da via metabólica cinética e regulação coenzima...
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Cinética e regulação enzímicas
(a velocidade das reações enzímicas in vivo e in vitro)
Departamento de Bioquímica da Faculdade de Medicina do Porto
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Os conceitos de “substrato da via metabólica” e coenzima só têm sentido se analisamos uma via metabólica no seu contexto celular.
Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo prostético e cofator.
O NADH e o NAD+ (assim como o NADPH e o NADP+ e a coenzima A) costumam designar-se como coenzimas: olhadas no contexto da célula (células isoladas ou organismos) não seconsomem no metabolismo mantendo (tal como as enzimas) uma concentração estacionária.
Os outros reagentes intervenientes (NAD+, por exemplo) são também substratos das enzimas...
mas na células o somatório das concentrações de NADH + NAD+ é de alguns μM e a viaglicolítica só pode ter lugar se o NADH for reoxidado a NAD+.
Na glicólise o “substrato da via metabólica” é a glicose que se consome gerando piruvato ou lactato...
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Os conceitos de apoenzima, grupo prostético e holoenzima podem ser definidos fora do contexto de uma via metabólica.O grupo prostético é um resíduo não aminoacídico ligado de forma estável (frequentemente covalente) à apoenzima.
Exemplos: (1) O FAD nas desidrogénases dependentes do FAD(2) A biotina em determinadas carboxílases
(como a carboxílase do piruvato)
Cofator é uma substância (orgânica ou não) que
não se encontra ligada de forma covalente à enzima,
é essencial ao processo catalítico mas
...não é reagente nem produto da reação.
Exemplo: as reações em que intervém o ATP exigem a presença de Mg2+ (que podemos designar de cofator)No entanto, muitos autores usam a palavra cofator para designar compostos que definimos como grupo prostético ou como coenzima.
O conceito de cofator é o menos preciso.
ATP + X ADP + X-PMg2+
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As concentrações dos intermediários do metabolismo variam de indivíduo para indivíduo e com o estado metabólico mas mantêm-se em torno de determinados valores. As concentrações dos intermediários do metabolismo dizem-se estacionárias. Mas a concentração da frutose-1-P não é estacionária.Exemplo: A concentração de ATP (e a maioria dos outros compostos existentes nos seres vivos) considerando as várias reações em que intervém como reagente ou produto não está em equilíbrio químico.
...mas a velocidade do conjunto de reações que formam ATP é (quase) sempre igual à velocidade do conjunto de reações em que este se gasta... existe nas células uma concentração estacionária de ATP.
Os mecanismos que permitem manter o ATP, os intermediários do metabolismo, a glicose do plasma, etc. em concentrações estacionárias são muito complexos e denominam-se de mecanismos homeostáticos.
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A regulação do metabolismo de modo a adaptar-se a diferentes condições (atividade ou descanso, jejum ou estado absortivo, diferentes tipos de dieta, diferentes graus de atividade física ao longo da vida, etc.) é uma condição de sobrevivência.
ATP
contração muscular
nutrientes
O2 ADP+Pi
ureia
CO2 + H2O
transporteativo
trabalhomecânico
Na+
Ca+
Estado absortivo= Glicemia↑
Estado de jejum = Glicemia↓
A adaptação a diferentes condições só é possível porque a atividade das enzimas se modifica quando se alteram essas condições.
glicose
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As enzimas são sensores do ambiente onde se encontram variando a sua atividade em função de variações nesse ambiente.
As enzimas que catalisam reações fisiologicamente reversíveis catalisam a conversão líquida no sentido direto ou inverso de acordo com a lei da ação das massas, mas não são determinantes no sentido nem na velocidade de fluxo (J) da via metabólica.
As enzimas “marca passo” de uma via metabólica catalisam reações fisiologicamente irreversíveis e a sua atividade determina a velocidade de fluxo nessa via metabólica. Estas enzimas (1) têm baixa atividade, (2) tem um papel determinante na regulação do metabolismo e (3) são controladas por efetores que só às vezes coincidem com os substratos e produtos.
A B1000
1010
S P0,01
10,01
Glicólise
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Aumentar a atividade de uma enzima que catalisa uma reação “de desequilíbrio” (M2 →M3) pode significar um aumento transitório na concentração do intermediário M3 mas, a enzima a jusante que catalisa a conversão reversível M3 ↔ M4 rapidamente repõe a concentração de M3 num valor próximo do original.
J1 = (10) = (1010 – 1000) = 10
J2= (20) = (1020 – 1000) = 20
É na barragem que se controla o caudal (fluxo) de um rio. Mudanças no valor do fluxo (J) na barragem provocam mudanças de fluxo idênticas a montante e a jusante da barragem.
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1- De instalação lenta (horas ou dias): a quantidade de enzima como a resultante das velocidades da sua síntese e da sua degradação.
Diferentes tipos de mecanismos podem participar na regulação das enzimas marca-passo das vias metabólicas:
2.1- Modificação alostérica (AMP, Ca2+…)
2.2- Modificação covalente (fosforilação e desfosforilação, clivagem hidrolítica…)
2.3- Ciclos de substratos (“fúteis”)
2.4- Acesso ao substrato por regulação do transporte transmembranar (GLUT4, CPT1…) e concentração de substratos
2- De instalação rápida
(segundos ou milissegundos):
3- De instalação rápida mas, geralmente, com papel menosimportante (pelo menos no metabolismo normal)
3.1- Inibição isostérica (competitiva) einibição pelo produto
3.2- pH 3.3- Temperatura
ATPADP
MM-PH2O
Pi
M M
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1- Mesmo quando o que varia é apenas a concentração da enzima E sem que tenha variado a atividade de cada uma das suas moléculas, se a velocidade da reação que a enzima E catalisa aumentou (/diminuiu), dizemos que a atividade enzímica da enzima E aumentou (/diminuiu). É um mecanismo de instalação lenta.
