ENGENHARIA BIOQUÍMICA

12/03/12

Ação das Enzimas

As enzimas diminuem a energia de ativação da reação catalisada ao se ligarem ao substrato

formando um complexo denominado enzima-substrato sem afetar a constante de equilíbrio. As

enzimas atuam em baixas concentrações em condições amenas de temperatura e, sendo moléculas

proteicas, podem sofrer desnaturação quando em temperaturas mais elevadas. Os aspectos

moleculares da interação entre enzima e substrato ainda não estão completamente esclarecidos.

Normalmente a interação entre enzima e substrato se dá por forças fracas, como as de van der

Waals ou pontes de hidrogênio, formando então o complexo E-S. Um modelo bastante utilizado para

ilustrar a formação do complexo E-S é o modelo da chave-fechadura:

As enzimas podem necessitar de um grupo não proteico para se tornarem ativas, que

normalmente são chamados de cofatores, que podem ser alguns íons metálicos, moléculas orgânicas

complexas também chamadas de coenzimas, e também algumas vitaminas. Uma enzima que contém

um grupo não-proteico é chamada de holoenzima. A parte proteica é chamada de apoenzima, ou

seja, holoenzima = apoenzima + cofator.

Denominamos de isozimas as enzimas que apresentam estrutura molecular diferente, mas

catalisam a mesma reação.

Fatores que afetam a ação das enzimas

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Diversos fatores contribuem para a catálise enzimática. Vimos anteriormente que as enzimas,

devido ao fato de serem moléculas proteicas, apresentam estruturas primárias, secundárias e

terciárias (algumas, a quaternária também) e que essas estruturas são importantes na interação E-S e

são fortemente dependentes do pH, ou seja, o pH no qual a enzima está dissolvida induzirá uma

determinada distribuição de cargas elétricas, que acabará afetando sua estrutura. Em geral, podemos

dizer que qualquer fator que provoque uma mudança na estrutura da enzima poderá provocar a

desnaturação da molécula, o que provocará um efeito sobre a atividade enzimática. Dentre os

principais fatores que afetam a ação das enzimas, podemos citar:

1) pH

2) Temperatura

3) Forças fluídas (hidrodinâmicas, pressão hidrostática, tensão interfacial)

4) Agentes químicos presentes no meio reacional (álcool, uréia, íons salinos, peróxidos)

5) Radiações (luz, sonoras, ionizantes, entre outros)

1. Efeito do pH sobre a atividade enzimática

As enzimas, sendo moléculas proteicas, são formadas por diferentes aminoácidos unidos por

ligações peptídicas. Os resíduos dos aminoácidos presentes na estrutura primária da molécula

apresentam grupos iônicos com determinados potenciais de ionização (pK), sendo assim que suas

elétricas irão depender do pH em que se encontram, logo a distribuição de cargas na molécula como

um todo será afetada pelo pH e logicamente também no sítio catalítico, ou seja, haverá uma

distribuição de cargas que fará com que a molécula tenha uma configuração mais favorável para

interagir com o substrato.

A figura abaixo ilustra um comportamento típico da distribuição de cargas elétricas líquidas de

uma molécula proteica em função do pH. Observa-se que haverá um pH em que a carga elétrica

líquida da molécula é nula e este pH é denominado pI (pH Isoelétrico)

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Assim, podemos dizer que as enzimas são mais ativas em determinadas faixas de pH e haverá

um determinado pH da solução enzimática em que a atividade será máxima, conforme podemos

observar na figura abaixo.

Geralmente o pH ótimo de ação de uma enzima é determinado experimentalmente estando a

atividade enzimática sob diferentes pH’s. Cabe lembrar que o pH também poderá alterar as

características do substrato, o que também afetará a cinética enzimática.

Alguns exemplos típicos para algumas enzimas:

● lipase do pâncreas, pH ~ 8

● pepsina, pH ~ 1,5-1,6

● urease, pH ~ 7

● invertase, pH ~ 4,5

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● amilase do malte, pH ~ 4,6-5,2

● amilase do pâncreas, pH ~ 6,7-7,0

2. Efeito da Temperatura sobre a atividade enzimática

Como vimos, as enzimas atuam, em sua grande maioria, em temperaturas amenas, por

exemplo entre 15 e 70°C. Como toda reação química, a velocidade da reação enzimática aumenta

com o aumento da temperatura, até um certo valor e neste caso dizemos que há uma ativação

térmica da reação enzimática, que pode ser explicada pela Lei de Arrhenius. A partir de uma

determinada temperatura, que é a Tmax de atividade, a velocidade da reação enzimática começa a

diminuir. Isto ocorre porque mais e mais moléculas de enzimas sofrem desnaturação à medida que se

aumenta a temperatura acima da Tmax. Assim dizemos que há uma desativação térmica. A figura

abaixo ilustra o efeito típico da temperatura sobre a atividade enzimática.

Observa-se que as enzimas possuem uma temperatura na qual a atividade é máxima. É

importante observar que normalmente a desativação térmica é irreversível e também vai depender

de quanto tempo a molécula está submetida à estas temperaturas que provocam a desnaturação.

Por exemplo, um aumento de temperatura de 30 para 40°C pode provocar um aumento de 1,8x na

atividade enzimática, mas também pode provocar um aumento de 41x na desnaturação enzimática.

Também, a temperatura irá afetar parâmetros como a velocidade máxima da reação e as constantes

cinéticas que veremos mais adiante.

Cabe lembrar que também as temperaturas de congelamento podem ter efeito sobre as

estruturas das moléculas e também provocar a desnaturação em baixas temperaturas.

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3. Efeito das forças fluídas sobre a atividade enzimática

Por forças fluidas entendemos as forças hidrodinâmicas da pressão hidrostática e as tensões

interfaciais. Em processos industriais, é comum o armazenamento de soluções em tanques, reatores,

etc., bem como o transporte de soluções através de tubulações utilizando bombas, isso gera forças e

tensões de cisalhamento que podem afetar as estruturas das enzimas, provocando a desnaturação.

