regulação e expressão gênica bacteriana
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Prof. Dra. Adriana DantasGenética de microorganismos
UERGS Bento Gonçalves
Regulação e expressão gênica bacteriana
TRANSCRIÇÃO : EUCARIOTO X PROCARIOTOTRANSCRIÇÃO : EUCARIOTO X PROCARIOTO
EUCARIOTOS
PROCARIOTOS
Enzimas responsáveis pela replicaçãoEnzimas responsáveis pela replicação
5
1 2
4
3
1 Rompem as pontes de hidrogênio às custas da energia de hidrólise do ATP, entre as bases.
2 Sintetiza o iniciador (primer):
1 + 2 =1 + 2 = complexo de iniciação da replicação (CIR).
3 Duas DNA polimerase (I e III) acoplam-se ao CIR e iniciam o alongamento da cadeia, uma na fita contínua (leading) e outra na fita descontínua (lagging).
DNA pol III - 30.000/minDNA pol III - 30.000/min
DNA pol I –600/min.DNA pol I –600/min.
4 Une a extremidade 5´fosfato de um fragmento novo à extremidade 3´- OH do próximo
5 Diminuem o grau de superenrolamento do DNA no ponto de origem da replicação
O RNA ou ARN
O açúcar é uma Ribose;É formado, geralmente,
por uma fita simples que pode enrolar-se;
Não existe a base pirimídica Timina e no seu lugar se encontra a base Uracila.
Os pareamentos seguem a ordem A-U e G-C).
O Ácido Ribonucléico é um polinucleotídeo que difere do DNA em três aspectos básicos:
A-UU-AG-CC-G
A-TT-AG-CC-G
DNA
RNA
Tipos de RNA
RNAm O RNA mensageiro é formado no núcleo e contém a “mensagem” - o código transcrito a partir do DNA - para a síntese das proteínas. Cada conjunto de três nucleotídeos no RNAm é chamado de CÓDON.
RNAt O RNA transportador está presente no citoplasma e é responsável pelo transporte dos aminoácidos até os ribossomos para a síntese protéica. No RNAt existe uma seqüência de nucleotídeos correspondente ao códon chamada de ANTI-CÓDON.
RNAr O RNA ribossômico ou ribossomal faz parte da estrutura dos ribossomos e participa do processo de tradução dos códons para construção das proteínas.
Regulação gênicaRegulação gênicaAs regulações metabólicas são catalisadas por
enzimas;
A transcrição e a tradução dirigem a síntese de proteínas, muitas das quais servem como enzimas;
Síntese de proteínas requer gasto energético;
Regulação da síntese protéica é importante para a economia energética celular;
Produção de proteínas necessárias em momentos específicos
GenesGenesMuitos genes, em torno de 60 a 80% não são
regulados, são constitutivos, ou seja seus produtos são constantemente produzidos em velocidade fixa.
Produção de outras enzimas é regulada, de modo que estejam presentes somente quando necessário.
Apenas 1% do DNA é transcrito em RNAm codificante de proteínas e até 10% do DNA são transcritos em RNA
Tipos de genesTipos de genes
Os que já funcionaram em uma fase anterior e atualmente não funcionam mais
Os que estão em funcionamento em um determinado momento
Os que ainda irão funcionar mais tarde
Os que funcionam sempre
Controle da expressão gênicaControle da expressão gênica
Controle do que é expresso pode ocorrer em vários níveis:
TranscriçãoProcessamentoTransporte do RNAmTraduçãoPós-traduçãoFuncionamento enzimático
RNA polimeraseRNA polimerase
Na maioria dos procariontes, uma única espécie de RNA polimerase transcreve todos os tipos de RNA.
RNA polimerase consiste em quatro tipos de subunidades:Beta: 150.000 dáltons (); beta primo: 160.000
dáltons (’); alfa: 40.000 dáltons (); sigma: 70.000 dáltons
()
Estrutura do RNA Estrutura do RNA polimerasepolimerase
O cerne da enzima contém dois polipeptídios , um polipeptídio e ’.
A adição da subunidade permite a iniciação nos sítios promotores, formando uma holoenzima
’
’
’
+
Cerne da enzima
Fator sigma
Holoenzima
Subunidades da RNA polimerase Subunidades da RNA polimerase de de E. coliE. coli
• Grande e complexa, a holoenzima RNA polimerase de E. coli possui 5 tipos de subunidades.
•Seu centro catalítico se encontra no chamado cerne da enzima (a2bb’).
•E, além das funções descritas no quadro1, a RNA polimerase também interage com proteínas ativadoras e repressoras que modulam a taxa de expressão gênica nas células.
