desnaturacao e identificaÇÃo quantitativa da proteina (aminoacido)

7/22/2019 desnaturacao E IDENTIFICAO QUANTITATIVA DA PROTEINA (AMINOACIDO)

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ROTEIRO DE PRTICA

DISCIPLINA Bioqumica

CURSO Unificada Semestre 2

TTULO DA AULA Protenas Reconhecimento de sua estrutura e desnaturao.

PROFESSOR Joo Paulo Cotrim

Materiais e Reagentes Quantidade1 Bquer de 150mL 82 Tubos de ensaio 20

3 Pipeta de Pasteur 154 Soluo de clara de ovo 50mL5 Soluo saturada de Sulfato de amnio

[(NH4)SO4]50mL

6 Soluo de cido tricloroactico 10% 50mL7 Soluo de uria 0,4 M pH 7,0 contendo o

indicador vermelho de fenol1

8 Urease 50mL9 cido Clordrico 10% 50mL10 Lamparina 50mL11 Acetona 50mL12 gua destilada 500mL

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1 DESNATURAO DA PROTEINA

As protenas (polmeros naturais de aminocidos condensados), formam cadeias polipeptdicas

longas, dispostas no espao de modos caractersticos. A sequncia dos aminocidos sempre igual,

com um nmero variado de combinaes possveis. As cadeias polipeptdicas esto enroladas em

forma de hlice ou ligadas lateralmente a outras cadeias formando folhas. As forasintermoleculares responsveis por estes arranjos conformacionais so, predominantemente, as

ligaes de hidrognio entre os grupos carbonilo, e os hidrognios do grupo amino.

Quando a protena deixa de exercer as suas funes, diz-se desnaturada. A desnaturao ocorre

quando os seus enrolamentos e agrupamentos caractersticos so desfeitos. Pode ser provocada

por agentes externos diversos - variao da temperatura, foras de cisalhamento ou valores de pH

extremos.

A albumina uma protena de alto valor biolgico presente na clara do ovo (protena maioritria),

no leite e no sangue. solvel em gua, moderadamente solvel em solues salinas e sofre

desnaturao por aco trmica. Possui propriedades antignicas que a tornam termo-estvel(resistente desnaturao trmica). Pode ser encontrada no plasma, diferindo das outras protenas

plasmticas por no ser glicosilada (no possui um resduo acar). A sua sntese est ligada ao


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fornecimento de aminocidos estruturais ao fgado e da a sua sensibilidade desnaturao

proteica.

1.1. Resultados experimentais

Reagentes /

Procedimento

Substncia

testadaObservaes

Aquecimento

com a lamparina

Clara de ovo

Entrou em ebulio; verificou-se uma diminuio do

volume da mistura e alterao para uma cor prxima

do branco.

Amostra Branco

Entrou em ebulio; verificou-se alterao para uma

cor prxima do branco mas no se verificou alterao

do volume da mistura.

H2SO4Clara de ovo O cido misturou-se com a clara de ovo.

Amostra Branco No se verificaram alteraes.

NaOHClara de ovo

O reagente dissolveu-se na clara de ovo e verificou-se

que o tubo aqueceu ligeiramente.


lcool etlico Clara de ovo A amostra ficou branca.



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1.2. Anlise dos resultados experimentais

No houve alterao em relao amostra-branco quando se adicionou hidrxido de

sdio a albumina no desnaturada pela adio de base (aumento de pH).

Aps a adio de cido sulfrico apenas se verificou um ligeiro aquecimento do tubo de

ensaio, relativamente amostra-branco

a albumina no desnaturada pela adio de

cido (diminuio de pH).

Aps o aquecimento da mistura verificou-se a desnaturao da protena a albumina

desnaturada pelo calor.

Aps a adio de lcool etlico, a mistura ficou esbranquiada, relativamente amostra-

branco (sem alteraes) a albumina desnaturada pela adio de lcool etlico.

2. AplicaesA bateria de testes aplicada tem como objetivos, verificar a desnaturao proteica por agentes

externos e determinar a presena de albumina. Este ltimo propsito do procedimento ser

importante como base para o estudo dos mtodos utilizados na determinao da presena desta

protena em materiais biolgicos diversos.

