crescimento/multiplicação · crescimento microbiano quantificação de uma população...

11/20/2017

1

Prof.(a) Juliana Moraes

Crescimento/Multiplicação

SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL

Instituto Federal de Alagoas - Campus Piranhas

ENGENHARIA AGRONÔMICA

Piranhas

2017

Fatores influenciadores

Fatores

Físicos

Temperatura pH

Químicos

Nutrientes

Crescimento microbiano

11/20/2017

2

FATORES FÍSICOS


TEMPERATURA

Faixa de temperatura de Crescimento (máxima e mínima)

Temperatura ótima de crescimento

Classificação:

Psicrófilos

crescem em baixas temperaturas crescem a 0 °C

temperatura ótima 15 °C

Psicrotróficos –

crescem em baixas temperaturas crescem a 0 °C

temperatura ótima 20 a 30 °C

Mesófilos

crescem em temperaturas moderadas

Maioria dos microrganismos deteriorantes e patógenos

Temperatura ótima entre 25 e 40 °C Crescimento microbiano

11/20/2017

3


Termófilos

crescem em altas temperaturas

Temperatura ótima entre 50 e 60 °C

Hipertermófilos ou termófilos extremos

crescem em temperaturas muito altas

Temperatura ótima de 80°C ou mais


11/20/2017

4


pH

Bactérias = A maioria crescem em pH perto da neutralidade 6,5 e 7,5.

Poucas bactérias crescem abaixo de pH 4,0

Bactérias acidófilas – resistentes a pH ácidos.

Fungos = maioria crescem em pH mais baixos do que os requeridos pelas

bactérias, geralmente entre 5,0 e 6,0.

Formação de ácido = metabolismo microbiano

Meios de cultivos adicionados de tampões (peptona e aminoácidos) par

controlar a acidez do meio e evitar inibição dos microrganismos.


11/20/2017

5

Pressão osmótica

Obtenção de nutrientes a partir da água

Composição da célula: 80 a 90% de água

Pressão osmótica (entrada e saída de solvente da célula)

Ambiente hipertônicos

plasmólise celular: perda de água do meio intracelular e separação da membrana plasmática (MB) e parede celular (PC)

Ambiente hipotônicos

Lise celular: entrada de água do meio extra para o intracelular podendo gerar ruptura da membrana em celular com paredes celulares mais frágeis.

Separação MB e PC – impedem o crescimento (multiplicação) microbiana.

Conservação de alimentos (adição de solutos/sais)

Halófilos extremos – adaptados as altas concentração de sais para o crescimento

Halófilos obrigatórios: requerem altas concentrações de sais (alguns até 15% a 30%)

Halófilos facultativos: suportam concentrações de até 2%



11/20/2017

6

FATORES QUÍMICOS



Nutrientes

Nitrogênio

Enxofre

Fósforo Carbono

Elementos traços

11/20/2017

7

Oxigênio


Classificação de acordo com o crescimento na concentração de oxigênio do meio:

AERÓBIOS

Fazem uso do oxigênio para a produção de energia / Alto rendimento

energético

AERÓBIOS ESTRITOS OU OBRIGATÓRIO: somente sobrevivem em ambientes

contendo oxigênio

ANAERÓBIOS

Produção de energia na ausência de oxigênio / Baixo rendimento energético

ANAERÓBIO FACULTATIVO: somente sobrevivem tanto em ambientes

contendo oxigênio como em ambientes que possuem oxigênio (vantagem

evolutiva)

ANAERÓBIOS ESTRITOS OU OBRIGATÓRIOS: somente sobrevivem em

ambiente ausentes de oxigênio.


ANAERÓBIO AEROTOLERANTES

São anaeróbios, porém conseguem crescem na presença de

oxigênio.

MICROAERÓFILOS

Crescem em concentrações de oxigênio menores que a

concentração normal do ar atmosférico (17%).

11/20/2017

8



O crescimento na presença de oxigênio produz formas

moleculares do oxigênio toxicas.

• Forma molecular de oxigênio que energizada e por isso tornou-se altamente reativa.

Oxigênio Singlet

• Superóxido-dismutase (SOD)

• Neutralização dos radicais

Radicais superóxidos

• Catalase

• Neutralização dos peróxidos

Peróxido de hidrogênio

11/20/2017

9

BIOFILMES


Biofilme


Forma de vida de células microbianas:

Planctônicas: vida livre

Sésseis: vida em comunidade

Células cobertas por uma camada extracelular de polissacarídeos (Matriz)

A matriz é compostas por água, proteínas, carboidratos e acido nucléicos.

Comunicação entre as células da comunidade - quorum sensing

(comunidade biológica funcional organizada).