Transcrição do DNATranscrição do DNA
• Quando se escreveescreve um seqüência de nucleotídios correspondente a um gene
•A seqüência é sempre escrita no sentido 5'-> 3'
Estágios da transcriçãoEstágios da transcrição
Iniciação
Alongamento
Término
A enzima RNA-polimerase abre a dupla hélice do DNA;
Inicia-se a produção de uma molécula de RNAm, no sentido 5’ 3’
Os nucleotídeos são ligados respeitando a ordem A-U, G-C.
Finaliza a transcrição quando a RNA-polimerase se desliga do DNA, a molécula de RNAm primário está formada e segue para o citoplasma onde será traduzida.
Fita de RNA em formação
Fita molde DNA
IniciaçãoIniciaçãoRegiões que indicam o inicio da transcrição
em procariontes são chamadas de promotorespromotores
Seqüenciais promotoras em 13 pontos diferentes de inicio de transcrição no genoma E. coli.
A A UnidadeUnidade de de TTranscriçãoranscrição
A transcrição de um segmento se inicia quando a RNA polimerase reconhece e liga-se a seqüências específicas de nucleotídios em uma região especial, no início do gene, denominada promotor
Além destas seqüências, o promotor engloba o ponto de início: Primeiro par de bases a ser transcrito em RNA
A partir daí a RNA polimerase move-se ao longo do molde, sintetizando RNA, até alcançar uma outra seqüência outra seqüência específica que sinaliza o término da transcrição. específica que sinaliza o término da transcrição.
Unidade de transcrição estende-se do ponto de início (+1) no Unidade de transcrição estende-se do ponto de início (+1) no promotor, até o terminadorpromotor, até o terminador
Diagrama representativo de um promotor genérico de E. coli. As caixas -35 e -10 (também chamada caixa de Pribnow ou caixa TATA) são muito conservadas entre distintos promotores.
Pequenas variações nestas seqüências podem reduzir drasticamente a afinidade do fator sigma da RNA pol pelo promotor.
A base +1 é, por convenção, aquela onde se inicia a transcrição. A RNA pol, uma vez acoplada ao promotor, ocupa cerca de 5 voltas do DNA.
Unidade de transcrição
Reconhecimento do Reconhecimento do PPromotorromotor Para que este processo ocorra é necessário, antes de
mais nada, que a RNA polimerase identifique sinais específicos no DNA, os quais direcionarão a transcrição de genes específicosgenes específicos no momento adequado
Uma enorme variedade de sinais pode ser encontrada nas regiões promotoras de diferentes genes.
É por este motivo que os promotores são locais extremamente importantes no controle da expressão gênica
PromotorPromotorExiste, um consenso em torno de sua seqüência.
A primeira base transcrita em RNA com a base +1 = seqüência de consenso de um promotor da bactéria Escherichia coli.
A freqüência com que um promotor é ligado e o gene promotor é ligado e o gene é transcrito pela RNA pol, está diretamente associada à homologia com a seqüência de consensohomologia com a seqüência de consenso.
É através da variação das seqüências nas duas caixas (conhecidas como caixa TATA, ou caixa de Pribnow, e caixa -35) que é modulada a transcrição modulada a transcrição relativa dos genes constitutivos (aqueles que são expressos o tempo todo durante a vida da célula).
Um gene cujo produto deva ser abundante tem um promotor com seqüência mais próxima ao consenso
Gene cujo produto deva ser raro na célula tem, em geral, um promotor com as seqüências das duas caixas bastante divergentes do consenso.
Processo de Processo de TTranscriçãoranscrição
•Diz-se que as seqüências que antecedem o ponto de início localizam-se à montante (upstream) e as que o sucedem localizam-se à jusante (downstream)
•A posição das bases é numerada nos dois sentidos, a partir do ponto de início, ao qual se atribui o valor +1. Os valores aumentam (valor positivo) à jusante e diminuem (valor negativo) à montante
•A taxa de transcrição gênica também pode ser afetada pela ligação de proteínas ativadoras e repressoras proteínas ativadoras e repressoras a sítios próximos aos pontos de iniciação e pela distância entre as seqüências de consenso dos promotores, sendo a separação ideal igual a 17 nucleotídeos (em procariotos).
Região consensoRegião consensoEssas seqüências podem ser bastante
variáveis, porém, mantêm conservadas regiões responsáveis pela função promotora.
Em procariotos, duas dessas regiões:
10 pb = 5´ TATATT 3´
35pb = 5' TTGACA 3’
Processo de Processo de TTranscriçãoranscrição
Regiões chamadas de -35 e -10 devido as suas localizações relativas ao ponto de inicio de transcriçao
A subunidade permite que a RNA polimerase reconheça (sinalização) (sinalização) e se ligue especificamente a regiões de promotores
A holoenzima procura um promotor e inicialmente se liga frouxamente a ele, reconhecendo as regiões -35 e -10
Forma uma estrutura chamada “complexo promotor fechado“complexo promotor fechado”
A partir daí a enzima se liga fortemente, deselicoizando bases próximas a região -10.