A albumina uma protena com um papel importante na alimentao pois fornece alguns

aminocidos essenciais, como a metionina e a cistena, fontes de enxofre. A monitorizao dos seus

nveis pertinente, nos alimentos como parte importante de uma dieta saudvel e no sangue como

um dos indicadores do estado de sade individual.

3. ConclusesCom esta experincia verificmos como reage a protena albumina ao calor e adio de cido, base

ou lcool, concluindo que se desnatura apenas com o calor e com o lcool.

Conhecido o aspeto da albumina desnaturada e reconhecida a sua reao diferenciada a agentes

desnaturantes, conclumos poder utilizar esta metodologia para determinar a sua presena

especfica numa mistura biolgica.

Os testes devero ser sempre realizados com as amostras biolgicas, uma amostra-branco (gua

destilada ou solvente orgnico sem azoto) e uma amostra-padro (albumina obtida da clara doovo), como forma de minimizar erros experimentais (falsos positivos e falsos negativos).

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1 MTODO DE BIURETO

IDENTIFICAO DA PROTEINA

Mtodo de biureto

O mtodo de biureto tem sido aplicado para determinar a concentrao de protenastotais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sanguneo, lquido crebro-


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espinhal, urina, alimentos, saliva, fibrinognio e tecido animal. O mtodo de biureto temsido, tambm, utilizado em anlise por injeo em fluxo, assim como em algunsmtodos cinticos. Apesar de ser rpido, utilizar reagentes de baixo custo e noapresentar grande variao da absortividade especfica para diferentes protenas, estemtodo no muito sensvel, como foi destacado por diversos autores, colocando-o emgrande desvantagem, em relao a outras metodologias, e por isto tem sido, ao longo

dos anos, substitudo por mtodos mais sensveis. Mesmo assim, o mtodo de biuretocontinua sendo recomendado para a determinao da concentrao de protenas totaisem plasma sanguneo pela Associao Americana de Anlises Clnicas e por diversosautores, bem como para a determinao de protenas totais em saliva e leite, quandocomparado com outros mtodos.

Ninhidrina um produto qumico usado para a deteco de amnia ou aminas primriase secundrias. Ao reagir com essas aminas livres, um de cor azul escuro ou roxoconhecido como Ruhemann de roxo evoludo. Ninhidrina mais comumente usadopara detectar impresses digitais, como aminas sobram de peptdeos e protenasaminas (terminal ou resduos de lisina) expelido das impresses digitais reagirem comninhidrina.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

A prtica foi realizada de forma que fosse possvel identificar e os aminocidos atravsda reao ou interao com ninhidrina. Dessa forma, utilizou-se o seguinte processo:pegou-se seis tubos de ensaio e em cada um adicionou-se as substncias (guadestilada, glicina 1%, prolina 1%, leucina 1%, aspartame 1% e leite), fora adicionado

com uma pipeta 1mL de cada uma das substncias no tubo, em seguida utilizando umaoutra pipeta, colocou-se cinco gotas de ninhidrina e homogeinezou-se bem, resultandoem uma substncia de colorao diferente, em seguida fora colocado todos os tubosem Banho Maria por trs minutos com um aquecimento em torno de 100 C, com umapina, retirou-se os tubos e verificou-se que as substancias foram alteradasvisualmente.

Aps o aquecimento de ambos os tubos de ensaio, observou-se que as soluesadquiriram colorao violeta, sendo esta mais intensa. Tendo em vista que tanto aglicina quanto a protena foram utilizadas com o mesmo volume, a diferena na

intensidade da colorao de ambas as amostras deve-se a maior superfcie de contatodo aminocido (glicina) que contm uma maior quantidade de grupamentos aminadisponveis para reao. Porm, isso no ocorre com a protena em funo da presenade ligaes peptdicas entre seus aminocidos, diminuindo assim, sua superfcie decontato. importante ressaltar que houve erro grosseiro no fornecimento de calor aostubos o que possivelmente influenciou a intensidade da cor.


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PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1 UREASE

As enzimas so protenas especializadas na catlise de reaes biolgicas. Elas esto entre as biomolculasmais notveis devido a sua extraordinria especificidade e poder cataltico, que so muito superiores aos doscatalisadores produzidos pelo homem. Praticamente todas as reaes que caracterizam o metabolismo celularso catalisadas por enzimas, sendo assim, consideradas as unidades funcionais do metabolismo celular.

