GUIA DE TRABALHOS LABORATORIAIS

de

ENGENHARIA GENÉTICA

Mestrado em Engenharia Biológica Mestrado em Engenharia Biomédica

(2011/2012)

Leonilde M. Moreira

Cristina A. Viegas

Arsénio Fialho

Jorge H. Leitão

Isabel Sá-Correia

(Área de Ciências Biológicas, IST)

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ENGENHARIA GENÉTICA

(Mestrados em Engª Biológica e Engª Biomédica)

(2011/2012)

Aulas laboratoriais

AULA TRABALHO

A1 TP1- Introdução de plasmídeos em bactérias por conjugação triparental e

electrotransformação.

A2 TP2- Amplificação do gene pgmG (que codifica a proteína bifuncional com

actividades de fosfoglucomutase/fosfomanomutase) a partir do DNA cromossómico de

Sphingomonas elodea, por recurso à técnica de PCR.

Utilização de ferramentas bioinformáticas para análise de sequências de nucleótidos e

aminoácidos.

A3 TP3- Hibridação de Southern utilizando sondas não radioactivas (1ª parte).

A4 TP4- Hibridação de Southern utilizando sondas não radioactivas (2ª parte).

A5 TP5- Métodos moleculares de tipagem: aplicação a isolados clínicos de Burkholderia

cepacia. Estudos de interacção proteína-proteína usando um sistema de dois híbridos

para bactérias.

3

BIOSSÍNTESE DO EXOPOLISSACÁRIDO GELANO POR Sphingomonas elodea

O gelano é um heteropolissacárido constituído por uma unidade tetrassacarídica

repetitiva, apresentando, na sua forma nativa, substituintes acilo laterais (Fig. 1).

Figura 1- Estrutura nativa do gelano. Abreviaturas: D-Glc: D-glucose; D-GlcA, ácido D-glucurónico; L-Rha, L-

ramnose; Oac: grupo acetilo; OGl: grupo glicerilo.

O gelano quando desacilado, é capaz de formar géis rígidos e quebradiços. Devido às suas

propriedades gelificantes, tem uma vasta gama de aplicações biotecnológicas, nomeadamente

nas indústrias alimentar e farmacêutica. É produzido, com elevado rendimento, pela espécie

bacteriana Sphingomonas elodea (Fialho et al., 2008).

Entre as várias actividades enzimáticas envolvidas na síntese dos precursores

activados, a enzima fosfoglucomutase (PGM) desempenha um papel central, catalizando a

interconversão de glucose 6-fosfato, um importante intermediário glicolítico, a glucose 1-

fosfato, um intermediário importante para a síntese de compostos de reserva e de

polissacáridos. O gene que codifica a actividade de fosfoglucomutase em S. elodea (pgmG)

foi já clonado e sequenciado (Fig. 2), sabendo-se que codifica uma proteína bifuncional de

cerca de 50 kDa, com actividades de fosfoglucomutase e fosfomanomutase (catalisa a

interconversão da manose 6-fosfato a manose 1-fosfato). A proteína PgmG de S. elodea

pertence à família das fosfohexomutases, que contêm três domínios funcionais característicos

[o centro activo, o local de ligação a iões metálicos (ex. Mg 2+) e o local de ligação ao

substrato] altamente conservados quer em bactérias, quer em organismos superiores (Videira

et al., 2000).

Um outro gene essencial na biossíntese de gelano denomina-se gelE. Este gene

codifica para uma proteína homóloga a proteínas com actividade de tirosina cinase e encontra-

→→→→ 3)-ββββ-D-Glcp-(1→→→→4)-ββββ-D-GlcpA-(1→→→→4)-ββββ-D-Glcp-(1→→→→4)-αααα-L-Rhap-(1→→→→

(OAc)

(OGl)

6

2

4

se envolvido nos passos finais de polimerização e excreção de gelano . Foi construído um

mutante de eliminação para este gene, tendo-se confirmado a ausência da produção de gelano

nesse mesmo mutante (Moreira et al. 2004).