H2OSíntese proteica
v1
v2
Se a velocidade de síntese de uma determinada enzima (v1) é maior que a velocidade com que se degrada (hidrolisa) na célula (v2) a concentração e a atividade dessa enzima aumenta. Na condição inversa a concentração e a atividade diminuem.
v1 > v2 v2 > v1
RNAm
RNAm
10centro ativo
AMP
sítio alostérico
Fosforílase muscular na conformação tensa (inativa)
Fosforílase muscular na
AMP
2.1- Quando uma fibra muscular se contrai aumenta a velocidade de hidrólise do ATP e aumenta a concentração de ADP (e AMP; 2 ADP → AMP + ATP). O AMP liga-se à fosforílase muscular induzindo uma conformação mais ativa ⇔ o AMP é um activador alostérico da fosforílase muscular.
conformação relaxada (ativa)
Glicose-1-P
CO2 + H2O
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Na cínase-1 da frutose-6-P (ATP+ Frutose-6-P→ ADP + Frutose-1,6-bisfosfato) o ATP é, simultaneamente, substrato e inibidor alostérico. Para concentrações fisiológicas de ATP, o AMP (e o ADP) é um activador alostérico.
(2) Contudo, existe na enzima um sítio alostérico onde o ATP se liga inibindo-a.Para concentrações fisiológicas de ATP essa ação inibidora é muito marcada.(1) Um dos substratos da cínase da frutose-6-P é o ATP.
(3) O AMP (e o ADP) compete com o ATP pelo mesmo sítio alostérico impedindo a sua ação inibidora.
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A complexidade dos processos de regulação de enzimas induzida por hormonas e neurotransmissores tem levado a que a palavra “alostérico” não se use neste contexto mesmo quando o termo seria adequado.
O recetor da insulina pode ser visto como uma enzima alostérica com o seu centro alostérico activador virado para o lado extracelular (onde se liga a insulina) e o centro ativo no lado citoplasmático.
A ligação da insulina induz uma alteração conformacional no recetor que se torna capaz de catalisar a fosforilação de resíduos tirosina de proteínas designadas de Substratos do Recetor da Insulina (IRS).
Efeitos da insulina
Insulina ligada ao seu recetor
Expressões equivalentes são: “domínio regulador”, “local de ligação da hormona/neurotransmissor ao recetor que tem atividade enzimática”.
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A ligação entre os modificadores (ativadores ou inibidores) alostéricos e os sítios alostéricos das enzimas é reversível e é de tipo não covalente.
… e o mesmo acontece nas ligações dos substratos e dos inibidores isostéricos competitivos ao sítio ativo das enzimas.
Activador alostérico
Inibidor alostérico
Inibidor isostérico competitivo14
2.2- A modificação da atividade de uma enzima pode envolver a sua modificação covalente (hidrólise irreversível ou fosforilação reversível) por ação catalítica de enzimas (normalmente outras enzimas).
Certas enzimas são ativadas por hidrólise irreversível.São exemplos a ativação dos zimogénios na digestão dos nutrientes.
Tripsinogénio
Tripsina (ativa)
polipeptídeo inativo+
H2O Enteropeptídase
Exemplo 1: O tripsinogénio é segregado pelo pâncreas. Converte-se em tripsina (protéase digestiva) por ação da enteropeptídase (uma ectopeptídase presente no polo apical dos enterócitos).
Exemplo 2: O pepsinogénio é segregado pelas células principais do estômago. Converte-se em pepsina (protéase digestiva) por ação hidrolítica do pH ácido do estômago e da própria pepsina que já se formou.
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Muitas enzimas são reguladas por mecanismos de fosforilação/desfosforilação catalisadas por enzimas (cínases e fosfátases).
A cínase da desidrogénase do piruvatocatalisa a fosforilação da desidrogénase do piruvato que no estado fosforilado fica inativa.
A fosfátase da desidrogénase do piruvatocatalisa a desfosforilação da desidrogénase do piruvato que no estado desfosforilado fica ativa.
Forma fosforilada (inativa)
Forma desfosforilada (ativa)
A atividade da desidrogénase do piruvato depende da percentagem da enzima total que está na forma ativa (desfosforilada).O valor desta percentagem depende das atividades relativas da (1) cínase da desidrogénase do piruvato e da (2) fosfátase da desidrogénase do piruvato.
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2.2, 2.1 e 1- A controlo da atividade das enzimas pode envolver mais de um mecanismo sendo o conjunto dos mecanismos de análise complexa.
Ca2+
O Ca2+ entra nas fibras musculares quando estas são estimulas pelo nervo motor e um dos efeitos é a estimulação alostérica da fosfátase da desidrogénase do piruvato…
A insulina aumenta no sangue quando a glicemia aumenta e um dos seus efeitos é reprimir o gene codificador da cínase da desidrogénase do piruvato…
O Ca2+ e a insulina estimulam a oxidação do piruvato.
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2.1 e 2.2- A fosforílase do glicogénio (quer hepática quer muscular) também é regulada por mecanismos de fosforilação (activadores) e desfosforilação (inibidores) induzidos pela ação de hormonas.
