da via metabólica cinética e regulação coenzima...
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Cinética e regulação enzímicas
(a velocidade das reacções enzímicas in vivo e in vitro)
Laboratório de Bioquímica da Faculdade de Medicina do Porto
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Os conceitos de “substrato da via metabólica” e coenzima só têm sentido se analisamos uma via metabólica no seu contexto celular.
Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo prostético e cofactor.
O NADH e o NAD+ (assim como o NADPH e o NADP+ e a coenzima A) costumam designar-se como coenzimas: olhadas no contexto da célula não se consomem no metabolismo mantendo (tal como as enzimas) uma concentração estacionária.
Os outros reagentes intervenientes (NAD+, por exemplo) são também substratos das enzimas...
mas na células a concentração do somatório NADH + NAD+ é de alguns µM e a via glicolítica só pode ter lugar se o NADH for re-oxidado a NAD+.
Na glicólise o “substrato da via metabólica” é a glicose que se consome gerando piruvato ou lactato...
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Os conceitos de apoenzima, grupo prostético e holoenzima podem ser definidos fora do contexto de uma via metabólica.O grupo prostético é um resíduo não aminoacídico ligado de forma estável (frequentemente covalente) à apoenzima.
Exemplos: (1) O FAD nas desidrogénases dependentes do FAD(2) A biotina em determinadas carboxílases
(como a carboxílase do piruvato)
Cofactor é uma substância (orgânica ou não) que
não se encontra ligada de forma covalente à enzima,
é essencial ao processo catalítico mas
...não é reagente nem produto da reacção.
Exemplo: as reacções em que intervém o ATP exigem a presença de Mg2+ (que podemos designar de cofactor)No entanto, muitos autores usam a palavra cofactor para designarcompostos que definimos como grupo prostético ou como coenzima.
O conceito de cofactor é o menos preciso.
ATP + X ADP + X-PMg2+
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As concentrações dos intermediários do metabolismo variam de indivíduo para indivíduo e com o estado metabólico mas mantêm-se em torno de determinados valores. As concentrações dos intermediários do metabolismo dizem-se estacionárias.Exemplo: A concentração de ATP (e a maioria dos outros compostos existentes nos seres vivos) considerando as várias reacções em que intervém como reagente ou produto não está em equilíbrio químico.
...mas a velocidade do conjunto de reacções que formam ATP é (quase) sempre igual à velocidade do conjunto de reacções em que este se gasta... ⇒ existe nas células uma concentração estacionária de ATP.
Os mecanismos que permitem manter o ATP, os intermediários do metabolismo, a glicose do plasma, etc em concentrações estacionárias são muito complexos e denominam-se de mecanismos homeostáticos.
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A regulação do metabolismo de modo a adaptar-se a diferentes condições (actividade ou descanço, jejum ou estado absortivo, diferentes tipos de dieta, etc.) é uma condição de sobrevivência.
ATP
contracção muscular
nutrientes
O2 ADP+Pi
ureia
CO2 + H2O
transporteactivo
trabalhomecânico
Na+
Ca+
Estado absortivo=Glicemia↑
Estado de jejum = Glicemia↓
A adaptação a diferentes condições só é possível porque a actividade das enzimas se modifica quando se alteram essas condições.
glicose
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As enzimas são sensores do ambiente onde se encontram variando a sua actividade em função de variações nesse ambiente.
As enzimas que catalisam reacções fisiologicamente reversíveis catalisam a conversão líquida no sentido directo ou inverso de acordo com a lei da acção das massas mas não são determinantes no sentido nem na velocidade de fluxo (J) da via metabólica...
As enzimas “marca passo” de uma via metabólica catalisam reacções fisiologicamente irreversíveis e a sua actividade determina a velocidade de fluxo nessa via metabólica. Estas enzimas (1) têm baixa actividade, (2) tem um papel determinante na regulação do metabolismo e (3) são controladas por efectores que só às vezes coincidem com os substratos e produtos...
