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PD-L1 IHC 28-8 pharmDx SK005 Cinquenta testes para uso com Autostainer Link 48 Uso pretendido Para uso com diagnstico in vitro. O PD-L1 IHC 28-8 pharmDx um ensaio imuno-histoqumico qualitativo que utiliza anticorpo monoclonal de coelhos anti-PD-L1, Clone 28-8 para uso na deteco da protena PD-L1 em tecidos com cncer de pulmo de clulas no pequenas no escamosas (NSCLC) embebidas em parafina e fixadas em formalina (FFPE) utilizando o sistema de visualizao EnVision FLEX no Autostainer Link 48. A expresso da protena PD-L1 definida como a porcentagem de clulas tumorais apresentando marcao positiva da membrana em qualquer intensidade. A expresso de PD-L1, conforme detectada pelo PD-L1 IHC 28-8 pharmDx em NSCLCs no escamosos, pode estar associada a uma maior sobrevida proporcionada pelo OPDIVO (nivolumab). Resumo e explicao A ligao dos ligantes PD-1, do PD-L1 e do PD-L2 com o receptor PD-L1 encontrados em clulas T inibe a proliferao de clulas T e a produo de citocinas. A regulao ascendente dos ligantes PD-1 ocorre em alguns tumores, e a sinalizao por meio dessa via pode contribuir para com a inibio da vigilncia de tumores imune a clulas T ativas (1). O OPDIVO (nivolumab) um anticorpo monoclonal com imunoglobulina humana G4 (IgG4) que se liga ao receptor PD-1 e bloqueia a interao com o PD-L1 e o PD-L2, liberando a inibio mediada via PD-1 da resposta imunolgica, incluindo a resposta imunolgica antitumor (2). Nos modelos de tumores de camundongos singnicos, o bloqueio da atividade do PD-1 resultou em diminuio do crescimento do tumor (3). Os benefcios clnicos do OPDIVO e da utilidade clnica do PD-L1 IHC 28-8 pharmDx foram investigados em NSCLCs. NSCLC no escamoso: A deteco de clulas tumorais com expresso de PD-L1 em pacientes vtimas de cncer de pulmo de clulas no pequenas e no escamosas pode indicar um maior benefcio de sobrevida ao tratamento com OPDIVO (nivolumab) para o paciente. Amostras dos pacientes em estudos clnicos com OPDIVO patrocinados pela Bristol-Myers Squibb, foram testadas usando PD-L1 IHC 28-8 pharmDx. O estudo clnico CA209057 investigou a validade clnica do PD-L1 IHC 28-8 pharmDx na avaliao do status do PDL1 em pacientes com NSCLC no escamoso tratados com OPDIVO (4,7). O efeito do tratamento imunoteraputico anti-PD-L1 com OPDIVO foi correlacionado expresso de PD-L1 em pacientes com NSCLC avanado. OPDIVO uma marca registrada da Bristol-Myers Squibb. Princpio do procedimento O PD-L1 IHC 28-8 pharmDx contm reagentes otimizados e o protocolo necessrio para executar procedimentos de marcao de IHC de amostras de FFPE usando Autostainer Link 48 e mdulo de pr-tratamento PT Link (5). Aps a incubao com o anticorpo monoclonal primrio PD-L1 ou o reagente de controle negativo (NCR), as amostras so incubadas utilizando um anticorpo de vinculao especfico s espcies hospedeiras do anticorpo primrio e, em seguida, incubadas com reagente de visualizao pronto para uso composto por molculas de anticorpo secundrio e molculas de perioxidase de raiz-forte ligadas espinha dorsal de um polmero dextrano. A converso enzimtica do cromognio adicionado posteriormente resulta na precipitao de um produto de reao visvel no local do antgeno. A cor da reao cromognica modificada por um reagente cromognico de realce. A amostra pode, ento, ser contrastada e recoberta com vidro. Os resultados so interpretados utilizando um microscpio de luz. So fornecidas lminas de controle contendo duas linhagens celulares humanas embebidas em parafina e fixadas em formalina para validar as sries de marcao. Materiais fornecidos PD-L1 IHC 28-8 pharmDx (Cdigo SK005) Os materiais listados abaixo so suficientes para 50 testes (50 lminas incubadas com anticorpo primrio para PD-L1 e 50 lminas incubadas com o reagente de controle negativo correspondente; 100 lminas de teste ao todo). Um anticorpo primrio adicional ao PD-L1 fornecido com o kit para marcao de lminas de controle de 15 linhagens celulares. O nmero de testes se baseia no uso de 2 x 150 L por lmina de cada reagente, exceto DAB+ e soluo de recuperao do alvo. O kit fornece materiais suficientes para, no mximo, 15 sries individuais de marcao. Quantidade Descrio 1 x 34,5 mL Reagente bloqueador da peroxidase

Soluo tamponada contendo perxido de hidrognio, detergente e 0,015 mol/L de azido de sdio.

PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT

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1 x 19,5 mL

Anticorpo primrio: Anticorpo monoclonal de coelhos anti-PD-L1, Clone 28-8

Anticorpo monoclonal de coelhos anti-PD-L1 em uma soluo tamponada contendo protena de estabilizao e 0,015 mol/L de azido de sdio.

1 x 15 mL

Reagente de controle negativo*

Anticorpo IgG de controle monoclonal de coelhos em uma soluo tamponada contendo protena de estabilizao e 0,015 mol/L de azido de sdio. * O IgG de controle monoclonal de coelhos vendido sob licena da Cell Signaling Technology.

