alterações histológicas e nos marcadores do estresse...
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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
DIEGO JOSÉ CIFUENTES
Alterações Histológicas e nos Marcadores do Estresse Oxidativo em Animais com Osteoartrite Submetidos ao Treinamento Físico
CRICÍUMA, 2009
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DIEGO JOSÉ CIFUENTES
Alterações Histológicas e nos Marcadores do Estresse Oxidativo em Animais com Osteoartrite Submetidos ao Treinamento Físico
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do Titulo de Mestre em Ciências da Saúde. Orientador: Prof. Dr. Ricardo Aurino de Pinho
CRICÍUMA, 2009
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Dedico este trabalho a toda minha
família, principalmente a minha esposa
Cristine, meu filho Vitor, amigos,
professores e colegas que sempre
estiveram ao meu lado em todos os
momentos.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por ter me guiado por este caminho, me
ajudado a superar as dificuldades e ter chegado até aqui com êxito.
A minha esposa Cristine, pelo apoio emocional e financeiro, pelo amor,
carinho, paciência e compreensão durante essa trajetória.
A todas as pessoas que de uma forma direta ou indiretamente contribuíram
para a realização deste estudo.
De uma forma especial ao meu orientador professor Dr. Ricardo Aurino de
Pinho, pelos esclarecimentos, pelo incentivo e amizade.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício-
LAFIBE e Laboratório de Fisiopatologia Experimental-FISIOPAT (UNESC).
E ao grupo do Laboratório de Reparo Tecidual/Departamento de Histologia e
Embriologia/UERJ que participaram da construção deste trabalho.
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RESUMO
A osteoartrite (OA) é uma doença articular degenerativa que compromete
várias articulações, sua origem é multifatorial e seu tratamento envolve ações como a fisioterapia e o uso de medicamentos como AINES (antiinflamatórios não hormonais). Entre as modalidades fisioterapêuticas admite-se o exercício físico aeróbico como forma de tratamento apesar de não haver base científica suficiente para essa afirmação. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos produzidos pelo exercício aeróbico nas articulações osteoartríticas de ratos. As articulações dos joelhos de ratos wistar machos de 4 meses de idade foram infiltradas com iodoacetato de sódio para indução da osteoartrite química. Após 8 semanas de treinamento em esteira rolante, os animais foram mortos e o soro, o lavado articular e a cápsula articular foram utilizados para analisar o estresse oxidativo desses animais, além da histologia da articulação dos joelhos. Nossos resultados claramente demonstram que o exercício físico aeróbico diminuiu o dano oxidativo tanto sistemicamente, como visto no soro pela lipoperoxidação (OA= 1.588 ± 0201 nmol TBARS/mg proteina, OAE= 0.829 ± 0142 nmol TBARS/mg proteina, p<0.05), xilenol laranja (OA= 1.310 ± 0.153 nmol/mg proteina, OAE= 0.471 ± 0221 nmol/mg proteina, p<0.05), oxidação de proteínas (OA= 1,956 ± 0.333 nmol/mg proteina, OAE= 1.146 ± 0.253 nmol/mg proteina, p<0.05) e conteúdo total de tióis (OA= 4.621 ± 0.147 nmol/mg proteína, OAE= 7,175 ± 0,823 nmol/mg proteina) quanto localmente como observado no lavado (OA= 0.460 ± 0.281 nmol DTNB/mg proteína, OAE= 0.974 ± 0.123 nmol DTNB/mg protein, p< 0.05) e cápsula articular (OA= 13.895 ± 7.624 nmol DTNB/mg proteina, OAE= 38.654 ± 3.976 nmol DTNB/mg proteina, p< 0.05) pela maior preservação do conteúdo de tióis . A análise histológica evidenciou maior preservação de conteúdo da matriz através dos proteoglicanos. Concluímos que o exercício físico aeróbico de forma não intensa contribui para a preservação da cartilagem articular em articulações osteoartríticas de ratos, destacando o possível papel do exercício aeróbico como modalidade de tratamento para osteoartrite. Palavras-chave: osteoartrite; exercício físico; aeróbico; estresse oxidativo.
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ABSTRACT
Osteoarthritis (OA) is a degenerative joint disease that undertakes various joints, their origin is multifactorial and its treatment involves actions such as physiotherapy and the use of drugs such as NSAIDs. Among the methods physical therapy is admitted aerobic exercise as a form of treatment despite the absence of sufficient scientific basis for that statement. The purpose of this study was to evaluate the effects produced by aerobic exercise in osteoarthritic joints of rats. The joints of the knees of Wistar male rats of 4 months of age were infiltrated with iodoacetate sodium for induction ostearthritis chemistry. After 8 weeks of training on a treadmill, the animals were killed and serum and washed articulate were used to analyze the oxidative stress of these animals, besides the histology of the knee joint. Our results clearly show that aerobic exercise reduced the oxidative damage both systemically, as seen in the serum lipoperoxidation (OA = 1.588 ± 0.201 nmol TBARS/mg protein, OAE= 0.829 ± 0.142 nmol TBARS/mg protein, p <0.05), xylenol orange (OA= 1.310 ± 0.153 nmol/mg protein, OAE= 0.471 ± 0.221 nmol/mg protein, p <0.05), oxidation of proteins (OA= 1.956 ± 0.333 nmol/mg protein, OAE= 1.146 ± 0.253 nmol/mg protein, p <0.05) and total content of thiols (OA= 4.621 ± 0147 nmol/mg protein, OAE= 7.175 ± 0.823 nmol/mg protein) and locally as observed in the lavage (OA= 0.460 ± 0281 nmol DTNB/mg protein, OAE= 0.974 ± 0.123 nmol DTNB/mg protein, p <0.05) and joint capsule (OA= 13.895 ± 7.624 nmol DTNB/mg protein, OAE= 38.654 ± 3.976 nmol DTNB/mg protein, p <0.05) for greater preservation of content of thiols as locally as observed in the wash. The histological analysis showed greater preservation of content through the matrix of proteoglycans. We conclude that aerobic exercise not intense contributes to the preservation of osteoarthritic articular cartilage in joints of rats, highlighting the potential role of aerobic exercise as a method of treatment for osteoarthritis. Key words: osteoarthritis; physical exercise, aerobic; oxidative stress.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACAN- Agrecan (Gene)
ADM- Amplitude de Movimento
AINES- Antiinflamatório Não- Esteroidal
AVD`s- Atividades de Vida Diária
COL2α1- Colágeno II (Gene)
DNPH- Dinitrofenilhidrazina
DTNB- Ácido 5,5-Ditiobis (2- Nitrobenzóico)
EDTA- Ácido Etilenodiamino Tetraacético
EROs- Espécies Reativas de Oxigênio
FISIOPAT - Laboratório de Fisiopatologia Experimental
FOXO- Oxidação do Ferro em Xilenol Laranja
GAG- Glicosaminoglicanos
GR- Glutationa-Redutase
GSH- Glutationa Reduzida
GSH-Px- Glutationa-Peroxidase
H2O2- Peróxido de Hidrogênio
IAL- Lavado Intra-Articular
IALF- Fluido do Lavado Intra-Articular
IGF-1- Fator de Crescimento Semelhante a Insulina
IL- 4- Interleucina-4
IL-1- Interleucina-1
IL-13- Interleucina-13
LAFIBE- Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício
MDA- Malondialdeído
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MMPs- Metaloproteases
MPO- Mieloperoxidase
NaCl- Cloreto de Sódio
NADPH - Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato
NF-kB - Fator de Transcrição Nuclear kB
NO- Óxido Nítrico
O2¯˙- Ânion Superóxido
OA- Osteoartrite
OAE- Grupo osteoartrite + exercício
OH˙- Radical Hidroxila
OMS- Organização Mundial de Saúde
PBS- Tampão Fosfato Salino
RNAm- Ácido Ribonucléico Mensageiro
ROOH- Hidroperóxidos
SH- Sulfidrila
SOD- Superóxido-Dismutase
SPSS- Pacote Estatístico para Ciências Sociais
TBARS- Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
TGF-β- Fator de Transformação do Crescimento
TIMPs- Inibidores Tissulares de Metaloproteases
TNF- Factor de Necrose Tumoral
UERJ- Universidade Estadual do Rio de Janeiro
UNESC- Universidade do Extremo Sul Catarinense
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SUMÁRIO
Capítulo I I- Introdução.....................................................................................................10 II- Fundamentação Teórica.............................................................................12 2.1- Conceituação da Osteoartrite.................................................................12 2.2- Patogênese da Osteoartrite....................................................................19 III- Objetivos....................................................................................................25 3.1- Objetivo Geral..........................................................................................25 3.2- Objetivos Específicos.............................................................................25
Capítulo II IV- Artigos........................................................................................................26 4.1- Artigo 1.....................................................................................................26 4.2- Artigo 2.....................................................................................................43
Capítulo III
V- Discussão...................................................................................................70 VI- Conclusão, Considerações Gerais e Perspectivas................................75 VII- Referências Bibliográficas......................................................................76
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Capítulo I I- INTRODUÇÃO
A Osteoartrite OA é, sem dúvida, a afecção mais freqüente do sistema
músculo-esquelético e a que mais está relacionada com o envelhecimento biológico
e pode ser secundária a outros eventos (Scott et al., 1998; Vad et al., 2002).
É uma condição comum que afeta milhões de pessoas anualmente. Ela ocupa
o terceiro lugar na lista dos segurados da Previdência Social, que corresponde a
65% das causas de incapacidade, que recebem auxílio-doença, sendo apenas
superada pelas doenças mentais e cardiovasculares segundo dados do Ministério da
Saúde. Apresenta-se como resultado da interação de várias causas e modelos
clínicos e não como entidade nosológica isolada (Vad et al., 2002). É uma das
principais causas de dor e incapacidade funcional gerando enorme carga econômica
para a comunidade, tanto em gastos médicos como sociais, sendo grande causa de
afastamento do trabalho (Kellgren, 1979; Novaes, 1997). Além da dor, há diminuição
importante da amplitude de movimento (ADM) e da força muscular, que acarreta
limitação funcional interferindo nas atividades de vida diária (AVD’s) (Marques et al.,
1998). Uma vez lesionada, a cartilagem articular tem uma habilidade limitada para o
reparo e este é o maior fator limitante no sucesso da reabilitação depois de uma
injúria articular (Little et al., 1997).