A glicagina (no caso do fígado) e as catecolaminas (nos casos do músculo e fígado)
podem desencadear uma cadeia de reações que levam à fosforilação e consequente ativação da fosforílase do glicogénio e, consequentemente, da fosforólise do glicogénio (formação de glicose-1-P).
PKA= cínase de proteínas dependente do AMP cíclico
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glicose
Frutose-6-P
Frutose-1,6-bisP
CO2 + H2O
ATP
ADPH2O
Pi
v = 9 v = 10
Frutose-6-P
Frutose-1,6-bisP
CO2 + H2O
ATP
ADPH2O
Pi
v = 9 v = 100AMP
J=91;J=100-9
glicose2.3- A existência de “ciclos de substrato” (antigamente chamados de “fúteis”) permite amplificar o efeito de um sinal.
O AMP ativa a glicólise muscular porque estimula a cínase da frutose-6-P. Se este aumento for de 10 vezes, o facto de esta enzima fazer parte de um ciclo de substrato permite compreender que o aumento no fluxo (J) possa ser de 91 vezes.
J=1; J=10-9
J=1; J=10-9
J=91;J=100-9
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2.3- Também há “ciclos de substrato” no fígado (principal órgão da gliconeogénese). Aqui, o sentido do fluxo pode inverter-se. Após uma refeição que contenha glicídeos, a concentração intracelular de frutose-2,6-bisfosfato é alta e fica estimulada a cínase 1 da frutose-6-P (e a glicólise).
Frutose-6-P
Frutose-1,6-bisP
Fosfoenolpiruvato
ATP
ADPH2O
Pi
J=10
v = 10 v = 20Frutose-2,6-
bisfosfato ↑
J=10
Glicose-6-P
Frutose-6-P
Frutose-1,6-bisP
ATP
ADPH2O
Pi
J= - 10
v = 20 v = 10Frutose-2,6-bisfosfato
↓
J= - 10
Glicose-6-P
No jejum, a concentração intracelular de frutose-2,6-bisfosfato é baixa e fica estimulada a frutose-1,6-bisfosfátase (e a gliconeogénese).
glicose
glicose
Fosfoenolpiruvato20
2.4.1- A acessibilidade aos substratos. Nas fibras musculares a entrada de glicose (e a sua subsequente metabolização) é limitada pelo número de transportadores (GLUT4) presentes na membrana sarcoplasmática.
Contração muscular ou insulina
Quer o exercício físico quer a insulina estimulam a entrada de glicose para as fibras musculares porque nestas condições, de forma rápida, vesículas intracelulares contendo GLUT4 fundem-se com a membrana sarcoplasmática.
Nos adipócitos o mesmo efeito é induzido pela insulina.
A insulina e o exercício físico estimulam a remoção da glicose do plasma para as células.
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2.1, 2.2 e 2.4- A entrada de acil-CoA (ácidos gordos “ativados”) para a mitocôndria (local onde ocorre a sua oxidação) depende da atividade da carnitina-acil transférase I que é inibida (inibição alostérica) pelo malonil-CoA. Quando a concentração citoplasmática de malonil-CoA desce a entrada de acil-CoA para a mitocôndria acelera. É dentro da mitocôndria que se dá a oxidação dos ácidos gordos (oxidação em beta).
Os fatores que estimulam a AMPK levam à fosforilação da carboxílase da acetil-CoA.
A fosforilação inativa a carboxílase de acetil-CoA
o que baixa a concentração de malonil-CoA.
A descida do malonil-CoA “desinibe” a carnitina-palmitil transférase I... acelerando-se a entrada de acil-CoA para a mitocôndria.
oxidação em βoxidação em β22
Brindle et al. (1989) Biochemistry 28: 4887-93
2.4.2- Nas enzimas marca-passo, geralmente, o efeito direto da variação da concentração do substrato é pequeno (que mais não seja porque, in vivo, as concentrações dos metabolitos são estacionárias). Mas, em alguns casos foi possível estudar in vivo a variação da atividade de enzimas com a concentração do substrato.
Num estudo de Brindle et al. (1989) estimulou-se eletricamente o nervo ciático de ratos e mediu-se, na musculatura da perna, por NMR (1) a concentração de ADP e (2) a incorporação de Pi no ATP (síntase do ATP).
Alta atividade contráctil
Baixa atividade contráctil
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Quando a concentração de glicose aumenta no sangue após as refeições entra para os hepatócitos provocando a dissociação do complexo glicocínase – proteína nuclear inibidora da glicocínase.
Concentrações de glicose possíveis
na veia porta
A entrada (GLUT2) e a fosforilação da glicose no fígado (cínase da glicose/hexocínase IV) é regulada diretamente pela concentração de glicose na veia porta e nos hepatócitos.
Ativ
idad
e do
GLU
T2 Concentrações de glicose possíveis
no hepatócito
Quer o GLUT 2 quer a hexocínase IV são sensíveis às variações fisiológicas da concentração de glicose
Ativ
idad
e da
Hex
ocín
ase
IV
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Dihidroxiacetona-P
Frutose-1-P
Gliceraldeído
ATP
ATP
ADP
ADP
Gliceraldeído-3-P
UDP-Glicose
ATP
ADP
Cínase da galactose
Glicose-1-P
Cínase da frutose
Frutose
Embora, na maioria dos casos, as concentrações dos intermediários do metabolismo varie entre limites estreitos, nem sempre é assim. Com exceção das vesículas seminais, a frutose só existe se for ingerida e, no caso da galactose, a sua concentração é próxima de zero se não houver ingestão.
as atividades da cínase da frutose e, em grande medida, a da cínase da galactose dependem da ingestão destes açúcares (ou dos seus precursores).
