MÉTODOS DE CULTIVO E

QUANTIFICAÇÃO DO

CRESCIMENTO MICROBIANO

METABOLISMO: • catabolismo: liberação de energia • anabolismo: requerimento de energia

macronutrientes incluem: C, N, P, S, K, Ca, Mg, Fe micronutrientes incluem: elementos traço, fatores de crescimento

REQUERIMENTOS DE ENERGIA POR MICRORGANISMOS

componentes celulares: parede, membrana, ...

síntese de enzimas, ác. nucléicos, polissacarídeos, fosfolipídeos

reparos e manutenção da célula

crescimento e multiplicação

acumulação de nutrientes e excreção de produtos indesejáveis

motilidade

OPÇÕES METABÓLICAS PARA OBTENÇÃO DE ENERGIA

(Madigan et al., Fig. 2.8)

Autotróficos: fixam carbono do CO2

• A maioria dos fototróficos são autotróficos: fotoautotróficos

• Produção primária – uso de uma fonte de energia química ou luz para produzir nova matéria orgânica a partir do CO2

Heteretróficos: obtêm carbono de compostos carbonados orgânicos pré-existentes.

Os procariontes podem ser: quimioautotróficos, quimioheterotróficos, fotoautotróficos e fotoheterotróficos.

Os eucariontes podem ser: fotoautotróficos e quimioheterotróficos.

Fontes de carbono:

MEIO DE CULTURA MEIO DE CULTURA: material nutriente preparado no laboratório para o crescimento de microrganismos in vitro. CULTURA: microrganismos que crescem e se multiplicam no meio de cultura. INOCULAÇÃO contaminação proposital de um meio de cultura, ou seja, é a transferência de um determinado número de microrganismos para um meio de cultura a fim de que estes se desenvolvam e permitam a sua identificação. TÉCNICAS DE SEMEADURA maneiras como a inoculação das bactérias é realizada em diferentes meios

CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA

Quanto a composição

Quanto ao estado físico

Quanto a finalidade e características

CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA Quanto a composição

NATURAIS São aqueles encontrados na natureza, de origem vegetal

(p.ex.: pedaço de batata, de abóbora) ou animal (p.ex.: gema de ovo, pedaço de carne)

ARTIFICIAIS São aqueles fabricados em laboratório, constituído de

substâncias químicas. Podem ser DEFINIDOS ou INDEFINIDOS (complexos)

CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA Quanto ao Estado Físico

LÍQUIDO Desprovidos de ágar caldo

SÓLIDO Contem de 1,5% a 2,5% de ágar

SEMI-SÓLIDO Contem até 1,0% de ágar

CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA Quanto à finalidade e

características Simples

Só possui os nutrientes básicos para o crescimento das bactérias em geral.

Enriquecido ou Diferencial

Além dos nutrientes básicos possui elementos nutritivos a mais, como fatores promotores de crescimento (sangue...), mas não é específico.

De enriquecimento ou Seletivo

É suplementado com nutrientes específicos para o microrganismo que se deseja pesquisar. Além disso, possui nutrientes agentes inibidores de determinados microganismos, mas não permite o isolamento da bactéria, pois é um meio líquido.

Por exemplo: aminoácidos (lisina à Salmonella)

CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA Quanto à finalidade e características

Seletivo

Possui agentes inibidores de determinados microrganismos. Permite a identificação e isolamento da bactéria, pois é um meio sólido (permite a visualização de UFCs).

Por exemplo: Agar EMB à inibe Gram+

Diferencial

Permite a diferenciação de diferentes microrganismos.

Por exemplo: a diferenciação de bactérias fermentadoras e não fermentadoras da lactose no Agar EMB.

Indicadores

Possuem agentes que indicam determinadas reações no meio, para a determinação do metabolismo das bactérias.

Por exemplo: ferro no meio à pode indicar a produção de H2S pelo enegrecimento do meio (sulfeto ferroso)

*** geralmente o agente é um indicador de pH

CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA Quanto à finalidade e características

Quanto à finalidade de estoque

Meios onde são estocadas culturas puras para posterior utilização.

Geralmente são meios semisólidos

Fonte: http://www.ebah.com.br/content/ABAAAe57YAG/tipos-meios-cultura-microbiologia

COMPOSIÇÃO g/L: · Caseína Ácida Hidrolisada: 0.50 · Extrato de Levedura: 0.50 · Protease Peptona: 0.50 · Dextrose: 0.50 · Amido Solúvel: 0.50 · Fosfato Dipotássico: 0.30 · Sulfato de Magnésio: 0.024 · Piruvato de Sódio: 0.30 pH FINAL: · 7.2 ± 0.2 APARÊNCIA DO PÓ: · Cor amarelo, homogêneo e pó livre circulante. COLORAÇÃO: · Cor amarelo. TRANSPARÊNCIA: · Solução clara.