Até os tempos atuais não foi encontrada a cura para a osteoartrite, entretanto
as terapias utilizadas pela fisioterapia visam controlar os sintomas, minimizar as
desabilidades, prevenir possíveis complicações, reduzir a progressão da destruição
da articulação e propiciar aos pacientes continuar suas atividades com mínimas
deficiências sociais e funcionais (Scott et al., 1998).
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Entre os possíveis tratamentos incruentos da OA, admitem-se os exercícios
como uma possibilidade terapêutica apesar de não haver suporte técnico-científico
de seus benefícios. No entanto, para Minor (2004) é possível visualizar que para as
conseqüências da OA nas articulações dos membros inferiores, os exercícios
contribuem para a progressão da doença. Já Thorstensson (2005) enfatiza que o
exercício é considerado ser um dos mais importantes tratamentos para pacientes
com osteoartrite leve a moderada do joelho e que níveis moderados de atividade
física não estão relacionados com progressão radiográfica da OA. Já Shrier (2004),
comenta que muitos profissionais da área da saúde acreditam que a maior causa da
OA é o desgaste, que é a perda gradual da cartilagem articular devido às repetidas
atividades de cargas na articulação e que a OA é causada e piorada pelo exercício.
Algumas pesquisas observaram que em sujeitos com doença articular prévia
o exercício moderado não exacerbou a doença e que ainda poderia ter grandes
efeitos benéficos (Minor, 2007).
Embora reconhecida a função dos exercícios na redução da dor, aumento da
força muscular, produção de estabilidade articular, aumento da flexibilidade e
melhora da capacidade aeróbica, ainda é necessário saber o alcance dessas
mudanças no paciente com OA, quais e como os exercícios devem ser prescritos,
quais exercícios devem ser evitados, resposta a curto e a longo prazo, e a adesão
dos pacientes a programas individuais e em grupo. Somente quando as respostas a
todas essas questões forem demonstradas cientificamente poderemos conduzir de
forma adequada o tratamento por exercício na OA.
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II- FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1- Conceituação da Osteoartrite
A osteoartrite é a mais comum forma de artrite e a OMS (Organização
Mundial de Saúde) estima que globalmente 25% dos idosos acima dos 65 anos
sofram de dor e incapacidade associada com esta doença. Quase todos os grupos
de idade são afetados pela OA, mas a prevalência aumenta dramaticamente depois
dos 50 anos de idade em homens e 40 anos em mulheres (Breedveld, 2004).
A OA é uma doença que leva a progressiva destruição da cartilagem articular
acompanhada por profundas mudanças no osso subcondral, resultando em dor,
fraqueza e eventualmente perda da função articular (Little, 1997). É uma síndrome
complexa com múltiplas causas, que envolve o balanço entre síntese de cartilagem
e degradação e que afeta todos os tecidos ao redor da articulação (Shrier, 2004).
Altman (1999) complementa dizendo que é uma afecção, primária ou secundária,
que pode ter origem tanto na cartilagem como no osso subcondral ou mesmo na
membrana sinovial. Como resultado final, há lesões anatômicas características,
representadas por degeneração cartilaginosa, desgaste do osso subcondral e
remodelagem óssea, podendo haver sinovite, geralmente nas fases mais evoluídas
do processo.
De acordo com Altman (1999), há tentativa de reparação da cartilagem e do
osso e é isso que determina a formação de osteófitos, que é uma remodelação
óssea desorganizada. Esta neoformação óssea se instala nas margens da
articulação, porém, em alguns casos esses fragmentos ósseos se deslocam para o
interior da articulação, podendo bloquear os movimentos e causar dor. Além disso,
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tendões e ligamentos são colocados sob tensão excessiva com possibilidade de
romperem ou inflamar; os músculos periarticulares adquirem certo espasmo como
forma de defesa em resposta à dor (Cossermelli et al., 2001).
É a doença músculo-esquelética mais comum, chegando a afetar uma em
cada três pessoas acima de 35 anos e causando perda importante da capacidade
laborativa e da qualidade de vida do ser humano. Representa cerca de 30% a 40%
das consultas em ambulatórios especializados e é responsável no Brasil, por 7,5%
de todos os afastamentos do trabalho (Chahade et al., 2001). Todas as articulações
podem ser atingidas pela osteoartrite, contudo, o quadril, os joelhos, os pés e a
coluna são de longe as mais atingidas, por serem articulações de carga e devido ao
esforço a que estão sujeitas. Pode haver comprometimento uni ou bilateralmente e
também mais de uma articulação pode ser atingida ao mesmo tempo (Baici et al,
1995).
Segundo Pecina et al.; 2001 os joelhos, são as articulações mais afetadas por
injúrias como a osteoartrite. A razão para isto se explica pelo fato de ser uma região
onde serve de inserção para vários músculos e tendões e com numerosas bursas. É
uma articulação de movimento (andar, correr, sentar, agachar) e ao mesmo tempo, é
uma articulação que recebe descarga de peso constantemente, mantendo a
estabilidade da posição bípede do humano quando estático, por isso, é considerada
a principal articulação de carga do membro inferior.
Os fatores de risco podem ser divididos em dois grandes grupos: fatores
locais, que tendem a resultar em sobrecarga biomecânica anormal da articulação
afetada, que inclui a obesidade, biomecânica articular alterada, injúria articular
prévia, fatores ocupacionais, a prática de esportes e o nível de atividade física. E os
14
fatores sistêmicos, que incluem a etnia, idade, gênero, estado hormonal, fatores
genéticos e estado nutricional (Garstang & Stitik, 2006).
De acordo com Vannucci et al (2000), na história clinica da OA, o sintoma
mais importante que traz o paciente ao médico é a dor. Embora, a dificuldade à
movimentação e a presença de deformidades articulares possam fazer parte da
queixa inicial, é a dor articular e/ou periarticular que prejudica com maior intensidade
a vida do paciente, levando em muitos casos à incapacidade funcional. Segundo
Chávez (1998) a origem da dor não está na cartilagem que é um tecido conjuntivo
denervado, mas sim em outras estruturas intra e periarticulares.
Nem sempre alterações da OA vistas nas radiografias se manifestam
clinicamente, porém, geralmente os sinais e sintomas são locais e se relacionam a
anormalidades radiológicas características, mas não há relação entre a gravidade da
dor e a gravidade da alteração radiológica (Chávez, 1998).
Segundo Golding (1999) os sintomas relacionam-se com:
a) desgaste articular;
b) episódios de inflamação;
c) degeneração e inflamação dos ligamentos ao redor das articulações;
d) possivelmente deposição de apatita ou outros sais de cálcio na sinóvia.
A dor na OA tem origem multifatorial: microfraturas no osso subcondral,
terminações nervosas da membrana sinovial estimuladas por mediadores
inflamatórios ou por contato com osteófitos, alterações na pressão intra-articular e
intra-óssea, contratura muscular periarticular e/ou contração da cápsula articular
(Seda, 1982). A causa da dor também varia dependendo do estágio da OA. Alguns
casos têm episódios intermitentes de dor devido a sinovite de leve a moderada. O
aumento da pressão intra-óssea devido à congestão vascular do osso subcondral é
15
freqüente, assim como fibrose capsular, contratura articular e fadiga muscular
(Kelley et al., 1998).
Geralmente os pacientes relatam que a dor é leve a moderada no início da
doença, piora com o uso da articulação afetada e melhora com o repouso. Este tipo
de dor é denominada dor mecânica, sendo, na maioria dos casos, auto-limitada e
aliviada com medicação analgésica e/ou antiinflamatória. Com o passar do tempo e
agravamento da destruição articular, o processo inflamatório pode ser persistente e
causar dor mesmo ao repouso (dor inflamatória), sendo mais difícil o alívio com a
terapêutica medicamentosa (Vannucci et al., 2000; Kelley et al., 1998).
A rigidez articular e a crepitação são também sintomas comuns na OA de
joelhos. Geralmente a rigidez é de curta duração, entre 5 e 30 minutos, ocorrem pela
manhã ou após um período de inatividade (o paciente queixa-se de dificuldades em
“começar a andar” depois de sentar). A rigidez matinal demorada (acima de 30
minutos) sugere inflamação persistente. Com a movimentação, a rigidez articular vai
gradativamente desaparecendo (Chávez, 1998; Golding, 1999). A crepitação
presente em 90% dos pacientes é uma sensação de atrito quando ocorre o
movimento articular, é comum e tanto pode ocorrer na movimentação sem
resistência, representando um espessamento sinovial, como também no movimento
contra resistência, representando a irregularidade das superfícies articulares (Arce,
1999). Em um estudo realizado por Creamer et al. (1998), os pacientes que
apresentaram dor generalizada também apresentaram mais rigidez. Alguns
pacientes podem não apresentar queixas de dor, referindo então como queixas
primárias, rigidez e/ou a diminuição da capacidade funcional.
A limitação do movimento vai gerar atrofia muscular, incapacidade funcional,
diminuição da força muscular e tudo isso consiste em um ciclo vicioso e isso limita
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as atividades de vida diária e, por sua vez, à piora da qualidade de vida (Marques &
Kondo, 1998). O grau de mobilidade pode apresentar-se diminuído pela fibrose
capsular, osteofitose, irregularidade das superfícies articulares, impacto dos corpos
livres e também pela própria dor (Golding, 1999). A atrofia muscular está presente
secundariamente ao desuso, os músculos que atuam sobre as grandes articulações
afetadas tornam-se atróficos (Cossermelli et al., 2001).
Em um estágio final ou avançado da OA pode haver uma fixação da
articulação em posição defeituosa causando uma deformidade (Winkel et al., 1997).
O diagnóstico da OA é clínico-radiográfico. Em geral, sintomas e sinais como
dor, limitações de mobilidade, crepitação, derrame articular e deformidades estão
presentes; no entanto, tais alterações são inespecíficas e também podem estar
presentes em outras afecções, como as doenças articulares inflamatórias. Logo, o
diagnóstico da OA deve pressupor a existência de alterações degenerativas
reacionais (osteófitos) e/ou diminuição do espaço articular (Oliveira & Mesquita,
2003).
Basicamente o diagnóstico da OA é clinico, se confirma pela análise do
liquido sinovial e estudos por imagem (Chavez, 1998), isto é, o exame radiológico
apenas confirma a hipótese clínica de OA (Vannucci et al., 2000).