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1- De instalação lenta: a quantidade de enzima como a resultante das velocidades da sua síntese e da sua degradação.
2.1- Controlo alostérico (AMP, Ca2+…)2.2- Modificação covalente (fosforilação e desfosforilação, clivagem
hidrolítica…)2.3- Ciclos de substratos (“fúteis”)2.4- Acesso ao substrato por regulação do transporte transmembranar
(GLUT4, CPT1…) e concentração de substrato
2- De instalação rápida:
3- De instalação rápida mas, geralmente, com papel menosimportante (pelo menos no metabolismo normal)
3.1- Inibição isostérica (competitiva) e inibição pelo produto
3.2- pH3.3- Temperatura
Estudamos até agora os mecanismos 1, 2.1, 2.2, 2.3 e 2.4. Falta referir os 3.1, 3.2 e 3.3.
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ΔG’ ≈ 18 kJ; Keq/QR ≈ 1000
3.1- O produto como inibidor das enzimas marca-passo. Na reação catalisada pela desidrogénase da glicose-6-P (via das pentoses-P) a reação inversa não existe mas o NADPH compete com o NADP+ pelo local de ligação deste no centro ativo (inibição isostérica e competitiva).
NADP+NADPH
6-fosfo-gliconolactona
+NADP+
NADPHNADPH
A desidrogénase da glicose-6-fosfato é ativada sempre que a concentração intracelular de NADPH desce.
Para além de regulada ao nível da transcrição (a desidrogénase da glicose-6-P é induzida pela insulina) a descida da concentração intracelular de NADPH (um dos produtos) também estimula a atividade da enzima.
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fosfodiestérase
H2O
Subunidades reguladoras
Subunidades catalíticas
Domínio semelhante aos substratos
Sítio ativo
ATP
PPi
AMP
AMPc
AMPc
A PKA (cínase de proteínas dependente do
AMPc) dissociada das unidades reguladoras é ativa e catalisa a fosforilação de enzimas…
PKA inativa (ligada e subunidades reguladoras)
A PKA é uma enzima que na forma inativa tem o seu sítio ativo bloqueado pela ligação a subunidades reguladoras que contêm um domínio “pseudosubstrato” (inibição isostérica e competitiva). A ligação do AMP cíclico às subunidades reguladoras induz a dissociação das subunidades catalíticas que são ativas.
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3.2- Pensa-se que a variação do pH não tem, em geral, um papel importante na regulação das enzimas intracelulares mas…
a) No estômago o pH do suco gástrico é ácido e as enzimas deste suco têm pH ótimo ácido.
b) O suco pancreático neutraliza o quimo ácido que vem do estômago(H+ + HCO3
- → CO2 + H2O)e as enzimas do suco pancreático e as enzimas digestivas intestinais têm pH ótimo neutro.
Acidificação das fibras musculares durante glicólise anaeróbia
c) Pensa-se que a diminuição da oxidação dos ácidos gordos durante a glicólise anaeróbia nas fibras musculares esqueléticas se deve à diminuição de atividade da carnitina-palmitil-transférase I… cuja atividade diminui quando o pH desce.
pH baixo
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3.3- No homem, a alteração de atividade das enzimas das células em situações de abaixamento da temperaturacorporal ou de febre poderá ser importante …mas não desempenha um papel relevante na regulação do metabolismo normal.
As enzimas e transportadores humanos (ao contrário do que acontece com outros seres vivos) foram selecionados de forma a manterem velocidades de fluxo adequadas à vida (nas vias anabólicas e catabólicas) numa estreita gama de temperaturas.
Francisco Lázaro(1888-1912)
Os órgãos para transplante são transportados a baixas temperaturas de forma a lentificar os processos catabólicos nomeadamente a hidrólise de proteínas (enzimas, transportadores, actina-miosina, etc.)
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A1 - Doseamentos de enzimas plasmáticas(algumas enzimas só aparecem no plasma sanguíneo em determinadas patologias)
A3 – Uso de enzimas purificadas de bactérias ou fungos como instrumento no doseamento de substâncias (como a glicose sanguínea e múltiplas outras substâncias…)
Estudar as enzimas in vitro (no tubo de ensaio) para quê?
A) O estudo das enzimas é muito útil em análises clínicas
A2 - Doseamentos de enzimas celulares(a deficiência de uma enzima pode ser diagnosticada… )
B1-O estudo das enzimas é uma importante área da investigação bioquímica.
B2-As enzimas purificadas são instrumentosimprescindíveis em múltiplas outras áreas de investigação.
A) O enzimas na investigação
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0
0,5
1
1,5
2
0 1 2 3Prod
uto
(mic
rom
oles
)
tempo (min)
Acumulação de produto versus tempo
Quando se quer quantificar aatividade de uma enzimaadicionamos num tubo de ensaio a enzima ao(s) substrato(s) e vamos observando ao longo do tempo como evolui a reação.
... mas atividade enzímica = velocidade da reação enzímica
O normal é que (por motivos vários) a reação se vá lentificando.
1/min
0,5/min0,1/min
Quando se atingir o equilíbrio químico ou se esgotar o substrato a velocidade será zero.
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Admitamos que fizemos dois ensaios idênticos mas com duas amostras diferentes da mesma enzima E:
amostra azulamostra vermelhaEm qual das amostras a enzima E tinha maior atividade?Como podemos exprimir quantitativamente a atividade da enzima E na amostra azul?