A B1000
1010
S P0,01
10,01
Glicólise
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Aumentar a actividade de uma enzima que catalisa uma reacção “de desequilíbrio” (M2 →M3) pode significar um aumento transitório na concentração do intermediário M3 mas, a enzima a jusante que catalisa a conversão reversível M3 ↔ M4 rapidamente repõe a concentração de M3 num valor próximo do original.
J1 = (10) = (1010 – 1000) = 10
J2= (20) = (1020 – 1000) = 20
É na barragem que se controla o caudal (fluxo) de um rio…mudanças no valor do fluxo (J) na barragem provocam mudanças de fluxo idênticas a montante e a jusante da barragem.
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1- De instalação lenta (horas ou dias): a quantidade de enzima como a resultante das velocidades da sua síntese e da sua degradação.
Diferentes tipos de mecanismos podem participar na regulação das enzimas marca-passo das vias metabólicas:
2.1- Modificação alostérica (AMP, Ca2+…)
2.2- Modificação covalente (fosforilação e defosforilação, clivagem hidrolítica…)
2.3- Ciclos de substratos (“fúteis”)
2.4- Acesso ao substrato por regulação do transporte transmembranar (GLUT4, CPT…)
2- De instalação rápida
(segundos ou milisegundos):
3- De instalação rápida mas, geralmente, com papel menos importante (pelo menos no metabolismo normal)
3.1- Concentração de substratos3.2- Inibição isostérica (competitiva) e
inibição pelo produto3.3- pH 3.4- Temperatura
ATPADP
MM-PH2O
Pi
M M
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1- Mesmo quando o que varia é apenas a concentração da enzima E sem que tenha variado a actividade de cada uma das suas moléculas se a velocidade da reacção que E catalisa aumentou dizemos que a actividade enzímica da enzima E aumentou (e vice-versa). É um mecanismo de instalação lenta.
H2OSíntese proteica
v1
v2
Se a velocidade de síntese de uma determinada enzima (v1) é maior que a velocidade com que se degrada (hidrolisa) na célula (v2) a concentração e a actividade dessa enzima aumenta. Na condição inversa a concentração e a actividade diminuem.
v1 > v2 ⇒ v2 > v1 ⇒
RNAm
RNAm
10centro activo
AMP
sítio alostérico
Fosforílasemuscular na conformação tensa (inactiva)
Fosforílasemuscular na
AMP
2.1- Quando uma fibra muscular se contrai aumenta a velocidade de hidrólise do ATP e aumenta a concentração de ADP (e AMP; 2 ADP → AMP + ATP). O AMP liga-se à fosforílase muscular induzindo uma conformação mais activa ⇔ o AMP é um activador alostérico da fosforílase muscular.
conformação relaxada (activa)
Glicose-1-P
CO2 + H2O
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Na cínase-1 da frutose-6-P (ATP+ Frutose-6-P→ ADP + Frutose-1,6-bisfosfato) o ATP é, simultaneamente, substrato e inibidor alostérico. Para concentrações fisiológicas de ATP, o AMP (e o ADP) é um activador alostérico.
(2) Contudo, existe na enzima um sítio alostérico onde o ATP se liga inibindo-a.Para concentrações fisiológicas de ATP essa acção inibidora é muito marcada.(1) Um dos substratos da cínase da frutose-6-P é o ATP.
(3) O AMP (e o ADP) compete com o ATP pelo mesmo sítio alostérico impedindo a sua acção inibidora.
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A complexidade dos processos de regulação de enzimas induzida por hormonas e neurotransmissores tem levado a que a palavra “alostérico” não se use neste contexto mesmo quando o termo seria adequado.
O receptor da insulina pode ser visto como uma enzima alostérica com o seu centro alostérico activador virado para o lado extra-celular (onde se liga a insulina) e o centro activo no lado citoplasmático.