Um dos objectivos do presente trabalho laboratorial é a introdução por

electrotransformação de um plasmídeo recombinado contendo o gene gelE (pHA010-3) no

mutante de Sphingomonas elodea ∆GelE (SpLM21-4) por forma a avaliar a reposição do

fenótipo mucoso desse mutante. A este processo denomina-se complementação homóloga.

Com o objectivo de demonstrar a complementação heteróloga, vai-se introduzir por

conjugação triparental um plasmídeo recombinado contendo o gene pgmG numa estirpe

mutante para a actividade de PGM de Pseudomonas aeruginosa e observar a reposição do

fenótipo mucoso devido à produção de alginato.

Em trabalhos posteriores ír-se-à obter um fragmento de DNA contendo o gene pgmG

de S. elodea usando a técnica de PCR. Esse fragmento de DNA será posteriormente usado

como sonda em experiências de hibridação de Southern. Finalmente proceder-se-à a estudos

de interacção proteína-proteína usando diversas proteínas envolvidas na biossíntese de gelano.

Fialho AM, Moreira LM, Granja AT, Popescu AO, Hoffman K, Sá-Correia I. (2008). Occurrence, production and applications of gellan: current state and perspectives. Applied

Microbiology and Biotechnology.79:889-900. Moreira LM, Hoffmann K, Albano H, Becker A, Niehaus K, and Sá-Correia I. (2004). The gellan gum biosynthetic genes gelC and gelE encode two separate polypeptides homologous to the activator and the kinase domains of tyrosine autokinases. Journal of Molecular Microbiology and

Biotechnology 8:43-57. Videira, P. A., L. L. Cortes, A. M. Fialho, e I. Sá-Correia. 2000. Identification of the pgmG gene, encoding a bifunctional protein with phosphoglucomutase and phosphomannomutase activities, in the gellan gum-producing strain Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461. Applied and Environmental

Microbiology. 66:2252-2258.

1 gacacgttgctgcgcggttgaggaccgtcctccgcacgtaacattttgccggcaactatg -35

61 ctgcagtgcaaaaattattaatctttccgtgcacggcgcgtcttgaaacttccattcgag

-10

121 tcgcggaaga ggcacgcatc tttaccttcg ggagggcatg a

RBS

162 atgacgcaccgtttcgatccgacgtcgctgcgcgagtacgacatc

M T H R F D P T S L R E Y D I

207 cgcgggatcgtggggaagacgctgggcccggacgacgcccgtgcg

R G I V G K T L G P D D A R A

252 atcggccgcggcttcgcgacgctgctgcgccgcgccggcggccgc

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297 cgggtggcggtgggccgcgatggccgcgtttcctcgccgatgctc

5

R V A V G R D G R V S S P M L

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1512 aagagcggcatcgtccgcggcgagcaggcggcgcattgaggtgcc

K S G I V R G E Q A A H *

aggggca Figura 2- Sequência de nucleótidos do gene pgmG de S. elodea e sequência deduzida de aminoácidos (código de 1 letra). Encontram-se ainda indicadas as potenciais regiões –35 e –10 do promotor e o local de ligação ao ribossoma (RBS).

6

TP1- INTRODUÇÃO DE PLASMÍDEOS RECOMBINADOS EM BACTÉRIAS

Pretende-se com este trabalho ilustrar e comparar dois métodos de introdução de DNA

recombinado em duas espécies Gram-negativas, S. elodea e P. aeruginosa e que são a

electrotransformação e a conjugação triparental (Fialho et al., 1991; Monteiro et al., 1992).

Por recurso à técnica de electrotransformação serão introduzidos no mutante SpLM21-4 de S.

elodea um plasmídeo contendo o gene gelE (pHA010-3) ou o vector onde este gene foi

clonado (plasmídeo pBBR1MCS) de forma o observar (ou não) a reposição do fenótipo

mucoso. Na conjugação triparental, será utilizada a estirpe P. aeruginosa 8858, com o

objectivo de observar a complementação, homóloga ou heteróloga, da mutação que as células

desta estirpe possuem no gene que codifica a actividade de

fosfoglucomutase/fosfomanomutase. Essa complementação será efectuada por introdução dos

plasmídeos recombinados pNZ49 ou pLC100 (contêm os genes algC ou pgmG de P.

aeruginosa ou S. elodea, respectivamente) e clonados no vector de expressão pMMB66(HE).

