estudo de produtos de abortamento: avaliação da expressão dos … · 2019-06-06 · estudo de...

Dissertação para a candidatura ao grau de

Mestre em Biologia Celular e Molecular

submetida à Faculdade de Ciências da

Universidade do Porto.

O presente trabalho foi desenvolvido sob a

orientação científica da Professora Doutora

Sofia Dória Príncipe dos Santos Cerveira e

foi realizado no Departamento de Genética

da Faculdade de Medicina da Universidade

do Porto.

“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água

no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota.”

Madre Teresa de Calcutá

FCUP Estudo de produtos de abortamento: Avaliação da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C

VII

Agradecimentos

Ao Prof. Doutor José Pissarra, diretor do Mestrado em Biologia Celular e Molecular da

Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, pelo trabalho realizado em prol

deste mestrado. Ao restante corpo docente, agradeço os ensinamentos e a

experiência que nos transmitiram.

Ao Departamento de Genética da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto,

na pessoa do seu diretor Prof. Doutor Alberto Barros, por me ter acolhido e pela

disponibilização de todos os materiais e equipamentos para a realização da presente

dissertação. Obrigada pelo voto de confiança.

À Prof. Doutora Sofia Dória, orientadora desta dissertação, agradeço a confiança que

depositou em mim. Estou também grata pelo acompanhamento disponibilizado ao

longo das diferentes etapas deste trabalho e pelo apoio nas dúvidas e inseguranças

que me foram surgindo.

À Dra. Vera Lima, co-orientadora desta dissertação, agradeço a amizade, o apoio, os

ensinamentos e os bons conselhos que me foi transmitindo desde que nos

conhecemos. Agradeço também a disponibilidade, a orientação e a revisão desta

dissertação

Aos restantes colaboradores do Departamento de Genética, obrigada pelo apoio na

realização deste trabalho. Um agradecimento especial à Dra. Ana Paula Neto pela

ajuda na realização do QF-PCR, bem como pela disponibilidade e paciência que

sempre demonstrou. À Prof. Doutora Filipa Carvalho agradeço as críticas construtivas

que me ajudaram a melhorar o meu trabalho.

Um agradecimento muito especial a todos os casais que participaram neste estudo,

pela sua disponibilidade, simpatia e boa-vontade.

À minha turma, Mestrado em Biologia Celular e Molecular 2011/2013, pelos excelentes

momentos que fomos partilhando.

Aos meus amigos, em especial à Eduarda, Marta e Tânia, pela compreensão e pelas

palavras de incentivo. Obrigada por me perdoarem tantas ausências!

À Liliana, minha colega de estágio e minha amiga. Obrigada por todo o apoio e ajuda

que tornaram este processo mais simples. Mas, acima de tudo, obrigada por todos os

bons momentos que passamos dentro e fora do Departamento. Obrigada por todas as

conversas, bem humoradas ou mais profundas, por todos os almoços e lanches, pelas


VIII

palavras amigas nos momentos mais complicados. Em suma: obrigada por seres

minha amiga!

A ti, Tiago, obrigada por existires na minha vida!

À minha família, nomeadamente aos meus pais e irmã, pelo apoio incondicional,

mesmo nos meus piores momentos. Aos meus pais, agradeço o exemplo de trabalho

e determinação que contribuiu muito para me incentivar ao longo deste longo caminho.

À minha irmã devo um agradecimento especial pela paciência com que lidou comigo

ao longo desta fase e pela disponibilidade para me ajudar sempre que necessário.


IX

Índice

Agradecimentos VII

Índice IX

Índice de Tabelas XI

Índice de Figuras XIII

Lista de Abreviaturas XV

Resumo XVII

Abstract XIX

I- Introdução 1

1. Aneuploidia 3

1.1. Mecanismos de origem da aneuploidia 3

1.1.1. Meiose 3

1.1.2. Origem pós-zigótica (mitótica) 7

1.1.3. Aneuploidias autossómicas mais frequentes 9

2. Diagnóstico pré-natal de aneuploidias 15

2.1. Técnicas de análise de patologia cromossómica 15

2.1.1. Cariótipo 15

2.1.2. FISH (Hibridação in situ de fluorescência) 16

2.1.3. QF-PCR (Quantitative fluorescent polymerase chain

reaction) 17

2.1.4. MLPA ® (Multiplex ligation-dependent probe

amplification) 18

3. Alteração da expressão génica e aneuploidia 19

3.1. Aneuploidia e instabilidade cromossómica 19

3.1.1. MAD2L2 21

3.1.2. BUB1 22

3.1.3. BUB1B 25

3.1.4. KIF2C 27

II- Objetivos 31

III- Metodologia 35

1. Avaliação da expressão génica de MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C 37

1.1. Obtenção e preparação das amostras 37

1.2. Extração de RNA 37

1.3. Síntese de cDNA 38

1.4. PCR quantitativo em tempo real 38

1.5. Análise dos resultados 39


X

2. Avaliação da origem parental do cromossoma supranumerário em produtos de

abortamento com trissomia dos cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 ou 22 40

2.1. Amostras Biológicas 40

2.2. Extração de DNA 41

2.3. PCR quantitativo de fluorescência 41

2.4. Eletroforese capilar 42

2.5. Análise de resultados 43

IV- Resultados 45




V- Discussão 53




VI- Conclusão 63

VII- Referências Bibliográficas 67

Anexos 77


XI

Índice de Tabelas

Tabela 1: Condições da PCR de transcrição reversa .................................................. 54

Tabela 2: Componentes da reação de PCR quantitativo em tempo real ..................... 55

Tabela 3: Condições de amplificação da QF-PCR ..................................................... 57

Tabela 4: Primers utilizados para os diferentes Short Tandem Repeats ..................... 58

Tabela 5: Informação clínica das amostras selecionadas e média das idades maternas

para cada trissomia .................................................................................................... 64

Tabela 6: Valores normalizados de expressão génica de MAD2L2, BUB1, BUB1B e

KIF2C considerando todas as trissomias em estudo .................................................. 65

Tabela 7: Valores normalizados de expressão génica de MAD2L2, BUB1, BUB1B e

KIF2C, excluindo a trissomia 15 ................................................................................. 66

Tabela 8: Dados clínicos e resultado obtido com a técnica QF-PCR .......................... 67


XIII

Índice de Figuras

Fig. 1: Estimativa da incidência de trissomias com o aumento da idade materna, obtida

por combinação de dados relativos às diferentes trissomias, considerando uma taxa de

abortamento espontâneo de aproximadamente 15%. (Adaptado de Hassold & Hunt,

2001) ............................................................................................................................ 6

Fig. 2: Representação esquemática dos mecanismos causadores de aneuploidia

mitótica (Adaptado de Mantikou et al, 2012) ................................................................. 9

Fig. 3: Cariótipo de indivíduo com trissomia do cromossoma 13 (Imagem cedida pelo

Departamento de Genética/FMUP) ............................................................................. 10

Fig. 4: Cariótipo de um indivíduo com trissomia do cromossoma 18 (Imagem cedida

pelo Departamento de Genética/FMUP) ..................................................................... 12

Fig.5 - Cariótipo de um indivíduo com trissomia do cromossoma 21 (Imagem cedida

pelo Departamento de Genética/FMUP) ..................................................................... 13

Fig. 6: Procedimento de MLPA® (Adaptado de

http://www.invitrotek.com.tr/en/mlpa.asp) .................................................................... 19

Fig.7 - Ciclo de aneuploidia e instabilidade cromossómica. (Adaptado de Potapova et

al 2013)....................................................................................................................... 20

Fig.8 - Localização genómica do gene MAD2L2 (Retirado de

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=MAD2L2) ................................... 21

Fig.9 - Localização genómica do gene BUB1 (Retirado de

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=BUB1&search=bub1) ................. 22

Fig.10 - Funções de Bub1 no checkpoint do fuso mitótico. a) Recrutamento de Mad1 e

Mad2 para os quinetocoros e subsequente formação do complexo MCC. b) Ação

direta de Bub1 fosforilando Cdc20 e impedindo a activação do complexo APC/C.

Adaptado de (Yu & Tang, 2005) ................................................................................. 23

Fig.11 - Ação de BUB1 na protecção da coesão centromérica, contribuindo para

prevenir a separação prematura das cromátides-irmãs. Adaptado de (Yu & Tang,

2005) .......................................................................................................................... 24

Fig.12 - Localização genómica do gene BUB1B (Retirado de

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=BUB1B&search=bub1b) ............ 25

Fig.13 - Localização genómica do gene KIF2C (Retirado de

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=KIF2C) ....................................... 27

Fig.14 - Esquema das fases obtidas após adição de clorofórmio na extracção de RNA

pelo método convencional do TriPure® ....................................................................... 37

Fig.15 - Processo de seleção das amostras fetais a analisar ...................................... 40


XIV

Fig.16 - Picos de fluorescência detetados pelo sequenciador automático ABI 3500 e

analisados pelo software GeneMapper v4.1 para a amostra 9. O painel superior

corresponde ao DNA fetal, sendo visíveis três picos de fluorescência. O painel

intermédio corresponde ao DNA materno e o painel inferior ao DNA paterno,

apresentando ambos dois picos de fluorescência. ...................................................... 41

Fig. 17- Diagramas de extremos-e-quartis dos valores normalizados para os genes

MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C; As caixas representam o intervalo interquartil. A

linha tracejada representa a mediana dos valores de expressão. Os extremos

representam os valores máximos e mínimos observados. .......................................... 41

Fig. 18- Diagramas de extremos-e-quartis dos valores normalizados para os genes

MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C excluindo as amostras com trissomia 15; As caixas

representam o intervalo interquartil. A linha tracejada representa a mediana dos

valores de expressão. Os extremos representam os valores máximos e mínimos

observados. ................................................................................................................ 41


XV

Lista de Abreviaturas

APC- Complexo promotor da anafase

APC/C- Complexo promotor da anafase/ ciclossoma

BUB1- Budding uninhibited by benzimidazole 1

BUB1B- Budding uninhibited by benzimidazole 1 homolog beta

CENP-E - Kinesin like centromere motor protein

CGH- Hibridação Genómica Comparativa

CIN- Instabilidade Cromossómica

DNA- Ácido Desoxirribonucléico

DPN- Diagnóstico Pré-Natal

FISH- Hibridação in situ Fluorescência

GAPDH - gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

KIF2C- Kinesin family member 2C

MAD2L2- mitotic arrest deficient like 2

MCC- complexo de checkpoint mitótico

MLPA®- Multiplex ligation-dependent probe amplification

mRNA- Ácido ribonucleico mensageiro

PCR- Reação em cadeia da polimerase (do inglês Polymerase chain reaction)

QF-PCR- Reação em cadeia da polimerase quantitativa de fluorescência

RNA- Ácido Ribonucleico

SAC- Checkpoint do fuso mitótico (do inglês Spindle assembly checkpoint)

STR’s- Short Tandem Repeats


XVII

Resumo

A aneuploidia, uma das alterações cromossómicas mais comuns na espécie

humana, define-se como perda ou ganho de um ou mais cromossomas. A aneuploidia

constitucional deriva de erros de segregação cromossómica na divisão meiótica,

maioritariamente com origem materna, ou de erros na segregação cromossómica

durante as primeiras divisões mitóticas do embrião. Se a aneuploidia surgir numa

célula diferenciada designa-se por aneuploidia somática adquirida, estando fortemente

associada com o desenvolvimento de diversos tipos de cancro. Uma das hipóteses

propostas para explicar o efeito deletério de ambos os tipos de aneuploidia nos

organismos é a existência de uma relação cíclica entre aneuploidia e instabilidade

cromossómica. A desregulação de genes intervenientes no controlo do ciclo celular é

um dos mecanismos que integram a interação entre aneuploidia e instabilidade

cromossómica.

O objetivo deste trabalho consistiu na avaliação da expressão dos genes

MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C em produtos de abortamento de constituição

cromossómica aneuplóide. Para tal, foi aplicada a técnica de PCR em tempo real a

cinquenta amostras de produtos de abortamento ou tecido fetal com trissomias dos

cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 e 22 e a trinta controlos com cariótipo normal. A

análise dos resultados mostrou que, quando se consideram todas as trissomias, existe

sobre-expressão de BUB1 e BUB1B. A alteração dos níveis de expressão de ambos

os genes tem sido detetada em diversos cancros com instabilidade cromossómica,

sendo este o primeiro trabalho a indicar sobre-expressão destes genes em produtos

de abortamento aneuplóides. Uma vez que o gene BUB1B se localiza no cromossoma

15, realizou-se uma segunda análise excluindo as amostras com trissomia 15, tendo

sido detetada sobre-expressão apenas do gene BUB1. Assim, é provável que a sobre-

expressão inicialmente detetada para BUB1B esteja relacionada com a presença de

uma cópia supranumerária deste gene nas sete amostras com trissomia 15.

Adicionalmente, pretendeu-se determinar a origem parental dos cromossomas

supranumerários em vinte amostras de produtos de abortamento e tecidos fetais

aneuplóides. Com esse objetivo foram recolhidas amostras de DNA de ambos os

progenitores e aplicada a técnica de PCR quantitativo de fluorescência. Os resultados

obtidos estão, na sua maioria, de acordo com os descritos na literatura. Das vinte

amostras analisadas, dezoito casos derivam de origem materna, um tem origem

paterna e foi impossível determinar a origem para uma das amostras devido a

homozigotia dos progenitores.


XVIII

Assim, os resultados deste trabalho contribuíram para o aumento do

conhecimento acerca da aneuploidia em produtos de abortamento e da possível

relação entre a aneuploidia constitucional e a instabilidade cromossómica,

estabelecendo-se, de certa forma, um paralelismo com a aneuploidia adquirida.

