cinética e regulação enzímicas não está em...
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Cinética e regulação enzímicas
(a velocidade das reacções enzímicas in vivo e in vitro)
Laboratório de Bioquímica da Faculdade de Medicina do Porto
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As concentrações dos intermediários do metabolismo variam de indivíduo para indivíduo e com o estado metabólico mas mantêm-se em torno de determinados valores. As concentrações dos intermediários do metabolismo dizem-se estacionárias.Exemplo: A concentração de ATP (e a maioria dos outros compostos existentes nos seres vivos) considerando as várias reacções em que intervém como reagente ou produto não está em equilíbrio químico.
...mas a velocidade do conjunto de reacções que formam ATP é (quase) sempre igual à velocidade do conjunto de reacções em que este se gasta... existe nas células uma concentração estacionária de ATP.
Os mecanismos que permitem manter o ATP, os intermediários do metabolismo, a glicose do plasma, etc em concentrações estacionárias são muito complexos e denominam-se de mecanismos homeostáticos.
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A regulação do metabolismo de modo a adaptar-se a diferentes condições (actividade ou descanso, jejum ou estado absortivo, diferentes tipos de dieta, etc.) é uma condição de sobrevivência.
ATP
contracção muscular
nutrientes
O2 ADP+Pi
ureia
CO2 + H2O
transporteactivo
trabalhomecânico
Na+
Ca+
Estado absortivo=Glicemia
Estado de jejum = Glicemia
A adaptação a diferentes condições só é possível porque a actividade das enzimas se modifica quando se alteram essas condições.
glicose
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As enzimas são sensores do ambiente onde se encontram variando a sua actividade em função de variações nesse ambiente.
As enzimas que catalisam reacções fisiologicamente reversíveis catalisam a conversão líquida no sentido directo ou inverso de acordo com a lei da acção das massas mas não são determinantes no sentido nem na velocidade de fluxo (J) da via metabólica...
As enzimas “marca passo” de uma via metabólica catalisam reacções fisiologicamente irreversíveis e a sua actividade determina a velocidade de fluxo nessa via metabólica. Estas enzimas (1) têm baixa actividade, (2) tem um papel determinante na regulação do metabolismo e (3) são controladas por efectores que só às vezes coincidem com os substratos e produtos...
A B1000
1010
S P0,01
10,01
Glicólise
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Aumentar a actividade de uma enzima que catalisa uma reacção “de desequilíbrio” (M2 M3) pode significar um aumento transitório na concentração do intermediário M3 mas, a enzima a jusante que catalisa a conversão reversível M3 M4 rapidamente repõe a concentração de M3 num valor próximo do original.
J1 = (10) = (1010 – 1000) = 10
J2= (20) = (1020 – 1000) = 20
É na barragem que se controla o caudal (fluxo) de um rio…mudanças no valor do fluxo (J) na barragem provocam mudanças de fluxo idênticas a montante e a jusante da barragem.
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1- De instalação lenta (horas ou dias): a quantidade de enzima como a resultante das velocidades da sua síntese e da sua degradação.
Diferentes tipos de mecanismos podem participar na regulação das enzimas marca-passo das vias metabólicas:
2.1- Modificação alostérica (AMP, Ca2+…)
2.2- Modificação covalente (fosforilação e defosforilação, clivagem hidrolítica…)
2.3- Ciclos de substratos (“fúteis”)
2.4- Acesso ao substrato por regulação do transporte transmembranar (GLUT4, CPT…) e concentração de substratos
2- De instalação rápida
(segundos ou milisegundos):
3- De instalação rápida mas, geralmente, com papel menosimportante (pelo menos no metabolismo normal)
3.1- Inibição isostérica (competitiva) einibição pelo produto
3.2- pH 3.3- Temperatura
ATPADP
MM-PH2O
Pi
M M
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1- Mesmo quando o que varia é apenas a concentração da enzima E sem que tenha variado a actividade de cada uma das suas moléculas se a velocidade da reacção que E catalisa aumentou dizemos que a actividade enzímica da enzima E aumentou (e vice-versa). É um mecanismo de instalação lenta.
