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REGULAÇÃO PÓS-TRANSCRICIONAL DA EXPRESSÃO DE GENES
VIII Congresso Regional da FeSBE GUARAPARI - 2013
Maria Tereza Nunes Departamento de Fisiologia e Biofísica
ICB-USP
REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
mRNA
DNA
Transcrição
proteínas
Tradução Degradação
oligonucleotídeos
Expressão gênica Expressão do mRNA (Northern/dot blotting, PCR, RT-PCR, hibridação in situ, array, siRNA (small interfering RNAs)
Expressão de proteínas (Western/dot blotting, ICC, ELISA, IHC. ME, RIE)
Em geral:
↑↓ transcrição gênica
↑↓ mRNAs específicos
↑ expressão do mRNA e da proteína GH ↓ a do mRNA e da proteína TSH
Ex: T3
AÇÃO TRANSCRICIONAL/GENÔMICA
↑↓ proteínas específicas
AÇÕES TRANSCRICIONAIS
SUFICIENTEMENTE LONGAS PARA PERMITIR A SÍNTESE PROTÉICA (duração : horas a dias)
No entanto: (1) muitas vezes observamos ↑ rápido (min) do mRNA e da
síntese protéica (2) nem sempre ↑ do mRNA leva ao ↑ da síntese protéica (3) às vezes o mRNA não está alterado, mas ocorre ↑ da
síntese protéica
REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
mRNA
DNA
Transcrição
proteínas
Tradução Degradação
oligonucleotídeos
Estabilidade do mRNA
Quem confere??
ESTABILIDADE DO mRNA
EFICIÊNCIA DE TRADUÇÃO
Polipeptídeo recém-sintetizado
Ribossomo
mRNA poliadenilado
eiF4E eiF4G
PABP aaaaaaaaa
Avaliação do grau de adenilação do mRNA
rápido do mRNA (min)
Ex: Procedimento X
AÇÃO TRANSCRICIONAL
Poliadenilação
Inserção de resíduos de adenina na cauda poli-A do mRNA
Aumento do PM do mRNA
Eletroforese em gel de agarose
Alteração na migração das amostras
Remoção da cauda poli-A migração se iguala
ENSAIO COM RNase H (tamanho da cauda poli-A)
AAAAAAAAAAAAA 3’ TTTTTTTTTTTTTT
5’ 3’ UTR AAAAAAAAAAAAA 3’ TTTTTTTTTTTTTT
RNase H
AAAAAAAAAAAAA 3’ 5’ 3’ UTR
oligodT
Corpo Cauda poli-A
5’ 3’ UTR
Avaliação do comprimento da cauda poli(A) do mRNA do GH por PCR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
2 a 4: ratos Tx; 5 e 6: ratos Tx tratados com T3 e sacrificados após 30 min; 8 a 10: ratos Tx tratados com T3 e sacrificados após 45 min; 11 a 13: ratos Tx tratados com T3 e sacrificados após 7 dias; 14 a 16: ratos eutireoideos 1: DNA ladder (φX 174 RF DNA)]; 7 e 17: controle negativo
AÇÕES NÃO GENÔMICAS NA HIPÓFISE (GH)
Ratos Hipotiroideos ( GH mRNA)
T3/T4 GH mRNA
(15 /30 min)
Estabilidade do mRNA do GH?
T3/T4
GH
Volpato CB, Nunes MT. Brazilian J Med Biol Res 27: 1269-1272, 1994 Volpato CB, Nunes MT. Neuroendocrinology, 74: 220-6, 2001
GH mRNA 30’
T3/T4 Poliadenilação ?
RNase H — + — +
Tx Tx + T3 Grupos Adeninas
Controle 127 ± 5,08 Tx 182 ± 4,05 *
Tx + T3 (30’) 234 ± 0,81*,** Tx + T3 (5 d) 115 ± 5,08 **
* p< 0.001 vs controle ** P< 0.01 vs Tx
O T3 AUMENTA A POLIADENILAÇÃO DO mRNA DO GH (30 min)
Volpato CB, Nunes MT. Endocrine Journal, 47: 169, 2000. Volpato CB, Nunes MT. Neuroendocrinology, 74: 220-6, 2001
Oligo (dT): Retângulo claro, complementar à cauda poli-A, ligado a um primer âncora (retângulo escuro), rico em G/C (oligo dT âncora)
Avaliação do comprimento da cauda poli-A
AÇÃO PÓS-TRANSCRICIONAL
Estabilização do mRNA (poliadenilação)
Aumento da taxa de tradução do mRNA
(Perfil Polissomal)
Conteúdo de mRNA ligado ao ribossomo
O T3 AUMENTA A TAXA DE TRADUÇÃO DO mRNA DE GH (30 min)
Síntese de GH
Perfil Polissomal (taxa de
tradução do mRNA do GH)
Silva FG, Giannocco G, Luchessi AD, Curi R, Nunes MT. Mol Cell Endocrinol 2010 ; 317(1-2):1-7
SO
Tx
Tx +
T3
Controle Iodo 30' 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1
Taman
ho d
a Ca
uda
Poli-
A (u.
a.)
Comprimento da Cauda Poli-A do mRNA de
NIS
Grupos
C I
Perfil Polissomal
Race-PAT
O IODO REDUZ A EXPRESSÃO, POLIADENILAÇÃO E TRADUÇÃO DO mRNA DA NIS
Tradução
Serrano-Nascimento C, Calil-Silveira J, Nunes MT. Am J Physiol Cell Physiol. 2010, 298(4):C893-9
< Recrutamento mRNA da NIS
Expressão Gênica
Ratos/ Células PCCl3
(10-3M NaI - 30 min)
Exemplo 1: hormônio… mRNA ∗ tempo horas
DNA
Transcrição
mRNA
actinomicina D/α amanitina vs salina
— RNA polimerase II
USAR DROGAS ESPECÍFICAS QUE BLOQUEIAM TRANSCRIÇÃO GÊNICA
(ALFA AMANITINA, ACTINOMICINA D)
Exemplo 2: hormônio… mRNA ∗ tempo 10 – 20 minutos
DNA
Transcrição
mRNA
actinomicina D/α amanitina vs salina
poliadenilação do mRNA
estabilidade do mRNA?
Cordicepina Bloqueia poli-A polimerase
RNase H Race PAT
Exemplo 3: hormônio…
mRNA proteína
mRNA
tradução
preproteína
modificação
proteína
transporte
Ação Biológica
P R O C E S S A M E N T O
P Ó S T R A D U C I O N A L
ciclohexamida
tunicamicina
brefeldina A
mRNA
proteína
efeito biológico nulo
REGULAÇÃO PÓS-TRANSCRICIONAL
Regulação pós-traducional
Modificação de Proteínas - fosforilação/desfosforilação (+ conhecida) – Western blotting - glicosilação - metilação (histonas) – controle epigenético
REGULAÇÃO PÓS-TRANSCRICIONAL
microRNAs, siRNAs, lncRNA (RNAs sintetizados de DNAs não codificantes)
(RNAs anti-sense)
Interferem com a Tradução do mRNA (silenciamento gênico)
70% do genoma
