conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo...

16
1 Cinética e regulação enzímicas (a velocidade das reações enzímicas in vitro e in vivo) Departamento de Bioquímica da Faculdade de Medicina do Porto [email protected] 2 Os conceitos de substrato da via metabólica” e coenzima só têm sentido se analisamos uma via metabólica no seu contexto celular. Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo prostético e cofator. A coenzima A, o NADH e o NAD + (assim como o NADPH e o NADP + ) costumam designar-se como coenzimas: olhadas no contexto da célula (células isoladas ou organismos) não se consomem no metabolismo mantendo (tal como as enzimas) uma concentração estacionária. Ácido gordo ATP AMP + PPi CoASH Acil-CoA CoASH 2-monoacil- glicerol 1,2-diacilglicerol Embora a Coenzima A seja substrato da sintétase de acil-CoA, no contexto do processo global de síntese de triacilgliceróis que ocorre nos enterócitos, não há consumo líquido nem formação de Coenzima A. 3 Os conceitos de apoenzima, grupo prostético e holoenzima podem ser definidos fora do contexto de uma via metabólica. O grupo prostético é um resíduo não aminoacídico ligado de forma estável (frequentemente covalente) à apoenzima. Exemplos: (1) O FAD nas desidrogénases dependentes do FAD (2) A biotina em determinadas carboxílases (como a carboxílase do piruvato) Cofator é uma substância (orgânica ou não) que não se encontra ligada de forma covalente à enzima, é essencial ao processo catalítico mas ...não é reagente nem produto da reação. Exemplo: as reações em que intervém o ATP exigem a presença de Mg 2+ (que podemos designar de cofator) No entanto, muitos autores usam a palavra cofator para designar compostos que definimos como grupo prostético ou como coenzima. O conceito de cofator é o menos preciso. ATP + X ADP + X-P Mg 2+ 4 A1 - Doseamentos de enzimas plasmáticas (algumas enzimas só aparecem no plasma sanguíneo em determinadas patologias) A3 – Uso de enzimas purificadas de bactérias ou fungos como instrumento no doseamento de substâncias (como a glicose sanguínea e múltiplas outras substâncias…) Estudar as enzimas in vitro (no tubo de ensaio) para quê? A) O estudo das enzimas é muito útil em análises clínicas A2 - Doseamentos de enzimas celulares (a deficiência de uma enzima pode ser diagnosticada… ) B1-O estudo das enzimas é uma importante área da investigação bioquímica. B2-As enzimas purificadas são instrumentos imprescindíveis em múltiplas outras áreas de investigação. A) O enzimas na investigação

Upload: others

Post on 09-Nov-2020

5 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo ...ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados...em velocidade de reação /volume de soro sanguíneo Porque as condições de ensaio

1

Cinética e regulação enzímicas

(a velocidade das reações enzímicas in vitroe in vivo)

Departamento de Bioquímica da Faculdade de Medicina do Porto

[email protected]

2

Os conceitos de “substrato da via metabólica ” e coenzima só têm sentido se analisamos uma via metabólica no seu contexto celular.

Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo prostético e cofator.

A coenzima A, o NADH e o NAD+ (assim como o NADPH e o NADP+) costumam designar-se

como coenzimas: olhadas no contexto da célula (células isoladas ou organismos) não se

consomem no metabolismo mantendo (tal como as enzimas) uma concentração estacionária.

Ácido gordo

ATP

AMP + PPiCoASH

Acil-CoA

CoASH

2-monoacil-glicerol

1,2-diacilglicerol

Embora a Coenzima A seja substrato da sintétase de acil-CoA, no contexto do processo global de síntese de triacilgliceróis que ocorre nos enterócitos, não há consumo líquido nem formação de Coenzima A.

3

Os conceitos de apoenzima , grupo prostético e holoenzima podem ser definidos fora do contexto de uma via metabólica.O grupo prostéticoé um resíduo não aminoacídico ligado de forma estável (frequentemente covalente)à apoenzima.