A complementação será visualizada através da reposição do fenótipo mucoso [capacidade

para produzir o exopolissacárido alginato (May e Chakrabarty, 1994)] no referido mutante de

P. aeruginosa 8858 (algC-).

Monteiro, G. A., A. M. Fialho, S. J. Ripley, e I. Sá-Correia. 1992. Electrotransformation of gellan-gum producing and non-producing Pseudomonas elodea strains. Journal of Applied Bacteriology 72:423-428.

Fialho, A. M., G. A. Monteiro, e I. Sá-Correia. 1991. Conjugal transfer of recombinant plasmids into gellan-gum producing and non-producing variants of Pseudomonas elodea ATCC 31461. Letters of

Applied Microbiology 12:85-87.

May, T. B., e A. M. Chakrabarty. 1994. Pseudomonas aeruginosa: genes and enzymes of alginate synthesis. Trends in Microbiology. 2:151-157.

A. Electrotransformação de Sphingomonas elodea

A electrotransformação tornou-se uma valiosíssima técnica de introdução de DNA quer

em células eucarióticas quer em bactérias, tendo vindo a possibilitar a transformação eficiente

de espécies refractárias à transformação pelo método clássico (incubação com CaCl2 ou

7

outros catiões tais como o Rb+, o K+, seguida de choque térmico). Nesta técnica, as células a

transformar são sujeitas, durante um curto espaço de tempo, a um campo eléctrico de elevada

voltagem. Pensa-se que esta exposição tornará a membrana celular reversivelmente permeável

a macromoléculas permitindo assim a entrada, com elevada eficiência, de DNA plasmídico,

mesmo o de elevado peso molecular. Enquanto que o campo eléctrico usado na

electrotransformação de células de mamíferos e de protoplastos de plantas é de normalmente

0,5 - 1 kV cm-1, o campo eléctrico necessário para a transformação de bactérias (dadas as

suas dimensões diminutas) é muito superior (em média entre 6 - 12,5 kV cm-1). Tal facto

exigiu a introdução de algumas modificações no equipamento usado para a

electrotransformação de bactérias, de modo a permitir o uso dessas grandes voltagens sem

riscos quer para o equipamento quer para o operador.

A electrotransformação é uma técnica de introdução de DNA muito eficiente, rápida,

reprodutível e de fácil execução. Permite o uso, com idêntica eficiência de transformação,

quer de células frescas (usadas logo após centrifugação e suspensas no tampão de

electrotransformação, por exemplo 10 % (v/v) glicerol) quer após congelação (em tampão de

electrotransformação) e armazenamento a - 70 °C, durante vários mêses. A eficiência de

electrotransformação (nº de transformantes / µg DNA) e a frequência de electrotransformação

(nº de transformantes / nº de células viáveis após electrotransformação) dependem de várias

condições experimentais (fase da curva de crescimento em que as células são recolhidas,

concentração das células e composição do tampão usados para a electrotransformação, bem

como variáveis associadas ao aparelho de electroporação, tais como - intensidade do campo

eléctrico e duração do pulso, o qual, por sua vez, depende do valor da resistência introduzida

em paralelo com a resistência da amostra, etc). Depende ainda da dimensão do DNA a

introduzir e da estirpe hospedeira a transformar (nomeadamente do seu sistema de

modificação - restrição).

Neste trabalho, proceder-se-á à introdução em células de S. elodea ∆gelE do vector de

clonagem pBBR1MCS (4,7 kb) e do plasmídeo recombinado pHA010-3 (contendo o gene

gelE de S. elodea e de dimensão 5,4 kb) (Anexo III).

8

TÉCNICA:

I- Preparação de células competentes para electrotransformação

1. Inocular, uma colónia da estirpe SpLM21-4 (∆gelE), em 20 ml de LB. Crescer durante

a noite a 30 °C com agitação constante.