H2OSíntese proteica
v1
v2
Se a velocidade de síntese de uma determinada enzima (v1) é maior que a velocidade com que se degrada (hidrolisa) na célula (v2) a concentração e a actividade dessa enzima aumenta. Na condição inversa a concentração e a actividade diminuem.
v1 > v2 v2 > v1
RNAm
RNAm
8centro activo
AMP
sítio alostérico
Fosforílasemuscular na conformação tensa (inactiva)
Fosforílasemuscular na
AMP
2.1- Quando uma fibra muscular se contrai aumenta a velocidade de hidrólise do ATP e aumenta a concentração de ADP (e AMP; 2 ADP AMP + ATP). O AMP liga-se à fosforílase muscular induzindo uma conformação mais activa o AMP é um activador alostérico da fosforílase muscular.
conformação relaxada (activa)
Glicose-1-P
CO2 + H2O
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A complexidade dos processos de regulação de enzimas induzida por hormonas e neurotransmissores tem levado a que a palavra “alostérico” não se use neste contexto mesmo quando o termo seria adequado.
O receptor da insulina pode ser visto como uma enzima alostérica com o seu centro alostérico activador virado para o lado extra-celular (onde se liga a insulina) e o centro activo no lado citoplasmático.
A ligação da insulina induz uma alteração conformacional no receptor que se torna capaz de catalisar a fosforilação de resíduos tirosina de proteínas designadas de Substratos do Receptor da Insulina (IRS).Efeitos
da insulina
Insulina ligada ao seu receptor
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A ligação entre os modificadores (activadores ou inibidores) alostéricos e os sítios alostéricos das enzimas é reversível e é de tipo não covalente.
… e o mesmo acontece nas ligações dos substratos e dos inibidores isostéricos competitivos ao sítio activo das enzimas.
Activadoralostérico
Inibidor alostérico
Inibidor isostérico competitivo
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2.2- A modificação da actividade de uma enzima pode envolver a sua modificação covalente (hidrólise irreversível ou fosforilação reversível) por acção catalítica de enzimas (normalmente outras enzimas).
Certas enzimas são activadas por hidrólise irreversível.São exemplos a activação dos zimogénios na digestão dos nutrientes.
Tripsinogénio
Tripsina(activa)
polipeptídeoinactivo+
H2O Entero-peptídase
Exemplo 1: O tripsinogénio ésegregado pelo pâncreas. Converte-se em tripsina (protéase digestiva) por acção da enteropeptídase (uma ectopeptídase presente no pólo apical dos enterócitos).
Exemplo 2: O pepsinogénio é segregado pelas células principais do estômago. Converte-se em pepsina (protéase digestiva) por acção hidrolítica do pH ácido do estômago e da próprio pepsina que já se formou.
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Muitas enzimas são reguladas por mecanismos de fosforilação/desfosforilação catalisadas por enzimas (cínases e fosfátases).
A cínase da desidrogénase do piruvatocatalisa a fosforilação da desidrogénase do piruvato que no estado fosforilado fica inactiva.
A fosfátase da desidrogénase do piruvatocatalisa a desfosforilação da desidrogénase do piruvato que no estado desfosforilado fica activa.
Forma fosforilada (inactiva)
Forma desfosforilada (activa)
A actividade da desidrogénase do piruvato depende da percentagem da enzima total que está na forma activa (desfosforilada).O valor desta percentagem depende das actividades relativas da (1) cínase da desidrogénase do piruvato e da (2) fosfátase da desidrogénase do piruvato.
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glicose
Frutose-6-P
Frutose-1,6-bisP
CO2 + H2O
ATP
ADPH2O
Pi
J=1
J=1
v = 9 v = 10
Frutose-6-P
Frutose-1,6-bisP
CO2 + H2O
ATP
ADPH2O
Pi
J=91
v = 9 v = 100AMP
J=91
glicose2.3- A existência de “ciclos de substrato” (antigamente chamados de “fúteis”) permite amplificar o efeito de um sinal.
O AMP activa a glicólise muscular porque estimula a cínase da frutose-6-P. Se este aumento for de 10 vezes, o facto de esta enzima fazer parte de um ciclo de substrato permite compreender que o aumento no fluxo possa ser de 91 vezes.
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2.3- Também há “ciclos de substrato” no fígado (principal órgão da gliconeogénese). Aqui, o sentido do fluxo pode inverter-se. Após uma refeição que contenha glicídeos, a concentração intracelular de frutose-2,6-bisfosfato éalta e fica estimulada a cínase 1 da frutose-6-P (e a glicólise).
