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LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil

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GENÉTICA DE COMPONENTES NUTRACÊUTICOS EM SOJA

Aluno: Philip Traldi WysmierskiOrientador: Prof. Dr. Natal Antonio Vello

Roteiro

n Introdução

n Nutracêuticos presentes na sojaq Caracterização

q Benefícios para a saúdeq Benefícios para a saúde

q Genética

n Conclusão

Introdução

“O homem é aquilo que come”Ludwig Andreas FeuerbachLudwig Andreas Feuerbach

Filósofo alemão

1863

Introdução

n OMS:q 2004-2030:

n Doenças cardiovasculares:q 17,1 milhões para 23,4 milhões (36%)

n Câncerq 7,4 milhões para 11,8 milhões (59%)

n Custo:q Doenças cardiovasculares 2009/ EUA: 475,3

bilhões de dólares (diretos e indiretos)

n Fatores de risco: alimentaçãoFonte: OMS, 2008

Introdução

n Alimentos: benefícios além dos nutrientes

n O que são componentes nutracêuticos?q “Qualquer substância que faz parte de um

alimento que fornece benefícios médicos e/ou de alimento que fornece benefícios médicos e/ou de saúde, incluindo a prevenção e tratamento de doenças”.

+

SCHMIDL; LABUZA, 2000.

Nutracêuticos na Soja

n Os componentes nutracêuticos abordados:q Isoflavonas

q Saponinasq Saponinas

q Peptídeos Bioativos

n Outros:q Ômega-3 e -6; inibidores de

proteases; fitoesteróis etc.

ISANGA; ZHANG, 2008.

ISOFLAVONAS

Caracterização

n Fenóis heterocíclicos

n Estrógeno → receptores

n Identificados 12 tiposq 3 grupos

n Genisteínan Daidzeínan Gliciteína

q 4 formas químicasn Agliconasn β-Glicosídeosn Acetilglicosídeos n Malonilglicosídeos

Agliconas

Fonte: ISANGA; ZHANG, 2008; CHENG et al., 2008.

71-92%

R3

R2

Glicose

R1

Substância R1 R2 R3

Daidzeína Ausente H HDaidzeína Ausente H H

Genisteína Ausente H OH

Gliciteína Ausente OCH3 H

Daidzina H H H

Genistina H OCH3 H

Glicitina H H OH

6''-O-malonildaizina COCH2COOH H H

6''-O-malonilgenistina COCH2COOH OCH3 H

6''-O-malonilglicitina COCH2COOH H OH

6''-O-acetildaidzina COCH3 H H

6''-O-acetilgenistina COCH3 OCH3 H

6''-O-acetilglicitina COCH3 H OH Fonte: OKUBO et al., 1992

Caracterização

n Semente: (vacúolo)q Glicosídeosq Malonilglicosídeos

n Aglicona → atividade fisiológican Eixo embrionário (gliciteína)n Eixo embrionário (gliciteína)n Função: nodulação e defesa patógenosn Fatores ambientaisq Temp. alta → reduz isoflavonas (cotilédones)q Maturaçãoq Irrigação

Fonte: MURPHY et al., 2009; HOECK et al., 2000.

Fenilalanina

Fenilalanina amônia-liase

Cinamato

Cinamato 4-hidrolase

p-Coumarato

4-Coumarato-CoA ligase

Caracterização Representação da via fenilpropanóide

4-Coumarato-CoA ligase

p-Coumaril-CoAChalcona sintetase

Chalcona redutase

4,2’,4’-trihidroxychalcona 4,2’,4’,6’-tetrahidroxychalcona

Chalcona isomerase

Liquiritigenina Naringenina

Isoflavona sintase

Daidzeína GenisteínaFonte: WILSON et al., 2004. IFS1 IFS2

Benefícios para a saúde

n Atividade hormonalq Câncer de mama

q Osteoporose

q Sintomas menopausaq Sintomas menopausa

n Doenças cardiovascularesq Redução de colesterol

n Antioxidante

n Câncer de próstata

Fonte: BERGER et al., 2008.