A ligação da insulina induz uma alteração conformacional no receptor que se torna capaz de catalisar a fosforilação de resíduos tirosina de proteínas designadas de Substratos do Receptor da Insulina (IRS).Efeitos
da insulina
Insulina ligada ao seu receptor
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A ligação entre os modificadores (activadores ou inibidores) alostéricos e os sítios alostéricos das enzimas é reversível e é de tipo não covalente.
… e o mesmo acontece nas ligações dos substratos e dos inibidores isostéricos competitivos ao sítio activo das enzimas.
Activadoralostérico
Inibidor alostérico
Inibidor isostérico competitvo14
2.2- A modificação da actividade de uma enzima pode envolver a sua modificação covalente (hidrólise irreversível ou fosforilação reversível) por acção catalítica de enzimas (normalmente outras enzimas).
Certas enzimas são activadas por hidrólise irreversível.São exemplos a activação dos zimogénios na digestão dos nutrientes.
Tripsinogénio
Tripsina(activa)
polipeptídeoinactivo+
H2O Entero-peptídase
Exemplo 1: O tripsinogénio ésegregado pelo pâncreas. Converte-se em tripsina (protéase digestiva) por acção da enteropeptídase (uma ectopeptídase presente no pólo apical dos enterócitos).
Exemplo 2: O pepsinogénio é segregado pelas células principais do estômago. Converte-se em pepsina (protéase digestiva) por acção hidrolítica do pH ácido do estômago e da próprio pepsina que já se formou.
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Muitas enzimas são reguladas por mecanismos de fosforilação/desfosforilação catalisadas por enzimas (cínases e fosfátases).
A cínase da desidrogénase do piruvatocatalisa a fosforilação da desidrogénase do piruvato que no estado fosforilado fica inactiva.
A fosfátase da desidrogénase do piruvatocatalisa a desfosforilação da desidrogénase do piruvato que no estado desfosforilado fica activa.
Forma fosforilada (inactiva)
Forma desfosforilada (activa)
A actividade da desidrogénase do piruvato depende da percentagem da enzima total que está na forma activa (desfosforilada).O valor desta percentagem depende das actividades relativas da (1) cínase da desidrogénase do piruvato e da (2) fosfátase da desidrogénase do piruvato.
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2.2, 2.1 e 1- A controlo da actividade das enzimas pode envolver mais de um mecanismo sendo o conjunto dos mecanismos de análise complexa.
Ca2+
O Ca2+ entra nas fibras musculares quando estas são estimulas pelo nervo motor e um dos efeitos é a estimulação alostérica da fosfátase da desidrogénase do piruvato…
A insulina aumenta no sangue quando a glicemia aumenta e um dos seus efeitos é reprimir o gene codificador da cínase da desidrogénase do piruvato…
O Ca2+ e a insulina estimulam a oxidação do piruvato.
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2.1 e 2.2- A fosforílase do glicogénio (quer hepática quer muscular) também éregulada por mecanismos de fosforilação (activadores) e desfosforilação (inibidores) induzidos pela acção de hormonas.
A glicagina (no caso do fígado) e as catecolaminas (nos casos do músculo e fígado)
podem desencadear uma cadeia de reacções que levam à fosforilação e consequente activação da fosforílase do glicogénio e, consequentemente, da fosforólise do glicogénio (formação de glicose-1-P).
A insulina activa uma fosfátase que reverte o processo; a fosfátase 1 de proteínas desfosforila a fosforílase do glicogénio inactivando-a.
H2O
Fosfátase 1 de proteínas
PKA= cínase de proteínas dependente do AMP cíclico
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2.3- A existência de “ciclos de substrato” (antigamente chamados de “fúteis”) permite amplificar o efeito de um sinal. O AMP (cuja concentração aumenta aquando do exercício) activa a glicólise muscular porque estimula a cínase da frutose-6-P mas também porque inibe a frutose-1,6-bisfosfátase. O aumento de fluxo na glicólise é muito mais marcado que o que seria de prever do efeito do AMP apenas numa das enzimas.
glicose
Frutose-6-P
Frutose-1,6-bisP
CO2 + H2O
ATP
ADPH2O
Pi
J=1
J=1
v = 9 v = 10
Frutose-6-P
Frutose-1,6-bisP
CO2 + H2O
ATP
ADPH2O
Pi
J=89
v = 1 v = 90AMP
J=89
glicose
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2.3- Também há “ciclos de substrato” no fígado (principal órgão da gliconeogénese). Aqui, o sentido do fluxo pode inverter-se. Após uma refeição que contenha glicídeos, a concentração intracelular de frutose-2,6-bisfosfato éalta e fica estimulada a cínase 1 da frutose-6-P (e a glicólise).
Frutose-6-P
Frutose-1,6-bisP
Fosfoenol-piruvato
ATP
ADPH2O
Pi
J=10
v = 10 v = 20Frutose-2,6-
bisfosfato ↑
J=10
Glicose-6-P
Frutose-6-P
Frutose-1,6-bisP
ATP
ADPH2O
Pi
J= - 10
v = 20 v = 10Frutose-2,6-bisfosfato
↓
J= - 10
Glicose-6-P
No jejum, a concentração intracelular de frutose-2,6-bisfosfato é baixa e fica estimulada a frutose-1,6-bisfosfátase (e a gliconeogénese).
glicose
glicose
Fosfoenol-piruvato20
2.4- A acessibilidade aos substratos. Nas fibras musculares a entrada de glicose (e a sua subsequente metabolização) é limitada pelo número de transportadores (GLUT4) presentes na membrana sarcoplasmática.
Contracção muscular ou insulina
Quer o exercício físico quer a insulina estimulam a entrada de glicose para as fibras musculares porque nestas condições, de forma rápida, vesículas intracelulares contendo GLUT4 fundem-se com a membrana sarcoplasmática.
Nos adipócitos o mesmo efeito éinduzido pela insulina.
A insulina e o exercício físico estimulam a remoção da glicose do plasma para as células.
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2.1, 2.2 e 2.4- A entrada de acil-CoA (ácidos gordos “activados”) para a mitocôndria (local onde ocorre a sua oxidação) depende da actividade da carnitina-acil transférase I que é inibida (inibição alostérica) pelo malonil-CoA. Quando a concentração citoplasmática de malonil-CoA desce a entrada de acil-CoA para a mitocôndria acelera. É dentro da mitocôndria que se dá a oxidação dos ácidos gordos (oxidação em beta).
Os factores que estimulam a AMPK levam à fosforilação da carboxílase da acetil-CoA.
A fosforilação inactiva a carboxílase de acetil-CoA
o que baixa a concentração de malonil-CoA.
A descida do malonil-CoA “desinibe” a carnitina-palmitoil transférase I... acelerando-se a entrada de acil-CoA para a mitocôndria.
oxidação em βoxidação em β22
1- De instalação lenta: a quantidade de enzima como a resultante das velocidades da sua síntese e da sua degradação.
2.1- Controlo alostérico (AMP, Ca2+…)2.2- Modificação covalente (fosforilação e defosforilação, clivagem
hidrolítica…)2.3- Ciclos de substratos (“fúteis”)2.4- Acesso ao substrato por regulação do transporte transmembranar
(GLUT4, CPT…)
2- De instalação rápida:
3- De instalação rápida mas, geralmente, com papel menosimportante (pelo menos no metabolismo normal)
3.1- Activação pelos substratos
3.2- Inibição isostérica(competitiva) e inibição pelo produto
3.3- pH3.4- Temperatura
Estudamos até agora os mecanismos 1, 2.1, 2.2, 2.3 e 2.4. Falta referir os 3.1, 3.2, 3.3 e 3.4.
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Brindle et al. (1989) Biochemistry 28: 4887-93
3.1- Nas enzimas marca-passo, geralmente, o efeito directo da variação da concentração do substrato é pequeno (que mais não seja porque, in vivo, as concentrações dos metabolitos são estacionárias). Mas, em alguns casos foi possível estudar in vivo a variação da actividade de enzimas com a concentração do substrato.