Se respondêssemos: atividade = 3 μmoles/5 min = 0,6 μmoles/min... estaríamos a falar da velocidade média nos 5 min de ensaio e a dizer que nas duas amostras a atividade era igual.
0
1
2
3
0 1 2 3 4 5Pr
odut
o (m
icro
mol
es)
Tempo (min)
Acumulação de produto versus tempo
Para a concentração de substrato em que o ensaio se iniciou a velocidade será o declive da curva produto formado versus tempo no tempo zero (v0 ou v inicial)mas poderemos considerar que, pelo menos no caso do ensaio azul, uma boa estimativa de v0 pode ser a velocidade média no primeiro minuto de ensaio (1 μmole/min).
Atividade azul (v0 ou vinicial) = 1 μmole / min
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Em teoria a atividade de uma enzima (num sistema de ensaio especificado e adequado) define-se como o aumento de velocidade de conversão (S → P) induzido pela enzima:
Atividade = vinicial = vel. na presença de enzima – vel. na sua ausência
A realização de “ensaios a branco” (sem enzima) permite prevenir a eventualidade de ocorrer reação não enzímica. Ao subtrair o branco... também se subtrai o produto que eventualmente se tenha formado na ausência de enzima (ou que esteja presente como contaminante do substrato).
incubar substrato napresença de Fosf Alc.
durante um tempo t
NaOH
ler Absorvânciano ensaio enzímico
incubar substrato naausência de Fosf Alc.
durante um tempo t
NaOH
ler Absorvância no “ensaio a branco”
pH=10
pH=10
pH=12; pH onde a Fosfátase Alcalina para de funcionar
pH=12
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Como variará vinicial se duplicarmos (ou triplicarmos...) a quantidade de enzima num ensaio enzímico?
A atividade enzímica (vinicial ou uma boa estimativa de vinicial) num meio especificado e adequado é proporcional à quantidade de enzima (… desde que a concentração molar de enzima seja muito inferior à do substrato).
[ ][ ] total
catinicial E
SKmSkv
+=
se fizermos ensaios nas mesmas condições (temperatura, pH, etc.) kcat e Km são constantes; se também usarmos a mesma concentração de substrato [S]este fator é constante
totalinicial Econstv .=
35
0
1
2
3
0 1 2 3 4 5
Prod
uto
(mic
rom
oles
)
Tempo (min)
Acumulação de produto versus tempo
Embora, pelo menos teoricamente, a quantidade de uma enzima possa ser medida em moles ou em gramas, é mais frequente medir a quantidade de enzima como uma velocidade de reação; a velocidade da reação catalisada pela enzima em análise (idealmente no tempo zero; vinicial).
UI (unidade internacional) = quantidade de enzima que catalisa a conversão de 1 μmol de substrato em produto / min
Qual a quantidade de enzima E no ensaio vermelho?
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Admitindo que
1) a enzima E catalisa a reação X→Y
2) o tubo de ensaio A continha 1 ml de solução
3) no tempo zero se adicionou 1 μl de soro
4) ... e se foi medindo a quantidade X ao longo do tempo
Qual a atividade da enzima E
no soro em análise?1) No tubo A nos primeiros 10 min
a concentração de X passou de 100 para 90 mM = diminuiu 10 mM (ou 10000 μM)
2) 10000 μM * 0,001 L = 10 μmoles de X convertido em Y
3) 10 μmol de X/ 10 min = 1 μmol / min
4) 1 UI / μl soro
Notar que no tubo B se adicionou um volume diferente do mesmo soro. Porque a velocidade de reação observada em B era metade da observada em A quer dizer que em B havia metade do número de moles da enzima E. Ou seja, em B o volume de soro era 0,5 μl.
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Quando se doseiam enzimas numa preparação que a contém (usando a atividade como medida da quantidade de enzima) pressupõe-se que a atividade (vinicial) é proporcional à quantidade de enzima.
Em química clínica doseiam-se com frequência enzimas no soro(por exemplo a amílase do soro em situações em que se suspeita de pancreatite aguda)exprimindo o resultado do ensaio enzimático em
velocidade de reação / volume de soro sanguíneo
Porque as condições de ensaio (concentração e natureza dos substratos, pH, natureza do tampão, temperatura, etc.) podem não ser iguais em dois laboratórios distintos os valores normais de um laboratório podem não ser iguais aos de outro laboratório.
1 mol de glicose é 1 mol de glicose em qualquer sítio do mundomas 1 UI de amílase (ou outra enzima qualquer) em dois laboratórios distintos pode significar diferentes quantidades de enzima.
Pâncreas inflamado liberta amílase para o sangue
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A atividade enzímica aumenta se o número de moléculas de enzima aumentar(e vice-versa). O doseamento de uma enzima em tecidos pode servir paraestudar o efeito de hormonas na síntese dessa enzima.
A insulina inibe a expressão de genes que codificam enzimas envolvidas na produção de glicose como, por exemplo, o gene da glicose-6-fosfátase.
Quando há muita insulinao número de moléculas de glicose-6-fosfátase diminui porque diminui a transcrição do seu gene.
Quando há pouca insulina
o número de moléculas de glicose-6-fosfátase aumenta pela razão oposta.
Voice et al. (1992) BST 20:272S
Glicose-6-fosfátase no fígado
Glicose-6-P
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1 mg de fígado2 mg de
fígado
2 μmol/min = 2UI
2 UI2 mg de fígado
Atividade = 1 UI / mg de fígado
2 μmol / 2min = 1UI
1 UI1 mg de fígado
Atividade =1 UI / mg de fígado
Porquê expressar atividade em UI / massa de tecido (ou UI / mg de proteína)? Permite comparar dois ensaios enzímicos em que se usam quantidades de enzima distintas...
Homogeneizado de fígado
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Quando se doseia uma enzima necessitamos de um meio de ensaio que contém obrigatoriamente o substrato (ou substratos) da enzima...mas em diferentes laboratórios podem usar-se diferentes temperaturas de ensaio.
20ºC 70ºC
Aumentar a temperatura aumenta a velocidade das reações incluindo a velocidade de desnaturação das enzimas.
O exemplo da figura indica que se se pretendesse dosear a enzima em questão poderia ser mais cómodo escolher para temperatura de ensaio 30ºC...
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Para dosear uma enzima, para além da temperatura, também se escolhem outras condições de ensaio como, por exemplo, o pH do meio de ensaio.Quando doseamos uma enzima costuma escolher-se para pH de ensaio um valor próximo do pH ótimo dessa enzima. Se numa amostra de tecido existirem duas enzimas que catalisem a mesma reação mas essas enzimas tiverem pHs ótimos distintos posso, escolhendo o pH de ensaio, estudar uma ou outra dessas enzimas.
pH 10 favorece isoenzima azul
pH 7 favorece isoenzima vermelha
42
Para dosear uma enzima, para além da temperatura e do pH, também se escolhe a concentração do substrato. Eventualmente podemos fazer vários ensaios usando diferentes concentrações do substrato.
Considerar apenas um substrato é uma simplificação
(estritamente só as isomérases têm um substrato)
...mas podem fixar-se as concentrações dos outros substratos
e estudar-se como varia a atividade (vinicial)
... em função da variação da concentração de um deles.
vinicial
43
A atividade de uma enzima aumenta com a concentração de substrato......mas para concentrações “altas” (saturantes) aumentar a concentração de substrato praticamente não afeta a atividade.
Para diferentes enzimas o “aspeto” do gráfico
atividade versus [S] ...
pode ser
hiperbólico ou sigmoide
... mas a característica saturabilidade está sempre presente.
A atividade é proporcional à quantidade de complexo E•Sno meio de ensaio (kcat é a constante de proporcionalidade)
vinicial = kcat
vinicial
44
Num grande número de enzimas o gráfico vinicial versus [S] tem o “aspeto” de uma hipérbole que se ajusta à equação de Michaelis-Menten [ ]
[ ]SKmSVvinicial +
= max
As enzimas com “cinéticas de tipo hiperbólico” são aquelas em que o gráfico
vinicial versus [S]
pode ser ajustado a uma equação do tipo
... sendo que Vmax e Km são constantes(...se a única condição de ensaio que varia é [S])
vinicial
[ ][ ]SKmSVvinicial +
= max
45
kcat
A velocidade de formação do produto é proporcional à concentração do complexo E•S
vinicial (μM/min) = kcat [E•S]
Numa reação enzímica existe um ciclo catalítico em que da ligação entre a enzima livre e o substrato resulta a formação do complexo E•S; o complexo E•S pode dissociar-se mas também vai formando produto e regenerando enzima livre.
Num ensaio enzímico enquanto a concentração de substrato não baixar de forma significativa a concentração do complexo E•S vai-se mantendo numa concentração “estacionária”.
O valor da concentração “estacionária” de E•Sdepende (1) da concentração de enzima, (2) da concentração de substrato e (3) da afinidade entre a enzima e o seu substrato.
vinicial (μmol/min) =
kcat [E•S] × vol. meio de ensaio46
Atividade ou v0 ou vinicial= kcat [E•S]
Se não há substrato [E•S] = 0
Vinicial = 0
Se a concentração de substrato é elevada quase todas as moléculas de enzima estão ligadas ao substrato[E•S] ≈ [Etotal]
Existe uma concentração de substrato (= Km) em que metade das moléculas de enzima estão ligadas ao substrato (enzima hemisaturada)[E•S] = [E][E•S] = [Etotal]/2
vinicial ≈ kcat [Etotal]vinicial ≈ Vmax
vinicial = kcat [Etotal]/2vinicial = Vmax/2
concentração de substrato = Km
concentração de substrato é saturante
47
Se [S] = Kmvinicial = Vmax / 2...e a enzima está hemisaturada
A atividade enzímica para concentração saturante de substrato = Vmax
... se a concentração de substrato é elevada variações moderadas na concentração do substrato não afetam a atividade para dosear enzimas é frequente usarem-se concentrações elevadas de substrato porque o gráfico produto formado versustempo se mantém linear durante mais tempo.
Se [S] < Kmvinicial é quase proporcional a [S]...e menos de metade das moléculas de enzima estão ligadas ao substrato
vinicial
48
[ ][ ]SKmSVv
+= max
0
max0 Vv =
[ ][ ]SKmSVv
+= max
0
][S = Km ][S<<Km[ ]
[ ] [ ]SSSVv
+= max
0
[ ][ ]S
SVv2max
0 =
2max
0Vv =
[ ][ ]SKmSVv
+= max
0
][S>>Km
[ ]SKm
Vv max0 =
[ ][ ]S
SVv max0 =
... se Km<<[S] denominador ≈ [S]
... se Km=[S] denominador =2 [S]... se Km>>[S]
denominador ≈ Km
A partir da equação
...pode deduzir-se o valor de v0 para determinadas concentrações de substrato.
v0 não é afetado por [S] para
altas concentrações de S
v0 é diretamente proporcional a [S] para
baixas concentrações de S
49
O Km é uma medida da afinidade da enzima para o seu substrato...quando maior o valor do Km menor a afinidade (e vice-versa).