Adesão em superfícies bióticas e abióticas

Célula planctônica

Adesão (reversível)

Biofilme Biofilme maduro

(irreversível)

11/20/2017

10

Biofilmes


Benefícios

Tratamento de resíduos

Sistema digestório de ruminantes

Malefícios

Risco de saúde pública

Danos de tubulações industriais

A vida em comunidade oferece aos microrganismos que compõem o biofilme 1.000 x

mais resistência a antibióticos e agentes sanitizantes.


11/20/2017

11



11/20/2017

12


Fatores orgânicos de crescimento


Os compostos orgânicos essenciais que um organismo é incapaz de sintetizar são conhecidos como fatores orgânicos de crescimento.

Eles devem ser obtidos diretamente do ambiente.

Muitas bactérias podem sintetizar suas próprias vitaminas e não dependem de fontes externas.

Contudo, algumas bactérias não possuem as enzimas necessárias para a síntese de certas vitaminas que são para elas fatores orgânicos de crescimento.

Outros desses fatores requeridos por certas bactérias são aminoácidos, purinas e pirimidinas.

11/20/2017

13

MEIO DE CULTURA


Conceitos


Meio de cultura ou meio de cultivo: mistura de nutrientes orgânicos e

inorgânicos utilizados para observar o crescimento microbiano em

laboratório.

Inóculo: quantidade de microrganismos adicionados no meio de cultivo

para o crescimento

Cultura: microrganismos que crescem em um meio de cultivo após a

manutenção em condições ambientais adequada.

Usados para identificar, identificar e enumerar microrganismos de interesse

Estéril: livre de microrganismos

11/20/2017

14

Classificação – forma


MEIOS DE CULTURA SÓLIDOS

Contém agente solidificante: ágar

Ágar: é um polissacarídeo complexo derivado de uma alga marinha,

Características:

Poucos micro-organismos podem degradar o ágar, o que permite que

ele permaneça solido.

Se liquefaz a cerca de 100°C (o ponto de ebulição da agua) e ao

nível do mar ele permanece liquido ate a temperatura diminuir até

cerca de 40°C.

MEIOS DE CULTURA LÍQUIDOS

Não possui agente solidificante: ágar

Para utilização no laboratório, o ágar mantido em banho-maria a 50°C. Nessa

temperatura, ele não destrói a maioria das bactérias quando adicionado sobre elas.


11/20/2017

15

Classificação – composição


MEIOS DE CULTURA COMPLEXOS

aquele cuja composição exata e conhecida. Para um quimio-heterotrofico, o meio

quimicamente definido deve conter fatores de crescimento orgânicos que servem

como fonte de carbono e energia.

MEIOS DE CULTURA QUIMICAMENTE DEFINIDOS

feitos de nutrientes como extratos de leveduras, de carnes ou de plantas, ou

produtos de digestão destas ou de outras fontes. A composição química exata varia

um pouco de acordo com o lote.

Classificação – finalidades


MEIOS DE CULTURA SELETIVOS

São elaborados para impedir o crescimento de bactérias indesejadas´e

favorecer o crescimento dos micro-organismos de interesse

MEIOS DE CULTURA DIFERENCIAIS

facilitam a diferenciação das colônias de um micro-organismo desejado

em relação a outras colônias crescendo na mesma placa. De maneira

similar, culturas puras de micro-organismos tem reações identificáveis

com meios diferenciais em tubos ou placas.

11/20/2017

16

Isolamento

OBTENÇÃO DE CULTURA PURA

Crescimento Microbiano

método de esgotamento por estrias


OBJETIVO: obter colônias isoladas

11/20/2017

17



11/20/2017

18



11/20/2017

19



11/20/2017

20



11/20/2017

21



11/20/2017

22

PRSERVAÇÃO DE CULTURAS BACTERIANAS



Congelamento

- 50 °C a - 95°C

Liofilização (congelamento e sublimação)

– 54 °C a -72 °C

11/20/2017

23

CRESCIMENTO DE CULTURA BACTERIANAS


Divisão celular


Divisão binária

Brotamento***

11/20/2017

24


Tempo de Geração


Tempo necessário para uma célula se dividir, ou mesmo, sua população

duplicar.

O tempo de geração é influenciado:

Tempo

Temperatura

Condições ambientais

Características da própria espécie

11/20/2017

25


Representação logarítmica


11/20/2017

26

Fases de Crescimento


Fase LAG ou Fase de adaptação

Período de pouca ou nenhuma divisão

podendo durar de uma hora a vários dias.

Durante esse tempo, contudo, as células não estão dormentes. A

população microbiana passa por um período de intensa atividade

metabólica, envolvendo principalmente a síntese de enzimas e varias

moléculas.

Fase LOG ou fase exponencial de crescimento

as células começam a se dividir e entram em um período de crescimento,

ou aumento logarítmico.

A reprodução celular e mais ativa durante esse período, e o tempo de

geração atinge um valor constante.

Momento de maior atividade metabólica,.


