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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
RIBEIRÃO PRETO
2006
WALTER DIAS JÚNIOR
EFEITO DO JEJUM E DO DIABETES NO METABOLISMO
DE CARBOIDRATOS, LIPÍDIOS E PROTEÍNAS EM
TILÁPIAS VERMELHAS ( )
(Teleostei: Cichlidae)
Oreochromis sp
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
EFEITO DO JEJUM E DO DIABETES NO METABOLISMO DE CARBOIDRATOS, LIPÍDIOS E PROTEÍNAS
EM TILÁPIAS VERMELHAS (Oreochromis sp) (Teleostei: Cichlidae)
Walter Dias Júnior
Tese apresentada ao departamento de Fisiologia da Faculdade de Medicina da USP de Ribeirão Preto - SP para obtenção do grau de Doutor em Ciências – área de concentração: Fisiologia
Orientadora: Profa. Dra. Isis do Carmo Kettelhut
Ribeirão Preto – SP
2006
FICHA CATALOGRÁFICA
Dias JR, Walter Efeito do jejum e do diabetes no metabolismo de carboidratos, lipídios e proteínas em tilápias vermelhas (Oreochromis sp) (Teleostei: Cichlidae). Ribeirão Preto, 2006. 104p. 29,5cm Tese de doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP – Departamento de Fisiologia – área de concentração: Fisiologia. Orientadora: Kettelhut, Isis do Carmo Data da defesa: 03/08/2006.
Dedico este trabalho aos tesouros da minha vida:
Meus pais, Walter e Joana D’Arc.
Meus irmãos, Walner e Walder.
Pelo amor incondicional e pelo constante apoio.
Minha adorada Moemy, por sua doçura, companheirismo e amor.
Meu amado filho Santiago, por sua confiança, seu bom humor,
sua sinceridade e amor.
Minha querida filha Tarsila, pela esperança do que está por vir.
Um belo dia, a Amanda me mostrou a figura abaixo... Essa ilustração me fez pensar no que é ser pesquisador e no que é ser homem. Olhando para ela pensei: “Esse homem e esse cachorro estão iguais! ” “Que pesquisador nesse mundo, não ficou como o homem da figura ou a andar pelo jardim entre as árvores e o chafariz, simplesmente a se perguntar, questionar e pensar? ” “Que homem nunca sentiu a inquietude da busca até encontrar a resposta que precisa? ” Então percebi a diferença que separa o homem do cachorro.
Ao contrário do que ilustra a figura, o mais importante é não ficar sentado simplesmente questionando e sim buscar as respostas. Buscá- las onde for preciso! Desenvolver tecnologias, escalar montanhas, mergulhar nas profundezas do oceano e do inconsciente.
Buscar respostas é mais do que sentar e ficar a se questionar. Se tivéssemos todas as respostas, não seria necessário pesquisar, deixaríamos de
ser homens. A busca em si é o verdadeiro objetivo do homem e do pesquisador. A partir do
momento que, sentados, ficamos a nos questionar, deixamos de ser homens ou pesquisadores.
Um pesquisador consegue viver sem questionar? Um homem consegue viver sem questionar? Ambos deixam de ser, se ficarem sentados!
AGRADECIMENTOS À Deus por minha vida e saúde. À Dra Ísis do Carmo Kettelhut pela oportunidade de trabalhar em seu laboratório, confiança, por sua paciente e valiosa orientação, pelo exemplo de determinação, dedicação e acima de tudo, por mostrar sempre o que é ser uma pessoa forte e positiva frente às situações em que a vida nos coloca. Ao Dr Renato Hélios Migliorini pelo seu incompreendido bom humor e por me classificar em segundo lugar na lista dos melhores cientistas “da computação”. Ao Dr. Célio Raimundo Machado por ter me recebido em seu laboratório e por estar sempre disposto a me ajudar e apoiar, e pela parceria durante meu doutorado. Ao Dr. Ricardo Macedo Corrêa (FFCLRP-USP) pela valiosa identificação e tombamento dos peixes no acervo de espécies do Laboratório de Ictiologia da Faculdade de Filosofia da USP/RP. À Neusa Maria Zanon por sua valiosíssima ajuda, parceria, companheirismo, apoio e auxílio técnico durante os experimentos e pelos momentos descontraídos de prosa e dança. À Elza Aparecida Filippin por estar sempre pronta a ajudar, pelo auxílio técnico, pelo alegre convívio e companheirismo durante minha passagem pelo laboratório e pelo seu delicioso e revigorante café. À Maria Antonieta Rissato Garófalo por sua disposição em sempre nos ensinar e ajudar a resolver os problemas aplicando sua grande experiência e sua preciosa calma, pelos momentos de conversa, descontração e alegre convívio e pela boa música compartilhada. Ao Víctor Diaz Galban pelo seu companheirismo, sua imprescindível e prestativa ajuda, atenção e apoio, e pelo gentil abastecimento da geladeira com víveres salvadores. À Amanda Martins Baviera, minha irmã proteolítica, por sua amizade, ajuda e presteza, por ter contribuído em tornar nossa temporada de convivência tão alegre e descontraída, pelas conversas agradáveis e trabalho compartilhado, e à sua mãe, D. Zeni, pelo apoio, conselhos, incentivo e pelo maravilhoso frango com polenta. À Valéria Ernestânia Chaves pelos diversos almoços e cafés filosóficos e pela amizade. À Danúbia Frasson, Maria Emília Soares Martins dos Santos e Renata Polessi Boschini pela amizade, companheirismo e convívio harmonioso e descontraído no laboratório. À Mírian Bassi pela amizade, ajuda, apoio e pela parceria no teatrinho do sarau da fisiologia.
Ao Dr. Ithamar Vughman e ao Elísio Evangelista pelos conselhos, ensinamentos, companheirismo e pelos bons momentos de convivência no laboratório. Aos companheiros de laboratório Ana Lúcia, Luis Carlos, Maria Ida, Maristela e William pelo apoio e incentivo. Ao Adriano e à Andreza pelo convívio no laboratório. Aos companheiros de pós-graduação: Jussara, Álvaro, Badauê, Felipe, Érica, Giu, Patrícia, Valéria, Ruither, Lisandra, Ana Catarina e Terence. Aos funcionários da secretaria do Departamento de Fisiologia, Elisa, Cláudia e Fernandinho, e do Departamento de Bioquímica, Ronaldo, Téia, Ivone e Lúcia, pelo apoio indispensável e pela atenção. Ao Adilson e Eusiane pelo fornecimento dos peixes e pela gentil acolhida no pesqueiro e ao seu Natalino (Domingão) pelo companheirismo e prestativa ajuda na captura dos peixes. Ao Aléssio pela ajuda na fixação e preparação dos peixes testemunha depositados no Laboratório de Ictiologia da FFCLRP. Ao bioterista Paulinho e ao Carlos pelos cuidados que tiveram com meus animais experimentais. Aos peixes que foram sacrificados. Ao CNPq pelo apoio financeiro.
AGRADECIMENTO ESPECIAL À minha sogra Celeste de Moraes Gomes, por seu apoio, incentivo, por entender minha
distância, acreditar em mim e me ajudar a cuidar das coisas mais preciosas que tenho.
Por abrir mão de outra parte da sua vida, me permitiu cumprir as tarefas do doutorado
com mais tranqüilidade.
À Senhora e a sua força inspiradora,
Eu agradeço.
ÍNDICE RESUMO................................................................................................................. i ABSTRACT............................................................................................................. iii 1. Introdução
Um breve histórico sobre a distribuição, alimentação e metabolismo dos peixes....................................................................................................................
1
A tilápia vermelha................................................................................................. 3 Metabolismo energético nos teleósteos................................................................ 3 A insulina nos teleósteos....................................................................................... 11 Diabetes mellitus nos peixes................................................................................. 14 Objetivos.............................................................................................................. 15
2. Material e métodos
2.1. Origem dos peixes.......................................................................................... 18
2.2. Aquários e manutenção dos peixes................................................................ 18
2.3. Tratamento e grupos experimentais.............................................................. 19
2.3.1 Grupo alimentado.................................................................................. 19 2.3.2. Grupos Jejuados................................................................................... 20 2.3.3. Grupo diabético.................................................................................... 20
2.3.3.1. Determinação da dose e da via de administração de aloxana para indução de diabetes experimental em tilápias...............
20
2.3.3.2. Indução do diabetes experimental........................................... 21 2.4. Sacrifício, biometria e retirada dos tecidos.................................................. 22
2.5. Retirada do músculo protractor hyoidei e procedimentos de incubação..... 23
2.6. Medida da taxa de degradação protéica....................................................... 24
2.6.1. Proteólise total...................................................................................... 24 2.6.2. Proteólise lisossomal............................................................................ 25 2.6.3. Proteólise dependente de ATP e proteólise independente de ATP ou
residual................................................................................................. 25
2.7. Coleta do tecido adiposo mesentérico e procedimentos de incubação......... 26
2.7.1. Medida da lipólise................................................................................ 27 2.8. Produtos químicos utilizados......................................................................... 27
2.9. Outras análises químicas............................................................................... 28
2.10. Análise estatística........................................................................................ 28
3. Resultados
Jejum..................................................................................................................... 29
3.1. Efeito dos diferentes períodos de jejum no peso corporal e dos tecidos e
metabólitos plasmáticos..............................................................................
29
3.1.1. Peso Corporal....................................................................................... 29
3.1.2 Peso dos tecidos..................................................................................... 29 3.1.3. Metabólitos plasmáticos....................................................................... 39
3.2. Efeito do jejum na concentração de glicogênio e lipídios totais no fígado e no músculo das tilápias vermelhas...............................................................
39
3.3. Efeito do jejum na lipólise in vitro do tecido adiposo mesentérico de tilápias..........................................................................................................
46
3.4. Efeito do jejum na degradação da proteína muscular.................................. 47
Diabetes mellitus.................................................................................................. 54 3.5. Padronização do diabetes mellitus experimental.......................................... 54
3.6. Perfil glicêmico e dos ácidos graxos plasmáticos de tilápias vermelhas injetadas com aloxana..................................................................................
56
3.6.1. Glicemia................................................................................................ 56 3.6.2. Níveis plasmáticos de ácidos graxos livres.......................................... 58
3.7. Efeito do diabetes mellitus no peso dos tecidos e metabólitos plasmáticos.. 59
3.8. Concentração de glicogênio e lipídios totais no fígado e no músculo das tilápias vermelhas com diabetes mellitus.....................................................
61
3.9. Efeito do diabetes mellitus na lipólise in vitro do tecido adiposo mesentérico (MAT) de tilápias vermelhas....................................................
62
3.10. Efeito do diabetes mellitus na degradação da proteína muscular.............. 64
4. Discussão
4.1. Parâmetros morfológicos, peso das gônadas, do fígado e do estômago e intestino.........................................................................................................
67
4.2. Ajustes metabólicos durante o jejum............................................................. 69
4.3. Lipólise do tecido adiposo mesentérico incubado in vitro.... ....................... 76
4.4. Proteólise do músculo esquelético................................................................. 81
4.5. Diabetes mellitus........................................................................................... 85
Parâmetros morfológicos............................................................................... 86 Parâmetros metabólicos................................................................................. 88 Lipólise do tecido adiposo mesentérico (MAT) incubado in vitro................. 89 Proteólise do músculo esquelético.................................................................. 91
5. Bibliografia.......................................................................................................... 94
Tabela Título da tabela
Página
Tabela 1: Peso inicial dos peixes no dia da coleta no tanque-rede (PI), peso final dos peixes no dia do experimento (PF) e diferença de peso.......
30
Tabela 2: Peso corporal, comprimento padrão e fator de condição (PC/CP3.100) de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum................................................................
31
Tabela 3: Peso do fígado, dos testículos e do estômago e intestino de tilápia (Oreochromis sp) alimentada e nos diferentes períodos de jejum.......
33
Tabela 4: Índice hepatossomático, índice gonadossomático e índice somátido do estômago e intestino de tilápia vermelha (Oreochromis sp) alimentada e nos diferentes períodos de jejum....................................
35
Tabela 5: Peso do tecido adiposo mesentérico e da bexiga natatória e seus índices somáticos de tilápia (Oreochromis sp) alimentada e nos diferentes períodos de jejum.................................................................
37
Tabela 6: Parâmetros metabólicos plasmáticos (glicemia, ácidos graxos livres e lactato) de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum.................................................................................
40
Tabela 7: Conteúdo de glicogênio e lipídios totais hepático e muscular de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum.....................................................................................................
43
Tabela 8: Mobilização de ácidos graxos livres (µmol AGL/g MAT.2h) do tecido adiposo mesentérico de tilápia (Oreochromis sp) para o meio de incubação em condições basais e na presença de isobutilmetilxantina e isoproterenol, de animais alimentados e nos diferentes períodos de jejum.................................................................
48
Tabela 9: Tirosina liberada no meio de incubação (nmol/mg.2h) de músculos protractor hyoidei de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum.................................................................
51
Tabela 10: Tirosina liberada no meio de incubação (nmol/mg.2h) de músculos protractor hyoidei de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum.................................................................
51
Tabela 11: Glicemia (mg/100mL) de tilápias (Oreochromis sp) que receberam aplicação endovenosa de aloxana pela veia caudal para indução de diabetes experimental............................................................................
55
Tabela 12: Perfil glicêmico de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos)...............
57
Tabela 13: Ácidos graxos livres plasmático (µmol/mL) após aplicação endovenosa de 150mg/Kg de aloxana e seus controles.......................
58
Tabela 14: Parâmetros corporais de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos)..
60
Tabela 15: Parâmetros corporais e seus índices somáticos de tilápias
(Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos).................................................
60
Tabela 16: Glicemia, ácidos graxos livres e lactato plasmático de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos) 5 dias antes.............................
61
Tabela 17: Conteúdo de glicogênio e lipídios totais no fígado e músculo de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos) 5 dias antes...................
62
Tabela 18: Mobilização de AGL (µmol AGL/g MAT.2h) do tecido adiposo mesentérico de tilápias (Oreochromis sp), 5 dias depois que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticas), para o meio de incubação em condições basais e na presença de IBMX e ISO......................................................................
63
Tabela 19: Tirosina liberada no meio de incubação (nmol/mg.2h) de músculos protractor hyoidei de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos)..
65
Tabela 20: Tirosina liberada no meio de incubação (nmol/mg.2h) de músculos protractor hyoidei de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos)..
65
Figura Título da Figura
Página
Figura 1: Croqui dos aquários experimentais. a) aquá rios de 250 litros; b) filtro de seixo rolado e conchas do mar; c) filtro de “bio-balls”; d) filtro de macrófitas (45 litros); e) filtro de lã artificial; f) aquecedor; g) bomba de água (3.500 litros/h) para circulação do sistema; h) bombas de água (1.000 litros/h). As flechas indicam o fluxo da água.....................................................................................................
19
Figura 2: Representação da tilápia marcada com miçanga colorida. Adaptação da marcação hidrostática tipo Lea...................................
21
Figura 3: Biometria indicando comprimento total e padrão........................... 22
Figura 4: Dissecação do músculo protractor hyoidei da mandíbula de tilápia e fixação no suporte para incubação in vitro..................................
23
Figura 5: Perda de peso corporal das tilápias alimentadas e nos diferentes períodos de jejum................................................................................
31
Figura 6: A) peso corporal final; B) comprimento padrão; C) fator de condição ((PC/CP3).100) de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. (As linhas transversais indicam a média de cada grupo)......................................................................
32
Figura 7: A) peso do tecido hepático; B) índice hepatossomático; C) peso das gônadas; D) índice gonadossomático; E) peso do estômago e intestino; F) índice somático do estômago e intestino de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. (As linhas transversais indicam a média de cada grupo)...................
36
Figura 8: A) peso do tecido adiposo mesentérico; B) índice somático do tecido adiposo mesentérico; C) peso do tecido adiposo da bexiga natatória; D) índice somático do tecido adiposo da bexiga natatória de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. (As linhas transversais indicam a média de cada grupo)....
38
Figura 9: Parâmetros metabólicos plasmáticos de tilápia (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. A) glicemia; B) ácidos graxos livres. * (P<0,05) vs alimentado.................................
41
Figura10: Conteúdo de glicogênio hepático e muscular de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. A) glicogênio hepático; B) glicogênio muscular. * (P<0,05) vs alimentado..........................................................................................
44
Figura 11: Conteúdo de lipídios totais hepático (A) e muscular (B) de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. * (P<0,05) vs alimentado..................................................................
45
Figura 12: Mobilização de AGL (µmol AGL/g MAT.2h) do tecido adiposo mesentérico de tilápia (Oreochromis sp) para o meio de incubação em condições basais (¦ ) e na presença de IBMX (?) e ISO (? ), de animais alimentados e nos diferentes períodos de jejum.*(P<0,05)
vs basal; #(P<0,05) vs alimentado..................................................... 49
Figura 13: Tirosina liberada no meio de incubação (nmol/mg.2h) de músculos protractor hyoidei de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. *(P<0,05) vs alimentado. Proteólise total....................................................................................................
52
Figura 14: Tirosina liberada no meio de incubação (nmol/mg.2h) de músculos protractor hyoidei de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. *(P<0,05) vs alimentado. As barras representam os valores médios da atividade proteolítica dependente do proteassoma...................................................................................
52
Figura 15: Tirosina liberada no meio de incubação (nmol/mg.2h) de músculos protractor hyoidei de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. *(P<0,05) vs alimentado. As barras representam os valores médios do componente proteolítico resultante da inibição do proteassoma...............................................
53
Figura 16: Glicemia (mg/100mL) de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de aloxana pela veia caudal para indução de diabetes experimental.........................................................................
56
Figura 17: Glicemia (mg/100mL) de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de aloxana pela veia caudal para indução de diabetes experimental. * (P<0,05) vs controle...................................
57
Figura 18: Ácidos graxos livres plasmático (µmol/mL) após aplicação endovenosa de 150mg/Kg de aloxana e seus controles. * (P<0,05) vs controle..........................................................................................
59
Figura 19: Mobilização de AGL (µmol AGL/g MAT.2h) do tecido adiposo de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos), para o meio de incubação em condições basais e na presença de IBMS e ISO. * (P<0,05) vs. Basal controle; # (P<0,05) vs. controle.........................
64
Figura 20: Tirosina liberada no meio de incubação (nmol/mg.2h) de músculos protractor hyoidei de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos). *(P<0,05) vs controle; #(P<0,05) vs controle...............
66
i
RESUMO
As alterações adaptativas no metabolismo de carboidratos, lipídios e proteínas
induzidas pelo jejum de 7, 15, 30, 60, 90, 150 e 200 dias de jejum foram investigadas na
tilápia vermelha (Oreochromis sp), um peixe de água doce bastante comum na região de
Ribeirão Preto. Neste estudo foram quantificados nas tilápias os níveis de glicose,
ácidos graxos livres e lactato plasmáticos, o conteúdo de glicogênio e lipídios totais
hepáticos e musculares, a liberação de ácidos graxos dos fragmentos do tecido adiposo
mesentérico e a degradação de proteína do músculo protractor hyoidei. Os níveis
plasmáticos de glicose permaneceram constantes até o período de 60 dias de jejum (63 ±
3 mg/100mL) e somente a partir de 90 dias foi observada uma diminuição de 25% da
glicemia, a qual foi mantida até 200 dias sem alimento. Os níveis de AGL plasmáticos
aumentaram 49, 64 e 90% após 60, 90 e 150 dias sem alimento, respectivamente. O
alto conteúdo de glicogênio hepático observado nos animais alimentados (≈15%)
diminuiu ≈50% nos peixes em jejum e se manteve constante até 200 dias sem alimento.
Já o glicogênio muscular apresentou uma diminuição de seus valores somente após 60
dias de jejum. O conteúdo de lipídios totais hepáticos aumentou significativamente
durante os períodos de jejum atingindo valores de 21 ± 2 % após 200 dias sem alimento
e o conteúdo de lipídios totais musculares apresentou uma significativa diminuição após
60 dias sem alimento. Corroborando os níveis de AGL plasmáticos, o jejum provocou
um claro aumento na lipólise do tecido adiposo incubado in vitro. A adição do IBMX
(isobutilmetilxantina, inibidor da fosfodiesterase do AMPc) e do ISO (isoproterenol,
agonista β-adrenérgico) ao meio de incubação induziu uma diminuição da lipólise nos
peixes alimentados e jejuados, resultado diferente do observado em mamíferos. As
tilápias apresentaram uma diminuição de 21% na proteólise total somente após 60 dias
de jejum. A via proteolítica dependente de ATP-proteassoma apresentou uma
diminuição de aproximadamente 48% nos períodos de 60, 90 e 150 dias de jejum,
mostrando uma participação na diminuição da proteólise total, observada
principalmente após 60 dias sem alimento. Este dado mostra ocorrer uma importante
adaptação do animal para preservação da proteína muscular e sobrevivência do peixe
em situações prolongadas de privação alimentar.
As tilápias que receberam aplicação endovenosa de 150mg de aloxana/Kg PC
apresentaram um aumento na glicemia de 5,5 vezes 48 horas após a administração da
ii
droga, atingindo valores médios de 330 ± 10mg/100mL. Já os níveis plasmáticos de
AGL aumentaram ≈26% em relação aos controles, somente depois de 96 horas da
aplicação da aloxana e 60% após 5 dias de diabetes. Os níveis plasmáticos de lactato
aumentaram aproximadamente 80% 120 horas após injeção da aloxana. Dentre os
parâmetros teciduais quantificados somente o glicogênio hepático dos peixes diabéticos
apresentou uma diminuição de 63%. O diabetes experimental estimulou a lipólise do
tecido adiposo mesentérico, tanto na condição basal como na presença de IBMX e ISO.
Na condição basal o aumento da lipólise foi de 84%. Já os controles, na presença das
drogas, surpreendentemente foi observada uma diminuição da lipólise aproximadamente
38% quando comparada com os valores basais. A degradação de proteína do músculo
protractor hyoidei das tilápias diabéticas teve um significativo aumento de 33% em
relação às controle e a participação da via proteolítica dependente de ATP-proteassoma
teve um aumento de 49% nos peixes diabéticos.
Esses dados mostram que as alterações do metabolismo energético nesta espécie
de peixe são semelhantes às que ocorrem em mamíferos (apesar da menor velocidade e
magnitude de resposta), com exceção do controle simpático da lipomobilização, que
parece exercer um papel inibitório na lipólise do tecido adiposo da tilápia. Vale a pena
ressaltar que este é o primeiro trabalho que demonstrou, com metodologia apropriada, a
presença so sistema proteolítico dependente de ATP-proteassoma em músculo de tilápia
e ter a insulina um papel inibitório da proteólise muscular nesta espécie de peixe.
iii
ABSTRACT
Effect of fasting and diabetes on carbohydrate, lipid and protein metabolism
in red tilapia (Oreochromis sp.).
The adaptive changes of carbohydrate, lipid and protein metabolism induced by
7, 15, 30, 60, 90, 150 and 200 days of fasting were investigated in red tilapia
(Oreochromis sp.), a hybrid fish specie from sweet water Brazilian aquaculture system.
For this purpose, plasma levels of glucose, lactate and free fatty acids (FFA), liver and
muscle glycogen and total lipid content, rates of FFA release from mesenteric adipose
tissue (MAT) and muscle (protractor hyoidei) protein degradation were measured in
these fishes.
Plasma glucose levels were similar to fed values until 60 days without food.
After 90 days fasting the glycemia was significantly lower (59 ± 5 mg/100mL) than
control (74 ± 1 mg/100mL) and remained constant until the end of experimental period
(200 days fasting). The high content of liver glycogen (≈15%) in fed tilapias fell to 5%
after 3 months starvation. After 60, 90 and 150 days starvation, plasma FFA levels
increased 49%, 64% and 90%, respectively, compared to fed values. In agreement with
the rise in plasma FFA, fasting induced a clear increase in the lipolytic activity of MAT
incubated in vitro. Addition of IBMX (isobuthylmethylxanthine, a cAMP-
phosphodiesterase inhibitor) or isoproterenol (a β-adrenergic agonist) to the incubation
medium induced a reduction of lipolysis of adipose tissue from fed and fasted fishes,
differently to what is seen in adipose tissue of mammals. Tilapia presented a fall on
ATP-proteasome-dependent proteolytic pathway activity after 60, 90 and 150 days of
fasting; this may be an important metabolic adaptation to preserve muscle protein for
animal survival. After 3, 4 and 5 months starvation, however, overall proteolysis
increased reaching values similar to fed fishes. Further experiments will be necessary to
investigate the rates of proteolysis in other kinds of muscle.
Diabetic tilapias, 5 days after alloxan administration, showed a significant
increase in glycemia (330 ± 10 mg/100mL) in relation to control fishes (67 ± 9
mg/100mL); a 60% increase in plasma free fatty acid levels (0.675 ± 0.077 vs 0.445 ±
0.026 µmol/mL, control values) and a 80% increase in lactate plasma levels (1.061 ±
iv
0.107 vs 0.586 ± 0.085 µmol/mL, control values). Liver glycogen content in diabetic
fishes was 63% lower than in controls. The lipolytic rate of mesenteric adipose tissue
was high in diabetic tilapia and IBMX or ISO addition to the incubation medium also
caused a significant decrease in FFA release. The rate of overall muscle protein
degradation and the activity of ATP-proteasome proteolytic pathway was increased in
diabetic fishes.
The data from the present work show that the adaptive metabolic adjustments to
fasting and diabetes in tilapia are similar to those in mammals (although the rate and
magnitude of responses are lower). However, in contrast, the sympathetic control of
lipolysis of adipose tissue from tilapia seems to be inhibitory, since β-adrenergic agonist
and cAMP-phosphodiesterase inhibitor decrease FFA release. Further experiments will
be necessary to shed light on the intriguing mechanism involved. To our knowledge this
is the first report to demonstrate the participation of ATP-proteasome proteolytic
pathway in total muscle protein degradation in tilapia and the changes in this metabolic
process during prolonged periods of fasting and diabetes.
Introdução
1
1. Introdução
Um breve histórico sobre a distribuição, alimentação e metabolismo dos peixes.
Os peixes pertencem à classe de vertebrados mais abundante, vivem em ambiente
aquático tropical, temperado e polar, representam mais da metade dos vertebrados e
constituem um grupo extremamente variado, ultrapassando mais de 40.000 espécies
conhecidas, contrastando com as 2.500 espécies de anfíbios, 6.000 espécies de répteis,
8.600 espécies de aves e 4.500 espécies de mamíferos, a partir do que se pode presumir
a grande variabilidade fisiológica, morfológica, nutricional e comportamental que
apresentam (LAGLER et al., 1977 e CUENCA e GALLEGO, 1987). Essa variedade de
espécies não é tão extraordinária se for considerado que mais de 70% da superfície do
planeta é coberta com água, que se extende entre os dois pólos terrestres e no interior
dos continentes, criando ambientes aquáticos tão variados, que justificam a grande
especiação observada nos peixes (LAGLER et al., 1977). No Brasil, as águas de
interiores ocupam uma área inundada de aproximadamente 3 milhões de hectares, que
são habitados por milhares de espécies de peixes (BRITSKI et al., 1988). Isso mostra
que a variabilidade de distribuição dos peixes supera à de qualquer outro vertebrado
(LAGLER et al., 1977).