Culture Media

defined: made from purified chemicals

e.g., glucose-mineral salts broth

complex (undefined): exact chemical composition not known

e.g., YE (yeast extract) agar

• agar – polysaccharide derived from algae

• forms a gel at temperatures of interest, including 37ºC

• not many microorganisms can degrade it

• widely used as solidifying agent in microbial media

(Madigan et al.)

aseptic transfer: inoculating loop

microbial culture

(Madigan et al., Fig. 5.3)

liquid solid

(Madigan et al., Fig. 5.4)

streak plate: confluent growth

single isolated colonies

(Madigan et al., Fig. 5.4)

MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO QUANTIFICAÇÃO DIRETA: - CONTAGEM EM PLACAS - FILTRAÇÃO - MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL - CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO QUANTIFICAÇÃO INDIRETA: - TURBIDIMETRIA - ATIVIDADE METABÓLICA - PESO SECO

MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO QUANTIFICAÇÃO DIRETA: (1) CONTAGEM EM PLACAS - técnica mais utilizada na determinação do tamanho da população bacteriana; VANTAGEM: qualificação de células viáveis DESVANTAGEM: tempo (24 h para o aparecimento das colônias)

Cálculo:

nº de colônias na placa x índice de diluição da amostra = nº de bactérias/mL

-DILUIÇÃO SERIADA

-MÉTODO DE ESPALHAMENTO EM PLACA

Contagem em placas e diluição seriada

Adaptado de Madigan et al. (2003).

• only those cells that are viable and able to grow and form colonies under the provided

conditions are counted

• results reported as colony forming units/mL (CFU/mL)

viable count:

(Madigan et al., Fig. 6.9)

Contador de Colônias

MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO

QUANTIFICAÇÃO DIRETA:

(2) FILTRAÇÃO

- < nº de bactérias = pode ser utilizado o método de filtração para a sua

contagem.

- concentração de bactérias sobre a superfície de uma membrana de

filtro de poros muito pequenos após a passagem de um volume de 100

mL de água.

- filtro posteriormente transferido para uma placa de petri contendo

meio sólido.

CONTAGEM DE BACTÉRIAS PELO MÉTODO DE FILTRAÇÃO

Células bacterianas na superfície da membrana (poros)

A membrana filtrante foi colocada sobre o

meio de cultura e a placa foi incubada. ↓

↓

MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO

QUANTIFICAÇÃO DIRETA:

(3) O MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)

- utilizado para microrganismos que não crescem bem em meio sólido.

A) diluição a partir de um alto volume de inóculo (ex. 10 mL)

B) diluição a partir de um médio volume de inóculo (ex. 1 mL)

c) diluição a partir de um baixo volume de inóculo (ex. 0,1 mL)

d) contagem do nº de tubos positivos

e) estimativa do nº de células/mL de bactérias

10 mL de inóculo

1 mL de inóculo

0,1 mL de inóculo

6 tubos positivos (com

crescimento bacteriano)

3 tubos positivos

1 tubos positivos

Figura 9. Método do número mais provável (NMP)

6

3

1

Método do número mais provável (NMP)

Tabela de combinações (NMP)

6-3-1

Índice de NMP/100 mL = 110

Inferior = 40

Superior = 300

Confiabilidade de 95%

MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL PARA ESTIMATIVA DE CRESCIMENTO

CONTAGEM EM PLACA E DILUIÇÕES SERIADAS

POUR-PLATE ESPALHAMENTO EM PLACA

METODOLOGIA

UTILIZADA PARA A

CONTAGEM DE COLÔNIAS

EM PLACA

MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO

QUANTIFICAÇÃO DIRETA:

(4) CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO

- um volume conhecido de suspensão bacteriana é colocado em uma

área definida da lâmina de microscópio.

- a amostra pode ser corada ou analisada a fresco.

- utilizam câmaras de contagem

DESVANTAGENS: - não separa células mortas e vivas

- pode haver erros de contagem

- difícil contagem para bactérias móveis

Utilização da câmara de contagem Petroff-Hausser.

Adaptado de Madigan et al. (2003)

Petroff-Hauser counting

chamber

• requires at least 106 cells/mL

• counts all cells (a total count)

• without special stains, cannot distinguish between live and dead cells

direct microscopic count:

(Madigan et al., Fig. 6.9)

CÂMARA DE NEUBAUER ou

HEMACITÔMETRO

CÂMARA DE NEUBAUER ou

HEMACITÔMETRO

CÂMARA DE NEUBAUER

Ao microscópio – aumento de 100X

Ao microscópio – aumento de 400X

CONTAGEM DIRETA

AO MICROSCÓPIO

Coloração com azul de metileno para evidenciar células viáveis de leveduras – células

azuis estão mortas; células sem coloração são células vivas

Câmara de Mac Master

Câmara de Sedgwick-Rafter reticulada

MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO

QUANTIFICAÇÃO INDIRETA:

(1) TURBIDIMETRIA

- monitoramento do crescimento bacteriano através da turbidez

- espectrofotômetro (660 nm)

(2) ATIVIDADE METABÓLICA

- quantidade de um certo produto (como ácido ou CO2) é diretamente

proporcional ao número de células bacterianas.

Fonte

de luz

Filtro Amostra

contendo

células

microbianas

Detector

sensível

á luz

Leitura dos

resultados

em absorbância

ou transmitância

no

espectrofotômetro

DETERMINAÇÃO DE CRESCIMENTO MICROBIANO PORTURBIDIMETRIA

A quantidade de luz que atravessa o detector é inversamente proporcional ao nº.

de bactérias.

Quanto > o nº. de bactérias < a quantidade de luz que é transmitida

Figura 11. Determinação do nº de bactérias por turbidimetria.

MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO

QUANTIFICAÇÃO INDIRETA:

(3) PESO SECO

- principalmente para fungos filamentosos

a) fungo é removido do meio por filtração

b) seco em dessecador

c) posterior pesagem.