Genétican 1000 a 3000 µg/g sementes

n 500 a 5500 µg/g sementes

n Caráter quantitativoq Distribuição contínua

q Ambienteq Ambiente

n Interação genótipo x ambienteq Complexa

q Simples (estabilidade relativa)

Fonte: HOECK et al., 2000; MORRISON et al., 2008; CHENG et al., 2008.

Genétican BARC-8 q ↓ isoflavona;

q ↑ proteína;

n IAC-100 q ↑ isoflavona; q ↑ isoflavona;

q proteína;

n F1 → F2 → F3

Fonte: CHIARI et al., 2004.

Herdabilidade sentido amplo: 40 a 90%

Genética


Genétican BARC-8 x IAC-100q F1; F2; RC1 e RC2 (recíprocos)

n Genes citoplasmáticos; nucleares e interação.


Genética

Daidzina 6’’-O-malonildaidzina Genistina 6’’-O-malonilgenistina

Fonte (R²)% (R²)% (R²)% (R²)%

Média 31,65 83,15 49,13 50,35

Efeito aditivo 45,34 9,89 3,57 41,27


Efeito aditivo 45,34 9,89 3,57 41,27

Efeito dominante 1 1,77 5,63 0,16

Efeito citoplasmático 0,87 4,84 20,39 0,73

Epistasia c x a 15,25 0,11 18,36 2,67

Epistasia c x d 5,89 0,24 2,91 4,82

Total 100 100 100 100

Genética

Cot.

2003 2004 2005

Emb.

Fonte: BERGER et al., 2008.

Genétican Associação SNPs e Isoflavonasq 33 genótipos: 16 G. soja e 17 G. max

q SNPs nos genes IFS1 (3) e IFS2 (2) - (P<0,05)

q Isoflavona total e individual

Fonte: CHENG et al., 2008.

SAPONINAS

Caracterização

n Triterpenóidesq Terpeno 30C → via do acetato-mevalonato

n Grupos de carboidratosq Ligação éter ou éster

n Soja: 0,2% a 0,5% de saponina

n Eixo embrionário: 0,6% a 7,2%

n > 20 saponinas descritas

n Saponinas da sojaq Grupo A → presente no eixo embrionário

q Grupo B → presente no eixo embrionário e cotilédones (DDMP) (outras espécies)

Fonte: BERHOW et al., 2006; RUPASINGHE et al., 2003.

Caracterização - Precursores

Triterpenóides

Mono ou oligo-sacarídeos

Fonte: RUPASINGHE et al., 2003

Fonte: BERHOW et al., 2006.

Tabela 1 – Nomenclatura de Saponinas


Caracterização

n Grupo A → sabor amargoq Composição variável

n Grupo B → propriedades bioativasq Composição mais estávelq Composição mais estável

n Cultivar, local, ano e maturidade


Benefícios para a saúde

n Atividade:q Quimioprotetora

q Hipocolesterolêmica

q Imunoestimulatóriaq Imunoestimulatória

q Antiviral (HIV)

q Anticarcinogênica

q Anti-inflamatória

Fonte: BERHOW et al., 2006; ISANGA; ZHANG, 2008.

Genética

n Saponinas Grupo Aq Cultivar Shirossenari (saponina Aa)

q Cultivar Suzuyutaka (saponina Ab)

q F1 → 100% fenótipo Aa-Ab

F → 1:2:1q F2 → 1:2:1

n 801 cultivares do Japão

n 330 acessos de Glycine soja

n Somente cultivar A – b(F) não apresentava saponina grupo A acetilada → desacetilada

Fonte: SHIRAIWA et al., 1990; KIKUCHI et al., 1999

Genétican Cultivar Shirossenari x A – b(F)