A curiosidade humana sobre a natureza e a necessidade de conhecer espécies
com potencial para recreação e comercialização proporcionam o crescimento da
ictiologia, despertando especial interesse os ajustes fisiológicos e bioquímicos, a
regulação do metabolismo, os quais conferem aos peixes uma extraordinária capacidade
de adaptação às mudanças nas condições ambientais.
No Brasil o aumento dos lagos artificiais resultantes da construção de
hidrelétricas contribui para incentivar o estudo dos peixes. O melhor conhecimento de
Introdução
2
sua biologia e seu metabolismo fornece ferramentas úteis para o desenvolvimento de
tecnologias de produção de alimento de alta qualidade.
Os peixes apresentam interessantes mecanismos adaptativos por crescerem e
sobreviverem frente às cíclicas flutuações naturais na disponibilidade de alimentos,
determinada por fatores biológicos ou climáticos, podendo por exemplo, suportar
períodos muito longos de jejum (LAGLER et al., 1977). Algumas espécies subtropicais
estivam nos períodos de seca em buracos úmidos por várias semanas sem se alimentar,
usando apenas as reservas de gordura corporal; já outras espécies de clima temperado,
se alimentam e crescem apenas na primavera, quando encontram boa oferta de alimento
no ambiente e passam o restante do ano em jejum (LAGLER et al., 1977, JØRGENSEN
et al., 2002 e POTTINGUER et al., 2003). Outra adaptação interessante é o jejum dos
peixes que fazem a piracema. Durante esse período os peixes nadam longas distâncias
contra a correnteza, fazem a vitelogênese dos ovos e interrompem a ingestão de
alimentos (LAGLER et al., 1977 e FRENCH et al., 1983), o que pode perdurar por
meses, dependendo da espécie e da extensão da migração.
Os peixes, animais pecilotérmicos, possuem metabolismo mais baixo que os
mamíferos e capacidade de armazenar grande quantidade de lipídios, isso garante sua
sobrevivência aos longos períodos de jejum observados em situações naturais como a
estivação, invernos rigorosos ou piracema (MARTIN et al., 2002; JØRGENSEN et al.,
2002 e POTTINGUER et al., 2003). Assim, períodos de jejum constituem parte do ciclo
natural da vida de algumas espécies de peixes (CZESNY et al., 2003 e FIGUEIREDO-
GARUTTI et al., 2004).
Assim, características como a abundância de espécies e os múltiplos
mecanismos adaptativos que elas apresentam em resposta à flutuações naturais na
disponibilidade de alimento, seu grande potencial recreativo e como fonte de alimento,
Introdução
3
além da curiosidade humana, aliados ao forte potencial hídrico de nosso país, torna o
peixe um animal que proporciona uma vasta fonte para estudos.
A tilápia vermelha
A tilápia vermelha (Oreochromis sp), também conhecida como “Red Jamaica”
ou “Saint Peters” é um peixe híbrido obtido a partir de diferentes cruzamentos de
espécies e/ou linhagens de tilápias, com origem nos Estados Unidos. Sua coloração
avermelhada e a qualidade da carne conferiram a este híbrido, melhor valor comercial.
Possuem grande potencial para aqüicultura no Brasil e são amplamente utilizados na
cozinha oriental. Apresentam crescimento rápido e são de fácil manejo. Ela tem sido
intensamente utilizada na piscicultura mundial e está entre as espécies mais indicadas
para o cultivo intensivo em regiões tropicais (Instituto de Pesca do Estado de São Paulo,
2006).
Metabolismo energético nos teleósteos
Já é bem conhecida a dependência dos mamíferos onívoros por carboidratos
como fonte de energia, mas para os peixes, essa preferência não é totalmente verdadeira
e conhecida. Os peixes possuem, de maneira geral, maior ingestão de proteína e menor
de carboidratos. Essas características levaram alguns autores a afirmarem que os
carboidratos não têm importância como fonte energética para os teleósteos ou que sua
utilização é bastante reduzida, talvez pela baixa capacidade de digestão ou pela limitada
habilidade de regular a concentração de glicose plasmática (CUENCA e GALLEGO,
1987 e HUNG e STOREBAKKEN, 1994), e por isso, a principal fonte de energia para
as células seria proveniente das proteínas e lipídios (CORNISH e MOON, 1985;
CUENCA e GALLEGO, 1987 e HUNG e STOREBAKKEN, 1994). Assim, algumas
espécies usam a proteína muscular como sua principal fonte energética, como a enguia
Introdução
4
(Anguilla anguilla), o peixinho dourado (Carassius auratus) e o “plaice” (Pleuronectes
platessa), enquanto outras espécies como o “p ike” (Esox lucius), o “roach” (Rutilus
rutilus) e a perca dourada (Macquaria ambigua) usam lipídios e preservam as reservas
de glicogênio (CZESNY et al., 2003 e FIGUEIREDO-GARUTTI et al., 2004).
Entretanto, existem sim espécies que podem usar primariamente os carboidratos como
fonte de energia. Como exemplo, pode ser citado o Brycon cephalus, uma espécie nativa
da região Amazônica brasileira, que é uma espécie onívora, responde rapidamente ao
jejum, com aumento endógeno do suprimento de glicose, provavelmente pela
estimulação da glicogenólise, se comparado com peixes carnívoros. É difícil estabelecer
uma relação entre hábito alimentar e a seqüência de mobilização dos substratos
energéticos durante os períodos de jejum em peixes teleósteos, mas as espécies
carnívoras provavelmente dependem menos dos carboidratos que as espécies onívoras
(FIGUEIREDO-GARUTTI et al., 2002 e 2004).
Muitos autores consideram o jejum como uma condição estressante para os
teleósteos e usam o aumento dos níveis plasmáticos de cortisol como indicador
endógeno, sendo esse hormônio capaz de promover uma elevação dos níveis de glicose
e ácidos graxos livres (AGL) plasmáticos, que dão suporte energético à demanda
metabólica que o estresse exige. Entretanto, estudos com “walleye” (Stizostedium
vitrium) mostraram que o jejum não afeta os níveis de cortisol plasmático,
demonstrando que, para alguns peixes, o jejum é uma condição natural e não um fator
estressante (CZESNY et al., 2003) e que eles ajustam as respostas metabólicas para
sobreviverem nessa condição nutricional adversa.
Nos mamíferos, o músculo esquelético corresponde a 45% do peso corporal, já
nos peixes, representa aproximadamente 60%, o que o torna um tecido de grande
importância para o estudo do metabolismo energético nestes vertebrados (WALTON,
Introdução
5
1987; HEPHER, 1988 e KETTELHUT, 1988). Os peixes apresentam significativo
metabolismo anaeróbico, considerando que 75% da musculatura esquelética é composta
predominantemente de fibras brancas anaeróbicas (com reduzido número de
mitocôndrias) e pouco vascularizadas (CORNISH e MOON, 1985). Os peixes cuja
ingestão de carboidratos é baixa, possuem elevada taxa de neoglicogênese hepática,
além de baixo conteúdo de glicogênio muscular e altos níveis de lactato, o que
implicaria a participação do ciclo de Cori (CORNISH e MOON, 1985) para a síntese de
glicose. Entretanto, já foi observado que existe também uma retenção do lactato no
músculo esquelético de Pleuronectiformes (“sluggish swimmers”) e que isso parece ser
um processo de utilização do próprio lactato para obtenção de energia pelos teleósteos
(BATTY et al., 1979; TURNER et al., 1983a e 1983b).
A demanda de alguns tecidos pela glicose como combustível primário nos peixes
é atendida mais pela neoglicogênese do que pela glicogenólise. Isto pode ser devido a
uma insuficiência enzimática da glicogênio fosforilase no fígado dos teleósteos
(CUENCA e GALLEGO, 1987), embora o acúmulo de glucagon observado durante
jejum nos peixes diminui a atividade da glicogênio sintase e aumente a atividade da
glicogênio fosforilase (HEPHER, 1988 e LE BAIL e BŒUF, 1997). É sabido que a
atividade das enzimas glicolíticas em peixes, é notoriamente mais baixa quando
comparada com a de mamíferos terrestres. A atividade da hexoquinase chega a ser 10
vezes menor que a dos mamíferos terrestres. Este fato limita a velocidade da glicólise e
assim a oxidação da glicose fica mais lenta em relação, por exemplo, à oxidação do
glutamato (CUENCA e GALLEGO, 1987). Isso pode explicar a pequena utilização da
glicose em peixes, (aproximadamente 0,35 a 0,71 mg/Kg peso corporal.min), que é bem
menor que a verificada nos vertebrados superiores (4 a 6 mg/ Kg peso corporal.min).
Ocorre ainda grande variação nos níveis de glicose plasmática nos peixes, geralmente
Introdução
6
são encontrados valores mais baixos que os verificados em mamíferos, como por
exemplo valores de aproximadamente 20 mg/100mL em traíras (Hoplias malabaricus)
(MACHADO, 1982), assim como outras espécies, tal como o “yellowtail” (Seriola
quinqueradiata), apresentam níveis bastante altos de 210 mg/% após alimentação
(HEPHER, 1988).
A qualidade da dieta precedente ao jejum pode determinar as alterações
metabólicas que ocorrem nessa situação nutricional, tanto em peixes como em
mamíferos. Uma dieta rica em proteínas como a da maioria dos teleósteos, tem os
aminoácidos exógenos como substratos da neoglicogênese, dessa forma, essa via está
constantemente ativada. Assim, a grande quantidade de músculo branco que os peixes
possuem representa uma importante fonte para abastecer essa via metabólica, quando o
alimento ficar escasso ou inexistente (RENAUD e MOON, 1980; MOON, 1983;
CORNISH e MOON, 1985 e MACHADO et al. 1988).
Assim, o controvertido uso dos carboidratos como fonte energética e da
capacidade dos peixes em regular a concentração de glicose plasmática, o jejum, muitas
vezes considerado uma condição natural, a representatividade do tecido muscular no
metabolismo energético, juntamente com a falta de dados conclusivos sobre o uso dos
carboidratos pelos peixes foram características determinantes para direcionar os
objetivos desse trabalho em estudar o metabolismo dos carboidratos.
Nos peixes os lipídios estão armazenados em grande quantidade dispersos em
tecidos como o músculo vermelho e o fígado ou em tecido adiposo organizado,
distribuído na cavidade abdominal, envolvendo o intestino e outras vísceras
(MACHADO, 1982; HEPHER, 1988; SHERIDAN e HARMON, 1994 e ALBALAT et
al., 2005). O principal substrato energético utilizado pelo tecido esquelético dos peixes
é o ácido graxo (CUENCA e GALLEGO, 1987 e HEPHER, 1988). O uso preferencial
Introdução
7
dos ácidos graxos no lugar da glicose é devido ao sistema enzimático oxidativo da
musculatura vermelha apresentar alta atividade da lipase e desidrogenase succínica
(BOKDAWALA e GEORGE, 1967). O sistema oxidativo de ácidos graxos no fígado
do peixe é similar ao dos mamíferos e demonstra que as enzimas mitocondriais
hepáticas oxidam uma variedade de ácidos graxos, inclusive os altamente insaturados
(MACHADO, 1982).
Os lipídios desempenham funções essenciais na fisio logia dos peixes das regiões
polares, como: aumento na capacidade de flutuação nos peixes marinhos, que não
possuem bexiga natatória, o que lhes permite explorar os nichos pelágicos; aumento na
capacidade de difusão do oxigênio (pois o oxigênio é mais solúvel em lipídios do que
no meio aquoso celular) e dessa forma fornece oxigênio aos sítios de fosforilação
oxidativa; evita o congelamento e é importante fonte de armazenamento de energia para
abastecer o metabolismo aeróbico. Esses peixes polares, utilizam principalmente os
ácidos graxos como fonte energética, pois esses compostos são energeticamente mais
eficientes para o músculo esquelético e para o coração que a glicose e o lactato (HAZEL
e SIDELL, 2004). Para os mamíferos, os estoques de lipídios também são muito
importantes. Apenas como exemplo de mamífero hibernante, a marmota de barriga
amarela (Marmota flaviventris) voluntariamente interrompe a alimentação no início do
inverno e permanece alguns meses em jejum durante a hibernação. Nesse período, ela
perde cerca de 50% de sua massa, equivalente a lipídios e tem a temperatura corporal
ligeiramente abaixo do ambiente, podendo atingir 0oC (MOSTAFA et al., 1993).
Nos peixes, a maquinaria enzimática responsável pela mobilização dos lipídios e
pela sua deposição no tecido adiposo é muito semelhante à dos mamíferos (SHERIDAN
e HARMON, 1994). Entretanto, os fatores endócrinos que estão diretamente envolvidos
na sua regulação não são bem conhecidos.
Introdução
8
As informações sobre os mecanismos envolvidos no controle da atividade do
tecido adiposo nos teleósteos são fragmentadas e contraditórias, apesar da presença de
uma boa quantidade de tecido adiposo organizado em muitas espécies de peixes
(MIGLIORINI et al., 1992). A regulação da lipólise nos peixes tem sido estudada há
vários anos e a participação de receptores adrenérgicos nesse processo ainda é um
problema intrigante e fascinante (FARKAS, 1967; MIGLIORINI et al., 1992; VAN
DEN THILLART et al., 2001 e VIANEN et al., 2002). Nos teleósteos há sugestões de
mecanismos para explicar o controle da lipólise, mas variam em função da espécie,
hábito alimentar, maturação sexual, variações sazonais, idade, níveis de oxigênio,
temperatura ambiental e estrutura social. Estudos vêm sendo conduzidos, tanto in vivo
quanto in vitro (em fragmentos de tecido adiposo e células isoladas) para investigar o
papel das catecolaminas e a participação dos receptores adrenérgicos na regulação da
lipólise em peixes (FARKAS, 1969; MIGLIORINI et al., 1992; VAN RAAIJ et al.,
1995; VAN DEN THILLART et al., 2001 e VIANEN et al., 2002). Dados recentes têm
sugerido a existência de um novo fenômeno de inibição da lipólise, ao contrário do
conhecido efeito dos receptores beta adrenérgicos na estimulação da atividade lipolítica
no tecido adiposo.
Assim sendo, um dos objetivos do presente trabalho foi estudar o controle
adrenérgico da lipólise no tecido adiposo mesentérico das tilápias tanto alimentadas
como submetidas a diferentes períodos de jejum.
A regulação da proteólise muscular possui grande importância para a
homeostasia energética, no controle da massa muscular e crescimento corporal, como
também nas adaptações do organismo a uma variedade de condições estressantes
impostas ou não pelo ambiente. Como o músculo esquelético é o tecido que contém a
maior quantidade de proteínas do organismo, a hidrólise das proteínas musculares é um
Introdução
9
processo de grande importância no fornecimento de aminoácidos para a neoglicogênese
(KETTELHUT et al., 1988).
O metabolismo de proteínas nos peixes é maior no fígado, intestino e
brânquias, e de maneira geral, a velocidade de síntese e de degradação de proteínas
musculares de peixes é muito baixa. Apesar do baixo “turnover” da proteína muscular, a
musculatura esquelética é um tecido bastante significativo nesse processo, pois constitui
aproximadamente 60% da massa corporal (WALTON, 1987 e SALEM et al., 2005).
Poucos são os estudos sobre o controle da síntese e degradação de proteínas em
músculo esquelético de peixes, provavelmente decorrente das dificuldades
metodológicas para tal investigação.
O uso de preparações in vitro, com incubações de músculos íntegros de ratos, foi
padronizado e descrito por KETTELHUT et al., (1988) e é rotineiramente empregado
nos estudos de proteólise muscular no laboratório de metabolismo e endocrinologia da
FMRP-USP. Este método consiste na incubação in vitro de músculos esqueléticos
intactos, das patas posteriores de ratos jovens, geralmente soleus e EDL (extensor
digitorum longus), fixados em suportes de acrílico ou de alumínio, através de seus
tendões, e incubados em condições apropriadas, permitindo adequada difusão de
oxigênio e nutrientes para as células. A vantagem deste método é que além do total
controle das condições experimentais, que permite uma medida precisa das taxas de
degradação de proteínas, pode-se estudar o papel de diferentes substâncias químicas,
que alteram a velocidade de renovação de proteínas no músculo esquelético, cujo estudo
in vivo seria de difícil interpretação (KETTELHUT et al., 1988 e BARACOS et al.,
1989).
WAARDE (1983) mostrou que o músculo mandibular protractor hyoidei de
peixe dourado (Carassius auratus L.) pode ser isolado e mantido intacto por um período
Introdução
10
de 2 horas de incubação, devido à manutenção dos níveis de ATP, creatinina fosfato e
adenilato, devido a uma rápida difusão dos substratos e do oxigênio do meio para as
células. Por isso, o músculo protractor hyoidei é um promissor modelo para estudos in
vitro do metabolismo energético muscular em peixes. Este músculo é do tipo misto, pois
suas fibras possuem características semelhantes ao músculo branco (devido ao tipo de
miosina) e ao músculo vermelho lateral (devido à atividade da lactato desidrogenase)
(WAARDE, 1983). Como este músculo mandibular das tilápias apresenta características
físicas (peso, tamanho e presença de tendões) semelhantes ao EDL e soleus, parecia ser
um promissor modelo para o estudo do metabolismo de proteínas em músculo de
tilápias, o que poderia fornecer uma melhor compreensão dos processos de degradação
de proteínas e sua regulação em teleósteos.
Com o desenvolvimento das técnicas de incubação in vitro com músculos
intactos com tendões foi possível demonstrar a existência de pelo menos 4 vias
proteolíticas em ratos e aves: a) lisossomal (envolvendo a ação de catepsinas B, D, H, L,
etc); b) dependente de cálcio (envolvendo as calpaínas e seu inibidor endógeno, a
calpastatina); c) dependente de proteassoma-ATP-ubiquitina, (com a participação de
duas grandes proteases citosólicas: 26S e 20S) e; d) independente de ATP ou residual
(não sendo ainda conhecidas as proteases envolvidas neste sistema de degradação)
(KETTELHUT et al., 1988).
Em peixes, tem sido relatada a participação das catepsinas, assim como das
calpaínas (EC 3.4.22.17) (que são proteases neutras cisteína cálcio-dependentes) na
degradação de proteínas miofibrilares (LADRAT et al., 2000). Esses sistemas
proteolíticos dependente de cálcio podem ser usados como indicadores bioquímicos
para a degradação muscular e predição da qualidade da carne de pescados
(TOYONARA e MAKINODAN, 1989; PAPA et al., 1996 e LADRAT et al., 2000).
Introdução
11
A maioria das células eucarióticas possui ainda duas grandes proteases
citosólicas denominadas de proteassoma 20S e 26S, sendo uma de suas principais
funções a degradação intracelular de proteínas anormais, proteínas reguladoras de meia-
vida curta ou mesmo outras normais citosólicas como proteínas sarcoplasmáticas e
miofibrilares (HERSHKO e CIECHANOVER, 1982 e DAHLMANN, 1995). Pouco se
sabe sobre a atividade e a importância destas proteases em peixes. Nos músculos de
carpa (MAKINODAN et al., 1963 e 1969 e HASE et al., 1980) e “white croakers”
(Micropogon opercularis) (BUSCONI et al., 1984 e FOLCO et al., 1988), foi isolada
uma protease alcalina de alto peso molecular, uma importante enzima envolvida nos
mecanismos de degradação de proteínas celulares desses peixes. Na década de noventa
foi purificada e caracterizada o proteassoma em músculo de “white croakers”
(Micropogon opercularis) e salmão do Atlântico (Salmo salar) por BUSCONI et al.
(1992), SANCHEZ et al. (1995) e STOKNES e RUSTAD (1995) que mostraram que
esse complexo enzimático possui também peso molecular de 600 kDa, (BUSCONI et
al., 1992 e DAHLMANN, 1995), mas pouco se sabe sobre o papel deste complexo
enzimático na degradação de proteínas em situação de demanda energética ou estresse.
Neste contexto, seria interessante detectar a presença da via proteolítica
dependente de proteassoma em músculo da tilápia, o que poderia fornecer importante
informação sobre a degradação de proteínas musculares nesta espécie de peixe em
situações de restrição alimentar.
A insulina nos teleósteos
A insulina está presente em todos os vertebrados, dos agnatos aos mamíferos
(LE BAIL e BOEUF, 1997). Em muitos teleósteos esse hormônio é secretado pelas
ilhotas extrapancreáticas chamadas corpúsculos de Brockman (NGUYEN et al., 1995 e
Introdução
12
MOMMSEN e PLISETSKAYA, 1991). O estudo histológico de dessas ilhotas em
“sculpin” (Cottus scorpius) mostrou que as células beta desse peixe são análogas às dos
mamíferos, sendo inclusive seu número maior que o das células alfa FALKMER
(1961).
A insulina já está bem caracterizada em teleósteos e em outras espécies de
vertebrados inferiores. A forma bioativa da insulina foi extraída dos corpúsculos de
Brockman dos teleósteos em 1922 por McLeod e a sua estrutura cristalina foi
determinada em agnatos (“hagfish” – Myxine glutinosa) (CHAN et al., 1993). A
insulina de peixes é também uma molécula constituída de 51 a 58 aminoácidos,
organizada em 2 cadeias, A e B, ligadas através de pontes dissulfeto. A análise da
seqüência de aminoácidos da insulina de mais de 60 espécies indica que ela é uma
molécula bastante conservada durante a evolução, assim como a molécula de seu
receptor.
A bioquímica e a fisiologia da insulina nos peixes têm sido muito estudadas por
MOMMSEN e PLISETSKAYA (1991). Nos peixes, bem como nos mamíferos, os
hormônios pancreáticos estão entre os mais importantes que controlam o
direcionamento do fluxo metabólico, para o armazenamento ou para a utilização da
energia obtida do alimento (PLISETSKAYA, 1993; LE BAIL e BŒUF, 1997). A
insulina estimula a captação de glicose e aminoácidos pelo músculo esquelético,
aumenta a síntese protéica nesses tecidos, sendo também nos peixes o principal
hormônio anabólico. A neoglicogênese e a glicogenólise hepáticas são processos
inibidos pela insulina, enquanto que a incorporação dos ácidos graxos nos lipídios
hepáticos é estimulada (HAZON e BALMENT, 1997 e MIGLIORINI e KETTELHUT,
1999). Portanto sua falta produz hiperglicemia (MURRELL e NACE, 1959;
PLISETSKAYA e DUAN, 1994), elevação do AGL plasmático e uma diminuição do
Introdução
13
conteúdo de glicogênio hepático. Esses achados foram verificados no peixe dourado,
“catfish” e “pike” (PLISETSKAYA e DUAN, 1994). Assim, a insulina, nos peixes,
proporciona decréscimo da glicose sanguínea, da mobilização de AGL e aumento do
glicogênio em músculos vermelho e branco (OTTOLENGUI et al., 1982 e
MACHADO, 1982). O fornecimento exógeno de insulina sem o fornecimento de
glicose ou alimentação causa hipoglicemia que persiste por um longo período (3 – 5
dias) e também pode levar a morte do peixe (HEPHER, 1988).
Em algumas espécies de peixes, a resposta à insulina pode ser diferente em
função do estresse ou do jejum e às vezes, favorecer a preservação do glicogênio
(FIGUEIREDO-GARUTTI et al., 2002). Os níveis plasmáticos de insulina geralmente
diminuem no jejum na maioria das espécies de peixes (PLISETSKAYA et al., 1986 e
LE BAIL e BŒUF, 1997). Existe uma correlação positiva com a ingestão de alimento e
uma correlação negativa com o jejum, sendo que os níveis estão sempre maiores nos
peixes alimentados do que nos jejuados (INCE, 1983 e LE BAIL e BŒUF, 1997).
Entretanto, os mecanismos que mantêm os níveis de insulina endógena durante o jejum
ainda não estão esclarecidos. A participação de fatores ambientais também é sugerida e
peixes não migratórios como o “scorpionfish” (Scorpaena porus) mostrou uma
diminuição significativa nos níveis plasmáticos de insulina durante os meses de inverno,
coincidentemente com uma expressiva redução do consumo alimentar INCE (1983).
Uma situação catabólica crônica como um jejum muito prolongado, baixos níveis de
insulina e um consumo energético alto só são citados em peixes que realizam piracema.
Como a tilápia possui desova parcial e não realiza piracema os ajustes metabólicos
resultantes do jejum prolongado e conseqüentemente dos níveis reduzidos de insulina
vão ajudar a entender melhor a regulação do metabolismo energético em situações
catabólicas.
Introdução
14
Diabetes mellitus nos peixes
Dentre os modelos de diabetes mellitus em peixes teleósteos e vertebrados
ectotérmicos, a injeção de aloxana consiste em uma das melhores opções, mesmo
sabendo que ela pode causar toxicidade sistêmica. Outra opção seria a utilização de
outra droga, também conhecida por seu potencial diabetogênico, a estreptozotocina. No
entanto, estudos de KELLEY (1993) e PLISETSKAYA e DUAN (1994) demonstraram
que esta droga não apresenta efeito diabetogênico em teleósteos. Além disso, o diabetes
experimental cirúrgico, que consistiria na retirada dos corpúsculos de Brockman
(ilhotas) pode ser mais complexo, uma vez que existe número variado de corpúsculos
espalhados em outras regiões fora do pâncreas dos teleósteos. Ainda a recuperação dos
peixes após a cirurgia de retirada das ilhotas é muito lenta, sendo que, nem todas as
espécies se recuperam deste tipo de intervenção (KELLEY, 1993). Junto a essas
informações, foi descoberta a existência de células endócrinas similares às dos
corpúsculos de Brockman, que produzem peptídeos da família do glucagon e peptídeos
pancreáticos, presentes no estômago e intestino, o que tornaria a remoção das ilhotas um
procedimento inválido (PLISETISKAYA et al., 1989).
Estudos demonstraram que a aplicação da aloxana em 7 espécies diferentes de
peixes promoveu o aparecimento de hiperglicemia, porém inconstantes lesões, ocorriam
tanto nas células beta dos corpúsculos de Brockman, como no tecido exócrino, células
alfa, fígado, rins e baço. MURRELL e NACE (1959) sugerem que os resultados
observados na literatura são conflitantes e variáveis devido ao uso de poucos animais
nas pesquisas, diferentes espécies e falta de correlações entre dose de aloxana, grau de
lesão e níveis de hiperglicemia. Para o “catfish” (Ictalurus nebulosus), a aloxana
apresenta especificidade pelas células beta e não apresenta toxicidade em outros tecidos,
Introdução
15
levando a um aumento da glicemia que persistiu por 14 dias (MURRELL e NACE,
1959).
Os trabalhos referentes ao diabetes experimental em peixes como o “catfish”
(Ictalurus nebulosus), lampréia (Lampetra fluviatilis e Petromizon marinus) e “goby”
(Gillichthys mirabilis) induzido por aloxana mostram que as alterações nos metabólitos
plasmáticos relacionados ao metabolismo energético são decorrentes da falta de insulina
(MURREL e NACE, 1959; BIUW, 1970; KELLEY, 1993; KAO et al., 1999, 2001 e
2003).
Nenhum estudo do metabolismo energético da tilápia em um estado catabólico
agudo resultante da falta de insulina foi encontrado. Assim, seria interessante investigar
neste peixe o papel deste hormônio no metabolismo de carboidratos, lipídios e
proteínas, padronizando um modelo de diabetes aloxânico agudo nesta espécie de
teleósteo.
Objetivos Tendo em vista as considerações citadas, o objetivo deste trabalho foi investigar
as alterações do metabolismo de carboidratos, lipídios e proteínas em tilápias vermelhas
durante períodos prolongados de jejum, assim como o efeito agudo da falta de insulina
resultante da administração de aloxana, nestes mesmos parâmetros metabólicos.