Exemplos: (1) O FAD nas desidrogénases dependentes do FAD(2) A biotina em determinadas carboxílases

(como a carboxílase do piruvato)

Cofator é uma substância (orgânica ou não) que

não se encontra ligada de forma covalente à enzima,

é essencial ao processo catalítico mas

...não é reagente nem produto da reação.

Exemplo: as reações em que intervém o ATP exigem a presença de Mg2+ (que podemos designar de cofator)

No entanto, muitos autores usam a palavra cofator para designar compostos que definimos como grupo prostético ou como coenzima.

O conceito de cofator é o menos preciso.

ATP + X ADP + X-PMg2+

4

A1 - Doseamentos de enzimas plasmáticas(algumas enzimas só aparecem no plasma sanguíneo em determinadas patologias)

A3 – Uso de enzimas purificadas de bactérias ou fungos como instrumento no doseamento de substâncias (como a glicose sanguínea e múltiplas outras substâncias…)

Estudar as enzimas in vitro (no tubo de ensaio) para quê?

A) O estudo das enzimas é muito útil em análises clínicas

A2 - Doseamentos de enzimas celulares(a deficiência de uma enzima pode ser diagnosticada… )

B1-O estudo das enzimas é uma importante área da investigação bioquímica.

B2-As enzimas purificadas são instrumentosimprescindíveis em múltiplas outras áreas de investigação.

A) O enzimas na investigação

Page 2: Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo ...ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados...em velocidade de reação /volume de soro sanguíneo Porque as condições de ensaio

5

0

0,5

1

1,5

2

0 1 2 3Pro

duto

(m

icro

mol

es)

tempo (min)

Acumulação de produto versus tempo

Quando se quer quantificar aatividade de uma enzimaadicionamos num tubo de ensaio a enzima ao(s) substrato(s) e vamos observando ao longo do tempo como evolui a reação.

... mas atividade enzímica = velocidade da reação enzí mica

O normal é que (por motivos vários) a reação se vá lentificando.

1/min

0,5/min0,1/min

Quando se atingir o equilíbrio químico ou se esgotar o substrato a velocidade será zero.

6

Admitamos que fizemos dois ensaios idênticosmas com duas amostras diferentes da mesma enzima E:

amostra azulamostra vermelha

Em qual das amostras a enzima E tinha maior atividade?

Como podemos exprimir quantitativamente a atividade da enzima E na amostra azul?

Se respondêssemos: atividade = 3 µµµµmoles/5 min = 0,6 µµµµmoles/min... estaríamos a falar da velocidade média nos 5 min de ensaio e a dizer que nas duas amostras a

atividade era igual.

0

1

2

3

0 1 2 3 4 5

Pro

duto

(m

icro

mol

es)

Tempo (min)

Acumulação de produto versus tempo

Para a concentração de substrato em que o ensaio se iniciou a velocidade será o declive da curva produto formado versus tempo no tempo zero (v0 ouv inicial)mas poderemos considerar que, pelo menos no caso do ensaio azul, uma boa estimativa de v0 pode ser a velocidade média no primeiro minuto de ensaio(1 µmole/min).

Atividade azul (v0 ou vinicial) = 1 µµµµmole / min

7

Em teoria a atividade de uma enzima (num sistema de ensaio especificado e adequado) define-se como o aumento de velocidade de conversão (S → P) induzido pela enzima:

Atividade = v inicial = vel. na presença de enzima – vel. na sua ausência

A realização de “ensaios a branco” (sem enzima) permite prevenir a eventualidade de ocorrer

reação não enzímica. Ao subtrair o branco... também se subtrai o produto que eventualmente se

tenha formado na ausência de enzima (ou que esteja presente como contaminante do substrato).

incubar substrato napresença de Fosf Alc.

durante um tempo t

NaOH

ler Absorvânciano ensaio enzímico

incubar substrato naausência deFosf Alc.

durante um tempo t

NaOH

ler Absorvância no “ensaio a branco”

pH=10

pH=10

pH=12; pH onde a Fosfátase Alcalina para de funcionar

pH=12

8

Como variará vinicial se duplicarmos (ou triplicarmos...) a quantidade de enzima num ensaio enzímico?

A atividade enzímica (vinicial ou uma boa estimativa de vinicial) num meio especificado e adequado é proporcional à quantidade de enzima (… desde que a concentração molar de enzima seja muito inferior à do substrato).

[ ][ ] total

catinicial E

SKm

Skv

+=

se fizermos ensaios nas mesmas condições (temperatura, pH, etc.) kcat e Km são constantes; se também usarmos a mesma concentração de substrato [S]este fatoré constante

totalinicial Econstv .=

Page 3: Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo ...ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados...em velocidade de reação /volume de soro sanguíneo Porque as condições de ensaio

9

0

1

2

3

0 1 2 3 4 5

Pro

duto

(m

icro

mol

es)

Tempo (min)

Acumulação de produto versus tempo

Embora, pelo menos teoricamente, a quantidade de uma enzimapossa ser medida em moles ou em gramas, é mais frequente medir a quantidade de enzima como uma velocidade de reação; a velocidade da reação catalisada pela enzima em análise (idealmente no tempo zero; vinicial).

UI (unidade internacional) = quantidade de enzima que catalisa a conversão de 1 µµµµmol de substrato em produto / min

Qual a quantidade de enzima E no ensaio vermelho?

10

Admitindo que

1) a enzima E catalisa a reação X→Y

2) o tubo de ensaio A continha 1 ml de solução

3) no tempo zero se adicionou 1 µl de soro

4) ... e se foi medindo a quantidade X ao longo do tempo

Qual a atividade da enzima E

no soro em análise?1) No tubo A nos primeiros 10 min

a concentração de X passou de 100 para 90 mM = diminuiu 10 mM (ou 10000 µM)

2) 10000 µM * 0,001 L = 10 µmoles de X convertido em Y

3) 10 µmol de X/ 10 min = 1 µmol / min

4) 1 UI / µl soro

Notar que no tubo B se adicionou um volume diferente do mesmo soro. Porque a velocidade de reação observada em B era metade da observada em A quer dizer que em B havia metade do número de moles da enzima E. Ou seja, em B o volume de soro era 0,5 µl.

11

Quando se doseiam enzimas numa preparação que a contém (usando a atividade como medida da quantidade de enzima) pressupõe-se que a atividade (v inicial ) é proporcional à quantidade de enzima .

Em Química Clínica doseiam-se com frequência enzimas no soro(por exemplo a amílase do soro em situações em que se suspeita de pancreatite aguda)exprimindo o resultado do ensaio enzimático em

velocidade de reação / volume de soro sanguíneo

Porque as condições de ensaio (concentração e natureza dos substratos, pH, natureza do tampão, temperatura, etc.) podem não ser iguais em dois laboratórios distintos os valores normais de um laboratório podem não ser iguais aos de outro laboratório.

1 mol de glicose é 1 mol de glicose em qualquer sítio do mundomas 1 UI de amílase (ou outra enzima qualquer) em dois laboratórios distintos pode significar diferentes quantidades de enzima.

Pâncreas inflamado liberta

amílase para o sangue

12

A atividade enzímica aumenta se o número de moléculas de enzima aumentar(e vice-versa). O doseamento de uma enzima em tecidos pode servir paraestudar o efeito de hormonas na síntese dessa enzima.

A insulina inibe a expressão de genes que codificam enzimas envolvidas na produção de glicosecomo, por exemplo, o gene da glicose-6-fosfátase.

Quando há muita insulina

o número de moléculas de glicose-6-fosfátase diminui porque diminui a transcrição do seu gene.

Quando há pouca insulina

o número de moléculas de glicose-6-fosfátase aumenta pela razão oposta.

Voice et al. (1992) BST20:272S

Glicose-6-

fosfátase no

fígado

Glicose-6-P

Page 4: Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo ...ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados...em velocidade de reação /volume de soro sanguíneo Porque as condições de ensaio

13

1 mg de fígado2 mg de

fígado

2 µmol/min = 2UI

2 UI2 mg de fígado

Atividade = 1 UI / mg de fígado

2 µmol / 2min = 1UI

1 UI1 mg de fígado

Atividade =1 UI / mg de fígado

Porquê expressar atividade em UI / massa de tecido (ou UI / mg de proteína)? Permite comparar dois ensaios enzímicos em que se usam quantidades de enzima distintas...