Frutose-6-P
Frutose-1,6-bisP
Fosfoenol-piruvato
ATP
ADPH2O
Pi
J=10
v = 10 v = 20Frutose-2,6-
bisfosfato
J=10
Glicose-6-P
Frutose-6-P
Frutose-1,6-bisP
ATP
ADPH2O
Pi
J= - 10
v = 20 v = 10Frutose-2,6-bisfosfato
J= - 10
Glicose-6-P
No jejum, a concentração intracelular de frutose-2,6-bisfosfato é baixa e fica estimulada a frutose-1,6-bisfosfátase (e a gliconeogénese).
glicose
glicose
Fosfoenol-piruvato
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2.4.1- A acessibilidade aos substratos. Nas fibras musculares a entrada de glicose (e a sua subsequente metabolização) é limitada pelo número de transportadores (GLUT4) presentes na membrana sarcoplasmática.
Contracção muscular ou insulina
Quer o exercício físico quer a insulina estimulam a entrada de glicose para as fibras musculares porque nestas condições, de forma rápida, vesículas intracelulares contendo GLUT4 fundem-se com a membrana sarcoplasmática.
Nos adipócitos o mesmo efeito éinduzido pela insulina.
A insulina e o exercício físico estimulam a remoção da glicose do plasma para as células. 16
Brindle et al. (1989) Biochemistry 28: 4887-93
2.4.2- Nas enzimas marca-passo, geralmente, o efeito directo da variação da concentração do substrato é pequeno (que mais não seja porque, in vivo, as concentrações dos metabolitos são estacionárias). Mas, em alguns casos foi possível estudar in vivo a variação da actividade de enzimas com a concentração do substrato.
Num estudo de Brindle et al. (1989) estimulou-se electricamente o nervo ciático de ratos e mediu-se, na musculatura da perna, por NMR (1) a concentração de ADP e (2) a incorporação de Pi no ATP (síntase do ATP).
Alta actividade contráctil
Baixa actividade contráctil
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1- De instalação lenta: a quantidade de enzima como a resultante das velocidades da sua síntese e da sua degradação.
2.1- Controlo alostérico (AMP, Ca2+…)2.2- Modificação covalente (fosforilação e defosforilação, clivagem
hidrolítica…)2.3- Ciclos de substratos (“fúteis”)2.4- Acesso ao substrato por regulação do transporte transmembranar
(GLUT4, CPT…) e concentração de substrato
2- De instalação rápida:
3- De instalação rápida mas, geralmente, com papel menosimportante (pelo menos no metabolismo normal)
3.1- Inibição isostérica(competitiva) e inibição pelo produto
3.2- pH3.3- Temperatura
Estudamos até agora os mecanismos 1, 2.1, 2.2, 2.3 e 2.4. Falta referir os 3.1, 3.2 e 3.3.
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G’ 18 kJ; Keq/QR 1000
3.1- O produto como inibidor das enzimas marca-passo. Na reacção catalisada pela desidrogénase da glicose-6-P (via das pentoses-P) a reacção inversa não existe mas o NADPH compete com o NADP+ pelo local de ligação deste no centro activo (inibição isostérica e competitiva).
NADP+NADPH
6-fosfo-gliconolactona
+NADP+
NADPHNADPH
A desidrogénase da glicose-6-fosfato é activada sempre que a concentração intracelular de NADPH desce.
Para além de regulada ao nível da transcrição (a desidrogénase da glicose-6-P é induzida pela insulina) a descida da concentração intracelular de NADPH (um dos produtos) também estimula a actividade da enzima.
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3.2- Pensa-se que a variação do pH não tem, em geral, um papel importante na regulação das enzimas intracelulares mas…
a) No estômago o pH do suco gástrico éácido e as enzimas deste suco têm pH óptimo ácido.
b) O suco pancreático neutraliza o quimo gástrico…(H+ + HCO3
- CO2 + H2O)e as enzimas do suco pancreático e as enzimas digestivas intestinais têm pH óptimo neutro. 20
3.3- No homem, a alteração de actividade das enzimas das células em situações de abaixamento da temperaturacorporal ou de febre poderá ser importante …mas não desempenha um papel relevante na regulação do metabolismo normal.
As enzimas e transportadores humanos (ao contrário do que acontece com outros seres vivos) foram seleccionados de forma a manterem velocidades de fluxo adequadas à vida (nas vias anabólicas e catabólicas) numa estreita gama de temperaturas.
Francisco Lázaro(1888-1912)
Os órgãos para transplante são transportados a baixas temperaturas de forma a lentificar os processos catabólicos nomeadamente a hidrólise de proteínas (enzimas, transportadores, actina-miosina, etc)
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A1 - Doseamentos de enzimas plasmáticas(algumas enzimas só aparecem no plasma sanguíneo em determinadas patologias)
A3 – Uso de enzimas purificadas de bactérias ou fungos como instrumento no doseamento de substâncias (como a glicose sanguínea e múltiplas outras substâncias…)
Estudar as enzimas in vitro (no tubo de ensaio) para quê?
A) O estudo das enzimas é muito útil em análises clínicas
A2 - Doseamentos de enzimas celulares(a deficiência de uma enzima pode ser diagnosticada… )
B1-O estudo das enzimas é uma importante área da investigação bioquímica.
B2-As enzimas purificadas são instrumentosimprescindíveis em múltiplas outras áreas de investigação.
A) O estudo das enzimas é muito útil em investigação
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Acumulação de produto versus tempo
0
0.5
1
1.5
2
0 1 2 3
tempo (min)
Prod
uto
(mic
rom
oles
)
Quando se quer quantificar aactividade de uma enzimaadicionamos num tubo de ensaio a enzima ao(s) substrato(s) e vamos observando ao longo do tempo como evolui a reacção.
... mas actividade enzímica = velocidade da reacção enzímica
O normal é que (por motivos vários) a reacção se vá lentificando.
1/min
0,5/min0,1/min
Quando se atingir o equilíbrio químico ou se esgotar o substrato a velocidade será zero.
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Admitamos que fizemos dois ensaios idênticos mas com duas amostras diferentes da mesma enzima E:
amostra azulamostra vermelhaEm qual das amostras a enzima E tinha maior actividade?Como podemos exprimir quantitativamente a actividade da enzima E na amostra azul?
Se respondessemos: actividade = 3 moles/5 min = 0,6 moles/min... estariamos a falar da velocidade média nos 5 min de ensaio e a dizer que nas duas amostras a actividade era igual.
Acumulação de produto versus tempo
0
1
2
3
0 1 2 3 4 5
Tempo (min)
Prod
uto
(mic
rom
oles
)
Para a concentração de substrato em que o ensaio se iniciou a velocidade seráo declive da curva produto formado versus tempo no tempo zero (v0 ou v inicial)mas poderemos considerar que, pelo menos no caso do ensaio azul, uma boa estimativa de v0 pode ser a velocidade média no primeiro minuto de ensaio (1 mole/min).
Actividade azul (v0 ou vinicial) = 1 mole / min
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Em teoria a actividade de uma enzima (num sistema de ensaio especificado e adequado) define-se como o aumento de velocidade de conversão (S P) induzido pela enzima:
Actividade = vinicial = vel. na presença de enzima – vel. na sua ausência
A realização de “ensaios a branco” (sem enzima) permite prevenir a eventualidade de ocorrer reacção não enzímica. Ao subtrair o branco... também se subtrai o produto que eventualmente se tenha formado na ausência de enzima (ou que esteja presente como contaminante do substrato).
incubar substrato napresença de Fosf Alc.
durante um tempo t
NaOH
ler Absorvânciano ensaio enzímico
incubar substrato naausência de Fosf Alc.
durante um tempo t
NaOH
ler Absorvânciano “ensaio a branco”
pH=10
pH=10
pH=12; pH onde a FosfátaseAlcalina pára de funcionar
pH=12
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Como variará vinicial se duplicarmos (ou triplicarmos...) a concentração de enzima num ensaio enzímico?
A actividade enzímica (vinicial ou uma boa estimativa de vinicial) num meio especificado e adequado é proporcional à quantidade de enzima (… desde que a concentração molar de enzima seja muito inferior à do substrato).
total
catinicial E
SKmSkv
se fizermos ensaios nas mesmas condições (temperatura, pH, etc.) kcat e Km são constantes; se também usarmos a mesma concentração de substrato [S]este factor é constante
totalinicial Econstv .
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Acumulação de produto versus tempo
0
1
2
3
0 1 2 3 4 5
Tempo (min)
Prod
uto
(mic
rom
oles
)
Embora, pelo menos teoricamente, a quantidade de uma enzima possa ser medida em moles ou em gramas, é mais frequente medir a quantidade de enzima como uma velocidade de reacção; a velocidade da reacção catalisada pela enzima em análise (idealmente no tempo zero; vinicial).
UI (unidade internacional) = quantidade de enzima que catalisa a conversão de 1 mol de substrato em produto / min
Qual a quantidade de enzima E no ensaio vermelho?
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Admitindo que
1) a enzima E catalisa a reacção XY
2) o tubo de ensaio A continha 1 ml de solução
3) no tempo zero se adicionou 1 l de soro
4) ... e se foi medindo a quantidade X ao longo do tempo
Qual a actividade da enzima E
no soro em análise?1) No tubo A nos primeiros 10 min
a concentração de X passou de 100 para 90 mM = diminuiu 10 mM (ou 10000 M)
2) 10000 M * 0,001 L = 10 moles de X convertido em Y
3) 10 mol de X/ 10 min = 1 mol / min
4) 1 UI / l soro
Notar que no tubo B se adicionou um volume diferente do mesmo soro. Porque a velocidade de reacção observada em B era metade da observada em A quer dizer que em B havia metade do número de moles da enzima E. Ou seja, em B o volume de soro era 0,5 l.
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Quando se doseiam enzimas numa preparação que a contém (usando a actividade como medida da quantidade de enzima) pressupõe-se que a actividade (vinicial) é proporcional à quantidade de enzima.
Em química clínica doseiam-se com frequência enzimas no soro(por exemplo a amílase do soro em situações em que se suspeita de pancreatite aguda)exprimindo o resultado do ensaio enzimático em
velocidade de reacção / volume de soro sanguíneo
Porque as condições de ensaio (concentração e natureza dos substratos, pH, natureza do tampão, temperatura, etc.) podem não ser iguais em dois laboratórios distintos os valores normais de um laboratório podem não ser iguais aos de outro laboratório.
1 mol de glicose é 1 mol de glicose em qualquer sítio do mundomas 1 UI de amílase (ou outra enzima qualquer) em dois laboratórios distintos pode significar diferentes quantidades de enzima.
Pâncreas inflamado liberta amílase para o sangue
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A actividade enzímica aumenta se o número de moléculas de enzima aumentar (e vice-versa). O doseamento de uma enzima em tecidos pode servir para estudar o efeito de hormonas na síntese dessa enzima.
A insulina inibe a expressão de genes que codificam enzimas envolvidas na produção de glicose como, por exemplo, o gene da glicose-6-fosfátase.
Quando há muita insulinao número de moléculas de glicose-6-fosfátase diminui porque diminui a transcrição do seu gene.
Quando há pouca insulina
o número de moléculas de glicose-6-fosfátase aumenta pela razão oposta.
Voice et al. (1992) BST 20:272S
Glicose-6-fosfátase no fígado
Glicose-6-P
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1 mg de fígado2 mg de
fígado
2 mol/min = 2UI
2 UI2 mg de fígado
Actividade específica = 1 UI / mg de fígado
2 mol / 2min = 1UI
1 UI1 mg de fígado
Actividade específica =1 UI / mg de fígado
Porquê expressar actividade em UI / massa de tecido (ou UI / mg de proteína)? Permite comparar dois ensaios enzímicos em que se usam concentrações de enzima distintas...
Homogeneizado de fígado
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Quando se doseia uma enzima necessitamos de um meio de ensaio que contém obrigatoriamente o substrato (ou substratos) da enzima...mas em diferentes laboratórios podem usar-se diferentes temperaturas de ensaio.
20ºC 70ºC
Aumentar a temperatura aumenta a velocidade das reacções incluindo a velocidade de desnaturação das enzimas.
O exemplo da figura indica que se se pretendesse dosear a enzima em questão poderia ser mais cómodo escolher para temperatura de ensaio 30ºC...
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Para dosear uma enzima, para além da temperatura, também se escolhem outras condições de ensaio como, por exemplo, o pH do meio de ensaio.Quando doseamos uma enzima costuma escolher-se para pH de ensaio um valor próximo do pH óptimo dessa enzima. Se numa amostra de tecido existirem duas enzimas que catalisem a mesma reacção mas essas enzimas tiverem pHs óptimos distintos posso, escolhendo o pH de ensaio, estudar uma ou outra dessas enzimas.
pH 10 favorece isoenzima azul
pH 7 favorece isoenzima vermelha
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Para dosear uma enzima, para além da temperatura e do pH, também se escolhe a concentração do substrato. Eventualmente podemos fazer vários ensaios usando diferentes concentrações do substrato.
Considerar apenas um substrato é uma simplificação
(estritamente só as isomérases têm um substrato)
...mas podem fixar-se as concentrações dos outros substratos
e estudar-se como varia a actividade (vinicial)
... em função da variação da concentração de um deles.
vinicial
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A actividade de uma enzima aumenta com a concentração de substrato......mas para concentrações “altas” (saturantes) aumentar a concentração de substrato praticamente não afecta a actividade.
Para diferentes enzimas o “aspecto” do gráfico
actividade versus S ...
pode ser
hiperbólico ou sigmoide
... mas a característica saturabilidade estásempre presente.
A actividade é proporcional àquantidade de complexo ESno meio de ensaio (kcat é a constante de proporcionalidade)
vinicial = kcat
vinicial
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Num grande número de enzimas o gráfico vinicial versus [S] tem o “aspecto” de uma hipérbole que se ajusta à equação de Michaelis-Menten
SKmSVvinicial
max
As enzimas com “cinéticas de tipo hiperbólico” são aquelas em que o gráfico
vinicial versus [S]
pode ser ajustado a uma equação do tipo
... sendo que Vmax e Kmsão constantes(...se a única condição de ensaio que varia é [S])
vinicial
SKmSVvinicial
max
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kcat
A velocidade de formação do produto éproporcional àconcentração do complexo ES
vinicial (M/min) = kcat [ES]
Numa reacção enzímica existe um ciclo catalítico em que da ligação entre a enzima livre e o substrato resulta a formação do complexo ES; o complexo ES pode dissociar-se mas também vai formando produto e regenerando enzima livre.
Num ensaio enzímico enquanto a concentração de substrato não baixar de forma significativa a concentração do complexo ES vai-se mantendo numa concentração “estacionária”.
O valor da concentração “estacionária” de ESdepende (1) da concentração de enzima, (2) da concentração de substrato e (3) da afinidade entre a enzima e o seu substrato.
vinicial (mol/min) =
kcat [ES] x vol. meio de ensaio
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Actividade ou v0 ou vinicial= kcat [ES]
Se não hásubstrato [ES] = 0
Vinicial = 0
Se a concentração de substrato é elevada quase todas as moléculas de enzima estão ligadas ao substrato[ES] [Etotal]
Existe uma concentração de substrato (= Km) em que metade das moléculas de enzima estão ligadas ao substrato (enzima hemisaturada)[ES] = [E][ES] = [Etotal]/2
vinicial kcat [Etotal]vinicial Vmax
vinicial = kcat [Etotal]/2vinicial = Vmax/2
concentração de substrato = Km
concentração de substrato é saturante
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Se [S] = Kmvinicial = Vmax / 2...e a enzima estáhemisaturada
A actividade enzímica para concentração saturante de substrato = Vmax
... se a concentração de substrato é elevada variações moderadas na concentração do substrato não afectam a actividade para dosear enzimas éfrequente usarem-se concentrações elevadas de substrato porque o gráfico produto formado versustempo se mantém linear durante mais tempo.
Se [S] < Kmvinicial é quase proporcional a [S]...e menos de metade das moléculas de enzima estão ligadas ao substrato
vinicial
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SKmSVv
max
0
max0 Vv
SKmSVv
max
0
][S = Km ][S<<Km
SSSVv
max
0
S
SVv2max
0
2max
0Vv
SKmSVv
max
0
][S>>Km
SKm
Vv max0
S
SVv max0
... se Km<<[S] denominador [S]
... se Km=[S] denominador =2 [S]... se Km>>[S]
denominador Km
A partir da equação
...pode deduzir-se o valor de v0 para determinadas concentrações de substrato.
v0 não é afectado por [S] para
altas concentrações de S
v0 é directamente proporcional a [S] para
baixas concentrações de S40
O Km é uma medida da afinidade da enzima para o seu substrato...quando maior o valor do Km menor a afinidade (e vive-versa).