A enzima azul precisa de uma concentração de substrato menor para ficar hemisaturada......porque tem maior afinidade para o substrato que a enzima cinzenta.Em ambos os casos a enzima está hemisaturada mas…
Km (no caso da enzima azul) < Km (no caso da enzima cinzenta)
KmKm
Brincando: o Km mede o desamor entre a enzima e o seu substrato50
Vmax1=Vmax2
A enzima cinzenta está hemisaturada ([E•S]=[Et]/2)quando [S]= 10 mM (Km = 10 mM)
⇔ tem baixa afinidade para o substrato
(mM)
A enzima azul já está hemisaturada ([E•S]=[Et]/2)quando [S]= 3 mM (Km = 3 mM)
⇔ tem alta afinidade para o substrato
O Km mede a afinidade da enzima para o seu substrato
...quando maior o valor do Kmmenor a afinidade.
51
As teorias
atualmente mais aceites para interpretar este tipo de comportamento cinético surgiram na década de 60
e visavam interpretar um fenómeno semelhante: a forma sigmoide do gráfico de saturação da hemoglobina.
Essas teorias
revelaram-se adequadas para interpretar as
“cinéticas de tipo sigmoide”
em enzimas com mais de um local de ligação ao substrato por molécula de enzima (enzimas poliméricas).
Quando se estuda o efeito da concentração de substrato na atividade de algumas enzimas e se representa vinicial versus [S] o gráfico pode ser não uma hipérbole mas um sigmoide.
[ ][ ]hh
h
SSSVv
+=
50
max0 ; h = coeficiente de Hill
52
Concentrações de glicose possíveis
no hepatócito
Velo
cida
de d
e re
ação
ou
trans
porte
tran
smem
bran
ar
Quando o gráfico velocidade de reação (ou velocidade de transporte transmembranar) versusconcentração de reagente (ou substância transportada) é uma reta… indica-nos que o processo reativo (ou de transporte) é não enzímico (ou não mediado).
A comparação entre o valor do Km (ou S50) e a concentração estacionária (in vivo) do substrato numa enzima (ou num transportador) diz-nos se a enzima (ou o transportador) é ou não sensível a variações fisiológicas na concentração de substrato.
Processos reativos (ou de transporte) catalisados por enzimas
(ou transportadores); saturabilidade presente
Processo não catalisado;
saturabilidade ausente
53
A atividade das enzimas pode ser diminuída ou aumentada pela adição ao sistema de ensaio de modificadores da atividade enzímica (inibidores e activadores).Adicionando a um meio de ensaio uma substância M (inibidor ou activador)e mantendo constantes todas as outras condições de ensaio podemos obter diminuição (inibição) ou aumento (ativação) da atividade enzímica.
0
20
40
60
80
100
120
140
Act
ivid
ade
enzí
mic
a
+ini
bido
r +act
ivad
or}Δ vo
Δ vo{
Grau de inibição ou grau de ativação =Mdeausêncianav
v
inicial
inicialΔ
vinicial na ausência de inibidor = 100 UI
Δvinicial = 30 UI
Grau de inibição = 30%
54
Um estudo mais aprofundado do efeito de um inibidor na atividade duma enzima pode revelar que ele aumenta o Km do substrato sem modificar Vmax.Quando se estuda a atividade enzímica para vários valores de [S]podemos, multiplicando o número de tubos de ensaios,fazer esse estudo:na ausência e na presença de um inibidor I.
Algumas vezes observa-se que:1- Na presença do inibidor o valor de Vmaxnão se modifica; ⇔ para concentrações de substrato elevadas o inibidor I não tem efeito.
2-O valor do Km observado é maior na presença de I que na sua ausência;⇔ o grau de inibição é mais marcado para concentrações de substrato baixas.
Nestes casos falamos de inibição competitiva
vinicial
Para [S] = 4 grau inibição =50%
Para [S] = saturantegrau inibição = 0%
Para [S] = 40 grau inibição = 14 %
55
Para explicar o comportamento deste sistema (I aumento do Km mas I não afeta Vmax) poderemos admitir que o inibidor I e o substrato S se ligam no centro ativo da enzima competindo entre si. As possibilidades do modelo
apresentadocorresponderem à realidade são reforçadas seas estruturas moleculares do substrato e do inibidor forem semelhantes.
H2O
A fosfátase alcalina catalisa a hidrólise do para-nitrofenilfosfato: para-nitrofenilfosfato + H2O →
para-nitrofenol + Pi
O vanadato é um inibidor competitivo da fosfátase alcalina.
Nestes casos há inibição isostérica competitiva
56
Quando um inibidor isostérico competitivo está presente, para obter hemisaturação da enzima com substrato, preciso de ter maior concentração do substrato; a presença do inibidor aumenta o Km.
Na ausência de inibidor esta concentração de substrato permitia hemisaturação. O Km era 9.
Na presença do inibidor competitivo preciso de aumentar a concentração de substrato para 32 para obter hemisaturação com o substrato.Na presença do inibidor o Km (que era 9) aumentou para 32.
Mas na presença do inibidor para esta concentração de substrato só 1/6 das moléculas de enzima estão ligadas ao substrato.
