controle transcricional de genes

7/22/2011

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I Curso de Inverno em Oncologia

Molecular

Controle transcricional da Expresso Gnica e sua

relao com o Cncer

Michelly C PereiraAdriana P Trape

2011

Nveis de regulao da expresso gnica e sua relao com o cncer

Controle transcricional

Controle processamento do RNA

Controle transporte e localizao do RNA (ncleo/citoplasma)

Controle epigentico

Controle por RNAi (siRNA/miRNAs)

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QUAL A IMPORTNCIA DA REGULAO DA

EXPRESSO GNICA NAS CLULAS?

?

Desenvolvimento dos organismos multicelulares envolve

alteraes na expresso gnica

nature.com/scitalble

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EXPLICA A GRANDE DIVERSIDADE CELULAR - CLULAS COM

DIFERENAS MORFOLGICAS E COM DIFERENTES FUNES!

DIFERENCIAO CELULAR


MESMO GENOMA

MESMA SEQUNCIA DE DNA

DIFERENTES FATORES DE TRANSCRIO

DIFERENTES RNAs

DIFERENTES SPLICES

DIFERENTES PROTENAS

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DIFERENTES INTERAES

PROTENA-PROTENA

Mapa DIP (Database of Interacting Proteins)

da Calmodulina. Fonte: nature.com

DIFERENTES CLULASFUNES

ESPECFICAS

As prprias clulas tumorais adquirem perfis de expresso gnica diferenciados

E AS CLULAS TUMORAIS?

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Estudos de expresso gnica sugerem que em algummomento do seu ciclo, uma clula humana ir expressaraproximadamente 10.000 a 20.000 dos seus 30.000 genes!

Quando comparamos o perfil de mRNAS das diferentes clulashumanas verificamos que os nveis de genes ativos varia de umaclula para outra.

Algumas protenas so expressas em quase todas as clulas(protenas do DNA, reparo, enzimas do metabolismo, docitoesqueleto) = CONSTITUTIVOS/Housekeeping (10.000a 20.000/clula)

Outras so especficas, como por exemplo a Hemoglobina,ou so expressas devido a estmulos especficos (aprox 1000genes/clula)

Os padres de expresso dos mRNAs so caractersticos decada tipo celular e podem ser utilizados para classificaotumoral.

GENES CONSTITUTIVOS & GENES ESPECFICOS

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Uma clula pode alterar a expresso de seus genes em resposta aos sinais externos

Clulas do fgado expostas ao hormnio

glicocorticide sintetiza vrias protenas

especficas em altas concentraes: enzimas

tirosina aminotransferase = converte tirosina em

glicose. Se no h o hormnio, os nveis da

enzima volta ao normal

Clulas do tecido adiposo na presena

do hormnio glicocorticide diminui a

expresso da enzima tirosina

aminotransferase

Outras clulas nem respondem ao hormnio

glicocorticide

Especializao celular: diferentes tipos celulares respondem de

forma diferente ao mesmo sinal extracelular

A expresso gnica pode ser regulada em muitos dos diferentes passos na via DNA RNA - PROTENA


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Controle epigentico


1 - CONTROLE TRANSCRICIONAL

Define QUANDO e QUANTO determinado gene transcrito!

nico nvel de controle que garante que a clulano sintetizar produtos desnecessrios, evitandogastos de energia!

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Elementos importantes para o controle da expresso gnica (MAQUINARIA TRANSCRICIONAL)

REGIO PROMOTORA OPERADOR ENHANCERS

RNA POLIMERASE

FATORES DE TRANSCRIO

ATIVADORES/REPRESSORES EFETORES ALOSTRICOS

MEDIADORES

ENZIMAS REMODELADORAS DA CROMATINA (histonas acetil transferases, deacetilases, metilases)

Stios regulatrios das bactrias so localizadas prximas regio do promotor


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MODELO DE REGULAO DA EXPRESSO GNICA: OPERON LAC

OPERON = segmento de DNA que codifica um mRNA multignico e tem

uma regio regulatria e do promotor comum; genes que codificam

enzimas de uma mesma via metablica; genes na sequncia de atuao

na via.

Fonte: nature.com

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REGULAO DA EXPRESSO GNICA NOS EUCARIONTES

Nvel de regulao mais complexo

+ tipos de protenas regulatrias (complexos proticos)

+ tipos de interaes com as regies regulatrias do DNA regies mais distantes do promotor).

Procariontes Eucariontes

Estrutura do genoma Simples, geralmentecircular s vezesacompanhado de plasmdios

Em cromossomos; nucleossomo limitaacessibilidade ao DNA

Tamanho do genoma Relativamente pequeno Relativamente grande

Localizao datranscrio gnica e traduo

acoplada; no h barreirado envoltrio nuclear

Transcrio nuclear e traduo citoplasmtica

Disposio gnica Operons (genes de funosimilar agrupados juntos)

Cada gene tem seu prpriopromotor e elementosenhancer

Estado da transcrio basal

On (ativa) Off (inativa)

Estrutura do DNA DNA supercoiled comvrias proteinas associadas

Cromatina altamentecondensada (associadocom histonas emnucleossomos.

DIFERENAS ENTRE REGULAO DA EXPRESSO GNICA

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Regio regulatria tpica de um gene eucarionte

SEQUNCIAS REGULATRIAS : prximas ao promotor

(200pb) distantes ao promotor

nas regies dos ntrons

downstream aos genes

Comuns a todos

os genesEspecficas para

cada clula

Fonte: Molecular Biology of the

Cell. 4th edition

REGIO PROMOTORA

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Fonte: nature.com

Como ocorre ao distncia entre sequncias maisdistantes e o promotor?

DNA age como uma ALA = grande complexo deregulao

Roeder R., 2004

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Combinao de vrias protenas regulatrias, permite grandeflexibilidade no controle da expresso gnica.Mesmo gene pode ser transcrito de diferentes formas, dependendoda combinao, presena ou ausncia das vrias protenasregulatrias.


Protenas Regulatrias

Domnios funcionais:

Domnio de ligao ao DNA (motivos especficos)

Domnio de interao com protenas do aparato transcricional (RNA pol

ou protenas que interagem com RNApol)

Domnio de cooperao com protenas que se ligam prximos s

sequncias regulatrias do DNA

Domnio que influencia condensao da cromatina (direta ou

indiretamente)

Domnio sensor das condies fisiolgicas da clula.

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Interaes DNA-Protena (domnios dos FATORES DE TRANSCRIO)

nature.com

c-fos/c-jun

c-myc

Cncer

&

Regulao da transcrio gnica

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TF

ER ER

TF

Transcrio do gene alvo

Sntese protica

Proliferao celular

ERE

ER ER

GGTCANNNTGACC

E2

ERE

P

ER ER

P

S118

GF

(Adaptado de NAGAI e BRENTANI, 2008)

Apotose

GP

AKT

PI3K

ER

Ca++iNOS

REGULAO DA EXPRESSO GNICA PELOS FATORES MITOGNICOS

Superexpresso do oncogene c-myc Linfoma de Burkitts t(8;14)

c-myc fica sob controle de um forte enhancer das imunoglobulinas


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Controle epigentico


2. Controle do Processamento (Splicing) do mRNA

S possvel devido a existncia do ncleo (separao fsica entretranscrio e traduo).

Quando existe diferentes possibilidades de splicing em vrias posiesdo transcrito, um NICO GENE pode produzir vrias protenas diferentes

(protenas com diferentes domnios funcionais = distintas isoformas

FGFR2/PGFR2

Fonte: Molecular Biology of the

Cell. 4th edition

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O splicing alternativo pode ser escolhido para regular a transcrio de protenas funcionais das no-funcionais.

Gera diferentes verses da protena em diferentes tipos celulares de acordo com as necessidades da clula (Tropomiosina forma especializada dependendo do tipo de clula).

H um delicado balano de competio entre stios de splicing;

Regulao diferencial do Splicing

Fonte: Molecular Biology of

the Cell. 4th edition

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DEFEITOS DA MAQUINARIA DE SPLICING & CNCER

Venables J, 2004

Outra forma de regular a transcrio pela mudana c-terminal do mRNA ( alterao do stio de clivagem do mRNA e incio da poliadenilao).

Exemplo: anticorpos dos Linfcitos B = ligados a membrana (cauda de poli-A mais longa) ou secretados (cauda de poli-A mais curta).

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Controle epigentico


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3. Controle do transporte e localizao dos mRNAS

Destino do mRNA definido por sequncias curtas (short sequences) 3UTR (elementos cis-regulatrios).

Ribonucleoprotenas (mRNA + fatores de ao trans: protenas e RNAs no-codificadores)

Cheneval et al., 2010

Localizao do mRNA um importante mecanismo:

Estabelecer compartimentos e estruturas funcionalmente distintos

polarizao

Migrao celular direcionada

Destino celular no desenvolvimento embrionrio (Ex: -actina).

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Mecanismos para localizao dos mRNAs

A localizao especfica dos mRNAs necessita de sequncias-sinais

tipicamente localizadas na regio 3UTR.



Besse & Ephrussi, 2008.

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Aberrante estabilizao

do mRNA!