Probabilidades dos arranjos Probabilidades dos arranjos O arranjo particular da estrutura do promotor permite que, com apenas um
par de 6 bases (cada caixa consenso tem em geral uma dúzia de bases) um promotor seja determinado com imensa precisão.
O que queremos dizer com isto? O que queremos dizer com isto?
Podemos formular a questão de outra forma: qual a probabilidade de uma seqüência de 6 bases ocorrer ao acaso no DNA?
Para cada base a probabilidade de ser um T, digamos, é 1/4, pois podemos ter T, A, G ou C.
O mesmo se aplica para as demais bases da seqüência, portanto, a probabilidade de se ter a seqüência TAATTA, por exemplo:
¼ x ¼ x ¼ x ¼ x ¼ x ¼ = (¼ )6 ~ 1/4000
ConsideraçõesConsideraçõesNão é uma probabilidade muito pequena, considerando que há de 2 a 10
milhões de bases num genoma procarioto.
O encontro de uma tal seqüência não pode ser fortuito!
Embora se tenha mais liberdade em alterar a seqüência da região promotora fora das caixas de consenso, não podemos retirar nem acrescentar bases entre as caixas, porque a distância entre elas deve ser mantida.
Chegamos, então, a um importante conceito na biologia molecular: distância distância também é informação. também é informação.
O fator deve reconhecer as duas caixas de consenso. primeiro a TATA e primeiro a TATA e depois a -35 depois a -35 e para tal elas devem estar a uma determinada distância entre si.
AlogamentoO RNA é sempre produzido no sentido 5’- 3’
Durante essa fase, o RNA recém-sintetizado pareia-se temporariamente com a fita molde de DNA = híbrido curto RNA-DNA.
Diferentemente da DNA polimerase, a RNA polimerase não tem atividade de nuclease, ou seja, não revisa a cadeia de RNA não revisa a cadeia de RNA nascente.
Conseqüentemente, a fidelidade da síntese de RNA (transcrição) é bem Conseqüentemente, a fidelidade da síntese de RNA (transcrição) é bem menor que aquela observada para o DNA (replicação)menor que aquela observada para o DNA (replicação). .
Os RNAs sintetizados que apresentarem problemas serão degradados e têm pouca probabilidade de serem prejudiciais, uma vez que outros transcritos serão rapidamente produzidos.
Regiões TerminadorasRegiões TerminadorasA análise de muitas dezenas de regiões terminadoras mostrou que sua
sequência apresenta características comunssequência apresenta características comuns, que podem ser resumidas da seguinte forma:
Na fita de DNA que está servindo de molde para a síntese do RNA surge uma sequência com cerca de 8 bases que, após um espaçador de tamanho variável (4 a 15 bases, em geral),
É seguida de outra sequência complementar a ela, porém em sentido contrário;
Logo após esta região simétrica há uma sequência longa de Timinas (um poliT), na fita 5’-3’.
Esta estrutura, conhecida como grampo de terminaçãogrampo de terminação, sinaliza para a polimerase que ela deve terminar a síntese de RNA.
Sinais de início e término da síntese de RNA pela RNA polimerase bacteriana.
O sinal de início é o promotor, reconhecido pelo fator sigma.
O sinal de término é reconhecido a posteriori (isto é, pela estrutura formada no RNA), e tem, no DNA uma sequencia poli-T.
TérminoTérminoO final da transcrição é um processo bem controlado no qual seqüências típicas dos transcritos de RNA (sinais de término) indicam o local para a finalização da síntese dessa molécula.
Na bactéria E. coli existem no mínimo duas classes de seqüências de sinalização do término da transcrição: uma utiliza a proteína r (rho) outra não (rho-independente).
Formação do grampo de Formação do grampo de finalizaçãofinalização
O pareamento intramolecular das seqüências complementares do RNA recém-sintetizado forma uma estrutura em grampo. Esse acontecimento desencadeia os seguintes eventos:
Parada da RNA polimerase:Parada da RNA polimerase:Destruição parcial do híbrido RNA-DNA (proporcionando
instabilidade da região que permanece ligada);
Dissociação do RNA nascente da enzima RNA polimerase
Restabelecimento da região dupla-fita do DNA;
Liberação da RNA polimerase da fita molde do DNA.
Afinal, qual é o destino dos RNAs na Afinal, qual é o destino dos RNAs na bactéria?bactéria?