57
sem vanadato
vanadato 2,5 μM
Vmax
Km(sem vanadato)=1,1 mM
Km(com vanadato)=7,6 mM
Vmax/2
Quando adicionado a meios de ensaio que contenham para-nitrofenilfosfato e fosfátase alcalina, o vanadato (HVO4
2-), inibe a atividade da enzima quando a concentração de para-nitrofenilfosfato não é saturante = a inibição é de tipo competitivo.Seargeant & Stinson (1979) Biochem J. 181: 247.
O vanadato é um inibidor competitivo da fosfátase alcalina = eleva o Km do para-nitrofenilfosfato mas não tem efeito no Vmax. Se a concentração de substrato for suficientemente alta compete eficazmente como o inibidor.
58
Dizer que a inibição é de tipo competitivo significa afirmar que, na presença do inibidor, o Km do substrato aumenta não sendo o Vmax afetado… e não significa obrigatoriamente que o inibidor seja um análogo do substrato e se ligue no centro ativo.
Inibidor alostérico
Conformação de alta afinidade = Km da glicose
Conformação de baixa afinidade =Km da glicose
A proteína inibidora da hexocínase IV é um inibidor competitivo relativamente à glicose.
Admite-se que a proteína inibidora se liga a um centro alostérico da enzima e que a conformação ligada tenha baixa afinidade para a glicose…
Vandercammen e Shaftingen (1991) Competitive inhibition of liver glucokinase by its regulatory protein, EJB, 200: 545.
kcat1
kcat2
kcat1 = kcat2 ⇔Vmax invariante
59
Quando se estuda o efeito de um inibidor para diferentes concentrações de substrato podemos, eventualmente, observar que a inibição não é de tipo competitivo.Algumas vezes observa-se que:
1- O Vmax é menor na presença de Ique na sua ausência.
2- Na presença de I o Km não se modifica; a concentração de substrato para a qual se observa um valor de atividade que é metade de Vmax (ou de Vmax’) é igual na presença e na ausência de I.
Nestes casos diz-se que a inibição é não competitiva.
vinicial
No exemplo o grau de inibição = 40% para todas as concentrações de substrato
3-O grau de inibiçãoé independente da concentração de substrato.
60
Um modelo possível para explicar a inibição de tipo não competitivo é admitir a existência na enzima de um local de ligação diferente do centro ativo (um sítio alostérico) cuja ligação ao inibidor impedisse a formação do produto.
De acordo com este modelo tudo se passaria como seas moléculas de enzima ligadas ao inibidor estivessem excluídas do processo catalítico, isto é,como se houvesse menos moléculas de enzima no meio de ensaio.
kcat1
kcat2 = 0
Km1
Km2
Km1= Km2
De acordo com o modelo (garantindo Km invariante) a afinidade entre a enzima e o substrato é igual nos casos da forma ligada e desligada do inibidor.
61
Um ligando diferente do substrato que se liga ao centro ativo é um inibidor isostérico (se se liga no centro ativo só pode inibir).
... mas se a ligação do inibidor ao sítio ativo for irreversível(não podendo ser “deslocado” por altas concentrações de substrato) as moléculas de enzima ligadas ao inibidor ficam excluídas do processo catalítico.
Se a ligação entre um inibidor isostérico e o centro ativofor reversível (se poder se “deslocado” pelo substrato) esse inibidor comporta-se funcionalmente como inibidor competitivo
Neste caso o inibidor comporta-se funcionalmente como não competitivo e é, frequentemente, usado o termo “inativador”. 62
A lípase pancreática catalisa a hidrólise de triacilgliceróis no intestino.
No tratamento da obesidade pode usar-se um fármaco (orlistat; xenical) que é um inativador (= inibidor irreversível) da lípase pancreática.
O orlistat reage com uma serina (formando uma ligação covalente e irreversível) situada no centro ativo da enzima bloqueando a sua atividade.
63
O doseamento da atividade da desidrogénase do piruvato pode ser feito em homogeneizados.Se o homogeneizado é preparado na presença de inibidores quer da cínase (dicloroacetato) quer da fosfátase (fluoreto) ...quando se faz o ensaio mede-se a atividade efetiva (“atual”).
P
ATP
ADP
H2O
Pi
Na ausência de inibidor (fluoreto),a fosfátase do tecido transforma toda a desidrogénase do piruvato na sua forma ativa.
Se o homogeneizado é preparado na presença do inibidor da cínase (dicloroacetato) mas na ausência de fluoreto...quando se faz o ensaio mede-se a atividade total.
No estudo in vitro de enzimas reguladas por fosforilação/desfosforilação podem usar-se inibidores das cínases e das fosfátases envolvidas.
64
1. Rakus, D., Maciaszczyk, E., Wawrzycka, D., Ulaszewski, S., Eschrich, K. & Dzugaj, A. (2005) The origin of the high sensitivity of muscle fructose 1,6-bisphosphatase towards AMP, FEBS Lett. 579, 5577-81.
2. Sugden, M. C. & Holness, M. J. (2006) Mechanisms underlying regulation of the expression and activities of the mammalian pyruvate dehydrogenase kinases, Arch Physiol Biochem. 112, 139-49.
3. Veiga-da-Cunha, M., Courtois, S., Michel, A., Gosselain, E. & Van Schaftingen, E. (1996) Amino acid conservation in animal glucokinases. Identification of residues implicated in the interaction with the regulatory protein, J Biol Chem. 271, 6292-7.
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7. Nelson, D. L. & Cox, M. M. (2005) Lenhinger principles of biochemistry, 4ª edn, New York.
8. Thorens, B. (1996) Glucose transporters in the regulation of intestinal, renal, and liver glucose fluxes, Am J Physiol. 270, G541-53.
Bibliografia utilizada: