regulação da expressão gênica em eucariotos_2009

Regulação da Regulação da Expressão Gênica em Expressão Gênica em

EucariotosEucariotos

• Diferentes tipos celulares ≠ estrutura e função

• Pensamento inicial:genes seletivamente perdidos quando a célula se diferenciava Ovelha Dolly

Diferenciação celular

Mudanças na expressão gênica

Diferentes tipos celulares

Sintetizam e acumulam ≠ RNAs

e proteínas

Sem alteração na seqüência de DNA

http://psych.um

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http://www.pucrs.br/fabio/histologia/

atlasvirtual/maxim

/57a7leg.htm

• Muitos processos comuns em células diferentes (genes housekeeping)

• Algumas proteínas são abundantes nas células especializadas onde atuam, mas não em outras células (hemoglobina)

• Diferença nos tipos de mRNA subestima a variação total de diferenças no padrão de produção de proteínas

modificações pós-traducionais

• Alteração da expressão gênica em resposta a sinais externos (hormônios glicocorticóides)

• Diferentes tipos celulares respondem de maneiras diversas ao mesmo sinal extracelular

• Para a maioria dos genes: controle transcricional + importante (evita síntese desnecessária)

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Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos

Regulação da Expressão Regulação da Expressão Gênica em EucariotosGênica em Eucariotos

TranscriçãoTranscrição

Promotor

• A iniciação da transcrição em eucariotos envolve um grande número de fatores (fatores de transcrição - FT)

• Os FT são necessários para a iniciação e os principais responsáveis pelo reconhecimento do promotor

• Todos os promotores da RNA pol II tem elementos de seqüência próximos ao ponto de início

ligação do aparato basal – determinação do sítio de iniciação

• Seqüências mais distantes -- tipos celulares

Genes housekeeping

Genes tecido-específicos

• Genes housekeeping: tem elementos de seqüência a montante que são reconhecidos por fatores ubíquos

• Reforçadores (enhancers): a vários Kb distante do promotor

Alvos para regulação tecido-específica e temporal

• A transcrição eucariótica está nas maioria das vezes sob regulação positiva

Tamanho do genoma

Média de 5 sítios regulatórios por gene em organismos multicelulares

30000-35000 genes regulados - ???

• O repressores também atuam na regulação

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Promotor

Promotor

Elementos reguladores

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Procariotos x Eucariotos

3 RNApol

Estrutura complexa da cromatina

Requerimento de vários FT

Complexidade RNApolII

Fatores de transcrição

• Reconhecem seqüências reguladoras presentes nos promotores e reforçadores (enhancers) dos genes

• Podem ser de dois tipos:– Fatores gerais – necessários para a

expressão de todos os genes transcritos pela RNA pol II

– Fatores específicos – responsáveis pela expressão de proteínas célula-específicas (ativadores, co-ativadores, repressores e co-repressores)

Fatores gerais de transcrição

• TFIID: TBP + 11 TAFs

• Diferentes TAFs, algumas são tecido-específicas

• TBP se liga à cavidade menor do DNA (domínio C-terminal DNA, N-terminal interação com proteínas

• Ligação de TBP ao DNA inconsistente com a presença de nucleossomos

• Ligação de TBP ao DNA-- associação ao DNA RNApolII + fatores

• RNA pol só se liga após a ligação dos FT ao promotor

Fatores gerais de transcrição

TATAbox:- Ocorre na maioria dos genes- Principal região promotora da transcrição- Sítio primário de adesão dos fatores de transcrição + TBP (TATA-Binding Protein)

Fatores de Transcrição (FT)- Se ligam a elementos reguladores nos promotores- Modificam a taxa de transcriçãoNão ocorre início de transcrição na ausência de proteínas acessórias.