A enzima azul precisa de uma concentração de substrato menor para ficar hemisaturada......porque tem maior afinidade para o substrato que a enzima cinzenta.Em ambos os casos a enzima está hemisaturada mas…
Km (no caso da enzima azul) < Km (no caso da enzima cinzenta)
KmKm
Brincando: o Km mede o desamor entre a enzima e o seu substrato
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Vmax1=Vmax2
A enzima cinzenta estáhemisaturada ([ES]=[Et]/2)quando [S]= 10 mM (Km = 10 mM)
tem baixa afinidade para o substrato
(mM)
A enzima azul já estáhemisaturada ([ES]=[Et]/2)quando [S]= 3 mM (Km = 3 mM)
tem alta afinidade para o substrato
O Km mede a afinidade da enzima para o seu substrato
...quando maior o valor do Kmmenor a afinidade.
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As teorias
actualmente mais aceites para interpretar este tipo de comportamento cinético surgiram na década de 60
e visavam interpretar um fenómeno semelhante: a forma sigmoide do gráfico de saturação da hemoglobina.
Essas teorias
revelaram-se adequadas para interpretar as
“cinéticas de tipo sigmoide”
em enzimas com mais de um local de ligação ao substrato por molécula de enzima (enzimas poliméricas).
Quando se estuda o efeito da concentração de substrato na actividade de algumas enzimas e se representa vinicial versus [S] o gráfico pode ser não uma hipérbole mas um sigmóide.
hh
h
SSSVv
50
max0 ; h = coeficiente de Hill
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Concentrações de glicose possíveis
no hepatócito
Vel
ocid
ade
de re
acçã
o ou
tra
nspo
rte tr
ansm
embr
anar
Quando o gráfico velocidade de reacção (ou velocidade de transporte transmembranar) versusconcentração de reagente (ou substância transportada) é uma recta…indica-nos que o processo reactivo (ou de transporte) é não enzímico (ou não mediado).
A comparação entre o valor do Km (ou S50) e a concentração estacionária (in vivo) do substrato numa enzima (ou num transportador) diz-nos se a enzima (ou o transportador) é ou não sensível a variações fisiológicas na concentração de substrato.
Processos reactivos (ou de transporte) catalisados por enzimas
(ou transportadores); saturabilidade presente
Processo não catalisado;
saturabilidade ausente
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A actividade das enzimas pode ser diminuída ou aumentada pela adição ao sistema de ensaio de modificadores da actividade enzímica (inibidores e activadores).Adicionando a um meio de ensaio uma substância M (inibidor ou activador)e mantendo constantes todas as outras condições de ensaio podemos obter diminuição (inibição) ou aumento (activação) da actividade enzímica.
0
20
40
60
80
100
120
140
Act
ivid
ade
enzí
mic
a
+ini
bido
r +act
ivad
or} vo
vo{
Grau de inibição ou grau de activação =Mdeausêncianav
v
inicial
inicial
vinicial na ausência de inibidor = 100 UI
vinicial = 30 UI
Grau de inibição = 30%
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Um estudo mais aprofundado do efeito de um inibidor na actividade duma enzima pode revelar que ele aumenta o Km do substrato sem modificar Vmax.Quando se estuda a actividade enzímica para vários valores de Spodemos, multiplicando o número de tubos de ensaios,fazer esse estudo:na ausência e na presença de um inibidor I.
Algumas vezes observa-se que:1- Na presença do inibidor o valor de Vmaxnão se modifica; para concentrações de substrato elevadas o inibidor I não tem efeito.
2-O valor do Km observado é maior na presença de I que na sua ausência; o grau de inibição é mais marcado para concentrações de substrato baixas.
Nestes casos falamos de inibição competitiva
vinicial
Para [S] = 4 grau inibição =50%
Para [S] = saturantegrau inibição = 0%
Para [S] = 40 grau inibição = 14 %
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Para explicar o comportamento deste sistema (I aumento do Km mas I não afecta Vmax) poderemos admitir que o inibidor I e o substrato S se ligam no centro activo da enzima competindo entre si. As possibilidades do modelo
apresentadocorresponderem à realidade são reforçadas seas estruturas moleculares do substrato e do inibidor forem semelhantes.
H2O
A fosfátase alcalina catalisa a hidrólise do para-nitrofenilfosfato: para-nitrofenilfosfato + H2O
para-nitrofenol + Pi
O vanadato é um inibidor competitivo da fosfátase alcalina.
Nestes casos há inibição isostérica competitiva
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Quando um inibidor isostérico competitivo está presente, para obter hemisaturação da enzima com substrato, preciso de ter maior concentração do substrato; a presença do inibidor aumenta o Km.