1 x 34,5 mL VINCULADOR, anticorpo de coelhos

Anticorpo secundrio de camondongos contra imoglobinas de coelhos em uma soluo tamponada contendo protena de estabilizao e 0,015 mol/L de azido de sdio.

1 x 34,5 mL Reagente de visualizao - HRP

Dextrano ligado a molculas de peroxidase e molculas de anticorpos secundrios de cabras contra imunoglobulinas de coelho e camundongo em uma soluo tamponada contendo protena de estabilizao e um agente antimicrobiano.

15 x 7,2 mL Tampo de substrato DAB+

Soluo tamponada contendo perxido de hidrognio e um agente antimicrobiano.

1 x 5 mL Cromognio DAB+

3,3- tetracloridrato de diaminobenzidina em solvente orgnico.

1 x 34,5 mL Realador DAB

Sulfato cprico em gua.

6 x 30 mL Soluo de recuperao do alvo EnVision FLEX, baixo pH (50X)

Soluo tamponada, pH 6.1, contendo detergente e um agente antimicrobiano.

15 lminas Lminas de controle PD-L1 IHC 28-8 pharmDx

Cada lmina contm sees de duas linhagens celulares granulares, embebidas em parafina e fixadas em formalina: NCI-H226** com expresso de protena PD-L1 positiva e MCF-7 com expresso de protena PD-L1 negativa.

PD

-L1,

SK

005

phar

mD

x XX

XXX

**Dr. AF Gazdar e Dr. JD Minna da NIH so reconhecidos por sua contribuio no desenvolvimento do NCI-H226 (Nmero ATCC: CRL-5826)(6) Observao: todos os reagentes includos so formulados especificamente para uso com este kit. De modo que a execuo do teste ocorra de acordo com as especificaes, nenhuma substituio, a no ser a soluo de recuperao do alvo EnVision FLEX, baixo pH (50x) (Cdigo K8005), poder ser feita. O PD-L1 IHC 28-8 pharmDx foi especialmente criado para uso com o Autostainer Link 48. Consulte os Guias do Usurio do Autostainer Link 48 e do PT Link para obter informaes adicionais.

CONTROL SLIDES

EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW pH (50X)

DAB ENHANCER

DAB+ CHROMOGEN

DAB+ SUBSTRATE BUFFER

VISUALIZATION REAGENT-HRP

LINKER, ANTI-RABBIT

NEGATIVE CONTROL REAGENT

MONOCLONAL RABBIT ANTI-PD-L1 CLONE 28-8

MCF-7: Negativo para PD-L1

NCI-H226: Positivo para PD-L1

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Materiais necessrios, mas no fornecidos Mdulo de pr-tratamento PT Link (Cdigo PT100/PT101) Autostainer Link 48 (Cdigo AS480) Tampo de lavagem EnVision FLEX (20x) (Cdigo K8007) Hematoxilina EnVision FLEX (Link) (Cdigo K8008) gua destilada ou deionizada (gua reagente) Temporizador Tecidos positivos e negativos para uso como controles de processo (consulte a seo Controle de qualidade e a Tabela 1) Lminas microscpicas: Lminas microscpicas Dako FLEX IHC (Cdigo K8020) ou lminas Fisherbrand Superfrost Plus carregadas Coberturas de vidro Reagentes mdios e subordinados de montagem permanente necessrios montagem de coberturas de vidro Microscpio de luz (ampliao objetiva de 4x a 40x) Precaues 1. Para uso com diagnstico in vitro. 2. Para usurios profissionais. 3. Este produto contm azido de sdio (NaN3), um produto qumico altamente txico em forma pura. Nas concentraes do produto,

embora no classificadas como perigosas, o NaN3 pode reagir com tubulaes de chumbo e cobre para formar acmulos altamente explosivos de azidos de metal. No descarte, lave com bastante gua a fim de impedir o acmulo de azido de metal na tubulao (8).

4. O anticorpo primrio, o reagente de controle negativo, o vinculador e o reagente de visualizao contm material de origem animal. 5. As amostras, antes e aps a fixao, e todos os materiais a elas expostos, devem ser tratados como capazes de transmitir infeces e

descartados observando-se as devidas precaues (9). 6. Os tempos, temperaturas ou mtodos de incubao que no sejam os especificados podero gerar resultados errneos. 7. Os reagentes foram perfeitamente diludos. Outras diluies podero resultar em perda de marcao do antgeno. 8. O reagente de visualizao, o cromognio DAB+ lquido e a soluo cromognea com substrato DAB+ preparado podem sofrer efeitos

adversos se expostos a nveis excessivos de luz. No armazene componentes do sistema nem execute a marcao em luz forte, como a luz direta do sol.

9. Resduos de parafina podero falsos negativos. 10. O uso de volumes de reagentes que no sejam os recomendados poder resultar na perda de imunorreatividade visvel do PD-L1. 11. Grandes sees de tecido ocupando 2/3 da lmina podero requerer 3x150 l de reagente. 12. Como regra geral, pessoas com menos de 18 anos de idade no podem trabalhar com este produto. Os usurios devem ser

cuidadosamente orientados sobre os procedimentos de trabalho adequados, as propriedades perigosas do produto e as instrues de segurana necessrias. Consulte a folha de dados de segurana (SDS) para obter inf