Epigentica

Potencialmente reversveis Alvos teraputicos

Categorias

Metilao do DNA

Modificaes de histonas (covalente e no-covalente)

RNAs no-codificantes

Definio

Processos

Estrutura da cromatina

Degradao do RNAm

Bloqueio de sntese protica

Mecanismos de regulao da expresso gnica independentes de alteraes na sequncia do DNA

Diversidade celular em tecidos normais

(Sharma et al; Carcinogenesis, 2010)

(Yoo et al; Nat Rev Drug Discov, 2006)

(Feinberg AP; Nature, 2007)

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Estrutura da cromatina Heterocromatina Eucromatina

(inativa) (ativa)

Acesso da maquinaria transcricional ao DNA

Manuteno do padro durante a replicao do DNA


(http://nature.com)

Hiptese CDGE

Estrutura da Cromatina

Sequncia do DNA

Ambiente

Common disease genetic and epigenetic hypothesis

(Bjornsson et al, Trends Genet, 2004)


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Nucleossomos

(Luger et al; Nature, 1997)

(Fullgrabe et al; Oncogene, 2011)

Metilao do DNA

Metilao e acetilao de histonas

~ 146 pb de DNA dispostos em torno de um octmero de histonas

Modificaes da cromatina

Metilao do DNA

(DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)


DNA Metil-transferases

(Gibney & Nolan, Heredity, 2010)

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HMT histona metil-transferases

HDM histona demetilases

Metilao de histonas

Alteraes em histonas Covalentes

Acetilao de histonas

HATs histona acetil-transferases

HDACs histona desacetilases

(Luczak & Jagodzinski; Folia Histochem Cytobiol, 2006)

Alteraes em histonas

Silenciamento Ativao

Efeitos sobre a expresso gnica

(Hake et al; British Journal of Cancer, 2004)

+ Metilao do DNA:

Silenciamento

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Remoo de histonas

Modificaes no-covalentes

Remodelagem da cromatina

(Complexos SWI/SNF)

(Wilson & Roberts, Nat Rev, 2011)

Variantes de histonas

(Hake et al; British Journal of Cancer, 2004)

Oncogenes (Imprinting Genmico)

Genes supressores tumorais (TSGs)

Metilao do DNA e Cncer

Ilhas CpG ~ 60%

promotores

(Brower V; Nature, 2011)

(Fainberg AP; Nature, 2007)

Tumor de Wilms

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Mobilidade de retrotransposons

Oncogene

Metilao do DNA e Cncer

(Carnell & Goodman; Toxicol Sci, 2003)

Modificao de histonas e Cncer

Principais alteraes descritas

Expresso alterada de enzimas modificadoras de histonas

(Fullgrabe et al; Oncogene, 2011)

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Modificao de histonas e CncerMLL: Leucemia EZH2: Mama, prstata, clon

(Chi et al; Nat Rev, 2010)

LSD1: Cncer de mama

Estrutura da cromatina e terapia

1. 5-Aza-CR (azacitidina) e 5-Aza-CdR (decitabine)

FDA sndromes mielodisplsicas

Linfoma de clulas T

Sequestradores de DNA metil-transferases

Inibidor de HDAC

Reativao de genes supressores tumorais

(Egger et al; Carcinogenesis, 2010)

(Yoo et al; Nat Rev Drug Discov, 2006)

(Plimack et al; Leuk Lymphoma, 2007)

2. SAHA

(Carew et al; Cancer Lett, 2008)

(Sharma et al; Carcinogenesis, 2010)

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Epigentica

Mecanismos de regulao independentes de alteraes na sequncia do DNA.

Potencialmente reversveis Alvos teraputicos

Categorias

Metilao do DNA

Modificaes de histonas (covalente e no-covalente)


Definio

Processos


Degradao do RNAm

Bloqueio de sntese protica


(tRNAs, rRNAs, snoRNAs)

Traduo e sntese protica

Splicing Alternativo

RNAs no traduzidos

em protenas

Small ncRNAs (18 a 200 nt)

Long ncRNAs (200 nt a > 100 kb)

(RNAs intrnicos, antisenso)

Inibio da Expresso Gnica

(snRNAs)

(miRNAs)

Inibio da Expresso Gnica

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Mattick & Makunin; Human Mol Genetics, 2005)

mRNAs e ncRNAs Small RNAs

RNA de

interferncia

RNA de

interferncia

Long ncRNAsPr-mRNAs

RNA de interferncia

Silenciamento transcricional e ps-transcricional

(Castanotto & Rossi; Nat Rev, 2009)

shRNAs

siRNAs

Long ncRNAsHOTAIR Cncer de mama

(Gibb et al; Mol Cancer, 2011)

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Terapia - mRNA

siRNAs x shRNAs

Eficcia

Capacidade de modificao na estrutura qumica

Maquinaria endgena de miRNAs

shRNAs bi-funcionaisDegradao do RNAm E bloqueio da traduo

(Rao et al; Advanced Drug Delivery Reviews, 2009)

Terapia - microRNAs

Supressores tumorais e Oncogenes

Oligonucleotdeos anti-miRNA (AMOS) - Oncogenes

Inibidores competitivos miRNA sponge

Reposio dos miRNAs por RNAi Supressores de tumor

1 miRNA Diversos mRNA

(Galasso et al; Gen Med, 2010)

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Objetivos

RNA de interfernciaPerspectivas

Os resultados obtidos por RNAi so promissores. A otimizao de entrega do shRNA e a

minimizao dos efeitos indesejveis sero estabelecidos pelos ensaios clnicos atualmente

em andamento.

controle transcricional de genes

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