Na ausência de inibidor esta concentração de substrato permitia hemisaturação. O Km era 9.
Na presença do inibidor competitivo preciso de aumentar a concentração de substrato para 32 para obter hemisaturação com o substrato.Na presença do inibidor o Km(que era 9) aumentou para 32.
Mas na presença do inibidor para esta concentração de substrato só 1/6 das moléculas de enzima estão ligadas ao substrato. 48
sem vanadato
vanadato 2,5 M
Vmax
Km(sem vanadato)=1,1 mM
Km(com vanadato)=7,6 mM
Vmax/2
Quando adicionado a meios de ensaio que contenham para-nitrofenilfosfato e fosfátase alcalina, o vanadato (HVO4
2-), inibe a actividade da enzima quando a concentração de para-nitrofenilfosfato não é saturante = a inibição é de tipo competitivo.Seargeant & Stinson (1979) Biochem J. 181: 247.
O vanadato é um inibidor competitivo da fosfátase alcalina = eleva o Km do para-nitrofenilfosfato mas não tem efeito no Vmax. Se a concentração de substrato for suficientemente alta compete eficazmente como o inibidor.
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Quando se estuda de efeito de um inibidor para diferentes concentrações de substrato podemos, eventualmente, observar que a inibição não é de tipo competitivo.Algumas vezes observa-se que:
1- O Vmax é menor na presença de Ique na sua ausência.
2- Na presença de I o Km não se modifica; a concentração de substrato para a qual se observa um valor de actividade que é metade de Vmax (ou de Vmax’) é igual na presença e na ausência de I.
Nestes casos diz-se que a inibição énão competitiva.
vinicial
No exemplo o grau de inibição = 40% para todas as concentrações de substrato
3-O grau de inibiçãoé independente da concentração de substrato.
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Um modelo possível para explicar a inibição de tipo não competitivo é admitir a existência na enzima de um local de ligação diferente do centro activo (um sítio alostérico) cuja ligação ao inibidor impedisse a formação do produto.
De acordo com este modelo tudo se passaria como seas moléculas de enzima ligadas ao inibidor estivessem excluídas do processo catalítico, isto é,como se houvesse menos moléculas de enzima no meio de ensaio.
kcat1
Kcat2 = 0
km1
km2
Km1= Km2
De acordo com o modelo (garantindo Km invariante) a afinidade entre a enzima e o substrato é igual nos casos da forma ligada e desligada do inibidor.
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Um ligando diferente do substrato que se liga ao centro activo é um inibidor isostérico (se se liga no centro activo só pode inibir).
... mas se a ligação do inibidor ao sítio activo for irreversível(não podendo ser “deslocado” por altas concentrações de substrato) as moléculas de enzima ligadas ao inibidor ficam excluídas do processo catalítico.
Se a ligação entre um inibidor isostérico e o centro activofor reversível (se poder se “deslocado” pelo substrato) esse inibidor comporta-se funcionalmente como inibidor competitivo
Neste caso o inibidor comporta-se funcionalmente como não competitivo e é, frequentemente, usado o termo “inactivador”. 52
A lípase pancreática catalisa a hidrólise de triacilgliceróis no intestino.
No tratamento da obesidade pode usar-se um fármaco (orlistat; xenical) que é um inactivador (= inibidor irreversível) da lípase pancreática.
O orlistat reage com uma serina (formando uma ligação covalente e irreversível) situada no centro activo da enzima bloqueando a sua actividade.
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O doseamento da actividade da desidrogénase do piruvato pode ser feito em homogeneizados.Se o homogeneizado é preparado na presença de inibidores quer da cínase (dicloroacetato) quer da fosfátase (fluoreto) ...quando se faz o ensaio mede-se a actividade actual.
P
ATP
ADP
H2O
Pi
Dicloroa
cetat
o
fluore
to
Na ausência de inibidor (fluoreto),a fosfátase do tecido transforma toda a desidrogénase do piruvato na sua forma activa.
Se o homogeneizado é preparado na presença do inibidor da cínase (dicloroacetato) mas na ausência de fluoreto...quando se faz o ensaio mede-se a actividade total.
No estudo in vitro de enzimas reguladas por fosforilação/desfosforilação podem usar-se inibidores das cínases e das fosfátases envolvidas.
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Bibliografia utilizada: