, que até o momento não existem relatos de PAM isolados, ou seqüências gênicas

determinadas, em outras espécies de moluscos.

Um outro aspecto de crucial importância, também estudado por Mitta et al. (2000a),

refere-se ao estabelecimento da fase do desenvolvimento ontogenético em que se inicia a

produção destes fatores antimicrobianos em M. galloprovincialis. Os autores demonstraram

que sua produção inicia-se durante (mitilinas) ou após (defensinas) a metamorfose, sugerindo

que as larvas deste mitilídeo não dispõem de um sistema imune maduro, devendo ser mais

susceptíveis a infecções bacterianas. Efetivamente, a susceptibilidade de larvas a infecções

bacterianas, principalmente a vibrioses, é um fenômeno bem conhecido em bivalves, podendo

ocasionar grandes mortalidades e perdas econômicas importantes. As mitilinas, cuja síntese

inicia-se apenas durante a metamorfose, são muito potentes contra diferentes espécies de

vibrios patogênicos (V. harveyi, V. alginolyticus, V. vulnificus e V. splendidus) e sua ausência

em larvas poderia explicar sua especial facilidade em contrair vibrioses (Mitta et al., 2000a).

No que se refere ao mexilhão P. perna, não existem, até o momento, relatos sobre a

presença de PAM em seus hemócitos. Numa avaliação da atividade antimicrobiana da

hemolinfa deste bivalve, encontramos uma ação antibacteriana, tanto da sua fração celular

quanto da plasmática, contra bactérias Gram(+) (Micrococcus luteus e Aerococcus viridans) e

Gram(-) (Enterobacter cloacae), mas não contra vibrios marinhos (V. alginolyticus e V.

harveyi) e fungos filamentosos (Microsporum canis e Tricophyton mentagrophytes) (dados

não publicados). Frente a estes resultados, fizemos uma tentativa de identificar mitilinas e

defensinas nestas células, por imunomarcação e por abordagem genômica (RT-PCR). Na

imunomarcação, os hemócitos de P. perna foram tratados com anticorpos monoespecíficos,

produzidos contra defensinas e mitilinas de M. galloproviancialis. Os resultados foram

positivos para ambos peptídeos, evidenciando a presença de moléculas semelhantes a estes

PAMs nos hemócitos de P. perna (Fig. 5A-C). Por outro lado, através de abordagem

genômica, utilizando-se oligonucleotídeos desenhados a partir das seqüências codificadoras

de mitilinas e defensinas de M. galloprovincialis, não foi possível amplificar nenhuma

sequência que correspondesse a estes peptídeos em P. perna até o momento. Em contraste,

utilizando-se os mesmos oligonucleotídeos, encontramos curiosamente seqüências

codificadoras para ambos peptídeos na ostra do mangue Crassostrea rhizophorae (dados não

publicados). Estes resultados surpreendem, uma vez que P. perna é filogeneticamente mais

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próximo de M. galloprovincialis do que a ostra C. rhizophorae. Todavia, a busca de PAM em

P. perna continua sendo tema de pesquisa em nosso laboratório e outras tentativas estão

sendo realizadas.

5. PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO

As proteínas de choque térmico (HSPs: do inglês heat shock proteins) são assim

denominadas porque a temperatura foi o primeiro fator descoberto que induziu a sua síntese

em larvas de Drosophila (Ritossa, 1962). Existem atualmente diferentes famílias de HSPs,

classificadas basicamente pelos seus pesos moleculares. Dentre estas, as HSP70 (68-72 kDa)

são as mais bem conservadas durante a evolução e as mais estudadas nos diferentes

organismos. Existem isoformas de HSPs que são induzidas em situações de estresse e

isoformas não-induzíveis (constitutivas) referidas como chaperonas. As isoformas

constitutivas estão presentes na célula em condições normais e estão envolvidas no transporte,

dobramento e montagem de proteínas sintetizadas pelas células. No entanto, sob condições

ambientais adversas a síntese de certas HSPs é aumentada para reparar e proteger as proteínas

celulares, facilitando seu dobramento correto e minimizando a agregação protéica. Uma

ampla variedade de fatores abióticos foi reconhecida como indutora da expressão de HSPs,

como temperatura, salinidade, anóxia e diferentes xenobióticos (Sanders, 1993). Desta forma,

as HSPs podem ser consideradas como biomarcadores potenciais de estresse ambiental.

Nos mexilhões M. edulis e M. galloprovincialis, a síntese de HSP70 e a indução de

termo-tolerância já foram referidas (Sanders, 1993; Snyder et al., 2001). Em M.

galloprovincialis, Snyder et al. (2001) demonstraram ainda a indução de HSP70 em animais

expostos ao cádmio e a hidrocarbonetos aromáticos policíclicos.

A grande maioria dos trabalhos sobre HSPs em bivalves refere-se a indução da síntese

de HSPs por fatores abióticos, em diferentes tecidos como brânquias e manto mas não em

hemócitos. Portanto, não se conhece ainda o efeito de infecções na produção de HSPs e sua

associação com a capacidade de defesa dos hemócitos. Dentre os poucos trabalhos existentes,

destaca-se o de Tirard et al. (1995) que estudou o efeito da temperatura sobre as HSP70 dos

hemócitos de C. virginica e do parasita Perkinsus marinus, verificando que o limiar de

temperatura para induzir a síntese de HSP nas células de P. marinus foi maior que para

induzi-la nos hemócitos, indicando que o parasita estaria funcionalmente capacitado mesmo

em condições de hipertermia, o que favoreceria sua estratégia de estabelecimento no

hospedeiro. Por outro lado, Encomio et al. (2005) estudaram a expressão de HSP70 em duas

populações distintas de C. virginica, uma resistente e outra suscetível à P. marinus e não

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encontraram variação significativa entre as populações ou entre as intensidades de infecção

por P. marinus. No entanto, é importante salientar que neste estudo, os autores utilizaram

brânquias e não hemócitos, o que poderia revelar resultados diferentes.

No que se refere a P. perna, nenhum estudo deste tipo foi realizado até o momento.

6. REAÇÕES IMUNE HUMORAIS E MECANISMOS DE RECONHECIMENTO

O mecanismo de reconhecimento do não-próprio é um processo crucial no

desencadeamento da resposta imune. Como descrito acima, os invertebrados não possuem as

moléculas de reconhecimento altamente específicas dos vertebrados. Possuem, contudo,

outras moléculas imunológicas (proteínas plasmáticas e receptores celulares) capazes de

reconhecer, com grande eficiência, padrões moleculares específicos e repetitivos, expressos

na superfície de diferentes microrganismos e parasitas, como as peptidoglicanas (PG) e

lipopolissacarídeos (LPS) da superfície de bactérias Gram(+) e Gram(-) respectivamente e as

β-1,3-glicanas da parede de fungos. Dentre estas moléculas de reconhecimento destacam-se

os receptores Toll, descritos em insetos (vide revisão de Ferrandon et al., 2004), as lectinas, o

sistema de ativação da pró-fenoloxidase (proPO) e o sistema de coagulação (vide revisão de

Vargas-Albores & Barracco, 2001).

6.1. Aglutininas e Lectinas.

Lectinas e/ou aglutininas são proteínas ou glicoproteínas com capacidade de se ligar

especificamente a açúcares expressos na superfície de diferentes células (padrões

moleculares), causando sua aglutinação. Esta propriedade deriva do fato destas moléculas,

assim como os anticorpos dos vertebrados, possuírem pelo menos dois sítios de ligação

(moléculas bivalentes), sendo assim capazes de aglutinar células que expressem determinados

açúcares na sua superfície. As lectinas foram inicialmente identificadas em plantas, mas hoje

se sabe que são de ocorrência ubíqua, sendo encontradas em todos os seres vivos, desde vírus

até mamíferos. Devido à sua propriedade de aglutinar células e de estarem envolvidas no

reconhecimento do não-próprio, as lectinas dos invertebrados foram inicialmente

consideradas análogas funcionais dos anticorpos dos vertebrados. No entanto, hoje é sabido

que são estrutural e funcionalmente distintas das imunoglobulinas dos vertebrados (Marques

& Barracco, 2000). Considera-se, atualmente, que as lectinas, tanto de vertebrados como de

invertebrados, sejam moléculas capazes de reconhecer e se ligar a padrões moleculares

específicos (açúcares), comumente expressos na superfície de microrganismos e parasitas,

sendo melhor definidas como pattern-recognition proteins ou PRP.

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Além da propriedade de reconhecimento e aglutinação, algumas lectinas de

invertebrados também foram descritas como capazes de aumentar a fagocitose dos

microrganismos com os quais reagiram, funcionando como opsoninas. O primeiro relato sobre

o aumento de fagocitose de bactérias (Vibrio anguillarum e Escherichia coli) pré-tratadas

com lectinas purificadas, foi na ostra Crassostrea gigas (Hardy et al., 1977). Além do mais, a

atividade aglutinante da hemolinfa de C. gigas foi ainda capaz de aumentar, após inoculação

de bactérias (Hardy et al., 1977; Olafsen et al., 1992). Também no mexilhão M. edulis, as

lectinas da hemolinfa mostraram-se capazes de estimular a fagocitose de leveduras pelos

hemócitos deste animal (Renwrantz, 1983).

No que diz respeito ao mexilhão P. perna, tal como esperado, sua hemolinfa também

apresenta uma atividade aglutinante contra diferentes tipos de eritrócitos (Barracco et al.,

1999; Pires et al., 2003), embora nenhuma lectina tenha sido bioquimicamente purificada

neste mexilhão até o momento. A atividade das lectinas plasmáticas de P. perna é cálcio-

dependente e específica para açucares N-acetilados, principalmente sialoglicoproteínas. Sua

atividade é inibida pelos LPS de Salmonella abortus e Pseudomonas aeruginosa, mas não

pelos LPS de Escherichia coli. Além do mais, a incubação do plasma de P. perna com as

bactérias P. aeruginosa e Serratia marescens levou a uma diminuição parcial da atividade

aglutinante (Couto, 2001). Estes resultados sugerem o envolvimento das lectinas de P. perna

no processo de reconhecimento e na resposta imune destes animais. Por outro lado, a injeção

de eritrócitos no músculo adutor de P. perna não levou a um aumento da expressão da

atividade aglutinante, sugerindo que estas moléculas não sejam induzíveis (Couto, 2001),

como referido em C. gigas (Hardy et al., 1977; Olafsen et al., 1992).

Cabe ainda salientar que a indução destas moléculas, principalmente em bivalves de

interesse econômico, como as espécies cultivadas, poderia ser de grande relevância, uma vez

que o aumento de seus níveis plasmáticos poderia conferir uma maior proteção a estes

animais e auxiliar na prevenção de infecções.

6.2. Cascatas proteolíticas - Sistema de coagulação

Tanto em vertebrados quanto em invertebrados, a invasão por microorganismos pode

desencadear um sistema de amplificação de resposta, representado por cascatas proteolíticas,

que levam a uma reação de defesa generalizada. Nos vertebrados, a principal cascata deste

tipo é o sistema complemento, que pode ser ativado direta ou indiretamente por

microorganismos, resultando na sua fagocitose ou destruição por formação de poros

membranosos. Nos invertebrados, a presença de componentes da parede de microorganismos

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também pode desencadear cascatas proteolíticas, sendo que duas delas foram particularmente

bem estudadas em artrópodes. A primeira corresponde ao sistema de coagulação, que foi

extensivamente estudada em limulídeos (vide revisão de Theopold et al., 2004). Neste

sistema, a presença de ß-1,3-glicanas, provenientes da parede de fungos e principalmente de

lipopolissacarídeos (LPS) da parede das bactérias Gram(-), provocam uma intensa

degranulação dos HG, liberando para o plasma uma série de fatores que desencadeiam uma

cascata proteolítica, que culmina com a formação de um gel de coagulação cujo principal

objetivo é de limitar a infecção.

Deve-se, no entanto, salientar que em outros artrópodes, como insetos e crustáceos,

ocorre um sistema distinto de coagulação, que não envolve cascatas proteolíticas e onde a

polimerização das proteínas de coagulação se dá através de enzimas transglutaminases

dependentes de cálcio (Theopold et al., 2004).

Em bivalves, um sistema de coagulação propriamente dito, levando a uma gelificação

do plasma não ocorre. A hemolinfa de bivalves, incluindo P. perna, permanece sempre fluida

mesmo após decorrido muito tempo de sua extração. Em contrapartida, imediatamente após a

coleta da hemolinfa, verifica-se uma intensa e imediata agregação dos hemócitos, em

conseqüência de uma forte ativação celular e que leva à formação de agregados hemocíticos

extremamente densos (vide revisão de Vargas-Albores & Barracco, 2001). Esta agregação

forma-se mesmo em presença de anticoagulantes tradicionais a base de quelantes de cálcio,

como EDTA e citrato de sódio, o que dificulta sobremaneira o estudo in vitro das respostas

imune celulares de bivalves.

6.3. Cascatas proteolíticas – Sistema pró-fenoloxidase (proPO).

Uma outra cascata proteolítica, também essencialmente estudada em artrópodes,

refere-se ao sistema de ativação da pró-fenoloxidase ou sistema proPO. Esta via culmina

com a produção do pigmento melanina, que confere um aspecto caracteristicamente escuro

nas regiões onde se deposita. Várias respostas celulares de defesa em artrópodes, como a

formação de cápsulas hemocíticas e cicatrização de feridas, são usualmente acompanhadas

por uma reação de melanização (vide revisões de Ashida & Brey, 1998; Söderhäll &

Cerenius, 1998). A biossíntese da melanina é um processo complexo, que envolve uma

série de reações proteolíticas em cascata, cuja enzima chave é a fenoloxidase (PO). As POs

podem catalisar dois tipos de reações: a oxigenação de monofenóis como a tirosina, para

difenóis (L-DOPA) e a oxidação de difenóis (DOPA e DOPAMINA), para quinonas

(DOPAQUINONA e DOPAMINOQUINA). Dentre as famílias de POs, existe um grupo

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com propriedade de catalisar os dois passos descritos acima (tirosinases), enquanto outro

grupo catalisa apenas o segundo passo (lacase), ou seja, a oxidação de difenóis. (Ashida &

Brey, 1998). A PO de artrópodes existe geralmente sob uma pró-forma inativa (proPO) que

é ativada por componentes da superfície de microrganismos, tais como os LPS da parede

de bactérias Gram(-), as peptidoglicanas (PG) de bactérias Gram(+) e as β-1,3-glicanas da

superfície de fungos, o que sugere que este sistema esteja relacionado ao reconhecimento

do não-próprio e ao sistema imune destes animais. Estes compostos parecem induzir a

ativação de serino-proteases endógenas, que por sua vez promoveriam a clivagem

proteolítica da proPO em PO (vide revisões de Ashida & Brey, 1998; Söderhäll &

Cerenius, 1998). Na maioria dos artrópodes, a proPO localiza-se preferencialmente nos

hemócitos, sendo liberada para o plasma por ocasião de injúrias e infecções (vide revisão

de Vargas-Albores & Barracco, 2001). O papel preciso da melanina nas respostas imune

dos artrópodes ainda não é bem compreendido. No entanto, é sabido que esta via gera

transitoriamente moléculas tóxicas, como as quinonas e ERO (Nappi & Vass, 2001), que

podem funcionar como potentes destruidores de parasitas e microrganismos invasores. Por

outro lado, o composto final melanina é descrito como fungistático (Söderhäll & Cerenius,

1998) e funciona ainda como scavenger de radicais livres auxiliando, assim, a eliminar

estes compostos altamente reativos, que podem danificar também aos tecidos internos dos

hospedeiros.

Apesar da reação de melanização ter sido muito estudada em artrópodes, este processo

foi ainda muito pouco investigado em moluscos, principalmente no que se refere ao seu

envolvimento no sistema imune. A presença da enzima PO na hemolinfa de moluscos não

parece ser tão generalizada como nos artrópodes. Em bivalves, por exemplo, esta enzima foi

referida na hemolinfa de algumas espécies de mexilhões, como o M. edulis (Coles & Pipe,

1994; Renwrantz et al., 1996), M. galloprovincialis (Carballal et al., 1997c), Geukensia

demissa (Deaton et al., 1999) e Perna viridis (Asokan et al., 1997; 1998). Contudo, em

alguns bivalves (vide revisão de Vargas-Albores & Barracco, 2001), incluindo P. perna

(Barracco et al., 1999), a PO não foi encontrada na hemolinfa.

Pode-se dizer que o primeiro estudo detalhado sobre o sistema proPO de bivalves e

sua ativação por componentes da superfície de microorganismos foi realizado no mexilhão

Perna viridis (Asokan et al., 1997; 1998), através de ensaios experimentais semelhantes

aos usados em artrópodes. Neste mexilhão, a PO foi encontrada principalmente nos

hemócitos, mas também em pequena quantidade no plasma, e sua atividade foi induzida

por serino-proteases, β-1,3-glicanas e diferentes tipos de LPS, sugerindo uma atuação no

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reconhecimento imunológico. Estes resultados assemelham-se aos descritos em artrópodes,

mas diferem dos descritos em outros bivalves onde a ativação da proPO por componentes

de microrganismos não ocorre ou mostra resultados contraditórios (Deaton et al., 1999).

A ocorrência de um sistema proPO em P. viridis e sua aparente ausência em P. perna

(Barracco et al., 1999), a partir de uma metodologia semelhante, nos levou a aprofundar a

busca deste sistema em P. perna, através de diferentes técnicas e ensaios alternativos. Após

um exaustivo estudo, pudemos efetivamente constatar a ocorrência de PO na hemolinfa

desta espécie (Pires, 2002). Esta enzima mostrou ser do tipo lacase (oxidação apenas de

difenóis) e sua atividade foi detectada tanto nos hemócitos (Fig. 6B-C) quanto no plasma

deste mexilhão. Contudo, a atividade desta enzima em P. perna não foi induzida por

componentes da superfície de microrganismos (LPS e β-1,3-glicanas), nem por serino-

proteases, diferindo dos resultados descritos em P. viridis. Além do mais, pequenos

ferimentos provocados experimentalmente na região do manto não resultaram em uma

reação de melanização da região ferida, diferentemente do que ocorre em artrópodes. Desta

forma, o envolvimento da PO no sistema imune de P. perna permanece pouco conclusivo e

demanda uma maior elucidação. Seria, contudo, interessante, investigar se a atividade

desta enzima de P. perna é capaz de variar em situações de estresse, tanto fisiológico

(infecções) como ambiental (xenobiontes) e assim constituir um parâmetro indicador de

condição de saúde para P. perna.

7. PARÂMETROS HEMATO-IMUNOLÓGICOS COMO BIOINDICADORES

Os bivalves, destacando-se os mexilhões, são animais essencialmente sésseis e de

ampla distribuição geográfica, o que os torna excelentes modelos biológicos para o estudo de

contaminação ambiental, podendo funcionar como organismos-sentinela. A presença de uma

quantidade elevada de poluentes no meio ambiente produz usualmente um efeito imunotóxico

aos bivalves, conferindo aos hemócitos e suas funções, a possibilidade de serem utilizados

como biomarcadores de contaminação ambiental. Por outro lado, estes poluentes podem ainda

causar um efeito imunossupressor importante, contribuindo para aumentar a susceptibilidade

dos bivalves a infecções, o que poderia acarretar prejuízos importantes aos cultivos. Vários

parâmetros hemato-imunológicos de bivalves vêm sendo utilizados para expressar sua

condição de saúde e qualidade ambiental. Dentre estes parâmetros destacam-se os

hemogramas, representados pelo número total (THC: do inglês total hemocyte count) e

diferencial de hemócitos circulantes (DHC: do inglês differential hemocyte count), a atividade

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fagocítica e produção de ERO. Sabe-se, por exemplo, que a THC pode sofrer variações

correlacionadas a fatores abióticos (Carballal et al., 1998) e fisiológicos (período de

reprodução) (vide revisão de Vargas-Albores & Barracco, 2001). A presença de agentes

patogênicos também acarreta a alteração deste parâmetro, como conseqüência da migração

dos hemócitos para os tecidos afetados. Contudo, esta modulação da THC nem sempre resulta

numa alteração simultânea da DHC. Carballal et al. (1998) observaram um aumento da THC

em mexilhões M. galloprovincialis infectados pelo protozoário Marteilia refringes, mas a

DHC permaneceu inalterada. Por outro lado, Santarém et al. (1994) observaram uma

diminuição de HG em M. galloprovincialis no período de mais alta prevalência do copépodo

Mytilicola intestinalis.

Com relação à presença de xenobiontes, como regra, os hemogramas mostram

resultados variáveis, mas em geral, ocorre um aumento da THC quando os animais são

expostos a poluentes. Alterações na THC foram descritas em M. edulis expostos a metais

pesados e outros xenobiontes (vide revisão de Anderson & Anderson, 2000).

A maioria dos trabalhos refere o efeito de diferentes poluentes sobre o sistema imune

dos mexilhões em condições experimentais, mas poucos trabalhos avaliam o efeito in situ,

aproveitando-se de alterações ambientais efetivas. No caso do derramamento de óleo do navio

Sea Empress, que ocorreu em 1996 na costa do Reino Unido, o efeito mais severo sobre o

sistema imune de M. edulis foi constatado dois meses após o desastre, com um aumento

significativo da THC (Anderson & Anderson, 2000), enquanto que o efeito a longo prazo foi

menor coincidindo com a diminuição dos níveis de contaminação (Dyrynda et al., 2000).

Sabe-se que a fagocitose representa um dos principais mecanismos de defesa em

bivalves. A sensibilidade desta reação à presença de xenobióticos faz deste imunoparâmetro

uma ferramenta útil para monitorar a saúde dos bivalves e a qualidade ambiental. Em

mexilhões, a fagocitose pode ser inibida por poluentes, como se observou em M. edulis de

áreas afetadas por derramamento de petróleo (Anderson & Anderson, 2000; Dyrynda et al.,

2000) ou por efluentes de indústria de papel (St-Jean et al., 2003), ou ainda em M.

galloprovincialis de zonas industriais (Cajaraville et al., 1996). No entanto, a fagocitose pode

não ser afetada pela exposição a metais pesados (Anderson & Anderson, 2000).

No que se refere ao mexilhão P. perna, da Silva et al. (2002) observaram uma

diminuição da THC e da porcentagem de HG em mexilhões infectados pelo trematódeo

Bucephalus sp., o que provavelmente resultou da migração dos hemócitos da hemolinfa para

os tecidos afetados. Por outro lado, Pires et al. (2003) avaliaram a alteração de vários

parâmetros hemato-imunológicos (THC, DHC, viabilidade celular, fagocitose e produção de

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ERO, concentração de lectinas e proteínas plasmáticas) em animais expostos a diferentes

concentrações de óleo diesel, mas surpreendentemente não houve diferenças significativas

destes parâmetros em relação aos animais não expostos ao óleo. Ainda em P. perna, os

mesmos parâmetros acima mencionados foram analisados em animais expostos, por vários

meses, a efluentes domésticos com níveis muito altos de coliformes fecais, sem que houvesse

uma alteração significativa de seus valores (dados não publicados). Abessa et al. (2005)

estudaram duas populações de P. perna provenientes de uma zona pouco alterada pela ação

humana (Ponta Grossa – Ubatuba) e outra afetada por efluentes industriais e domésticos (Ilha

de Palmas – Santos). Os autores não encontraram diferenças na retenção de vermelho neutro

(indicador de estabilidade da membrana lisossomal) pelos hemócitos das populações de

ambas localidades, mas verificaram que quando os mexilhões foram transferidos de Ponta

Grossa para Palmas, os hemócitos sofreram uma redução da capacidade de retenção do

vermelho neutro; indicando que cada população encontrava-se adaptada ao seu meio.

Estes resultados parecem indicar que P. perna, diferentemente de M. edulis e M.

galloproviacialis, não é uma espécie muito sensível a poluentes, não produzindo uma resposta

imunológica rápida e confiável que contribua para indicar e predizer com precisão uma

situação de estresse ambiental. No entanto, é importante considerar que os resultados obtidos

até o momento sobre imunomarcadores em bivalves apresentam geralmente uma variação

muito ampla, o que limita sua utilização para esta finalidade. No caso de P. perna, os estudos

realizados até o momento são insuficientes para se chegar a uma conclusão definitiva, sendo

necessária uma maior investigação para definir os melhores imunoparâmetros na indicação de

saúde e qualidade ambiental, antes de descartar esta espécie para esta finalidade.

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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