Também é comum operações de agitação e mistura que igualmente contribuem com forças que

podem provocar a desnaturação enzimática. Também as enzimas possuem resíduos de aminoácidos

que podem ser polares ou apolares (hidrofílicos ou hidrofóbicos), o que faz com que as moléculas

tenham caracteristicas anfifílicas

4. Efeito dos agentes químicos sobre a atividade enzimática

Diversas substancias químicas quando presentes ou adicionadas no meio reacional enzimático

podem interagir quimicamente com as moléculas de enzimas, por exemplo, formando pontes de

hidrogênio, o que irá afetar a estrutura da molécula de enzima e consequentemente a atividade

enzimática, por exemplo, agentes como etanol e outros solventes, a presença de sais como sulfato de

amônio, cloreto de sódio, etc. (alteração da força iônica do meio), a presença da ureia, etc. que

podem alterar as propriedades dielétricas do meio, podem provocar o fenômeno da solvatação, e,

consequentemente, a desnaturação das moléculas de enzima. Alguns sais em concentrações muito

elevadas podem provocar o efeito salting-out, que é quando provoca a indisponibilização de água e

consequente diminuição da solubilidade da enzima, ou seja, pode provocar a precipitação das

proteínas do meio.

5. Efeito das radiações sobre a atividade enzimática

É sabido que as radiações eletromagnéticas, a ultravioleta, luz visível, dentre outras, afetam

algumas reações e estruturas orgânicas, pois transportam uma determinada energia, tal energia pode

ser absorvida em maior intensidade por alguns grupos químicos aromáticos presentes em alguns

resíduos de aminoácidos e pode provocar um desequilíbrio nas forças que mantém a estrutura

enzimática; dependendo da intensidade da radiação, poderá provocar a quebra de ligações ou então

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provocar um aquecimento da solução com as consequências vistas para o efeito da temperatura

(desnaturação térmica). Efeito similar é obtido com as ondas ultrassônicas.

19/03/12

Cinética Enzimática

Como vimos, a cinética das reações enzimáticas é afetada pela concentração da enzima, pH,

temperatura, presença de cofatores e outros agentes químicos, existência de forças e tensões, etc.

Também, a concentração do substrato é outro fator importante que afeta a cinética enzimática. É

importante conhecer e analisar os diferentes efeitos de diferentes fatores sobre a velocidade das

reações enzimáticas de tal forma que permita o melhor entendimento da natureza da catálise e seus

mecanismos para determinada enzima.

Em termos cinéticos, as enzimas podem ser classificadas em:

1) ENZIMAS CLÁSSICAS: Reações com essas enzimas mostram que a cinética é do tipo de

saturação e a velocidade da reação enzimática em função da [] do substrato mostra um

comportamento assintótico conhecido como Modelo de Michaelis Menten.

2) ENZIMAS REGULATÓRIAS: As enzimas regulatórias não obedecem ao Modelo Clássico de

Michaelis-Menten, e normalmente essas enzimas têm dois tipos diferentes de sítios, um é o sítio

catalítico, onde o substrato se liga e outro é um sítio regulatório onde se liga um regulador. Quando o

regulador se liga na molécula, provoca uma alteração no sítio catalítico e altera suas propriedades

cinéticas.

Cinética de Michaelis-Menten

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Considere uma reação enzimática na qual um substrato S é transformado num produto P pela

enzima E. Considere o mecanismo abaixo em que uma enzima E, numa interação reversível com o

substrato S formando um complexo E-S que se transforma em produto P de forma irreversível e

liberando o catalisador. Seja S a [] do substrato, E a [] da enzima e E-S a [] do complexo Enzima-

Substrato.

Desenvolvimento:

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Graficamente, temos:

Observa-se que a [] da enzima afeta a Vmax da reação dentro de certos limites e pode-se

observar que se duplicarmos a [] da enzima, a velocidade da reação enzimática também duplicará.

[DEMONSTRAR A SITUAÇÃO ACIMA]

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Também a [] de substrato na qual a velocidade da reação é metade da Vmax fornece o Km

(DEMONSTRAR ISSO).

Também podemos observar que nas altas [] de substrato, a velocidade da reação enzimática

comporta-se como se fosse uma reação de ordem zero, ou seja, alterando-se a [S], a velocidade não

será alterada e sempre será Vmax (DEMONSTRAR).

Já nas baixas [S], a velocidade da reação enzimática comporta-se como se fosse de 1a ordem.

As unidades de velocidade podem ser em

Determinação das constantes cinéticas Vm e Km.

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Para se determinar Vm e Km, podemos lançar mão de métodos gráficos e/ou rearranjar a Eq.

de MM numa forma linearizada e com os pares de dados cinéticos V x S, conseguimos determinar os

valores numéricos de Km e Vm sob determinadas condições da reação. Isso é importante quando

desejamos resolver a equação de projeto de um determinado reator enzimático, seja em batelada ou

contínuo.

Há varios metodos disponiveis e que podem ser utilizados na determinação de Vm e Km e o

que os diferencia entre si será a precisão final dos valores obtidos. Nesses métodos, é necessário um

conhecimento prévio de V e S (tais dados cinéticos podem ser obtidos pode diferentes métodos,

sejam eles diferenciais ou integrais. Um método bastante comum para obtenção de V e

correspondente S é o método das velocidades iniciais.

Os três métodos mais comuns para de determinar Km e Vm são:

1. Método do Duplo Recíproco ou Lineweaver-Burk (LB) - Neste caso, rearranjamos a

Equação a de Michaelis-Menten numa forma linear do tipo vs . Isto é possível fazendo a inversão

de cada membro da Eq. MM: sabendo que

então teremos . Logo

Que é a equação de uma reta do tipo y = b + ax.

Assim, fazendo-se a regressão linear obtemos um coeficiente angular e um coeficiente linear.

Conhecendo-se o coeficiente linear, determinamos Vm. Determinado o valor de Vm e conhecendo-se

o valor do coeficiente angular, determinamos Km. [DEMONSTRAR!]

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21/03/12

2. Método de Eadie-Hofstee (EH) - Plota-se vs .

A linearização é a seguinte:

→ y=b - a.X

Coef. Linear: Vm

Coef. Angular: Km

3. Método de Hanes-Woolf (HW) - Plota-se vs .

----> y=b + a.X

4. Método Gráfico ou Método de Eisenthal & Cornish-Bawden - O Método Gráfico para a

determinação de Km e Vm é considerado superior, estatisticamente, em relação aos três métodos

vistos anteriormente e é fortemente sugerido para o cálculo de Km e Vm. O método consiste em

colocar num eixo gráfico tanto para v quanto para S os pares v e S, então, traça-se uma linha reta

através do par, ou seja,

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Fazendo esse procedimento para os diversos pares de v e S, observa-se que as retas tendem a

se interceptar num único ponto, então determina-se Km e Vm nos respectivos eixos.

Neste Método Gráfico, as principais vantagens são que nenhum cálculo é necessário e que os

pontos experimentais ou dados cinéticos ruins são facilmente reconhecidos.

Exemplo: Os seguintes dados cinéticos foram obtidos para a decomposição da ureia pela

urease e são mostrados na tabela abaixo:

[Ureia], kmol/m³

0,20 0,02 0,01 0,005 0,002

v kmol/m³.s

1,08 0,55 0,38 0,20 0,09

Determine a constante de Michaelis-Menten (Km) e a velocidade máxima para a

decomposição da ureia pela urease (Vm)

a. Pelo Método LB

b. Pelo Método EH

c. Pelo Método HW

d. Pelo Método Gráfico

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26/03/12

Reações Enzimáticas na presença de Inibidores

Quando certas substâncias estão presentes em uma reação enzimática e provocam uma

diminuição nas taxas da reação, nós dizemos que tais substâncias inibem a reação enzimática e por

isso são chamadas de inibidores. Alguns inibidores se ligam irreversivelmente à enzima e anulam a

atividade enzimática. Dentre esses tipos de inibidores temos os íons de metais pesados como

chumbo, mercúrio, cádmio, etc. Alguns inibidores se dissociam mais facilmente após se ligarem à

enzima e dentre esses inibidores podemos ter: 1. Os inibidores competitivos, 2. Os inibidores não-

competitivos.

1. Cinética Enzimática na Presença de Inibidor Competitivo

Como o nome diz, um inibidor competitivo compete com o substrato pelo sítio ativo da

enzima. Geralmente são substâncias que possuem semelhança com o substrato. O seguinte

mecanismo foi proposto para explicar a inibição competitiva.

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Graficamente:

Comparando-se com a Eq. de MM clássica, nota-se que a velocidade máxima da reação não se

altera, na presença de um inibidor competitivo, no entanto, Km aumenta, o que provoca uma

diminuição na velocidade da reação. Observa-se que os efeitos do inibidor competitivo podem ser

atenuados trabalhando-se com elevadas [S].

Um exemplo prático de inibição competitiva pode ser observado em algumas drogas

antibióticas do grupo das sulfas, como a sulfanilamida. A sulfanilamida tem estrutura molecular

muito similar à do ácido p-aminobenzoico que é utilizado pela célula microbiana para produzir o

ácido fólico. A sulfanilamida bloqueia esta rota bioquímica e acaba por matar o MO.

Ácido p-aminobenzoico Sulfanilamida

Determinação e Km e Vm na presença do inibidor competitivo: procede-se de forma análoga

aos métodos vistos anteriormente (LB, HW, EH, e Gráfico) sendo também necessários os pares v vs S:

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2. Cinética Enzimática na Presença de Inibidor Não-Competitivo

Inibidores não-competitivos podem se ligar ou à enzima ou ao substrato dando um complexo

ternário EIS [enzima-inibidor-substrato], prejudicando a formação do produto. O seguinte mecanismo

foi proposto:

Graficamente:

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Inibição da velocidade da reação nas altas concentrações de substrato

É bastante comum que elevadas concentrações de substrato provoquem um efeito inibitório,

ou seja, há uma diminuição na velocidade da reação a partir de uma determinada concentração

crítica de substrato no meio. O seguinte modelo foi proposto para esse tipo de inibição pelo

substrato:

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Ex.: A hidrólise da ureia pela urease pode apresentar inibição. Dados cinéticos obtidos:

Concentração do Substrato

[S] = 0,2M [S] = 0,02M

1/v [I] 1/v [I]

0,22 0 0,68 0

0,33 0,0012 1,02 0,0013

0,51 0.0027 1,50 0,0022

0,76 0,0044 1,83 0,0032

0,88 0,0061 2,04 0,0037

1,10 0,0080 2,72 0,0044

1,15 0,0093 3,46 0,0057

Pergunta-se: Qual é o tipo de inibição? Justifique sua resposta e determine Ki.

Inibição não-competitiva, Km=0,07525 mol/L , Ki=0,00226 mol/L

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28/03/12

Modelo Cinético para Enzimas Regulatórias:

Para o caso das enzimas regulatórias, a cinética é um pouco mais complexa visto que essas

enzimas possuem mais de um sítio de ligação. Num dos sítios ocorre a ligação de uma substância que

provoca uma alteração no sítio de ligação do substrato de tal forma que poderá haver uma maior

facilidade para que o substrato atinja o sítio catalítico, mas também pode haver substâncias que

provocam alterações no sítio de ligação do substrato que acabam por dificultar a entrada do

substrato do sítio catalítico. No primeiro caso, o efeito é conhecido como cooperativo ou alostérico.

O modelo matemático proposto é:

Quando n>1, indica cooperação positiva.

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Determinação do coeficiente de cooperatividade (n)

Rearranjando a equação acima:

y = a. x - b

TECNOLOGIA DAS ENZIMAS IMOBILIZADAS

Vimos anteriormente que a enzima normalmente em solução aquosa interage com o

substrato para formar um produto. Normalmente a enzima se encontra diluída num meio reacional e

aí dizemos que a enzima é livre. Uma problemática que surge desse caso é que no final teremos uma

mistura de Enzima, Substrato não convertido e Produto, e como a enzima se encontra muito diluída,

fica praticamente inviável a sua reutilização e ela acaba sendo um contaminante no produto (quando

não é possível recuperá-la).

Logo, a imobilização de enzimas apresenta inúmeras vantagens:

1) As enzimas podem ser reutilizadas (vantagens econômicas)

2) Elimina os processos de recuperação e purificação enzimática

3) As enzimas podem ganhar maior estabilidade

4) A pureza do produto é melhorada e problemas com tratamento de efluentes são

minimizados

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Métodos de Imobilização:

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Os principais métodos de imobilização das moléculas de enzima estão ilustrados na figura

abaixo. Podemos dizer que as duas principais categorias de imobilização são:

1. Imobilização superficial (em superfícies);

2. Imobilização interna ou confinamento

Imobilização por confinamento

É quando as moléculas de enzimas ficam confinadas num pequeno espaço (ou volume).

Podemos ter o confinamento por membranas, o microencapsulamento e também a imobilização ou

aprisionamento em matrizes poliméricas. Neste último caso, pode ser utilizado alginato de cálcio,

ágar, -carragena, colágeno, géis de poliacrilamida, entre outros. Também, podem ser utilizados

outros componentes. Para o caso da imobilização entre membranas semipermeáveis de tal modo

que os poros da membrana mantenham as moléculas de enzima retidas no confinamento, porém

devem pemitir a passagem do substrato e do produto. As moléculas de enzimas também podem ser

imobilizadas por microencapsulamento quando se formam pequenas esferas formadas por uma

membrana porosa que são capazes de reter as moléculas de enzima mas também devem permitir a

passagem do substrato e do produto formado.

Uma problemática que surge nesses vários tipos de confinamento de moléculas de enzima é

que algumas moléculas podem se libertar para o meio reacional devido à não uniformidade na

distribuição dos poros das membranas. Também poderá haver severas limitações difusionais, seja

das moléculas do substrato, seja do produto. Outro problema que pode surgir é um menor controle

das condições microambientais (dentro da membrana). Muitos desses efeitos negativos podem ser

atenuados utilizando diferentes matrizes e condições de processamento, pode-se reduzir o tamanho

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das particulas ou o diametro das microcapsulas, de tal modo a se obter um ambiente reacional mais

favorável.

Imobilização superficial

Os dois principais tipos de imobilização de enzimas em superfícies de matrizes ou suportes são

a imobilização por adsorção ou por ligações covalentes entre as moléculas de enzimas e os suportes.

A adsorção se refere a uma ligação entre as moléculas de enzima e grupos específicos num suporte

normalmente por forças fracas ou ligações iônicas (adsorção iônica) devido ao compartilhamento de

íons entre o suporte e as moléculas de enzima. Normalmente, o sítio catalítico não é alterado no

processo e quase que toda a atividade da enzima é mantida após a imobilização por adsorção. Uma

problemática que surge nesse tipo de imobilização é que devido à presença de forças hidrodinâmicas

fortes poderá ocorrer a dessorção de moléculas, ou seja, poderá haver um “escape” de moléculas

para a solução, já que as forças de adsorção são fracas. A dessorção de moléculas de enzimas

também poderá ocorrer caso haja alterações no pH do meio reacional, visto que o pH tem um

importante papel na manutenção das cargas elétricas das enzimas. Isto pode ser resolvido

promovendo-se ligações cruzadas (cross-linking) entre as moléculas de enzimas, utilizando, por

exemplo, glutaraldeído, bis-diazobenzidina e também o ácido 2-2-dissulfônico. No entanto, deve-se

observar que poderá ocorrer o bloqueio de sítios catalíticos.

A imobilização por ligação covalente é quando moleculas de enzimas reagem com grupos

químicos específicos de tal modo a formar uma ligação covalente entre as enzimas e o suporte. Os

principais grupos químicos que reagem nesses processos são os grupos amino, grupos carboxílicos,

grupos hidroxilas e grupos sulfidrilas, que obviamente não podem estar nos sítios ativos. Para se

evitar este problema, efetua-se antes da imobilização o bloqueio do sítio ativo, seja com o próprio

substrato ou substância analoga (por exemplo, um inibidor competitivo), procedendo-se em seguida

a imobilização com um sítio ativo protegido. Os gurpos funcionais presentes na superfície do suporte

(ou matriz) podem ser ativados quimicamente utilizando brometo de cianogênio, carbodiimida e

glutaraldeído de acordo com o grupo químico que se quer ativar. Por exemplo, a Tabela 3.3 (Shuller)

ilustra os principais métodos para promover a ligação covalente de enzimas a um suporte específico.

04/04/12

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Tecnologia das Enzimas Imobilizadas [cont]:

Imobilização covalente na superfície de suportes (matrizes):

ATIVAÇÃO QUÍMICA:

- Com -OH: Uso de brometo de cianogênio

Uso de S-triazina

- Com -NH2: Por diazotização (NaNO2 + HCl)

Com glutaraldeído

- Com -COOH: Via derivados de azida

Uso de carbodiimida

Características desejáveis do suporte de imobilização enzimática:

Os materiais mais adequados para serem utilizados como suportes de imobilização

enzimática, bem como o método de imobilização variam dependendo da enzima e da aplicação em

particular. Os dois principais critérios usados na seleção de um material suporte são:

1. A capacidade de ligação existente no suporte que dependerá da densidade de carga dos

grupos funcionais, da porosidade e da hidrofobicidade da superfície do suporte.

2. Estabilidade e retenção da atividade enzimática, que dependerá dos grupos funcionais

existentes no suporte e das condições microambentais. Caso a imobilização provoque

alterações conformacionais na estrutura da enzima ou se o grupo reativo presente no sítio

catalítico estiver envolvido na ligação química entre matriz e proteína, poderá ocorrer perda

da atividade enzimática após a imobilização. Também, caso o sítio catalítico fique orientado

para a superfície do suporte, poderá ocorrer um impedimento de acesso do substrato até o

sítio catalítico.

[comentário]

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A imobilização normalmente afeta a estabilidade térmica das enzimas, que geralmente

aumenta após a estabilização devido à presença de barreiras difusionais térmicas e também devido a

uma maior dificuldade que a molécula terá para se deformar.

Aplicações da catálise enzimática

As enzimas podem ter diversas aplicações, sejam médicas ou industriais. A Tabela 3.5 do

Shuller mostra algumas enzimas de importância industrial [tradução abaixo].

Amilase Bacillus subtilis, Aspergillus niger Hidrólise do amido, produção de glicose

Glicoamilase A. niger, Rhizopus niveus, Endomycopsis Sacarificação do amido, produção de glicose

Tripsina Pâncreas animal Amaciante de carne, remoção de turbidez na cerveja

Papaína Mamão papaia Auxílio na digestão, amaciante de carne, aplicações médicas

Renina Estômago de bezerros Manufatura de queijo

Glicose isomerase Flavobacterium arborescens, Bacillus coagulans, Lactobacillus brevis

Isomerização da glicose em frutose

Penicilinase B. subtilis Degradação da penicilina

Glicose oxidase A. niger Glicose ácido glucônico, produção de ovo em pó

Lipases Rhizopus, pâncreas Hidrólise de lipídios, auxílio na digestão e flavorização

Invertase S. cerevisae Hidrólise da sacarose para posterior fermentação

Pectinase A. oryzae, A. niger, A. flavus Clarificação de sucos de frutas, hidrólise da pectina

Celulase Trichoderma viride Hidrólise da celulase

* Fazer resumo da seção 3.6

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09/04/12

QUESTÕES:

1. Considere as seguintes enzimas ou classe de enzimas:

01. Proteases

02. Pectinases

03. Lipases

04. Amilases e glicoamilases

05. Celulases e hemicelulases

06. Lactases

07. Invertase

08. Glicose isomerase

09. Glicose oxidase

10. Asparaginase

11. Penicilinases

12. Aspartase

13. Urease

Comente sobre essas enzimas com respeito à suas fontes (de onde são extraídas/produzidas),

bem como as respectivas aplicações industriais ou médico-farmacêuticas.

Resposta:

1. Proteases

As proteases hidrolisam proteínas em unidades peptídicas e constitui um grande e

industrialmente importante grupo de enzimas. As proteases constituem cerca de 60% do mercado

total de enzimas. Proteases industriais são obtidas de bactérias (Bacillus), bolores (Aspergillus,

Rhizopus e Mucor), pâncreas animal e plantas. Maior parte das proteases são endoproteases.

Proteases são utilizadas no processamento de alimentos, tal como preparação de queijo (renina),

panificação, amaciamento de carne (papaína, tripsina) e preparo de cerveja (tripsina, pepsina); em

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detergentes para a hidrólise das manchas proteicas (subtilisina Carlsberg); e no bronzeamento e

tratamento médico de ferimentos.

2. Pectinases

As pectinases são principalmente produzidas por A. niger. Os principais componentes nas

pectinases são a pectina esterase, poligalacturonase e polimetilgalacturonato-liase. As pectinases são

utilizadas no processamento de sucos de frutas e na preparação de vinho para aumentar o

rendimento de suco, reduzir a viscosidade e clarificar o suco.

3. Lipases

As lipases hidrolisam lipídios em ácidos graxos e glicerol e são produzids a partir de pâncreas

de animais, alguns bolores e leveduras. As lipases podem ser usadas para hidrolisar óleos para a

manufatura de sabão e para hidrolisar compostos gordurosos lipídicos presentes em fluxos de água

suja. Interesterificação de óleos e gorduras pode ser catalisada por lipases. As lipases podem também

ser usadas nas indústrias de queijo e manteiga para dar sabor como resultado da hidrólise de

gorduras. Detergentes contendo lipase são uma importante aplicação das lipases.

4. Amilases e glicoamilases

Amilases são usadas na hidrólise do amido e são produzidas por diferentes organismos,

incluindo A. niger e B. subtilis. Os três principais tipos de amilases são a -amilase, -amilase e a

glicoamilase. -Amilase quebra ligações glicosídicas ,1-4 aleatoriamente na cadeia da amilose e

solubiliza a amilose. Por esta razão, a -amilase é conhecida como a “enzima liquefatora do amido”.

-Amilase hidroliza ligações glicosídicas ,1-4 nas terminações não-redutivas da amilose e produzem

resíduos de maltose. -Amilase é conhecida como enzima sacarificadora. Ligações glicosídicas ,1-6

na fração amilopectina do amido são hidrolisadas pela glicoamilase, que também é conhecida como

uma enzima sacarificadora. Aproximadamente lb/ano de glicose é produzida pela hidrólise

enzimática do amido nos Estados Unidos na média. A enzima pullulanase também hidrolisa as

ligações glicosídicas ,1-6 no amido seletivamente.

5. Celulases e hemicelulases

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As celulases são usadas na hidrólise da celulose e são produzidas por algumas espécides de

Trichoderma, tais quais Trichoderma viride ou T. reesei e por alguns bolores, como o Aspergillus niger

e Thermomonospora; e por algumas espécies de Clostridium. A celulase é uma enzima compleza e

sua formação é induzida pela celulose. A celulase de Thichoderma hidrolisa a celulose cristalina, mas

a do Aspergillus não. A celulose é primeiro hidrolisada a celobiose pela celulase, e a celobiose é

posteriormente hidrolisada a glicose pela -glicosidase. Ambas enzimas são inibidas pelos seus

produtos finais, celobiose e glicose. As celulases são usadas no processamento de cereais,

fermentações alcoólicas de biomassa, preparo de cerveja e tratamento de esgoto. As hemicelulases

hidrolisam a hemicelulose em unidade de açúcar de cinco carbonos e são produzidas por alguns

bolores, como bolor/podridão branco[a] e A. niger. As hemicelulases são usadas em combinação com

outras enzimas em massas de pão, misturas de preparo de cerveja, fermentação alcoólica de

biomassa e tratamento de esgoto.

06. Lactases

Lactases são as enzimas que hidrolizam a lactose em glucose e galactose. Está na família das -

galactosidase. Faz parte da secreção intestinal dos mamíferos jovens e é essencial para a digestão do

leite. A deficiência ou improdutividade da lactase no organismo pode resultar em intolerância a

lactose. Porém, nos dias de hoje, ja é vendida como suplemento alimentar, em cápsulas, ajudando na

digestão da lactose.

07. Invertase

A invertase (ou -frutofuranosidase) é uma sacarase e, portanto, catalisa/hidroliza a sacarose em frutose +

glicose, geralmente na forma de xarope de açucar invertido.

Industrialmente, a invertase é comumente obtida a partir de leveduras. Na natureza, é sintetizada por

abelhas, produzem a invertase para fazer o mel.

08. Glicose isomerase

A glicose isomerase é uma enzima intracelular e é produzida por diferentes organismos, tais como

Flavobcterium arborescens, Bacillus licheniformis e algumas espécies de Streptomyces e Arthrobacter.

Página 26

A conversão de glicose em frutose por glicose isomerase imobilizada é um processo industrial muito

importante, uma vez que a frutose é 1,7 vezes mais doce que a glicose e é usada como adoçante em

bebidas.

09. Glicose oxidase

A glicose oxidase catalisa a oxidação da glicose a ácido glucônico e peróxido de hidrogênio, que pode ser

facilmente detectado. Justamente por isso, é usada pra a determinação de níveis de glicose no

sangue e urina. Pode ser produzida a partir de A. niger, além de ser encontrada no mel, onde atua

como conservante natural (a enzima à superfície do mel reduz o oxigênio atmosférico em peróxido

de hidrogênio, que atua como barreira antimicrobiana.

10. Asparaginase

A asparaginase, uma proteína tetramérica de aproximadamente 140 kDa, é uma enzima

obtida de E. coli ou Erwinia. Sua ação catalítica transforma o aminoácido asparagina em ácido

aspártico e amônia. Em certas linhagens de células leucêmicas, a baixa concentração de uma outra

enzima, a asparagina sintetase, faz com que estas células leucêmicas sejam incapazes de produzir

asparagina suficiente e, portanto, dependentes de uma fonte extracelular desse aminoácido. A

degradação da asparagina bloqueia a síntese protéica, ocasionando a morte celular.

11. Penicilinases

A penicilinase é um tipo de lactamase que apresenta especificidade para penicilinas atuando

através da hidrólise do anel beta-lactama. Pode ser obtida de Bacillus subtilis.

12. Aspartase

Uma enzima encontrada em várias bactérias, leveduras, plantas e que catalisa a conversão do ácido aspártico ao ácido fumárico através da remoção de amónia e catalisa a reação inversa por adição de amoníaco. Também chamado de ammonialyase aspartato.

13. Urease

A urease é uma enzima que catalisa a hidrólise da ureia em dióxido de carbono e amônia.

Pode ser encontrada em bactérias, leveduras e diversas plantas superiores. Uma vez que muitos

Página 27

patógenos do trato gastrintestinal e urinário produzem urease, a medida desta pode ser utilizada

como parâmetro para diagnóstico. Também pode ser utilizada em biossensores condutimétricos para

detecção de íons de metais pesados.

11/04/12

Reatores Enzimáticos

● Processos descontínuos (bateladas)

Volume útil V constante.

BM para S:

Página 28

● Processos contínuos (Tanque agitado ou CSTR)

BM para S:

onde:

V = volume útil do reator (m³)

Q = vazão volumétrica (m³/s)

Se = [S] na alimentação (entrada) (kgmol/m³)

S = [S] na saída (retirada)

v = velocidade da reação

Página 29

● Reator PFR

Do BM, obtemos:

Cinética da Desativação Enzimática

Como vimos, as enzimas são moléculas proteicas de configuração complexa, que atuam

como catalisadores no entanto, no transcorrer de uma reação de catalisada por enzimas, a

desativação da enzima poderá ocorrer com uma velocidade que dependerá da estrutura da molécula,

bem como das condições da reação (pH, temperatura, força iônica, etc). A concentração de enzima

ativa pode diminuir consideravelmente durante a reação, logo é importante conhecer a cinética, bem

como os parâmetros da desativação enzimática. O modelo mais simples de desativação enzimática é

o da desativação irreversível de primeira ordem com respeito à enzima ativa, ou seja:

16/04/12

Página 30

Desativação de primeira ordem:

(irreversível) Ea = [ ] de enzima ativa

Ei = [ ] de enzima inativa

kd = constante de desativação

Ou seja:

⇒ (1)

Como Ea(t=0)=Eao, resolvendo-se (1) temos:

(2)

Sabendo que , logo

ou, com Vmo=k.Eao

(3)

Assim, Vm=Vm(t)

Tempo de meia vida

É o tempo necessário para que a concentração da enzima ativa (Ea) seja reduzida à metade.

Logo:

(4)

A taxa de desativação depende da temperatura conforme Arrhenius:

Ed 170 a 400 kJ/mol

Exemplos:

1. A catalase tem sido utilizada para acelerar a decomposição do peróxido de hidrogenio em agua e

oxigenio. Utilizou-se um balão volumétrico com 100mL de meio reacional, contendo a enzima e o

substrato em pH = 6,76 e mantidos a 30oC. Acompanhou-se a concentração do peróxido de

hidrogenio em função do tempo, mostrado na tabela abaixo.

Página 31

t (min) 0 10 20 50 100

[H2O2] (M) 0,02 0,01775 0,0158 0,0106 0,005

--- 0,011935 0,011786 0,012698 0,013863

--- 0,000225 0,000210 0,000188 0,000150

a) Determine Vm e Km

b) Se a concentração da enzima for triplicada, qual será a concentração molar do substrato aos 20min

a)

Linearização para batelada (dados da resposta em vermelho na tabela):

y=b-ax

Fazendo a regressão linear, obtém-se: y = 0,018021 - 28,2078.x (R=0,96799)

b) Se a concentração de Enzima for triplicada, a velocidade máxima tbm o será, ou seja:

V’m=0,00192 M/s

Resolvendo para este valor na eq de projeto de um Batelada, com Km igual ao obtido:

, obtém-se S = 0,0092 M

2) Um reator enzimático tipo CSTR com 500L de volume útil é utilizado para converter um substrato

A num produto B a 35°C e pH 4,5. A enzima utilizada foi imobilizada em partículas poliméricas

pequenas e porosas e obedecem ao modelo de MM. Os dados apresentados na tabela abaixo

foram obtidos no estado estacionário para uma vazão de alimentação do substrato e do produto

de 100 L/h.

Página 32

Se (g/L) 11,70 16,25 19,8 31,0 59,3

X (conversão) 0,90 0,80 0,70 0,47 0,25

10,53 13 13,86 14,57 14,825

x=9 4 2,333333 0,886792 0,333333

a) Determine Km e Vm

b) Qual a vazão, em L/h, deve ser alimentada no CSTR para que seja obtida uma conversão igual a

95% quando a concentração de substrato alimentado no CSTR for de 60g/L.

a) Linearização para o CSTR:

y = a - b.x → y = 15,00527 - 0,49859.x (R=0,99983)

D=Q/V=100/500=0,2

b) Se=60g/L

X=0,95

Resolvendo: D=0,045147

Q=D.V=22,57342 L/h

Página 33

3. Utilizando os dados do exemplo do dia 21/03 (ureia/urease), determinar o tempo necessário

para se atingir uma conversão de 95% quando a concentração inicial de enzima for igual a 0,1

mol/dm³.

Km=0,0266 mol/dm³ e Vm=1,33 mol/dm³.s

Eq. de Projeto Batelada:

,

18/04/12

Processos Fermentativos

23/04/12

Página 34

Processos Fermentativos

● Microrganismos para fermentações industriais

○ Fontes;

○ Características Desejáveis

● Meios de Cultivo para fermentações industriais

○ Tipos de matérias-primas

■ Matérias-primas amiláceas

■ Matérias-primas celulósicas

■ Matérias-primas proteicas

■ Outras

○ Tratamentos prévios (pré-tratamentos) dos meios de cultivo

○ Características desejáveis dos meios de cultivo para uso industrial

Esterilização em Bioprocessos

● Esterilizar -> Remover ou inativar TODAS as formas de vida existentes num sistema.

● O que deverá ser esterilizado?

○ Equipamentos

○ Ferramentas e vidrarias

○ Meios de cultivo

○ Ar

● Tudo que entrará em contato com o M.O. de interesse deverá ser esterilizado (Mas nem

sempre -> As vezes uma boa assepsia é suficiente para o sucesso da fermentação)

● Terminologia e Modos de Atuação (Tab 3.1 -> Principais termos técnicos)

○ Calor Seco

○ Calor Úmido

Página 35

○ Radiações

○ Agentes químicos

Resumindo:

● ESTERILIZAÇÃO

○ MÉTODOS FÍSICOS

■ Calor Seco

■ Calor Úmido

■ Radiações UV e Ionizantes

○ MÉTODOS QUÍMICOS*

■ Líquidos

■ Gasosos

* Podem deixar resíduos que contaminam o produto

● Esterilização por agentes físicos [uso de vapor]

○ Esterilização de fermentadores vazios

○ Esterilização de fermentadores + meio de cultura

● Esterilização do meio de cultivo e do Fermentador

Processo Descontínuo

Página 36

I : aquecimento

II : esterilização

III: resfriamento

Te = Temperatura de Esterilização

Ti = Temperatura Inicial

Tf = Temperatura final do meio esterilizado = Temperatura da Fermentação

T.m= Temperatura mínima letal

teta = tempo de esterilizaçao (>= 20 min, 121 oC, 2 atm+).

Esterilização Contínua

(Imagem)

Página 37

02/05/2012

Esterilização do Ar

1) Comente sobre a necessidade da esterilização do ar em alguns tipos de fermentação.

2) Comente sobre os aerossóis microbianos.

3) Como pode ser determinado o nível de contaminação do ar?

4) Comente sobre os amostradores de ar:

a) AGI (All Glass Impinger);

b) Shipe;

c) Amostragem por filtração.

5) Quais os métodos que podem ser usados para esterilizar o Ar? Comente-os.

TRABALHO

09/05/2012

Agitação e Aeração em Bioprocessos

Referência: Capítulo 14 - Biotecnologia Industrial - vol. II

Eng. Bioquímica

Balanço de Massa para o oxigênio num tanque agitado e aerado:

[Eq1]

Página 38

Acumulo = O2 formado - O2 consumido

C: conc. de O2 no líquido

C*: conc. de O2 que estaria em equilíbrio com a conc de O2 no gás (bolha)

kLa: coeficiente global de TM no líquido

kr: constante específica de respiração celular

X: concentração do microrganismo (X ou Cm)

Suprimento e Demanda de O2

1. Instante em que cessa a aeração (t=0)

2. Instante em que se reinicia a aeração

Co: conc. de O2 no EE

Cc. conc. crítica de O2

Determinação de kr

Sistema operando em EE e interrompe-se o fornecimento de O2. O B.M. fica:

com C(0)=C0

Logo:

[Eq2]

kr: coef. angular

Página 39

Determinação de kLa

Reinício da aeração, logo

Método 1: rearranjando a Eq 1

Logo é uma reta cujo coef angular permite calcular kLa

Método 2: Resolução da Eq 1, o que resulta

Questões:

1. Por que é necessário agitar e aerar um biorreator? Cite exemplos de processos

fermentativos que necessitam oxigênio.