PALAVRAS-CHAVE: ANEUPLOIDIA, INSTABILIDADE CROMOSSÓMICA,

BUB1, BUB1B, PRODUTOS DE ABORTAMENTO


XIX

Abstract

Aneuploidy, one of the most common chromosomal alterations on human

species, is defined as gain or loss of one or more chromosomes. Constitutional

aneuploidy results from errors in chromosome segregation during meiotic division, the

majority of which have maternal origin, or from chromosomal missegregation during the

embryo early mitotic divisions. If aneuploidy arises in a differentiated cell it is called

acquired somatic aneuploidy, being strongly associated with the onset of several types

of cancer. One of the hypotheses to explain the deleterious effect of aneuploidies in

organisms is the existence of a cyclical association with chromosomal instability. The

disruption of genes involved in cell cycle control is one of the mechanisms related with

the interaction between aneuploidy and chromosomal instability.

The overall aim of the present study is evaluate the expression pattern of genes

known to be involved in cell-cycle regulation (MAD2L2, BUB1, BUB1B and KIF2C), in

miscarriage products with a confirmed aneuploidy for chromosomes 13, 15, 16, 18, 21

and 22. In order to do that, quantitative Real-Time PCR was performed in fifty samples

and thirty controls with normal karyotype. The results analysis showed that, when all

six trisomies are included, both BUB1 and BUB1B expression levels were upregulated.

The overexpression of these two genes has been detected in several cancers with

chromosomal instability. This is the first work indicating overexpression of BUB1 and

BUB1B in miscarriage products with aneuploidy. Once the BUB1B gene is located on

chromosome 15, a second analysis was performed without trisomy 15 samples. The

results showed upregulation only of BUB1B gene. So, it is likely that the

overexpression initially detected for BUB1B may be related with the presence of a

supranumerary copy of this gene in the seven samples with trisomy 15.

Additionally, it was intended to determine the parental origin of the extra

chromosome of twenty miscarriage and fetal products samples with aneuploidy. With

this purpose samples were collected from both parents and subjected to quantitative

fluorescence PCR. The vast majority of results were consistent with that previous

described in literature. From the twenty samples analyzed, eighteen cases had

maternal origin, one had paternal origin and for one sample it was not possible to

determine the origin of the aneuploidy due to homozygosity of the parents.

As a conclusion, the results of this work contributed to increase the knowledge

about aneuploidy in miscarriage products and about the possible relationship between

constitutional aneuploidy and chromosomal aneuploidy, being possible, at least at

some extent, to establish a parallel with somatic acquired aneuploidy.


XX

KEY WORDS: ANEUPLOIDY, CHROMOSOMAL INSTABILITY, BUB1, BUB1B,

MISCARRIAGE SAMPLES

I. INTRODUÇÃO


3

I. Introdução

1. Aneuploidia

A aneuploidia é uma condição caraterizada por um número incorreto de

cromossomas que resulta da perda ou ganho de cromossomas relativamente ao

complemento cromossómico normal da espécie em questão. O complemento

cromossómico humano normal é constituído por 22 pares de autossomas e 1 par de

cromossomas sexuais.

Atualmente, estima-se que cerca de 10-30% dos óvulos humanos fertilizados e

7-10% das gravidezes clinicamente comprovadas têm alterações cromossómicas

numéricas. A maioria destas serão trissomias, tornando a aneuploidia na alteração

cromossómica mais frequente em humanos e na principal causa genética de

abortamentos espontâneos e malformações congénitas (Hunt, 2008). Quando se

consideram apenas dados relativos a produtos de abortamento com idade gestacional

inferior a 15 semanas, as taxas de aneuploidia podem ascender a cerca de 50%

(Hassold et al., 1980, Nicolaidis & Petersen, 1998). No entanto, existe a hipótese de os

valores indicados estarem subestimados. Por um lado, a perda ou ganho de

determinados cromossomas é tão letal que inviabiliza a progressão da gravidez ainda

antes de esta ser clinicamente reconhecida. Por outro, sabe-se que a incidência de

aneuploidias aumenta muito consideravelmente com o aumento da idade materna, de

tal forma que, para mulheres no fim do período reprodutivo, a taxa de ovócitos

aneuplóides pode atingir os 50% (Hunt, 2008).

Estes valores estão muito acima das médias para outros mamíferos,

nomeadamente para o ratinho, que é o modelo animal mais usado neste tipo de

investigação (Hassold & Hunt, 2001). O motivo para esta discrepância entre espécies

ainda permanece desconhecido (Martin, 2008).

1.1. Mecanismos de origem da aneuploidia

1.1.1. Meiose

A meiose é um mecanismo de divisão celular especializado que origina

gâmetas haplóides a partir de células progenitores diplóides. A meiose é antecedida

por uma primeira fase de replicação de DNA e consiste em duas divisões celulares,

dando assim origem a células com metade do complemento cromossómico das suas

progenitoras.


4

Na primeira divisão meiótica (Meiose I), os cromossomas que consistem em

pares de cromátides-irmãs emparelham com os seus homólogos, formando-se um

complexo sinaptonémico entre eles. Neste ponto, as cromátides homólogas não-irmãs

sofrem recombinação e permanecem ligadas por estes pontos de quiasma, mesmo

após a dissociação do complexo sinaptonémico. Assim, os pares de cromossomas

homólogos alinham-se no fuso meiótico na metafase I. Na anafase I os pontos de

quiasma são removidos e os cromossomas homólogos são segregados para pólos

opostos do fuso meiótico, por ação de microtúbulos.

A segunda divisão meiótica inicia-se sem replicação prévia de DNA e decorre

de forma mais rápida. Na profase II forma-se um novo fuso meiótico no qual se

alinham os cromossomas constituídos por duas cromátides-irmãs cada, durante a

metafase II. Na anafase II as duas cromátides-irmãs são segregadas para pólos

opostos do fuso meiótico, forma-se um invólucro nuclear na telofase II e dá-se a

citocinese. A partir de uma célula progenitora diplóide o processo meiótico origina

quatro células-filhas haplóides.

Apesar da meiose ser um mecanismo altamente conservado e transversal à

maioria dos organismos superiores, na espécie humana existem diferenças

consideráveis entre a meiose feminina e masculina, e consequentemente na

gametogénese.

i. Gametogénese feminina

A meiose feminina inicia-se no ovário fetal, após um breve período de

proliferação mitótica. No entanto, após a dissociação do complexo sinaptonémico, a

célula entra num período de quiescência (dictióteno) até ocorrer ovulação, que se

inicia na puberdade. A meiose I é então retomada e, quando termina, ocorre a

extrusão do primeiro glóbulo polar. Após um breve período denominado Intercinese

inicia-se a Meiose II. Esta divisão prossegue até metafase II e apenas se completa se

ocorrer fertilização, ocorrendo a extrusão do segundo glóbulo polar. Caso não se dê a

fertilização, a célula sofre um processo de degeneração (Hunt, 2008).

A elevada taxa de aneuploidias de origem materna tem levantado muito

interesse no seio da comunidade científica. Nas últimas décadas foram surgindo

diversas teorias no sentido de explicar os mecanismos moleculares na base deste

fenómeno e a sua relação com o aumento da idade materna (Figura 1).

Atendendo ao facto de a maioria destes erros ocorrer em meiose I, pensa-se

que possam estar em larga medida relacionados com o período de quiescência

existente após a profase I. Para que ocorra uma correta segregação cromossómica é


5

crucial que os pontos de quiasma formados se mantenham intactos e,

consequentemente, a coesão entre as cromátides-irmãs constituintes de cada

cromossoma e entre os pares de cromossomas homólogos tem de ser mantida

durante décadas. Caso esta conexão seja de alguma forma quebrada precocemente,

ou seja, antes de ser atingida a metafase I, os pontos de quiasma perdem-se e podem

ocorrer erros de segregação na meiose I. Esta coesão é assegurada por complexos

proteicos denominados coesinas. Na transição da metafase I para a anafase I as

coesinas entre os cromossomas homólogos são libertadas por ação enzimática,

permitindo assim a segregação dos cromossomas homólogos, mas não das

cromátides-irmãs que deverão nesta fase permanecer ligadas. A perda de coesão

prematura entre as cromátides-irmãs pode ser uma consequência direta do aumento

da idade materna, devido a uma eventual degradação das coesinas. A não ocorrência

de recombinação diminui a estabilidade das ligações entre cromossomas homólogos e

entre cromátides-irmãs, podendo também contribuir para a perda de coesão prematura

(Handyside, 2012, Nagaoka S., 2012).

Um outro mecanismo gerador de aneuploidia na meiose I é a clássica não-

disjunção de um dos cromossomas constituído por duas cromátides-irmãs, embora

seja responsável por apenas 3% das aneuploidias (Gabriel et al., 2011).

A meiose, como referido anteriormente, não está isenta de erros. No entanto,

as células são sujeitas a diversos mecanismos de controlo (checkpoints), numa

tentativa de assegurar que apenas células com um correto complemento

cromossómico prosseguem a divisão. Um dos checkpoints mais estudados é o SAC

(Spindle Assembly Checkpoint) que atua impedindo a ativação do APC (Anaphase

Promoter Complex), bloqueando a progressão para anafase até todos os

cromossomas estarem corretamente alinhados no plano equatorial e devidamente

ligados a microtúbulos provenientes dos pólos, através dos seus cinetocoros. Assim

sendo, além dos mecanismos de não-disjunção descritos anteriormente, para serem

gerados gâmetas aneuplóides é necessário que as células ultrapassem este controlo,

o que pode ocorrer devido a mutações nos seus componentes, inativando o

checkpoint ou tornando-o mais permissivo (Zhou et al., 2002). Existem também

trabalhos que apontam no sentido de o SAC feminino ser naturalmente mais

permissivo do que o masculino, permitindo a progressão da meiose mesmo na

presença de um ou mais cromossomas univalentes (Hawley, 2011, Nagaoka et al.,

2011). Adicionalmente, estruturas como ligações bipolares podem contornar o

mecanismo de controlo do SAC.


6

Os mecanismos geradores de aneuploidia na metafase II são de certa forma

semelhantes aos verificados em metafase I, assentando essencialmente em não-

disjunção dos centrómeros-irmãos ou separação prematura das cromátides-irmãs

(Nagaoka S., 2012).

ii. Gametogénese masculina

A gametogénese masculina é um processo relativamente rápido. Ainda na vida

fetal, as células germinativas, espermatogónias, sofrem numerosas divisões mitóticas,

que continuam após o nascimento e se prolongam pela vida adulta. Quando é atingida

a puberdade, as espermatogónias são estimuladas a progredir o seu desenvolvimento

para espermatócitos primários. Estas células iniciam a primeira divisão meiótica,

originando espermatócitos secundários que, por sua vez, sofrem a segunda divisão

meiótica dando origem a espermátides. Posteriormente, são sujeitas a um mecanismo

de amadurecimento de onde resultam espermatozóides.

Sendo um processo sequencial em que cada célula que entra em meiose

produz quatro espermatozóides e em que não existem períodos de pausa durante a

Incid

ência

de

tris

som

ias

(%

de

gra

vid

ezes

clin

ica

men

te r

econhecid

as)

Idade materna

Fig. 1: Estimativa da incidência de trissomias com o aumento da idade materna, obtida por combinação de dados relativos às diferentes trissomias, considerando uma taxa de abortamento espontâneo de aproximadamente 15%. (Adaptado de Hassold & Hunt, 2001)


7

meiose, a espermatogénese é menos propensa à ocorrência de erros de segregação

cromossómica. Estudos realizados em homens saudáveis indicam que cerca de 1 a

2% dos espermatozóides produzidos têm um complemento cromossómico incorreto,

sendo as alterações mais comuns as trissomias dos cromossomas 21 e 22 e

aneuploidias dos cromossomas sexuais. Por outro lado, estima-se que cerca de 6 a

13% dos espermatozóides produzidos por um indivíduo saudável possam ser

portadores de alterações estruturais, o que se pode dever à elevada taxa de divisões

mitóticas que aumenta a probabilidade de ocorrência de mutações ou de alterações

pós-meióticas. A questão do efeito da idade paterna na incidência de anomalias

cromossómicas tem sido bastante debatida sem que, no entanto, pareça haver

consenso entre os diversos autores. Estudos mais recentes vieram acrescentar

evidências que apontam no sentido de a idade paterna avançada aumentar a

probabilidade de alterações estruturais mas não de alterações numéricas (Revisto por

Martin, 2008).

A aneuploidia de origem paterna tem na sua génese mecanismos semelhantes

aos verificados na meiose feminina. A não-disjunção pode derivar de emparelhamento

anormal dos cromossomas, sinapses deficientes ou inexistentes ou perda de coesão

prematura entre as cromátides-irmãs (Uroz & Templado, 2012).

1.1.2. Origem pós-zigótica (mitótica)

A ocorrência de um erro de segregação durante as mitoses correspondentes às

primeiras clivagens, pode levar ao desenvolvimento de um embrião aneuplóide, por

divisão preferencial da célula com o complemento cromossómico anormal em

detrimento das células diplóides normais, embora este fenómeno seja raro. Mais

frequentemente, erros neste mecanismo de divisão celular originam embriões com

mosaicismo, ou seja, onde coexistem duas ou mais linhas celulares de constituição

cromossómica distinta, mas ambas com origem em células progenitoras provenientes

do embrião. Assim, a maioria dos estudos nesta área estima a incidência de erros de

disjunção na mitose a partir da frequência de mosaicismos detetada em embriões. No

entanto, estes valores não reúnem consenso, podendo variar entre 15 e <90%, de

acordo com os diferentes autores (Bielanska et al., 2002, Daphnis et al., 2005, Harper

et al., 1995, van Echten-Arends et al., 2011). Esta discrepância de resultados deve-se

a questões como a definição de mosaicismo, o número de cromossomas analisados e

a proveniência e qualidade dos embriões usados na pesquisa (Mantikou et al., 2012).

As aneuploidias mitóticas encontram-se em todas as fases de desenvolvimento

pré-implantatório humano, mas a percentagem relativa de células aneuplóides diminui


8

com a ativação do genoma fetal e continua a diminuir ao longo da vida fetal e após o

parto (Fragouli et al., 2013). Mantikou et al refere que, se analisado a fundo, o

mosaicismo estará presente em virtualmente todos os indivíduos da população

comum, mas a um nível de tal forma baixo que é praticamente indetetável, não

causando efeitos a nível fenotípico (Mantikou et al., 2012).