Informações esparsas e contraditórias sobre a participação dos receptores
adrenérgicos na regulação da lipólise e a descrição da ocorrência de um novo fenômeno
relacionado ao controle hormonal e simpático no metabolismo dos lipídios em peixes
despertam o interesse de investigar estes mecanismos.
Como ainda não foi encontrada nenhuma padronização desse método para
incubação do músculo esquelético para outras espécies que não os ratos e aves, a
padronização de uma técnica para o estudo do metabolismo de proteínas em músculo
Introdução
16
esquelético de peixes permitirá uma melhor compreensão desses processos fisiológicos
e sua regulação em teleósteos. Até hoje não é conhecido nenhum estudo na literatura
com o propósito de investigar os efeitos do jejum e da ausência de insulina na proteólise
da musculatura esquelética de peixes. Portanto este trabalho teve como objetivos:
Avaliar as alterações do metabolismo energético provocadas por diferentes períodos
de jejum e pela deficiência aguda de insulina decorrente da administração de aloxana
através da:
- Determinação do conteúdo de glicogênio hepático e muscular, e dos níveis de glicose,
lactato e AGL (ácidos graxos livres) plasmáticos;
- Medida da lipólise do tecido adiposo mesentérico na presença de agonistas e
antagonistas adrenérgicos envolvidos na regulação do metabolismo dos lipídios;
- Padronização de métodos para estudo da degradação de proteínas em músculo
esquelético de peixe, utilizando os procedimentos empregados nos estudos de
proteólise em músculo esquelético de ratos;
- Determinação da degradação total de proteínas no músculo protractor hyoidei da
tilápia, assim como da participação da via proteolítica dependente de proteassoma-
ATP-ubiquitina.
Estes estudos serão importantes para:
- Obter resultados que sirvam de base para posteriores estudos de controle do
metabolismo neste peixe, possibilitando um estudo comparativo entre as diferentes
espécies de animais.
- Proporcionar conhecimentos básicos que possam ser usados na aqüicultura e
conseqüentemente melhorar a produção de fonte protéica de alta qualidade para a
população.
Introdução
17
Os conhecimentos básicos de padrões metabólicos como os níveis de
metabólitos plasmáticos, lipólise, degradação de proteínas e os principais produtos
liberados pelos tecidos dos peixes permitem o uso destes animais como indicadores de
poluição, uma vez que a anoxia, entre outros fatores, podem interferir neste
metabolismo.
Neste sentido, a tilápia (Oreochromis sp) desperta o interesse para este estudo
por ser um peixe considerado como ótima fonte nutricional, com grande potencial
econômico e facilmente encontrado em vários sistemas de produção intensiva de peixes
no Estado de São Paulo e na região de Ribeirão Preto – SP.
Material e métodos
18
2. Material e Métodos
2.1. Origem dos peixes
Tilápias vermelhas (Oreochromis sp) adultas, machos, com peso médio de 500g
foram capturadas em tanque rede do centro de aqüicultura da Usina São Geraldo
Sertãozinho-SP-Brazil, transportadas, no período de 2003 a 2005, até os aquários do
Laboratório de Metabolismo da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP) em
recipientes de plástico de 50 litros com aeração. Os peixes foram criados sob condições
ambientais de temperatura e fotoperíodo antes de serem coletados para os experimentos.
Foram coletados ao longo do ano, compreendendo todas as estações, e posteriormente
mantidos em ambiente controlado nos aquários do Laboratório de Metabolismo da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.
Quatro exemplares-testemunho encontram-se depositados no Laboratório de
Ictiologia de Ribeirão Preto – SP (LIRP 5887, 4 ex., 205-227 mm CP), Faculdade de
Filosofia Ciências e Letras da USP.
2.2. Aquários e manutenção dos peixes
Os aquários do Laboratório de Metabolismo consistem em 3 caixas de cimento-
amianto de 250 litros (Figura 1), revestidos com tinta epóxi branca e interligados a um
sistema de filtro mecânico (camadas de seixo rolado de diferentes tamanhos, conchas do
mar e lã artificial), filtro biológico (estabelecido nos espaços dos seixos e conchas do
filtro mecânico e em uma coluna de bio-balls) e de macrófitas aquáticas (Ceratofilum ou
rabo de raposa e Utriculária, as quais foram selecionadas de acordo com as condições
dos aquários e de luminosidade oferecidos pelo sistema). O bombeamento da água entre
os aquários e os filtros garantia sua circulação com um fluxo de aproximadamente 3000
litros/h, permitindo que toda a água do sistema passasse pelos filtros no mínimo 3
Material e métodos
19
vezes/h. A água era aerada através de sua circulação entre os recipientes dos filtros e por
bombas de ar com pedras porosas. A temperatura era mantida em 28oC por uma
resistência elétrica de 1500W e o fotoperíodo mantido em 12:12h claro:escuro, os níveis
de oxigênio ficaram em aproximadamente 5 a 6 mg O2/L e pH da água em 7.
Ao chegarem no Laboratório de Metabolismo da FMRP os peixes eram
transferidos manualmente, um a um, sendo 10 peixes por aquário de 250 litros, para se
aclimatarem no novo ambiente por pelo menos 2 semanas antes da realização dos
experimentos. A ração somente era oferecida após 48h da chegada dos animais, na
proporção de 2% do peso corporal, duas vezes ao dia (8:00 e 17:00h).
Figura 1: Croqui dos aquários experimentais. a) aquários de 250 litros; b) filtro de seixo rolado e conchas do mar; c) filtro de “bio-balls”; d) filtro de macrófitas (45 litros); e) filtro de lã artificial; f) aquecedor; g) bomba de água (3.500 litros/h) para circulação do sistema; h) bombas de água (1.000 litros/h). As flechas indicam o fluxo da água.
2.3. Tratamento e grupos experimentais
2.3.1. Grupo Alimentado
Um grupo de peixes foi diariamente alimentado com ração comercial peletizada
– Laguna, 10mm de diâmetro (proteína bruta: 28%; lipídios: 6%; fibra: 10%; minerais:
Material e métodos
20
9%; Ca++: 3%; P: 0,5%; umidade: 8%) fornecida a 2% do peso corporal dividida em
duas vezes por dia.
2.3.2. Grupos Jejuados
Outros grupos foram mantidos em jejum por 7, 15, 30, 60, 90, 150 e 200 dias.
Os animais desses grupos permaneceram em aquários que possuíam telas na superfície
para evitar que insetos ou outros animais ou plantas caíssem dentro d’água. Todos os
experimentos foram conduzidos entre 8:00-10:00h.
2.3.3. Grupo diabético
2.3.3.1. Determinação da dose e da via de administração de aloxana para indução de
diabetes experimental em tilápias
Para a determinação da via de aplicação e da quantidade de aloxana necessária
para a indução do diabetes experimental nas tilápias foram testadas quatro doses de
aloxana, 50, 100, 150 e 200mg/Kg de peso corporal administradas por duas vias
diferentes, ambas endovenosa. A primeira constituiu na administração da droga via
conus arteriosus e a segunda via foi a punção caudal. Em todos os testes as tilápias
ficaram em jejum de 48h antes da administração da droga. A aloxana foi dissolvida em
salina 0,9% no momento da aplicação como recomendado por MUREL e NACE
(1959). A aplicação foi feita de modo que a quantidade necessária de droga era aplicada
na proporção volume/peso corporal de 100µL/100g. Nos animais controles foi injetado
igual volume de salina 0,9%.
Foram realizadas coletas de sangue para a determinação de glicemia, no
momento da aplicação da aloxana e a cada 24h por um período de 5 dias e também
depois de uma e duas semanas. A amostragem de sangue foi feita por punção caudal
retirando-se no máximo 400µL de sangue em cada coleta.
Material e métodos
21
Para permitir o acompanhamento individual do perfil glicêmico os peixes foram
individualizados através da adaptação da marcação hidrostática tipo Lea descrito por
CECCARELLI et al. (1991), onde se usou miçanga colorida. Com o auxilio de uma
broca elétrica, foi feito um pequeno orifício na parte superior do opérculo esquerdo, no
qual era fixada a miçanga com fio de nylon, como indicado na figura 2.
Figura 2: Representação da tilápia marcada com miçanga colorida. Adaptação da marcação hidrostática tipo Lea.
2.3.3.2. Indução do diabetes experimental
O diabetes experimental foi induzido pela aplicação de aloxana, nas tilápias em
jejum de 48h, por via endovenosa, na dose de 150mg/Kg de peso corporal, e a via
escolhida foi a veia caudal (de acordo com os resultados obtidos na determinação da
dose e da via de administração de aloxana para indução de diabetes experimental
apresentados nos resultados). Amostras de sangue foram coletadas no momento da
aplicação da aloxana e a cada 24h após a aplicação de aloxana para se determinar o
perfil glicêmico e de ácidos graxos livres por um período de 120h. Os peixes desse
grupo não receberam ração durante todo o período experimental (120h). Seu grupo
controle foi constituído por peixes que receberam salina 0,9% e ficaram em jejum
durante o mesmo período de tempo que os animais que receberam aloxana.
Material e métodos
22
2.4. Sacrifício, biometria e retirada dos tecidos
Os peixes foram retirados dos aquários no momento do experimento,
sacrificados rapidamente por secção cervical. Anotava-se o peso corporal e
comprimento padrão (da boca até o final da cauda) (Figura 3).
Figura 3: Biometria indicando compri-mento total e padrão.
Após a biometria retirava-se a mandíbula, para dissecação do músculo
protractor hyoidei (Figura 4), que era pesado e incubado in vitro. Em seguida, os peixes
eram abertos ventralmente para retirada do tecido adiposo mesentérico (em fitas), que
era pesado e incubado in vitro. Retirava-se também o fígado e fragmentos de músculo
branco (região posterior esquerda do corpo do peixe a partir do ânus e poro genital), os
quais eram usados para a quantificação do glicogênio e dos lipídios totais. Também
foram retirados e pesados as gônadas, o estômago e o intestino. Todos os tecidos foram
removidos com o máximo de cuidado e colocados imediatamente em uma placa de petri
no gelo, onde ficavam até serem pesados e destinados para as dosagens específicas.
Amostras de sangue foram coletadas por punção caudal em seringas geladas e
heparinizadas e imediatamente colocadas no gelo para posterior dosagem de glicose,
AGL (ácidos graxos livres) e lactato.
Comprimento total
Comprimento padrão
Material e métodos
23
Figura 4: Dissecação do músculo protractor hyoidei da mandíbula de tilápia e fixação no suporte para incubação in vitro.
2.5. Retirada do músculo protractor hyoidei e procedimentos de incubação
O músculo mandibular P. hyoidei está associado a movimentos bucais
importantes relacionados ao sistema suspensorial-hyoideo o qual permite um rápido
movimento de sucção relacionado à alimentação e fluxo de água pelas brânquias. O
movimento que esse músculo desempenha permite um aumento do volume da cavidade
bucal para realização da sucção (OSSE, 1969; WINTERBOTTON, 1974; AERTS,
1991; ADRIENS e VERRAES, 1998; EASTMAN e LANNOO, 2003; DIOGO et al.,
2004 e VANDEVALLE et al., 2005).
Esses músculos íntegros foram cuidadosamente e rapidamente dissecados e
fixados em sua posição de repouso prendendo seus tendões em suportes de acrílico com
alfinetes entomológicos conforme ilustrado na figura 4. A manutenção dos músculos
nestas condições possibilita a difusão de oxigênio e nutrientes, evitando-se a anoxia das
fibras musculares centrais. Em seguida os músculos presos nos suportes foram
Material e métodos
24
incubados em erlenmeyer com 4 mL de tampão Krebs-Ringer bicarbonato, pH 7,4,
37oC, aerado com 95%O2 :5%CO2, contendo glicose (5mM) e cicloheximida (0,5mM)
para evitar a síntese de proteínas e a reincorporação de aminoácidos nas proteínas. Após
uma hora de pré- incubação para estabilização, trocava-se o meio de incubação por outro
fresco de mesma composição e os músculos permaneciam incubados por mais 2h. Esse
procedimento garante a manutenção dos conteúdos de ATP, de fosfocreatinina e
glicogênio no tecido muscular, reproduzindo as características dos músculos in vivo e
permite que eles sejam mantidos in vitro por até 4 horas em boas condições
morfológicas, bioquímicas e fisiológicas, sendo que em rato o músculo pode ser
mantido por até 9 horas (KETTELHUT, 1988).
2.6. Medida da taxa de degradação protéica
A taxa de degradação protéica foi medida pela liberação de tirosina dos
músculos para o meio de incubação. A tirosina liberada no meio de incubação é usada
para medida da degradação de proteínas por ser um aminoácido que não é nem
sintetizado e nem degradado pelo músculo e por ser facilmente quantificado pelo
método fluorimétrico simples e de grande sensibilidade descrito por WAALKES e
UDENFRIEND (1957). Essa liberação de tirosina deve refletir a velocidade de
degradação de todas as classes de proteínas celulares, uma vez que este aminoácido é
distribuído em todas as proteínas celulares.
2.6.1. Proteólise total
A taxa de proteólise total, que reflete a atividade de pelo menos quatro vias
proteolíticas bem conhecidas em músculos de mamíferos (lisossomal, dependente de
cálcio, dependente de proteassoma-ATP-ubiquitina e independente de ATP ou residual)
Material e métodos
25
foi determinada pela medida da taxa de liberação de tirosina dos músculos incubados na
ausência de inibidores específicos das diferentes vias.
A participação de cada via proteolítica corresponde à diferença da liberação de
tirosina no meio de incubação (Krebs-Ringer bicarbonato) entre o músculo
submandibular direito e esquerdo, incubados na presença ou ausência de inibidores
específicos para a via proteolítica que se deseja quantificar.
2.6.2. Proteólise lisossomal
Para medir a proteólise intra-lisosomal, o músculo de um lado foi incubado na
ausência de insulina e aminoácidos de cadeia ramificada, condição essa que ativa os
lisossomos. O músculo contralateral foi incubado na presença de insulina (1U/mL),
aminoácidos de cadeia ramificada (leucina 170 µM; isoleucina 100 µM; valina 200 µM)
e metilamina (10mM), uma base fraca que aumenta o pH no interior do lisossomo e
inibe a proteólise lisossomal (Kettelhut et al., 1988). A diferença na quantidade de
tirosina liberada entre os dois músculos reflete a atividade proteolítica da via lisossomal.
2.6.3. Proteólise dependente de proteassoma-ATP-ubiquitina e proteólise independente
de ATP ou residual
Para estimar a participação da proteólise dependente de proteassoma-ATP-
ubiquitina e a independente de energia (ou residual) o músculo de um lado (“stretched”)
foi incubado em condições semelhantes à medida da proteólise total e o músculo
contralateral foi incubado no tampão de incubação livre de cálcio contendo metilamina,
insulina, aminoácidos de cadeia ramificada e MG132 (carbobenzoxy-L-leucyl-L- leucyl-
L- leucinal), um potente inibidor do proteassoma, numa concentração de 20µM. A
tirosina liberada nessa condição, representa a proteólise residual. A diferença de tirosina
liberada entre os 2 músculos representaria a participação das vias lisossomal,
dependente de cálcio e dependente proteassoma-ATP-ubiquitina (KETTELHUT et al.,
Material e métodos
26
1988 e ROCK et al., 1994). No presente estudo, esta diferença representa
principalmente a proteólise dependente de proteassoma, uma vez que nossos prévios
estudos mostraram que neste tipo de músculo a participação das vias lisossomal e
dependente de cálcio é muito pequena.
2.7. Coleta do tecido adiposo mesentérico e procedimentos de incubação
Após a transecção espinhal e abertura do ventre do peixe, rebatia-se o estômago
e intestino, separava-se rapidamente as fitas de tecido adiposo mesentérico do intestino
e pesava-se todo o conteúdo de tecido adiposo retirado da cavidade abdominal obtendo-
se porções de 5-20g/peixe. Após a pesagem o tecido adiposo foi rapidamente colocado
em uma placa de petri com tampão Krebs-Heinselet (em mM: 118,5 NaCl; 4,75 KCl;
1,2 MgSO4.7H2O; 1,91 CaCl2.2H2O; 1,2 KH2PO4; 25 NaHCO3; 0,5 D-glicose) com 1%
de albumina bovina livre de ácidos graxos, equilibrado com 95% O2:5% CO2, pH=7,4
em temperatura ambiente e cuidadosamente picado com tesoura e lâmina de aço (gilete)
sobre um papel de filtro umedecido com o tampão para obtenção de fragmentos de 2-
5mm2. Porções de aproximadamente 500mg desse tecido foram transferidos para
pequenas placas de plástico com tampão Krebs-Heinselet com 1% de albumina bovina
livre de ácidos graxos antes de serem transferidos para frascos plásticos de 20 mL. Após
colocar a porção de tecido adiposo picado nos frascos com 5mL de tampão Krebs-
Heinselet (meio basal) (em mM: 118,5 NaCl; 4,75 KCl; 1,2 MgSO4.7H2O; 1,91
CaCl2.2H2O; 1,2 KH2PO4; 25 NaHCO3; 0,5 D-glicose) contendo 2% de albumina
bovina livre de ácidos graxos e pH 7,4 eles foram tampados com rolhas de borracha,
aerados com 95% O2:5% CO2 e colocados para incubar em banho Maria a 37oC com
agitação por um período de 2h.
Material e métodos
27
2.7.1. Medida da lipólise
Cada experimento foi conduzido com triplicatas para cada tratamento, os quais
consistiam em meio de incubação basal, meio basal + isobutimetilxantina (10-3M)
(inibidor da fosfodiesterase do AMPc) e meio basal + isoproterenol (10-5M) (agonista
beta-adrenérgico não seletivo). No final das 2h de incubação os frascos foram retirados
do banho e colocados no gelo para interromper as reações e em seguida alíquotas do
meio de incubação foram coletadas para dosagem de AGL (ácidos graxos livres) de
acordo com métodos descritos por DOLE e MEINERTZ (1960).
Para dissolver a isobutilmetilxantina foi usado um Eppendorf de 1,5mL com
meio de incubação basal no qual se gotejava uma solução de NaOH 5N seguida de
agitação no vortex, até que a droga ficasse totalmente dissolvida. Essa solução era
adicionada ao volume total de meio de incubação usado no experimento. Em seguida o
pH foi corrigido para 7,4. Para dissolver o isoproterenol foi usada uma solução de 1mM
de ácido ascórbico (para evitar a oxidação do isoproterenol) dissolvido em salina,
também previamente misturado em um Eppendorf de 1,5mL, antes de adiciona- lo ao
meio de incubação, seguido de posterior verificação e correção do pH para 7,4.
2.8. Produtos químicos utilizados
E64 (N-(trans-Epoxisuccinil)-L- leucina-4-guanitidinobutilamida), leupeptina
hemisulfato, MG 132 (carbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-L- leucinal), albumina de soro
bovino (fração V, essencialmente livre de AGL), 3- isobutyl-1-methylxanthine (IBMX),
isoproterenol (ISO) usadas nos experimentos foram adquiridas de Sigma Chemical, St
Louis, MO. Outras substâncias como íons e outros reagentes que também foram usados
foram adquiridos da Sigma, Merk, Amersham e Lilly Co.
Material e métodos
28
2.9. Outras análises químicas
Glicemia, lactato e AGL plasmáticos foram determinados seguindo os métodos
descritos por BERGNEYER et al. (1974); CLARK et al. (1984) e DOLE et al. (1960),
respectivamente. Glicogênio e lipídios totais foram determinados segundo método
descrito por CARROL et al. (1956) e por método gravimétrico, respectivamente. Para
quantificação do glicogênio foram usados 500 mg de tecido hepático e muscular e para
a quantificação de lipídios totais foi usado 1g de tecido hepático e muscular.
2.10. Análise estatística
Para comparar os músculos contralaterais submandibulares do mesmo peixe foi
usado o teste-t pareado de Student e para comparar os diferentes grupos de peixes foi
usado o teste-t de Student não pareado.
Os resultados de lipólise foram analisados pela análise de variância (ANOVA)
usando P<0,05 como critério de significância sendo que os resultados foram
apresentados como média ± erro padrão da média.
Os experimentos foram repetidos por mais de duas vezes em diferentes épocas
do ano, não tendo sido observada nenhuma alteração nos resultados entre os diferentes
períodos do ano.
Resultados
29
3. Resultados
Jejum
3.1. Efeito dos diferentes períodos de jejum no peso corporal e dos tecidos e
metabólitos plasmáticos
3.1.1.Peso Corporal
O peso inicial (PI) dos peixes no dia da coleta no tanque-rede, peso final (PF)
dos peixes no dia do experimento e a diferença de peso estão apresentados na tabela 1 e
figura 5. Foi observado que os animais alimentados não apresentaram perda de peso
durante o período de adaptação e condução dos experimentos. Já os animais jejuados
perderam peso, sendo que os valores mais altos foram observados nos períodos mais
prolongados de jejum (90, 150 e 200 dias).
3.1.2 Peso dos tecidos
Os resultados referentes aos parâmetros corporais e seus respectivos índices das
tilápias vermelhas alimentadas e em diversos períodos de jejum estão ilustrados nas
figuras 6, 7 e 8 e nas tabelas 2, 3, 4 e 5.
Os valores de peso corporal, comprimento padrão e fator de condição dos peixes
alimentados e em diferentes períodos de jejum (apresentados na tabela 2 e figura 6),
mostram um aparente aumento do peso e do comprimento padrão dos peixes conforme
aumenta o período de jejum, mas o fator de condição diminui significativamente a partir
de 30 dias de jejum e continua caindo até 200 dias sem alimentação.
Os valores de peso do fígado, dos testículos e do estômago e intestino e seus
índices somáticos apresentados nas tabelas 3 e 4 e figura 7 mostram que o jejum induziu
significante diminuição do peso do fígado e conseqüentemente no índice
hepatossomático. O peso do fígado somente teve uma diminuição significativa a partir
Resultados
30
de 15 dias de jejum (4,6g vs. 8,9g no alimentado) e se manteve constante até 200 dias
sem alimento. Já o índice hepatossomático diminuiu significativamente a partir de 7
dias de jejum (1,55 vs. 2,27 no alimentado) sendo que seus valores continuaram a cair
até os 30 dias de jejum (1,08) e permaneceram constantes até o final do período
experimental (7 meses).
O peso dos testículos e o índice gonadossomático não são significativamente
diferentes apesar de ser observada uma aparente diminuição no peso deles em períodos
mais prolongados de jejum.
Tabela: 1: Peso inicial dos peixes no dia da coleta no tanque-rede (PI), peso final dos peixes no dia do experimento (PF) e diferença de peso.
Peso inicial (g)
Peso final (g)
Perda de peso (g)
Alimentadas 441 ± 27
(8) 443 ± 10
(8) -2 ± 10
(8)
7 582 ± 27
(3) 469 ± 47
(3) 113 ± 27
(3)
15 537 ± 27 (2) 387 ± 22
(2) 150 ± 27 (2)
30 556 ± 1 (2)
425 ± 42 (2)
131 ± 1 (2)
60 602 ± 1 (3)
451 ± 45 (3)
151 ± 1 (3)
90 703 ± 51 (3) 509 ± 51
(3) 194 ± 51 (3)
150 642 ± 16 (2) 456 ± 24
(2) 186 ± 12 (2)
Jejum (dias)
200 691 ± 1 (2)
478 ± 33 (2)
213 ± 33 (2)
Os valores representam médias ± erro padrão. Valores entre parênteses representam lotes com média de 5 animais em cada um.
Resultados
31
Figura 5: Perda de peso corporal das tilápias alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. Tabela 2: Peso corporal, comprimento padrão e fator de condição (PC/CP3.100) de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum.
Peso Corporal
Comprimento Padrão
Fator de Condição
Alimentadas 443 ± 10
(79)
24 ± 0,2 (79)
3,22 ± 0,05 (79)
Jejum (dias)
7 469 ± 22
(19) 24 ± 0,4
(19) 3,42 ± 0,14
(19)
15 387 ± 22
(18) 23 ± 0,4
(18) 3,11 ± 0,12
(18)
30 425 ± 14
(40) 24 ± 0,2*
(40) 3,01 ± 0,06*
(40)
60 451 ± 21
(21) 25 ± 0,3*
(21) 2,9 ± 0,10*
(21)
90 509 ± 21*
(28) 26 ± 0,4*
(28) 2,96 ± 0,07*
(28)
150 456 ± 24
(13) 26 ± 0,6*
(13) 2,74 ± 0,11*
(13)
200 478 ± 33
(10) 26 ± 0,7*
(10) 2,79 ± 0,08*
(10)
Os valores representam médias ± erro padrão. Valores entre parênteses representam o número de animais utilizados. * (P<0,05) vs alimentada.
-20
0204060
80100120140160180
200220240
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Per
da p
eso
(g)
Jejum (dias)
Resultados
32
Figura 6: A) peso corporal final; B) comprimento padrão; C) fator de condição ((PC/CP3).100) de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. (As linhas transversais indicam a média de cada grupo).
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800 A
Pes
o co
rpor
al (g
)
Jejum (dias)
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
0,0
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Jejum (dias)
Fat
or d
e C
ondi
ção
C
0
18
20
22
24
26
28
30
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Com
prim
ento
pad
rão
(cm
)
Jejum (dias)
B
Resultados
33
Tabela 3: Peso do fígado, dos testículos e do estômago e intestino de tilápia (Oreochromis sp) alimentada e nos diferentes períodos de jejum.
Peso do Fígado (g)
Peso dos Testículos
(g)
Peso do Estômago e Intestino
(g)
Alimentada
8,9 ± 0,3 (136) 2,22 ± 0,19
(54) 13,6 ± 1,7 (18)
7
7,1 ± 0,5 (19)
1,65 ± 0,26 (19)
8,16 ± 0,42* (10)
15
4,6 ± 0,4* (18)
1,98 ± 0,24 (18)
7,65 ± 0,37* (13)
30
4,6 ± 0,3* (40)
2,16 ± 0,24 (40)
7,39 ± 0,47* (16)
60
4,56 ± 0,46* (21)
1,85 ± 0,28 (21)
7,07 ± 0,44* (19)
90
5,36 ± 0,29* (28)
1,46 ± 0,20 (28)
7,32 ± 0,45* (28)
150
4,49 ± 0,49* (13)
1,83 ± 0,45 (13)
6,86 ± 0,77* (12)
Jejum (dias)
200
5,12 ± 0,63* (10)
1,36 ± 0,33 (10)
7,37 ± 0,79* (6)
Os valores representam médias ± erro padrão.Valores entre parênteses representam o número de animais utilizados. * (P<0,05) vs alimentada.
Resultados
34
O peso do estômago e intestino e seu índice somático (Tabela 3 e 4 e Figura 7E e
F) mostraram uma significativa diminuição a partir do início do jejum mantendo valores
estáveis em todos os diferentes períodos em que os animais ficaram sem alimento.
Os valores do peso do tecido adiposo mesentérico (MAT) e do tecido adiposo da
bexiga natatória estão apresentados na tabela 5 e ilustrados na figura 8. O peso do tecido
adiposo mesentérico e o índice somático apresentam uma queda significativa a partir de
60 dias jejum, diminuindo ainda mais conforme aumenta o período de jejum. Já em
outro tipo de tecido adiposo, o tecido adiposo da bexiga natatória, não foi observada
diferença significativa do seu peso ao longo de todo o período de jejum. Seu índice
somático apresentou uma diminuição significativa somente a partir de 90 dias de jejum.
Resultados
35
Tabela 4: Índice hepatossomático, índice gonadossomático e índice somático do estômago e intestino de tilápia vermelha (Oreochromis sp) alimentada e nos diferentes períodos de jejum. Peso do tecido/100g Peso Corporal
(Índice Somático)
Fígado (HSI)
Gônada (GSI)
Estomago Intestino
Alimentada
2,27 ± 0,07
(136) 0,50 ± 0,04 (54) 2,90 ± 0,39
(18)
7
1,55 ± 0,11* (19)
0,35 ± 0,05 (19)
1,78 ± 0,12* (10)
15
1,22 ± 0,09* (18)
0,53 ± 0,07 (18)
1,79 ± 0,06* (13)
30
1,08 ± 0,05* (40)
0,52 ± 0,06 (40)
1,62 ± 0,10* (16)
60
1,04 ± 0,12* (21)
0,41 ± 0,06 (21)
1,54 ± 0,08* (19)
90
1,05 ± 0,04* (28)
0,29 ± 0,03 (28)
1,46 ± 0,08* (28)
150
1,06 ± 0,07* (13)
0,27 ± 0,05 (11)
1,56 ± 0,17* (12)
Jejum (dias)
200
1,05 ± 0,08* (10)
0,27 ± 0,06 (10)
1,53 ± 0,15* (6)
Os valores representam médias ± erro padrão. Valores entre parênteses representam o número de animais utilizados. * (P<0,05) vs alimentada.
Resultados
36
Figura 7: A) peso do tecido hepático; B) índice hepatossomático; C) peso das gônadas; D) índice gonadossomático; E) peso do estômago e intestino; F) índice somático do estômago e intestino de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. (As linhas transversais indicam a média de cada grupo).
0
1
2
3
4
5
6
7
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Jejum (dias)
Índi
ce s
omát
ico
do e
stôm
ago
e do
inte
stin
o (g
/100
g P
C)
F
0
5
10
15
20
25
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Jejum (dias)
Pes
o do
fíga
do (g
)
A
1
2
3
4
5
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Jejum (dias)
Índi
ce h
epat
osso
mát
ico
(%)
B
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Jejum (dias)
Índi
ce g
onad
osso
mát
ico
(%)
D
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Jejum (dias)
Pes
o da
s gô
nada
s (g
)
C
0
5
10
15
20
25
30
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Jejum (dias)
Pes
o do
est
ômag
o e
do in
test
ino
(g)
E
Resultados
37
Tabela 5: Peso do tecido adiposo mesentérico e da bexiga natatória e seus índices somáticos de tilápia (Oreochromis sp) alimentada e nos diferentes períodos de jejum.
Peso do tecido/100g Peso Corporal
(Índices Corporais)
Peso do Tecido
Adiposo Mesentérico
(MAT) (g)
Peso do Tecido Adiposo da
Bexiga Natatória
(g)
TA Mesentérico
(g)
TA Bexiga
Natatória (g)
Alimentada
15,1± 1,1
(53)
4,09 ± 0,53 (12)
3,26 ± 0,19 (53)
0,83 ± 0,07 (12)
7
15,5 ± 2,1 (19)
5,13 ± 0,41 (10)
3,19 ± 0,30 (19)
1,10 ± 0,08 (10)
15
11,4 ± 1,7 (18)
4,15 ± 0,54 (13)
2,80 ± 0,29 (18)
0,94 ± 0,09 (13)
30
13,3 ± 1,0 (39)
4,91 ± 0,063 (16)
3,11 ± 0,21 (39)
1,02 ± 0,10 (16)
60
9,0 ± 0,7* (21)
-
2,07 ± 0,16*
(21) -
90
9,15 ± 0,9* (23)
3,91 ± 0,26 (28)
1,95 ± 0,18* (23)
0,76 ± 0,04* (28)
150
6,93 ± 1,63* (11)
3,40 ± 0,42 (13)
1,45 ± 0,29* (11)
0,72 ± 0,06* (13)
Jejum (dias)
200
5,92 ± 1,08* (10)
3,21 ± 0,38 (10)
1,25 ± 0,23* (10)
0,66 ± 0,05* (10)
Os valores representam médias ± erro padrão.Valores entre parênteses representam o número de animais utilizados. * (P<0,05) vs alimentada.
Resultados
38
Figura 8: A) peso do tecido adiposo mesentérico; B) índice somático do tecido adiposo mesentérico; C) peso do tecido adiposo da bexiga natatória; D) índ ice somático do tecido adiposo da bexiga natatória de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. (As linhas transversais indicam a média de cada grupo).
0
10
20
30
40
50
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200 Jejum (dias)
TA
mes
enté
rico
(g)
A
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Jejum (dias)
Índi
ce s
omát
ico
do te
cido
adi
poso
da
bexi
ga n
atat
ória
(g/
100g
PC
)
D
0
2
4
6
8
10
12
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Jejum (dias)
TA
bex
iga
nata
tóri
a (g
)
C
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Índi
ce s
omát
ico
teci
do a
dipo
so m
esen
téric
o(g
/100
g P
C)
Jejum (dias)
B
Resultados
39
3.1.3. Metabólitos plasmáticos
Na tabela 6 e figura 9 estão apresentados os valores de glicemia, ácidos graxos
livres (AGL) e lactato plasmáticos de tilápias vermelhas alimentadas e nos diferentes
períodos de jejum.
Os níveis de glicose plasmática dos peixes alimentados ficaram estáveis até 60
dias de jejum, somente a partir de um jejum mais prolongado de 90 dias é que se
observa uma diminuição significativa (aproximadamente 25%) nos valores da glicemia,
os quais se mantiveram baixos e constantes até 200 dias sem alimento (50 ± 5
mg/100mL) (Figura 9A).
Na figura 9B pode-se observar que o jejum de 60, 90 e 150 dias, proporcionou
um aumento de 49, 64 e 90% nos níveis de AGL plasmático, respectivamente. Os
níveis de lactato plasmático dos peixes em jejum não foram diferentes dos níveis dos
peixes alimentados e se mantiveram constantes durante os diferentes períodos sem
alimento.
3.2. Efeito do jejum na concentração de glicogênio e lipídios totais no fígado e no
músculo das tilápias vermelhas
A tabela 7 e as figuras 10 e 11 apresentam os valores do conteúdo de glicogênio
e lipídios totais hepático e muscular das tilápias alimentadas e nos diferentes períodos
de jejum.
Resultados
40
Tabela 6: Parâmetros metabólicos plasmáticos (glicemia, ácidos graxos livres e lactato) de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum.
Glicemia
(mg/100mL)
AGL (µmol/mL)
Lactato (µmol/mL)
Alimentada
74 ± 1 (131)
0,369 ± 0,011 (141)
0,530 ± 0,036 (119)
7
65 ± 5 (15)
0,410 ± 0,025 (15)
0,561 ± 0,056 (10)
15
69 ± 4 (12)
0,404 ± 0,028 (17)
0,464 ± 0,047 (13)
30
69 ± 5 (37)
0,399 ± 0,021 (41)
0,552 ± 0,049 (34)
60
63 ± 3 (14)
0,551 ± 0,046* (21)
0,689 ± 0,188 (5)
90
59 ± 5* (20)
0,606 ± 0,058* (28)
0,676 ± 0,064 (13)
150
56 ± 8* (11)
0,703 ± 0,056* (13)
0,446 ± 0,065 (13)
Jejum (dias)
200
50 ± 5* (9)
0,422 ± 0,022 (10)
0,716 ± 0,059 (10)
Os valores representam médias ± erro padrão.Valores entre parênteses representam o número de animais utilizados. * (P<0,05) vs alimentado.
Resultados
41
Figura 9: Parâmetros metabólicos plasmáticos de tilápia (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. A) glicemia; B) ácidos graxos livres. * (P<0,05) vs alimentado
0
40
45
50
55
60
65
70
75
80
**
A
*
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Glic
emia
(m
g/10
0mL)
Jejum (dias)
0,00
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80B
*
*
*
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Áci
dos
Gra
xos
Livr
es (µ
mol
/mL)
Jejum (dias)
Resultados
42
Nas tilápias alimentadas foi observado um alto conteúdo de glicogênio hepático
(15,0 ± 0,4%). Após 7 dias de jejum houve uma queda de aproximadamente 40% e se
manteve constante até 30 dias sem alimento. Já no jejum mais prolongado (60 a 200
dias) o conteúdo de glicogênio hepático diminuiu ainda mais, atingindo valores médios
55% menores que os peixes alimentados (Tabela 7 e Figura 10A). É interessante notar
que durante o jejum prolongado (60 a 200 dias) o valor médio de glicogênio hepático
(6,5 %) é relativamente alto quando comparado com o encontrado em mamíferos.
Normalmente os mamíferos alimentados apresentam um conteúdo de glicogênio
hepático por volta de 5%, que diminuem quase 95% depois de 24 horas de jejum. O
conteúdo de glicogênio muscular da tilápia alimentada (aproximadamente 0,5%) é baixo
quando comparado com mamíferos e apresentaram os menores valores
(aproximadamente 0,3%) somente após 60 e 90 dias sem alimento (Tabela 7 e Figura
10B).
O conteúdo de lipídios totais no fígado da tilápia também é alto e o jejum
proporciona um aumento ainda maior na quantidade de gordura hepática desses peixes
(Tabela 7). Esse aumento atingiu valores duas vezes maiores que os alimentados quando
os peixes foram submetidos a um jejum de 3 meses e mantiveram-se significativamente
altos até 200 dias de jejum (Tabela 7 e Figura 11A). Nos músculos brancos das tilápias
foi observada uma diminuição no conteúdo de lipídios totais, sendo que uma queda
significativa somente ocorreu a partir de 90 dias de jejum e continuou a cair até os 200
dias sem alimento (Tabela 7 e Figura 11B).
Resultados
43
Tabela 7: Conteúdo de glicogênio e lipídios totais hepático e muscular de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum.
Os valores representam médias ± erro padrão. Valores entre parênteses representam o número de animais utilizados. * (P<0,05) vs. alimentado.
Glicogênio (%) Lipídios Totais (%)
Hepático Muscular Hepático Muscular
Alimentada
15,0 ± 0,4 (127)
0,52 ± 0,03 (131)
10,5 ± 0,4 (143)
4,1 ± 0,3 (36)
7
9,1 ± 1,0* (12)
0,51 ± 0,06 (10)
12,3 ± 0,98 (18)
3,8 ± 0,3 (17)
15
8,3 ± 0,9* (17)
0,48 ± 0,05 (16)
14,6 ± 1,7* (16)
3,3 ± 0,4 (15)
30
7,8 ± 0,5* (39)
0,49 ± 0,03 (37)
16,1 ± 0,6* (27)
3,5 ± 0,2 (29)
60
7,4 ± 0,8* (15)
0,30 ± 0,03* (20)
14,1 ± 1,0* (20)
3,1 ± 0,3 (21)
90
5,9 ± 0,4* (25)
0,31 ± 0,03* (20)
21,3 ± 1,0* (23)
2,7 ± 0,2* (23)
150
6,7 ± 0,6* (12)
0,40 ± 0,04 (13)
22,1 ± 3,3* (13)
2,2 ± 0,3* (13)
Jejum (dias)
200
6,8 ± 0,5* (10)
0,40 ± 0,05 (8)
21,0 ± 2,0* (9)
1,5 ± 0,1* (9)
Resultados
44
Figura 10: Conteúdo de glicogênio hepático e muscular de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. A) glicogênio hepático; B) glicogênio muscular. * (P<0,05) vs alimentado.
0
56
789
10
1112131415
1617
A
** *
** *
*
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Glic
ogên
io H
epát
ico
(%)
Jejum (dias)
0,0
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60 B
**
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Glic
ogên
io M
uscu
lar
(%)
Jejum (dias)
Resultados
45
Figura 11: Conteúdo de lipídios totais hepático (A) e muscular (B) de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. * (P<0,05) vs alimentado.
0
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
*
*
*
***
A
Lipí
dios
Tot
ais
Hep
átic
o (%
)
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Jejum (dias)
0,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5B
*
*
*
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Lipí
dios
Tot
ais
Mus
cula
r (%
)
Jejum (dias)
Resultados
46
3.3. Efeito do jejum na lipólise in vitro do tecido adiposo mesentérico de tilápias
Os valores de ácidos graxos livres liberados pelos fragmentos de tecido adiposo
mesentérico (MAT) de tilápias incubados in vitro em condições basais e na presença de
isobutilmetilxantina (IBMX) e isoproterenol (ISO) estão apresentados na tabela 8 e
ilustrados nas figuras 12A e B.
A liberação de ácidos graxos livres dos fragmentos do MAT de tilápia em jejum
de 60, 90, 150 e 200 dias foi maior que a taxa de liberação de ácidos graxos livres para
os peixes alimentados nas três situações de incubação em que o tecido foi submetido
(basal, basal + IBMX e basal + ISO) (Tabela 8 e Figura 12). Comportamento
semelhante pôde ser observado nos níveis de ácidos graxos livres plasmáticos, com
exceção de 200 dias de jejum, que apresentou valores semelhantes aos animais controle
(Tabela 6 e Figura 9B).
A inibição da lipólise dos fragmentos de MAT de tilápias incubados com os dois
agentes (IBMX e ISO) foi observada somente nos peixes mantidos em períodos de
jejum acima de 30 dias (Tabela 8 e Figuras 12A e B). Quando se compara a liberação de
ácidos graxos livres dos fragmentos de MAT incubados em meio basal com os
fragmentos incubados na presença do inibidor da fosfodiesterase do AMPc (IBMX) ou
na presença de um agonista beta-adrenérgico não seletivo (ISO) verifica-se a ação das
drogas na diminuição significativa da lipólise somente a partir de 30 dias de jejum
(Tabela 8).
Apesar do efeito inibitório induzido pelas drogas, nem a presença do IBMX e
nem a do ISO impediram o aumento da lipólise dos fragmentos do MAT induzida pelo
jejum de 60, 90, 150 e 200 dias (Tabela 8 e Figura 12A e B). Somente após o
aparecimento do efeito lipolítico induzidos por longos períodos de jejum (60 a 200 dias)
é que se observou um efeito anti- lipolítico mais eficaz das drogas adicionadas ao meio
Resultados
47
de incubação. O aumento da lipólise induzida pelo jejum foi amenizado na presença do
IBMX (isobutilmetilxantina) e do ISO (isoproterenol) (Tabela 8 e Figura 12A e B). A
liberação de AGL pelos fragmentos de MAT incubados na presença de IBMX de
animais em jejum de 200 dias não foi significativamente diferente dos alimentados
devido ao pequeno número de animais com quantidade de MAT suficiente para realizar
a incubação.
Em nosso laboratório, recentes estudos de incubação do tecido adiposo
mesentérico de tilápia vermelha (Oreochromis sp) com agonista e antagonista dos
receptores adrenérgicos alfa1 e alfa2 não mostraram nenhum efeito na lipólise.
Experimentos de incubação do MAT de tilápias jejuadas na presença de dibutiril-cAMP
mostraram ocorrer surpreendentemente uma queda da lipólise (2,280 ± 0,129 sem
cAMP versus 1,087 ± 0,107 µmol AGL/g MAT.2h com cAMP). cAMP adicionado ao
meio de incubação com fragmentos de MAT de peixes alimentados não provocou
nenhuma alteração da atividade lipolítica.
3.4. Efeito do jejum na degradação da proteína muscular
Os resultados apresentados na tabela 9 e ilustrados na figura 13 mostram a
proteólise total em músculo protractor hyoidei de tilápias vermelhas alimentadas e em
diferentes períodos de jejum.
Pode-se observar que a proteólise total no músculo dos animais alimentados foi
de 0,193 ± 0,004 nmol de tirosina/mg.2h. Somente após 60 dias sem alimento foi
observada uma queda de 21% na proteólise total, atingindo um valor médio de 0,153 ±
0,009 nmol tyr/mg.2h. Nos outros períodos de jejum os valores se mantiveram altos e
iguais aos animais alimentados.
Resultados
48
Tabela 8: Mobilização de ácidos graxos livres (µmol AGL/g MAT.2h) do tecido adiposo mesentérico de tilápia (Oreochromis sp) para o meio de incubação em condições basais e na presença de isobutilmetilxantina e isoproterenol, de animais alimentados e nos diferentes períodos de jejum.
BASAL
IBMX (10-3M)
ISO (10-5M)
Alimentada
1,314 ± 0,094 (58)
0,983 ± 0,138 (20)
1,081 ± 0,123 (29)
Jejum (dias)
7
1,369 ± 0,154 (20)
0,923 ± 0,157 (10)
0,993 ± 0135 (8)
15
1,895 ± 0,206 (13)
1,314 ± 0,123 (10)
1,509 ± 0,128 (8)
30
1,339 ± 0,107 (20)
0,900 ± 0,099 * (17)
0,980 ± 0,09 * (17)
60
2,449 ± 0,157# (37)
1,589 ± 0,165#* (20)
1,856 ± 0,145#* (19)
90
2,280 ± 0,129# (21)
1,529 ± 0,129#* (19)
1,764 ± 0,132#* (18)
150
3,581 ± 0,465# (10)
2,086 ± 0,207#* (8)
2,338 ± 0,338#* (9)
200
3,056 ± 0,341# (6)
1,569 ± 0,159 * (6)
2,083 ± 0,199#* (6)
IBMX: isobutilmetilxantina; ISO: isoproterenol. Os valores representam médias ± erro padrão. Valores entre parênteses representam o número de animais utilizados. * na mesma linha (P<0,05) vs. basal. # na mesma coluna (P<0,05) vs. alimentada.
Resultados
49
Figura 12: Mobilização de AGL (µmol AGL/g MAT.2h) do tecido adiposo mesentérico de tilápia (Oreochromis sp) para o meio de incubação em condições basais (¦ ) e na presença de IBMX (?) e ISO (? ), de animais alimentados e nos diferentes períodos de jejum.*(P<0,05) vs basal; #(P<0,05) vs alimentado.
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5 A
##
#
*
*
*
**
#
#
##
Alimentado 7 15 30 60 90 150 200
Mob
iliza
ção
AG
L(µ
mol
AG
L/g
MA
T.2
h)
Jejum (dias)
BASAL IBMX
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5B
#
##
#
#
***
*
#
#
#
*
Alimentado 7 15 30 60 90 150 200
Mob
iliza
ção
AG
L(µ
mol
AG
L/g
MA
T.2
h)
Jejum (dias)
BASAL ISO
Resultados
50
Na tabela 10 e na figura 14 estão apresentados os valores referentes à
participação da via proteolítica dependente de proteassoma, uma das vias proteolíticas
que participam da degradação total das proteínas musculares. Esses valores mostram
que o proteassoma participa da degradação de proteínas do músculo esquelético de
tilápias. Pode-se verificar que somente a partir de 60 dias sem alimento é que ocorre
significativa diminuição da proteólise dependente do proteassoma, coincidindo com a
queda na proteólise total nesse mesmo período (Figuras 12). Essa baixa atividade do
proteassoma se mantém até os 150 dias de jejum, voltando a atingir os valores iguais
aos alimentados somente aos 7 meses sem alimento (Figura 14). A proteólise não
dependente do proteassoma (Tabela 10 e Figura 15) diminui a partir do início do jejum,
se mantêm constante durante todo o período de jejum, apresentando também seu menor
valor após 60 dias sem alimento, com uma diminuição de 48% em relação aos
alimentados.
A atividade de outros componentes proteolíticos como a dependente de cálcio
não foi investigada de maneira sistemática, com apenas informações preliminares que a
atividade dessa via neste tipo de músculo é muito baixa ou inexistente.
Nenhuma atividade da proteólise lisossomal foi encontrada no músculo das
tilápias alimentadas e nem no jejum. Os valores de tirosina liberados pelos músculos
incubados na presença ou ausência dos inibidores específicos de tiol-proteases foram
iguais na grande maioria dos animais.
51
Tabela 9: Tirosina liberada no meio de incubação (nmol/mg.2h) de músculos protractor hyoidei de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum.
Jejum (dias) Alimentada
7 15 30 60 90 150 200
Proteólise Total
0,193 ± 0,004 (20)
0,194 ± 0,009 (18)
0,206 ± 0,007 (17)
0,191 ± 0,008 (20)
0,153 ± 0,009* (15)
0,171 ± 0,011 (17)
0,189 ± 0,007 (12)
0,205 ± 0,008 (10)
Os valores representam médias ± erro padrão. Valores entre parênteses representam o número de animais utilizados. * (P<0,05) vs alimentado. Tabela 10: Tirosina liberada no meio de incubação (nmol/mg.2h) de músculos protractor hyoidei de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum.
Jejum (dias) MG132
Alimentada
7 15 30 60 90 150 200
Ausência
0,287 ± 0,020
(7)
0,221 ± 0,009
(8)
0,217 ± 0,011
(13)
0,238 ± 0,011
(15)
0,115 ± 0,007
(6)
0,161 ± 0,012
(10)
0,179 ± 0,007
(11)
0,205 ± 0,008
(10)
Presença
0,192 ± 0,021
(7)
0,142 ± 0,007*
(9)
0,125 ± 0,006*
(12)
0,144 ± 0,006*
(13)
0,093 ± 0,005*
(6)
0,132 ± 0,008*
(10)
0,144 ± 0,011*
(8)
0,118 ± 0,007*
(10)
Diferença
0,095 ± 0,014
(7)
0,080 ± 0,009
(8)
0,092 ± 0,009
(13)
0,094 ± 0,015
(13)
0,022 ± 0,003*
(5)
0,029 ± 0,007*
(10)
0,034 ± 0,006*
(8)
0,087 ± 0,008
(10) Os valores representam médias ± erro padrão. Valores entre parênteses representam o número de animais utilizados. * (P<0,05) vs alimentado.
Resultados
Resultados
52
Figura 13: Tirosina liberada no meio de incubação (nmol/mg.2h) de músculos protractor hyoidei de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. *(P<0,05) vs alimentado. Proteólise total Figura 14: Tirosina liberada no meio de incubação (nmol/mg.2h) de músculos protractor hyoidei de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. *(P<0,05) vs alimentado. As barras representam os valores médios da atividade proteolítica dependente do proteassoma.
0,00
0,14
0,15
0,16
0,17
0,18
0,19
0,20
0,21
0,22
0,23PROTEÓLISE TOTAL
*
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Tyr
libe
rada
no
mei
o de
incu
baçã
o(n
mol
/mg.
2h)
Jejum (dias)
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12PROTEÓLISE DEPENDENTE DO PROTEASSOMA
***
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Tyr
libe
rada
no
mei
o de
incu
baçã
o(n
mol
/mg.
2h)
Jejum (dias)
Resultados
53
Figura 15: Tirosina liberada no meio de incubação (nmol/mg.2h) de músculos protractor hyoidei de tilápias (Oreochromis sp) alimentadas e nos diferentes períodos de jejum. *(P<0,05) vs alimentado. As barras representam os valores médios do componente proteolítico resultante da inibição do proteassoma..
0,00
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24PROTEÓLISE NÃO DEPENDENTE DO PROTEASSOMA
*
**
*
*
*
*
Alimentada 7 15 30 60 90 150 200
Tyr
libe
rada
no
mei
o de
incu
baçã
o(n
mol
/mg.
2h)
Jejum (dias)
Resultados
54
Diabetes mellitus
3.5. Padronização do diabetes mellitus experimental
Durante a aplicação de aloxana e coleta de sangue, os peixes permaneceram
acordados, pois em experimentos prévios com o uso de anestésico (solução alcoólica de
benzocaína – 10% adicionada à água, segundo recomendações de MACHADO, 1982),
os peixes ficaram inquietos e se mexeram muito quando retirados da água para o manejo
e injeção, mesmo após ficarem totalmente imóveis na solução de anestésico. Ao
contrário, os peixes acordados e enrolados em um tecido de algodão umedecido,
ficavam completamente imóveis, facilitando muito mais o manejo e a aplicação das
injeções.
A aplicação de 150 mg aloxana/Kg de peso corporal via conus arteriosus não
teve diferença significativa da aplicação via veia caudal na indução do diabetes
experimental, no entanto exige mais manuseio do peixe e com isso proporciona maior
estresse ao animal. Por esta razão foi padronizada a aplicação da aloxana na veia caudal
para obtenção de peixes diabéticos.
Assim sendo, os resultados dos níveis de glicose plasmática após a aplicação de
diferentes doses de aloxana (por injeção na veia caudal) em tilápias vermelhas
acordadas estão apresentados na tabela 11 e ilustrados na figura 16.
Os controles apresentaram valores glicêmicos constantes durante todo o período
de estudo (até 2 semanas após a aplicação da salina), com uma média de 68 mg
glicose/100mL plasma. Os valores de glicemia de todos os animais eram semelhantes
no momento da injeção, tanto para os que receberam salina como para os injetados com
aloxana, apresentando um valor médio de 69 mg glicose/100mL plasma (Figura 16).
Resultados
55
Após a aplicação de aloxana, observou-se um aumento na glicemia de
aproximadamente 3 vezes nas primeiras 24 horas, para todas as doses de aloxana
(Figura 16), mas esses níveis mais altos somente foram mantidos nos animais que
receberam 150 e 200 mg de aloxana/Kg de peso corporal, sendo que, nas 48 horas
seguintes, ainda aumentaram até 5 vezes os valores basais, enquanto para as doses de 50
e 100 mg de aloxana/Kg PC, a glicemia retornou aos valores basais. Somente os peixes
que receberam 150mg/Kg de aloxana sobreviveram com a glicemia alta por um maior
período de tempo (120 horas após aplicação de aloxana) (Tabela 11 e Figura 16).
Baseado nesses resultados, para a indução do diabetes experimental nas tilápias
vermelhas nos experimentos seguintes, foi sempre utilizada uma dose única de 150 mg
aloxana/Kg PC injetada na veia caudal do animal acordado.
Tabela 11: Glicemia (mg/100mL) de tilápias (Oreochromis sp) que receberam aplicação endovenosa de aloxana pela veia caudal para indução de diabetes experimental.
Tempo após aplicação de aloxana (h)
0 24 48 72 96 120 168 (1 sem)
336 (2 sem)
Controle
64 ± 4
(5)
72 ± 8
(5)
69 ± 4
(8)
71 ± 5
(3)
59 ± 4
(2)
53 ± 5
(2)
86 (1)
67 (1)
Aloxana (mg/Kg)
50 71 ± 15 (3)
186 ± 34* (3)
81 ± 13 (3)
90 ± 17 (3)
92 ± 10 (3)
107 ± 12 (3)
103 ± 8 (3)
123 ± 43 (3)
100
63 ± 2
(2)
173 ± 4*
(2)
104 ± 32
(2)
93 ± 17
(2)
90 ± 17
(2)
82 ± 17
(2)
76 (1)
71 (1)
150
64 ± 3 (13)
256 ± 17*
(4)
341 ± 25*
(12)
311 ± 25*
(6)
345 ± 20*
(6)
312 ± 12*
(5)
†
200
85 ± 9
(3)
198 ± 51*
(3)
359 ± 16*
(2)
296* (1)
†
Os valores representam médias ± erro padrão. Valores entre parênteses representam o número de peixes utilizados. * (P<0,05) vs controle; o símbolo (†) indica a morte dos animais.