Homogeneizado de fígado

14

Quando se doseia uma enzima necessitamos de um meio de ensaio que contém obrigatoriamente o substrato (ou substratos) da enzima...mas em diferentes laboratórios podem usar-se diferentes temperaturas de ensaio .

20ºC 70ºC

Aumentar a temperatura aumenta a velocidade das reações incluindo a velocidade de desnaturação das enzimas.

O exemplo da figura indica que se se pretendesse dosear a enzima em questão poderia ser mais cómodo escolher para temperatura de ensaio 30ºC...

15

Para dosear uma enzima , para além da temperatura, também se escolhem outras condições de ensaio como, por exemplo, o pH do meio de ensaio .

Quando doseamos uma enzima costuma escolher-se para pH de ensaio um valor próximo do pH ótimo dessa enzima. Se numa amostra de tecido existirem duas enzimas que catalisem a mesma reação mas essas enzimas tiverem pHs ótimos distintos posso, escolhendo o pH de ensaio, estudar uma ou outra dessas enzimas.

pH 10 favorece isoenzima azul

pH 7 favorece isoenzima vermelha

16

Para dosear uma enzima , para além da temperatura e do pH, também se escolhe a concentração do substrato. Eventualmente podemos fazer vários ensaios usando diferentes concentrações do substrato .

Considerar apenas um substrato é uma simplificação

(estritamente só as isomérases têm um substrato)

...mas podem fixar-se as concentrações dos outros substratos

e estudar-se como varia a atividade (vinicial)

... em função da variação da concentração de um

deles.

vinicial

Page 5: Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo ...ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados...em velocidade de reação /volume de soro sanguíneo Porque as condições de ensaio

17

A atividade de uma enzima aumenta com a concentração de substrato......mas para concentrações “altas” (saturantes ) aumentar a concentração de substrato praticamente não afeta a atividade.

Para diferentes enzimas o “aspeto” do gráfico

atividade versus[[[[S]]]] ...

pode ser

hiperbólico ou sigmoide

... mas a característica saturabilidade está sempre presente.

A atividade é proporcional à quantidade de complexo E•Sno meio de ensaio (kcat é a constante de proporcionalidade)

vinicial = kcat

vinicial

18

Num grande número de enzimas o gráfico v inicial versus [S] tem o “aspeto” de

uma hipérbole que se ajusta à equação de Michaelis-Menten

As enzimas com “cinéticas de tipo hiperbólico” são aquelas em que o gráfico

vinicial versus[S]

pode ser ajustado a uma equação do tipo

... sendo que Vmax e Km são constantes(...se a única condição de ensaio que varia é [S])

vinicial

[ ][ ]SKm

SVv

+= max0

[ ][ ]SKm

SVvinicial +

= max

19

kcat

A velocidade de formação do produto é proporcional à concentração do complexo E•S

vinicial (µM/min) = kcat [E•S]

Numa reação enzímica existe um ciclo catalítico em que, da ligação entre a enzima livre e o substrato, resulta a formação do complexo E•S; o complexo E•S pode dissociar-se mas também vai formando produto e regenerando enzima livre.

Num ensaio enzímico enquanto a concentração de substrato não baixar de forma significativa a concentração do complexo E•S vai-se mantendo numa concentração “estacionária”.

