curso pcr tempo real e aplicaçoes xviii met out 2013

Genetic Resources and Biotechnology

Cenargen

Curso PCR em Tempo Real

Dr. Júlio Carlyle M. Rodrigues (Cenargen)

XVIII MET – Salvador, Outubro 2013

Introdução: Reação em Cadeia da Polimerase

• Mecanismo de replicação;

• Histórico;

• Princípios;

• Aplicações.

Replicação do DNA

Replicação do DNA

Mecanismo de reação da DNA polimerase

• ataque nucleofílico –OH/PO4;

• cofatores: metais divalentes (Mg+2);

• energia: quebra de pirofosfato;

• pareamento posiciona dNTP corretamente

PCR: histórico

• 1953 – Watson & Crick: estrutura (1962)

• 1957 – Arthur Kornberg: replicação e descoberta da DNA polimerase (1959)

• 1959 – Gobind Khorana: código genético, síntese de oligonucleotídeos (1968)

• 1969 – Thomas D. Brock: isolamento da bactéria Thermus aquaticus

• 1970 – Isolamento do fragmento Klenow

• 1971 - "... one would hope to obtain two structures, each containing the full length of the template strand appropriately complexed with the primer. DNA polymerase will be added to complete the process of repair replication. Two molecules of the original duplex should result. The whole cycle could be repeated, there being added every time a fresh dose of the enzyme."

• 1976 – Isolamento de DNA polimerase de T. aquaticus

• 1977 – Frederick Sanger – Sequenciamento (1980)

•Pesquisa em diagnóstico – Cetus Corporation, California

•Kary B. Mullis (1983) – reação cíclica para detecção da mutação de anemia falciforme (usou princípio de Sanger e teve a idéia de colocar o 2nd primer);

• Cetus – aplicou para patente em Março, 1985, aprovada em 1987;

• Cetus – purificação e utilização da Taq polimerase, patente Junho 1987, aprovada em 1990;

• 1985 – joint venture Cetus- Perkin Elmer: instrumentação;

• Kary B. Mullis – Nobel 1993

• Roche compra patente por US$ 300.000.000,00

PCR: histórico

Polymerase Chain Reaction


• simplicidade;

• custo;

• diversidade de aplicações;

• material biológico limitante.

PCR: cuidados

• Contaminação!!!!

Bancada, primers, reagentes, pipetas

• preparar controles negativos/positivos;

• sempre uma boa idéia sequenciar produtos;

• desenho de primers fundamental: evitar ‘hairpins’, complementariedade (formação de dímeros). Programas:

primer3 (http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm);

PCR: otimização

• MgCl2 - altas concentrações facilitam inespecificidade, típico 1,5 mM;

• dNTP – alta concentração aumenta erro, típico 0,2 mM;

• concentração do molde: muito pode favorecer inespecifidade;

• temperatura de anelamento do primer: ponto mais crítico, quanto mais alta mais específico. Testar usando gradiente;

• tempo do ciclo: extensão - de acordo com tamanho do fragmento a ser amplificado (aprox. 1Kb/min)

Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription)

• análise de expressão gênica;

• isolamento de RNA (total ou poli-A+);

• síntese de cDNA (transcriptase reversa);

• PCR com primers específicos

Aplicações: RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)

• obtenção de cDNA full length;

•kits (Clontech/Invitrogen);

• extração de RNA total;

• sintese de cDNA (oligo-dT);

• adição de adaptadores nas pontas;

• PCR usando primers gene-específicos e primers específicos aos adaptadores;

• derivação: genome walking – elementos regulatórios (promotores)

Aplicações: RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA)

• detecta polimorfismos;

• utilização de primers randômicos (6nt);

• gera marcadores moleculares;

• pode gerar SCAR (Sequence Characerized Amplified Region)

Aplicações: PCR-based diagnostic assays

US$ 5,4 bilhões (2008)


Considerações importantes

• Qualidade do RNA (padronizar protocolo);

• Remoção de DNA;

• Quantificação precisa (Nanodrop + gel);

• Genes de referência: constitutivos/housekeeping;

• Controle negativo: sem template/reações de cDNA sem TR;

• Controle positivo: gDNA

Genes de Referência

• controle de quantidade inicial de molde (evitar diferenças de amplificação sejam devido à quantidades iniciais diferentes): Normalização

• mesmo número de cópias em todas as células;

• expressão em todas as células;

• Exemplos: gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase; actina; tubulina; ubiquitina, genes ribossomais, etc.;

• Pode variar de acordo com tecido: TEM QUE TESTAR!!



Semi-quantitativo

• análise na fase exponencial do PCR;

• usar mesma quantidade de molde;

• montar vários tubos da mesma reação;

• variar qtde de ciclos de cada reação;

• softwares de análise de imagem (Image J)


Pq PCR em tempo real? QUANTIFICAÇÃO

Método de detecção de produtos de amplificação: SYBR Green

Vantagens:

• custo;• sensibilidade;• só liga a DNA fita dupla;• não interfere na reação.

Desvantagens:

• liga a qualquer DNA fita dupla(detecta produtos inespecíficos)

Método de detecção de produtos de amplificação: TaqMan probes

Vantagens:

• especificidade;• sensibilidade.

Desvantagem:

• custo (uma sonda por reação)

Método de detecção de produtos de amplificação

PCR em Tempo Real: quantificação de expressão gênica

• vantagem quando o RNA é limitante;

• muito mais sensível que RT-PCR comum;

• fazer cDNA com kits comerciais, testar diluições (depende do nível de expressão do gene);

• desenho de primers: amplicon pequeno (100 a 200 bp); Tm alto; muito cuidado com formação de dímeros!

• fazer amostras em triplicatas.

PCR em Tempo Real

PCR em Tempo Real: genes de referência

• controle de quantidade inicial de molde (evitar diferenças de amplificação sejam devido à quantidades iniciais diferentes): Normalização

• mesmo número de cópias em todas as células;

• expressão em todas as células;

• repetições para ter média;

• Exemplos: gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase; actina; tubulina; ubiquitina, genes ribossomais, etc.;

• Pode variar de acordo com tecido: TEM QUE TESTAR!!

Passo-a-passo

1) Extração de RNA total

2) Sintese de cDNA – same kit, standard and optimized protocol;

3) Gene de referência;

4) Primer design – parâmetros, teste com RT-PCR convencional;

5) Curva de diluição – eficiência , determinar diluição para experimento, curva de dissociação (especificidade);

6) Experimento – triplicata

7) Análise – Delta-delta Ct

8) Data – Fold change

Extração de RNA total

• time points – controle rígido, padronização de tratamentos;

• DNAse treatment – controle, primers spanning introns;

• integridade: gel - ribossomais;

• quantificação: nanodrop e gel;

Gene de referência

• testar vários;

• estabilidade, pouca variação (geNorm);

• experimento: pode usar mais de um para normalização;

• geNorm: determina estabilidade entre vários genes testados, Calcula fator de normalização - auxilia na escolha

Gene de referência

meristema

flor

raiz

PCR em Tempo Real: genes de referência

• parâmetros: GC 40-50%, 18-22 nt, amplicon de 100-200bp

• cuidados: auto-complementariedade, dimerização;

• Primer 3 software – http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/

• teste com RT-PCR convencional;

• Determinar eficiência;

• Curva de diluição – usar cDNA ou plasmídeo;

• determinar diluição para experimento;

• curva de dissociação (especificidade);

Desenho de primers

http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/

http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/

Desenho de primers – Primer3

PCR em Tempo Real: correlação e eficiência dos primers

Eficiência: E = 10(-1/slope) –1

PCR em Tempo Real: correlação e eficiência dos primers

PCR em Tempo Real: curva de dissociação

Desnaturação e Temperatura em que fluorescência some

Depende de tamanho e sequência: utilizado para genotipagem

Mais de um pico: recomenda desenho de primers novos

PCR em Tempo Real: quantificação por curva padrão

• fazer curva padrão atribuindo valores para cada ponto de diluição;

• quantificar amostras desconhecidas na curva padrão;

• correlação (r2) tem que ser alta e valores das amostras dentro da curva;

• normalização com valores do gene de referência;

• Quantificação absoluta: saber número de cópias, moléculas, partículas virais

PCR em Tempo Real: quantificação por curva padrão

PCR em Tempo Real: quantificação relativa método DDCt

• ∆Ct(controle)- ∆Ct(tratamento);

• assume eficiência de 100% para os dois pares de primers;

• precisa ser validado: curva padrão;

• bastante utilizado, mas o Pfaffl corrige para eficiências diferentes.

PCR em Tempo Real: quantificação relativa formula de Pfaffl

PCR em Tempo Real: quantificação relativa método DDCt

• 2∆∆Ct;

• 211.40 = 2702

• pelo método Pfaffl: 1901

REST (Relative Expression Software Tool) - rest.gene-quantification.info/

Corrige variações do gene de referência, entre placas, vários genes de referência

Statistical analysis programs

Statistical analysis programs

http://www.biotechniques.com/softlib/qgene.html

Q-gene

Aplicações PCR em tempo real

• Expressão gênica;

• Detecção de transgenes – número de cópias, rastreabilidade;

• Diagnóstico – presença/ausência, genotipagem;

• microRNA expression;

• multiplex para detecção, diagnóstico e expressão

PCR em Tempo Real: Aplicações

Transgenic detection


Pathogen detection

Alteração da temperatura dos picos mostra fragmentos diferentes: genotipagem


Pathogen detection

Painel de primers e alvos:

presença/ausência

genotipagem


Pathogen detection

Detecção e análise de expressão de microRNA

• codificados por genes endógenos;

• 21-22 nucleotídeos;

• afetam expressão de genes-alvo: bloqueio/degradação de mRNA;

• controlam vários processos do desenvolvimento de plantas e animais;

• detecção por gel de acrilamida;

• validação de high throughput small RNA data


microRNA expression



• Análise por Southern blot;

• Caro, time-consuming, método radioativo;

• Real-time: análise em high throughput;

• Método delta-delta Ct: gene endógeno com número de cópias conhecido;

• Planta não transformada ou previamente caracterizada



Gene endógeno

Transgene

- Quantificação pode determinar número de cópias

Detecção de transgenes: Javdi et al. Euphytica (2010) 173:185–191

Taqman probe

1)Curva padrão

Adicionar plasmideo equivalente de acordo com tamanho do genoma;

Usar DNA de planta não transformada;


2) Curva padrão: reação multiplex gene endógeno e transgene;

TPS – uma cópia por genoma;

Delta Delta Ct


Homozigose – valores pequenos negativos, Hemizigose - valores positivos pequenos,Não transgênico – valores altos negativos

Real-Time PCR Technology for Cancer Diagnostics

Método: Taqman probes

Alvo: Proteína p53


High Resolution Melting (HRM) analysis: Genotyping

Fibrose Cística

Detecção de SNP – HTR2A


High Resolution Melting (HRM) analysis: Genotyping

Simultaneous detection of Brazilian isolates of grapevine viruses by TaqMan real-time RT-PCR. Dubiela et al, Trop Plant Path 38(2). 2013

Taq probes and primer sets


Variabilidade genética dificulta detecção e diagnóstico

Desenvolvimento de técnica para detectar isolados virais brasileiros

Metodologia

Infecção controlada com amostras controle;

Sondas: alinhamento e detecção de regiões conservadas;

Extração de RNA total;

Real time

96-well plates using the kit TaqMan Master Mix One-Step RT-PCR (Applied Biosystems): 6.1 µL of the One-Step RT-PCR Master Mix (containing AmpliTaq Gold DNA polymerase, dNTPs, a passive reference ROX and optimized buffer); 0.6 µL of the mixture of primers and probe(s) (415 nM primer and 85 nM probe); 0.3 µL of MuLV reverse transcriptase and RNAse inhibitor and 3 µL of total RNA (ca. 300 ng) to a final volume of 12 µL.

Thermocycler StepOnePlus Real-time PCR System (Applied Biosystems) :45ºC for 35 min (for reverse transcription), 95ºC for 10 min (activation of AmpliTaq Gold), followed by 40 cycles at 95ºC for 15 s (denaturation) and 60ºC for 1 min (annealing and extension).

Presence/absence assays by determining the CT (threshold cycle). It was established that a CT value below 35 indicates a positive result.

To check the efficiency and reproducibility of reactions resulting from the use of primers and probes, virus-infected control samples and samples with unknown phytosanitary status were analyzed in simplex reactions for all ten viruses evaluated.



Grapevine leafroll-associated virus (GLRaV-1, -2, -3 and -5),

Grapevine virus A (GVA),

Grapevine virus B (GVB),

Grapevine virus D (GVD),

Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (GRSPaV),

Grapevine fleck virus (GFkV)

Grapevine fanleaf virus (GFLV)


Duplex – detecção de dois isolados virais

Análise de 6 sets de primers para detecção de 4 isolados. Qual par funcionou melhor?

Thanks for Your Attention!Thanks for Your Attention!

Julio Carlyle, PhDJulio Carlyle, PhD

Assessor CHPD – BiotecnologiaAssessor CHPD – Biotecnologia

Embrapa Genetic Resources and Embrapa Genetic Resources and BiotechnologyBiotechnology

[email protected]@embrapa.br

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