Num estudo de Brindle et al. (1989) estimulou-se electricamente o nervo ciático de ratos e mediu-se, na musculatura da perna, por NMR (1) a concentração de ADP e (2) a incorporação de Pi no ATP (síntase do ATP).
Alta actividade contráctil
Baixa actividade contráctil
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Quando a concentração de glicose aumenta no sangue após as refeições entra para os hepatócitos provocando a dissociação do complexo glicocínase – proteína nuclear inibidora da glicocínase.
Concentrações de glicose possíveis
na veia porta
A entrada (GLUT2) e a fosforilação da glicose no fígado (cínase da glicose/hexocínase IV) é regulada directamente pela concentração de glicose na veia porta e nos hepatócitos.
Act
ivid
ade
do G
LUT2 Concentrações
de glicose possíveis
no hepatócito
Quer o GLUT 2 quer a glicocínase são sensíveis às variações fisiológicas da concentração de glicose
Act
ivid
ade
do G
licoc
ínas
e
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∆G’ ≈ 18 kJ; Keq/QR ≈ 1000
3.2- O produto como inibidor das enzimas marca-passo. Na reacção catalisada pela desidrogénase da glicose-6-P (via das pentoses-P) a reacção inversa não existe mas o NADPH compete com o NADP+ pelo local de ligação deste no centro activo (inibição isostérica e competitiva).
NADP+NADPH
6-fosfo-gliconolactona
+NADP+
NADPHNADPH
A desidrogénase da glicose-6-fosfato é activada sempre que a concentração intracelular de NADPH desce.
Para além de regulada ao nível da transcrição (a desidrogénase da glicose-6-P é induzida pela insulina) a descida da concentração intracelular de NADPH (um dos produtos) também estimula a actividade da enzima.
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fosfodiestérase
H2O
Sub-unidadesreguladoras
Sub-unidadescatalíticas
Domínio semelhante aos substratos
Sítio activo
ATP
PPi
AMP
AMPc
AMPc
A PKA (cínase de proteínas dependente do
AMPc) dissociada das unidades reguladoras é activa e catalisa a fosforilação de enzimas…
PKA inactiva (ligada e sub-unidades reguladoras)
A PKA é uma enzima que na forma inactiva tem o seu sítio activo bloqueado pela ligação a sub-unidades reguladoras que contêm um domínio “pseudo-substrato” (inibição isostérica e competitiva). A ligação do AMP cíclico às sub-unidadesreguladoras induz a dissociação das sub-unidades catalíticas que são activas.
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3.3- Pensa-se que a variação do pH não tem, em geral, um papel importante na regulação das enzimas intracelulares mas…
a) No estômago o pH do suco gástrico é ácido e as enzimas deste suco têm pH óptimo ácido.
b) O suco pancreático neutraliza o quimo gástrico…(H+ + HCO3
- → CO2 + H2O)e as enzimas do suco pancreático e as enzimas intestinais têm pH óptimo neutro.
Acidificação das fibras musculares durante glicólise anaeróbia
c) Pensa-se que a diminuição da oxidação dos ácidos gordos durante a glicólise anaeróbia nas fibras musculares esqueléticas se deve à diminuição de actividade da carnitina-palmitil-transférase I… cuja actividade diminui quando o pH desce.
pH baixo
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3.4- No homem, a alteração de actividade das enzimas das células em situações de abaixamento da temperaturacorporal ou de febre poderá ser importante …mas não desempenha um papel relevante na regulação do metabolismo normal.
As enzimas e transportadores humanos (ao contrário do que acontece com outros seres vivos) foram seleccionados de forma a manterem velocidades de fluxo adequadas à vida (nas vias anabólicas e catabólicas) numa estreita gama de temperaturas.
Francisco Lázaro(1888-1912)
Os órgãos para transplante são transportados a baixas temperaturas de forma a lentificar os processos catabólicos nomeadamente a hidrólise de proteínas (enzimas, transportadores, actina-miosina, etc)