→ F1 (saponina Aa) → F2 → segregação 3:1

n Cultivar Suzuyutaka x A – b(F)

→ F1 (saponina Ab) → F2 → segregação 3:1

Ausência Aa e Ab → um alelo recessivon Ausência Aa e Ab → um alelo recessivoq Saponina Aa → Sg – 1a

q Saponina Ab → Sg – 1b

q Saponina desacetilada → sg - 10

n Papel fisiológico saponina grupo A acetilada

Fonte: SHIRAIWA et al., 1990; KIKUCHI et al., 1999

GenéticaGene Características

Posição C-22 do sapogenol A

Sg-1a xilosilação β(1→3) da arabinose do C-22

Sg-1b glicosilação β(1→3) da arabinose do C-22

sg-10 ausente

Sg-2acetilação dos grupos hidroxila dos grupos glicosil ou xilosil

ligados à arabinose do C-22

Fonte: Tsukamoto et al., 2004

1

2sg-2 ausente

Posição C-3 dos sapogenois

Sg-3glicosilação β(1→2) dos grupos galactosil e arabinosil ligados ao

GlcUA do C-3

sg-3 ausente

Sg-4 arabinosilação α(1→2) do GlcUA do C-3

sg-4 ausente

Sapogenol A

Sg-5 Sapogenol A presente no hipocótilo da semente

sg-5 Sapogenol A ausente no hipocótilo da semente

2

3

4

5

Sg-5Sapogenol A

AcetilaçãoSg-2

Xil Sg-1a

Glc Sg-1b

sg-10

Ara Sg-4

Glc Sg-3


Fenótipo Genótipo

Aa Sg-1a/Sg-1a Sg-2/Sg-2 Sg-3/Sg-3 sg-4/sg-4 Sg-5/Sg-5

Ab Sg-1b/Sg-1b Sg-2/Sg-2 Sg-3/Sg-3 sg-4/sg-4 Sg-5/Sg-5

AcAf Sg-1b/Sg-1b Sg-2/Sg-2 sg-3/sg-3 sg-4/sg-4 Sg-5/Sg-5

A0 sg-10/sg-10 Sg-2/Sg-2 Sg-3/Sg-3 sg-4/sg-4 Sg-5/Sg-5

AaAb Sg-1a/Sg-1b Sg-2/ - Sg-3/ - sg-4/sg-4 Sg-5/ -AaAb Sg-1a/Sg-1b Sg-2/ - Sg-3/ - sg-4/sg-4 Sg-5/ -

AaBc Sg-1a/Sg-1a Sg-2/Sg-2 Sg-3/Sg-3 Sg-4/Sg-4 Sg-5/Sg-5

AbBc Sg-1b/Sg-1b Sg-2/Sg-2 Sg-3/Sg-3 Sg-4/Sg-4 Sg-5/Sg-5

A0Bc Sg-1b/Sg-1b sg-2/sg-2 Sg-3/Sg-3 Sg-4/Sg-4 Sg-5/Sg-5

A0Bc-S Sg-1a/Sg-1a Sg-2/Sg-2 Sg-3/Sg-3 Sg-4/Sg-4 sg-5/sg-5

AaAbBc Sg-1a/Sg-1b Sg-2/ - Sg-3/ - Sg-4/ - Sg-5/ -


PEPTÍDEOS BIOATIVOS

Caracterização

n Possuem algum efeito biológico

n Podem existir naturalmente ou ser derivados da digestão ou fermentação de alimentos

n Geralmente são curtosn Geralmente são curtos

n Resistentes à ação de peptidases

Fonte: ISANGA; ZHANG, 2008; MEJIA et al., 2004.

Caracterizaçãon Principais proteínas de reserva da soja:

q β-conglicinina (globulina 7S) q Glicinina (globulina 11S)

n Representam 85% da proteína totaln β-conglicinina: 3 subunidades (apresenta 4% carboidratos)

q Alfa’q Alfaq Betaq Beta

n Glicinina: 6 subunidadesn Outras: lipoxigenases, lectinas, inibidores de tripsina e alfa-

amilases.

