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Enzimas

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Enzimas - Intrudução

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Poder catalítico de algumas enzimas

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Classificação das enzimas

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Cofatores e coenzimas

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Exemplo de uso de coenzima Álcool desidrogenase

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As enzimas são estereoespecíficas

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Enzimas – Catálise

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Relação entre ΔG0 e constante de equilíbrio

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Relação entre ΔG0 e constante de equilíbrio

Relação entre ΔG, ΔG0

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As enzimas aceleram as reações químicas mas não alteram a constante de equilíbrio

ou o ΔG de reação

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Modelos catalíticos

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Formação do complexo ES

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http://www.wiley.com/legacy/college/boyer/0470003790/animations/animations.htm

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Enzimas – Cinética

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Cinética enzimática

Ordem de reação:

A+B→P

Velocidade ∝[A][B]

A+2B→P

Vel ∝ [A] [B] [B]

Vel ∝ [A] [B ]2

nA+mB→P

Vel ∝[A]n [B]m

Vel1 = k An Bm

Vel−1= k−1 [P]

Vel1= Vel−1

No equilíbrio:

k An Bm = k−1 [P]

k [P]

k−1 An Bm =

[P]

An Bm K eq =

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As enzimas são estudadas em condições de velocidade inicial

v0 = k2[ES] = velocidade inicial

[P]

0

S1

tempoti

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[P]

0

Sn

S1

S2

S3

tta ti

Efeito da [S] na velocidade inicial de reação

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Efeito da [S] na velocidade inicial de reação

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•  Km é uma medida que inclui a afinidade e a capacidade catalítica de uma enzima por um dado substrato

•  Km é a [S] necessária para uma catálise em que V0 = Vmax/2

Constante de Michaelis Menten (Km)

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Em condições de velocidade inicial: •  Taxa de formação e consumo de ES é constante.

•  Km = (K2+K-1)/k1

•  Se [S]é : [ES] = [Et] : V0 = Vmax

Entendendo a equação de Michaelis-Menten

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Em condições de velocidade inicial:

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Número de renovação (Kcat)

•  Kcat é a quantidade de produto formado por tempo por enzima

•  Kcat = Vmax / [Et]

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Linearizando a equação de Michaelis e Menten

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Efeito da [E] na velocidade inicial de reação

Curva de Progresso - Invertase

0

2

4

6

8

10

12

0 20 40 60 80

Tempo (min)

[Pro

duto

] (m

M)

E=25  µg /mL

E=33 ,34  µg /mL

E=41 ,67  µg /mLE=50  µg /mLE=66 ,67µg /mL

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Efeito do pH na velocidade inicial de reação

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Vmax = k2 [Et]

k = F . e -Ea/RT (eq de Arrhenius) F = Fator de frequência Ea = Energia de ativação R = constante dos gases T = temperatura absoluta

Vmax = [Et].F. e -Ea/RT

Vm

T

Efeito da temperatura na velocidade inicial de reação

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Vm

Vm’3

Vm 2

Vm 3 Vm 1

T1 T2 TO T3 T

Efeito da temperatura na velocidade inicial de reação Efeito da desnaturação

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Enzimas – Inibidores

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Controle da atividade enzimática por efetores

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Inibição competitiva

]['][SmKSVmv+

=

mKKIKmI

'][1 =⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

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Inibição não competitiva

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

=

IKI

VmmV][1

'

][]['SKmSmVv

+=

][][][

][][][

ESIIES

EIIEK I ==

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v1

][1SKm

1−

Vm1

mV´1

com inibiçãonão competitiva

sem inibição

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Inibição acompetitiva

][']['SmKSmVv+

=

( )

][][1

][][1

][][1

][

][][1

][][ 03

S

KI

Km

S

KI

Vm

SKIKm

SVm

SKIKm

SEkv

I

I

II!!"

#$$%

&+

!!"

#$$%

&+

=

!!"

#$$%

&++

=

!!"

#$$%

&++

= V0

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http://www.wiley.com/legacy/college/boyer/0470003790/animations/animations.htm

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Regulação da atividade enzimática por efetores alostéricos

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Enzimas – Extra

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PURIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ENZIMAS

Na maior parte dos extratos ou preparações a concentração molar real da enzima não é conhecida e a quantificação da enzima presente é feita por medida de sua atividade.

Para a expressão da atividade das enzimas a Enzyme Comission International Union of Biochemistry, definiu uma unidade padrão de enzima:

1U =quantidade de enzima que catalisa a formação de 1 µmol de produto por

minuto sob condição definida.

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• A concentração de enzima em uma preparação impura é expressa em unidades/mL.

• A atividade específica da preparação é dada em unidades/mg de proteína.

Como a velocidade da reação enzimática é função da concentração de substrato, temperatura e pH, procura-se determinar a atividade da enzima nas condições ótimas de ensaio, com uma temperatura constante (geralmente entre 25º a 37oC) e com concentração de substrato saturante.

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À medida que se purifica observa-se um aumento na atividade específica, ou seja, um enriquecimento da enzima em questão naquela fração. Por outro lado, é importante que, em cada etapa de purificação, haja a menor perda possível de enzima. A percentagem de recuperação da enzima é dada pela relação:

Bruto Extrato no totalAtividadePurificada Fração na totalAtividade% =orecuperaçãde

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A atividade total é determinada multiplicando-se a atividade da enzima na fração pelo volume total desta fração.

O grau de purificação é dado pela relação:

Bruto Extrato no Específica AtividadePurificada Fração na Específica Atividade

=oPurificaçãdeGrau