O valor da concentração “estacionária” de E•Sdepende (1) da concentração de enzima, (2) da concentração de substrato e (3) da afinidade entre a enzima e o seu substrato.

vinicial (µmol/min) =

kcat [E•S] × vol. meio de ensaio20

Atividade ou v0 ou vinicial= kcat E•S

Se não há substrato E•S = 0

Vinicial = 0

Se a concentração de substrato é elevada quase todas as moléculas de enzima estão ligadas ao substratoE•S ≈ Etotal

Existe uma concentração de substrato (= Km) em que metade das moléculas de enzima estão ligadas ao substrato (enzima hemisaturada)E•S = EE•S = Etotal/2

vinicial ≈ kcat Etotal

vinicial ≈ Vmax

vinicial = kcat Etotal/2vinicial = Vmax/2

concentração de

substrato = Km

concentração de

substrato é saturante

Page 6: Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo ...ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados...em velocidade de reação /volume de soro sanguíneo Porque as condições de ensaio

Se [S] = Kmvinicial = Vmax / 2...e a enzima está hemisaturadaE•S = ½ Etotal

Se [S] < Kmvinicial é quase proporcional a [S]...e

E•S < ½ Etotal

vinicial

… é o valor da fração de enzima que está na forma de complexo E•S

Se [S] >> Kmvinicial ≈ Vmax... a enzima está saturada

E•S ≈ Etotal

[ ][ ] 1≈

+ SKm

S

[ ][ ] 2

1=+ SKm

S[ ]

[ ] 21<

+ SKm

S

22

max0 Vv =

][ S = Km ][ S<<Km[ ]

[ ] [ ]SS

SVv

+= max0

[ ][ ]S

SVv

2max0 =

2max

0

Vv =

[ ][ ]SKm

SVv

+= max0

][ S>>Km

[ ][ ]S

SVv max0 =

... se Km<<[S] denominador ≈ [S]

... se Km=[S] denominador =2 [S]... se Km>>[S]

denominador ≈ Km

A partir da equação

...pode deduzir-se o valor de v0 para determinadas concentrações de substrato.

v0 não é afetado por [S] para

altas concentrações de S

v0 é diretamente proporcional a [S] para baixas

concentrações de S

[ ][ ]SKm

SVv

+= max0

[ ][ ]SKm

SVv

+= max0

[ ]Km

SVv max0 =

23

O Km é uma medida da afinidade da enzima para o seu substrato

...quando maior o valor do Km menor a afinidade (e vice-versa).

A enzima azulprecisa de uma concentração de substrato menor para ficar hemisaturada......porque tem maior afinidade para o substrato que a enzima cinzenta.Em ambos os casos a enzima está hemisaturada mas…

Km (no caso da enzima azul) < Km (no caso da enzima cinzenta)

Km

Km

Brincando: o Km mede o desamor entre a enzima e o seu substrato24

Vmax1=Vmax2

A enzima cinzenta está hemisaturada ([E••••S]=[Et]/2)quando [S]= 10 mM(Km = 10 mM)

⇔⇔⇔⇔ tem baixa afinidade para o substrato

(mM)

A enzima azul já está hemisaturada ([E••••S]=[Et]/2)quando [S]= 3 mM (Km = 3 mM)

⇔⇔⇔⇔ tem alta afinidade para o substrato

O Km mede a afinidade da enzima para o seu substrato

...quando maior o valor do Kmmenor a afinidade.

Page 7: Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo ...ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados...em velocidade de reação /volume de soro sanguíneo Porque as condições de ensaio

25

Estudar o valor do Km serve para caracterizar uma enzima mas também pode servir para compreender a sua regulação in vivo.

1- Duas isoenzimas podem distinguir-se por valores distintos no Km do substrato (caso da hexocínase cerebral e glicocínase hepática...).

2- Se o valor das concentrações fisiológicas do substrato (in vivo; na célula) é conhecida, a comparação com o valor do Km

...pode servir para estimaro efeito das variações fisiológicas da concentração do substrato na atividade da enzima.

hexocínase cerebral

glicocínase hepática (ou hexocínase IV)

26

As teorias

atualmente mais aceites para interpretar este tipo de comportamento cinético surgiram na década de 60

e visavam interpretar um fenómeno semelhante: a forma sigmoide do gráfico de saturação da hemoglobina.

Essas teorias

revelaram-se adequadas para interpretar as

“cinéticas de tipo sigmoide”

em enzimas com mais de um local de ligação ao substrato por molécula de enzima (enzimas poliméricas).

Quando se estuda o efeito da concentração de substrato na atividade de algumas enzimas e se representa vinicial versus [S] o gráfico pode ser não uma hipérbole mas um sigmoide .

[ ][ ]hh

h

SS

SVv

+=

50

max0 ; h = coeficiente de Hill

Velo

cida

de d

e re

ação

ou

tran

spor

te tr

ansm

embr

anar

Quando o gráfico velocidade de reação (ou velocidade de transporte transmembranar) versusconcentração de reagente (ou substância transportada) é uma reta… indica-nos que o processo reativo (ou de transporte) é não enzímico (ou não mediado).

Processos reativos (ou de transporte) catalisados por enzimas

(ou transportadores); saturabilidade presente

Processo não catalisado;

saturabilidade ausente

28

A atividade das enzimas pode ser diminuída ou aumentada pela adição ao sistema de ensaio de modificadores da atividade enzímica (inibidores e activadores).

Adicionando a um meio de ensaio uma substância M (inibidor ou activador)e mantendo constantes todas as outras condições de ensaio podemos obter diminuição (inibição)ou aumento (ativação)da atividade enzímica.

0

20

40

60

80

100

120

140

Act

ivid

ade

enzí

mic

a

+in

ibid

or

+ac

tivad

or}∆∆∆∆ vo

∆∆∆∆ vo{

Grau de inibição ou grau de ativação=Mdeausêncianav

v

inicial

inicial∆

vinicial na ausência de inibidor = 100 UI

∆vinicial = 30 UI

Grau de inibição = 30%

Page 8: Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo ...ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados...em velocidade de reação /volume de soro sanguíneo Porque as condições de ensaio

29

Um estudo mais aprofundado do efeito de um inibidor na atividade duma enzima pode revelar que ele aumenta o Km do substrato sem modificar Vmax.

Quando se estuda a atividade enzímica para vários valores de [S]podemos, multiplicando o número de tubos de ensaios,fazer esse estudo:na ausência e na presença de um inibidor I.

Algumas vezes observa-se que:1- Na presença do inibidor o valor de Vmaxnão se modifica; ⇔ para concentrações de substrato elevadas o inibidor I não tem efeito.

2-O valor doKm observado é maior na presença de I que na sua ausência;⇔ o grau de inibição é mais marcado para concentrações de substrato baixas.

Nestes casos falamos de inibição competitiva

vinicial

Para [S] = 4 ⇒grau inibição =50%

Para [S] = saturantegrau inibição = 0%

Para [S] = 40 ⇒grau inibição = 14 %

3030

Para explicar o comportamento deste sistema (I ⇒ aumento do Km, mas I não afeta Vmax) poderemos admitir que o inibidor I e o substrato S se ligam no centro ati vo da enzima competindo entre si .

As possibilidades do modelo apresentadocorresponder à realidade são reforçadas seas estruturas moleculares do substrato e do inibidor forem semelhantes.

O malonato compete com o succinato na atividade da desidrogénase do succinato

Nestes casos há inibição isostérica competitiva

31

Quando um inibidor isostérico competitivo está presente, para obter hemisaturação da enzima com substrato, preciso de ter maior concentração do substrato; a presença do inibidor aumenta o Km.

Na ausência de inibidor esta concentração de substrato permitia hemisaturação. O Km era 9.

Na presença do inibidor competitivo preciso de aumentar a concentração de substrato para 32 para obter hemisaturação com o substrato.Na presença do inibidor o Km (que era 9) aumentou para 32.

Mas na presença do inibidor para esta concentração de substrato só 1/6 das moléculas de enzima estão ligadas ao substrato. 32

sem vanadato

vanadato 2,5 µM

Vmax

Km(sem vanadato)

=1,1 mM

Km(com vanadato)=7,6 mM

Vmax/2

Quando adicionado a meios de ensaio que contenham para-nitrofenilfosfato e fosfátase alcalina, o vanadato (HVO42-), inibe a atividade da enzima quando a concentração de para-nitrofenilfosfato não é saturante = a inibição é de tipo competitivo.Seargeant & Stinson (1979) Biochem J. 181: 247.

O vanadato é um inibidor competitivo da fosfátase alcalina = eleva o Km do para-nitrofenilfosfato mas não tem efeito no Vmax. Se a concentração de substrato for suficientemente alta compete eficazmente como o inibidor.

Page 9: Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo ...ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados...em velocidade de reação /volume de soro sanguíneo Porque as condições de ensaio

33

Dizer que a inibição é de tipo competitivo significa afirmar que, na presença do inibidor, o Km do substrato aumenta não sendo o Vmax afetado… e não significa obrigatoriamente que o inibidor seja um análogo do substrato e se ligue no centro ativo.

Inibidor alostérico

Conformação de

alta afinidade = baixo Km da glicose

Conformação de baixa

afinidade =

alto Km da glicose

A proteína inibidora da hexocínase IV é um inibidor competitivo relativamente à glicose.

Admite-se que a proteína inibidora se liga a um centro alostérico da enzima e que a conformação ligada tenha baixa afinidade para a glicose…

Vandercammen e Shaftingen (1991) Competitive inhibition of liver glucokinase by its regulatory protein, EJB, 200: 545.

kcat1

kcat2

kcat1 = kcat2 ⇔Vmax invariante

34

Quando se estuda o efeito de um inibidor para diferentes concentrações de substrato podemos, eventualmente, observar que a inibição não é de tipo competitivo.Algumas vezes observa-se que:

1- O Vmax é menor na presença de Ique na sua ausência.

2- Na presença de I o Km não se modifica; a concentração de substrato para a qual se observa um valor de atividade que é metade de Vmax (ou de Vmax’) é igual na presença e na ausência de I.

Nestes casos diz-se que a inibição é não competitiva.

vinicial

No exemplo o grau de inibição = 40% para todas as concentrações de substrato

3-O grau de inibiçãoé independente da concentração de substrato.

35

Um modelo possível para explicar a inibição de tipo não competitivo é admitir a existência na enzima de um local de ligação diferente do centro ativo (um sítio alostérico) cuja ligação ao inibidor impedisse a formação do produto.

De acordo com este modelo tudo se passaria como seas moléculas de enzima ligadas ao inibidor estivessem excluídas do processo catalítico, isto é,como sehouvesse menos moléculas de enzima no meio de ensaio.

kcat1

kcat2 = 0

Km1

Km2

Km1= Km2

De acordo com o modelo (garantindo Km invariante) a afinidade entre a enzima e o substrato é igual nos casos da forma ligada e desligada do inibidor.

36

Um ligando diferente do substrato que se liga ao centro ativo é um inibidor isostérico (se se liga no centro ativo só pode inibir).

... mas se a ligação do inibidor ao sítio ativo for irreversível(não podendo ser “deslocado” por altas concentrações de substrato) as moléculas de enzima ligadas ao inibidor ficam excluídas do processo catalítico.

Se a ligação entre um inibidor isostérico e o centro ativofor reversível(se poder se “deslocado” pelo substrato) esse inibidor comporta-se funcionalmente como inibidor competitivo

Neste caso o inibidor comporta-se funcionalmente como não competitivo e é, frequentemente, usado o termo “inativador ”.

Page 10: Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo ...ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados...em velocidade de reação /volume de soro sanguíneo Porque as condições de ensaio

37

A lípase pancreática catalisa a hidrólise de triacilgliceróis no intestino.

No tratamento da obesidade pode usar-se um fármaco (orlistat; xenical)

que é um inativador(= inibidor

irreversível) da lípase pancreática.

O orlistat reage com uma serina (formando uma ligação covalente e irreversível) situada no centro ativo da enzima bloqueando a sua atividade.

3838

A par da classificação que divide os inibidores em competitivos e não competitivos existe uma outra que divide os modificadores (inibidores ou ativadores) em isostéricos ou alostéricos .

Um modificador isostérico liga-se ao centro activo e é sempre inibidor: é um inibidor isostérico.

Um ligando alostérico liga-se à enzima num sítio diferente do centro activo (um sítio alostérico) provocando uma alteração conformacional na enzima.

Se a alteração conformacional diminuir a atividade da enzima dizemos que há inibição alostérica.

