Apresentador: Gabriel Moreira Duarte

Gene Sge1 de Verticillium dahliae um regulador importante para a expressão de genes candidatos

efetores

Instituto Federal Goiano câmpus UrutaíCurso de Agronomia

Disciplina de Fitopatologia I

SANTHANAM, P.; THOMMA, B. P. H. J. Verticillium dahliae Sge1 DifferentiallyRegulates Expression of Candidate Effector Genes. Molecular Plant-MicrobeInteractions Vol. 26, No. 2, 2013.

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Introdução

• Genes efetores: moléculas segregadas que tem como alvo afisiologia do hospedeiro, de modo que ele torna-se suscetível àinfecção;

• Normalmente, os efetores de fungos são poucos expressados forado hospedeiro e são induzidos no momento da penetração;

• Foi proposto que a ação do nitrogênio nas plantas, induz aprodução de um gene efetor;

•Recentemente, um regulador de transcrição, que é importante parainfecção precoce foi identificado em raízes de tomate infectadas pelofungo Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici onde foi descoberto ogene Sge1 desse fungo;

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• Os patógenos humanos no caso de Candida albicans e Histoplasmacapsulatum, os reguladores de transcrição Wor1 e Ryp1,respectivamente, foram identificados como principais reguladoresmorfológicos que está associado com a habilidade de causar doença;

• No caso dos patógenos necrotróficos como Botrytis cinerea , ogene FoSge1 que é homólogo de B. cinerea Reg1 (BcReg1), éimportante para a produção de conídios e para a patogenicidade emfolhas de feijão;

• O fungo hifomiceto Verticillium dahliae causa murchas vascularesem centenas de espécies de plantas dicotiledôneas;

• O Ciclo de hospedeiros de V. dahliae também incluem tomate aoqual é colonizado por F. oxysporum f . sp . Lycopersici;

Introdução

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5Fonte:

Fonte: www.wikipedia.com .br, 2014.

6Fonte: www.wikipedia.com .br, 2014.

Objetivos

Neste estudo, foram investigados o papel do V. dahliae comohomólogo de F. oxisporum e avaliou o seu papel na virulência dospatógenos e na regulação da expressão de genes efetores.

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Material e métodos

1- Analises Filogenéticas

• As análises filogenéticas de VdSge1 com homólogos de outrosespécies de fungos foram realizados usando a web Phylogeny;

• As sequências foram alinhadas e a árvore filogenética foiconstruída usando o programa PhyML (método da máximaprobabilidade).

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2- Transformações Fúngicas

• Transformação de Agrobacterium tumefaciens- mediada de V.dahliae foram realizadas e os transformantes foram selecionados emBDA completadas com cefotaxima a 200 μg/mL e higromicina a 50μg/mL;

• A recombinação foi verificada por PCR (reação em cadeia dapolimerase);

• Transformantes de complementação foram selecionados em BDAcompletadas com cefotaxima a 200 μg/mL e de fleomicina a 100μg/mL.

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3- Ensaios de Patogenicidade

• Os ensaios foram realizados com tomate (Moneymaker) com 10dias de desenvolvimento;

• Os sintomas da doença foram marcados até o 14 dia e ImageJ foiusado para determinar a área de cobertura;

• Para determinar a colonização das plantas, seções na altura doprimeiro internódio foram cortadas, a sua superfície esterilizada ecolocado em meio BDA suplementado com cloranfenicol a 50 μg/mL,e incubou-se a 22 ° C;

• Todos os ensaios de patogenicidade foram realizados três vezes deforma independente com seis plantas de cada genótipo, e ensaios deplaca foram realizados por dois experimentos biológicos emtriplicata.

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4- Crescimento, Conidiogênese e Testes de Germinação

• O crescimento radial foi monitorado colocando uma gota de 2 μlde uma suspensão de conídios (106 conídios/ml) no centro de umBDA ou placa de ágar de Czapek-Dox, com incubação dasuspensão a 22 ° C, medindo o diâmetro das colônias após 10

dias;

• Para a quantificação da produção de conídios, tampões de ágarforam tomadas a partir da colônia de fungos usando uma sonda eos conídios foram contados num hemocitómetro;

• Dois experimentos biológicos foram realizadas em triplicata paracada genótipo. Para determinar a taxa de germinação, 106conídios/mL foram inoculados em meio Czapek-Dox, a 22 ° C

durante 24 h.

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4- Análise da Expressão Gênica

• Conídios foram inoculados em 30 mL de meio MS suplementadocom vitaminas e cinetina a 0,1 mg/litro, de tal modo que aconcentração final foi de 107 conídios/mL;

• Após 4 dias de incubação a 25 ° C, as culturas foram colhidas e

processadas por centrifugação e liofilizadas. O RNA total foi isolado eutilizado para transcriptase reversa;

• O cDNA resultante foi diluído 10 vezes e usadas como modelo paraa expressão de perfis de Ave1;

• Para determinar a expressão da planta em VdSge1, mudas detomate com 10 dias de idade foram inoculadas. E as plantas foramcolhidas aos 4, 8, 12 e 16 dias, congelando-as em nitrogênio líquido.Após a moagem, com 100 mg de material de solo, foi usada paraextração de RNA total e a síntese de cDNA.

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Resultados e Discussões

Figura 1. A- Alinhamento de Verticillium dahliae Sge1 (VdSge1) com homólogosde outras espécies fúngicas.

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Figura 2. B- Árvore filogenética de VdSge1 com homólogos de outras espéciesde fungos.

Figura 2. Eliminação sistemática de Verticillium dahliae Sge1 (VdSge1) resulta na morfologia da colônia alterada e produção reduzida de conídios. 15

Figura 3. Verticillium dahliae Sge1 (VdSk1) é necessária para a patogenicidade deV. dahliae em tomate (Moneymaker).

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Conclusões

• Os efeitos da exclusão de VdSge1 no crescimento vegetativo,bem como sobre a produção de conídios podem afetarsignificativamente a patogenicidade, pois a produção e liberação deconídios é um passo crucial na colonização dos vasos do xilema dohospedeiro;

• Embora o papel de metabólitos secundários na patogenicidade demurchas vasculares dos patógenos F. oxysporum f. sp. lycopersici eV. dahliae é menos clara, um efeito significativo na patogenicidadenão pode ser excluída;

• Após a eliminação sistemática de VdSge1, houve alteraçõessignificativas na pigmentação do micélio e na secreção dessespigmentos.

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