R.:

2. Quais são os fatores que devem ser levados em consideração quando se projeta um

sistema de agitação?

R.: Fragilidade do material, tipo de mistura (liquido, gás, sólido, líquidos miscíveis ou não)

dispersão de liquidos imiscíveis,

3. Quais são as principais resistências à TM que a molécula de oxigênio encontra num

tanque agitado aerado para fermentação?

R.:

4. Quais são os principais sistemas para Transf. de oxigênio? Comente sobre cada um deles.

Página 40

R.:

5. Faça um BM global para o oxigênio num tanque de fermentação agitado e aerado e

explique como podemos determinar seus parâmetros a partir de dados experimentais.

R.:

6. Com relação aos equipamentos destinados à agitação:

a. comente sobre os agitadores tipo hélice

R.: �São rotores muito utilizados para líquidos com baixa viscosidade, possuem uma constituição similar aos das hélices marinhas. Apresentam a vantagem de proverem alto fluxo e baixa potencia quando comparada com os outros tipos de impelidores. Devido a sua construção e faixas de operação e características construtivas, normalmente dispensam a utilização de redutores.

b. comente sobre os agitadores tipo turbina

R.: �São impelidores muito eficientes, apresentando uma alta performance de fluxo, e uma grande faixa de aplicações. � São indicados onde se deseja um grande cisalhamento e/ou alto grau de turbilhonamento. �Podem ser construídos com lâminas fechadas ou abertas, as pás da turbina pode ser reta, ou curvada longitudinalmente, porém sempre em posição vertical.

_____________________________

Operação e Controle de Processos Bioquímicos

1 - Princípios gerais para operação;

2 - Condições gerais para a execução de um processo fermentativo:

Matéria Prima -> Preparo dos Substratos -> Preparo do Inóculo -> Inoculação e

Controle da Fermentação

Salas de fermentação, Equipamentos e acessórios

3 - Operação de uma indústria:

Operações com os fermentadores

Esterilização dos meios

Página 41

Controle operacional da fermentação: T, P,O2, agitação, pH, espuma, gases da

exaustão, reologia

4 - Operações assépticas de um processo fermentativo

5 - Exemplo de uma operação industrial (Etanol)

Cinética dos Processos Fermentativos· Parâmetros de Transformação;· Curva de crescimento microbiano (em batelada)· Classificação dos processos fermentativos:

o Cinética da formação de produtos:§ Produção associada ao crescimento;§ Produção parcialmente associada ao crescimento;§ Produção não-associada ao crescimento;

· Fatores que afetam o crescimento das células:o Nutrientes e substratoo Temperaturao pHo Força Iônica (concentração de íons)

· Influência da concentração do substrato limitante na velocidade especifica de crescimento

· Referencias:o Cap 6 – Biotecnologia Industrial – Vol. IIo Cap 6 – Shuler (pág 148) – “How Cells Grow”o outras

04/06/12Cinética dos Processos Fermentativos (cont)

Cinética dos Processos Fermentativos Ex. 6.1 (Shuler): Considere os seguintes dados cinéticos para um MO que consome glicose

num cultivo em batelada

t (h) 0 9 16 23 30 34 36 40

X (g/L) 1,25 2,45 5,1 10,5 22 33 37,5 41

S (g/L) 100 97 90,4 76,9 48,1 20,6 9,38 0,63

a. Calcule a taxa de crescimento máxima

Página 42

b. Calcule o fator de conversão SUBSTRATO em CÉLULAS (rendimento YXS)c. Qual a concentração máxima de células possível de ser obtida caso se utilize 150g de glicose

e mesmo inóculo?

- Solução: [EXCEL]

E. 6.4 (Shuler): Uma nova linhagem de leveduras está sendo considerada para a produção de

biomassa. Os seguintes dados cinéticos foram obtidos num cultivo contínuo (quimiostato). O reator é alimentado com concentração de substrato igual a 800 mg/L e utilizou-se excesso de O2 em pH 5,5 e T=35°C

D (h^-1) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

S (mg/L) 16,7 33,5 59,4 101 169 298 702

X (mg/L) 366 407 408 404 371 299 59

a. Determine mu_x_max e Ksb. Qual a vazão volumétrica que fornece máxima produtividade de células

06/06/12

Fermentação Descontínua (Batelada): Cálculo do número de dornas

Seja:

F: vazão média de líquido fermentado que deve ser fornecido continuamente ao setor de

tratamentos finais;

tf: tempo necessário para que o mosto fermente (= tempo de fermentação);

V: volume útil de cada dorna;

D: número de dornas;

td: tempo necessário para descarregar (esvaziar) uma dorna;

tc: tempo necessário para limpar e carregar uma dorna;

F depende - da quantidade de produto final que se deseja obter na unidade de tempo

- do rendimento dos tratamentos finais

- da concentração do produto no líquido fermentado

Página 43

Seja M a massa de produto final que se deseja produzir num tempo r com rendimento r,

assim:

● O tempo de descarga, td, pode ser dado como (9.1)

V NÃO pode ser escolhido de forma arbitrária (depende do fabricante)

● Considera-se que tc=td (facilita a avaliação de D)

● Deverá existir um intervalo de tempo td separando o início do funcionamento de duas dornas

consecutivas

● Seja o instante ZERO o início do trabalho da dorna #1. A dorna D deverá começar a funcionar

no instante (D-1).td. Se a dorna D inicia seu funcionamento no instante td+tf, temos:

(D-1).td = td+tf (D>3)

Logo: ou, (9.2)

Nos permite calcular o número de dornas D desde que conheçamos F, V e tf.

Página 44