FASE ESTÁCIONÁRIA

Se a fase de crescimento continua sem controle, ocorre a formação de um

grande numero de células.

Na realidade, isso não ocorre. No final do crescimento, a velocidade de

reprodução se reduz, o numero de mortes microbianas é equivalente ao

numero de células novas, e a população se estabiliza.

A causa da interrupção do crescimento exponencial não e sempre clara. O

esgotamento dos nutrientes, o acumulo de resíduos e mudanças no pH

danosas a célula podem ser os motivos.

FASE DE MORTE OU DECLÍNIO

O numero de mortes finalmente ultrapassa o numero de células novas

formadas.

Essa fase continua ate que a população tenha diminuído para uma

pequena fração da população da fase anterior ou morre totalmente.

11/20/2017

27


Medidas de crescimento microbiano


Quantificação de uma população normalmente é registrada como o

numero de células por mililitro de liquido ou grama de material solido.

Como as populações bacterianas geralmente são muito grandes, a maioria

dos métodos de contagem tem como base enumerações diretas ou indiretas

de amostras pequenas; um calculo determina depois o tamanho total da

população.

Enumeração Indireta Direta

11/20/2017

28


Enum

era

ção d

ireta

Contagem em placas

Diluições seriadas

Incorporação em placas a espalhamento em

placas

Filtração

Numero mais provável

(NMP)

Microscópica direta

Contagem em placas


Vantagem: mede o numero de células viáveis.

Desvantagem: são necessárias 24 horas ou mais para que colônias visíveis sejam formadas.

Unidade Formadora de colônia (UFC)

Quando uma contagem em placas e feita, é importante que somente um numero limitado de colônias se desenvolva na placa.

Quando muitas colônias estão presentes, algumas células são reprimidas e não podem se desenvolver (imprecisão na contagem).

Para evitar imprecisão: contagem de placas com somente 25 a 250 colônias (FDA – recomendação)

11/20/2017

29

Diluições seriadas


Plaqueamento


Métodos de incorporação em

placa

Sinônimos:

Plaqueamento por profundidade

Plaqueamento “pour plate”

Método de espalhamento em

placa

Sinônimos:

Plaqueamento em superfície

Plaqueamento “Spread-plate”

11/20/2017

30

Filtração


Aplicado quando o numero de bactérias são muito pequenos (lagos e

correntes de água).


11/20/2017

31

Numero mais provável (NMP)


Principio estatístico:

quanto maior o numero de bactérias em uma amostra, maior será o numero de

diluições necessárias para reduzir a densidade ate um ponto no qual mais nenhuma

bactéria esteja presente nos tubos de diluição seriada.

O MNP fornece somente uma estimativa de 95% de probabilidade de a

população bacteriana estar em uma faixa determinada e que o MNP

obtido e estatisticamente o numero mais provável.


11/20/2017

32


Contagem microscópica direta


Técnica: Um volume conhecido de uma suspensão bacteriana e colocado em uma área definida da lâmina microscópica.

Uma lamina especialmente desenvolvida chamada de contador de células Petroff-Hausser

0,01 mL (10 µL) é adicionado na lâmina

Adição de corante

Observação em microscópio (lente objetiva de 100x)

Contagem de diferentes regiões da lâmina,

Calcular média de bactérias por campo observado

Calculo do número de bactérias no centímetro quadrado

MÉDIA DE BACT./ CAMPO x 100 (correção do inoculo 0,01 mL)

11/20/2017

33



11/20/2017

34


Enum

era

ção Ind

ireto

Turbidimetria

Atividade metabólica

Peso Seco

Turbidimetria


Uma maneira de monitorar o crescimento bacteriano. A medida que as

bactérias se multiplicam em um meio liquido, o meio se torna turvo ou

opaco com as células.

O instrumento utilizado para medir a turbidez é um espectrofotômetro (ou

calorímetro). No espectrofotômetro, um feixe de luz passa através de uma

suspensão de bactérias ate um detector fotossensível.

Com o aumento do numero de bactérias, menos luz atingira o detector. Essa

alteração da luz será registrada na escala do instrumento como

porcentagem de transmissão. Também será registrada a expressão

logarítmica chamada de absorbância (algumas vezes denominada

densidade ótica, ou DO)

11/20/2017

35


Atividade metabólica


Esse método assume que a quantidade de um produto

metabólico determinado, como um acido ou CO2, e

diretamente proporcional ao numero de bactérias presentes.

11/20/2017

36

Peso Seco


Uma das melhores maneiras de medir o crescimento de

organismos filamentosos e pelo peso seco.

Procedimento:

1. Remoção do meio de crescimento

2. Filtragem (remoção de outros materiais)

3. Dissecação

4. Pesagem

Obrigada pela atenção!

Juliana Moraes


crescimento/multiplicação · crescimento microbiano quantificação de uma população...

Documents