2. Adicionar o pré-inóculo a 750 mL de LB (DO inicial 0,05), e crescer até uma

densidade óptica, determinada a 640 nm, de 1,2 ± 0,1 (12 horas), a qual corresponde a

uma fase avançada do crescimento exponencial.

3. Transferir a cultura para tubos de centrifuga; arrefecer em gelo durante 15 minutos.

4. Centrifugar a cultura durante 15 minutos a 5.000 rpm, a 4°C (Beckman J2 - 21 ; rotor

JA 10).

5. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 500 mL de H2O

desionizada fria.

6. Repetir 4.

7. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 300 mL de H2O

desionizada fria.

8. Repetir 4.

9. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 100 mL de uma

solução fria (em gelo) de 10 % de glicerol (v/v).

10. Centrifugar a cultura durante 10 minutos a 5.000 rpm, a 4°C (Beckman J2 - 21 ; rotor

JA 10).

11. Ressuspender o sedimento em 20 ml glicerol 10 % (v/v) frio.

12. Repetir 10.

13. Ressuspender o sedimento em 10 ml de glicerol 10%(v/v) frio.

10. Dividir a suspensão celular em aliquotas (500 µL) e conservar a -70 °C. Nota: Este procedimento não será efectuado na aula. As células serão fornecidas já preparadas.

9

II- Electrotransformação

1. As células a electrotransformar, após descongelamento lento, deverão ser mantidas em

gelo. As cuvettes para electrotransformação (0,2 cm) deverão também ser previamente

arrefecidas (colocadas a -20 °C durante a noite).

2. Ligar o aparelho de electroporação ("Gene Pulser" da "BioRad" equipado com um

"Pulser controler"). Acertar a voltagem para 2,5 kV, o condensador para 25 µF e a

resistência para 400 Ω.

3. Adicionar às células electrocompetentes 2-5 µl de uma solução de DNA plasmídico em

H2O (cerca de 350 ng). Usar soluções dos plasmídeos pBBR1MCS, e pHA010-3.

Agitar a suspensão, com a ponta da pipeta, tendo o cuidado de não deixar formar bolhas

de ar.

4. Transferir a mistura para a cuvette evitando a formação de bolhas de ar, e colocá-la na

câmara de electrotransformação.

5. Desferir a corrente eléctrica.

6. Retirar a cuvette e adicionar, imediatamente, 2 ml de meio LB à suspensão.

7. Incubar, com agitação, a 30°C durante 2 horas [crescimento das células em meio não

selectivo, durante o tempo correspondente a cerca de uma geração, de modo a permitir a

síntese de proteínas codificadas pelos genes relacionados com as marcas selectivas

associadas ao plasmídeo (por exemplo de resistência a antibióticos)].

8. Plaquear (após diluição apropriada em solução salina) a suspensão celular em placas de

meio S contendo 25 mg/l de cloranfenicol (LB+Cm) para a selecção de transformantes.

9. Plaquear a mesma suspensão, diluída de 10-4 a 10-7, em meio S, para a determinação

do nº de células viáveis totais.

10

10. Incubar, durante 3 dias, a 30 °C, para crescimento dos electrotransformantes.

11. Calcular a eficiência (nº de transformantes / µg de DNA) e a frequência da

electrotransformação (nº de transformantes/nº de células viáveis após

electrotransformação) para cada um dos plasmídeos, nas condições ensaiadas. Observar

ainda se houve ou não reposição do fenótipo mucoso.