Resultados
56
Figura 16: Glicemia (mg/100mL) de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de aloxana pela veia caudal para indução de diabetes experimental.
3.6. Perfil glicêmico e dos ácidos graxos livres plasmáticos de tilápias vermelhas
injetadas com aloxana.
3.6.1. Glicemia
Os valores de glicemia dos peixes que receberam injeção endovenosa na veia
caudal de 150 mg de aloxana/Kg de peso corporal e dos peixes controles, que receberam
injeção de salina pela mesma via, estão apresentados na tabela 12 e ilustrados na figura
17.
Os resultados mostram que a glicemia dos animais injetados com aloxana
aumentou quase 4 vezes nas primeiras 24 horas após a aplicação e 5,5 vezes 48 horas
após a aplicação, permanecendo alta até 120h, com valores médios de 330 ± 10
mg/100mL. Já nos peixes controles, os níveis de glicose plasmática foram os mesmos
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 24 48 72 96 120 168 336
Glic
emia
(m
g/10
0mL)
Tempo após aplicação de aloxana (h)
Controle 50mg/Kg 100mg/Kg 150mg/Kg 200mg/Kg
Resultados
57
desde o momento da aplicação da salina (tempo zero) até 120 horas após, permanecendo
com valores médios de 66 ± 1 mg/100mL de plasma. (Tabela 12 e Figura 17).
Tabela 12: Perfil glicêmico de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos).
Tempo após aplicação de aloxana (h) 0 24 48 72 96 120
Controle
64 ± 3 (12)
69 ± 5 (10)
65 ± 4 (15)
66 ± 4 (10)
63 ± 5
(9)
67 ± 9
(9)
Diabéticas
60 ± 2 (27)
229 ± 13*
(14)
330 ± 13*
(26)
330 ± 12*
(20)
326 ± 11*
(20)
330 ± 10*
(16)
Os valores representam médias ± erro padrão. Número entre parêntese representa a quantidade de peixes utilizados. * (P<0,05) vs controle. Figura 17: Glicemia (mg/100mL) de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de aloxana pela veia caudal para indução de diabetes experimental. * (P<0,05) vs controle.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
****
*
0 24 48 72 96 120
Glic
emia
(m
g/10
0mL)
Tempo após aplicação de aloxana (h)
Controle 150 mg/Kg
Resultados
58
3.6.2. Níveis plasmáticos de ácidos graxos livres
O perfil de ácidos graxos livres plasmáticos de tilápias com diabetes
experimental está apresentado na tabela 13 e ilustrado na figura 18. Os resultados
mostram que os níveis de ácidos graxos livres plasmáticos dos animais controle foram
os mesmos desde o momento da aplicação da salina (tempo zero) até 120 horas após,
permanecendo com valores médios de 0,410 ± 0,009 µmol de AGL/mL de plasma
(Tabela 13). Também não se observou diferença significativa nos níveis de AGL
plasmáticos até 72 horas após a injeção de aloxana.
Os níveis plasmáticos de ácidos graxos livres nos animais diabéticos somente
tiveram um aumento significativo 96 e 120 horas após a aplicação da aloxana (Tabela
13 e Figura 18).
Tabela 13: Ácidos graxos livres plasmático (µmol/mL) após aplicação endovenosa de 150mg/Kg de aloxana e seus controles. Tempo após aplicação
da aloxana (h)
Controle
Diabéticas
0
0,410 ± 0,025 (18)
0,445 ± 0,026 (26)
24
0,409 ± 0,046 (10)
0,381 ± 0,032 (18)
48
0,441 ± 0,029 (15)
0,383 ± 0,017 (25)
72
0,400 ± 0,026 (11)
0,421 ± 0,028 (22)
96
0,375 ± 0,030 (10)
0,563 ± 0,045* (19)
120
0,424 ± 0,030 (8)
0,675 ± 0,077* (16)
Os valores representam médias ± erro padrão. Número entre parênteses representa a quantidade de peixes utilizados. * (P<0,05) vs. Controle.
Resultados
59
Figura 18: Ácidos graxos livres plasmático (µmol/mL) após aplicação endovenosa de 150mg/Kg de aloxana e seus controles. * (P<0,05) vs controle.
3.7. Efeito do diabetes mellitus no peso dos tecidos e metabólitos plasmáticos
Os valores de peso corporal, comprimento padrão e fator de condição dos peixes
diabéticos e seus controles estão apresentados na tabela 14. Não foi observada diferença
significativa entre os peixes diabéticos e seus controles. Outros parâmetros corporais,
como peso do fígado, peso do tecido adiposo mesentérico (MAT), dos testículos, do
peso do tecido adiposo da bexiga natatória e peso do estômago e intestino e seus índices
somáticos estão apresentados na tabela 15. O índice gonadossomático dos animais
diabéticos apresentou uma diminuição de 45% e o índice somático do estômago e
intestino uma diminuição de 27% em relação aos controles.
Os níveis plasmáticos de glicose, ácidos graxos livres e lactato após 5 dias da
administração da aloxana estão apresentados na tabela 16. Observa-se que no diabetes
experimental houve um aumento significativo dos níveis desses metabólitos
plasmáticos. A glicemia aumentou 5,5 vezes em relação ao controle, (330 ± 10
mg/100mL vs 64 ± 3mg/100mL), enquanto os níveis de ácidos graxos livres tiveram um
0,00
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8*
*
0 24 48 72 96 120
µmol
AG
L/m
L pl
asm
a
Tempo após aplicação de aloxana (h)
Controle Diabéticos
Resultados
60
aumento de aproximadamente 1,5 vezes e o lactato um aumento de 2 vezes em relação
ao controle (Tabela 16).
Tabela 14: Parâmetros corporais de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos).
Controle Diabéticas (120h)
Peso Corporal (g)
523 ± 43 (10)
483 ± 19 (17)
Comprimento Padrão (cm)
26 ± 1 (10)
25 ± 0,3 (19)
FC (PC/CP)
3,31 ± 0,06 (10)
3,27 ± 0,08 (19)
Os valores representam médias ± erro padrão. Valores entre parênteses representam o número de peixes utilizados. Tabela 15: Parâmetros corporais e seus índices somáticos de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos).
Índice Somático (g/100gPC)
Controle
(g)
Diabéticas (120h)
(g) Controle
Diabético (120h)
Fígado
6,12 ± 0,7
(10)
6,92 ± 0,38
(19)
1,21 ± 0,06
(10)
1,38 ± 0,07
(19)
MAT
13,32 ± 3,32
(10)
14,7 ± 1,7
(19)
3,22 ± 0,75
(10)
2,85 ± 0,27
(19)
Gônada
2,18 ± 0,55
(10) 1,18 ± 0,2
(19)
0,42 ± 0,10
(10)
0,23 ± 0,04*
(19)
Tecido Adiposo da Bexiga Natatória
5,00 ± 0,51
(7)
5,35 ± 0,77
(7)
0,91 ± 0,01
(7)
1,0 ± 0,09
(7)
Estômago/Intestino
8,35 ± 0,05
(7)
6,86 ± 0,93
(7)
1,76 ± 0,10
(7)
1,3 ± 0,13*
(7)
MAT: tecido adiposo mesentérico; BN: bexiga natatória. Os valores representam médias ± erro padrão. Valores entre parênteses representam o número de peixes utilizados. * (P<0,05) vs. controle.
Resultados
61
Tabela 16: Glicemia, ácidos graxos livres e lactato plasmático de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos) 5 dias antes.
Glicemia (mg/100mL)
AGL (µmolAGL/mL)
Lactato (µmol/mL)
Controle
64 ± 3 (12)
0,424 ± 0,030 (8)
0,586± 0,085 (10)
Diabética
330 ± 10* (16)
0,675 ± 0,077* (16)
1,061 ± 0,107* (16)
Os valores representam médias ± erro padrão. Valores entre parênteses representam o número de peixes utilizados. *(P<0,05) vs. controle.
3.8. Concentração de glicogênio e lipídios totais no fígado e no músculo das tilápias
vermelhas com diabetes mellitus
A tabela 17 mostra os valores do conteúdo de glicogênio e lipídios totais
hepático e muscular das tilápias vermelhas. O diabetes experimental de 120 horas
provocou uma queda de 63% no conteúdo de glicogênio hepático quando comparado
com o controle (jejum de 7 dias). Apesar disso o conteúdo de glicogênio hepático no
diabético (3%) ainda permaneceu alto se comparado com valores de mamíferos, que
quando alimentados apresentam valores em torno de 5% e após jejum de 24 horas esses
valores caem para menos de 0,5%.
Curiosamente, o conteúdo de glicogênio muscular, lipídio total hepático e
muscular não foram alterados pelo diabetes experimental mantendo valores muito
próximos do controle (Tabela 17).
Resultados
62
Tabela 17: Conteúdo de glicogênio e lipídios totais no fígado e músculo de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos) 5 dias antes.
Glicogênio (%) Lipídios Totais (%)
Hepático Muscular Hepático Muscular
Controle
8,04 ± 0,89
(12)
0,51 ± 0,17
(10)
13,2 ± 1,3
(19)
3,3 ± 0,2
(17)
Diabética
3,00 ± 0,50*
(15)
0,44 ± 0,05
(17)
12,7 ± 0,9
(17)
4,5 ± 0,4
(19)
Os valores representam médias ± erro padrão. Valores entre parênteses representam o número de peixes utilizados.*(p<0,05) vs controle.
3.9. Efeito do diabetes mellitus na lipólise in vitro do tecido adiposo mesentérico (MAT)
de tilápias vermelhas
Os valores referentes à mobilização de ácidos graxos livres (µmol AGL/g
MAT.2h) dos fragmentos do tecido adiposo mesentérico de tilápia controle e com
diabetes experimental para o meio de incubação estão apresentados na tabela 18 e
ilustrados na figura 19.
O diabetes experimental estimula a lipólise no tecido adiposo mesentérico
(MAT) de tilápias, tanto na condição basal como na presença de um inibidor da
fosfodiesterase do AMPc (isobutilmetilxantina - IBMX) ou de um agonista beta-
adrenérgico não seletivo (isoproterenol - ISO) . Na condição basal a liberação de ácidos
graxos livres dos fragmentos de MAT de tilápias com 5 dias de diabetes para o meio de
incubação (2,216 ± 0,140 µmol AGL/g MAT.2h) foi 84% maior que o controle (1,203 ±
0,162 µmol AGL/g MAT.2h). Já na presença de IBMX ou de ISO a lipólise do MAT
dos animais diabéticos foi, respectivamente, 2,6 e 2,9 vezes maio r que os controles. Nos
Resultados
63
fragmentos incubados na presença IBMX ou na presença de ISO a liberação de ácidos
graxos livres para o meio de incubação dos animais com diabetes experimental (1,999 ±
0,254 e 2,111 ± 0,182 µmol AGL/g MAT.2h, respectivamente) foi semelhante ao
valores basais.
A lipólise nos fragmentos de tecido adiposo dos animais controles incubados na
presença de IBMX (0,756 ± 0,148 µmol AGL/g MAT.2h) e ISO (0,728 ± 0,143 µmol
AGL/g MAT.2h) sofreu uma inibição de aproximadamente 46%, quando comparados
com os valores basais (1,369 ± 0,154 µmol AGL/g MAT.2h) (Tabela 18 e Figura 20).
Tabela 18: Mobilização de AGL (µmol AGL/g MAT.2h) do tecido adiposo mesentérico de tilápias (Oreochromis sp), 5 dias depois que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticas), para o meio de incubação em condições basais e na presença de IBMX e ISO.
Controle Diabéticas
BASAL
1,203 ± 0,162
(15)
2,216 ± 0,140#
(20)
IBMX
(10-3M)
0,756 ± 0,148*
(13)
1,999 ± 0,254#
(8)
ISO
(10-5M)
0,728 ± 0,143*
(12)
2,111 ± 0,182#
(14)
IBMX: isobutilmetilxantina; ISO: isoproterenol. Os valores representam médias ± erro padrão. Valores entre parênteses representam o número de animais utilizados. * na mesma coluna (P<0,05) vs basal; # na mesma linha (P<0,05) vs. controle.
Resultados
64
Figura 19: Mobilização de AGL (µmol AGL/g MAT.2h) do tecido adiposo de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos), para o meio de incubação em condições basais e na presença de IBMS e ISO. * (P<0,05) vs. Basal controle; # (P<0,05) vs. controle.
3.10. Efeito do diabetes mellitus na degradação da proteína muscular
Os valores de tirosina liberada no meio de incubação de músculos protractor
hyoidei de tilápias vermelhas controles e diabéticas estão apresentados na tabela 19 e
figura 20.
A proteólise total indicada pela tirosina liberada no meio de incubação dos
músculos dos peixes com diabetes experimental teve um aumento significativo de 33%
em relação ao animal controle.
A tabela 20 e a figura 20 apresentam a participação da via proteolítica
dependente de proteassoma nos controles e nos animais com diabetes experimental. A
participação da proteólise dependente de proteassoma foi de 0,080 ± 0,009 para os
controles e 0,119 ± 0,015 (nmol tirosina/mg.2h) para os diabéticos, contribuindo com
um aumento significativo de 49% na proteólise do músculo protractor hyoidei de
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
**
# ##
CONTROLE DIABÉTICAS
µm
ol A
GL/
g M
AT
.2h
Basal IBMX ISO
Resultados
65
tilápias vermelhas com diabetes experimental. Já a proteólise não dependente do
proteassoma, não mostrou diferença entre o controle e o tratamento com aloxana. Estão
contribuindo para essa atividade proteolítica provavelmente a via dependente de cálcio e
a via residual. Estudos preliminares mostraram que a atividade da via lisossomal não
participava e nem se alterava ao longo do período de jejum, em medidas feitas apenas
após 7, 15, 30, 60 e 90 dias sem alimento.
Tabela 19: Tirosina liberada no meio de incubação (nmol/mg.2h) de músculos protractor hyoidei de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos).
Controle Diabéticos
Proteólise
Total
0,194 ± 0,009
(18)
0,253 ± 0,019*
(12)
Os valores representam médias ± erro padrão. Valores entre parênteses representam o número de animais utilizados. * (P<0,05). Tabela 20: Tirosina liberada no meio de incubação (nmol/mg.2h) de músculos protractor hyoidei de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos).
MG132 Controle Diabéticos
Ausência 0,222 ± 0,009 (8)
0,287 ± 0,030 (6)
Presença 0,142 ± 0,007 (8)
0,143 ± 0,016 (5)
Diferença 0,080 ± 0,009 (8)
0,119 ± 0,015* (5)
Os valores representam médias ± erro padrão. Valores entre parênteses representam o número de animais utilizados. *(P<0,05).
Resultados
66
Figura 20: Tirosina liberada no meio de incubação (nmol/mg.2h) de músculos protractor hyoidei de tilápias (Oreochromis sp) que receberam injeção endovenosa de salina (controles) ou de aloxana (diabéticos). *(P<0,05) vs controle; #(P<0,05) vs controle.
CONTROLE DIABÉTICO0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
#
*
Tyr
libe
rada
no
mei
o de
incu
baçã
o(n
mol
/mL.
2h)
Total Dependente do Proteassoma
Discussão
67
4. Discussão
4.1. Parâmetros morfológicos e peso das gônadas, fígado, estômago e intestino
O peso corporal dos animais alimentados foi mantido constante durante o
período em que os animais permaneceram nos aquários experimentais na FMRP-USP.
O mesmo foi observado para o fator de condição, cujos valores permaneceram
semelhantes aos dos peixes dos tanques rede ao serem capturados. Isso mostra que as
condições de manutenção e alimentação foram adequadas durante todo o período
experimental.
O fator de condição é um indicador quantitativo do grau de higidez ou de bem
estar do peixe; reflete as condições alimentares recentes e/ou o gasto de reservas
energéticas em atividades cíclicas. Mudanças nesses valores indicam alterações nas
condições alimentares dos animais (WEATHERLEY, 1972; BRAGA, 1986;
WOOTTON, 1990 e VAZZOLER, 1996). As tilápias vermelhas mantiveram a higidez
uniforme até 15 dias de jejum; somente após períodos maiores sem alimento é que se
observou diminuição dos valores do fator de condição. Isso concorda com outros
estudos realizados em tilápias (Oreochromis mossambicus) e “catfish” (Ictalurus
punctatus) que mostraram que quando a disponibilidade de alimento é baixa, o fator de
condição geralmente é baixo também (BRUTON e ALLANSON, 1974; UCHIDA et al.,
2003 e PETERSON et al., 2004).
A tendência na diminuição do índice gonadossomático (GSI) dos peixes em
jejum prolongado mostrou uma possível adaptação do animal a períodos de estresse
ambiental. Apesar dos peixes mostrarem uma grande variedade de estratégias
reprodutivas entre os vertebrados, condições ambientais desvantajosas, como a falta de
alimento, podem interferir na regulação endócrina e conseqüentemente no crescimento,
Discussão
68
diferenciação e morte celular (apoptose) no tecido gonadal dos peixes (VAN DER
KRAAK et al., 1998). Foi observada redução do GSI nas tilápias vermelhas deste
trabalho, que passaram por períodos maiores de 60 dias de jejum. Isso concorda com
WEBER (1999) que somente observou alteração no GSI de tilápias (O. mossambicus)
fêmeas apenas após 21 dias de jejum. UCHIDA et al. (2003) também não encontraram
alterações no GSI das tilápias (O. mossambicus) em jejum curto de 2 semanas.
O decréscimo do índice hepatossomático (HSI) e do peso do fígado, observados
nas tilápias do presente estudo, após 7 e 15 dias de jejum está de acordo com
ALBALAT et al. (2005), mostrando que a falta de alimento afeta significativamente o
estado metabólico dos peixes. Uma redução no peso do fígado é comum ocorrer durante
períodos prolongados de jejum e provavelmente é devido à mobilização do glicogênio e
à degradação de proteínas (PETERSON et al., 2004 e VAN HEESWIJK et al, 2006). Já
o jejum curto (2 a 7 dias) não proporcionou alteração no HSI de “striped bass”
(Morone saxatilis) nem no “catfish” (Ictalurus punctatus) (SIHARATH et al., 1996 e
GAYLORD et al., 2001). Os resultados deste trabalho mostram que o HSI das tilápias
sofre significativa diminuição em períodos curtos de jejum, porém após queda de
aproximadamente 50% de seu valor ele estabiliza e não sofre alteração nem em períodos
bastante prolongados sem alimento. Isso mostra que o peixe parece consumir parte
significativa das reservas hepáticas no início do jejum e que em períodos maiores de
restrição alimentar, esse nível se mantém estável. Talvez, este achado seja decorrente da
diminuição do metabolismo e do gasto energético em função do estado de jejum,
mostrando uma grande capacidade de adaptação e economia energética. Há no início do
jejum redução do conteúdo de glicogênio e/ou proteína neste tecido e em períodos
prolongados, aumento do conteúdo de lipídios totais, o que será discutido mais adiante.
Discussão
69
Os resultados deste trabalho mostraram que no período de 7 dias de jejum as
tilápias já apresentavam o tubo digestivo completamente vazio, confirmado por
observações durante a dissecação dos peixes nos experimentos, com diminuição de 39%
no índice somático do estômago e intestino (ISEI). Esses valores coincidem com os
dados de FIGUEIREDO-GARUTTI, et al. (2002) em “brycon” (Brycon cephalus), onde
o índice do estômago caiu 11% após 24h e do intestino 40% após 72h de jejum,
permanecendo constante durante 15 dias de jejum. A variação do período de tempo de
esvaziamento do tubo digestivo depende da composição da dieta, da quantidade de sua
ingestão, do tamanho do peixe e de seu tubo digestivo, o qual está diretamente
relacionado com seu hábito alimentar. Um levantamento de estudos histológicos feitos
em outras espécies de peixes durante o período de jejum mostrou que, além do
estômago e intestino, a vesícula biliar, também apresentava atrofia (MARTIN et al.,
1993). A atrofia do tubo digestivo das tilápias foi ainda maior (48%) em períodos
prolongados de jejum (60 a 200 dias) o que sugere que esse tecido pode ser mobilizado
para fornecer substratos para o metabolismo energético e/ou os processos de síntese de
proteína tecidual estejam inibidos.
4.2. Ajustes metabólicos durante o jejum
A diminuição significativa da glicemia nas tilápias somente ocorre depois de 90
dias de jejum, apresentando valores 26% menores que os animais alimentados e
permanecendo constante até 200 dias sem ingestão de alimento. Nesse mesmo período
os níveis de AGL plasmáticos estão aumentados, assim como sua provável utilização
pelos tecidos periféricos, o que leva a uma redução da utilização periférica da glicose. O
provável aumento de liberação do glicerol, (decorrente do aumento da lipólise) que é
substrato da neoglicogênese, poderia contribuir para a manutenção da glicemia.
Discussão
70
Também são precursores da neoglicogênese os aminoácidos mobilizados dos tecidos
periféricos como o músculo branco (JØRGERNSEN et al., 2002) durante o jejum
podendo explicar a manutenção da glicemia das tilápias. Embora não tenha sido
observada (no presente trabalho) alteração da proteólise até 60 dias sem alimento, seria
interessante considerar que o músculo (protractor hyoidei) usado nestes experimentos
de incubação in vitro é um músculo com funções especiais para deglutição e respiração
e talvez não represente a massa da musculatura esquelética corporal importante do
ponto de vista energético.
A homeostasia glicêmica durante o jejum em peixes varia de acordo com a
espécie (FIGUEIREDO-GARUTTI et al., 2002). Nenhuma alteração da glicemia foi
observada após jejum de algumas semanas ou meses em Myxine glutinosa, Anguilla
rostrata ou Clarias lazera (FIGUEIREDO-GARUTTI et al., 2002). Por outro lado, a
concentração de glicose plasmática em “striped bass” (Morone saxatilis) (com valores
de 200mg/dl) reduziu 50% nos peixes que ficaram tanto 30 quanto 60 dias de jejum,
associada com a significante redução do HSI e do fator de condição (SIHARATH et al.,
1996). Também a traíra, Rhamdia hilarii, apresentou uma queda de 50% da glicemia
após 30 dias de jejum (de 60 para 30 mg/dl) (MACHADO et al., 1988). A manutenção
da glicemia durante a falta de alimento está diretamente relacionada com a capacidade
de mobilizar glicogênio hepático do fígado, principalmente durante o período inicial do
jejum, e também, depende da ativação da neoglicogênese hepática e da redução da
utilização de glicose (MOON E FOSTER, 1995).
Os níveis de lactato plasmático nas tilápias não apresentaram diferença
significativa entre os animais alimentados e os submetidos a diferentes períodos de
jejum. Comparando com os níveis plasmáticos no homem e em ratos, os peixes em
geral apresentam níveis mais baixos de lactato plasmático (CORNISH e MOON, 1985;
Discussão
71
MILLIGAN e McDONALD, 1988 e JØRGERNSEN et al., 2002). JØRGERNSEN et
al. (2002) afirmam que a manipulação do peixe “Artic charr” (Salvelinus alpinus)
durante o experimento e o jejum de 140 dias afetam significativamente os níveis de
lactato plasmático. A manipulação dos animais contribui para o aumento de 2 para 9
µmol/mL e o jejum para a diminuição dos níveis plasmáticos do lactato de 2,3 para 1,4
µmol/mL (JØRGERNSEN et al., 2002), diferente do observado em tilápias.
O estresse da manipulação ou de condições ambientais, contrações musculares e
forma de coleta de sangue podem contribuir para aumentar a concentração de lactato.
Os peixes levam entre 2 a 4h para apresentar o pico de lactato após forte estímulo como
manipulação e exercício e 12 a 24h para retornar aos valores basais (CORNISH e
MOON, 1985; MILLIGAN e McDONALD, 1988). Após exercício, as espécies de
peixes mais ativos apresentam um pico de lactato semelhante ao encontrado no homem
(15 a 20 µmol/mL), entretanto as espécies de peixes menos ativos o pico de lactato
raramente atinge valores acima de 2 µmol/mL. O baixo nível plasmático de lactato
apresentado pelos peixes menos ativos é devido a não liberação do lactato pela célula
muscular. Isso sugere que uma significante parte do lactato produzido pela glicogenólise
muscular ou pela glicólise anaeróbica no músculo é metabolizado “in situ” e que a
participação do ciclo de Cori no metabolismo do lactato e controle da glicemia possui
pouca importância em teleósteos, pois, como observado em enguias (Anguilla rostrata)
por MILLIGAN e McDONALD (1988), a glicose produzida não é oriunda do lactato.
Assim, a função do lactato como substrato para a neoglicogênese em teleósteos em
condições de repouso não está esclarecida (CORNISH e MOON, 1985; MILLIGAN e
McDONALD, 1988). Nesse contexto, vale lembrar que as tilápias são peixes que não
apresentam muita atividade física o que pode justificar os baixos níveis de lactato
observados, como também pode ser resultado da adaptação aos aquários experimentais e
Discussão
72
de uma manipulação cuidadosa e eficiente durante os experimentos, uma vez que
aumentos nos níveis de glicose e lactato são indicadores secundários de estresse
(JØRGERNSEN et al., 2002). Ou ainda, não podemos deixar de sugerir, a participação
de uma via metabólica pouco estudada mesmo em mamíferos, a glicogêniogênese, que
consiste na utilização do lactato pela própria célula muscular para a formação do
glicogênio (XAVIER et al. 2002), mantendo essa reserva energética neste tecido.
Estaria essa via presente e ativa em músculo esquelético de peixes como a tilápia? Essa
é uma possibilidade que mereceria ser investigada.
A porcentagem de glicogênio no músculo branco é geralmente baixa nos peixes,
mas a contribuição desse tecido para armazenar ou consumir energia é alta, uma vez que
ele representa 60% da massa total do corpo do peixe. O conteúdo de glicogênio
muscular diminuiu em Brycon cephalus sem alimento por 14 dias. A utilização do
glicogênio pelo músculo branco foi observada somente após 72h de jejum nesse peixe.
Isso indica que os estoques de glicogênio muscular não são utilizados logo de início do
período sem alimento. O glicogênio muscular pode não contribuir diretamente para a
homeostase glicêmica, pois o próprio tecido muscular provavelmente utiliza essa
glicose como fonte de energia (FIGUEIREDO-GARUTTI et al., 2002).
No músculo branco das tilápias o conteúdo de glicogênio também é baixo
(0,5%) e fica 42% menor após 60 e 90 dias de jejum sendo provavelmente consumido
(pela formação de glicose-6-P) pelo próprio tecido na via glicolítica para produção de
ATP.
A resposta dos teleósteos ao jejum é caracterizada geralmente pela utilização
primária do glicogênio, seguida dos lipídios e das reservas de proteínas (COLLINS e
ANDERSON, 1995). Já MARTÍNEZ et al. (2002) afirmam que o bacalhau (Gadus
morhua), privado de alimento, consome primeiro as reservas de lipídios que as de
Discussão
73
glicogênio (hepático e do músculo branco), e que a proteína muscular se torna a única
fonte de energia somente após um jejum prolongado de 140 dias.
Semelhante ao bacalhau (Gadus morhua), que possui grande capacidade de
armazenar energia no fígado durante períodos com grande oferta de alimento
(MARTÍNEZ et al., 2002), a tilápia também é capaz de armazenar grande quantidade de
energia na forma de glicogênio hepático (15% nas tilápias alimentadas). Na maioria das
espécies de peixes o glicogênio hepático é prontamente mobilizado durante o jejum,
mas o grau de mobilização do glicogênio nos peixes sem alimento varia entre as
espécies, podendo ser rapidamente ou parcialmente mobilizado ou até mesmo protegido
da mobilização durante o jejum (SHERIDAN e MOMMSEN, 1991). No presente
estudo, houve uma redução no conteúdo de glicogênio hepático das tilápias de
aproximadamente 40% após 7 dias de jejum (9,1%) e após 90 dias de jejum este
conteúdo estava 60% menor (5,9%). Interessante que mesmo após 200 dias sem
alimento, os valores de glicogênio hepático permaneceram altos (6,8%), em torno de
40% dos valores dos peixes alimentados (15%). Já em Brycon cephalus ocorre queda de
aproximadamente 80% logo após 3 dias de jejum (de 2,5 para 0,5%), mas após 5 dias
ocorre recuperação do conteúdo hepático de glicogênio (FIGUEIREDO-GARUTTI et
al., 2002 e 2004). Os autores acreditam ser decorrente do aumento da neoglicogênese. A
diminuição das reservas de glicogênio pode estar relacionada com a redução do índice
hepatossomático em períodos prolongados de jejum (FAIRBRIDGE e
LEATHERLAND, 1992a e 1992b e POTINGUER et al., 2003).
POTTINGUER et al. (2003) verificou que, nas trutas após 120 dias sem
alimento, as reservas de glicogênio hepático foram rapidamente consumidas, e
concomitante a isso, os níveis de glicose plasmática diminuíram significativamente. Por
outro lado, CORNISH e MOON (1985) afirmam que a glicogenólise sozinha não é
Discussão
74
capaz de suprir a produção de glicose por muito tempo nas enguias (Anguilla rostrata)
em jejum prolongado (6, 15 e 36 meses). Entretanto, os baixos níveis de glicose
plasmática podem ser tolerados, pois há um aumento na utilização de lipídios pelos
peixes em jejum, refletidos pelo aumento dos níveis de AGL plasmáticos. Com base nas
afirmações acima, podemos dizer que a tilápia possui alto conteúdo de glicogênio
hepático e que consome rapidamente parte dessa reserva quando fica em jejum
fornecendo glicose para os tecidos periféricos e para a manutenção da glicemia, fato que
ocorre juntamente com a elevação dos níveis de AGL plasmáticos que podem ser
usados como substratos energéticos pelos músculos, poupando assim parte do
glicogênio hepático.
O aumento dos níveis de AGL plasmático é uma característica marcante do
jejum em peixes (FARBRIDGE e LEATHERLAND, 1992a, b e POTTINGUER et al.,
2003). Tal fato foi observado nas tilápias do presente estudo, o que sugere a
mobilização das reservas de lipídios seguida pela redução do peso do tecido adiposo
mesentérico após longos períodos de jejum. O aumento de 49% dos níveis de AGL das
tilápias a partir de 60 dias de jejum, juntamente com a diminuição subseqüente da
glicemia e do conteúdo de glicogênio muscular e do peso do tecido adiposo indica que o
metabolismo de lipídios ganhou preferência nos peixes em jejum. Esse ajuste
metabólico também foi observado em percas (Perca flavescens) e no salmão
(Onchorhynchus kisutch) e pode ser resultado da redução da atividade glicogenolítica,
sendo mantida constante a atividade das enzimas lipolíticas (FOSTER e MOON, 1991;
SHERIDAN e MOMMSEN, 1991 e VAN HEESWIJK et al., 2006).
O uso de lipídios durante o jejum promove o aumento da concentração de AGL
plasmático devido à quebra dos triglicerídeos (SHERIDAN, 1988). O elevado nível de
AGL plasmático promove uma inibição competitiva da utilização da glicose pelos
Discussão
75
tecidos (COLLINS e ANDERSON, 1995). Esse mecanismo pode explicar a redução na
utilização de glicose pelos tecidos periféricos favorecendo a manutenção da glicemia
observada nas tilápias desse trabalho.
As grandes reservas de lipídios sustentam a demanda metabólica dos peixes
mantidos em laboratório, considerando que levam uma vida sedentária (CORNISH e
MOON, 1985). Nas tilápias o conteúdo de lipídio total hepático aumentou em resposta
ao jejum, e o conteúdo de lipídio total muscular somente foi reduzido após jejum
prolongado de 90 dias. GAYLORD et al. (2001) verificaram também um aumento no
conteúdo de lipídio hepático em “catfish” (Ictalurus punctatus). O “channel catfish” não
parece mobilizar o lipídio hepático proporcionalmente a outros componentes hepáticos
em resposta à falta de alimento. Por isso, o conteúdo de lipídios aumentou durante o
período de jejum e permaneceu alto até o final do experimento (GAYLORD et al.,
2001). Nas tilápias ocorre aumento de 42% no conteúdo de lipídio hepático, o qual se
estabiliza entre 7 a 60 dias de jejum. Após 90 dias sem alimento, há outro aumento
(105%), que se mantém estável até os 200 dias. Isso pode ser resultado do acúmulo
hepático de AGL mobilizados, que no fígado esterificam com glicerofosfato e são
armazenados na forma de triacilgliceróis, uma vez que ocorre a diminuição no peso do
tecido adiposo mesentérico conforme aumenta o período de jejum, como sugerido por
GAYLORD et al. (2001). Este acúmulo de lipídio no fígado serviu para a tilápia como
um reservatório de energia para utilização pelos próprios hepatócios. Vale a pena
salientar a grande quantidade de gordura acumulada no fígado da tilápia, em torno de
21% após 90 a 200 dias de jejum. Valores tão elevados tem sido observado também em
morcegos, os quais atingem 25% após 48 e 96h de jejum (PINHEIRO, 1995). Já em
ratos esses valores ficam em torno de 7 a 10% após restrição alimentar de 3 dias.
Discussão
76
4.3. Lipólise do tecido adiposo mesentérico incubado in vitro
O significativo aumento dos níveis de ácidos graxos livres observado no plasma
de tilápias em resposta ao prolongado período de jejum foi confirmado pelos achados de
aumento da mobilização dos AGL do tecido adiposo mesentérico (MAT) incubado in
vitro desses mesmos animais. A mobilização basal dos AGL do MAT incubado in vitro
de tilápias em jejum de 60, 90, 150 e 200 dias foi 2 vezes maior que a observada em
peixes alimentados. Estas respostas em peixes, embora com velocidade e magnitude
muito menores, se assemelham às verificadas em várias espécies de mamíferos
submetidos ao jejum. Valores de AGL, tanto in vivo como in vitro, observados após 60
dias de jejum nas tilápias se assemelham a valores encontrados em mamíferos após 24
horas sem alimento.
Informações sobre os mecanismos envolvidos no controle da atividade lipolítica
do tecido adiposo em teleósteos são poucas e fragmentadas, apesar da presença em
muitas espécies de peixes, incluindo a tilápia, de significativa quantidade de tecido
adiposo organizado, distribuído na cavidade abdominal, perivisceralmente e em fitas. A
administração in vivo de hormônios, sabidamente lipolíticos em mamíferos, como as
catecolaminas (VAN DEN THILLART et al., 2001 e VIANEN et al., 2002) e glucagon,
parece não provocar alteração na lipomobilização (HARMON e SHERIDAN, 1992) em
peixes. Estudos referentes ao efeito direto in vitro desses mesmos hormônios lipolíticos,
que mimetizam a situação de jejum, ou mesmo de agonistas beta adrenérgicos não
seletivos, como o isoproterenol, mostraram que não produzem alterações na
mobilização de AGL quando incubados com tecido adiposo de peixes, anfíbios e répteis
(MIGLIORINI et al., 1992 e FARKAS, 1967). Entretanto, dados apresentados por
MIGLIORINI et al., (1992) claramente mostram que a atividade lipolítica do tecido
adiposo de peixes (traíras), anfíbios (sapos) e répteis (serpentes) incubado in vitro está
Discussão
77
aumentada na presença de AMPc ou de derivados de xantina, drogas que inibem a
fosfodiesterase do AMPc e aumentam a concentração intracelular de AMPc, conhecido
segundo mensageiro em adipócitos de mamíferos e responsável pela ativação da
proteína quinase dependente de AMPc e da lipase dos triacilgliceróis.
O sistema adrenérgico dos mamíferos atua através de dois tipos de receptores
adrenérgicos, alfa e beta com seus respectivos subtipos: alfa 1 e 2 e beta 1, 2 e 3, os
quais pertencem à família dos receptores acoplados à proteína G. São ativados por
hormônios e neurotransmissores, como a adrenalina e noradrenalina, além de muitas
drogas de grande importância clínica (RUUSKANEN et al., 2005). Nos peixes existem
poucas informações sobre os efeitos de drogas que afetam o sistema adrenérgico, assim
como a existência dos diferentes subtipos dos receptores adrenérgicos. Há trabalhos
sobre o controle da pressão arterial (sistema renina-angiotensina) em trutas
(Oncorhynchus mykiss), dos melanóforos que conferem cor à pele dos “cuckoo wrasse”
(Labrus ossifagus) (RUUSKANEN et al., 2005) e recentemente alguns estudos foram
publicados sobre o papel dos receptores adrenérgicos no controle da lipólise em peixes
(VAN DEN THILLART et al., 2001 e VIANEN et al., 2002). Esses trabalhos mostram
que a regulação da lipólise nos peixes ainda é um problema intrigante. Foi descrito um
novo e curioso fenômeno envolvendo os receptores beta-adrenérgicos na inibição da
lipólise (VAN DEN THILLART et al., 2001 e VIANEN et al., 2002), diferente do bem
conhecido mecanismo descrito em mamíferos. Para analisar com detalhes esse novo
mecanismo seria necessário realizar experimentos in vitro com diferentes tipos de tecido
adiposo ou adipócitos isolados de diferentes depósitos, incubados na presença de
diferentes agonistas e antagonistas dos receptores adrenérgicos alfa e beta conhecidos
até então, assim como de diferentes drogas que atuassem em passos específicos da
cascata de ativação da lipólise.
Discussão
78
Assim, estudos do nosso laboratório realizados com fragmentos de tecido
adiposo mesentérico de tilápia alimentada mostraram não ocorrer nenhuma alteração da
atividade lipolítica desse tecido quando incubado com hormônios, como catecolaminas
e outras drogas como fenilefrina (agonista alfa não seletivo), prazosin (antagonista alfa
1), ioimbina (antagonista alfa 2), sugerindo o não envolvimento dos receptores alfa-
adrenérgicos nessa resposta. A adição de fluoreto de sódio, forskolina (ativadores da
adenil ciclase), assim como adenosina desaminase, não modificaram a resposta
lipolítica. Esses estudos não foram feitos com tecido adiposo de tilápia em jejum.
Os resultados obtidos no presente trabalho com o tecido adiposo mesentérico de
tilápias alimentadas e nos diferentes períodos de jejum mostram ocorrer uma
diminuição significativa na liberação de AGL após 30 dias de jejum até 200 dias sem
alimento, quando o tecido foi incubado na presença do IBMX e ISO, conhecidos
agentes lipolíticos em tecidos de mamíferos. Esta queda da lipólise foi semelhante
quando comparado o efeito isolado do ISO e do IBMX em relação ao tecido controle
incubado na ausência dessas drogas, em todos os períodos estudados.
Não se sabe a razão pela qual estas drogas causam inibição da lipólise em tecido
adiposo de tilápias a partir de 30 dias de jejum, nem a razão do efeito do jejum
prolongado (acima de 60 dias) no aumento da lipólise ser maior que o efeito dos beta-
agonistas em inibi- la.
Para tentar esclarecer o mecanismo da inibição da lipólise no tecido adiposo de
tilápia in vitro VIANEN et al. (2002) usaram adipócitos de tilápia (Oreochromis
mossambicus) e demonstraram que a noradrenalina e o isoproterenol inibiam a lipólise
através de receptores beta e ainda mostraram evidências do envolvimento dos receptores
adrenérgicos beta3 nesta resposta. Mais experimentos usando agonistas e antagonistas
adrenérgicos beta3 devem ser realizados para esclarecer a importância fisiológica desses
Discussão
79
dados. Também VAN DEN THILLART et al. (2001), verificaram que carpas
infundidas com noradrenalina e isoproterenol apresentavam redução nos níveis de AGL
plasmáticos, e demonstraram um envolvimento direto de receptores beta-adrenérgicos
nesta resposta, sendo os beta2 estimulatórios e os beta1 inibitórios da lipólise. Nossos
resultados concordam com os de VIANEN et al. (2002), que sugerem que nas tilápias
os receptores beta-adrenérgicos estão envolvidos na redução da lipólise. Qual é o sinal
fisiológico que promove a mobilização do AGL dos depósitos do tecido adiposo nos
peixes durante o jejum é ainda uma questão à espera de resposta.
Sabe-se que em mamíferos as catecolaminas estimulam a lipólise no tecido
adiposo via receptores beta adrenérgicos resultando em um aumento nos níveis de AGL.
HAGVE et al. (1990) e KATZ e MESSINEO (1981) sugerem que o acúmulo desses
compostos anfifílicos pode ser prejudicial para a estrutura e as funções das membranas
das células. Assim a observação que os níveis de AGL não aumentam em peixes frente
ao estímulo das catecolaminas e agonistas adrenérgicos, ou até mesmo reduzem, pode
ser considerada uma estratégia adaptativa desses animais para sobreviverem em
situações de stress.
Os resultados da mobilização in vitro dos AGL do tecido adiposo das tilápias
nesse trabalho corroboram a discussão acima que os agonistas e antagonistas alfa
adrenérgicos não afetam a lipólise, que um agonista não seletivo beta adrenérgico como
o ISO (que aumenta o AMPc citosólico) inibe a lipólise e difere das observações de
MIGLIORINI et al. (1992) que um inibidor da fosfodiesterase do AMPc, como o
IBMX, que aumenta a concentração intracelular de AMPc, promove aumento da
lipólise. Portanto, a participação dos receptores beta na inibição da lipólise é um novo
fenômeno e sugere um mecanismo diferente do conhecido em mamíferos (VAN DEN
THILLART et al., 2001 e VIANEN et al., 2002). Apesar dessa diversidade da
Discussão
80
participação e da ação dos receptores adrenérgicos no controle da lipólise dos peixes,
todos os estudos se referem à ação do AMPc como sinalizador intracelular. No entanto,
experimentos prévios em nosso laboratório (dados não apresentados) com incubação de
fragmentos de MAT na presença de dibutiril AMPc não mostraram alterações da
lipólise nos animais alimentados mas mostrou uma inibição de 52% da lipólise das
tilápias que estavam 90 dias sem alimentação em contraste com o MAT incubado em
condições basais.
IBMX e ISO mostraram um efeito inibitório da lipólise in vitro no tecido
adiposo mesentérico de tilápias em diferentes períodos de jejum, sendo esta diminuição
da liberação de AGL para o meio de incubação significativa a partir dos 30 dias de
jejum permanecendo até os 200 dias sem alimento. Poderia o ISO atuar através de
receptores beta1 inibitórios, via proteína Gi e diminuir os níveis de AMPc? Mas IBMX,
que supostamente aumenta os níveis de AMPc, também apresenta a mesma resposta
inibitória! Estaria realmente o IBMX inibindo a fosfodiesterase do AMPc? Poderia na
tilápia existir outra isoenzima não inibida pelo IBMX? Seria diferente o controle da
lipase dos triacilgliceróis existente no tecido adiposo de peixes? Valeria ainda a pena
mencionar que em nenhum experimento, tanto no presente trabalho, como nos relatados
na literatura foram feitas medidas da liberação do glicerol, que corresponde ao
verdadeiro metabólito indicador da lipólise, uma vez que os ácidos graxos podem ser
reesterificados com alfa glicerofosfato formando triacilgliceróis e permanecendo dentro
das células. Estaria nestes animais jejuados aumentada a atividade da gliceroneogênese
e assim aumentada a reesterificação dos ácidos graxos e por isto menor liberação no
meio de incubação seria observada?
Trabalhos de ROY et al. (2003) também demonstraram que células adiposas de
carpas (Catla catla) podem produzir e liberar insulina. Se este curioso achado for
Discussão
81
também verdadeiro para tecido adiposo de tilápia, poderia a insulina liberada no meio
de incubação inibir a própria liberação dos ácidos graxos, ficando este efeito mais nítido
nas células de animais em jejum, quando provavelmente estão altos os níveis de outros
hormônios, como catecolaminas, que parecem inibir a resposta lipolítica em peixes.
Estas são importantes questões que merecem ser investigadas!
4.4. Proteólise do músculo esquelético
Quase nada é sabido sobre o controle das taxas de degradação da proteína
muscular nesses animais aquáticos, como já salientado na introdução.
O conhecimento de fatores que controlam a degradação de proteína em aves
(NAVEGANTES et al., 2003), ratos (KETTELHUT et al., 1994) e peixes (DIAS JR et
al., 2004) é importante para entender o mecanismo pelo qual a nutrição, hormônios e
fatores ambientais e genéticos influenciam o crescimento e a adaptação do animal em
diferentes situações, além de poder aumentar a eficiência da utilização dos nutrientes e
maximizar o crescimento dos peixes em cultura intensiva.
Uma importante adaptação ao jejum é a mobilização de aminoácidos das
proteínas do corpo, principalmente do músculo esquelético, para suprir as necessidades
energéticas do organismo. Um evento que ocorre no jejum é o aumento da liberação de
aminoácidos da musculatura esquelética, a qual resulta no decréscimo da síntese
protéica e de um característico aumento na degradação da proteína muscular, levando à
perda de massa muscular. Isso parece essencial para abastecer o organismo com
aminoácidos para a neoglicogênese (KETTELHUT et al., 1994; BUSQUETS et al.,
2002; MOMMSEN, 2004; SALEM et al., 2005). Mas durante prolongada restrição de
alimento, a quebra da proteína do músculo dos animais e humanos diminui e pode até
mesmo cair abaixo da taxa observada no estado alimentado (KETTELHUT et al., 1994
Discussão
82
e SARTORI et al., 1995 e 1996). Os resultados obtidos com tilápias apresentados nesse
trabalho confirmam a diminuição na degradação da proteína muscular somente depois
de período prolongado de jejum, tendo sido observado neste tipo de músculo e nesta
espécie, redução de proteólise após 60 dias de restrição alimentar. Isso pode refletir uma
importante adaptação metabólica, provavelmente para preservar a proteína muscular
para a sobrevivência do animal. Mas, depois de um prolongado período de jejum (90 a
200 dias), as taxas de degradação da proteína muscular aumentaram gradativamente
alcançando valores semelhantes ao observados nos animais alimentados. Existe,
entretanto, uma clara tendência de uma proteólise maior depois de 15 e 200 dias sem
alimento. Mais experimentos serão necessários para esclarecer estas alterações nos
diferentes períodos de restrição alimentar! Também será interessante investigar as taxas
de proteólise em outro tipo de músculo, uma vez que o músculo estudado, protractor
hyoidei apresenta características diferentes com funções especiais para a alimentação e a
respiração e talvez não representa a musculatura esquelética corporal com maior
importância para o metabolismo energético.
Já está bem demonstrado em músculo esquelético de mamíferos e aves a
presença de 4 vias proteolíticas: 1) lisossomal; 2) dependente de cálcio; 3) dependente
de proteassoma-ATP-ubiquitina e 4) independente de ATP ou residual (KETTELHUT
et al., 1988 e 1994; NAVEGANTES et al., 2003). O sistema proteolítico mais estudado
em mamíferos e aves é o sistema lisossomal, uma organela rica em catepsinas e
hidrolases ácidas (KETTELHUT et al., 1988). Nenhuma atividade da proteólise
lisossomal foi encontrada tanto nos músculos das tilápias alimentadas como jejuadas. Já
MOMMSEN (2004), FRENCH et al. (1983) e MARTIN et al. (2002), mostram que nos
teleósteos ocorre ativação do lisossoma e sugerem ser as catepsinas D e L presentes
nessa organela as responsáveis pela degradação muscular em períodos catabólicos como
Discussão
83
a migração, o jejum e sob efeito de poluentes. Talvez essa diferença seja decorrente da
espécie de peixe, do tipo de músculo e da metodologia empregada nos experimentos.
Nos mamíferos a via lisossomal tem pequena participação na degradação de proteínas
em situações catabólicas, não tendo sido encontrada nenhuma participação da via
lisossomal em ratos em jejum de 48 horas ou mesmo diabéticos (KETTELHUT et al.,
1994 e PEPATO et al., 1996 e BUSQUETS et al., 2002).
Apesar da purificação e caracterização do proteassoma 20S e 26S em músculo
de peixes (BUSCONI et al., 1992; STOKNES e RUSTAD, 1995 e SANCHES et al.,
1995) nada se sabe sobre a presença e a atividade deste complexo enzimático nas
tilápias. No músculo dos mamíferos em situações catabólicas como o jejum, uremia ou
câncer a via proteolítica dependente do proteassoma constitui uma das mais importantes
envolvidas na degradação das proteínas musculares como revisado por MOMMSEN
(2004). Este é o primeiro trabalho, tanto quanto se saiba, que mostra na tilápia a
partic ipação do processo proteolítico dependente do proteassoma na degradação das
proteínas musculares durante diferentes períodos de jejum. A atividade dessa via nas
tilápias, durante o jejum prolongado de 60 a 150 dias apresentou uma queda
significativa de aproximadamente 70% em relação à atividade apresentada nos animais
alimentados, acompanhando as alterações observadas na atividade proteolítica total.
Na truta com 2 semanas de jejum foi observado também, diminuição da
atividade da via proteolítica dependente do proteassoma como resultado da diminuição
da degradação de proteínas e do metabolismo do peixe (DOBLY et al., 2004 e
MARTIN et al., 2002). Esses autores enfatizam que existem diferenças na regulação da
renovação de proteínas entre pecilotérmicos e homeotérmicos. Durante o jejum ocorre
uma diminuição na atividade do proteassoma tanto no fígado quanto no músculo branco
das trutas (O. mykiss), já no rato, o proteassoma é ativado após 24 horas de jejum,
Discussão
84
indicando aumento da proteólise que reflete aumento do metabolismo e do requerimento
energético (MEDINA et al., 1995 e VOGES et al., 1999).
Outro ponto a ser considerado é que a capacidade metabólica do músculo, em
parte, determina o desempenho da sua utilização como substrato energético
(MARTÍNEZ et al., 2002). As fibras glicolíticas rápidas (fibras brancas) são usadas em
movimentos rápidos, consumindo o ATP que é produzido anaerobicamente da quebra
do glicogênio formando lactato. O jejum diminui significativamente essa capacidade
metabólica e conseqüentemente a capacidade funcional do músculo branco ao passo que
as fibras oxidativas são poupadas. Por isso, as proteínas das fibras brancas são
facilmente mobilizadas durante o jejum quando comparadas com as fibras oxidativas
(BEARDALL e JOHNSTON, 1983; FRENCH et al., 1983 e MARTÍNEZ et al., 2002).
MOMMSEN et al. (1980) também verificaram que o músculo vermelho do
salmão, durante a subida do rio (migração) fora conservado. Esse período é considerado
catabólico, pois os peixes não se alimentam, percorrem grandes distâncias e mobilizam
proteína para as gônadas devido à maturação sexual. Nele foi observada uma pequena
redução da síntese protéica. Da mesma forma, LOUGHNA e GOLDSPINK (1984)
verificaram um declínio na síntese protéica do músculo vermelho em trutas há 2 meses
em jejum. Vale lembrar que o músculo protractor hyoidei é oxidativo e que participa de
movimentos bucais importantes para a respiração e alimentação. Isso pode contribuir
para determinar a sua utilização e conservação, pois está diretamente relacionado com
funções vitais do animal. Essa proteção pode ser vista como uma adaptação da tilápia
para sobrevivência a condições ambientais adversas.
Experimentos futuros poderiam ser realizados para verificar se em períodos
ainda maiores de restrição alimentar haveria ativação da proteólise. Embora nesse tipo
de músculo, o qual foi estudado devido às suas características morfológicas apropriadas
Discussão
85
para incubação in vitro, não tenha ocorrido ativação da proteólise, talvez em outros
músculos corporais, este processo metabólico possa estar ativado. Para isso, podem ser
aplicadas novas técnicas como a da microdiálise, a qual está sendo padronizada em
nosso laboratório e que permitirá a determinação da proteólise total em outros músculos
de peixes in vivo e acordados. Esta técnica consiste na colocação de um cateter de
microdiálise na musculatura branca dorsal, logo depois da nadadeira dorsal, conectado a
uma bomba de infusão contínua e perfundido com solução salina isotônica contendo
soroalbumina bovina, tirosina e glicose, durante 45min, a 1µL/min para estabilização. O
dialisado pode ser coletado durante determinado período de tempo para posterior
medida da concentração de tirosina, que reflete a liberação deste aminoácido do
músculo em estudo.
4.5. Diabetes mellitus
A aplicação endovenosa e a dose de 150 mg de aloxana/Kg PC foram eficientes
para a indução do diabetes mellitus nas tilápias, tendo sido observado um significativo
aumento da glicemia logo após 24 horas da aplicação da droga.
O aumento de 3 vezes da glicemia nas primeiras 24 horas e de 5 vezes 48 horas
após aplicação de aloxana nas tilápias desse trabalho concorda com os resultados de
BIUW (1970) em lampréias (Lampetra fluviatilis) e de KELLEY (1993) para “goby”
(Gillichthys mirabilis) islectomizados, que afirma que o aumento de aproximadamente 4
vezes da glicemia está entre os sinais típicos do diabetes mellitus. Cottus scorpius
islectomizados e Anabas testudineus injetados com aloxana apresentaram níveis
glicêmicos altos após 48 horas, que retornaram aos valores basais após a aplicação de
insulina de mamíferos (FALKMER, 1961; VIJAYASREE et al., 2005). As tilápias que
receberam injeções de aloxana com doses abaixo de 150mg/Kg apresentaram, nesse
Discussão
86
período uma recuperação dos níveis basais de glicemia e as tilápias que receberam
dosagens acima, não sobreviveram mais que 72 horas. BIUW (1970) relata que o efeito
da dose de aloxana pode estar relacionado com a via de aplicação e com a temperatura
da água, sendo que temperaturas mais altas e aplicação endovenosa favorecem a ação
lesiva da aloxana nas células beta dos corpúsculos de Brockman. As tilápias receberam
injeções de aloxana via veia caudal e a temperatura da água foi mantida em 28±1oC;
portanto, essas condições foram suficientes para uma eficiente ação da aloxana.
Portanto, os estudos de indução de diabetes mellitus nos peixes também mostram que a
hiperglicemia é resultante da ausência da insulina e não do estresse da manipulação dos
animais, pois os níveis glicêmicos observados nos animais que receberam apenas
injeção de salina não apresentaram alterações, como é mostrado pelas tilápias desse
estudo.
Parâmetros morfológicos
O período de 120 horas em que as tilápias ficaram diabéticas não contribuiu
para alterar parâmetros corporais como peso, comprimento e fator de condição. Assim,
apesar do jejum durante o experimento e do diabetes experimental os animais
mantiveram a higidez corpórea.