Fonte: ISANGA; ZHANG, 2008; GIBBS et al., 2004.

Caracterização

n Gibbs et al., (2004): peptídeos bioativos em alimentos fermentados de soja após digestão com enzimas proteolíticas.q Glicinina: precursora de 95% dos peptídeos bioativos

encontradosq β-conglicinina: resistiu à digestão

n Yoshikawa et al., (1999): encontraram o peptídeo bioativo LPYPR na subunidade A5A4B3 da glicinina

n Galvez; de Lumen (1999): lunasina – subunidade menor de uma albumina 2S (α-conglicinina de cotilédones de soja).

Fonte: GIBBS et al., 2004.

Benefícios para a saúden Propriedades

q Antioxidante;q Tensoativa;q Anti-trombótica;q Inibição da ACE (enzima conversora de angiostenina) – efeito

cardioprotetor;

β-conglicinina: n β-conglicinina: q Inibe crescimento de células de leucemia in vitroq Subunidade α’ - redução de colesterol e triglicerídeos in vivo

n LPYPR: reduz colesterol

n Lunasina:q Prevenção de câncer in vivo

Fonte: GIBBS et al., 2004

Genética - Glicinina e beta-conglicinina

n Aumentando o conteúdo de glicinina, pode-se aumentar número de peptídeos bioativos.

n Glicinina e β-conglicinina: em geral, apresentam correlação inversaapresentam correlação inversa

n Existem cultivares com elevados níveis de glicinina ou β-conglicinina disponíveis

n Cultivar Kyu-kei 305 apresenta apenas glicinina como proteína de reserva


n β-conglicinina: família gênica – 15 membros (altamente homólogos);

n Glicinina: família gênica – 6 membros (Gy1 a Gy6);Gy6);

Fonte: WILSON, R.F, 2004.


n Objetivo: determinar efeitos genéticos e ambientais sobre o teor de beta-conglicinina e glicinina em cultivares de soja brasileiras

n Materiais e métodos:Experimento 1: variação genéticaq Experimento 1: variação genétican 90 cultivaresn 1 local

q Experimento 2: efeitos de local de cultivon Cultivar Conquista (MG/BR 46) em 16 locaisn Cultivar IAS 5 em 12 locais

Fonte: CARRÃO-PANIZZI et al., 2008


n Experimento 1:q Variabilidade significativa para ambas proteínas

q Beta-conglicinina apresentou maior variabilidade

q É possível alterar a composição de proteínas e q É possível alterar a composição de proteínas e suas subunidades sem alterar o conteúdo total de proteína (concorda com outros trabalhos)

n Experimento 2:q Existe diferença significativa entre locais

q Influência do ambiente

Genética - LPYPR e outrosn Objetivos: inserir várias cópias de peptídios bioativos para

aumentar concentraçãoq Novokinina: hipotensivoq LPYPR: redutor colesterolq Rubiscolina: memória

n Materiais e métodos:q Vetor de transformaçãoq 4 cópias de novokinin (tipo I)q 7 cópias de LPYPR (tipo II)q 7 cópias de LPYPR e 7 cópias de Rubiscolina (tipo III)q Inseridos na subunidade α’ da β-conglicinina (região de extensão)q Alteração de aminoácidos para melhorar sua liberação na

digestão

Fonte: NISHIZAWA et al., 2008.

n Figura de Nishizawa


Genética - LPYPR e outrosn As proteínas foram detectadas em pelo menos 2

plantas transgênicas independentes para cada caso.n Quantificação:

q Tipo I: 0,1 a 0,2% da subunidade modificada na proteína extraída (1,0 a 2,0 µg novokinin/ 100mg sementes)

q Tipo II: 0,05% da subunidade modificada na proteína Tipo II: 0,05% da subunidade modificada na proteína extraída (1,0 µg LPYPR/ 100mg sementes)

q Tipo III: <0,05% da subunidade modificada na proteína extraída (<1,0 µg Rubiscolina e LPYPR/ 100mg sementes)

n Não foram testados os efeitos farmacológicos in vivo.n Estimação: apenas Tipo I produziria efeitos

significativos


Lunasina

n 144 acessos de soja do USDA: q 0,1g a 1,33g de lunasina por 100g de farinha

desengordurada.

q Genótipos ancestrais e exóticos.Genótipos ancestrais e exóticos.