B- Transferência de DNA recombinado de Escherichia coli para Pseudomonas

aeruginosa por conjugação triparental

A transferência de DNA plasmídico por conjugação pressupõe contacto físico entre as

células, dadora e receptora. Há plasmídeos que, embora não sendo autotransmissíveis, são

mobilizáveis (como é o caso dos plasmídeos pMMB66(HE), pLC100 e pNZ49, usados neste

trabalho). Isto quer dizer que não apresentam genes (tra), envolvidos no processo de

transferência (responsáveis por exemplo pela síntese do pilus sexual e de outras estruturas de

superfície que permitem o contacto físico entre as duas células envolvidas) mas que

apresentam os genes (mob) que codificam para funções envolvidas na sua mobilização entre

células. Neste caso, é necessário recorrer a um plasmídeo "ajudante" que, por ser conjugativo,

vem mediar a transferência de plasmídeos mobilizáveis por conjugação. Neste trabalho, usar-

se-á o plasmídeo pRK2013 (plasmídeo conjugativo) em E. coli HB101, que será uma terceira

estirpe (a estirpe ajudante) a qual participará num processo de acasalamento que envolverá

assim as 3 estirpes (dadora, receptora e ajudante). Estas serão para tal colocadas em contacto

sobre um filtro que retém bactérias (porosidade = 0, 45 µm).

O sistema descrito é geralmente utilizado para introduzir plasmídeos mobilizáveis em

espécies que não são transformáveis com uma eficiência razoável, ou que são mesmo

refractárias à transformação clássica, não sendo possível proceder à sua electrotransformação.

Os plasmídeos usados neste trabalho (pMMB66(HE), pLC100 e pNZ49) têm uma vasta

gama de hospedeiros entre as bactérias Gram-negativas podendo assim replicar quer em E.

11

coli , a célula dadora, quer em P. aeruginosa, que neste trabalho funciona como célula

receptora.

TÉCNICA :

1. Inocular e incubar, durante a noite, a 37 °C e com agitação vigorosa, em meio LB

contendo o antibiótico indicado pela marca selectiva do plasmídeo (Anexo I, Tabelas I e

II), as seguintes bactérias:

a ) Escherichia coli HB101/ pRK2013

b) Pseudomonas aeruginosa 8858

c) Escherichia coli HB101/pMMB66(HE)

d) Escherichia coli HB101/pLC100

e) Escherichia coli HB101/pNZ49

- O plasmídeo conjugativo pRK2013 contém a marca de resistência a canamicina (Km)

pelo que se deverá adicionar 50 mg/l deste antibiótico ao meio de cultura. Os plasmídeos

pMMB66(HE), pLC100 e pNZ49 (anexo III) conferem resistência à ampicilina, pelo que este

antibiótico deverá ser adicionado ao meio de cultura (Anexo II. B.).

1. Lavar as células com solução salina (NaCl 0,9%(v/v)) para eliminar restos dos

antibióticos.

2 Para mobilizar os plasmídeos pMMB66(HE), pLC100 ou pNZ49 para dentro de células

de P. aeruginosa 8858, proceder às seguintes misturas (A a C), de 3 culturas num tubo

eppendorf:

P. aeruginosa 8858 (0,5 ml)

A E. coli HB101/pRK2013 (0,1 ml)

E. coli DH1 / pMMB66(HE) (0,2 ml)

12

P. aeruginosa 8858 (0,5 ml) P. aeruginosa 8858 (0,5 ml)

B E. coli HB101 / pRK2013 (0,1 ml) C E. coli HB101/pRK2013 (0,1 ml)

E. coli DH1 / pLC100 (0,2 ml) E. coli DH1 / pNZ49 (0,2 ml)

4. Centrifugar 1 min, ressuspender as células no líquido que fica no eppendorf e aplicar

sobre um filtro estéril colocado num placa de LB sólido. Incubar a 30°C entre 6 a 18 h.

5. Ressuspender as células que cresceram sobre a membrana em 1 ml de uma solução estéril

de cloreto de sódio (0,9% p/v) (solução salina) contida em tubo de ensaio, mediante forte

agitação (vórtex).

6. No caso de P. aeruginosa 8858 (misturas A, B e C) plaquear em placas de meio PIA

(anexo II) suplementado com 500 mg/l de carbenicilina, a suspensão celular obtida em 5.

após diluição dessa mesma suspensão de 10-1 a 10-3 em solução salina estéril. Plaquear

ainda (após diluição entre 10-4 e 10-7 em solução salina) a mesma suspensão celular em

placas de meio PIA para determinação do número de células viáveis.