Numa divisão mitótica normal, a partir de uma célula progenitora diplóide são

originadas duas células filhas também elas diplóides. Diversos mecanismos podem

estar na base do surgimento de linhas celulares aneuplóides ou poliplóides (Figura 2).

Na situação de atraso na anafase em mitose (anaphase lag), ocorre o atraso na

movimentação de uma cromátide durante a anafase, não sendo incorporado no

genoma de nenhuma das células-filhas, podendo resultar em monossomia. A não-

disjunção é a situação clássica em que as cromátides-irmãs não se separam

corretamente, resultando numa célula-filha com uma perda cromossómica e outra com

um ganho cromossómico. Em conjunto com a ocorrência de anaphase lag, é

responsável pela grande maioria das aneuploidias de causa mitótica. Existem outros

mecanismos que contribuem para a taxa de aneuploidias mitóticas, mas a uma escala

menor. A extrusão cromossómica é tida como um mecanismo celular de resgate de

trissomias. No entanto, quando ocorre em células cromossomicamente normais, este

fenómeno leva à perda de um cromossoma, originando monossomias. A quebra

cromossómica é um mecanismo algo semelhante mas provoca aneuploidias parciais

pois alguns segmentos cromossómicos permanecem viáveis. A aneuploidia pode

também resultar de separação prematura das células-filhas ou de citocinese

incompleta ou inexistente, das quais podem resultar células-filhas com diferentes

padrões de erros do complemento cromossómico. Pode ainda ocorrer fusão de

blastómeros no embrião, o que vai originar uma linhagem celular poliplóide (Mantikou

et al., 2012).


9

Fig. 2: Representação esquemática dos mecanismos causadores de aneuploidia mitótica (Adaptado de Mantikou et al, 2012)

1.1.3. Aneuploidias autossómicas mais frequentes

Os primeiros estudos citogenéticos acerca da incidência das aneuploidias

foram realizados em recém-nascidos, tendo sido observada aneuploidia envolvendo

apenas 3 dos 22 autossomas (cromossomas 13, 18 e 21) presentes na espécie

humana (Jacobs et al., 1992). No entanto, rapidamente se equacionou a hipótese de a

aneuploidia humana se poder estender praticamente a todos os autossomas, sendo as

consequências fenotípicas da aneuploidia para os restantes autossomas

habitualmente incompatíveis com a vida (exeto quando em mosaico), o que acabou

por se comprovar mediante estudos realizados em produtos de abortamento (Jackson-

Cook, 2011).

i. Trissomia 13

A trissomia 13, ou Síndrome de Patau, foi descrita pela primeira vez por Klaus

Patau em 1960 (Patau et al., 1960). Esta aneuploidia afeta cerca de 0,18% de todas

as gravidezes clinicamente reconhecidas, a maioria das quais termina em abortamento

espontâneo. Estima-se que 1,1% do total de abortamentos espontâneos e 0,3% do

total de nados-mortos sejam portadores de trissomia 13 (Hassold et al., 1980).


10

Segundo Hassold et al, a incidência de trissomia 13 em nados-vivos é de 1/5000-

20000, sendo uma das poucas aneuploidias compatível com gestações de termo na

espécie humana (Hassold et al., 1980).

As alterações fenotípicas associadas à Síndrome de Patau incluem alterações

graves do desenvolvimento psico-motor, microcefalia, malformações oculares, fenda

lábio-palatina, onfalocelo, hipotonia, malformações renais e cardíacas, entre outras

(Baty et al., 1994a, Baty et al., 1994b, Patau et al., 1960). Devido à grave

apresentação clínica da Síndrome de Patau, 95% das crianças afectadas não

sobrevivem habitualmente ao primeiro ano de vida (Rasmussen et al., 2003).

Relativamente ao mecanismo pelo qual é originada, a trissomia 13 pode

ocorrer devido à existência de um cromossoma 13 supranumerário livre (Figura 3) ou

de uma translocação Robertsoniana envolvendo este cromossoma. No caso de

trissomias provocadas por um cromossoma 13 livre, a grande maioria tem origem

materna, com contribuição equitativa de erros na primeira e segunda divisão meiótica

(Bugge et al., 2007).

ii. Trissomia 15

A Trissomia 15 é uma alteração cromossómica incompatível com a vida pós-

parto. Estima-se que cerca de 1,4% do total de abortamentos espontâneos tenham

esta alteração (Hassold et al., 1980), sendo maioritariamente de origem materna,

principalmente devido a erros de não disjunção na meiose I (Zaragoza et al., 1994).

Fig. 3: Cariótipo de indivíduo com trissomia do cromossoma 13 (Imagem cedida pelo Departamento de Genética/FMUP)


11

iii. Trissomia 16

A Trissomia 16 é a trissomia mais frequentemente encontrada em produtos de

abortamento do primeiro trimestre (Nicolaidis & Petersen, 1998, Doria et al., 2009).

Estima-se que ocorra em aproximadamente 1,5% do total de gravidezes clinicamente

reconhecidas (Wolstenholme, 1995) e em 5,1% dos abortamentos espontâneos

(Hassold et al., 1980). A trissomia 16 é considerada incompatível com a vida pós-

parto.

Segundo vários estudos, virtualmente todos os casos de trissomia 16 derivam

de erros de não disjunção na meiose I materna (Hassold et al., 1991, Hassold et al.,

2007).

iv. Trissomia 18

A trissomia 18, também conhecida como Síndrome de Edwards, é a segunda

trissomia autossómica mais comum no recém-nascido, afetando cerca de 1 em cada

2500 conceções, a maioria das quais termina em abortamento espontâneo (Crider et

al., 2008). Os primeiros casos reportados desta alteração cromossómica remontam a

1960, quando dois grupos de investigadores publicaram independentemente

descrições de um quadro clínico associado à presença de um cromossoma 18

supranumerário em todas as células do organismo (Figura 4) (Edwards et al., 1960,

Smith et al., 1960).

A Síndrome de Edwards caracteriza-se por um marcado atraso no crescimento

e no desenvolvimento psico-motor e cognitivo. Uma das manifestações clínicas mais

características é a malformação das mãos que leva à sobreposição dos dedos. Outras

alterações fenotípicas incluem dolicocefalia, micrognatia, onfalocelo, excesso de pele

no pescoço e malformações nos pés, bem como graves problemas cardíacos em

cerca de 90% dos casos (Cereda & Carey, 2012).

Devido à severidade dos sintomas provocados pela trissomia 18 existe uma

elevada taxa de mortalidade durante o trabalho de parto e período neonatal, sendo

que apenas aproximadamente 20% das crianças afetadas atingem um ano de vida

(Niedrist et al., 2006). Existem, no entanto, relatos de pacientes que sobreviveram

além dos 15 anos, embora se tratem de casos esporádicos (Niedrist et al., 2006, Kelly

et al., 2002, Shanske, 2006).

No que diz respeito à origem da trissomia 18, a grande maioria dos casos tem

origem materna (aproximadamente 91%), principalmente devido a erros na segunda

divisão meiótica (Nicolaidis & Petersen, 1998, Hassold et al., 2007).


12

v. Trissomia 21

A trissomia 21, responsável pela maioria dos casos de Síndrome de Down, é a

alteração cromossómica numérica mais comum em recém-nascidos, afetando cerca

de 1 em cada 750 nados-vivos (O'Connor, 2008), sendo que a incidência aumenta

marcadamente com o aumento da idade materna. Esta patologia é referida pela

primeira vez em 1886 por John Langdon Down numa publicação em que é descrito o

conjunto de sintomas característico desta patologia (Down, 1866). No entanto, só na

década de 50 do século XX é estabelecida a relação causa-efeito entre a presença de

uma cópia supranumerária do cromossoma 21 e a sintomatologia descrita cerca de

100 anos antes por Down, em duas investigações independentes realizadas por

Jerome Lejeune (Lejeune J, 1959) e Patrícia Jacobs (Jacobs et al., 1959). Atualmente,

sabe-se que a trissomia 21 é responsável por cerca de 95% do total de casos de

Síndrome de Down (Figura 5), sendo que os restantes 5% devem-se a translocações

envolvendo o cromossoma 21 (O'Connor, 2008).

Cerca de 90% dos casos de trissomia 21 tem origem materna, maioritariamente

devido a erros de não-disjunção na meiose I. Dos restantes, estima-se que cerca de

5% tenham origem em alterações pós-zigóticas ocorridas muito cedo no

desenvolvimento embrionário (Nicolaidis & Petersen, 1998).

Esta patologia caracteriza-se por um défice ligeiro a moderado no

desenvolvimento psicológico e cognitivo, sendo mesmo considerada como a principal

causa de atraso mental a nível mundial (Galdzicki et al., 2001). No que diz respeito ao

fenótipo, as alterações são variáveis mas, por norma, incluem baixa estatura, pescoço

Fig. 4: Cariótipo de um indivíduo com trissomia do cromossoma 18 (Imagem cedida pelo Departamento de Genética/FMUP)


13

Fig.5 - Cariótipo de um indivíduo com trissomia do cromossoma 21 (Imagem cedida pelo Departamento

de Genética/FMUP)

largo, fissuras palpebrais oblíquas, língua protuberante, prega palmar transversal

única, entre outras. Do ponto de vista clínico, as complicações associadas à Síndrome

de Down prendem-se com malformações cardíacas (afetam cerca de 50% dos recém

nascidos com Síndrome de Down), perda de audição (38-78%), problemas

oftalmológicos, malformações gastro-intestinais e propensão para infeções e doenças

hematológicas, nomeadamente leucemias (Roizen & Patterson, 2003). A esperança

média de vida de um indivíduo com Trissomia 21 é variável de acordo com o conjunto

de sintomas apresentado. No entanto, para países economicamente desenvolvidos

esta situa-se acima dos 55 anos (Glasson et al., 2002).

vi. Trissomia 22

A trissomia 22 é a terceira trissomia mais comum em produtos de abortamento,

estimando-se que afete 1 em cada 200 gravidezes clinicamente reconhecidas e sendo

responsável por pelo menos 2,7% do total de abortamentos espontâneos e 0,2% do

total de nados-mortos (Hassold & Jacobs, 1984). Devido à severidade dos sintomas

associados à trissomia 22, que incluem microcefalia, malformações cardíacas e renais

e restrição de crescimento intra-uterino, são raros os relatos de gravidezes que

atingem o termo (Heinrich et al., 2013). No caso de nados-vivos, a sobrevivência

média é de apenas 4 dias e a maior longevidade registada foi de 29 dias (Heinrich et

al., 2013, Tinkle et al., 2003).


14

Segundo Hall et al, cerca de 96% dos casos de trissomia 22 derivam de erros

na meiose materna, sendo que 90% deles estão relacionados com erros de disjunção

na primeira divisão meiótica (Hall et al., 2007).

vii. Triploidia

A triploidia é uma das anomalias cromossómicas mais comuns na espécie

humana, ocorrendo em cerca de 1% do total de conceções que, na sua maioria,

resultam em abortamento frequentemente ainda numa fase precoce da gravidez. Em

casos muito raros, fetos com triploidia completa sobrevivem até ao termo da gestação.

O tempo máximo de sobrevivência de uma criança com triploidia (não mosaico)

registado até hoje é de 11 meses (Sherard et al., 1986). Esta anomalia cromossómica

consiste na existência de uma cópia adicional de cada um dos cromossomas em todas

as células do organismo, ou seja, indivíduos com esta condição possuem um

complemento cromossómico haplóide adicional, resultando num total de 69

cromossomas.

Esta condição pode resultar de diginia (complemento cromossómico adicional

tem origem materna) ou de diandria (complemento cromossómico adicional tem

origem paterna). A prevalência de cada um destes mecanismos de origem varia de

acordo com a idade gestacional atingida. Tratando-se de abortamentos ocorridos nas

primeiras semanas de gestação, a origem é predominantemente paterna.

Abortamentos mais tardios tendem a relacionar-se com diginia. Considerando a

triploidia como um todo, a diandria é o mecanismo de origem mais comum (Wick et al.,

2013, Zaragoza et al., 2000).

A nível do fenótipo provocado por esta condição também existem diferenças de

acordo com a origem parental da anomalia. Em casos derivados de diandria, verifica-

se um crescimento fetal normal ou moderadamente afetado de forma simétrica, com

glândulas adrenais normais. A placenta tende a ser de grandes dimensões e com

características histológicas conhecidas como mola hidatiforme parcial. Quando a

triploidia deriva de diginia, o feto apresenta habitualmente uma restrição de

crescimento grave e hipoplasia adrenal. A placenta classifica-se como não molar. Em

comum, os fetos tendem a apresentar anomalias congénitas generalizadas,

nomeadamente sindactilia nos dedos das mãos e nos dedos dos pés, anomalias

genitais e cardíacas bem como malformações cerebrais, entre outras (McFadden &

Robinson, 2006).


15

2. Diagnóstico Pré-Natal de Aneuploidias

Por norma, no acompanhamento normal de uma gravidez é realizado de forma

generalizada o rastreio pré-natal de cromossomopatias que, levando em consideração

uma série de fatores, fornece indicações sobre a existência ou não de risco

aumentado de patologia cromossómica. Nas situações em que o resultado deste

rastreio é positivo, deve ser oferecida à grávida a possibilidade de realização de

diagnóstico pré-natal (DPN). O DPN engloba um conjunto de técnicas de recolha de

material fetal, nomeadamente amniocentese, biópsia de vilosidades coriónicas,

cordocentese e recolha de material fetal em circulação no plasma materno, permitindo

assim a determinação direta da constituição cromossómica do feto.

2.1. Técnicas de análise da patologia cromossómica

2.1.1. Cariótipo

A análise do cariótipo, ferramenta tradicional de citogenética, é um processo

demorado e relativamente trabalhoso. Inicialmente, é necessário estabelecer uma

cultura celular do material biológico em questão (vilosidades coriónicas, sangue,

líquido amniótico, ou outros) que posteriormente é sincronizada no sentido de se obter

a maior quantidade de metafases possível. Os cromossomas metafásicos são sujeitos

a processos de coloração, tradicionalmente Bandas-G, que permitem a sua

visualização ao microscópio. A análise do cariótipo permite avaliar a ploidia bem como

a existência, dentro de certos limites de resolução, de rearranjos estruturais,

equilibrados ou não, em qualquer cromossoma.

Apesar da sua inegável importância esta técnica apresenta limitações,

nomeadamente a necessidade de cultura celular prévia. A falência de culturas, que se

pode dever a uma multiplicidade de fatores, impossibilita a obtenção de cariótipos,

surgindo a necessidade de recorrer a outras técnicas que não necessitam de cultura

celular, nomeadamente de análise molecular.

Adicionalmente, na cultura celular pode ocorrer crescimento preferencial de

células de origem materna, contaminação por material externo ou mesmo seleção

contra as células anormais, tratando-se de fetos com mosaicismo.

A análise do cariótipo está muito dependente da experiência do profissional,

podendo por vezes surgir situações ambíguas, nomeadamente devido à resolução do

bandeamento, que dificultam a determinação dos resultados.

A limitação mais importante da análise do cariótipo é, no entanto, o tempo

necessário até serem reportados os resultados (aproximadamente 15 dias), o que em


16

contexto de Diagnóstico Pré-Natal coloca o casal sob uma grande ansiedade. Do

ponto de vista médico esta situação também é problemática pois procedimentos como

a interrupção médica da gravidez são mais seguros se realizados mais precocemente.

2.1.2. FISH (Hibridação in situ de Fluorescência)

É uma técnica pela qual um segmento de DNA conjugado previamente com um

fluorocromo (sonda) hibridiza numa metafase ou interfase, com determinado

cromossoma ou determinada região de um ou mais cromossomas, na sua região

complementar. Uma vez que permite a deteção de aneuploidias e alterações da ploidia

em células em interfase, não exige cultura celular prévia, possibilitando resultados

mais rápidos do que os obtidos pela técnica convencional de análise do cariótipo. Esta

técnica possibilita ainda a deteção de mosaicismo mesmo que de baixo grau (<10%)

bem como de situações de contaminação materna em fetos de sexo masculino. No

contexto do diagnóstico pré-natal de aneuploidias, são usadas sondas específicas

para as aneuploidias mais comuns (13, 16, 18, 21 e 22), disponíveis em kits

comerciais.

Esta técnica tem como principal desvantagem o facto de estar limitada às

sondas utilizadas no estudo, não fazendo um estudo integral de todo o genoma.

Um dos desenvolvimentos mais importantes conseguidos a partir da técnica de

FISH foi a introdução da Hibridação Genómica Comparativa (CGH), que alarga a

pesquisa de alterações numéricas e estruturais desequilibradas a todo o genoma.

Nesta técnica o DNA em estudo e o DNA controlo (extraído de um indivíduo

cariotipicamente normal) são marcados com fluorocromos distintos e hibridados com

cromossomas metafásicos humanos de referência. A interpretação dos resultados é

feita avaliando o rácio da intensidade de fluorescência entre o controlo e o DNA

estudado, através de ferramentas de análise digital (Revisto por Bishop, 2010). Esta

técnica clássica já deixou de ser usada pois foi substituída pela técnica de array-CGH,

em que a hibridação é feita numa lâmina de array, comumente designada de chip,

onde são impressas milhares de sondas de DNA (mais recentemente

oligonucleótideos) permitindo a análise da totalidade do genoma (perdas e ganhos)

com uma resolução muito superior (pelo menos 100kb ou mesmo maior resolução,

conforme o tipo de array).


17

2.1.3. QF-PCR (Quantitative fluorescent polymerase

chain reaction)

A técnica de QF-PCR baseia-se na amplificação de sequências de DNA

altamente polimórficas, nomeadamente STR’S (Short Tandem Repeats) específicas

para um cromossoma, recorrendo a pares de primers marcados com fluorescência.

Uma vez que se assume que na fase exponencial do PCR a quantidade de DNA

específico produzida é proporcional à quantidade de DNA-alvo inicial, é possível

determinar o número de cópias do cromossoma em questão, por análise da

intensidade de fluorescência dos fragmentos amplificados.

A interpretação dos resultados baseia-se no número de picos de fluorescência

e no cálculo do rácio entre a altura dos mesmos, para cada marcador polimórfico

usado. Assim, um indivíduo heterozigótico euplóide para o cromossoma em questão

deve apresentar dois picos de fluorescência com rácio de intensidade de fluorescência

não superior a 0,8-1. Tratando-se de um indivíduo homozigótico, deverá existir apenas

um pico de fluorescência. Quando estamos perante uma trissomia para o cromossoma

em questão, as três cópias cromossómicas podem ser detetadas como três picos de

fluorescência distintos com um rácio de intensidade de 1:1:1 ou como dois picos com

rácio de intensidade inferior a 0,65 ou superior a 1,8 (Diego-Alvarez et al., 2005,

Hulten et al., 2003).

A QF-PCR permite a realização de ensaios em multiplex, ou seja, com vários

pares de primers em simultâneo, existindo mesmo kits comerciais disponíveis em

várias empresas que permitem o diagnóstico de forma relativamente económica. Uma

vez que o DNA usado para esta técnica é extraído a partir de líquido amniótico,

vilosidades coriónicas ou tecido fetal sem cultura celular prévia, a QF-PCR permite a

obtenção de resultados num curto período de tempo (24-48 horas). Esta técnica tem

ainda a vantagem de permitir detetar células com genótipo diferente do DNA da

maioria das células presente na amostra, o que pode representar contaminação

materna, mosaicismo, quimerismo ou mesmo contaminação externa (Mann & Ogilvie,

2012). Adicionalmente, permite obtenção de resultados em casos em que o

diagnóstico citogenético não foi possível, sendo ainda informativo relativamente à

origem parental e meiótica da aneuploidia.

Relativamente às desvantagens da QF-PCR, a existência de resultados não

informativos (existência de um só pico de fluorescência que pode corresponder a um

padrão de 1:1 ou de 1:1:1) é apontada com alguma frequência. Adicionalmente, a

existência de tetraploidia e de mosaicismos de baixo grau pode ser difícil de identificar

(Diego-Alvarez et al., 2005). Devido ao facto de os kits comerciais só testarem as


18

aneuploidias mais comuns (cromossomas 13, 16, 18, 21, 22 e sexuais), aneupoidias

dos restantes cromossomas não são detetadas por esta técnica.

2.1.4. MLPA® (Multiplex ligation-dependent probe

amplification)

A técnica de MLPA foi desenvolvida pela empresa “MCR-Holland” em 2002

como um método de quantificação relativa que permitia a pesquisa direcionada de

alterações do número de cópias de DNA de até 50 sequências de DNA, baseada na

técnica de PCR quantitativa. No contexto do Diagnóstico Pré-natal, a MLPA pode ser

usada para detetar aneuploidias, microdeleções e estudos familiares de alteração do

número de cópias num gene.

Numa reação de MLPA, para cada alvo são usadas duas sondas

oligonucleotídicas que são complementares a regiões imediatamente adjacentes na

sequência de DNA em estudo. Cada sonda contém um local de ligação para um

primer, forward e reverse respetivamente. A sonda 3’ contém ainda uma sequência de

DNA, conhecida como stuffer sequence, que não emparelha com a sequência-alvo e

que confere um comprimento distinto aos amplicões, permitindo a sua distinção em

ensaios multiplex, através de separação por eletroforese capilar. Uma vez que os

primers usados são marcados com fluorescência, a análise dos resultados baseia-se

na interpretação da intensidade dos picos de fluorescência detetados por eletroforese

capilar, por comparação com um padrão de referência ou com os rácios relativamente

a outros cromossomas (Figura 6). Rácios abaixo de 0,7 são indicativos de perda de

material-alvo e acima de 1,3 de ganho de material-alvo. Os valores intermédios são

considerados normais. (Willis et al., 2012).


19

As vantagens da MLPA relativamente a outras técnicas relacionam-se com o

facto de ser uma técnica rápida (resultados disponíveis em cerca de 48 horas) e

relativamente simples, com resultados fiáveis, robustos e replicáveis devido à

existência de kits comerciais otimizados para a deteção das aneuploidias mais

comuns. A quantidade de DNA necessária é relativamente baixa. Adicionalmente, a

MLPA elimina o problema dos resultados não informativos existentes na QF-PCR. Os

aspetos negativos desta técnica incluem a não deteção de triploidias, cujo resultado é

igual ao de um indivíduo diplóide, bem como a não deteção de contaminação materna.

3. Alteração da expressão génica e aneuploidia

3.1. Aneuploidia e instabilidade cromossómica

O efeito prejudicial da aneuploidia no desenvolvimento humano está

largamente documentado, sendo particularmente evidente no fenótipo associado às

trissomias compatíveis com a vida pós-parto. Adicionalmente a aquisição de

aneuploidia em células diferenciadas tem vindo a ser associada ao desenvolvimento

de diversos tipos de cancro. O mecanismo pelo qual a aneuploidia afeta de tal forma

Fig. 6: Procedimento de MLPA® (Adaptado de http://www.invitrotek.com.tr/en/mlpa.asp)

http://www.invitrotek.com.tr/en/mlpa.asp


20

os organismos tem vindo a ser alvo de estudo nas últimas décadas e, embora tenham

surgido diversas teorias, permanece por esclarecer.

Uma das hipóteses colocadas é a relação entre a aneuploidia e a instabilidade

cromossómica. Potapova et al sugerem que esta relação se baseia num ciclo, em que

a existência de uma potencia a outra. Assim, a existência de aneuploidia provoca um

desequilíbrio da expressão de mRNA, o que por sua vez altera os níveis proteicos.

Estas perturbações podem afetar diversos complexos proteicos e vias metabólicas,

alterando o correto funcionamento de processos biológicos essenciais à célula e

podendo provocar, entre outros, defeitos na maquinaria de checkpoint e no fuso

celular. Estas alterações levam ao aumento de erros de segregação, contribuindo

assim para o aumento da instabilidade cromossómica e, consequentemente, da

incidência de aneuploidia (Figura 7) (Potapova et al., 2013).

Fig.7 - Ciclo de aneuploidia e instabilidade cromossómica. (Adaptado de Potapova et al 2013)

A maioria dos trabalhos que focam a instabilidade cromossómica baseia-se em

situações de aneuploidia adquirida, nomeadamente em oncologia. No entanto, a

relação entre aneuploidia e instabilidade cromossómica também existe em

aneuploidias constitucionais. Potapova et al afirmam que células provenientes de

pacientes com Síndrome de Down, Edward e Patau são menos estáveis do que

células provenientes de indivíduos cariotipicamente normais (Potapova et al., 2013).


21

Muito embora aparentemente a alteração dos componentes do checkpoint seja

responsável apenas por uma minoria dos casos de instabilidade cromossómica, esta

continua a ser uma contribuição relevante para o conhecimento global acerca de

aneuploidia.

3.1.1. MAD2L2

Os genes envolvidos no mecanismo de checkpoint do fuso mitótico de

Saccaromyces cerevisiae têm sido amplamente estudados ao longo das últimas

décadas. O gene MAD2, responsável por monitorizar a ligação dos microtúbulos ao

cinetocoro pertence a uma das famílias de genes melhor caracterizadas, a família

MAD (mitotic arrest deficent). Em organismos eucarióticos superiores existem dois

homólogos de MAD2: MAD2L1 (mitotic arrest deficient like 1), frequentemente

designado apenas como MAD2, e MAD2L2 (mitotic arrest deficient like 2), também

designado por MAD2B ou hREV. Este último gene foi identificado e caracterizado por

Cahill et al em linhas celulares humanas provenientes de tumores com instabilidade

cromossómica. MAD2L2 tem localização citogenética em 1p36 (Figura 8) e codifica a

proteína Mad2l2. Esta proteína intervém no mecanismo de checkpoint, inibindo o

complexo APC/C através da ligação a um dos seus ativadores, CDC20 ou CDH1. No

entanto, atendendo ao facto de Mad2l2 se localizar essencialmente no núcleo mas não

se associar com os cinetocoros ao longo do ciclo celular, pensa-se que esta proteína

estará envolvida em algum processo celular para além do checkpoint do fuso.

Adicionalmente, Mad2l2 representa uma subunidade da enzima polimerase de DNA

zeta. Esta enzima é mais permissiva a alterações na cadeia molde, sendo capaz de

prosseguir a replicação de DNA em situações em que as DNA-polimerases

convencionais parariam. Quando atinge o local da lesão na cadeia molde, a DNA

polimerase zeta insere um nucleótido (correto ou não) na posição correspondente da

cadeia sintetizada e prossegue a replicação. Este processo tem a desvantagem de

poder fixar mutações (Murakumo, 2002). Como esta DNA polimerase não tem

atividade de revisão da cadeia sintetizada, há maior propensão para a ocorrência de

mutações. Apesar deste risco, este mecanismo tende a implicar menos consequências

do que a paragem da replicação.

Fig.8 - Localização genómica do gene MAD2L2 (Retirado de http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=MAD2L2)

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=MAD2L2

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=MAD2L2


22

Trabalhos focando a DNA polimerase zeta em leveduras indicam que Mad2l2 é

fundamental para a sua capacidade de síntese transpondo a lesão. Assim, é de

esperar que a redução de Mad2l2 prejudique a capacidade de tolerância de erros na

cadeia de DNA, levando à paragem da síntese, com consequências drásticas para os

organismos.

Por outro lado, dados relativos à sobre-expressão de Mad2l2 que provêm

maioritariamente de estudos em tumores (nomeadamente colo-retais e

neuroblastomas) mostram que pacientes em que este gene se encontra sobre-

expresso têm pior prognóstico, com diminuição das taxas de sobrevivência.

Apesar das informações disponíveis acerca da intervenção de Mad2l2 em

processos distintos, o seu papel exato no controlo do ciclo celular e os mecanismos

através dos quais ele se processa permanecem pouco claros.

3.1.2. BUB1

O gene BUB1 (Budding uninhibited by benzimidazole) tem localização

citogenética 2q13 (figura 9) e foi identificado pela primeira vez em levedura.

Posteriormente, foi identificada a sequência de cDNA que codifica o gene BUB1 em

humanos. A comparação desta sequência com a de Saccaromyces cerevisiae e com a

de ratinho, previamente determinadas, revelou uma grande similaridade, indicativa de

elevado grau de conservação (Cahill et al., 1999). A proteína codificada por este gene,

uma cínase rica em serinas e treoninas denominada Bub1, está presente em níveis de

concentração variáveis de acordo com o tecido considerado, tendo sido detetados

níveis máximos em amostras de tecido testicular e níveis mínimos em amostras de

baço (The GeneCards human gene database).

A maioria da informação sobre o papel de Bub1 na mitose provém de estudos

em S. cerevisiae e S. pombe (Marchetti & Venkatachalam, 2010). As evidências em

vertebrados derivam maioritariamente de trabalhos com linhas celulares tumorais

humanas ou de modelos animais como o ratinho. No seu conjunto, estes trabalhos

Fig.9 - Localização genómica do gene BUB1 (Retirado de http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=BUB1&search=bub1)

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=BUB1&search=bub1

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=BUB1&search=bub1


23

Fig.10 - Funções de Bub1 no checkpoint do fuso mitótico. a) Recrutamento de Mad1 e Mad2 para os quinetocoros e subsequente formação do complexo MCC. b) Ação direta de Bub1 fosforilando Cdc20 e impedindo a activação do complexo APC/C. Adaptado de (Yu & Tang, 2005)

denotam o papel essencial de Bub1 na correta segregação cromossómica na mitose.

Durante a profase, esta proteína acumula-se nos cinetocoros não ligados, para onde

recruta dímeros Mad1-Mad2. Em resposta a danos no fuso mitótico, Bub1 fosforila

Mad1, levando à dissociação do complexo Mad1-Mad2. Uma vez livre, Mad2 liga-se a

Cdc20, um ativador do complexo APC/C. Pensa-se que esta ligação pode

desencadear a formação do complexo de checkpoint mitótico (MCC) constituído por

BubR1-Bub3-Mad2-Cdc20, qua atua inibindo o complexo APC/C e,

consequentemente, a progressão para anafase. No entanto, a formação do complexo

MCC no cinetocoro ainda não está suficientemente documentada (Figura 10a).

Adicionalmente, pensa-se que Bub1 pode atuar diretamente fosforilando Cdc20,

impedindo assim a ativação do complexo APC/C, embora o mecanismo através do

qual esta inibição ocorre ainda não esteja totalmente esclarecido (Figura 10b)

(Marchetti & Venkatachalam, 2010, Williams et al., 2007). Existem ainda autores que

defendem que a proteína Bub1 pode sinalizar células que escaparam aos mecanismos

de controlo, tendo herdado um complemento cromossómico incorreto, promovendo a

sua degradação (Jeganathan et al., 2007).

No que diz respeito à meiose, à semelhança do que acontece na mitose, Bub1

é um componente-chave do checkpoint do fuso. Assim, a inativação ou o decréscimo

de atividade de Bub1 afetaria numerosos aspetos em ambos os processos de divisão

celular, nomeadamente o correto alinhamento cromossómico e a sincronização

temporal pois seria desencadeada uma entrada precoce em anafase (Marchetti &

Venkatachalam, 2010).


24

Uma vez que a perda total de função de Bub1 é letal ainda na fase embriónica,

a investigação do papel desta proteína in vivo tem sido realizada em ratinhos mutantes

com redução de atividade ou mutação de apenas uma das cópias do gene em

questão. Estes trabalhos permitiram concluir que o fenótipo provocado pela redução

de Bub1 na meiose é marcadamente diferente entre os sexos. O estudo dos

espermatozóides destes organismos mutantes não revelou alterações significativas

nas taxas de aneuploidia detetadas. Por oposição, quando foram analisados óvulos, s

taxas de aneuploidia detetadas sofreram um incremento relativamente a controlos não

mutados. Este aumento de aneuploidia em óvulos de organismos mutantes estará,

muito provavelmente relacionado com separação prematura das cromátides-irmãs

(Leland et al., 2009).

Além do seu papel como proteína de checkpoint, Bub1 atua também evitando a

separação prematura das cromátides-irmãs. Para que ocorra segregação dos

cromossomas homólogos, os complexos de coesinas localizados ao longo dos braços

dos cromossomas têm de ser retirados por fosforilação mediada por Plk1/Aurora B,

durante a profase. No entanto, é necessário que se mantenha a coesão no centrómero

para conservar as cromátides-imãs unidas, evitando a remoção das coesinas desta

região. Este papel é levado a cabo por proteínas denominadas sugosinas, que

protegem a coesão centromérica. Bub1 regula a estabilidade e a correta localização

centromérica das sugosinas, contribuindo assim para evitar a separação prematura

das cromátides-irmãs. Posteriormente, em meiose II a enzima separase cliva as

coesinas centroméricas para permitir a segregação das cromátides-irmãs (Figura 11)

(Yu & Tang, 2005, Marchetti & Venkatachalam, 2010).

Fig.11 - Ação de BUB1 na protecção da coesão centromérica, contribuindo para prevenir a

separação prematura das cromátides-irmãs. Adaptado de (Yu & Tang, 2005)


25

Os efeitos de uma eventual sobre-expressão de BUB1 não estão muito

documentados. No entanto, sabe-se que existe sobre-expressão de BUB1 em

determinados tipos de cancro, nomeadamente linfomas, por oposição a outras

neoplasias referidas anteriormente em que a expressão deste gene está diminuída.

Segundo um trabalho de Ricke et al, a sobre-expressão de BUB1 pode ser

potenciadora do desenvolvimento de neoplasias de constituição cromossómica

aneuplóide por promover erros de segregação cromossómica. No entanto, as

consequências moleculares e fisiológicas desta sobre-expressão ainda não são

conhecidas (Ricke et al., 2011). Assim, embora sejam necessárias evidências

adicionais para suportar estes dados, poderá ser de esperar um aumento das taxas de

aneuploidia tanto quando existe sub-expressão de BUB1 como quando este gene é

sobre-expresso.

3.1.3. BUB1B

O gene BUB1B (Budding uninhibited by benzimidazole 1 homolog beta),

localizado no cromossoma 15 em q15 (Figura 12), foi inicialmente identificado devido à

homologia com BUB1. Pouco depois da sua identificação, este gene foi reconhecido

como o ortólogo em mamíferos do gene MAD3 de leveduras. No entanto existem

diferenças entre a proteína BubR1, codificada por BUB1B e a proteína Mad3,

nomeadamente a existência de um domínio de cínase na primeira. Esta

particularidade é indicativa de que a atividade de cínase de BubR1 terá sido adquirida

no decorrer da evolução, provavelmente no sentido de dar resposta a novas funções

que lhe terão sido atribuídas (Elowe, 2011). Atualmente, pensa-se que a proteína

BubR1 é muito importante tanto para os mecanismos de checkpoint da divisão celular

como para estabilizar a ligação dos microtúbulos aos cinetocoros.

Esta proteína é recrutada para os cinetocoros onde provavelmente atua

regulando a acção de CENP-E (Kinesin like centromere motor protein). CENP-E

intervém na ligação dos microtúbulos aos cinetocoros bem como no alinhamento dos

cromossomas na placa metafásica. A monitorização destes processos foi comprovada

pelo facto de células em que CENP-E está ausente permanecerem bloqueadas no

processo de divisão, não completando a meiose. Esta monitorização é, pelo menos

Fig.12 - Localização genómica do gene BUB1B (Retirado de http://www.genecards.org/cgi-

bin/carddisp.pl?gene=BUB1B&search=bub1b)

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=BUB1B&search=bub1b

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=BUB1B&search=bub1b


26

em parte, levada a cabo por BubR1, como demonstrado por Chan e colaboradores

(Chan et al., 1999). Adicionalmente, BubR1 integra o complexo MCC que, em resposta

a erros de ligação ao fuso, impede a ativação de APC/C e consequente progressão

para anafase. É ainda sugerido um papel de BubR1 na sinalização de células

aneuplóides, promovendo a sua apoptose, à semelhança do que foi descrito para o

gene BUB1 (Elowe, 2011).

Trabalhos com linhas celulares e organismos mutantes com diminuição da

expressão de BubR1, nomeadamente ratinho, têm vindo a acrescentar informação

acerca das funções desta proteína. Células de levedura em que foram induzidas

mutações que inativam BUB1B permanecem viáveis. No entanto, desenvolvem-se

mais lentamente e apresentam erros de segregação cromossómica e aneuploidia. De

forma semelhante, trabalhos com fibroblastos de ratinho com níveis reduzidos de

BubR1 indicam um elevado nível de aneuploidia, enquanto que os ratinhos em si

apresentam uma marcada propensão para o desenvolvimento de tumores. Estes

resultados estão em concordância com os obtidos em humanos com sub-expressão

desta proteína. (Harris et al., 2005).

A redução de expressão de BUB1B e/ou do nível da sua proteína tem vindo a

ser associada a um conjunto de sintomas denominado de Síndrome de Separação

Prematura das Cromátides Irmãs com Aneuploidia Variegada em Mosaico. Trata-se de

uma condição autossómica recessiva rara, caracterizada por atraso no

desenvolvimento psico-motor, microcefalia e elevada taxa de desenvolvimento de

cancro nos primeiros anos de infância ou mesmo durante o desenvolvimento

embrionário (Hanks et al., 2004). Cerca de 37% dos pacientes desenvolvem cancro

nos primeiros 3 anos de vida (Suijkerbuijk et al., 2010). Adicionalmente, estes

pacientes tendem a apresentar separação prematura das cromátides irmãs para todos

os cromossomas, bem como mosaicismo para várias trissomias e monossomias. A

pesquisa em famílias afetadas por esta condição revelou comprometimento das

funções normalmente desempenhadas por BubR1, nomeadamente ao nível do

checkpoint mitótico e do correto alinhamento cromossómico. Foram também detetadas

mutações no gene em questão, causadoras de redução da quantidade de BubR1

disponível ou da perda de funcionalidade desta proteína (Suijkerbuijk et al., 2010).

Embora muito provavelmente a ocorrência desta síndrome não possa ser atribuída

exclusivamente às mutações de BUB1B, os dados existentes apontam no sentido de

contribuírem maioritariamente para esta condição.

Existem ainda trabalhos que relacionam a sub-expressão de BUB1B com

fenótipos típicos de quadros de envelhecimento. Sabe-se também que os níveis de

BubR1 diminuem com o envelhecimento cronológico. Assim, especula-se que este


27

gene esteja de alguma forma envolvido no controlo do envelhecimento precoce (Baker

et al., 2013).

A sobre-expressão de BUB1B, por sua vez, não reúne consenso no que diz

respeito às consequências provocadas. Por um lado, seria de esperar um conjunto de

efeitos semelhantes aos observados quando ocorre sobre-expressão de BUB1. Esta

conjetura é apoiada por trabalhos na área da oncologia que evidenciam a existência

de sobre-expressão de BUB1B em diversos tumores de constituição cromossómica

aneuplóide, nomeadamente tumores do ovário, da mama, do estômago e da bexiga,

entre outros. No entanto, segundo um trabalho recente de Baker et al., a sobre-

expressão de BubR1 pode ter um papel protetor relativamente ao aparecimento de

aneuploidia e cancro (Baker et al., 2013).

3.1.4. KIF2C

O gene KIF2C (Kinesin family member 2C), localizado em 1p34.1 (Figura 13),

codifica a proteína Kif2c também designada por MCAK (mitotic centromere associated

kinesin). Esta proteína é o membro melhor caraterizado da família cinesina-13 e foi

identificada através da sua elevada homologia com a proteína Mcak já conhecida em

hamster (Kim et al., 1997). As proteínas pertencentes a esta família são “motores

moleculares” que despolimerizam microtúbulos através da remoção de unidades de

tubulina na extremidade onde ocorre a polimerização. Kif2c, em particular, tem uma

afinidade muito elevada para as extremidades dos microtúbulos, tendo a capacidade

de destabilizar cataliticamente ambas as extremidades a níveis semelhantes.

Esta proteína pode ser encontrada no citoplasma da maioria das células ao

longo de todo o ciclo celular, havendo no entanto um considerável enriquecimento nas

regiões dos cromossomas, cinetocoros e fuso durante a mitose. Atendendo a este

facto, têm sido atribuídas a Kif2c funções na elaboração do fuso mitótico, na dinâmica

dos microtúbulos e no movimento cromossómico no sentido da sua correta

segregação (Sanhaji et al., 2011).

A sobre-expressão de Kif2c está associada à diminuição de erros de

segregação em linhas celulares cromossomicamente instáveis. Assim, pensa-se que

Fig.13 - Localização genómica do gene KIF2C (Retirado de http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=KIF2C)

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=KIF2C

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=KIF2C


28

esta proteína recorre à sua atividade de despolimerizadora para desligar os

microtúbulos dos cinetocoros e promover a reparação de ligações incorretas (Sanhaji

et al., 2011).

A inibição de Kif2c em mitose leva à acumulação de microtúbulos

incorretamente ligados causando nomeadamente a ligação de um cinetocoro a ambos

os polos, o que se designa por ligação merotélica. Por norma, este tipo de ligações

incorretas não é detetado pelos mecanismos de controlo do SAC, o que torna a

merotelia numa potencial causa de aneuploidia (Cimini et al., 2001, Salmon et al.,

2005). Em concordância com este facto, a diminuição da atividade ou ausência de

Kif2c não impede a progressão da divisão em células somáticas mas, em

consequência, estas células apresentam problemas no alinhamento cromossómico em

prometafase, atraso no movimento cromossómico em anafase e erros de segregação

cromossómica (Sanhaji et al., 2011).

A redução de kif2c pode também, de certa forma, estar relacionada com o

efeito da idade materna no aumento da taxa de ovócitos aneuploides. Estudos de

expressão génica em ovócitos de ratinho sugerem uma redução de quantidade de

Kif2c à medida que a idade materna avança (Pan et al., 2008). A confirmar-se existe a

possibilidade de que, devido à redução da proteína, exista uma redução da

capacidade de Kif2c na reparação de ligações cinetocoro-microtúbulo incorretas,

contribuindo assim para o aparecimento de ovócitos aneuplóides. No entanto, diversos

trabalhos têm vindo a apontar no sentido de, apesar de Kif2C ser importante para o

correto alinhamento cromossómico, a sua inibição não implicar necessariamente

aumento na taxa de aneuploidias verificada (Illingworth et al., 2010, Vogt et al., 2010).

Níveis baixos de Kif2c podem estar também implicados na ocorrência de separação

prematura das cromátides-irmãs. Um estudo de Vogt e colaboradores sugere a

possibilidade de esta proteína se acumular nos locais de conexão entre cromátides-

irmãs, evitando que se formam ligações estáveis de microtúbulos aos seus

cinetocoros, o que provocaria a sua separação prematura (Vogt et al., 2010).

As evidências provenientes de trabalhos na área da oncologia permitem

concluir que diferentes tipos de tumores estão associados a diferentes alterações da

expressão de KIF2C. Este gene encontra-se sobre-expresso em tumores da mama

(Shimo et al., 2008), gástricos (Nakamura et al., 2007), colo-retais (Ishikawa et al.,

2008), entre outros. A expressão aumentada deste gene encontra-se ainda

relacionada com prognósticos piores, nomeadamente com maior invasão de células

tumorais nos tecidos circundantes, possibilidade aumentada de metástases e

progressão acelerada da doença (Sanhaji et al., 2011). Estes dados indicam que

existe desregulação de Kif2c em células tumorais, que culmina no desenvolvimento de


29

instabilidade cromossómica o que, aparentemente não é impeditivo da proliferação

descontrolada deste tipo de células.

II. OBJETIVOS


33

II. Objetivos

O objetivo global deste estudo consiste na avaliação da expressão de genes

associados ao controlo do ciclo celular em produtos de abortamento de constituição

cromossómica aneuplóide.

Para tal foram estabelecidos três objetivos sequenciais:

1. Realização de uma base de dados com todos os produtos de abortamento

com cariótipo aneuplóide para os cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 e 22, que foram

estudados no Departamento de Genética FMUP, entre 2004 e 2012, e respetivo

registo de dados clínicos.

2. Seleção de genes-alvo que, de acordo com a literatura, têm um papel

relevante na segregação cromossómica;

3. Avaliação da expressão dos genes selecionados por Real-Time PCR,

usando ensaios de expressão com sondas TaqMan.

Adicionalmente, pretende-se também determinar a origem parental do

cromossoma supranumerário em produtos de abortamento aneuplóides (Trissomias

dos cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 e 22) e triplóides recorrendo à técnica de QF-

PCR (Quantitative Fluorescense Polymerase Chain Reaction).

III. Metodologia


37

III. Metodologia

1. Avaliação da expressão génica de MAD2L2, BUB1, BUB1B

e KIF2C

1.1.Obtenção e preparação das amostras biológicas

As amostras de produtos de abortamento (fragmentos ovulares, placenta ou

tecido fetal) foram enviadas pelo Departamento de Obstetrícia/Ginecologia do Hospital

São João para o Departamento de Genética FMUP/HSJ (Campos, 2008). O material

foi dividido em duas partes, uma para realização de cultura celular e posterior análise

de cariótipo e a restante armazenada em RNA later a -80ºC até à sua utilização.

Após realização do cariótipo selecionaram-se 50 amostras com trissomia

(quatro amostras com trissomia 13, sete com trissomia 15, onze com trissomia 16, dez

com trissomia 18, onze com trissomia 21 e sete amostras com trissomia 22).

Adicionalmente foram selecionados 30 controlos com cariótipo normal, provenientes

de interrupções voluntárias de gravidez, com informação clínica de provável infeção ou

abortamentos de causa materna.

1.2. Extração de RNA

As amostras selecionadas foram submetidas a um processo de desagregação

mecânica (MiniLys, Bertin Technologies, França), seguindo-se a extração do RNA total

pela técnica convencional do TriPure (Roche Diagnostics, Indianapolis, EUA) (Anexo

I). Este reagente leva à disrupção da membrana celular e à desnaturação das

nucleases endógenas. Com a adição de clorofórmio e subsequente centrifugação dá-

se a separação da amostra em três fases: uma fase superior incolor, uma interfase

branca e uma fase inferior vermelha, constituída por substâncias orgânicas.

Transferindo a fase superior para um novo tubo é possível recuperar o RNA mediante

precipitação com Isopropanol (Figura 14). O RNA total foi eluído em água livre de

nucleases.

Fig.14 - Esquema das fases obtidas após adição de clorofórmio na extracção de RNA pelo método convencional do TriPure

®


38

A concentração de RNA total extraído por amostra foi avaliada usando o

Nanodrop 2000c (Thermo Scientific).

1.3. Síntese de cDNA

Para a síntese de cDNA, 500ng de RNA total foram sujeitos a transcrição

reversa com primers aleatórios, usando o kit comercial qScript cDNA Supermix

(Quanta BioSciences Inc., Gaithersburg, MD, EUA) de acordo com o protocolo

fornecido pelo fabricante. As condições da PCR estão sumariadas na tabela 1.

Tabela 1: Condições da PCR de transcrição reversa

Temperatura (ºC) Tempo (min)

25,0 5,0

42,0 30,0

85,0 5,0

4,0 ∞

1.4. PCR quantitativo em tempo real

Analisaram-se os níveis de expressão de RNA dos quatro genes-alvo

selecionados (BUB1, BUB1B, MAD2L2 e KIF2C) e de um gene housekeeping

(GAPDH) por PCR quantitativo em tempo real utilizando o sistema StepOne Plus Real-

Time PCR™ (Applied Biosystems, Foster City, EUA). Foram usados ensaios Taqman

Gene Expression Assays (Sondas MGB, marcadas com o corante FAM; Applied

Biosystems, Foster City, EUA) para cada gene: MAD2L2 (Hs01057448_m1), BUB1

(Hs01557701_m1), BUB1B (Hd01084828_m1) e KIF2C (Hs00901710_m1) e para o

controlo GAPDH (Hs99999905_m1). As reações foram levadas a cabo num volume de

20µL, de acordo com o indicado na tabela 2, para cada gene. Foi construída uma reta

padrão com diluições sucessivas para cada gene analisado (Doria et al., 2010).


39

Tabela 2: Componentes da reação de PCR quantitativo em tempo real

Componentes Volume (µL) por reacção

Mix do ensaio de expressão génica TaqMan® (20X) 1,0

Molde de Cdna 2,0

Água livre de RNAses 7,0

Master Mix TaqMan® Fast Universal PCR (2X), No AmpErase

® UNG 10,0

Volume final 20,0

1.5. Análise dos resultados

A análise de resultados foi efetuada usando o software REST 2009 (Relative

Expression Software Tool), que permite estimar variações da expressão génica,

comparando duas populações: casos e controlos. Esta ferramenta considera ainda

fatores como a eficiência da reação e normalização com genes de referência. O teste

de hipótese P(H1) representa a probabilidade de a hipótese alternativa de que a

diferença entre a amostra e os grupos de controlo se deve apenas ao acaso. A

negatividade do PCR em tempo real é definida como a ausência de produto

amplificado após 40 ciclos. O valor de significância foi estabelecido em P<0.05. Como

o software REST usa para o cálculo os valores Ct e a eficiência da reação ao invés de

valores relativos de expressão, assumiu-se que o valor do último ciclo de amplificação

(Ct=40 ciclos) corresponde ao valor de ausência de expressão relativa (Doria et al.,

2010).


40

Amostras Aneuplóides e Triplóides

258

Outras aneuploidias

74

Trissomias dos cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 e 22 e triploidias

184

Não puderam ser contactadas ou não aceitaram participar

164

Amostras analisadas

20

2. Avaliação da origem parental do cromossoma

supranumerário em produtos de abortamento com

trissomia dos cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 ou 22

2.1. Amostras Biológicas

Nas amostras de produtos fetais (fragmentos ovulares, placenta, tecido fetal,

líquido amniótico, vilosidades coriónicas ou sangue do cordão umbilical) com indicação

para estudo molecular procedeu-se à extração de DNA e análise da ploidia, pelas

técnicas de MLPA ou QF-PCR. Após seleção das amostras com trissomia para os

cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 e 22 e triploidia, procedeu-se ao contacto telefónico

com os pais no sentido de aferir a sua disponibilidade para colaborar neste estudo.

Nos casos em que a resposta foi afirmativa, foi obtido consentimento informado e

procedeu-se à recolha do material biológico por esfregaço bucal (IsoHelix SK-1; Cell

Projects Ltd, Kent, Inglaterra). Procedeu-se à secagem dos esfregaços bucais à

temperatura ambiente e ao seu armazenamento até serem utilizados (não mais do que

72 horas). O procedimento de triagem das amostras biológicas a analisar encontra-se

sumariado na Figura 15.

Fig.15 - Processo de seleção das amostras fetais a analisar


41

2.2. Extração de DNA

O DNA fetal foi extraído usando o kit comercial DNeasy® (Qiagen, Hilden,

Alemanha), de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. O DNA materno e

paterno foi extraído a partir de esfregaços bucais recorrendo ao kit comercial JETquick

Blood & Cell Culture DNA Spin Kit (Genomed, Löhne, Alemanha) e eluído em 50 µL de

água estéril bidestilada. A concentração de DNA das amostras foi posteriormente

quantificada usando um Nanodrop 2000c (Thermo Scientific). As amostras foram

armazenadas a 4ºC até à sua utilização.

2.3. PCR quantitativo de fluorescência (QF-PCR)

As reações de QF-PCR foram realizadas usando uma mix de primers

específica para os marcadores de cada trissomia em particular. Os pares de primers

utilizados são compostos por um primer forward marcado com fluorescência e um

primer reverse não marcado e estão sumariados na tabela 4. As condições de

amplificação estão descritas na tabela 3.

Temperatura Tempo (min) Número de ciclos

95,0ºC 5,0 1

94,0ºC 0,48 35

58,0ºC 0.48 1

72,0ºC 1,0 1

72,0ºC 30,0 1

Tabela 3: Condições de amplificação da QF-PCR.


42

Tabela 4 : Primers utilizados para os diferentes Short Tandem Repeats

2.4. Eletroforese capilar

Para cada poço da placa de 96 poços utilizada foram pipetados 13,7 µL de

formamida Hi-Di™ (Applied Biosystems) (agente desnaturante) e 0,3 µL de

GeneScan™-600Liz™ (Applied Biosystems) (padrão interno), bem como 2 µL de

produto de PCR. Posteriormente as amostras foram desnaturadas a 94ºC por 3

minutos, arrefecidas em gelo por 3 minutos e colocadas no sequenciador automático

Primer Sequência Marcação

Tri

ss

om

ia 1

5

D15S1028-F TGTCCTGAAATTCCCAAC VIC

D15S1028-R GAACTGTGCTCTGTGCTC

D15S211-F AAAAGCCCCAGGTAGGG PET

D15S211-R AAGCAGGTGGAATCCTTG

D15S1023-F GGTATTGTTTTGGACCACATCTTAG NED

D15S1023-R GGGAGGCTGAGACAGTTTC

D15S125-F TTCCACACATGACCGC VIC

D15S125-R CCCCTGAAGACCGTGA

Tri

ss

om

ia 1

6

D16S539-F GATCCCAAGCTCTTCCTCTT NED

D16S539-R ACGTTTGTGTGTGCATCTGT

D16S753-F CAGGCTGAATGACAGAACAA VIC

D16S753-R ATTGAAAACAACTCCGTCCA

D16S518-F GGCCTTTTGGCAGTCA PET

D16S518-R ACCTTGGCCTCCCACC

D16S519-F AGCTTACCAGTCTCACAGGG NED

D16S519-R AAACCATGCTTGTCTAGCC

Tri

ss

om

ia 1

8

D18S386-F TCAGGAGAATCACTTGGAAC PET

D18S386-R TCCATGAAGTAGCTAAGCAG

D18S535-F TCATGTGACAAAAGCCACAC 6-FAM

D18S535-R AGACAGAAATATAGATGAGAATGCA

D18S51-F GAGCCATGTTCATGCCACTG VIC

D18S51-R CAAACCCGACTACCAGCAAC

D18S1002-F CAAAGAGTGAATGCTGTACAAACAGC 6-FAM

D18S1002-R CAAGATGTGAGTGTGCTTTTCAGGAG

Tri

ss

om

ia 2

1

D21S11-F GTGAGTCAATTCCCCAAG NED

D21S11-R GTTGTATTAGTCAATGTTCTCC

D21S1411-F ATGATGAATGCATAGATGGATG VIC

D21S1411-R AATGTGTGTCCTTCCAGGC

D21S1412-F CGGAGGTTGCAGTGAGTTG NED

D21S1412-R GGGAAGGCTATGGAGGAGA

D21S1437-F ATGTACATGTGTCTGGGAAGG 6-FAM

D21S1437-R TTCTCTACATATTTACTGCCAACA


43

ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, EUA) onde se deu a

separação dos fragmentos marcados com fluorescência por electroforese capilar.

2.5. Análise dos resultados

A análise dos resultados foi realizada recorrendo ao software GeneMapper

v4.1. (Applied Biosystems, Foster City, EUA). Esta ferramenta permite interpretar os

picos de fluorescência detetados na eletroforese capilar (Figura 16). O software

recorre ao tamanho do padrão incluído em cada amostra para criar uma reta-padrão.

Por comparação com esta reta-padrão foi então determinado o tamanho relativo de

cada fragmento marcado com fluorescência.

Fig.16 - Picos de fluorescência detetados pelo sequenciador automático ABI 3500 e analisados pelo software GeneMapper v4.1 para a amostra 9. O painel superior corresponde ao DNA fetal, sendo visíveis três picos de fluorescência. O painel intermédio corresponde ao DNA materno e o painel inferior ao DNA paterno, apresentando ambos dois picos de fluorescência.

IV. Resultados


47

IV. Resultados


e KIF2C em produtos de abortamento

No sentido de avaliar a expressão de quatro genes envolvidos no controlo do

ciclo celular (MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C) em produtos de abortamento foi

realizada uma reação de PCR quantitativa em tempo real em 50 amostras com

trissomia dos cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 e 22 e em 30 controlos com cariótipo

normal. As informações clínicas relativas às amostras encontram-se sistematizadas na

tabela 5. O cálculo da média das idades maternas para cada trissomia em estudo foi

indicativo de que a trissomia 18 teve a idade materna média mais elevada (39,1 anos),

seguindo-se a trissomia 21 (37,1 anos), a trissomia 15 (36,3 anos) e a trissomia

trissomia 13 (35,8 anos). Para as trissomias 13 e 18 foram obtidas as médias de idade

materna mais baixas, 32,6 anos e 32,5 anos, respetivamente.

Para a análise dos resultados da PCR quantitativa em tempo real usou-se o

software REST 2009 e o gene GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) como

gene de referência para a normalização. Os rácios de expressão génica foram

calculados usando a fórmula:

Os resultados relativos à análise de todas as trissomias em estudo encontram-

se sumariados na tabela 6. Para os genes MAD2L2 e KIF2C não se verificou alteração

dos valores de expressão, comparativamente com o grupo controlo. No que diz

respeito aos genes BUB1 e BUB1B foi possível detetar sobre-expressão relativamente

aos valores obtidos para o grupo controlo (Tabela 6, Figura 17).


48

Tabela 5 : Informação clínica das amostras selecionadas e média das idades maternas para cada trissomia

Nº Amostra Idade Gestacional

(Semanas)

Idade Materna

(Anos)

Média da Idade

Materna (Anos) T

risso

mia

13 A22 12 41

35,8 A23 ? 32

A26 ? 32

A27 ? 38

Tri

sso

mia

15

A36 ? 29

36,3

A37 9 40

A38 ? 32

A39 ? 31

A40 9 42

A41 ? 42

A42 8 38

Tri

sso

mia

16

A04 ? 33

32,6

A05 ? 33

A06 ? 29

A09 ? 31

A10 ? 36

A12 ? 25

A16 5 25

A18 6 40

A19 10 38

A21 ? 35

A50 ? 34

Tri

sso

mia

18

A24 17 37

32,5

A25 ? 20

A28 15 43

A29 ? 39

A30 17 39

A31 9 31

A32 13 36

A33 28 20

A34 13 31

A35 ? 29


49

Tabela 6 : Valores normalizados de expressão génica de MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C considerando todas as trissomias em estudo.

Gene Expressão 95% C.I. P(H1) Resultado

MAD2L2 1,611 0,000 - 11.498,539 0,509 ↔

BUB1 3,826 0,003 - 29.981,105 0,036 ↑

BUB1B 4,023 0,000 - 78.430,260 0,042 ↑

KIF2C 3,353 0,001 - 29.582,351 0,068 ↔

(C.I.: Intervalo de confiança; P(H1): Probabilidade hipótese alternativa)

Tri

sso

mia

21

A01 ? 34

37,1

A02 12 42

A03 9 41

A07 ? 37

A08 18 35

A11 16 40

A13 ? 33

A14 ? 37

A15 ? 35

A17 16 36

A20 18 38

Tri

sso

mia

22

A43 7 34

39,1

A44 ? 41

A45 8 37

A46 ? 41

A47 8 38

A48 ? 42

A49 8 41


50

Tendo em conta a localização do gene BUB1B no cromossoma 15, optou-se

por realizar uma segunda análise com o software REST 2009 excluindo as sete

amostras com trissomia para o cromossoma 15, no sentido de avaliar se a sobre-

expressão detetada para este gene estaria relacionada com a presença de uma cópia

supranumerária do gene BUB1B. Os resultados obtidos mostram que, excluindo as

amostras com trissomia do cromossoma 15, existe sobre-expressão de BUB1 nas

amostras quando comparadas com os controlos. Para os restantes genes testados,

incluindo BUB1B, não foram detetadas alterações dos níveis de expressão

estatisticamente significativas (Tabela 7, Figura 18).

Tabela 7 : Valores normalizados de expressão génica de MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C, excluindo a trissomia 15.

Gene Expressão 95% C.I. P(H1) Resultado

MAD2L2 1,948 0,000 - 12.210,700 0,380 ↔

BUB1 4,235 0,003 - 34.634,942 0,046 ↑

BUB1B 4,006 0,001 - 83.988,820 0,072 ↔

KIF2C 3,495 0,001 - 30.955,781 0,080 ↔

Fig. 17- Diagramas de extremos-e-quartis dos valores normalizados para os genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C; As caixas representam o intervalo interquartil. A linha tracejada representa a mediana dos valores de expressão. Os extremos representam os valores máximos e mínimos observados.


51

Fig. 18- Diagramas de extremos-e-quartis dos valores normalizados para os genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C excluindo as amostras com trissomia 15; As caixas representam o intervalo interquartil. A linha tracejada representa a mediana dos valores de expressão. Os extremos representam os valores máximos e mínimos observados.


52




Com o objetivo de determinar a origem parental do cromossoma

supranumerário ou, no caso da triploidia, do complemento cromossómico adicional, foi

aplicada a técnica de QF-PCR a vinte amostras de produtos de abortamento. Os

resultados obtidos, bem como os dados relativos à idade materna e idade gestacional

na altura do abortamento encontram-se sistematizados na tabela 8.

Tabela 8: Dados clínicos e resultado obtido com a técnica QF-PCR.

Amostra Origem parental

Idade

Gestacional

(Semanas)

Idade Materna

(Anos)

Idade Materna

Média (Anos)

Trissomia 15

01 Materna ? 42

35,3 02 Materna ? 32

03 Materna ? 32

Trissomia 16

04 Materna 9 29

33,5 05 inconclusiva ? 34

06 Materna ? 31

07 Materna 6 40

Trissomia 18

08 Materna ? 40

33,8 09 Materna ? 20

10 Materna 17 37

11 Materna 12 38

Trissomia 21

12 Materna ? 33

38,2

13 Materna 9 41

14 Materna 16 35

15 Materna 18 38

16 Materna 17 44

Triploidia

17 Materna ? 32

32,0 18 Paterna 8 27

19 Materna 12 31

20 Materna 21 38

V. Discussão


55

V. Discussão


e KIF2C em produtos de abortamento

A necessidade de manter um genoma euplóide equilibrado é uma condição

essencial para o sucesso de todos os organismos multicelulares. A divisão celular,

absolutamente necessária para a reprodução e desenvolvimento dos organismos

superiores é um processo extremamente complexo e, apesar de ser altamente

regulado, está sujeito à ocorrência de erros. Se, por algum motivo, este mecanismo

falhar, as células-filhas resultantes podem herdar um complemento cromossómico

anormal, condição denominada como aneuploidia. Se a aneuploidia tiver sido

originada no processo meiótico aquando da formação de gâmetas ou nas primeiras

divisões mitóticas de um embrião, denomina-se aneuploidia constitucional. São

exemplos deste tipo de aneuploidia as trissomias 13, 18 e 21, responsáveis pelos

síndromes de Patau, Edwards e Down, respetivamente. No entanto, a aneuploidia

também pode surgir numa célula ou população de células somáticas diferenciadas,

designando-se neste caso como aneuploidia adquirida (Jackson-Cook, 2011).

Diversos trabalhos indicam que a aneuploidia tem efeitos prejudiciais no

desenvolvimento humano, o que é ilustrado pelo efeito letal ainda em período

embriogénico bem como pelo severo fenótipo associado às raras aneuploidias

compatíveis com a sobrevivência em humanos (Siegel & Amon, 2012, Sheltzer &

Amon, 2011). Também em organismos modelo como leveduras e ratinho é possível

verificar efeitos deletérios associados à alteração do complemento cromossómico

(Torres et al., 2008). Adicionalmente, estes efeitos foram também comprovados ao

nível celular, tendo sido verificado que células aneuplóides têm taxas de proliferação

consideravelmente inferiores quando comparadas com células semelhantes, mas com

complemento cromossómico normal, em condições padronizadas de crescimento

(Sheltzer & Amon, 2011). No entanto, estes dados parecem estar em desacordo com

as evidências que têm vindo a surgir de que um elevado número de tumores tem

cariótipo aneuplóide. A aneuploidia, de facto, tem vindo a ser apontada como uma das

principais características da maioria dos tumores sólidos e de cerca de metade dos

processos oncológicos hematopoiéticos (Pariente, 2012). Trabalhos na área da

oncologia têm vindo a evidenciar que em determinados tumores a aneuploidia

adquirida é transmitida de forma estável ao longo das divisões celulares

subsequentes. No entanto, mais frequentemente, o complemento cromossómico tem


56

tendência a sofrer alterações rápidas ao longo das sucessivas divisões celulares,

sugerindo a existência de defeitos na capacidade das células replicarem ou

segregarem corretamente os seus cromossomas (King, 2008). Este fenómeno é

designado como instabilidade cromossómica (CIN, do inglês chromosomal instability) e

tem vindo a ser descrito em numerosos processos oncológicos na espécie humana

(Yuen & Desai, 2008). No seguimento destas evidências, Thompson e Compton

realizaram a medição direta das taxas de erro de segregação em linhas celulares

derivadas de tumores com instabilidade cromossómica. Esta análise revelou que, em

média, estas células falham na correta segregação de um cromossoma a cada uma a

cinco divisões celulares (Thompson & Compton, 2008). Algumas evidências apontam

no sentido de, ao contrário do que se verifica nos casos de aneuploidia estável, a CIN

não acarretar diminuição da proliferação celular (Zasadil et al., 2013).

Existem diversos mecanismos que podem estar na origem da CIN,

nomeadamente defeitos na coesão cromossómica ou no SAC, número incorreto de

centrossomas, alteração da dinâmica das ligações cinetocoro-microtúbulo e

desregulação do ciclo celular (Thompson et al., 2010). Muito embora a maioria das

situações de CIN derive provavelmente de centrossomas em número anormalmente

elevado (Vitre & Cleveland, 2012), a contribuição da alteração da atividade do SAC

não deve ser ignorada.

A relação entre a aneuploidia constitucional e a instabilidade cromossómica

não está bem definida. No entanto, o aumento da prevalência de determinados tipos

de cancro com instabilidade cromossómica em pacientes com trissomias sugere a

existência de algum tipo de ligação entre estes dois fenómenos (Ganmore et al.,

2009).

Um dos objetivos deste trabalho consistiu na avaliação do nível de expressão

dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e KIF2C em produtos de abortamento aneuplóides

através da técnica de PCR quantitativa em tempo real. Trata-se de genes envolvidos

no mecanismo de checkpoint meiótico e mitótico e, particularmente no caso de KIF2C,

na monitorização da ligação entre cinetocoros e microtúbulos, mecanismos essenciais

para a correta divisão celular. Assim sendo, e atendendo à possível contribuição de

alterações no SAC para o desenvolvimento de CIN, equacionou-se a hipótese de

existirem alterações na expressão destes genes comparativamente a amostras de

produtos de abortamento de constituição cromossómica normal.

Os resultados obtidos neste trabalho indicam que, quando consideradas as

seis trissomias, dois dos genes estudados, BUB1 e BUB1B, se encontram sobre-

expressos nas amostras. Para os genes MAD2L2 e KIF2C não foram detectadas

diferenças significativas entre as amostras e os controlos (Tabela 6, Figura 17).


57

A proteína Bub1, codificada pelo gene BUB1, tem um papel crucial no SAC,

participando não só no recrutamento de outras proteínas fundamentais como também

de forma mais direta no adiamento da progressão para anafase em situações em que

o mecanismo de checkpoint não foi satisfeito. A maioria dos trabalhos acerca de BUB1

foca os efeitos da sua sub-expressão, nomeadamente no que diz respeito à redução

dos níveis ou da funcionalidade da proteína Bub1, associando-os ao desenvolvimento

de processos tumorais e produção de gâmetas haplóides. Os efeitos da sobre-

expressão deste gene não têm sido tão visados pela investigação, pelo que não se

encontram bem documentados. Em leveduras, Warren et al. demonstraram que a

sobre-expressão de BUB1 provoca instabilidade cromossómica, levando à diminuição

da competência dos mecanismos de checkpoint e ao aumento da taxa de erros de

segregação cromossómica (Warren et al., 2002). Em ratinhos mutantes usados como

modelo de cancro da próstata foi também detetada a sobre-expressão deste gene,

estando associada ao desenvolvimento de instabilidade cromossómica (Guo et al.,

2006). Na espécie humana, sabe-se que existe sobre-expressão de BUB1 em

determinados tipos de cancro, nomeadamente gástricos (Grabsch et al., 2003), da

mama (Yuan et al., 2006), e linfomas (Alizadeh et al., 2000). Segundo um trabalho de

Ricke et al, a sobre-expressão de BUB1 pode ser potenciadora do desenvolvimento de

neoplasias de constituição cromossómica aneuplóide por promover erros de

segregação cromossómica (Ricke et al., 2011, Ricke & van Deursen, 2011) e,

consequentemente, CIN. Atendendo ao seu papel protetor da coesão das cromátides-

irmãs (Marchetti & Venkatachalam, 2010), é possível especular que em níveis

demasiados elevados, a proteína Bub1 possa atuar atrasando esta separação,

culminando num aumento da taxa de aneuploidia nas células-filhas.

Relativamente ao gene BUB1B, sabe-se que codifica uma das proteínas

cruciais tanto para o funcionamento do SAC, como para a estabilização da ligação dos

cinetocoros aos microtúbulos, contribuindo assim para a correta segregação

cromossómica (Hanks et al., 2004). A sub-expressão deste gene durante o processo

meiótico, à semelhança do que foi descrito para BUB1, tem vindo a ser associada com

o desenvolvimento de gâmetas aneuplóides e, consequentemente contribuindo para o

aparecimento de aneuploidias constitutivas. Durante a mitose, a redução da expressão

de BUB1B relaciona-se com o desenvolvimento de processos tumorais associados a

instabilidade cromossómica e prognósticos clínicos pouco favoráveis. Mutações

conducentes a expressão reduzida de BUB1B estão ainda implicadas na origem de

uma doença rara denominada Síndrome de separação prematura das cromátides-

irmãs com aneuploidia variegada em mosaico. Esta condição caracteriza-se por uma

elevada instabilidade cromossómica que conduz ao aparecimento de várias


58

aneuploidias em mosaico que, por sua vez, parecem relacionar-se com a elevada

prevalência de diversos tipos de cancro nos primeiros anos de vida ou ainda durante o

desenvolvimento fetal. Por sua vez, diversos trabalhos indicam que a sobre-expressão

deste gene também se correlaciona com determinados tipos de cancro,

nomeadamente da tiróide (Wada et al., 2008), rim (Pinto et al., 2008), mama

(Maciejczyk et al., 2013) e bexiga (Yamamoto et al., 2007), bem como linfomas (Chen

et al., 2013) e neoplasias gástricas (Grabsch et al., 2003, Ando et al., 2010).,

associados a instabilidade cromossómica. Por oposição, um trabalho recente de Baker

et al refere que a sobre-expressão de BUB1B em ratinhos transgénicos tem um papel

protetor relativamente ao surgimento de aneuploidia adquirida e de cancro. Os autores

sugerem que o aumento da expressão deste gene reforça a actividade de vigilância do

SAC, reduzindo assim a incidência de instabilidade cromossómica. Outra hipótese

sugerida no trabalho em questão é a influência desta sobre-expressão em

mecanismos pós-zigóticos em que BubR1 também intervém, nomeadamente

morfogénese e diferenciação (Baker et al., 2013). Estes resultados parecem colidir

com as evidências que associam a sobre-expressão de BUB1B ao desenvolvimento

de processos tumorais. Uma explicação possível é que a sobre-expressão de BUB1B

tenha um papel protector até um determinado limiar, a partir do qual os seus efeitos

passam a ser deletérios.

A sobre-expressão de ambos os genes tem vindo a ser associada ao

desenvolvimento de processos tumorais relacionados com cariótipos aneuplóides, ou

seja, a aneuploidias adquiridas. Até à data, este é o único trabalho a indicar a sobre-

expressão destes genes em produtos de abortamento com diferentes trissomias

constitucionais. Estes resultados podem permitir, em parte, estabelecer um

paralelismo entre as aneuploidias adquiridas e as aneuploidias constitucionais,

nomeadamente no que diz respeito à instabilidade cromossómica. Como foi descrito

anteriormente, diversos trabalhos associam a desregulação de BUB1 e BUB1B ao

desenvolvimento de tumores aneuplóides com instabilidade cromossómica. No caso

das aneuploidias constitucionais, a sobre-expressão detetada pode, pelo menos em

certa medida, ser responsável pelo aumento da prevalência de determinados tipos de

cancro em pacientes com síndromes associados à alteração do complemento

cromossómico, cujo exemplo paradigmático é a síndrome de Down.

Os resultados obtidos na análise em que foram excluídas as amostras com

trissomia do cromossoma 15 continuam a indicar a existência de sobre-expressão de

BUB1. No entanto, para BUB1B já não se verifica o aumento de expressão (Tabela 7,

Figura 18). A discrepância de resultados entre as duas análises realizadas parece

suportar a hipótese de que a sobre-expressão detetada para BUB1B na análise global


59

se poderá dever à presença de uma terceira cópia do gene em questão nas amostras

com trissomia 15.

Embora o aumento da expressão de BUB1 e BUB1B seja significativo do ponto

de vista estatístico, não se tratam de diferenças muito pronunciadas. Assim, existe a

hipótese de o aumento de expressão verificado se tratar de um mecanismo para tentar

colmatar uma eventual perda de função do SAC. Importa também salientar que o facto

de o gene BUB1B se localizar no cromossoma 15 e de este trabalho ter incluído sete

casos de trissomia 15, o que pode ter influenciado os resultados obtidos. Por outro

lado, os níveis elevados de mRNA detetados podem não se traduzir em efeitos ao

nível da quantidade e/ou funcionalidade da proteína. Assim, como perspectivas

futuras, seria importante analisar a funcionalidade e quantidade das proteínas Bub1 e

BubR1, no sentido de confirmar os resultados obtidos através da quantificação relativa

de mRNA. Seria também importante analisar o nível de expressão génica para cada

trissomia em particular, sendo para isso necessário aumentar a dimensão da amostra

para se obterem resultados representativos.


60




Apesar de na triagem inicial terem sido selecionadas 184 amostras de produtos

de abortamento com trissomia dos cromossomas 13, 15, 16, 18, 21 e 22 e triploidia,

apenas 20 casais acederam a colaborar com este estudo (Figura 15). Esta reduzida

adesão poderá estar relacionada com a carga emocional que um abortamento

acarreta. Segundo um estudo conduzido por Adolfsson et al., que consistiu na

realização de entrevistas periódicas a mulheres que experienciaram abortamentos, os

principais sentimentos envolvidos são o luto, a depressão, a revolta e impotência face

ao sucedido (Adolfsson et al., 2004). A maioria dos trabalhos relacionados com o

impacto psicológico de um abortamento foca-se na mãe. No entanto, a maioria dos

pais também experiencia sentimentos de perda, ansiedade e impotência após um

abortamento (Conway & Russell, 2000). Um abortamento pode também ser um fator

gerador de tensão no casal, estando registado um ligeiro aumento de separações e

divórcios em casais com pelo menos um abortamento, comparativamente com casais

que não foram sujeitos a esta condicionante (Gold et al., 2010). Assim, no entender de

alguns casais, a participação neste estudo podia de certa forma reavivar a memória

desse acontecimento traumático, tendo optado por não participar.

Embora a reduzida dimensão da amostra não permita que sejam tiradas

conclusões com relevância estatística, é possível observar que a grande maioria das

aneuploidias analisadas deriva de erros de origem materna (Tabela 8). Esta tendência

está de acordo com o referido na literatura.

Relativamente à trissomia 15, embora não seja muito comum, estando

presente apenas em cerca de 1,4% dos abortamentos espontâneos, existem trabalhos

publicados que indicam uma elevada prevalência da origem materna do cromossoma

supranumerário (Zaragoza et al., 1994). Trabalhos relacionados com as síndromes de

Prader-Willi e Angelman focando dissomias monoparentais fornecem mais

informações acerca da contribuição materna para esta aneuploidia. Assim, sabe-se

que em cerca de 73% das trissomias 15 de origem materna a não-disjunção ocorre na

meiose I, em 12% dos casos o erro ocorre em meiose II e os restantes 15% são

atribuídos a mecanismos pós-zigóticos, também eles com origem materna (Robinson

et al., 1996). Neste trabalho foram analisados apenas três casos de trissomia 15,

tendo todos eles origem materna, o que está de acordo com o descrito na literatura.


61

A trissomia 16 é a aneuploidia mais comum nas conceções humanas, embora

seja incompatível com a vida, exceto quando em mosaico. Segundo vários estudos

visando a origem parental e meiótica desta condição, praticamente todos os casos

descritos têm origem na primeira divisão meiótica materna. Este padrão de não-

disjunção é específico para este cromossoma e ainda não foi devidamente elucidado.

Existem evidências que apontam no sentido de este padrão de não disjunção derivar

de configurações anormais dos locais de crossing-over (Garcia-Cruz et al., 2010). Os

resultados obtidos neste trabalho estão enquadrados com os anteriormente descritos,

uma vez que três das trissomias 16 analisadas derivaram de erros de disjunção

materna. A origem parental da quarta amostra analisada foi inconclusiva pois os pais

eram homozigóticos para os marcadores testados. Quanto ao efeito da idade materna,

os casos descritos em trabalhos anteriores referem que a trissomia 16 é transversal a

todas as idades maternas. O aumento da idade materna relaciona-se com o aumento

da incidência de trissomia 16 de forma muito menos acentuada do que o que se

verifica com outras trissomias. A média de idade materna das amostras incluídas

neste trabalho foi de 33,5 anos, sendo a segunda mais baixa do conjunto de cinco

alterações cromossómicas numéricas analisadas, estando assim de acordo com o que

foi previamente descrito.

No que diz respeito à trissomia 18, os resultados obtidos neste trabalho vão de

encontro aos descritos em publicações anteriores, segundo as quais cerca de 91%

dos casos derivam de erros de não-disjunção materna, 31% dos quais devido a erros

na meiose I, 60% devido a mecanismos de não-disjunção em meiose II e cerca de 8%

devido a erros mitóticos que levaram à duplicação do cromossoma materno (Nicolaidis

& Petersen, 1998). Nas quatro amostras analisadas, a aneuploidia foi associada a

origem materna. A média da idade materna foi de 33,8 anos, estando de acordo com

trabalhos que indicam um aumento da prevalência desta condição quando a idade

materna ultrapassa os 30 anos (Savva et al., 2010).

A trissomia 21, mecanismo responsável pela maioria dos casos de síndrome de

Down, tem sido detalhadamente estudada ao longo das últimas décadas. Os

resultados provenientes destes trabalhos indicam que, na maioria dos casos, o

cromossoma supranumerário tem origem materna, contribuindo para

aproximadamente 90% do total. De entre estes casos, três em cada quatro terão

resultado de erros de disjunção em meiose I. Mecanismos de não disjunção na meiose

paterna são responsáveis por cerca de 8% do total de casos, dividindo-se de forma

praticamente equitativa entre não disjunção em meiose I ou em meiose II. Erros de

disjunção nas divisões pós-zigóticas estão na base de uma minoria de 2% do total de

casos. Relativamente à idade materna média, os resultados provenientes da literatura


62

mostram que é mais elevada nos casos de origem materna (cerca de 32 anos), não

havendo diferenças significativas entre meiose I e meiose II. Nos casos com origem

paterna ou pós-zigótica a média de idade materna é semelhante (aproximadamente 28

anos) (Hassold & Sherman, 2000). Neste trabalho foram analisados cinco casos de

trissomia 21, tendo todos eles origem materna. A média da idade materna foi de 38,2

anos, o que está de acordo com a relação amplamente descrita entre esta condição e

a idade materna avançada. Das aneuploidias analisadas, a trissomia 21 apresentou a

idade materna média mais elevada.

A origem parental da triploidia permanece de certa forma controversa. Estudos

citogenéticos antigos indicavam que a maioria das triploidias teria origem paterna,

nomeadamente devido a mecanismos de dispermia. Trabalhos mais recentes,

baseados na análise de microssatélites indicam uma prevalência da origem materna.

Esta discrepância pode dever-se a diferenças nas populações em estudo. Segundo

Zaragoza et al., a dispermia é a principal responsável pela ocorrência de triploidias

detectadas em amostras de idade gestacional de 5-18 semanas. Fetos com triploidia

de origem materna têm tendência a abortar mais precocemente ou, caso resistam às

primeiras semanas de gestação, tipicamente resultam em abortamentos tardios, de

fetos já consideravelmente desenvolvidos (Zaragoza et al., 2000). No que diz respeito

à triploidia, os resultados obtidos neste trabalho não estão de acordo com o padrão

descrito anteriormente. No entanto, foram analisadas apenas quatro amostras sendo

que para uma delas não foi possível obter informação relativa à idade gestacional.

Assim sendo, esta discrepância pode ser motivada por um enviesamento dos

resultados deste estudo, motivado pela reduzida dimensão da amostra que pode não

ser representativa da população.

VI. Conclusão


65

VI. Conclusão

Em conclusão, devido ao elevado impacto clínico da aneuploidia, é importante

conhecer detalhadamente os mecanismos que estão na sua origem e na origem dos

fenótipos a si associados.

Relativamente à análise da expressão dos genes MAD2L2, BUB1, BUB1B e

KIF2C em produtos de abortamento de constituição cromossómica aneuplóide, os

resultados obtidos permitem equacionar a existência de uma relação entre a

aneuploidia constitucional e a instabilidade cromossómica, estabelecendo-se, de certa

forma, um paralelismo com a aneuploidia adquirida.

No que diz respeito ao estudo da origem parental do cromossoma

supranumerário em produtos de abortamento com trissomias, a reduzida dimensão da

amostra não permitiu conclusões significativas. Embora os resultados obtidos estejam

de acordo com o referido na literatura, é necessário aumentar a dimensão da amostra.

Assim, de forma geral, os resultados obtidos neste trabalho contribuíram para

aumentar o conhecimento na área da aneuploida, particularmente no que diz respeito

à aneuploida em produtos de abortamento.

VII. Referências Bibliográficas


69

VIII. Referências Bibliográficas

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Anexos


79

Anexo I

Extração de RNA – Método Clássico do Trizol

1. Em gelo, distribuir 1 mL de solução de extracção de RNA (TriPure®, Roche

Diagnostics, Indianapolis, EUA ) pelos tubos com esferas.

2. Selecionar um pequeno fragmento de tecido e triturá-lo em placa de Petri, com

o auxílio de lâminas de bisturi.

3. Colocar no Minilys (Bertin Technologies, França) durante 10 segundos à

velocidade máxima (se o tecido não ficar devidamente homogeneizado, repetir

este passo).

4. Incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente.

5. Transferir para um eppendorf livre de nucleases com o auxílio da P1000.

6. Adicionar 200 µL de clorofórmio.

7. Agitar bem (Vórtex – 15’’).

8. Incubar 3 min à temperatura ambiente.

9. Centrifugar 15 min., 4ºC, 10600rpm.

10. Transferir o sobrenadante (fase superior) obtido em 9 para um eppendorf livre

de nucleases.

11. Adicionar lentamente 500µL de isopropanol e homogeneizar, invertendo várias

vezes o eppendorf.

12. Incubar 10 min à temperatura ambiente para o RNA precipitar.

13. Centrifugar 10 min, 4ºC, 10600rpm.

14. Descartar cuidadosamente o sobrenadante, sem perturbar a pellet.

15. Adicionar 1mL de etanol a 75% e lavar a pellet utilizando o vórtex (a pellet deve

destacar da parede do eppendorf).

16. Centrifugar durante 5 min., 4ºC, 8400rpm.

17. Descartar cuidadosamente o sobrenadante, sem perturbar a pellet.

18. Secar a pellet ao ar, à temp. ambiente.

19. Ressuspender a pellet em 30-200µL de RNA Storage Solution ou H2O estéril

livre de nucleases.

Deixar em gelo durante 30 min e guardar a -80ºC.

estudo de produtos de abortamento: avaliação da expressão dos … · 2019-06-06 · estudo de...

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