Fonte: MEJIA et al., 2004.

Lunasina - Estrutura

Fonte: HERNÁNDEZ-LEDESMA; HSIEH; de LUMEN, 2009.

Lunasina

n Objetivo:q Avaliar a influência de cultivares e de condições ambientais

sobre a concentração de lunasinan Material e método:

q 5 cultivaresq Casa de vegetação

3 regimes de temperatura:q 3 regimes de temperatura:n Baixo: 13/23ºCn Médio: 18/28ºCn Alto: 23/33ºC

q 2 regimes de umidade do solon Alto (70% da capacidade de campo)n Baixo (30% da capacidade de campo)

q 5 repetições

Fonte: WANG et al., 2008.

Resultados

Problemas

“Muitas pessoas não gostam de comer verduras – e o sentimento é mútuo.”

n Plantas se protegemn Plantas se protegem

n Alguns destes compostos são benéficos (dose)

Fonte: DREWNOWSKI 2008; GOMEZ-CARNEROS, 2000.

Problemasn Alguns compostos bioativos → sabor amargon Consumidores

q 50 tipos receptores → amargoq Alta sensibilidade:

n PTC: 25 µmol/Ln Sacarose: 10.000 µmol/L

n Melhoramento → removern Sabor versus saúden Sabor versus saúde

q Isoflavona: genisteína → sabor amargoq Saponinas → adstringente

n Solução → “pílulas”n Toxicidade:

q Saponina: ruptura da membrana celular ou apoptoseq Isoflavonas: anormalidades no sistema imunológico;

desenvolvimento do feto e infância.

Fonte: DREWNOWSKI; GOMEZ-CARNEROS, 2000; ISANGA; ZHANG, 2008.

Conclusões

Genética

+

Ambiente

+

Consumidor

+ Interações

Referências Bibliográficasn BERGER,M.; RASOLOHERY, C.A.; CAZALIS,R.; DAYDÉ,J. Isoflavone accumulation kinetics in soybean seed

cotyledons and hypocotyls: distinct pathways and genetic controls. Crop Science, 48, p.700-708, 2008.n BERHOW,M.A.; KONG,S.B.; VERMILLION,K.E.; DUVAL,S.M. Complete quantification of group A and group B

soyasaponins in soybean. J. Agric. Food Chem., v.54, p.2035-2044, 2006.n CARRÃO-PANIZZI,M.C.; KWANYUEN,P.; ERHAN,S.Z.; LOPES,I.O.N. Genetic variation and environmental effects

on beta-conglycinin and glycinin content in Brazilian soybean cultivars. Pesq. Agropec. Bras., v.43, n.9, p.1105-1114, 2008.

n CHENG,H.; YU,O.; YU,D. Polymorphisms of IFS1 and IFS2 gene are associated with isoflavone concentrations in soybean seeds. Plant Science, v. 175, p.505-512, 2008.

n CHIARI, L.; PIOVESAN,N.D.; NAOE,L.K.; JOSÉ,I.C.; VIANA,J.M.S.; MOREIRA,M.A.; BARROS,E.G. Genetic parameters relating isoflavone and protein content in soybean seeds. Euphytica, 138, p.55-60, 2004.

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n WILSON, R.F. Seed composition. In: BOERMA, H.R.; SPECHT, J.E. Soybeans: improvement, production and uses. 3ª ed. 2004

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