Nota: Dado que E. coli não cresce em meio PIA e que P. aeruginosa é naturalmente resistente

a ampicilina, as placas de PIA contendo carbenicilina visam seleccionar os transconjugantes

de P. aeruginosa 8858 que contêm os plasmídeos pMMB66(HE), pLC100 ou pNZ49.

7. Incubar, durante 2 a 3 dias, a 30 °C, para crescimento dos transconjugantes.

8. Calcular a frequência de conjugação (nº de transconjugantes/nº de células viáveis após

conjugação) para cada plasmídeo, nas condições ensaiadas.

9. Registar, no caso dos tranconjugantes de P. aeruginosa 8858, a reposição do fenótipo

mucoso produtor do exopolissacárido alginato, resultante da ocorrência de complementação

homóloga (pNZ49) ou heteróloga (pLC100).

13

Anexo I

TABELA I - ESTIRPES BACTERIANAS

Estirpe Fenótipo / Genótipo

S. elodea SpLM21-4 Gelano-; gelE-

P. aeruginosa 8858 Alginato-, algC-

E. coli HB101 F-, hsdR , hsdM , recA

TABELA II - PLASMÍDEOS

Plasmídeo Hospedeiro Descrição

pHA010-3 - gene gelE, Cmr

pBBR1MCS - vector, Cmr

pMMB66HE E. coli HB101 vector, Apr

pLC100 E. coli HB10 gene pgmG, Apr

pNZ49 E. coli HB101 gene algC, Apr

pRK2013 E. coli HB101 Kmr, tra+ Anexo II

A- Meios de cultura Os meios de cultura são esterilizados em autoclave (15 minutos,120 °C).

Meios líquidos Meio LB (pH 7,5) líquido (g/l) NaCl 5 g Peptona (Difco) 10 g Extracto de levedura (Difco) 5 g

14

Meios sólidos

Os meios sólidos usados são idênticos aos meios líquidos aos quais se adicionou 20 g de agar por litro. O meio PIA é uma formulação comercial, sendo apenas necessário juntar 45 g de PIA, 20 ml de glicerol, perfazer o volume a 1 litro e esterilizar. Meio S (pH 7,4) ( g / l)

Na2HPO4 10 g

KH2PO4 3 g

K2SO4 1 g

NaCl 1 g

MgSO4.7H2O 0,2 g

Hidrolisado de caseina (Difco) 1 g

Extracto de levedura (Difco) 1 g

Glucose * 20 g

CaCl2.2H2O * * 0,01 g

FeSO4.7H2O * * 0,001 g

* A glucose (tal como os outros açúcares) é esterilizada sempre em separado ** Soluções concentradas (10x) de CaCl2 e FeSO4 são esterilizadas,

individualmente, e em separado dos outros componentes do meio.

B. Antibióticos

Meio sólido (mg/l) Meio líquido (mg/l)

Ampicilina 150 75

Canamicina 100 50

Carbenicilina 500 -

Cloranfenicol 25 -

Os meios selectivos são preparados por adição de soluções concentradas dos

antibióticos (esterilizados por filtração) de modo a se obterem as concentrações acima indicadas. A concentração de antibiótico a usar para a preparação dos meios líquidos será metade da concentração usada em meio sólido.

15

Anexo III – Mapas de restrição dos plasmídeos pMMB66(HE), pLC100, pNZ49 e pHA010-3.

702 pbgelE

pBBR1MCS

4,7 kb

Plac

CmR

β-gal

KpnI HindIII

pHA010-3 (gelE)

B

702 pbgelE

pBBR1MCS

4,7 kb

Plac

CmR

β-gal

KpnI HindIII

pHA010-3 (gelE)

B

702 pbgelE

pBBR1MCS

4,7 kb

Plac

CmR

β-gal

KpnI HindIII

pHA010-3 (gelE)

702 pbgelE

pBBR1MCS

4,7 kb

Plac

CmR

β-gal

KpnI HindIII

pHA010-3 (gelE)

702 pbgelE

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β-gal

KpnI HindIII

pHA010-3 (gelE)

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