A urease foi primeira enzima a ser purificada e cristalizada, um feito de James B. Sumner em 1926, numaaltura em que a maior parte dos cientistas acreditava ser impossvel cristalizar enzimas. A urease catalisa ahidrlise de ureia em dixido de carbono e amnia. Encontra-se principalmente em sementes, micro-organismos e invertebrados. Nas plantas, a urease um hexmero (consiste em seis cadeias idnticas) elocaliza-se no citoplasma. Em bactrias, constituda por duas ou trs subunidades diferentes. Para ser ativada,

a urease precisa ligar-se a dois ons nquel por subunidade.

2.3. Resultados Observados

Tabela 1. Resultado da mudana de cor do experimento I:

Tubos Ureia tamponada c/ indicador Urease gua destilada AGITAR Mudana de cor

1 3ml 3 gotas +

2 3ml 3 gotas -

Resultados e discusses

Procedimento A:No tubo que continha a soluo de urase percebeu-se uma colorao violeta apsadicionado o biureto, que um indicador prottico e cuja mudana de cor proveniente da reao indica a

presena de ligaes peptdicas no tubo com urase.

No tubo que trazia apenas gua e o biureto no apresentou mudana significativa de cor, permanecendo azulda cor do biureto,j que a soluo no apresentava ligaes peptdicas.

2.4. Discusso

A partir dos resultados obtidos na tabela 1, pode-se inferir que no tubo 1 houve mudana na cor da reaodevido a presena da ureia no meio, onde a mesma o substrato da urease. Com isso o produto final dessareao a amnia constatada pela mudana na colorao, pois ao ocorrer a reao CO(NH2)2+ H2O 2 NH3+ CO2h um aumento do pH e o indicador vermelho de fenol presente na soluo muda para uma tonalidadersea.

No entanto no tubo 2 no foi observado nenhuma mudana na colorao, visto que no mesmo s foiadicionado gua destilada e urease e com isso a enzima no pode ser ativada uma vez que o seu substrato

estava ausente na soluo. Por isto, com o tubo 2, pode-se ainda concluir a natureza da atividade da urase Xureia, sendo o tubo 2 um padro para o experimento.

Concluso


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As enzimas em geral tem uma aplicabilidade muito diversificada em vrios ramos da industria, pois soprotenas que permite uma interferncia na matria prima de forma desejvel e pratica.

Com a pratica realizada conclui-se que, para a aplicao de enzimas como em processos indstrias requertambm um total controle das condies e aplicao dos mtodos enzimticos, j que em condies extremascomo de pH, temperatura, e a presena de inibidores influencia significadamente no processo, na qualidade ena quantidade do produto.


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REFERENCIAS:

http://www.ebah.com.br/content/ABAAABlJ8AL/enzimas
http://www.ebah.com.br/content/ABAAABlJ8AL/enzimashttp://www.ebah.com.br/content/ABAAABlJ8AL/enzimashttp://www.ebah.com.br/content/ABAAABlJ8AL/enzimas


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7-Questes

1) Que so enzimas?

So protenas especializadas em reaes catalticas, que aceleram reaes qumicas.

2) Que reao catalisada pela urase?Ela catalisa a reao de hidrolise da uria.

3) Como pode ser evidenciada a natureza a natureza protica da enzima?

O biureto detecta a presena de ligaes peptdicas caractersticas de protenas, o que pode ser visualizado noexperimento A com a mudana de colorao.

4) Qual a fonte de urase utilizada nos experimentos?

No experimento a fonte de urase foi a soja.

5) Explique o uso do indicador cido-base vermelho de fenol no teste de atividade da enzima, qual ajustificativa para se empregar um tampo diludo na incubao para a medida da atividade de urase?

O vermelho de fenol um indicador cido-base utilizado para determinada variao de pH, no experimentofez-se necessrio a utilizao de uma soluo tampo para que o pH variasse moderadamente.

6) Explique o resultado obtido quando a enzima foi previamente fervida.

Com o aquecimento da enzima, a uma alta temperatura, ela desnaturou e perdeu sua atividade enzimtica.

7) Explique o resultado obtido no teste VI.

O cloreto de mercrio, como composto por um metal pesado, desativou a enzima.

desnaturacao e identificaÇÃo quantitativa da proteina (aminoacido)

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