A verdade é que a vida média de um mRNA bacteriano é muito curta, raramente ultrapassando 60 segundos;
Por isso, um mRNA só é necessário por breves instantes, sendo em seguida descartado.
No caso dos mRNA de procariotos, a sua degradação é controlada por um processo engenhoso.
A transcrição e a tradução estão de tal forma acopladas que, imediatamente após a síntese de um pequeno trecho de mRNA, os ribossomos já se ligam a este RNA nascente, protegendo-o da degradação pelas RNases bacterianas.
Mecanismo de transcritosMecanismo de transcritos
Uma primeira categoria em que se dividem os mecanismos reguladores, é a que consiste em ligar (indução) ou desligar (repressão) óperonsóperons em resposta a alterações ambientais (este sistema têm maior significância entre os microorganismos).
A segunda categoria envolve o desencadeamento de circuitos pré-programados de óperons.
Existem três categorias de genes:
o reguladoro operador os estruturais;
O modelo ÓPERON LAC:O modelo ÓPERON LAC:
O regulador controla o operador regulador controla o operador e este, os estruturais; O gene regulador produz uma proteína chamada repressor regulador produz uma proteína chamada repressor ; O repressor se liga ao gene operador, impedindo a ligação da RNA pol e
portanto impedindo a transcrição dos genes estruturais que codificam as enzimas de degradação da lactose;
Quando o indutor (no caso a lactose) é adicionada ao sistemao indutor (no caso a lactose) é adicionada ao sistema, este se liga ao repressor, liberando o operador, o que permitirá a ligação da RNA pol ao sítio promotor e consequentemente os 3 genes estruturais serão transcritos.
•Esquema representativo do controle da transcrição dos genes para as enzimas responsáveis pelo uso da lactose em E. coli.lactose em E. coli.
• O repressor, produto do gene iproduto do gene i, liga-se ao operador (em verdade, duas moléculas), impedindo a ligação da RNA polimerase ao sítio promotor P sítio promotor P e bloqueando a transcrição.
•A lactose no citosol bacteriano liga-se ao repressor, inativando-o e liberando o promotor para ser ligado pela RNApol.
• O processo de transcrição estará liberado até que a concentração citosólica de lactose seja insuficiente para garantir a inativação das moléculas do repressor.
Que importância tem o Que importância tem o operon lac na genética operon lac na genética molecular?molecular?
Muitos dos vetores de expressão, sejam eles fagos ou plasmídeos, empregados em engenharia genética, têm o gene clonado sob o controle de um promotor/operador lac.
Este sistema propicia o controle da expressão do gene clonado através da adição de um análogo da lactose, o IPTG (isopropiltiogalactosídeo).
Este produto é muitas vezes mais efetivo que a lactose na indução da expressão do operão lac, além de não ser degradado.
Processo de TraduçãoProcesso de TraduçãoO processo de tradução se inicia pela ligação da sub-
unidade menor do ribossomo a um sítio (sequência) específica no mRNA chamado RBS (ribosome binding site).
Esta ligação é mediada pelo pareamento de uma sequência do rRNA 16 S (que faz parte da composição da sub-unidade leve) com a sequência de Shine-Delgarno (ou RBS). de Shine-Delgarno (ou RBS).
À sub-unidade menor acopla-se, então, o primeiro tRNA (sempre para formil-metioninaformil-metionina, em E. coli), e o conjunto desliza pelo mRNA até encontrar o códon AUG (identificado pelo anticódon correspondente no tRNA).
Sítio E ( “empty” = vazio), onde se aloja o tRNA descarregado antes de sair do ribossomo
Estão representados os diversos fatores que participam do processo de tradução, além do ribossoma e dos tRNAs.
Síntese ProtéicaSíntese Protéica
O RNAm transcrito no núcleo chega ao citoplasma e se liga a um ou mais ribossomos.
O ribossomo “lê” o primeiro códon e um RNAt com o anticódon correspondente transporta um aminoácido e se liga ao códon.
O ribossomo se desloca, no sentido 5’3’ e lê o próximo códon.
Os aminoácidos são unidos por ligações peptídicas.
Ao final da tradução o polipeptídeo se desliga e se constituí na proteína.
TRADUÇÃO: SÍNTESE PROTEICA
Adição do aminoácido correto: pareamento do códon (RNAm) com o anticódon (RNAt)
Terminal 3´que liga ao aminoácido - fenilalanina (Phe)
Nucleotídeos modificados
ProteínasProteínas
As proteínas se definem como polímeros formados pela união, mediante a cadeias peptídicas, de unidades de menor massa molecular chamadas aminoácidos;
As proteínas são macromoléculasSão compostos mais abundantes da
matéria vivaSão especificasAtravés delas se expressam a informação
genética