O peso dos testículos e seu índice somático foram significativamente menores
nas tilápias diabéticas quando comparadas com os controles. A significativa regressão
gonadal nos peixes diabéticos reflete a participação da insulina no crescimento e
desenvolvimento dos peixes. Em comparação com os mamíferos, pouco é conhecido
sobre os mecanismos hormonais que regulam a gametogênese e o desenvolvimento
gonadal em peixes. Os teleósteos são capazes de adaptar o desenvolvimento gonadal em
função de alterações ambientais e morfológicas (MOMMSEN, 1997). Neste contexto, a
insulina estimula a síntese de DNA e a incorporação de (3H-timidina) na
Discussão
87
espermatogônia de truta arco- iris (Oncorhynchus mykiss), (LOIR e LE GAC, 1994). Por
outro lado, o estresse possui um efeito inibitório na reprodução de muitas espécies,
agindo diretamente na inibição da síntese de esteróides e na morte celular ou apoptose,
que desempenham importante função na fisiologia das gônadas. Nas espécies que
apresentam desovas sazonais a regressão das gônadas é um processo natural e está
envolvida diretamente com as variações ambientais que determinam a sazonalidade da
reprodução, como a falta de oxigênio, temperatura e jejum, além da ação antropogênica
(MOMMSEN, 1997). A apoptose é um processo que necessita de mRNA, síntese
protéica e possui especificidade tecidual e os fatores que ativam ou inibem a apoptose
são controlados por hormônios, na qual a insulina participa inibindo o processo de
regressão (MOMMSEN, 1997). Isso pode explicar a regressão das gônadas das tilápias
com diabetes mellitus agudo (120 horas).
A diminuição do índice somático do estômago e intestino nos peixes diabéticos
pode estar relacionada com a mobilização protéica de um tecido que não apresenta
função pela ausência de alimento. O índice somático do estômago e intestino foi o
mesmo e durante todos os períodos de jejum (7 a 200 dias) mas foi menor comparado
com os animais alimentados. Isso indica um completo esvaziamento gástrico após 7 dias
de jejum. Mas foi observada também uma tendência na diminuição desse índice nos
tempos mais prolongados sem alimento. Isso pode indicar a mobilização tecidual
decorrente do processo catabólico de um tecido que não está sendo usado. Já as tilápias
que tiveram uma depleção dos níveis de insulina após 120 horas da aplicação de
aloxana, apresentaram valores do índice somático do estômago e intestino ainda
menores quando comparados com o controle. A total depleção de insulina no peixe
diabético leva a um quadro agudo de catabolismo que mostra ser equivalente a um
período bastante prolongado de jejum.
Discussão
88
Parâmetros metabólicos
O conteúdo de glicogênio hepático foi significativamente menor nos animais
com 120 horas de diabetes, indicando intensa mobilização hepática de glicose para o
plasma, quando comparado com os valores dos peixes controles (com 7 dias de jejum).
A mobilização de aproximadamente 62% do conteúdo de glicogênio hepático das
tilápias diabéticas no período de 5 dias foi superior ao que foi mobilizado no período de
200 dias sem alimento (aproximadamente 55%), tendo sido encontrado no final desse
período valores de 3,0 ± 0,5% para os peixes diabéticos e 6,8 ± 0,5 % para os peixes em
jejum. Essa intensa mobilização do glicogênio hepático em um curto período de tempo
reflete o importante papel da insulina no controle do metabolismo de carboidratos no
fígado. FEKETE (1978) também encontrou uma diminuição no conteúdo de glicogênio
hepático e muscular de carpas, rãs, pombos e ratos após a aplicação de aloxana. Nos
peixes, na ausência da insulina a síntese do glicogênio diminui e sua degradação é
estimulada pela ativação da fosforilase, assim como ocorre em mamíferos
(MIGLIORINI e KETTELHUT, 1999).
Como explicar o significativo aumento dos níveis plasmáticos de lactato nas
tilápias diabéticas apesar de não ter sido verificada diminuição no conteúdo de
glicogênio muscular? Poderia ser decorrente da sucessiva manipulação para
amostragem de sangue dos animais durante o período experimental, pois como afirmado
por JØRGERNSEN et al. (2002) a manipulação contribui para o aumento dos níveis de
lactato, sendo o lactato um indicador secundário de estresse. Mas como os níveis de
lactato plasmático das tilápias controles não aumentaram e ainda apresentaram valores
iguais aos dos peixes alimentados e em jejum, esse conceito não pode ser aplicado para
as tilápias diabéticas. A afirmação de CORNISH e MOON, (1985) e MILLIGAN e
McDONALD, (1988) que o ciclo de Cori possui pouca importância para os teleósteos
Discussão
89
parece que não pode ser aplicada para as tilápias nessa situação catabólica. Apesar da
função do lactato como substrato para a neoglicogênese nos teleósteos ainda não estar
totalmente esclarecida, e de que o músculo esquelético das enguias (Anguilla rostrata)
recicla o lactato, os altos níveis plasmáticos observados nas tilápias diabéticas mostram
uma significativa liberação do lactato para o plasma. Esse resultado mostrou ser
conseqüência do estado catabólico induzido pela ausência da insulina: 1) pela
glicogenólise em outro tipo de músculo? 2) ou pelo aumento do metabolismo
anaeróbico dos tecidos em conseqüência da diminuição da perfusão sangüínea nos
tecidos pela própria falta de insulina?
Lipólise do tecido adiposo mesentérico (MAT) incubado in vitro
As tilápias diabéticas apresentaram um aumento dos níveis de AGL plasmático e
um aumento da mobilização do AGL dos fragmentos de MAT incubados in vitro em
relação aos controles. Porém o uso de IBMX e ISO, que mostraram inibir a lipólise no
tecido adiposo incubado dos animais em jejum, não apresentou o mesmo efeito no
tecido adiposo das tilápias diabéticas. A presença dessas drogas não alterou a alta
lipólise no MAT de tilápias diabéticas.
Nos mamíferos, a ausência de insulina ativa a lipólise e aumenta a liberação de
AGL e glicerol para a circulação (MIGLIORINI e KETTELHUT, 1999). Os níveis de
AGL plasmático das tilápias diabéticas aumentaram após 96 horas da aplicação da
aloxana. Esse aumento, decorrente da ausência de insulina pela destruição das células
beta, também foi observado nas lampréias (Petromyxon marinus) (KAO et al., 1999,
2001 e 2003), no “hagfish” do Pacífico (Eptatretus stouti), peixe dourado (Carassius
auratus), “catfish” (Heteropneustes fossilis) e em “pike” (Esox lucius)
(PLISETSKAYA et al., 1983 e 1994). A injeção de insulina reduziu os níveis de AGL
de salmão (Oncorhyncus kisutch) tratados com soro anti- insulina (HARMON e
Discussão
90
SHERIDAN, 1992). Apesar de não terem sido observadas diminuição no peso de tecido
adiposo e alteração no controle de lipídios hepático e muscular nas tilápias, ocorreu uma
mobilização das reservas lipídicas nos animais diabéticos. Isso pôde ser comprovado
pelo aumento dos níveis plasmáticos de AGL e pela quantificação da lipólise em
fragmentos de tecido adiposo mesentérico (MAT) incubados in vitro.
Os fragmentos de MAT dos animais controle incubados na presença de IBMX e
ISO apresentaram também, como já observado nos animais em jejum, uma
surpreendente diminuição de 38% na lipólise em relação ao controle. Já os fragmentos
de MAT das tilápias diabéticas revelaram um aumento da lipólise de aproximadamente
84% em relação aos controles. Esse aumento foi mantido mesmo na presença de drogas
como a isobutilmetilxantina (inibidor da fosfodiesterase do AMPc) e o isoproterenol
(agonista não seletivo beta-adrenérgico), mostrando efeito diferente ao observado nos
animais controle e nos observados nos animais em diferentes períodos de jejum.
Parece que essas drogas conseguem inibir a lipólise quando há ainda insulina
presente (pois com insulina inibe a lipase hormônio sensível e aumenta a reesterificação
dos AGL com glicerofosfato), a qual também inibe a mobilização de AGL. Porém,
quando a insulina fica drasticamente reduzida (como no diabetes aloxânico), o efeito
dessas drogas não aparece e acaba sobrepujando o efeito da ausência de insulina, que é
o aumento da lipomobilização.
VAN DEN THILLART et al. (2001) mostraram o envolvimento de receptores
adrenérgicos alfa 2 e beta 1 na inibição e de receptores beta 2 na estimulação da lipólise
de carpas (Cyprinus carpio) e VIANEN et al., (2002) mostraram o envolvimento de
receptores adrenérgicos inibitórios beta 3 nas tilápias (Oreochromis mossambicus), o
contrário do que afirmam MIGLIORINI et al. (1992) que não observaram efeito das
catecolaminas na regulação da lipólise in vitro do tecido adiposo de traíra (Hoplias
Discussão
91
malabaricus) e de sapos (Bufo paracnemis). A participação de receptores beta-
adrenérgico na lipólise parece exercer funções diferentes em tecidos diferentes. Os
receptores beta 1 inibem a lipólise no tecido adiposo e os beta 2 estimulam a lipólise no
fígado das carpas. Na tilápia, somente os receptores beta 1 e beta 3 participam da
regulação da lipólise no tecido adiposo, já nas carpas, também foi verificado a
participação de receptores alfa 2 na regulação da lipólise no tecido adiposo. Entretanto,
a lipólise do MAT dos animais diabéticos não foi inibida na presença do IBMX e do
ISO. Portanto, da mesma forma que ocorre no jejum, a situação catabólica devido à
ausência de insulina prevalece sobre a ação das drogas, sendo que a situação aguda
induzida pelo diabetes (pela ausência de insulina e aumento do glucagon e talvez
cortisol e catecolaminas), parece ser ainda mais importante que o jejum prolongado,
quando talvez as alterações hormonais não sejam tão drásticas ou já houve uma resposta
adaptativa dos peixes. Já os mecanismos responsáveis por estas respostas necessitam de
mais estudos para serem desvendados.
Proteólise do músculo esquelético
Ao contrário do que foi observado nos animais em jejum a degradação da
proteína muscular dos animais diabéticos foi maior que nos animais controle. O
aumento de 30% da proteólise total dos animais diabéticos mostra a importante ação da
insulina no metabolismo da musculatura esquelética das tilápias e manutenção da
homeostase energética. Na sua total ausência, a síntese protéica encontra-se
provavelmente diminuída e há o aumento da proteólise muscular para fornecer
aminoácidos para o fígado. Esses aminoácidos juntamente com o glicerol oriundo da
lipólise do tecido adiposo e o lactato do metabolismo anaeróbico dos tecidos fornecem
substratos para a neoglicogênese que está muito ativada (MIGLIORINI e
KETTELHUT, 1999) promovendo o aumento significativo da glicemia.
Discussão
92
Dentre as vias de degradação protéica estudadas nesta situação a via lisossomal,
da mesma forma que o observado para os animais em jejum, não apresentou nenhuma
atividade na musculatura esquelética das tilápias diabéticas. No entanto, é sabido que
em inúmeras situações catabólicas como diabetes, câncer, uremia e sepse, ocorre a
participação do proteassoma na degradação da proteína muscular. Os dados desse
trabalho corroboram essa afirmação, pois na situação catabólica induzida pela ausência
de insulina nas tilápias, também foi verificado um aumento na participação da proteólise
dependente do proteassoma. Isso mostra que essa via participa da liberação de
aminoácidos musculares como substrato para neoglicogênese. Acredita-se que a via
dependente de cálcio também participa desse processo, uma vez que TOYOHARA e
MAKINODAN (1989), LADRAT et al. (2000) e SALEM et al. (2005) verificaram a
existência de calpaínas no músculo das tilápias e de sua participação na degradação das
proteínas musculares em processos catabólicos. Porém a atividade dessa via não foi
estudada nas tilápias diabéticas.
Assim, os dados do presente trabalho mostram que o jejum prolongado,
considerado a partir de 60 dias, promove a diminuição da glicemia, do conteúdo de
glicogênio hepático e muscular e do conteúdo de lipídios totais musculares. Proporciona
também o aumento dos níveis plasmáticos de AGL e do conteúdo de lipídios totais
hepáticos.
O aumento da lipólise do MAT foi observado nos animais em jejum, e
surpreendentemente, a isobutilmetilxantina (inibidor da fosfodiesterase do AMPc) e o
isoproterenol (agonista beta adrenérgico) inibem a lipólise tanto nos animais
alimentados quanto nos animais em jejum, diferente do que ocorre em mamíferos.
Discussão
93
O jejum prolongado diminui a proteólise no músculo esquelético das tilápias
sendo que a via dependente de proteassoma-ATP-ubiquitina possui grande participação
nesse processo, pois contribui com aproximadamente 50% do total da proteólise.
A aplicação da aloxana endovenosa é eficiente na indução do diabetes mellitus
proporcionando aumento de 5 vezes da glicemia. Os níveis de AGL também
aumentaram nos animais diabéticos, como também os níveis de lactato plasmático. Já o
conteúdo de glicogênio hepático diminui drasticamente nos animais diabéticos.
O diabetes aumenta a mobilização de AGL do tecido adiposo mesentérico das
tilápias mesmo na presença de IBMX e ISO, que mostraram exercer forte inibição da
lipólise no tecido adiposo mesentérico dos animais alimentados e jejuados.
Ao contrário do que foi observado nos peixes em jejum, o diabetes aumentou a
proteólise na musculatura esquelética das tilápias, sendo que, a participação da via
dependente de proteassoma-ATP-ubiquitina no aumento da proteólise total também foi
de aproximadamente 50%.
Portanto, as alterações do metabolismo energético na tilápia vermelha são
semelhantes às que ocorrem em mamíferos (apesar da menor velocidade e magnitude de
resposta), com exceção do controle simpático da lipomobilização, que exerce um papel
inibitório na lipólise do tecido adiposo desta espécie. Vale a pena ressaltar que este é o
primeiro trabalho que demonstrou, com metodologia apropriada, a presença do sistema
proteolítico dependente de proteassoma-ATP-ubiquitina em músculo de tilápia e a
alteração de sua atividade em situação de jejum e no diabetes mellitus experimental.
Ainda a insulina parece apresentar nesta espécie de peixes ação semelhante aos de
mamíferos no metabolismo de carboidratos, lipídios e proteínas.
Bibliografia
94
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MIGLIORINI, R.H.; KETTELHUT, I.C. (2002). Glyconeogenic pathway in isolated skeletal muscles of rats. Can. J. Physiol. Pharmacol. 80:164-169.
ANEXO
1
Effect of fasting on carbohydrate, lipid and protein metabolism in red tilapia
(Oreochromis sp) (Teleostei: Cichlidae).
Walter Dias Júnior, Amanda M. Baviera, Neusa M. Zanon, Renato H. Migliorini, Isis C.
Kettelhut*
Department of Physiology and Biochemistry, School of Medicine, University of São Paulo,
Ribeirão Preto, 14049-900 São Paulo, Brazil. (E-mail: [email protected])
*Corresponding author.
Department of Physiology and Biochemistry
School of Medicine, Ribeirão Preto – USP
Ribeirão Preto – SP, Brasil, 14040-900
Phone #: 55 16 3602-3212; fax #: 55 16 3602-3259
E-mail address: [email protected] (Isis C. Kettelhut)
Running title: Carbohydrate, lipid and protein metabolism in red tilapia
2
Abstract
Effect of fasting on carbohydrate, lipid and protein metabolism in red tilapia
(Oreochromis sp.).
The adaptive changes of carbohydrate, lipid and protein metabolism induced by 7, 15,
30, 60, 90, 150 and 200 days of fasting were investigated in red tilapia (Oreochromis sp.),
hybrid fish specie from sweet water Brazilian aquaculture system.
For this purpose, plasma levels of glucose, lactate and free fatty acids (FFA), liver and
muscle glycogen and total lipid content, rates of FFA release from mesenteric adipose tissue
(MAT) and muscle (protractor hyoidei) protein degradation were measured in these animals.
Plasma glucose levels remained constant until 90 days fasting, when glycemia was lower (50
± 5 mg/100mL) than fed values (74 ± 1 mg/100mL). These low values remained constant
until 200 days without food. The high content of liver glycogen (≈ 15%) in fed tilapias fell to
5% after 3 months starvation. After 60, 90 and 150 days starvation, plasma FFA levels
increased 49%, 64% and 98%, respectively, compared to fed values. In agreement with the
rise in plasma FFA, fasting induced a clear increase in lipolytic activity of MAT incubated “in
vitro”. Addition of IBMX (isobuthylmethylxanthine) and isoproterenol to the incubation
medium induced a reduction of lipolysis of fed and fasted fishes, differently to what are seen
in adipose tissue of mammals. Tilapia presented a fall on overall muscle protein degradation
after 60 days of fasting.
This may reflect an important metabolic adaptation to preserve muscle protein for
animal survival. After 3, 5 and 7 months starvation, however, proteolysis increased reaching
values similar to fed fishes, with a clear tendency to higher values after 200 days fasting.
Further experiments will be necessary to investigate the rates of proteolysis in other
kinds of muscle. The marked differences in the metabolic responses to prolonged periods
without food in fishes depend on species, food habits, season, age, sex, genetic background
and social structure.
Keywords: red tilapia, Oreochromis sp, proteolysis, lipolysis, fasting, mesenteric adipose
tissue, adrenergic agonists and antagonists
3
1. Introduction
Fishes use preferentially lipids and proteins as main source of energy, because carbohydrates are usually metabolized very slowly and not so well absorbed from the diet. The blood glucose levels remain constant for several days of fasting, only falling at long periods of fasting, with concomitant rise of FFA levels (NAGAY and IKEDA, 1972; COWEY et al., 1974; MACHADO, 1983; CUENCA e GALLEGO, 1987; BRAUGE et al., 1994 e HUNG e STOREBAKKEN, 1994). This adaptation of several species of fishes on long periods of fasting is explained by use of glucose originated from hepatic glycogenolysis and gluconeogenesis and by amino acids from skeletal muscle protein catabolism for glucose production energy supply (MACHADO, 1983). There is a great variation of plasma glucose levels in fishes, showing values between 40 to 160 mg/% depending on species (HEPHER, 1988), with values between 60-160 mg/mL in fed state and 40-100 mg/ml in fasting (MACHADO, 1983).
The blood glucose levels in rainbow trout (Oncorhyncus mykiss) is approximately 63 mg/10mL before food ingestion, reaching values of 250 mg/10 mL in postprandial pattern, returning to the fasting levels only 30 hours after food ingestion (BRAUGE et al., 1994). In traira (Hoplias malabaricus), another carnivorous fish, glycemia is also 63 mg/100mL and maintain constant without food, a decrease is observed only in prolonged fasting periods of 60 – 90 days. In this fish, fall of glycemia is followed by an increase of plasma FFA levels, which is the main energetic substrate used by fish red muscle (MACHADO, 1983).
The insulin plasma levels in the fishes may vary from 4 to 24 ng/mL depending on species and its regulation during the annual cycle (MURAT et al., 1981; GUTIÉRREZ et al., 1987; GUTIÉRREZ et al., 1988; HEPHER, 1988; GUTIÉRREZ et al., 1993; YOUSON et al., 1994 e LE BAIL e BOEUF, 1997). Insulin has in fishes the same physiological actions as in mammals; promote decrease in glycemia, decrease FFA mobilization and increase in muscle glycogen (OTTOLENGUI et al., 1982 e MACHADO, 1983).
Information about the mechanisms involved in the control of adipose tissue activity in teleosts is fragmentary, despite the presence of appreciable amounts of organized fat tissue in many species (MIGLIORINI et al., 1992). The lipids are found scattered in hepatic tissue, muscle (main red muscle) and in mesenteric adipose tissue involving the gut, and has slow mobilization during long periods of fasting (HEPHER, 1988 e MACHADO, 1983).
4
The regulation of lipolysis in fishes has been studied for several decades and the participating of adrenoceptors in this process is still an intriguing and fascinating problem (FARKAS, 1967; MIGLIORINI et al., 1992; VAN DEN THILLART et al., 2001 and VIANEN et al., 2002). As recently described, the participation of beta-adrenoceptors in inhibition of lipolysis, indicate a novel phenomenon and suggest a different mechanism from that well described in mammals. Even in teleosts a wide variety of mechanisms has been described on the control of lipolysis depending on the species, food habits, sexual maturation, seasonal variations, age, environmental temperature and oxygen, social structure, and others. In other specie of tilapia (Oreochromis mossambicus) and in carp (Cyprinus carpio) beta1-adrenoceptors appear to inhibit lipolysis in adipose tissue and beta2-adrenoceptors appear to stimulate lipolysis. Also, recent work shows the participation of beta3-adrenoceptors in inhibition of FFA mobilization from adipose tissue in fish. Many studies were made to investigate whether in fish NE decreases lipolysis via direct activation of adipocyte alpha and/or beta-adrenoceptors. VAN RAAIJ et al. (1995), observed a fall in FFA by NE action in carp (Cyprinus carpio), MIGLIORINI et al. (1992) observed that catecholamines did not affect the release of FFA in wolf fish (Hoplias malabaricus), and FARKAS (1969) observed a slightly production of FFA in brean (Abramis brama). VIANEN et al. (2002) found that NE-induced reduction of FFA production in tilapia (Oreochromis mossambicus) adipocyte was not affected by the addition of phentolamine (alpha1- and alpha2-adrenoceptor antagonist), and VAN DEN THILLART et al. 2001 observed that in carp (Cyprinus carpio) alpha2-adrenoceptor antagonist antagonized the NE effect. Recent studies in our laboratory did not show any effect in lipolysis when mesenteric adipose tissue of red tilapia (Oreochromis sp) was incubated with alpha1- and alpha2- agonist and antagonist. Thus, the participation of alpha-adrenoceptors appears to be partially in some species, combined or absent in others.
Because this large number of controversial results, one of the objectives of this work was to investigate in red tilapia, the adaptation of this hybrid specie from sweet water Brazilian aquaculture systems to long periods of fasting, studying first, the FFA mobilization in vivo and secondly, the lipolytic response of the tilapia mesenteric adipose tissue “in vitro” to beta-adrenoceptors agonists and to inhibitors of cAMP phosphodiesterase.
There are a few studies about the regulation of skeletal muscle protein synthesis and degradation in fishes. The control of these processes is very important for caloric homeostasis, since the skeletal muscle represents about 60% of fish body weight (WALTON, 1987; HEPHER, 1988 e KETTELHUT, 1988 e LEGATE et al. 2001).
It has been demonstrated in mammal skeletal muscle the existence of at least 4 proteolytic pathways: a) lysossomal (catepsins); b) Ca++ dependent (calpains and calpastatin); c) ATP-ubiquitin-dependent (proteassome 20S and 26S); d) ATP-independent or residual system (KETTELHUT et al, 1988).
These proteolytic pathways have been studied in in vitro incubated skeletal muscle of rat and chick, in appropriated conditions with different buffers and specific inhibitors. The utilization of this technique for studying fish skeletal muscle protein metabolism is original and may allow a better comprehension of muscle protein turnover and its regulation in teleosts (KETTELHUT et al, 1988). Than, the other objective of this work was to investigate the effect of long periods of fasting on skeletal muscle overal protein degradation, using a small muscle containing tendons, which can be incubated in vitro and is adequate to evaluate the participation of the four known proteolytic pathways. As far as we know this is the first study in the literature with the proposal of investigating the effect of fasting on skeletal muscle protein degradation in fish.
Also, the quantification of levels of blood glucose, plasma lactate, glycogen and lipids in liver and muscle, could contribute for the knowledge of energy metabolism adaptation to starvation in this specie of fish.
5
2. Materials and Methods 2.1. Maintenance of experimental animals
Adult male red tilapias (Oreochromis sp), weighing 500g were supplied by Aquaculture Center, Usina São Geraldo Sertãozinho-SP-Brazil. Four witness-exemplary are deposited in Ictiology Laboratory of Ribeirão Preto – SP, University of São Paulo (LIRP 5887, 4ex., 205-227mm CP), Brazil. The fishes were acclimated in aquaria of 250L (10fishes/aquaria) with indoor recirculation system, equipped with a mechanical and biological filtration system, in 12:12h (light:dark) photoperiod, controlled temperature at 28oC for at least two weeks before experiments. One group of fishes was daily fed with commercial pelleted fish food – Laguna, 10mm diameter (protein: 28%; lipids: 6%; fibers: 10%; minerals: 9%; Ca++: 3%; P: 0,5%; moisture: 8%) (2% of body weigh per day), and other groups were kept without food for 7, 15, 30, 60, 90, 150 and 200 days. The water of this system was maintained with ~5mg O2/L and pH ~7. All the experiments were done between 8:00-10:00h and the animals were obtained throughout the year. The fishes were killed by rapid spinal transection at cervical level and the tissues (muscle protractor hyoidei and mesenteric adipose tissue) for the in vitro incubation experiments were dissected free from connective tissue and blood vessels. Liver and white muscle fragments removed from left side of body fish at the anal fin were taken to quantify glycogen and total lipids content (CARROL et al.,1956 and gravimetric method respectively). Blood samples were collected from the caudal vein into ice-cooled, heparin-flushed syringes that were placed immediately on ice. Blood glucose, lactate and free fatty acids (FFA) plasma levels were determined following methods described by BERGMEYER et al. (1974); CLARK et al. (1984) and DOLE et al. (1960), respectively. 2.2. Mesenteric adipose tissue collection and in vitro incubation procedure After spinal transection the gastrointestinal tract was removed and samples of mesenteric adipose tissue (MAT) were rapidly removed and portions of 5-20g/fish were obtained. The adipose tissue was placed immediately into a Petri dish with Krebs-Henseleit buffer at room temperature, and carefully cut with small scissors and sharp lamina to obtain pieces of ~2-5mm2. After cutting, portions of ~500mg were incubated for 2h at 37oC in 5 mL of Krebs-Henseleit buffer (in mM: 118,5 NaCl; 4,75 KCl; 1,2 MgSO4.7H2O; 1,91 CaCl2.2H2O; 1,2 KH2PO4; 25 NaHCO3; 0,5 D-glucose) containing 2% free fatty acid BSA (bovine serum albumin) and equilibrated with 95% O2 :5% CO2. Tissues were incubated in constant shaking waterbath, and triplicate flasks were run at each test. Other additions to the incubation medium are indicated in the legends to the individual figures. At the end of the experimental period aliquots of the incubation medium were taken for measurement of FFA concentration according DOLE and MEINERTZ (1960). 2.2. Muscle protractor hyoidei excision and incubation procedure
The muscle is associated to important mouth movements related to the hyoid-suspensorial system that permit a fast suction feeding. The work of this muscle allows for a maximal increase in the volume of the mouth cavity for suction (AERTS, 1991; ADRIENS and VERRAES, 1998; DIOGO et al., 2004; and VANDERVALLE et al., 2005)
The submandibular muscles protractor hyoidei of the fishes were carefully and rapidly dissected, and incubated at resting length by pinning their tendons on acrylic support in Krebs-Ringer bicarbonate buffer, pH 7,4, 37oC, equilibrated with 95%O2 :5%CO2, containing glucose (5mM) and in presence of cycloheximide (0,5mM) to prevent protein synthesis and
6
the reincorporation of amino acids back into proteins. After one hour of equilibration period, tissues were incubated for 2h in fresh medium of identical composition. 2.3. Measurement of rates of protein degradation
Rates of protein degradation are measured by tyrosine release of incubated muscles. Because muscle cannot synthesize or degrade tyrosine, its release reflects the rate of protein breakdown, and this amino acid can be easily quantified by a fluorimetric method of WAALKES and UDENFRIEND (1957).
The rate of total proteolysis which probably reflects the activity of at least 4 proteolytic systems, known to exist in muscles of mammals (lysosomal, Ca2+-dependent, ATP-ubiquitin-dependent and ATP-independent) was determined by measuring the rate of tyrosine release from muscles incubated in the absence of any protease inhibitor.
