cultura e crescimento microbiano aula4 30_11_2015

MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

ENGENHARIA AMBIENTAL

Prof.ª Mestranda Graziele Ruas 2 Sem 2015

CULTURA E CRESCIMENTO MICROBIANO NUTRIÇÃO

Crescimento Microbiano

• Objetivos da Aula:

• Identificar as fases da curva de crescimento dos microrganismos e o que caracteriza o início e o fim de cada fase;

• Conhecer os tipos de associações e os fatores internos e externos que influenciam na velocidade de crescimento dos microrganismos;

• Conhecer os métodos de quantificação dos microrganismos.

Biologia Ambiental 2014 2


• O CRESCIMENTO CELULAR é definido como aumento coordenado de todos os constituintes celulares. Consequência => Multiplicação Celular;

• O CRESCIMENTO MICROBIANO é normalmente associado ao crescimento de uma população de células de um dado microrganismo, ou seja, com aumento do número de células da população



• Tempo de Geração é o intervalo de tempo necessário para que uma célula se duplique;

– O tempo de geração é variável para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos ou até dias, os microrganismos de interesse ambiental ou tecnológico têm tempo de geração que varia de 1 a 3 horas;

– Depende dos fatores genéticos, ambientais e nutricionais.



• O Crescimento Microbiano pode ocorrer em meio líquido com células em suspensão ou associados a superfícies (biofilmes, flocos, e outros).



• O crescimento individual

termina com a divisão da

célula, gerando duas células –

filhas, independentes e

autônomas.



• Etapas do Crescimento Populacional

– INÍCIO;

– FASE LAG (latência);

– FASE EXPONENCIAL (log);

– FASE ESTACIONÁRIA;

– FASE DE DECLÍNIO.



• Sistema fechado de cultivo => curva de crescimento. (Ex: reatores em batelada).



• Sistema fechado de cultivo => curva de crescimento.


Crescimento Microbiano –Fase LAG ou Adaptativa (I)

• Fase em que não há multiplicação celular;

• Ocorre a síntese de enzimas;

• As células apresentam-se em tamanho aumentado;

• Há síntese e consumo de grânulos de reserva.


Crescimento Microbiano –Fase LAG ou Adaptativa (I)

• É um período de adaptação ao novo meio, ocorre a síntese de enzimas;

• ↑Tamanho das células;

• ↑ da atividade Metabólica;

• Transcrição do DNA (sem replicação);

• Síntese de DNA.


Crescimento Microbiano –Fase LOG ou Exponencial (II)

• Crescimento logarítmico (Exponencial);

• Fim da síntese de enzimas;

• Célula voltam ao tamanho normal;

• Absorvendo os nutrientes do meio;

• Sintetizando constituintes celulares;

• As células são sensíveis às mudanças ambientais e compostos antimicrobianos;

• Há predominância de células jovens.


Crescimento Microbiano –Fase LOG ou Exponencial (III)

• Equação do Crescimento

• N = N0.2n

• Onde N é o nº de microrganismos ao fim de n divisões e N0 é o nº inicial de microrganismos;

• A velocidade exponencial de crescimento é expressa pelo número de divisões no tempo:

• R=n/t-t0;

• Tempo de Geração:

• G = 1/R.


Crescimento Microbiano –Fase LOG ou Exponencial (III)


Fase Log ou Exponencial (III)


Crescimento Microbiano –Fase Estacionária (III)

• O número de bactérias que surge é o mesmo que morre;

• Acúmulo de metabólicos tóxicos (Ácidos Orgânicos);

• Exaustão de Nutrientes;

• Alteração nas condições físicas do meio;

• As células apresentam tamanho

• Menor que nas fases anteriores;


Crescimento Microbiano –Fase Estacionária (III)

• Nessa fase há um favorecimento à adesão e agregação entre as células;

• A membrana plasmática torna-se menos permeável;

• A célula tem maior resistência ao choque térmico, pressão osmótica e estresse oxidativo;

• Há redução da síntese proteica;

• Há síntese de proteínas específicas.