RNApolII

A ligação de TFIID ao TATA box é o primeiro passo da iniciação da transcrição em eucariotos

TFIIA ativa TBP – alivia repressão por TAFII230

TFIIB promove a superfície que será reconhecida pela RNApol

TFIIF- helicase

TFIIH –ATPase, helicase, quinase (fosforilação da CTD da RNApol)

TFIIE e TFIIH movimento da polimerase

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• Elementos de seqüência (curtos): eficiência e especificidade de reconhecimento do promotor. Ex: genes Hsp

• Vários elementos de resposta em um gene. Ex: gene metalotioneina

• ~100pb distantes do ponto de início ou + distantes (enhancers)

• Influenciam a freqüência de iniciação (freqüência de montagem)

Fatores específicos

MRE resposta a metais pesados

TRE resposta a ésteres de forbol

Um único gene regulado por vários elementos

Fatores específicos

Reforçadores (Enhancers)• Promotores eucarióticos não funcionam sempre sozinhos

• Reforçadores podem ativar o promotor de locais a montante ou a jusante

• Podem estar a vários kb distantes da região promotora ou localizado dentro do gene

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VIII

• Podem aumentar a transcrição em centenas ou mais vezes

• Em leveduras UAS (upstream activator sequence)

• Estrutura + cooperativa entre os fatores de ligação: todos os componentes requeridos

• Superfície que se liga ao complexo de co-ativação (auxilia complexo de pré-iniciação)

Reforçadores (Enhancers)

• Os reforçadores atuam aumentando a concentração de ativadores nas proximidades do promotor

• cis e trans-atuantes: reforçando a idéia da necessidade de “proximidade” entre promotor e reforçador

Reforçadores (Enhancers)Le

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Proximidade reforçador-promotorPete

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Levedura

Mediador: complexo de 20 subunidades (co-ativador)

• Os isoladores são capazes de bloquear a passagem de qualquer efeito de ativação ou inativação de reforçadores, silenciadores

• Promovem barreiras contra a propagação da heterocromatina

• Dois isoladores podem proteger a região entre eles de efeitos externos

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Isoladores

Regulação do enhancer: isoladoresW

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Ativadores• São FT que reconhecem seqüências específicas no promotor ou reforçador

• Aumentam a eficiência da ligação do aparato basal ao promotor, aumentando assim a freqüência da transcrição

• Co-ativadores promovem a conexão entre ativador e aparato basal (RNA pol II + fatores basais)

• Atuação:

Recrutamento da maquinaria de transcrição

Recrutamento de modificadores de nucleossomos

• Interagem com os fatores basais

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Ativador: domínios• Possuem regiões separadas independentes para ligação ao DNA e para a ativação (geralmente domínios protéicos separados)

Plasmídeo repórter: promotor GAL1 fundido ao gene LacZ de E. coli

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Duplo híbrido

Proteínas fundidas a diferentes domínios do ativador

A interação entre as duas proteínas possibilita que o gene repórter seja expresso

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Duplo híbrido

Ligação entre proteína e DNA

• Proteínas regulatórias geralmente se ligam a seqüências específicas do DNA.

• As proteínas regulatórias possuem domínios de ligação ao DNA, que incluem um ou mais motivos estruturais.

• Os sítios de ligação ao DNA para proteínas regulatórias são freqüentemente seqüências de DNA repetidas e/ou invertidas (palindrômicas), onde múltiplas subunidades (normalmente duas) da proteína se ligam.

Motivos de ligação ao DNA em proteínas regulatórias

Hélice-volta-hélice (helix-turn-helix)Em laranja e vermelho


Homeodomínio (helix-turn-helix)

Homeobox codifica domínio de 60 aa

Identificados originalmente no loci homeótico de Drosophila

Muitas vezes o homeodomínio é combinado com outros motivos em FTs de animais

A região C-terminal apresenta homologia com o motivo helix-turn-helix

Braço N-terminal: contato com cavidade menor do DNA

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Homeodomínio (helix-turn-helix)

Podem atuar como ativadores ou repressores

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Dedo de zinco (zinc finger)

“Dedo” ~23 aa

Ligação entre os dedos 7-8 aa

Cys2/Hys2Wats

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GL1 proteína monomérica com 5 dedos de zinco. O “dedo”1 não interage com o DNA

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Três dedos de zinco ligados ao DNA

Comum em proteínas eucarióticas

Poucos exemplos em procariotos

Receptores de esteróides (forma distinta)

Receptor de glicocorticóide C4 zinc finger

Os receptores de glicocorticóides e estrogênio tem 2 dedos de zinco (Cys2/Cys2)

Formam dímeros quando se ligam ao DNA

Dedo de zinco (à esquerda) determina a seqüência de DNA que será reconhecida

Dedo de zinco (à direita) controla o espaçamento entre os sítios alvo reconhecidos por cada subunidade do dímero


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Os receptores de glicocorticóides e estrogênio diferem pela composição de aminoácidos no dedo de zinco

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VIII

GR - TGTTCTMR - TGTTCTAR - TGTTCTER -TGACCT

Motivos de ligação proteína-proteína em proteínas

regulatórias• Além de motivos de ligação ao DNA, as

proteínas regulatórias possuem motivos de ligação a outras proteínas

– RNA polimerase– Outras proteínas regulatórias– Outras subunidades da mesma

proteína regulatória


regulatóriasZíper de leucina (Leucine zipper)

Um motivo leucine zipper ligado ao DNA.Resíduos de Leu são mostrados em vermelho.

Muito encontrado em eucariotos.Pouco encontrado em procariotos.

Cada hélice é parte integrante de uma cadeia polipeptídica, mantidas ligadas pelo motivo leucine zipper na formação do dímero.

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O zíper de leucina é uma α hélice anfipática que dimeriza

O zíper possui uma região básica adjacente que se liga ao DNA

A dimerização forma o motivo bZIP (braços que se ligam ao DNA) no qual duas regiões básicas simetricamente ligam repetições invertidas no DNA

Ex: Ativador AP1 (formado por proteína Jun e Fos)Jun forma homo e heterodímerosFos só forma heterodímeros

Seqüências alvo: repetições invertidas sem espaçamento


regulatórias

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regulatóriasHélice-alça-hélice (helix-loop-helix)

Proteínas HLH

Motivo de 40-50 aa (2 α hélices anfipáticas de 15-16 aa separadas por uma alça)

Formam homo e heterodímeros

Um único par de Leu liga as hélices (vermelho no topo)

Alça permite liberdade para as 2 hélices interagirem independentemente

A maioria das HLH possuem uma região adjacente ao motivo HLH que é altamente básica

Proteínas bHLH

Dímero com ambas subunidades bHLH podem ser ligar ao DNA

Possibilidade de associação combinatória

Combinações particulares possuem função diferente com relação à ligação ao DNA e regulação transcricional


regulatórias

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Controle combinatório

Ativadores trabalham sinergicamente para integrar os sinais

Em alguns casos vários sinais são necessários para ligar um gene

O controle combinatório permite um aumento na complexidade

Dois ativadores podem recrutar um mesmo complexo ou diferentes

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Controle combinatório

A sinergia pode também resultar do auxílio mútuo entre ativadores para ligação ao sítio de atuação

Ligação cooperativa

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Controle combinatórioGenes do tipo acasalante em leveduras

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Remodelamento da cromatina

+ comum: alterar a organização dos nucleossomos

Gasto de ATP para o remodelamento

Alguns ativadores podem se ligar ao DNA na superfície do nucleossomo

Gene ativo: estrutura da cromatina no promotor e na região próxima

Remodelamento da cromatinaLe

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VIII


Região N-terminal

Co-ativador

Ativador

Co-repressor

Repressor

Histonas acetiladas:Cromatina ativa

Histonas desacetiladas:Cromatina inativa

Grupo Acetil(Ac)

Lisina

Região N-terminal

Co-ativador

Ativador

Co-repressor

Repressor

Histonas acetiladas:Cromatina ativa

Histonas desacetiladas:Cromatina inativa

Grupo Acetil(Ac)

Lisina

Acetilação das histonas pelas histonas acetiltransferases (HAT)

As HAT podem ser recrutadas pelos ativadores

Complexo de remodelamento da cromatina (SWI/SNF) estimulam a ligação de fatores de transcrição (subunidades com atividade helicase)

Acetilação das

histonasTodo o core de histonas pode ser acetilado

Principais alvos: lisinas da cauda N-terminal da H3 e H4

Cromatina acetilada é mais sensível a DNaseI

Ativadores conhecidos pos-suem atividade HAT

Momentos: Replicação e ativação gênica

TAFII145: acetilase

HAT A: transcrição

HAT B: montagem do nucleos-somo

Complexo de remodelamento da cromatinaP

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Histona - acetilase


Ativação de um

promotorPredominância de regulação positiva em eucariotos: armazenamento do DNA na cromatina

Silenciamento gênicoPete

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Histonas podem ser deacetiladas por histonas deacetilases (HDACs)

Deacetilação de histonas está relacionada à repressão gênica

Ausência de acetilação de histonas é uma das características de heterocromatina

HDAC

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nMetilação do DNA e

histonasA metilação do DNA e histonas está relacionada à cromatina inativa

Locais para metilação de histonas: 2 lisinas na cauda da H3 e uma arginina na cauda da H4

A maioria dos sítios de metilação do DNA: ilhas CpG

CpG em heterocromatina: metiladas

Conexão entre metilação de DNA e histonas: algumas HMT contém sítios para ligação a CpG metilado (o contrário é observado em leveduras).

De-acetilação -- metilação

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Metilação do DNA

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Efeito da Metilação do DNA

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Metilação do DNA

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nMetilação do DNA e imprinting

Insulin-like growth factor 2

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Metilação do DNA e

imprinting

Xic (X-inactivation center): região de ~450 kb

Xic contém o gene Xist, expresso no cromosso X inativo

X inativo: sem acetilação, metilação da seqüências CpG

Metilação do promotor Xist no X ativo

Inativação do cromossomo X

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Repressores

a – menos comum em eucariotos

Sítio de ligação do repressorSítio de ligação do ativador

Superf ície de ativação

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Sítio de ligaçãodo ativador

Sítio de ligação do ativadorSítio de ligação do repressor

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Sítio de ligação do repressorSítio de ligação do ativador

Superf ície de ativação

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Sítio de ligaçãodo ativador

Sítio de ligação do ativadorSítio de ligação do repressor

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Repressores

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Repressores

Repressão do gene GAL1 na presença de glicose

Mig1 recruta complexo repressor Tup1 que recruta a deacetilase

E também inibe a maquinaria de transcrição

Regulação da utilização de galactose em levedura

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Ação do hormônios peptídicos e hormônios esteróides

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VIII

Modelo para a ação de hormônios esteróides

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Modelo para a ação de glicocorticóide em células de mamíferos

Pete

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Regulador com atividade controlada por localização nuclear

Silenciamento gênico mediado por RNA de

interferência

Dicer = endonuclease ~ a RNAaseIII

stRNA = small temporal RNA

Dicer

siRNA

O mecanismo de RNAi em plantas: defesa contra vírus

Pode controlar a atividade de transposons

Micro RNAs (miRNAs) podem inativar genes do mesmo modo que o siRNA

Mecanismo prático e eficiente para silenciamento gênico

siRNAs 21-23 nt: 2 bases na ext. 3´são não pareadas

RNA-induced silencing complex (RISC)

Silenciamento gênico mediado por RNA de

interferência

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Splicing alternativo

Gene Sex-lethal em moscas (só nas fêmeas)Sexo determinado pela relação entre cromossomos sexuais e autossomos

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Splicing alternativo

Gene Sex-lethal em moscas (só nas fêmeas)

Sxl auto-regulação (proces-samento)

Vários mRNA eucarióticos estão sujeitos a repressão

traducional

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Controle traducionalGcn4 ativador transcricional – proteínas da biossíntese de aminoácidos

regulação da expressão gênica em eucariotos_2009

Documents