In muscles maintained at resting length in the presence of insulin, methylamine and amino acids (which inhibits lysossomal proteolysis), most protein breakdown occurs by a non- lysosomal and Ca2+-independet process that requires ATP (KETEELHUT et al., 1988). To measure the ATP-dependent and energy-independent processes muscles were first incubated under conditions that prevent activation of the lysosomal and Ca2+-dependent proteolytic systems, by use of Ca2+-free medium and different inhibitors, including methylamine, insulin and branched chain amino acids (KETEELHUT et al., 1988). The proteolytic activity measured in contralateral muscles incubated with dinitrofenol MG 132 (20mM), an aldehyde peptide which inhibit proteassome activity) must represent an ATP-independent proteolytic process (KETEELHUT et al., 1988 and ROCK et al., 1994). This difference between the two contralateral muscles reflects the activity of the ATP-dependent proteolytic system. 2.5. Chemicals Bovine serum albumin (fraction V, essentially free of FFA), 3- isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), isoproterenol (ISO), MG 132 and all the substances used in the assays were purchased from Sigma Chemical, St Louis, MO. Other chemicals were of analytical grade.
2.6. Statistical analysis
Student’s paired t-test was used for comparison between contralateral submandibular muscles of the same fish and Student’s unpaired t-test for the different groups of fishes.
The results of lipolysis were analyzed by a two-way analysis of variance. P<0,05 was taken as the criterion of significance and the data are presented as means ± SEM.
7
3. Results
3.1. Effects of fasting on morphological parameters and tissues weight
No significant differences were found in body weight but were observed a rise in
standard length in fasted fishes (from 30 to 200 days fasting) (Figs. 1A and 1B) compared to fed animal at the day of experiments. After 30 days fasting until 200 days without food a significant fall in the condition factor was observed (Fig. 1C). Although all the groups of fishes submitted to different periods of fasting show similar body weight at the day of experiments, it is worthy to emphasize that the initial body weight were different at the beginning of experiments, and a clear reduction of this parameter occurred during the long period without food.
Fasting for 7 days induced a significant decrease in liver weight and in hepatosomatic index, which values continue to fall until 30 days without food, remaining constant for 7 months (Figs. 2A and 2B).
Gonads weight and gonadosomatic index are not significantly different in all periods of experiment (Fig 2C and D). Fasting for 7 until 200 days induced a significant and similar decrease in stomach and gut weight and in their somatic index in comparison to fed animals (Fig. 2E and 2F).
The mesenteric fat mass and its somatic index decreased after 60 days fasting, reaching values still lower after 200 days without food. No change in adipose tissue mass of swimbladder neither in its somatic index was observed in all periods of the experiment (Fig. 3). 3.2. Effect of fasting on metabolites levels
Plasma glucose levels of fed fishes (74 ±1) did not change until 60 days fasting. Only
after 90 days fasting the values of glycemia decreased significantly (approximately 25%), which remained low and constant until 200 days without food (50 ± 5 mg/100mL) (Fig. 4). Fasting of 60, 90 and 150 days provided an increase of 49, 64 and 90% in FFA plasma levels, respectively (Fig. 4). The lactate plasma levels of fed fishes did not change significantly during the different periods without food, ranging from 0,530 ± 0,036 (fed) to 0,716 ± 0,059 µmol/mL (200 days of fasting). 3.3. Glycogen and total lipids content in liver and muscle of tilapia
High content of liver glycogen was identified in fed tilapias (15,0 ± 0,4%), decreasing approximately 40% after 7 days fasting (Table 1). These values remained constant until 60 days without food. After 90 to 200 days fasting the content of liver glycogen fell to values 55% lower than fed state (6,8%). It is interesting to note that these values are relatively high when compared with those found in mammals. Usually liver glycogen content in fed mammals is around 5% and fell almost 95% after 24 and 48 hours fasting. Total lipids content in fed tilapia liver is also high (10,5 ± 0,4%) and increases twice when these fishes are submitted to 3 months fasting (Table 1), remaining constant until 7 months without food. No change is observed in total lipids content in tilapia muscle until 60 days fasting (3,1 ± 0,3%); the values remain constant and similar to fed condition (4,1 ± 0,3%) (Table 1). A significant decrease of muscle lipid content was only observed after 90 days (2,7%), which continues falling until 200 days without food (1,5%). Muscle glycogen content is low in tilapia (~0,5%)
8
when compared to mammals and fell to values significantly smaller after 60 and 90 days without food (~0,30%) (Table 1). 3.4. Effect of fasting on mesenteric adipose tissue lipolysis “in vitro”
FFA mobilization from fragments of adipose tissue of tilapias fasted for 60 to 200 days was higher than FFA release from adipose tissue of fed and 7, 15 or 30 days fasted fishes (Fig. 5). Similar results were found in the absence or in the presence of isobutylmethylxanthine (IBMX) (except after 200 days) or isoproterenol (ISO).
Fragments of mesenteric adipose tissue of tilapias incubated in the presence of IBMX, an inhibitor of a cAMP-phosphodiesterase or in the presence of isoproterenol, a non-selective beta-adrenoceptor agonist, showed a significant decrease in FFA release to incubation medium (Fig. 5). The inhibition of lipolytic rate after incubation of adipose tissue with these two agents was clearly observed in MAT of fishes fasted for 30 to 200 days (Fig. 5). Recent studies from our laboratory have found that alpha1 and alpha2 adrenergic receptor agonists and antagonists incubated with tilapia MAT (fed or fasted) did not show any effect on lipolysis. However the addition of dibutyril-cAMP (10-3M) to the incubation medium promotes a surprising fall of lipolysis (2,280 ± 0,129 without cAMP versus 1,087 ± 0,107 mmol AGL/g MAT.2h with cAMP). This effect was only observed in fasted tilapias. 3.5. Effect of fasting on the rates of muscle protein degradation
The overall rate of protein degradation in muscle protractor hyoidei of fed tilapias was 0,193 ± 0,004 nmol tyrosine/mg.2h. By 30 days fasting, total proteolysis was still high, but there was a significant decrease (21%) in the rates of total muscle proteolysis in tilapias after 60 days without food. The rates of tyrosine release increased after 90, 150 and 200 days reaching values similar to fed animals (Fig. 6).
Figure 7 show that the ATP-proteasome proteolytic pathway participates of total muscle protein breakdown of red tilapia in fed and fasted periods. Lower rates of ATP-proteasome proteolytic activity was also seen after 60 days without food, reaching values similar to fed fishes only after 7 months fasting. The values of proteasome independent proteolitic component are presented in Fig. 8, which are lower than fed values in all fasted periods. Preliminary studies from our laboratory show that the calcium dependent and lysosomal proteolytic systems have very low activity in this kind of muscle and in this fish specie in all nutritional conditions studied. Further experiments should be done to clarify the role of these proteolytic systems in other kinds of muscle.
9
4. Discussion 4.1. Morphological parameters The morphological parameters data were used to verify the uniformity of the fishes used in experiments even during different periods of fasting. The cond ition factor reflects the recent feeding condition or the waste of energy reserves in cyclical activities. Changes in these values indicate alterations in the nutritional conditions of animals. Only after prolonged periods without food was observed a fall in the condition factor values. These data agree with other studies carried out with tilapias (Oreochromis mossambicus) and "catfish" (Ictalurus punctatus) that showed that when the food availability is low, the condition factor generally is also low (BRUTON and ALLANSON, 1974; VAZZOLER, 1996; UCHIDA et al., 2003 and PETERSON et al., 2004).
The decrease of liver weight and hepatosomatic index after 7 days fasting corroborates with ALBALAT et al., (2005) findings, that food deprivation significantly affects the metabolic status of fishes. The period of 7 days fasting was also enough to completely empty the gut of the tilapias. These values agree with the data of FIGUEIREDO-GARUTTI, et al. (2002) in "brycon" (Brycon cephalus), where the stomach somatic index fell 11% after 24h and the gut somatic index fell 40% after 72h fasting, remaining constant during 15 days without food. The gut atrophy observed in red tilápias submitted to prolonged periods of fasting (60 to 200 days) also suggests that this tissue can be mobilized to supply substrate to energy metabolism. 4.2. Plasma and tissue metabolic parameters The response of fishes to fasting is characterized by a sequential utilization of glycogen, lipid and protein reserves (COLLINS and ANDERSON, 1995). It has been reported that a fasting of 3 days is enough to induce a decrease in the liver glycogen of Brycon cephalus (FIGUEIREDO-GARUTTI et al., 2002). In the present study, hepatic glycogen reserves were reduced in 7 days fasted fish. The fall of hepatic glycogen content after fasting periods is accompanied by reduction of hepatosomatic index in prolonged fasting periods. This pattern may reflect the mobilization of glycogen to replace the absence of dietary carbohydrate intake accompanied by a re-adjustment of the set point for plasma glucose levels. Beside lower plasma glucose levels may be tolerated because of the increased utilization of lipid in fasted fish, and the glycemia was kept constant and similar to fed fish levels until 60 days fasting, the lipids utilization is reflected by the elevation of plasma FFA levels within 60, 90 and 150 days of food restriction. Elevated plasma FFA levels are a characteristic marker of food withdrawal in fish (FARBRIDGE and LEATHERLAND, 1992a, b) in (POTTINGUER et al., 2003). The observed rise in plasma FFA in the present study suggests a mobilization of lipid reserves, which is followed by the reduction of mesenteric fat tissue weight after long period of fasting. Beside this, an increase of plasma FFA may be followed by an increase of glycerol, which can be used as substrate for gluconeogenesis (FIGUEIREDO-GARUTTI et al., 2004).
A significant reduction of glycemia in tilapias only occurs after 90 days fasting, remaining constant until 200 days without food ingestion. During this period, was observed the rise of FFA plasma levels, as well as its probable use for peripheral tissue, promoting a reduction of the peripheral use of the glucose. The probable increase of glycerol release (which is gluconeogenic substrate), as a result of the rise of lipolysis rate, could contribute for maintenance of glycemia. Also the amino acids mobilized from peripheral tissues, like white
10
muscle during fasting, are precursors of gluconeogenesis (JØRGERNSEN et al., 2002) and can explain the maintenance of tilapias glycemia. Although it was not observed (in the present work) alteration in the rates of muscle protein breakdown until 60 days without food, it would be interesting to consider that the muscle (protractor hyoidei) used in "in vitro" incubation experiments have special functions related to swallow and breath and probably it does not represent an important skeletal muscle for energy metabolism. The maintenance of glycemia during fasting is related directly with the capacity of hepatic glycogen mobilization, mainly during the initial period of fasting, and also depends on the activation hepatic gluconeogenesis and the reduction of the glucose use (MOON and FOSTER, 1995).
The plasma lactate level are low in tilapias and no difference was observed between fed and fasted fishes. Probably these results are due to low muscle glycogen content and a reduced capacity for anaerobic metabolism in food deprived periods in these animals. Similar results were found in other species of fishes like Artic charr (Salvelinus alpinus) in 140 days of fasting (JORGENSEN et al. 2002).
In tilapia occurs a higher lipolysis of mesenteric adipose tissue and consequent lipid storage in liver with increase of fasting period. This increase on lipolysis and FFA mobilization due to a prolonged period of fasting could be confirmed by the studies “in vitro” by incubation of tilapia mesenteric adipose tissue. 4.3. Effect of fasting on “in vitro” lipolysis of mesenteric adipose tissue
FFA mobilization from 60 days fasted fishes (2,449 ± 0,157 µmol FFA/g MAT.2h) was almost 2 times higher than in fed fishes (1,314 ± 0,049 µmol FFA/g MAT.2h). In contrast, LEWIS and EPPLE (1984), studying eels (Anguilla rostrata) fasted for 6 months, did not find significant alterations in serum glucose, liver and muscle glycogen, liver and muscle +FA and abdominal fat stores compared with fed fishes. These data show the wide different metabolic responses to prolonged periods without food depending on fish species, the nutritional conditions, weather, sex, habits, etc. Information about the mechanisms involved in the control of adipose tissue activity in teleosts is fragmentary, despite the presence of appreciable amounts of organized fat tissue in many species (MIGLIORINI et al., 1992). Adipose tissue is distributed in the abdominal cavity located periviscerally in many fishes species, including tilapia. Few studies have analyzed the morphology and distribution of adipose cells in visceral fat and muscle of tilapias. There are few studies about lipolitic activity in the fishes species when compared to mammals (ALBALAT et al., 2005).
Studies on the direct in vitro effects of fast-acting lipolytic hormones like, catecholamines and glucagon have shown that these hormones on adipose tissue from fish, amphibian and reptilian did not change FFA mobilization (MIGLIORINI et al. 1992 and FARKAS, 1967) and was corroborated with results of in vivo experiments in carp (VAN DEN THILLART et al. 2001). However, using isoproterenol(beta non-selective agonist) + ICI-118,551(beta2 antagonist) and isoproterenol + atenolol(beta1 agosnist), “in vivo” experiments promote, respectively, a fast decline and enhanced plasma FFA when infused in carp (VAN DEN THILLART et al. 2001), indicating that the plasma FFA levels are regulated by inhibitory beta1- and stimulatory beta2-adrenoceptors.
The data in the present work clearly show that the lipolitic activity of tilapia mesenteric adipose tissue “in vitro” increase after 60 days of fasting, which agree with our results “in vivo” and with ALBALAT et al. (2005) in seabream (Sparus aurata) after 11 days of fasting. Thus, in agreement with the increase in plasma FFA there was a clear increase in lipolytic activity of mesenteric adipose tissue incubated “in vitro” from fasted tilapia, indicating a significant contribution of this visceral adipose tissue to lipid mobilization.
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The data presented by MIGLIORINI et al. (1992) clearly show that the lipolitic activity of toad, fish and snake adipose tissue in vitro is markedly increased in the presence of cAMP or xanthine derivatives, which have been shown to inhibit phosphodiesterase and increase the intracellular concentration of cAMP in mammalian adipocytes, but not in the presence of lipolytic hormones, like glucagon and epinephrine. Preliminary results from our laboratory indicate that isoproterenol, a specific beta-adrenergic agonist, is ineffective in fish (Hoplias malabaricus), toad and snake adipose tissue. However, further experiments with selective adrenergic agonists and antagonists are needed to clarify this point.
Recently, studies in our laboratory performed in tilapias adipose tissue fragments, showed no response of this tissue to hormones and other drugs such as catecholamines, prazosin, phenilephrine, forskoline, adenosine deaminase, yohimbine, sodium fluorite and some of their combinations.
Figure 5 show the results of FFA released to the incubation medium from mesenteric adipose tissue of fed and fasted tilapia. Comparing the isolated effect of known lipolytic agents (for mammals) such IBMX and ISO, in FFA release from MAT of fed and fasted 7, 30, 60, 90, 150 and 200 days tilapias, it was observed that the released FFA values are not different between IBMX and ISO, but the presence of these drugs, promote a significant decrease in FFA released to the medium in all the situations when compared to the lipomobilization observed in their absence (Fig. 5). It is not known the reason for these drugs show a higher effect in inhibiting lipolysis in 30 to 200 days fasted tilapias, neither the reason of the effect of prolonged fasting (more than 60 days) in increasing lipolysis be higher than the effect of ISO and IBMX in inhibiting this lipolytic process. To answer these questions further “in vitro” experiments must be carried out.
The regulation of lipolysis in fishes is an intriguing problem. The involvement of beta adrenoceptors in inhibition of lipolysis as described by VAN DEN THILLART et al. (2001) and VIANEN et al. (2002), is a novel phenomenon and suggests a mechanism different from the well-described mammalian system. For analysis of this mechanism it is necessary to carry out “in vitro” experiments with different adipose tissues stores or isolated adipocytes from different deposits incubated in the presence of a variety of alpha and beta agonists and antagonists.
To elucidate the mechanism of lipolysis inhibition in adipose tissue in tilapia “in vitro” studies were made by VIANEN et al. (2002), using nonseletive beta-agonists and beta 1, 2 e 3 agonists. These authors, observed that the lipolysis in this tissue is mediated by beta3-adrenoceptors. Our results corroborates with VIANEN et al that suggest that in tilapia beta-adrenoceptors are involved in the reduction of lipolysis. Further experiments using beta3-adrenoceptors agonists and antagonists should be done to clarify the physiological importance of these findings. What is the physiological signal to promote FFA mobilization from adipose tissue deposits in fishes remains to be found.
The results about the “in vitro” mobilization of FFA in tilapia mesenteric adipose tissue on this work corroborate with the discussion above that alpha-adrenergic agonist and antagonist do not affect the lipolysis; that a nonseletive beta-adrenergic agonist, like isoproterenol, suppresses lipolysis, and disagree with observations of MIGLIORINI et al., (1992) that a phosphodiesterase inhibitor, like 3- isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), (which increase the intracellular concentration of cAMP), promote increase in lipolysis. IBMX and isoproterenol show an inhibitory effect on “in vitro” lipolysis in mesenteric adipose tissue of fed and fasted tilapias.
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4.4. Proteolysis
KETTELHUT et al. (1994), emphasize our limited knowledge about the control of muscle protein degradation.
“In vitro” studies with isolated muscles incubated “in vitro” have provided important new information about the changes in protein turnover in various physiological and pathological states and about the regulatory effects of individual hormones and nutritional conditions. This kind of study has no t been performed in fishes. Almost nothing is known about the control of rates of muscle protein degradation in these aquatic animals. A knowledge of the regulatory factors involved in the control of rates of protein degradation in chicks (NAVEGANTES et al., 2003), rats (KETTELHUT et al., 1994), and fishes (DIAS et al., 2004) is important for understanding the mechanism by which nutritional, hormonal, environmental and genetic factors influence growth and animal adaptation to several situations. An important adaptation to fasting is the mobilization of amino acids from body protein reserves, mainly in skeletal muscle, to support the energy requirements of the organism. An early event in fasting is the increased release of amino acids from skeletal muscle, which results from decreased protein synthesis and from a marked rise in muscle protein degradation. This appears essential in providing the organism with amino acids for gluconeogenesis. But during prolonged food restriction, protein breakdown in human or animal muscle decreases and may even fall below the rate observed in the fed state as reviewed by KETTELHUT et al., (1994). The results in tilapia presented in this work confirm a fall on muscle protein degradation only after 60 days of fasting. It may reflect an important metabolic adaptation, probably to preserve muscle protein for animal survival. But, in higher periods of fasting (90, 150 and 200 days), the rates of muscle protein degradation increase reaching values similar to those found in fed fishes. There is however a clear tendency of higher proteolysis after 7 months without food. Probably in this fish specie an increase in muscle proteolysis could be found in periods even longer of fasting. More experiments will be necessary to clarify this point. Also it will be interesting to investigate the rates of proteolysis in other kind of muscle. No significant activity of lysosomal or calcium-dependent proteolitic processes was found in tilapia protractor hioidei muscle in any nutritional condition stud ied.
Despite of purification and characterization of proteasoma 20S e 26S in fish muscle (BUSCONI et al., 1992; STOKNES and RUSTAD, 1995; and SANCHES et al., 1995), little is known about this enzymatic process in muscle tilapias. LADRAT et al. (2000) described the involvement of this enzyme on fish miofibrillars protein degradation. In tilapias muscle protractor hyoidei, proteasome has low, but significant participation on protein degradation in fed and fasted periods. The activity of this system follows the variations of overall protein degradation during all the nutritional periods. Probably the reduction of proteasome-dependent proteolytic system activity after 60 days fasting is the main responsible for the decrease in overall muscle protein degradation during these prolonged periods without food and may represent an important adaptation to preserve muscle mass in these situations. In summary, differences in species, sex, and acclimation condition of fishes are likely to contribute to variability between studies reported in the literature. The results of the present work suggest that in tilapia the metabolic adjustment to fasting is characterized by a sequential utilization of glycogen, lipid and protein reserves. In this specie the increase of fasting period lead to a higher lipolysis in mesenteric adipose tissue and consequent lipid storage in liver. In agreement with the increase in plasma FFA there was a clear increase in lipolytic activity of mesenteric adipose tissue incubated “in vitro” from fasted tilapia, indicating a significant contribution of this tissue to lipid mobilization, that was different from others species like eels (Anguilla rostrata) and from seabream (Sparus aurata) in different
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periods of fasting. The “in vitro” experiments the incubation with beta-agonist (IBMX and Isoproterenol) also show that in tilapia these drugs reduced the lipolysis of fed and fasted fishes, corroborating with other studies. Tilapia presented a fall on muscle protein degradation only after 60 days of fasting. It may reflect an important metabolic adaptation, probably to preserve muscle protein for animal survival. But, after prolonged periods of fasting (90, 150 and 200 days), the rates of muscle protein degradation increase reaching values similar to those found in fed fishes. There is however a clear tendency of higher proteolysis after 7 months without food. More experiments will be necessary to clarify this point. Also it will be interesting to investigate the rates of proteolysis in other kind of muscle. The wide difference of metabolic responses to prolonged periods of food withdrawal found in the literature depends on fish species, nutritional condition, food habits, season variation, age, sex, sexual maturation, habits, environmental temperature and oxygen and social structure. Acknowledgments The authors thank Elza Aparecida Filippin, Maria Antonieta R. Garófalo, and Victor Diaz Galban for technical assistance. This work was supported by grants from the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) and from Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq). During this study, W. Dias Jr received a fellowship from CNPq.
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Figure 1: A) Body weight (BW); B) Standard length (SL); C) Condition factor ((BW/SL3).100); of fed and fasted red tilapias (Oreochromis sp). Transversal lines represent each group mean.
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Figure 2: A) Hepatic tissue weight; B) Hepatosomatic index; C) Gonads weight; D) Gonadosomatic index; E) Stomach and gut weight; F) Stomach and gut somatic index; of fed and fasted red tilapias (Oreochromis sp). Transversal lines represent each group mean. Tissue somatic index = (tissue weight x 100)/body weight.
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Figure 3: A) Mesenteric adipose tissue weight; B) Mesenteric adipose tissue somatic index; C) Swimbladder adipose tissue weight; D) Swimbladder adipose tissue somatic index; of fed and fasted red tilapias (Oreochromis sp). Transversal lines represent each group mean. Tissue somatic index = (tissue weight x 100)/body weight.
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40
50
Fed 7 15 30 60 90 150 200 Fasted (days)
Mes
ente
ric a
dipo
se ti
ssue
(g)
A
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
Fed 7 15 30 60 90 150 200
Fasted (days)
Sw
imbl
adde
r ad
ipos
e tis
sue
som
atic
inde
x (g
/100
g P
C)
D
0
2
4
6
8
10
12
Fed 7 15 30 60 90 150 200
Fasted (days)
Sw
imbl
adde
rad
ipos
e tis
sue
(g)
C
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Fed 7 15 30 60 90 150 200
Mes
ente
ric a
dipo
se ti
ssue
som
atic
inde
x (g
/100
g B
W)
Fasted (days)
B
21
Figure 4: Plasma metabolic parameters of fed and fasted red tilapia (Oreochromis sp). A) Glycemia; B) Free fatty acids. Values are means ± SEM. * (P<0,05) vs fed.
0
40
45
50
55
60
65
70
75
80
**
A
*
Fed 7 15 30 60 90 150 200
Gly
cem
ia (
mg/
100m
L)
Fasted (days)
0,00
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80B
*
*
*
Fed 7 15 30 60 90 150 200
Fre
e F
atty
Aci
ds (
µmol
/mL)
Fasted (days)
22
Table 1: Hepatic and muscle glycogen and total lipids of fed and fasted red tilapias (Oreochromis sp).
Values represent mean ± standard error. Parentheses values represent the number of utilized animals. * (P<0,05) vs fed.
Glycogen (%) Total Lipid (%)
Hepatic Muscle Hepatic Muscle
Fed
15,0 ± 0,4 (127)
0,52 ± 0,03 (131)
10,5 ± 0,4 (143)
4,1 ± 0,3 (36)
7
9,1 ± 1,0* (12)
0,51 ± 0,06 (10)
12,3 ± 0,98 (18)
3,8 ± 0,3 (17)
15
8,3 ± 0,9* (17)
0,48 ± 0,05 (16)
14,6 ± 1,7* (16)
3,3 ± 0,4 (15)
30
7,8 ± 0,5* (39)
0,49 ± 0,03 (37)
16,1 ± 0,6* (27)
3,5 ± 0,2 (29)
60
7,4 ± 0,8* (15)
0,30 ± 0,03* (20)
14,1 ± 1,0* (20)
3,1 ± 0,3 (21)
90
5,9 ± 0,4* (25)
0,31 ± 0,03* (20)
21,3 ± 1,0* (23)
2,7 ± 0,2* (23)
150
6,7 ± 0,6* (12)
0,40 ± 0,04 (13)
22,1 ± 3,3* (13)
2,2 ± 0,3* (13)
Fasted (days)
200
6,8 ± 0,5* (10)
0,40 ± 0,05 (8)
21,0 ± 2,0* (9)
1,5 ± 0,1* (9)
23
Figure 5: FFA mobilization (µmol FFA/g MAT.2h) from mesenteric adipose tissue of red tilapia (Oreochromis sp) to the incubation medium in basal condition (¦ ) and in the presence of IBMX (?) and ISO (? ), of fed and fasted animals. * (P<0,05) vs basal; #(P<0,05) vs fed. Values are mean ± SEM.
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5 A
##
#
*
*
*
**
#
#
##
Fed 7 15 30 60 90 150 200
FF
A M
obili
zatio
n(µ
mol
FF
A/g
MA
T.2
h)
Fasted (days)
BASAL IBMX
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5B
#
##
#
#
***
*
#
#
#
*
Fed 7 15 30 60 90 150 200
FF
A M
obili
zatio
n(µ
mol
FF
A/g
MA
T.2
h)
Fasted (days)
BASAL ISO
24
Figure 6: Tyrosine release in incubation medium (nmol/mg.2h) of muscle protractor hyoidei of fed and fasted red tilapias (Oreochromis sp). Bars are mean ± SEM (n=10) of muscle total proteolysis. Values are mean ± SEM. *(P<0,05) vs fed. Figure 7: Tyrosine released in incubation medium (nmol/mg.2h) of muscle protractor hyoidei of fed and fasted red tilapias (Oreochromis sp). Bars are mean ± SEM (n=10) of muscle proteasome-dependent component. *(P<0,05) vs fed.
0,00
0,14
0,15
0,16
0,17
0,18
0,19
0,20
0,21
0,22
0,23TOTAL PROTEOLYSIS
*
Fed 7 15 30 60 90 150 200
Tyr
rel
ease
in in
cuba
tion
med
ium
(nm
ol/m
g.2h
)
Fasted (days)
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12PROTEASOME DEPENDENT PROTEOLYSYS
**
*
Fed 7 15 30 60 90 150 200
Tyr
rel
ease
in in
cuba
tion
med
ium
(nm
ol/m
g.2h
)
Fasted (days)
25
Figure 8: Tyrosine release in incubation medium (nmol/mg.2h) of muscle protractor hyoidei of fed and fasted red tilapias (Oreochromis sp). Bars are mean ± SEM (n=10) of muscle proteasome-independent component. *(P<0,05) vs fed.
0,00
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24PROTEASSOME INDEPENDENT PROTEOLYSIS
*
**
*
*
*
*
Fed 7 15 30 60 90 150 200
Tyr
rele
ase
in in
cuba
tion
med
ium
(nm
ol/m
g.2h
)
Fasted (days)
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