Os sintomas e a diminuição funcional causados pela OA, podem
freqüentemente ser aliviados com fisioterapia e medicação. Ocasionalmente a
utilização de medicamentos analgésicos ou antiinflamatórios não esteróides são
freqüentemente utilizadas. Em pacientes com OA muito avançada, os tratamentos
cirúrgicos podem ser uma opção, no sentido de aliviar ou melhorar a função (Fisher
et al, 1993; Skare, 1999).
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O objetivo principal da fisioterapia é prevenir e minimizar o dano articular e
limitação funcional, tendo papel importante na reabilitação dos pacientes com OA,
auxiliando-os, tanto no alívio dos sintomas, quanto na execução das atividades da
vida diária, contribuindo para manter a qualidade de vida (Marques & Kondo, 1998).
Segundo Greene & Lim (2000), a intervenção fisioterapêutica é apropriada em
todos os estágios da patologia, desde a prevenção primária e secundária até a
reabilitação pós-cirúrgica no que diz respeito à melhora dos sintomas e restauração
da função.
Na fase precoce é importante que além do tratamento dos sintomas, a
biomecânica articular seja corrigida, na tentativa de prevenir futuras alterações que
podem agravar o processo degenerativo. Nesta fase também é importante a
orientação do paciente sobre a patologia, os estágios de evolução e os cuidados que
devem se tomados para que não se agrave o quadro (Marques & Kondo, 1998).
No estágio avançado é necessário a analgesia da região acometida, através
de recursos térmicos e elétricos, para que se possa restabelecer a função articular,
através da cinesioterapia. Quanto mais acelerado o processo degenerativo, menores
são as chances de alta fisioterapêutica, pois as dores vão se tornando cada vez
mais fortes, com conseqüente diminuição da função articular, sendo necessária a
manutenção do estado do paciente (Marques & Kondo, 1998).
Vários são os recursos da fisioterapia no tratamento da OA. O calor, frio e
eletroterapia são amplamente utilizados, mas existem poucos estudos a respeito de
sua eficiência na OA (Marques & Kondo, 1998).
Marques & Kondo (1998) afirmam que muitos trabalhos anteriores a 1980,
apresentam a cinesioterapia como forma inapropriada para tratar pacientes com OA,
pois alegavam que os exercícios poderiam causar estresse e esforço indevido na
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articulação lesada e, assim, piorar a inflamação. Entretanto, vários estudos
encontraram diminuição de força e endurance muscular e, conseqüentemente, perda
de capacidade funcional desses pacientes, além da diminuição da capacidade
aeróbica. Fisher & Pendergast (1994), lembram que o uso somente de exercícios
aeróbicos não melhora a função muscular e nem a performance funcional e que,
portanto, estes devem ser feitos somente como exercícios adicionais.
Apesar da presença de dor, rigidez articular, mau alinhamento e perda de
função serem as principais características da OA, fraqueza muscular, hipotrofia,
derrame articular, desencadeando espasmo muscular protetor e reflexo, imobilidade
e perda de “endurance” são também comuns no curso natural da doença (Hsieh
apud Teixeira & Olney, 1995).
As vantagens dos exercícios isotônicos dinâmicos incluem maior amplitude de
movimento da articulação, o que resulta em manutenção da flexibilidade capsular,
ligamentar e muscular, e maior nutrição da cartilagem. O fortalecimento muscular
ocorre em todas as amplitudes articulares o que resulta em um complexo músculo-
articulação funcionalmente mais eficiente (Bennett apud Hall & Brody, 2001).
Segundo Hall & Brody (2001), a utilização de baixa resistência e alta repetição
(até o surgimento de fadiga) em um arco de movimento que não irrite a articulação é
preferida aos esquemas de alta carga e baixa repetição, nos quais a maior
sobrecarga articular pode causar inflamação. Ainda, de acordo com Galois et al.
(2004), os exercícios terapêuticos na OA poderiam prevenir a degeneração
acelerada causada por desuso sem causar mais degeneração.
Faltam estudos que forneçam resultados mais objetivos relatando quais
exercícios são realmente seguros e que intensidade pode estar provocando maior
dano na articulação. Enquanto essa incerteza permanece, os terapeutas devem
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estar atentos aos sinais e sintomas, controlando os exercícios para obter os
resultados desejados (Marques & Kondo, 1998).
2.2- Patogênese da Osteoartrite
Segundo Skare (1999), os condrócitos são capazes de sintetizar colágeno,
proteoglicano e também são a maior fonte de enzimas degradadoras na osteoartrite,
liberando metaloproteinases (colagenase, estromelisina, gelatinase), que são as
enzimas mediadoras do processo catabólico. A homeostase da cartilagem se
estabelece através do equilíbrio entre agentes que atuam no seu anabolismo e
catabolismo, ou seja, a síntese de matriz celular deve ser igual à velocidade de
degradação (Moreira & Carvalho, 2001). O condrócito é, portanto, a fonte tanto das
atividades catabólicas quanto das anabólicas da cartilagem e o elemento central na
manutenção de sua vitalidade (Skare, 1999).
Dois processos estão envolvidos na patogênese da osteoartrite segundo
Vannucci et al. (2000):
a) os condrócitos produzem uma matriz com resistência e elasticidade diminuídas;
b) O equilíbrio entre síntese e degradação da matriz é rompido pela maior produção
de proteases.
A matriz tem suas propriedades alteradas devido a uma mudança qualitativa
na produção de seus componentes; os condrócitos, que antes sintetizavam colágeno
tipo II, dando forma e resistência á tensão para a cartilagem, passam a sintetizar
colágeno tipo I e III (ao invés do II) e também proteoglicanos mais curtos (Muhlen,
2002).
20
A ruptura do equilíbrio entre síntese e degradação da matriz cartilaginosa
ocorre pelo aumento da produção de enzimas proteolíticas capazes de digerir o
agrecano e o colágeno. A atividade destas proteinases pode ser freada por
inibidores tissulares das metaloproteinases (TIMPs) que também são produzidos
pelos condrócitos (Vannucci et al, 2000; Belhorn & Hess, 1993). Na osteoartrite a
produção de metaloproteinases (MMPs), que são as principais enzimas envolvidas
na degradação da cartilagem, supera a produção dos inibidores tissulares das
metaloproteinases (TIMPS), promovendo a degradação progressiva da matriz.
Outras enzimas, como as catepsinas e glicosidases, também contribuem para o
processo de degradação articular (Muhlen, 2002).
No processo catabólico, os condrócitos estão sujeitos à influência de
mediadores bioquímicos entre eles a interleucina-1 (IL-1) e o fator de necrose
tumoral alfa (TNF-α) (Belhorn & Hess, 1993). No processo anabólico há influência
dos vários fatores de crescimento (fator de crescimento do fibroblasto, fator de
crescimento derivado das plaquetas, etc) e pelos diversos fatores estimuladores de
colônia (Oddis, 1996). O aumento da síntese e liberação enzimática pelos
condrócitos é estimulado pelo contato destas células com citocinas, prostaglandinas,
radicais livres como o óxido nítrico (NO) e ainda por componentes da matriz tais
como fragmentos de fibronectina.
A OA não é considerada essencialmente uma doença inflamatória, tem sido
demonstrado que citocinas pró-inflamátorias como a IL-1 e o TNF-α estão presentes
e ativam a produção de metaloproteinases pelos condrócitos (Altman, 1999). Além
de estimular a síntese enzimática, a IL-1 induz a diminuição da produção dos
colágenos II e IX e o aumento da produção dos colágenos I e III, modificando a
qualidade da matriz. Outras interleucinas liberadas durante o processo inflamatório
21
como IL-4 e IL-13 têm papel inibidor e tentam contrabalançar os efeitos catobólicos
da IL-1 (Vannucci et al., 2000; e Mühlen, 2002).
Embora o papel dos condrócitos seja primordial, o tecido sinovial também
exerce função no desenvolvimento do processo de degradação da matriz. Os
sinoviócitos são capazes de fagocitar fragmentos de cartilagem liberados no espaço
articular, o que leva a uma inflamação do tecido sinovial. As células sinoviais se
tornam então capazes de produzir e liberar enzimas (MMPs) e citocinas as quais
podem lesar a cartilagem e estimular os condrócitos. Células do osso subcondral
(osteoblastos) também podem produzir enzimas proteolíticas, participando assim do
processo de degradação da cartilagem (Moreira & Carvalho, 2001; Vannucci et al.,
2000).
Segundo Skare (1999) e Altman (1999), nos estágios iniciais da OA há uma
tentativa de reparação das lesões produzidas na cartilagem e no osso subcondral
pelos condrócitos, sinoviócitos e osteoblastos. Estas células aumentam a produção
dos fatores de crescimento envolvidos na síntese da matriz, tais como fator de
transformação do crescimento (TGF-β) e fator de crescimento insulina semelhante
(IGF-1). O osso subcondral também produz um fator de crescimento denominado
proteína morfogenética-2. Esta tentativa de reparação é infrutífera pois, os
condrócitos começam a produzir colágeno I e III ao invés do tipo II. Há também
produção insuficiente de inibidores das metaloproteinases e fatores de crescimento
diante do excesso de proteinases e citocinas.
Todos os tecidos que formam a articulação sinovial estão envolvidos na
osteoartrite, incluindo cartilagem articular, osso subcondral, tecido sinovial, metáfise
do osso, ligamentos, cápsula articular e músculos adjacentes à articulação afetada;
porém, primariamente as mudanças consistem de perda da cartilagem articular,
22
remodelação do osso subcondral e formação dos osteófitos (Martin, 1994;
Buckwalter & Mankin, 1997).
Os osteófitos representam uma resposta à degeneração da cartilagem
articular e uma remodelação do osso subcondral, incluindo a liberação de citocinas
anabólicas que estimulam proliferação celular e a formação óssea e de cartilagem
(Cossermelli et al., 2001).
A perda progressiva de cartilagem progride para as mudanças secundárias do
tecido sinovial, ligamentos, cápsula e músculos. A membrana sinovial geralmente
apresenta uma reação inflamatória (sinovite) de leve a moderada e que ainda pode
conter fragmentos de cartilagem articular. Com o tempo os ligamentos, cápsulas e
músculos se tornam contraídos e rígidos; há uma diminuição do uso da articulação,
diminuição da amplitude de movimento (ADM) e isso geram atrofia muscular. Essas
alterações secundárias geralmente contribuem para rigidez, fraqueza e dor
(Buckwalter & Mankin, 1997).
O mecanismo de degradação da cartilagem articular é pouco conhecido mas,
as EROs são implicadas como um dos principais fatores causadores (Ostalowska et
al., 2006). Os radicais são formados tanto em condições fisiológicas e patológicas
nos tecidos. A produção incontrolada de radicais livres é considerada um fator
importante na lesão tecidual induzido por várias patofisiologias (Surapaneni &
Venkataramana, 2007). O radical inicialmente formado é geralmente o radical
superóxido (O2¯˙); entretanto, ele pode ser convertido a espécies mais danosas
como o radical hidroxil (OH.) e o peróxido de hidrogênio (H2O2) através da interação
com metais livres. Essas espécies reativas de oxigênio são capazes de oxidar e
subseqüentemente, lesionar numerosos componentes da articulação, incluindo
colágeno, proteoglicanos e hialurônio (Ostalowska et al., 2006).
23
A peroxidação lipídica mediada por radicais livres é considerada o mecanismo
mais importante de destruição da membrana celular e lesão celular (Surapaneni &
Venkataramana, 2007). Para proteger-se, a célula possui um sistema de defesa que
pode atuar em duas linhas. Uma delas atua como detoxificadora do agente antes
que ele cause lesão. Esta linha é constituída por glutationa reduzida (GSH),
superóxido-dismutase (SOD), catalase, glutationa-peroxidase (GSH-Px) e vitamina
E. A outra linha de defesa tem a função de reparar a lesão ocorrida, sendo
constituída pelo ácido ascórbico, pela glutationa-redutase (GR) e pela GSH-Px, entre
outros (Ferreira & Matsubara, 1997). Surapaneni (2007) acrescenta ainda que,
alterações no perfil oxidante-antioxidante ocorrem nas doenças reumáticas e
Ostalowska et al. (2006), complementa dizendo que as EROs, incluindo ânion
superóxido, peróxido de hidrogênio e radical hidroxil, medeiam a lesão articular em
pacientes com OA e esses pacientes freqüentemente exibem níveis maiores de
oxidantes no fluido sinovial.
Várias teorias têm sido propostas para explicar a produção de superóxido e
outras EROs na articulação envolvida. Edmonds et al (1993) e Grisham (2004)
encontraram que o movimento da articulação osteoartrítica com exudato, gera
pressão suficiente para causar isquemia temporária da superfície da membrana
sinovial. Isto aumenta a possibilidade que a articulação está sujeita a lesão por
isquemia reperfusão que envolve produtos de O2¯ através da enzima xantina
desidrogenase. Wientjes & Segal (1995), usando modelos celulares cultivados in
vitro revelaram que sob condições estressantes as células da cartilagem articular
produzem O2¯ no fluido sinovial, provavelmente através da ativação da NADPH
oxidase. Dahlgren & Karlsson (1999) e Borsiczky et al. (2003) encontraram que a
fagocitose envolve O2¯ em articulações contendo neutrófilos, monócitos, e
24
macrófagos como fagócitos ativados. A quebra dos componentes da articulação
através de uma injúria pode levar a um aumento da produção de O2¯, parcialmente
devido à liberação e oxidação da hemoglobina de eritrócitos com ativação da
NADPH oxidase.
A lesão causada pelas EROs poderia ser sugerida como a causa da
diminuição da viscosidade do fluido sinovial. Ainda é desconhecido que mecanismos
são responsáveis por esta mudança, mas isto poderia resultar em fragmentação das
proteínas de ligação, perda da habilidade de associar monômeros proteoglicanos
com ácido hialurônico, fragmentação do ácido hialurônico, modificação química das
proteínas de ligação e outras mudanças por EROs excessivas (Ostalowska et al.,
2006).
25
III- OBJETIVOS
3.1- Objetivo Geral:
Avaliar os efeitos do treinamento aeróbico sobre a constituição da cartilagem
articular e sobre os marcadores de estresse oxidativo presentes no soro e fluido
sinovial dos joelhos de ratos induzidos a osteoartrite química.
3.2- Objetivos Específicos:
• Avaliar os efeitos do exercício físico sobre as alterações morfológicas
(histológica) da cartilagem articular induzida a osteoartrite;
• Avaliar os efeitos do exercício físico sobre os marcadores de dano oxidativo
na cápsula articular, lavado articular e soro de ratos induzidos a osteoartrite;
• Avaliar os efeitos do exercício físico sobre a atividade da Superóxido
Dismutase (SOD) no soro e cápsula articular;
• Avaliar os efeitos do exercício físico sobre a atividade da mieloperoxidase no
soro, na cápsula articular e lavado articular em ratos induzidos a osteoartrite.
26
CAPÍTULO II
IV- ARTIGOS
ARTIGO 1
Exercise improves oxidative stress parameters in an experimental
model of osteoarthritis
Submetido na Rheumatology International
27
Physical Exercise improves oxidative stress parameters in an
experimental model of osteoarthritis
Diego J. Cifuentes, MSca; Luís Gustavo Rocha, BSca;
Débora L. Scheffer, BSca ; Merieli Medeiros Ronsani, BSca;
Karoline Scarabelot, BSca; Claudio T. Souza, PhDa; Ricardo A. Pinho, PhDa
aLaboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício, UNESC
Address:
Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício, UNESC
Av. Universitária, 1105 – Bairro Universitário
88806-000 – Criciúma – SC – Brazil
E-mail: [email protected]
28
Abstract
Osteoarthritis is a degenerative joint disease affecting various ages, especially
the elderly. Aerobic exercise can be considered a therapeutic option, although loads
of impact should be avoided in this condition. The objective was to evaluate the
effects of aerobic exercise on oxidative stress in serum of rats with osteoarthritis.
Eighteen four-month-old male Wistar rats were randomly divided into three groups,
control (C), osteoarthritis (OA), and osteoarthritis plus exercise (OAE). We evaluated
markers of inflammation and oxidative stress through the activity of myeloperoxidase
and superoxide dismutase (SOD) enzyme, and oxidative damages, such as
lipoperoxidation (TBARS), protein carbonylation, formation of xylenol orange, and
sulfhydryl quantification. Both myeloperoxidase (OA= 285.24 ± 56.84 MPO
activity/mg protein; OAE = 319.86 ±27.66 MPO activity/mg protein, p<0.05) and SOD
(OA = 1.43 ±0.22 nmol/mg protein, OAE = 1.28 ±0.18 nmol/mg protein, p<0.05)
remained high in the osteoarthritis groups. Results showed less oxidative damage in
animals that exercised (TBARS: OA= 1.588 ± 0201 nmol TBARS/mg protein, OAE=
0.829 ± 0142 nmol TBARS/mg protein; xylenol orange: OA=1.310 ±0.153 nmol/mg
protein, OAE= 0.471 ±0221 nmol/mg protein; carbonyl: OA = 1,956 ±0.333 nmol/mg
protein, OAE= 1.146 ±0.253 nmol/mg protein, total thiol: OA= 4.621 ±0.147 nmol/mg,
OAE= 7,175 ± 0,823 nmol/mg protein, p<0.05). We concluded that aerobic exercise
decreases oxidative damage in serum of rats with osteoarthritis.
Keywords: Osteoarthritis, oxidative stress, aerobic exercise, serum.
29
Introduction
Osteoarthritis (OA) is a degenerative disease and the most common joint
disease that occurs in a large proportion of the elderly and that is characterized by
cartilage matrix degradation [1,2]. Systemic and local risk factors are associated with
the development of OA and result in abnormal biomechanical loading of affected
joints (e.g. altered joint biomechanics, prior joint injuries, occupational factors, the
effects of sports and physical activities) [3]. Physical exercise is considered one of
the most important treatments for patients with mild to moderate knee osteoarthritis
[4,5]. The consensus on the management of OA, in general, recommends exercise
therapy to reduce pain and for functional improvement,[6-8] despite few criteria in
evidence research.
While morphological and histological features of OA are well known, the
underlying molecular mechanisms are still not completely understood [9]. The
articular cartilage is avascular and, thus, per se hypoxic tissue. The implications of a
hypoxic environment are hardly understood on the molecular level. Additionally, the
role of changes in oxygen (O2) levels during the process of cartilage degeneration
seems to be of great interest. Oxygen can also be processed into the so-called
reactive oxygen species (ROS). Elevated production of ROS and/or depletion of
antioxidants have been observed in a variety of pathological conditions, including
inflammatory joint diseases [10]. The aim of this work was to investigate the effects of
a program of physical activity on markers of oxidative stress in serum of rats with
experimental osteoarthritis.
30
Materials and methods
Sample: Eighteen 4-month-old male Wistar rats were used in the experiments and
were cared for according to the European Communities Council Directive of 24
November 1986. Food (Nuvilab CR1, Nuvital Nutrientes S/A, Brazil) and water were
available ad libitum. The room housing the animals was kept at 70 % humidity,
20±2ºC, and in a 12-h light/dark cycle with lights on at 06.00 a.m. The rats were
periodically checked to verify their pathogen-free condition. They were randomly
divided into 3 groups (n=6): control (C), osteoarthritis (OA), and osteoarthritis plus
exercise (OAE).
Osteoarthritis exposure: The animals were anesthetized with ketamine (90 mg/kg,
i.p.) and Xylazine (9 mg/kg, i.p.). Osteoarthritis was then induced by direct infiltration
of the right knee joint with a 27-gauge needle and a 2-ml syringe containing 1.2 µl of
iodoacetate diluted in 50 µl saline solution, according to Guzman (2003) [11].
Training protocol: Twenty-four hours after induction of osteoarthritis, all groups
were habituated on a motor-driven treadmill, with speed set at 10 m/min, for 10
min/day during the first two days and 15m/min in the third day to reduce their stress
to the new environment. The rats did not receive any stimuli to run. The exercise
groups performed an incremental running program to obtain progressive levels of
intensity during 8 weeks for 3 days/week and for a total of 60 days (Table I). The
untrained animals were put on the switched-off treadmill during the same 8 weeks as
the exercise-trained groups.
Heart puncture: After anesthetizing the animals, a thoracotomy with exposure of the
heart followed, with left ventricular puncture with a 5 ml syringe and needle. The
31
blood was collected in tubes and centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes. The serum
was separated from the pellets and frozen at -80 oC for later analysis.
Biochemical assay
Myeloperoxidase (MPO) activity assay : Serum was homogenized (10 µL/mL) in
0.5% hexadecyltrimethylammonium bromide and centrifuged at 5000×g for 5 min.
The suspension was then sonicated three times for 30 s. An aliquot of the
supernatant was then mixed with a solution of 1.6 mM tetramethylbenzidine and 1
mM H2O2. Activity was measured spectrophotometrically as the change in
absorbance at 650 nm at 37 °C [12].
Superoxide Dismutase (SOD) activity assay: SOD activity of serum was
determined according to the method of Bannister and Calabrese (1987) [13]. The
enzymatic activity estimation occurs by inhibition of adrenaline autoxidation read at
480 nm in a spectrophotometer. Enzyme activity was expressed as U/mg protein.
Lipid peroxidation assay: The 2-thiobarbituric acid reactive species (TBARS) levels
were measured by the method of Draper and Hadley (1990) [14] and expressed as
malondialdehyde (MDA) equivalent. Briefly, serum was mixed with 1 ml 10 %
trichloroacetic acid and 1 ml 0.67 % thiobarbituric acid; subsequently; they were
heated in a boiling water bath for 15 min. TBARS were determined by measuring
absorbance at 532 nm and the results are given as nmol MDA/mg protein.
Ferrous oxidation in xylenol orange (FOXO): This technique was used for
detecting hydroperoxides (ROOH) [15]. Serum was homogenized (10 µL/mL) and
aliquots (90 µL) were transferred to microcentrifuge vials (1 mL). Ten microliters (10
mM) TPP in methanol were added to the vials to reduce ROOH. All vials were then
vortexed and incubated at room temperature for 30 min. Absorbance was measured
at 560 nm and the results were expressed in nmol/mg protein.
32
Carbonyl assay: Protein concentration of the soluble protein fractions was
determined according to Levine et al. (1990) [16]. Protein carbonyl content was
measured by first forming labeled protein hydrazone derivatives using 2,4-
dinitrophenylhydrazide (DNPH). These derivatives were sequentially extracted with
10 % (vol/vol) trichloroacetic acid followed by treatment with ethanol/ethylacetate, 1:1
(vol/vol) and reextraction with 10 % trichloroacetic acid. The resulting precipitate was
dissolved in 6 M urea hydrochloride. The difference spectrum between a
2.4-dinitrophenylhydrazide protein blank was used to calculate nmol of
2.4-dinitrophenylhydrazide incorporated per mg of protein. Results are reported for
each sample read at 370 ηm in a spectrophotometer using a molar absorption
coefficient of 22.0000M-1.
Total thiol content: The total thiol content was determined using the 5,5`-dithiobis
(2-nitrobenzoic acid) method (DTNB) (Sigma). The reaction was started by adding
30 µL of 10 mM DTNB stock solution in PBS. Control samples did not include DTNB.
After 30 min incubation at room temperature, absorbance at 412 nm was measured
and the amounts of TNB formed were calculated (equivalent to the amount of SH
groups) using the Aksenov technique [17].
Protein content: Protein concentration was estimated by the method of Lowry [18],
using bovine serum albumin as standard.
Statistical analyses: Means ± S.E.M were calculated, and multiple comparisons
were performed by using one-way ANOVA with Tukey's post-hoc tests. A p value
<0.05 was considered significant. The software used for data analysis was the
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 12.0 for Microsoft
Windows.
33
Reagents and animals: Thiobarbituric acid, adrenaline, trichloroacetic acid,
dinitrophenylhydrazide, hexadecyltrimethylammonium bromide, tetramethylbenzidine,
5,5`-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) were purchased from Sigma Chemical (St. Louis,
MO, USA). The animals were acquired from the animal house of Universidade do
Extremo Sul Catarinense (Criciúma, Santa Catarina, Brazil).
Results
Enzymatic activities: According to figure 1, the myeloperoxidase activity was
increased in both groups with OA, independently of exercise (OA = 285.24 ±56.84
MPO activity/mg protein; OAE = 319.86 ±27.66 MPO activity/mg protein, p<0.05). In
figure 2, results show an increase of the superoxide dismutase (SOD) activity in
animals with OA, and exercise did not alter these values (OA = 1.43 ±0.22 nmol/mg
protein, OAE = 1.28 ±0.18 nmol/mg protein, p<0.05).
Oxidative Damages: According to figure 3, our data show that the levels of serum
lipid peroxidation in OA animals were higher than in the control group (C= 0.658
±0.241 nmol TBARS/mg protein; OA = 1.588 ±0.201 nmol TBARS/mg protein,
p<0.05), and that animals exposed to physical exercise had lower levels of
lipoperoxidation in the serum constituents (OA = 1.588 ±0201 nmol TBARS/mg
protein, OAE = 0.829 ±0142 nmol TBARS/mg protein, p<0.05). Xylenol orange level
was also significantly lower in the OAE group compared with the animals of the OA
group (OA=1.310 ±0.153 nmol/mg protein, OAE=0.471 ±0221 nmol/mg protein,
p<0.05) (figure 4). With regard to protein oxidation, results show a significant
increase in the OA group compared with the control group, while in OAE animals
these values were significantly reduced (OA = 1,956 ±0.333 nmol/mg protein, OAE =
1.146 ±0.253 nmol/mg protein, p<0.05) (figure 5). Total thiol content was lower in the
34
OA group (OA= 4.621 ±0.147 nmol/mg protein) than in the control group (C= 8.330
±0.517 nmol/mg protein. Interestingly, the group OAE values were significantly higher
(OAE= 7,175 ± 0,823 nmol/mg protein) (Figure 6).
Discussion
Our data clearly show that the protocol of physical activity applied to animals
with OA was significant enough to reduce the rates of oxidative damages, as
demonstrated through markers such as protein carbonylation and lipid peroxidation.
This is the first study that evaluates the effects of a program of aerobic exercise on
markers of oxidative damage in the serum of rats with OA. Our findings are similar as
those of other studies that identified protective effects of exercise on plasma [19],
erythrocytes [20], and specific tissues [21-23].
It is possible that during the training to which these animals were submitted
during almost two months there were changes in the expression and activity of
various proteins and enzymes, including superoxide dismutase because a single
bout of exercise can be enough to induce –at least some– adaptation and increased
protection through superoxide dismutase [24], since in non-exhaustive daily training
sessions –typical of endurance exercise training– the generation of free radicals
could be the actual stimulus to exercise adaptation and mitochondrial biogenesis
[25].
It seems that high levels of the enzyme superoxide dismutase follow the
pathophysiological process of OA as reported in a study [26], and all evidences are
that exercise does not change this behavior, at least in the serum of animals with OA
35
induced with sodium iodoacetate, differently from in situ findings (not published)
observed by us.
MPO is regarded not only as an index of inflammation but also as an index of
oxidative damage [27]. The activity of MPO remained high in the serum of animals
with OA regardless of the exercise. A possible explanation is based on the
assumption that physical activity stimulates blood neutrophil degranulation. This
should result in a decrease of the determined protein content in neutrophils and a
concomitant increase in blood plasma. The stimulus might be related to the actions of
hormones such as catecholamines or glucocorticoids [28].
Adaptive mechanisms observed in moderate exercise seem to decrease
oxidative stress and they encompass increased antioxidant defenses, reduced basal
production of oxidants, and reduction of radical leak during oxidative phosphorylation
[29]. Moreover, a low rate of lipid peroxidation associated with a slower appearance
of sarcoplasmic reticulum and endoplasmic reticulum damage supports the view that
the reduced sensitivity of tissues of trained animals to exercise-induced damage is
due to their lower susceptibility to lipid peroxidation [21]. Our data show that animals
of the OAE group produced such adaptive mechanisms, which have been confirmed
by lipid peroxidation and protein carbonyls tests. Similarly to other studies, in which
moderate exercise significantly decreased the development of age-associated
oxidative stress in mice, quality of life increased, decay of mitochondrial function was
prevented, and even improves behavioral performance was improved [30].
Our results suggest that a program of aerobic exercise could be directed and
applied to individuals with mild to moderate degree of OA. Our results further indicate
that activities of mild to moderate impact on an involved joint do not exacerbate
oxidative damage, but rather seem to reduce oxidative stress.
36
Further investigations are needed to better establish which degree of OA will
benefit most from aerobic activity and at which intensity exercise should be
performed.
Acknowledgments
This research was supported by grants from CNPq/MCT (Brazil), CAPES/MEC
(Brazil) and UNESC (Brazil).
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week day speed (Km/h)
degree (%) duration (min)
1(adaptation) 1-2 0,6 0 10
1(adaptation) 3 0,8 0 15
1 1-3 1,0 0 15 2 1-3 1,0 0 30 3 1-3 1,0 0 30 4 1-3 1,0 0 30 5 1-3 1,0 0 45 6 1-3 1,0 0 45 7 1-3 1,0 0 45 8 1-3 1,0 0 45
Table 1- training protocol for rats
41
Fig.1- Myeloperoxidase activity in the serum of rats. Data are expressed as mean±SEM for six animals.
Different from control (*p<0.05).
Fig. 2- SOD activity in serum of rats. Data are expressed as mean±SEM for six animals. Different from control (*p<0.05).
Fig. 3- Lipoperoxidation in the serum of rats. Data are expressed as mean±SEM for six animals. Different from control (*p<0.05) and
different from the non-exercise group OA (#p<0.05).
42
Fig. 4- Xylenol orange. Data are expressed as mean±SEM for six animals. Different from control (*p<0.05) and
different from the non-exercise group OA (#p<0.05).
Fig. 5- Protein carbonyl in the serum of rats. Data are expressed as mean±SEM for six animals. Different from control (*p<0.05) and different
from the non-exercise group OA (#p<0.05).
Fig.6- Sulfhydryl in the serum of rats. Data are expressed as mean±SEM for six animals. Different from control (*p<0.05) and different
from the non-exercise group OA (#p<0.05).
43
Artigo 2
Decrease of oxidative stress and histological changes induced by
exercise in rats with osteoarthritis
Submetido na Osteoarthritis and Cartilage
44
Decrease of oxidative stress and histological changes induced by
exercise in rats with osteoarthritis
Diego J. Cifuentes, MSca; Luís Gustavo Rocha, BSca ; Luciano A. Silva, MSca; Ana
Carolina Brito, BScb; Carlos R. Rueff-Barroso, MScb; Luis C. Porto, PhDb; Ricardo A.
Pinho, PhDa
aLaboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício/PPGCS/UNESC
bLaboratório de Reparo Tecidual/Departamento de Histologia e Embriologia/UERJ
Address:
Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício/UNESC
Av. Universitária, 1105 – Bairro Universitário
88806-000 - Criciúma – SC – Brazil
e-mail: [email protected]
45
Abstract
Osteoarthritis (OA) is a chronic, multifactorial disease that affects the joints.
The treatment involves pharmacological and non-pharmacological actions, such as
physiotherapy and invigorating, stretching and aerobic exercises. The purpose of this
study was to evaluate the effects of impact exercise on the cartilage of joints of rats
with osteoarthritis induced with sodium iodoacetate. Eighteen male rats were divided
into three groups of six animals each: control (C), osteoarthritis (OA), and
osteoarthritis plus exercise (OAE). The OAE group trained on a treadmill for 8 weeks.
Later, the right joint of the animals was washed with saline solution and joint lavage
was used for biochemical analyses of the myeloperoxidase and enzyme superoxide
dismutase (SOD) activities, and total thiols content. The same limb provided the
samples of the articular capsule for the analysis of myeloperoxidase activity and total
thiol content. The left joint was used for histological analysis. Our results indicate that
the activity of myeloperoxidase was increased in both groups with OA, in the lavage
(OA= 16.315 ± 5.32 activity MPO mg/protein; OAE= 11.955 ± 4.80 MPO activity
mg/protein, p<0.05) as in the articular capsule (OA= 210.586 ± 30.31 MPO activity
mg/protein; OAE= 133.206 ± 24.57 MPO activity mg/protein, p<0.05), regardless of
exercise. SOD activity was increased in animals with OA, especially in animals that
had run on the treadmill (OA= 7.172 ± 0.43 nmol mg / protein; OAE = 13.90 ± 0.51
nmol mg/protein, p < 0.05). On the other hand, thiols content in the articular capsule
(OA=13.895 ± 7.624 nmol DTNB/mg protein; OAE= 38.654 ± 3.976 nmol DTNB/mg
protein, p< 0.05) and in joint lavage (OA=0.460 ± 0.281 nmol DTNB/mg protein;
OAE= 0.974 ± 0.123 nmol DTNB/mg protein, p< 0.05) decreased in the OA group,
while in the OAE group it showed values similar to the control group. The histological
46
data indicate that the animals submitted to running exercise showed a higher
preservation rate of proteoglycans content in the superficial and intermediate areas
of the joint cartilage. Our results show that physical activity contributes to preserving
the joint cartilage in animals with OA.
Key-words: osteoarthritis, physical exercise, joint cartilage, oxidative stress.
47
Introduction
Osteoarthritis (OA) is a degenerative disease characterized by a progressive
degradation of joint cartilage accompanied with secondary inflammation of synovial
membranes1. With synovial fluid, joint cartilage provides an almost frictionless
articulation enabling painless joint movement. The extracellular matrix of joint
cartilage provides this tissue with its great strength, resistance to deformation, and
ability to dissipate load and handle the forces generated within the joint.2
The pathophysiology of OA is almost certainly multifactorial, with interplay
between systemic and local factors. The systemic risk factors include ethnicity, age,
gender and hormonal status, genetic factors, bone density, and nutritional factors.
Local biomechanical factors include obesity, altered joint biomechanics (including
ligamentous laxity, malalignment, impaired proprioception, and muscle weakness),
prior joint injuries, occupational factors, the effects of sports and physical activities.3 It
is the combination of molecular damage and inability to effectively manage physical
forces, leading to pathology.2
The symptoms of OA are often associated with significant functional
impairment, as well as signs and symptoms of inflammation, including pain, stiffness
and loss of mobility.4 In agreement with the Brazilian consensus for the treatment of
osteoarthritis, the treatment should be multidisciplinary and seek functional,
mechanical and clinical improvement.5 The treatment can be either pharmacological,
with the use of analgesic and anti-inflammatory drugs, and nonpharmacological, with
physiotherapy and invigorating and stretching exercises, besides aerobic exercises
of low and medium intensity. Exercise of low and medium impact exert elastic and
compressive forces on the joint cartilage, similarly as those observed in studies
48
including cartilage explants (Fehrenbacher, 20036; Fitzgerald, 20067; Giannoni,
20038; Murata, 20039; Valhmu 200210; Valhmu, 199811), in in vitro systems such as
agarose (Mio, 200512; Mauck, 200713; Kisiday, 200214) alginate (Giannoni, 20038)
and other polymeric scaffolds (Grodzinsky, 200015). At low magnitudes, tensile forces
act as potent anti-inflammatory signals and inhibit IL-1β–, TNF-α-, and
lipopolysaccharide-induced proinflammatory gene transcription,16,17,18. Thus, the
purpose of this study was to evaluate the effects of a physical-training program on
histological parameters and oxidative stress markers in cartilage of rats with
osteoarthritis.
Materials and methods
Sample: Eighteen 4-month-old male Wistar rats were used and cared for according
to the European Communities Council Directive of 24 November 1986. Food (Nuvilab
CR1, Nuvital Nutrientes S/A, Brazil) and water were available ad libitum. The room
was kept at 70% humidity, 20±2ºC on a 12-h light/dark cycle with lights on at 06.00
a.m. The mice were periodically checked to verify their pathogen-free condition. The
animals were randomly divided into three groups (n=6): control (C), osteoarthritis
(OA) and osteoarthritis plus exercise (OAE).
Osteoarthritis Exposure: The animals were anesthetized with ketamine (90 mg /
kg, i.p.) and Xylazine (20 mg /kg, i.p.); osteoarthritis was induced by direct infiltration
of both knee joints with a 27-gauge needle and a 2-mL syringe containing 1.2 µL of
iodoacetate diluted in 50 µL saline solution, according to Guzman (2003).19
49
Training Protocol: Twenty-four hours after the induction of osteoarthritis, all groups
were habituated on a motor-driven treadmill at a speed of 10 m/min for 10 min/day
during one week to reduce their stress to the new environment. The rats did not
receive any stimuli to run. The exercise groups performed an incremental running
program to obtain progressive levels of intensity during 8 weeks for 3 days/week and
for a total period of 60 days. The untrained animals were put on the switched-off
treadmill during the same 8 weeks as the exercise-trained groups.
Intra-Articular Lavage (IAL): IAL of the right knee joints was performed with
2x50 µL of 0.9% NaCl under anesthesia (ketamine 90 mg/Kg and Xylazine 20 mg/Kg,
i.p.). Approximately 70µL IAL fluid (IALF) was recovered from each rat. IALF was
immediately diluted in 0.5 mL of distilled water and centrifuged at 300 g for 10 min.
The IALF supernatants were stored at -70 oC for later analysis. Immediately after
recovering IAL, the animals were killed by decapitation and the articular capsule was
removed. The sample was homogenized in phosphate buffer and frozen at -70 oC for
further analysis.
Histology: The soft parts of the left joint of all the animals were dissected and stored
in 4% neutral-buffered formalin for 24 h. Afterwards, they were kept in a running-
water bath for two hours for removing excess fixative. They were then placed in 10 %
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 7.4, for decalcification. The EDTA was
changed every 48h / 48h / 72h for approximately ten weeks until the bone was
satisfactorily decalcified. Tissue blocks were placed in formalin, dehydrated in a
graded series of ethanols and xylol, embedded in paraffin, cut into 6-mm-thick serial
sections, and stained with hematoxylin-eosin for analyses of the cartilage joint,
50
subchondral bone and disk epiphyses. The femur and tibia were evaluated
separately as to their histological appearance. In both, the sections were divided into
three areas of analysis, according to illustration (Fig. 1). Proteoglycan preservation in
the cartilage matrix was evaluated using a metachromasia scale of proteoglycan
preservation evidenced by toluidine blue. Thus, we consider (+) for mild, (++)
moderate, and (+++) intense metachromasia.
Biochemical assays
Myeloperoxidase (MPO) Activity: IALF and the capsule (10 µL/mL) was
homogenized in 0.5% hexadecyltrimethylammonium bromide and centrifuged at
5000×g for 5 min. The suspension was then sonicated three times for 30 sec. An
aliquot of supernatant was mixed with a solution of 1.6 mM tetramethylbenzidine and
1 mM H2O2. Activity was measured spectrophotometrically as the change in
absorbance at 650 nm at 37°C.20
Superoxide Dismutase (SOD) Activity: SOD activity of articular capsule was
determined according to the method of Bannister and Calabrese (1987).21 The
enzymatic activity was assayed by adrenaline autoxidation inhibition read at 480 nm
on a spectrophotometer. Enzyme activity was expressed as U/mg protein. SOD of
the joint lavage was not performed due to lack of appropriate material.
Total Thiol Content: Total thiol content of the capsule and lavage was determined
using the 5,5`-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) method (Sigma). The reaction
was started by the addition of 30 µL of 10 mM DTNB stock solution in PBS. Control
51
samples did not include DTNB. After 30 min of incubation at room temperature, the
absorbance at 412 nm was measured and the amounts of TNB formed were
calculated (equivalent to the amount of SH groups) using the Aksenov technique
(2001).22
Protein Content: Protein concentration was estimated by the method of Lowry23,
using bovine serum albumin as standard.
Statistical Analyses: Means ±S.E.M. were calculated and multiple comparisons
were performed by using one-way ANOVA with Tukey's post-hoc tests. A p value
<0.05 was considered significant. The software used for data analysis was the
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 16.0 for Microsoft
Windows.
Results
Histology
Our results show that the histology of the joint cartilage in both the femur and
tibia of the control group was intact, without anomalies, and with a homogeneous
eosinophilic matrix (Figure 2A). However, in the OA group, the anterior surface of the
joint cartilage of the tibia shows groups of isogenic chondrocytes, embedded in a
homogeneous and slightly basophilic matrix, while in the back, the cartilage matrix is
more stained and shows chondrocytes in greater numbers. In the anterior and
posterior areas of the subchondral bone, there are small infiltration foci of loose
connective tissue rich in fibroblasts and microvessels. This pattern is maintained in
52
the intermediate area, where there is no cartilage, but only bone tissue. The joint
cartilage of the femur presents outbreaks of fibroblastoid infiltrate, mainly in the
intermediate area (Figure 2B), whereas the subchondral bone presents more discreet
outbreaks. In the OAE group, the joint cartilage of the shinbone shows no alterations
in its thickness and some infiltration foci of fibroblastoid cells (Figure 2C) along its
length. In some areas of connective tissue infiltration, we find osteoclasts. In the
back, we can see the reactive proliferation of cartilage cells, evidenced by the
increase of focal chondrocytes. The subchondral bone did not evidence any
changes. The surface of the joint cartilage at the back of the femur presents an
irregular, thickened appearance, with a smaller number of chondrocytes, with gaps
and cracks and small isogenic groups, thus, taking on an aspect of fibrocartilage
(Figure 2D). In the anterior area, the pattern is maintained, but with reduced
thickness and mixed with a loose connective tissue. The subchondral bone did not
evidence any changes. The metachromasia analysis was done in the intermediate
area of the joint cartilage of the femur, as shown in Table 1. The control group
showed intense metachromasia in the superficial and intermediate areas, whereas in
areas of deep and calcified cartilage there was a slight metachromasia. In the OA
group, the superficial and intermediate areas showed slight metachromasia, while the
metachromasia of deep areas with calcified cartilage was intense. The OAE group
presented moderate metachromasia in the superficial and intermediate areas, while
the deeper, calcified area showed slight metachromasia.
Myeloperoxidase Activity (MPO): The MPO activity of the joint capsule (figure 3A)
showed to be high in both groups with OA (OA= 210.586 ± 30.31 MPO activity
mg/protein; OAE= 133.206 ± 24.57 MPO activity mg/protein, p<0.05). Similarly, in
53
joint lavage (figure 3B) was increased in the groups with OA, irrespective of exercise
(OA= 16.315 ± 5.32 activity MPO mg/protein; OAE= 11.955 ± 4.80 MPO activity
mg/protein, p<0.05).
Superoxide Dismutase (SOD) Activity: According to figure 4, SOD activity showed
an increase in the joint capsule of animals with OA and exercise further exacerbated
the antioxidant activity of SOD in this tissue (OA= 7.172 ± 0.43 nmol mg / protein;
OAE = 13.90 ± 0.51 nmol mg/protein, p < 0.05).
Total Thiol Content: According to figure 5, total thiol content was significantly lower
in the OA group compared with the control group. Interestingly, in the OAE group,
total thiol content remained high both in the joint capsule (figure 5A) (OA=13.895 ±
7.624 nmol DTNB/mg protein; OAE= 38.654 ± 3.976 nmol DTNB/mg protein, p<
0.05) and in the joint lavage (figure 5B) (OA=0.460 ± 0.281 nmol DTNB/mg protein;
OAE= 0.974 ± 0.123 nmol DTNB/mg protein, p< 0.05).
Discussion
The present study is one of the few works that assesses the effects of
exercise on osteoarthritic joints of rats. The histomorphological changes found in
slides show evidence of tissue damage characteristic of osteoarthritis in groups
where OA was induced by intra-articular administration of iodoacetate. The most
significant changes were seen in the joint cartilage of the back of both the femur and
the tibia, with increased basophilia, decrease in chondrocytes, and fibroblastoid
infiltrate with an evident change of hyaline cartilage to a fibrous cartilage. These
changes are consistent with other studies of OA.24,25,26,27,28
54
The OA group showed a decrease of metachromasia in the surface and
intermediate areas of the joint cartilage indicating a greater destruction of
proteoglycans in this area, similarly as in the study of Galois et al (2004)29. However,
more intense metachromasia appears in deep and calcified areas of said group in an
attempt to restructure the matrix of the unaffected cartilaginous tissue, as shown in
Table 2.
In the OAE group, the surface and intermediate areas were better preserved
compared with the OA group, suggesting that exercise may have contributed to
preserving proteoglycans that act as a mechanical shock absorbing system,
especially in joint cartilage. This was also observed in the study of Roos & Dahlberg
(2005),30 in which moderate exercise improved GAG content in patients with risk of
knee OA.
It is possible that the joint cartilage depends on the mechanotransduction
mechanism to maintain homeostasis. According to Knobloch (2008),31 biomechanical
signals provide the bridge between gross morphologic signals and molecular gene
expression. The combination of fluid–flow-generated signals coupled to matrix
mechanotransduction generates a complex series of signaling cascades and
ultimately a biomechanical signal–dependent transcriptional response.31 The gene
expression in chondrocytes under compression is dependent on the magnitude,6,11,32
frequency,13 and duration,8,9,11,13,32,33,34 of applied compressive forces.
These data show that physical exercise can be manipulated in intensity,
frequency and duration for obtaining a physiological response of chondrocytes. Our
protocol of exercise was prepared with the purpose of evaluating the effects of
interspersed sessions of aerobic activity with impact on overload joints such as
osteoarthritic knees of rats. The intensity of effort, in agreement with Leandro
55
(2007),35 reached moderate levels. It seems that intensity, frequency and duration of
aerobic exercise in some way modulates chondrocyte response, favoring the
preservation of proteoglycan content in osteoarthritic joints in this stage of the
disease11, as seen in our study.
A study suggests that the dynamic compression upregulates gene expression
of genes such as anabolic ACAN, COL2α1, TIMP3, while downregulating specific
genes of the matrix metalloproteinase (MMP) family.34 Furthermore, cyclic tensile
strain could augment cartilage repair by facilitating the induction of ACAN mRNA and
attenuation of IL-1β– induced suppression of PG synthesis. More importantly,
compressive forces at low magnitudes have been shown to be anti-inflammatory in
nature. These observations suggested that the anti-inflammatory cascade initiated by
the application of dynamic tensile forces persisted despite the cessation of the
biomechanical stimuli.31
One of the pathways regulated in chondrocytes following mechanical
stimulation is the signaling cascade involved in inflammatory responses.31 Attention
soon turned to the NF-κB signaling pathway as a possible link between tensile
loading and chondrocytic responses to proinflammatory cytokines31. Biomechanical
signals are transduced to cells by surface molecules such as β-integrins and focal
adhesion kinases/protein tyrosine 2 kinases.36 At lower magnitudes, biomechanical
signals inhibit nuclear translocation of NF-κB transcription factors and act as potent
inhibitors of IL-1β– and TNF-α–dependent proinflammatory gene transcription.37,38,39
As mentioned by Knobloch (2008),31 compressive, tensile, and shear forces of
appropriate low/physiologic magnitudes also promote the upregulation of
proteoglycans and collagen synthesis that is drastically inhibited in inflamed joints.
This could explain the greater preservation of proteoglycan content, as observed by
56
more intense metachromasia on the superficial and intermediate areas of the joint
cartilage in the exercised rats of the present study.
Measuring tissue MPO activity is an established method of quantifying the
presence of activated leukocytes, primarily neutrophils, and inflammatory response in
damaged tissue40,41,42 Significant elevations of muscle and tissue MPO activity have
been reported following ischemia-reperfusion injury43 as well as exercise.44
According to Morozov (2003),45 even moderate-intensity exercise stimulates blood
neutrophil degranulation, although to a lesser degree. Thus, our results indicate that
the exercise protocol used in our study was adequate for inducing a higher activity of
this enzyme in serum (data not shown) and in specific tissues, such as of the joints.
Moreover, the link between neutrophil proteins and exercise stress relates to three
specific functions of these proteins. Firstly, they can improve blood bactericidal
potency. Secondly, they can activate granulopoiesis in bone marrow and move into
the circulation neutrophils rich in lysosome cationic proteins. Finally, neutrophil
cationic proteins may have a regulatory significance.45
According to Pinho et al (2006),46 exercise promoted important changes in the
antioxidant enzyme activities, reducing oxidative damage and increasing tissue
resistance against free radicals in the soleus muscle. We also found increased
activity of the enzyme superoxide dismutase in the joint capsule of rats with OA that
underwent a chronic aerobic training program with joint impact articulate. This
important finding must be highlighted, because it is usual in clinical practice to
deprive individuals with OA of joints like the hip and the knee from programs of
physical training, especially impact exercise. Our study points to a potential
therapeutic alternative for people with OA as proposed by several studies 47,48
57
Higher total thiol content in the OAE group, both in the joint capsule as in the
joint lavage is the evidence that biomechanical signals generated during joint
movement are essential components of the cells’ and tissues' ability to repair and
recover following physiologic insults, as well as to maintain homeostasis.31 Davies
(1982)49 comments that in nonexhaustive daily training sessions (typical of
endurance exercise training) the generation of free radicals could be the actual
stimulus to exercise adaptation and mitochondrial biogenesis. Therefore, it seems
that ROS may modulate the antioxidant enzyme activities by regulating mRNA levels
through activation of signaling pathways.50 NFκB can bind to promoter areas for
several hours to days after acute exercise and activate the production of more than
one protective enzyme, thereby playing a very important role in defending against
oxidative and radical damage.51
Our group reached the conclusion that aerobic exercise performed on a
treadmill (impact activity) can promote histological and biochemical changes that
benefit the joints of rats with OA. These data indicate that exercise, or more precisely
biomechanical signals converted into biochemical response on the joint cartilage with
OA, can induce anabolic changes in tissues. This is one of the few studies to
evaluate the effects of low-impact physical training on osteoarthritis in rats.
Conflict of Interest The authors declare that there are no conflicts of interest that could have
inappropriately influenced this work.
Acknowledgments
This research was supported by grants from CNPq/MCT (Brazil), CAPES/MEC
(Brazil) and UNESC (Brazil).
58
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TABLE 1- Metachromasia analyses of the articular cartilage
in central area of the femur
Groups
Areas
CTR OA 1,2 mg OA 1,2 mg + Ex
Superficial Medium Deep Calcified
+++ + ++ +++ + ++ + +++ + + +++ +
(+) metachromasia mild; (++) metachromasia moderate; (+++) metachromasia intense. CTR=control,
OA= osteoarthritis; OA+EX= osteoarthritis plus exercise
67
Figure 1: Illustration showing the three areas of reference used for the histomorphological analysis. Anterior area (1), intermediate area (2) the posterior area (3). The patella is indicated by the arrow.
Figure 2: Photomicrographs of histomorphological changes of joint cartilage stained by H & E. Normal appearance of joint cartilage (A). Invasion of fibroblastoid infiltrate in the cartilage (B) and the cartilage and subchondral bone (C). Chondrocytes forming strings with elongated collagen fibers in parallel bands giving it the appearance of fibrocartilage (D). Scale A-C= 100 mm, D = 50 mm.
1 2 3
68
A
B
Figure 3: Myeloperoxidase activity in the joint capsule (A) and IALF (B). Values are expressed as mean ±S.E.M. and results are expressed in MPO activity/mg protein. Significant difference in relation to the corresponding control group (*) and in relation to OA group (#); p<0.05.
Figure 4: Superoxide dismutase activity in the joint capsule. Values are expressed as mean ±S.E.M. and results are expressed in U/mg protein. Significant difference in relation to the corresponding control group (*) and in relation to OA group (#); p<0.05.
69
A
B
Figure 5: Total thiol content in joint capsule (A) and IALF (B). Values are expressed as mean ±S.E.M. and results are expressed in MPO nmol DTNB/mg protein. Significant difference in relation to the corresponding control group (*) and in relation to OA group (#); p<0.05.
70
CAPÍTULO III
V- DISCUSSÃO GERAL
As mudanças histomorfológicas encontradas nas lâminas mostram danos
teciduais característicos de osteoartrite nos grupos induzidos com iodoacetato. As
alterações mais significativas foram vistas na cartilagem articular posterior tanto do
fêmur como da tíbia, com aumento da basofilia, diminuição dos condrócitos e
infiltrado fibroblastóide com uma aparente mudança da cartilagem hialina para
cartilagem fibrosa. Esses dados são consistentes com outros estudos (Cotran et al.,
1996, Tokuda, 1997, Kuettner et al., 1998; Yamamoto et al., 2005; Pritzker et al.,
2006).
O grupo de osteoartrite sem exercício apresentou uma diminuição da
metacromasia nas zonas superficial e média da cartilagem articular indicando uma
importante destruição dos proteoglicanos desta região. Contudo uma importante
metacromasia aparece nas zonas profunda e calcificada no mesmo grupo, indicando
uma tentativa de reestruturar a matriz do tecido cartilaginoso inalterado.
No grupo de osteoartrite mais exercício, houve uma melhor preservação das
zonas superficial e média comparado com o grupo não exercitado, sugerindo que o
exercício poderia contribuir para a preservação dos proteoglicanos que atuam como
sistema de absorção de choque mecânico, especialmente na cartilagem articular.
Esse é um dos poucos estudos que temos conhecimento, que avalia os efeitos do
exercício em ratos com osteoartrose.
É possível que a cartilagem articular é dependente de um mecanismo de
mecanotransdução para manter a homeostasia. De acordo com Knobloch et al.
71
(2008), sinais biomecânicos fornecem a ligação entre sinais morfológicos grossos e
expressão gênica molecular. A combinação dos sinais gerados no fluido ligados a
matriz extracelular gera uma série complexa de cascata de sinalização que culmina
em uma resposta transcricional dependente do sinal biomecânico. A expressão
gênica em condrócitos sobre compressão é dependente da magnitude (Valhmu et
al., 1998; Hunter et al., 2002; Fehrenbacher et al., 2003) freqüência (Mauck et al.,
2007) e duração das forças compressivas aplicadas (Valhmu et al., 1998; Hunter et
al., 2002; Giannoni et al., 2003; Murata et al., 2003; Stoddart et al., 2006; Mauck et
al., 2007).
Esses dados indicam que o exercício físico pode ser manipulado em
intensidade, freqüência e duração para o propósito de obter uma resposta fisiológica
dos condrócitos. Nosso protocolo de exercício foi formulado com o propósito de
avaliar os efeitos de sessões intercaladas de atividade aeróbica de impacto na
articulação do joelho de ratos com OA. A intensidade do esforço, de acordo com um
estudo (Leandro et al., 2007), alcançou valores do esforço moderado. Parece então
que a intensidade, freqüência e duração do exercício aeróbico modula algumas vias
de respostas dos condrócitos, favorecendo a preservação do conteúdo de
proteoglicanos nas articulações osteoartríticas neste estágio da doença, como
observado por nós.
Um estudo sugere que a compressão dinâmica “upregulate” a expressão de
genes anabólicos tais como, ACAN, COL2α1, TIMP3, enquanto “downregulate”
genes específicos como da família das metaloproteases (MMPs) (Fitzgerald et al.,
2004). Ainda mais, a tensão cíclica elástica poderia aumentar o reparo da cartilagem
por facilitar a indução do RNAm do ACAN e atenua a supressão induzida por IL-1β
da síntese de proteoglicanos. Como relatado por Knobloch et al. (2008), forças
72
compressivas em baixas magnitudes tem apresentado características
antiinflamatórias naturalmente. Essas observações sugerem que a cascata
antiinflamatória iniciada pela aplicação das forças tensil dinâmicas persistiram
apesar da cessação do estímulo biomecânico.
Uma atenção tem sido dada a via de sinalização do NF-kB como uma
possível ligação entre tensão de sobrecarga e resposta condrocítica as citocinas
proinflamatórias. Sinais biomecânicos são transduzidos para as células pelas
moléculas de superfície tais como β-integrinas e proteínas tirosina kinases. Em baixa
magnitude, sinais biomecânicos inibem a translocação nuclear dos fatores de
transcrição e atuam como potentes inibidores da transcrição gênica proinflamatória
dependente da IL-1β e TNF-α (Angele et al., 2004; Trindade et al., 2004; Ferreti et
al., 2005). Forças compressivas, tensil e elásticas de baixa magnitude fisiológica
também promovem a “upregulation” da síntese de proteoglicanos e colágeno que é
drasticamente inibida em articulações inflamadas (Knobloch et al., 2008). Isto
poderia explicar a importante preservação do conteúdo de proteoglicanos através da
maior metacromasia nas áreas superficial e média da cartilagem articular dos ratos
exercitados.
A MPO é considerada não somente como um marcador inflamatório, mas
também, um marcador de dano oxidativo (Morozov et al., 2003). A atividade da
mieloperoxidase permaneceu elevada no soro e na articulação (cápsula e lavado
articular) dos animais com OA independentemente do exercício, uma possível
explicação é baseada na suposição que a atividade física, através de ações
hormonais, estimula a degranulação dos neutrófilos, isto poderia resultar em uma
diminuição de determinado conteúdo de proteínas dos neutrófilos e um aumento no
plasma sangüíneo e em tecidos específicos. Elevações significantes da atividade da
73
MPO muscular foram encontradas seguintes lesões por isquemia-reperfusão (Smith
et al., 1989), assim como no exercício (Belcastro et al., 1996). A ligação entre
proteínas dos neutrófilos e o estresse por exercício está relacionada a três funções
específicas dessas proteínas. Primeiro, essas proteínas podem promover uma maior
potência bactericida sangüínea, segundo, essas proteínas podem ativar
granulopoiese na medula óssea e mover para a circulação neutrófilos ricos em
proteínas catiônicas lisossômicas. Finalmente, as proteínas catiônicas poderiam ter
um significado regulatório (Morozov et al., 2003). Nossos resultados demonstram
que o protocolo de exercício utilizado em nosso estudo foi suficiente para induzir um
aumento da atividade desta enzima no soro e em tecidos específicos tal como a
articulação do joelho de ratos.
Diferentemente da MPO, os animais com OA na articulação do joelho
submetidos a um protocolo de exercício físico aeróbico evidenciaram uma
diminuição do estresse oxidativo indicado pela menor carbonilação de proteínas,
lipoperoxidação, xilenol laranja e maior preservação dos grupos tióis. Parece que
mecanismos adaptativos observados com o exercício moderado aumentam as
defesas antioxidantes, reduzem a produção de oxidantes e o vazamento de radicais
durante a fosforilação oxidativa (Leeuwenburgh et al., 2001). Esses dados são
similares a outro trabalho onde, o exercício moderado significativamente diminuiu o
estresse oxidativo associado a idade em camundongos, aumentou a qualidade de
vida, preveniu o decaimento da função mitocondrial, e ainda melhorou o
desempenho (Packer et al., 2008). É provável que o treinamento aeróbico imposto a
esses animais, durante um período de aproximadamente 2 meses, induziu a
expressão e aumentou a atividade de várias proteínas e enzimas, inclusive da
superóxido dismutase. De acordo com Hollander et al. (2001), um simples período
74
de exercício pode induzir uma adaptação e uma proteção aumentada através da
superóxido dismutase.
Parece que altos níveis da enzima superóxido dismutase acompanham o
processo fisiopatológico da OA como evidenciado por alguns trabalhos (Ostalowska
et al., 2006). Nossos resultados indicam que o exercício não modificou a alta
atividade desta enzima no soro de ratos com OA, mas na cápsula articular essa
atividade demonstrou-se significativamente mais intensa.
O conteúdo maior de tióis no grupo com OAE, tanto na cápsula e lavado
articular quanto no soro é a representação que sinais biomecânicos gerados durante
o movimento articular são componentes essenciais das células e dos tecidos para a
recuperação e o reparo seguinte insultos fisiológicos, assim como também para
manutenção da homeostasia (Knobloch et al., 2008). Davies et al., (1982) comenta
que em sessões de treinamento diária não exaustiva (típicas do treinamento de
endurance), a geração de radicais livres pode ser o estímulo para a adaptação ao
exercício e biogênese mitocondrial. Portanto, parece que a ROS pode modular a
atividade enzimática antioxidante por meio da regulação dos níveis de RNAm
através da ativação de vias de sinalização (Fulle et al., 2004). O NF-kB pode ligar-se
a regiões promotoras por várias horas a dias depois do exercício agudo e ativar a
produção de mais do que uma enzima protetora, portanto executando um importante
papel nas defesas contra lesões oxidativas (Gomes-Cabrera et al., 2005).
75
CAPÍTULO IV
VI- CONCLUSÕES, CONSIDERAÇÕES E PERPECTIVAS
Nossos dados sugerem que um programa de exercício aeróbico não intenso
poderia ser direcionado e aplicado em indivíduos com OA de grau leve a moderado
pois, de acordo com nossos resultados a atividade de impacto moderado não
exacerba o problema, pelo contrário, parece reduzir o estresse oxidativo e promover
mudanças anabólicas na cartilagem articular.
Esse trabalho teve o intuito de simular uma condição clínica muito comum que
é a osteoartrite em articulações de impacto. Consideramos essa pesquisa de grande
importância por elucidar os possíveis benefícios do exercício no processo
fisiopatológico desta doença.
Pesquisas futuras são necessárias para compreender melhor o papel do
exercício em articulações com osteoartrite, principalmente se demonstrarem por
quais mecanismos moleculares e em que nível de intensidade de esforço isso
ocorre.
76
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