Crescimento Microbiano –Fase de Declínio (IV)

• As células perdem a capacidade de se dividir;

• Número de células mortas > células novas;

• Ocorre o processo de esporulação (Esporos Bacterianos);

• Há impossibilidade de produção de energia e elevado produção de enzimas autolíticas.


Crescimento Descontínuo e Crescimento Contínuo

• Crescimento Descontínuo: são as quatro fases citadas (Lag, Log, Estacionária e Declínio);

• Crescimento Contínuo: compreende as duas fases lag e exponencial, estabilizando e mantendo a fase exponencial com o suprimento contínuo de nutrientes e remoção contínua e na mesma proporção de células do meio.


Medidas de Crescimento Microbiano

• Vários métodos na contagem do número total de células ou mensuração da massa celular – adaptáveis para diferentes organismos ou situações;

• Avaliação Direta – contagem de células, filtração e técnica do número mais provável;

• Avaliação Indireta – Turbidez, Atividade Metabólica e Peso seco.


Medidas do Crescimento Microbiano

• Métodos que determinam o número de células;

– Diretos;

– Indiretos.

• Métodos que determinam a massa das células.


Métodos que Determinam o Número de Células

•Método Diretos;

•Métodos Indiretos.


Métodos que Determinam o Número de Células – Método Direto

• Métodos Diretos 1. Enumeração ao microscópio

(com uso de lâminas especiais); (Câmara de Petroff-Hausser e de Neubauer);

2. Enumeração por câmara eletrônica (através de condutividade elétrica).


Métodos que Determinam o Número de Células – Método direto

• Métodos diretos

1. Método de contagem de células viáveis ou unidades formadoras de colônias (UFC).


Métodos que Determinam o Número de Células – Método direto


Diluição Decimal para Plaqueamento


Útil para analisar grandes volumes de água

Métodos que Determinam o Número de Células – Método direto MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL

• É uma técnica estatística: quanto maior o número de bactérias em uma amostra, maior será o número de diluições necessárias para reduzir a densidade até um ponto em que nenhuma bactéria esteja presente nos tubos de diluição seriada;

• Esse método também é utilizada para identificar microrganismos (como bactérias que fermentam lactose produzindo ácido = coliformes);

• Oferece uma estimativa de 95% de probabilidade de a população bacteriana estar em uma faixa determinada.


Métodos que Determinam o Número de Células – Método Indireto


Métodos que Determinam a Massa das Células

MÉTODOS INDIRETOS

1. Massa seca: a massa celular é separada por centrifugação, ou filtração, seca e pesada;

2. Dosagem de proteína celular: as células são centrifugadas e o conteúdo proteico dosado;

3. Dosagem de ATP (Identifica células viáveis) – reação de luminscência.

MÉTODOS INDIRETOS

3. Turbidimetria;


Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano

Limitações de Crescimento pelos Fatores Ambientais

Lei dos Mínimos de Leibig

• O crescimento da população é limitado pelo elemento cuja concentração é inferior a um valor mínimo – o crescimento da biomassa é determinado pelo nutriente em menor concentração;

Lei de Tolerancia de Shleford

• Faixa de tolerância de sobrevivência e crescimento com seus limites superior e inferior – o organismos só cresce em determinada faixa de fatores ambientais;


Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano

• FATORES AMBIENTAIS

• Os fatores ambientais influenciam a absorção de nutrientes e portanto no próprio metabolismo celular;

• Os principais fatores são: pH, pressão osmótica, Temperatura, Oxigênio e Luz.


Fatores que controlam o

Desenvolvimento Microbiano - pH • A maioria dos microrganismos crescem

melhor em pH próximo a neutralidade (6,5 a 7,5);

• Os microrganismos apresentam valores de pH, mínimo, ótimo e máximo para multiplicação;



Desenvolvimento Microbiano - pH Bactérias: pH entre 5 e 9;

Classificação das bactérias em relação ao pH: • Neutrófilas: espécies que crescem em faixas de

pH entre 5,4 a 8,5 (EX: Maioria das bactérias patogênicas);

• Acidófilas: espécies que crescem em faixas de pH extremamente baixas, entre 0,1 a 5,4. Ex: Bactérias do estomago – Helicobacter pylory.

• Alcalinófilas: crescem em faixas de pH entre 8,5 e 11,5.



Desenvolvimento Microbiano - pH

• Tolerância ao pH

• Maior tolerância a valores baixos de pH: Bolores > Leveduras > Bactérias;

• Microrganismos patogênicos apresentam uma faixa de pH mais estreita;



Desenvolvimento Microbiano - pH Efeito dos Ácidos nos Microrganismos

• Maior gasto de energia para manter o pH intracelular;

• Desnaturação de proteínas (DNA);

• Alteração das atividades das enzimas, vitais para as células;

• Menor velocidade de crescimento.



Desenvolvimento Microbiano - pH pH do Alimentos

• Alimentos pH > 4,5 => mais sujeitos ao crescimento bacteriano;

• pH entre 4,0 e 4,5 => predominância do crescimento de bolores e leveduras, poucas bactérias;

• pH < 4,0 => crescimento de bolores e leveduras.


Fatores que controlam o Desenvolvimento

Microbiano – Pressão Osmótica • As bactérias tem mecanismos que as

permitem manter a pressão osmótica elevada.

• Sempre que houver uma diferença de concentração de soluto entre os meios externos e internos (intracelular), as moléculas de água tenderão a igualar as concentrações, fluindo do lado menos concentrado para o mais concentrado.



Microbiano – Pressão Osmótica • As bactérias geralmente vivem meios

hipotônicos, mas possuem recursos que permitem a manutenção de alta osmolaridade interna;

• Por outro lado a parede celular rígida permite que o citoplasma possa apresentar alta concentração de solutos sem lise celular.



Microbiano – Pressão Osmótica



Microbiano – Temperatura • Quando a temperatura

aumenta, os processos químicos e enzimáticos ficam mais rápidos;

• ↑ Temperatura => ↑Taxa de crescimento;

• Pode ocorrer desnaturação proteica.



Microbiano – Temperatura • Classes Térmicas do Microrganismos



Microbiano – Temperatura Psicrotrófico:

• Pseudomonas, Alcalígenes, Flavobacterium, Micrococcus; Mesófilos:

• A maioria das espécies ; Maior parte dos patógenos; Termófilos:

• Algumas espécies de Bacillus e Clostridium.

Bolores: • Faixa ampla de temperatura; Crescem em temperatura de

refrigeração; Leveduras:

• Crescem na temperatura de psicrotróficos e mesófilos.



Desenvolvimento Microbiano – Luz

• A luz é um fator essencial para bactérias fotossintetizantes;

• Pode inibir o crescimento de alguns microrganismos.



Microbiano – Oxigênio • O oxigênio exerce um papel decisivo no crescimento

bacteriano, já que os microrganismos reagem diferentes a sua presença.

As bactérias podem ser divididas em: • Aeróbias estritas: Necessitam de O2; • Microaerófilas: Necessitam de O2 em baixa

concentração; • Facultativas: Desenvolvem-se tanto na presença,

quanto na ausência de O2; • Anaeróbias Tolerantes: não utilizam O2; • Anaeróbias Estritas: Oxigênio é letal.



Microbiano – Oxigênio


Efeito da Concentração de Nutrientes (ou Substrato)



• Baixas concentrações de nutrientes determinam baixa velocidade de tomada de nutrientes.

• Quando as concentrações dos nutrientes estão baixas a velocidade de assimilação é que determina a velocidade específica de crescimento;

• Já quando as concentrações dos nutrientes são altas, a constante de velocidade específica independe de tais concentrações. Segundo Barbosa et al. (1999) “a velocidade máxima provavelmente é resultante da saturação dos transportadores de membrana pelos nutrientes”.



Macronutrientes

• Necessários em grandes quantidades;

• Tem papel na estrutura celular e metabolismo;

Micronutrientes:

• Necessários em Pequenas quantidades;

• Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas.


Componentes Celulares

Fonte de Carbono

• Compostos Orgânicos (heterotróficos) – carboidratos, lipídeos, proteínas;

• Dióxido de Carbono (autotróficos) – a fonte de energia é a luz ou compostos inorgânicos.


Componentes Celulares - Macronutrientes

Fonte de Nitrogênio

• É o elemento necessário em maior quantidade depois do carbono, ~12%. – constitui proteínas, ácidos nucléicos, etc).

• O N está presente em moléculas orgânicas (Aminoácidos, peptídeos) e em moléculas

inorgânicas (NH3, NO3-, N2)


Componentes Celulares - Macronutrientes

Hidrogênio

• Presente em compostos orgânicos e inorgânicos (água, sais e gases);

• Funções:

• Manutenção do pH;

• Formação de ligações de H entre moléculas;

• Fonte de energia nas reações de oxirredução na respiração.



Outros Macronutrientes: • P –Síntese de ácidos nucléicos, ATP; • ƒ S –Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas; • ƒ K–Atividade de enzimas; • ƒ Mg–Estabilidade dos ribossomos; • ƒ Ca–Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de

endósporos; • ƒ Na–Requerido em maior quantidade por microrganismos

marinhos. Bactérias halofílicas extremas não crescem com menos de 15% de sal;

• ƒ Fe–Papel chave na respiração, componente dos citocromos e das proteínas envolvidas no transporte de elétrons.



Micronutrientes

• São necessárias quantidade muito pequenas na composição do meio de cultura : Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B.

• Função estrutural em várias enzimas;

• Nem sempre sua adição é necessária;

• Meio de Sintéticos com alto grau de pureza podem não ter esses elementos.


Meios de Cultura

• Meios de cultura são soluções de nutrientes que promovam o crescimento dos microrganismos;

• Existem diferentes meios de cultura para os diferentes microrganismos e finalidades;

• Para se ter sucesso no cultivo de microrganismos é necessários: conhecer suas necessidades nutricionais => fornecer os nutrientes na proporção adequada.


Meio de Cultura

• Pode ser: • Quimicamente Definidos (vendidos com os

componentes pré misturados) – pode-se usar o Agar como agente solidificante (polissacarídeo complexo de algas marinhas;) ou

• Complexos – tem maior variabilidade de acordo com o lote.

• Meios gerais (vários organismos crescem); ou • Específicos (identificação de espécies).


Meio de Cultura

Observação:

• Os micro-organismos introduzidos em um meio de cultura para iniciar o crescimento são chamados de inóculo. Os microorganismos que crescem e se multiplicam dentro ou sobre um meio de cultura são denominados cultura.


Meios de Cultura – Como de ser?

• Nutrientes na proporção adequada;

• Água;

• pH adequado;

• O Meio deve ser estéril – inicialmente não deve conter microrganismos vivos, assim a cultura será somente do organismos inoculado;

• Incubada em temperatura apropriada.


Meios de Cultura Seletivos e Diferenciais

• No saneamento é interessante detectar a presença de microrganismos específicos associados a doenças e para esse fim são usados meios seletivos e diferenciais;

• Os meios seletivos impedem o crescimento de bactérias indesejadas e favorecem as de interesse.

• Exemplo: o ágar sulfeto bismuto isola a bactéria da tifoide, gram negativa (Salmonella typhi), pois inibe as bactérias gram positivas e a maiorias das bactérias gram negativas intestinais.



• Os meios diferenciais facilitam a identificação de colônias em relação as outras colônias;

• Alguns meios de cultura tem reações identificáveis com meios diferenciais em tubos ou placas. (Identificação de colônias de Streptococis pyogenes – lisam as hemácias, meio Agar sangue (contêm hemácias)).



• Meio Diferencial


Bibliografia

• MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M., PARKER, J. Microbiologia de Brock.São Paulo: Prentice Hall, 2004.

• PELCZAR, M.J., CHAN, E.C.S., KRIEG, N.R. Microbiologia. São Paulo: Makron Books, 1996. volumes 1 e 2.

• TORTORA, G.J., FUNKE, B.R., CASE, C.L. Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2000.


Perguntas

1. Quais são as etapas do crescimento microbiano? Explique cada uma delas.

2. O que são macro e micronutrientes? Porque é importante conhecer as necessidades nutricionais dos microrganismos?

3. Para que serve os meios de cultura?


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