Se a alteração conformacional aumentar a atividade da enzima dizemos que há ativação alostérica.

Sítios alostéricos

Ativador alostérico

Inibidor alostérico

39centro ativo

AMP

sítio alostérico

Fosforílase muscular na conformação tensa (inativa)

Fosforílase muscular na

AMP

O AMP liga-se à fosforílase muscular induzindo uma conformação mais ativa ⇔ o AMP é um ativador alostérico da fosforílase muscular.

conformação relaxada (ativa)

Glicose-1-P

CO2 + H2O40

Na cínase-1 da frutose-6-P (ATP+ Frutose-6-P→ ADP + Frutose-1,6-bisfosfato) o ATP é, simultaneamente, substrato e inibidor alostérico. Para concentrações fisiológicas de ATP, o AMP (e o ADP) é um ativador alostérico.

(2) Contudo, existe na enzima um sítio alostéricoonde o ATP se liga inibindo-a.Para concentrações fisiológicas de ATP essa ação inibidora é muito marcada.(1) Um dos substratos da cínase da frutose-6-P é o ATP.

(3) O AMP(e o ADP) compete com o ATP pelo mesmo sítio alostérico impedindo a sua ação inibidora.

Page 11: Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo ...ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados...em velocidade de reação /volume de soro sanguíneo Porque as condições de ensaio

Tal como no caso da ligação dos inibidores competitivos ao centro ativo também a ligação entre os modificadores (ativadores ou inibidores) alostéricos e os sítios alostéricos das enzimas é reversível e é de tipo não covalente .

Ativador alostérico

Inibidor alostérico

42

A modificação da atividade de uma enzima pode envolver a sua modificação covalente (hidrólise irreversível ou fosforilação reversível ) por ação catalítica de enzimas (normalmente outras enzimas).

Certas enzimas são ativadas por hidrólise irreversível.São exemplos a ativação dos zimogéniosna digestão dos nutrientes.

Tripsinogénio

Tripsina (ativa)

polipeptídeo inativo

+

H2O

Enteropeptídase

Exemplo 1: O tripsinogénio é segregado pelo pâncreas. Converte-se em tripsina (protéase digestiva) por ação da enteropeptídase (uma ectopeptídase presente no polo apical dos enterócitos).

Exemplo 2:

43

Exemplo:só a forma desfosforilada da desidrogénase do piruvato é ativa

Algumas enzimas são ativadas ou inibidas por fosforilações ou desfosforilações induzidas por outras enzimas em locais que nãosão o centro ativo*.

A cínase da desidrogénase do piruvato promove a inativação da desidrogénase do piruvato e a fosfátase da desidrogénase do piruvato promove a sua ativação.

* A denominação de centro alostérico para designar o local onde se dá esta modificação covalente não é consensual; a designação de local ou domínio regulador é mais comum.

44

O doseamento da atividade da desidrogénase do piruvat o pode ser feito em homogeneizados.

Se o homogeneizado é preparado na presença de inibidores quer da cínase (dicloroacetato) quer da fosfátase (fluoreto)

...quando se faz o ensaio mede-se a atividade efetiva (“actual”).

P

ATP

ADP

H2O

Pi

Na ausência de inibidor (fluoreto),a fosfátase do tecido transforma toda a desidrogénase do piruvato na sua forma ativa.

Se o homogeneizado é preparado na presença do inibidor da cínase (dicloroacetato) mas na ausência de fluoreto

...quando se faz o ensaio mede-se a atividade total.

No estudo in vitro de enzimas reguladas por fosforilação/desfosforilação podem usar-se inibidores das cínases e das fosfátases envolvidas.

Page 12: Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo ...ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados...em velocidade de reação /volume de soro sanguíneo Porque as condições de ensaio

45

A relevância para a regulação do metabolismo de uma ação moduladora da atividade detetada in vitro pode ser marcada se “o modulador” (substrato, ativador, etc.) variar muito no meio interno e pequena se variar pouco.

Exemplo 2:A atividade de muitas enzimas é modificada por alterações na concentração de ATP, mas a relevância disto na regulação do metabolismo normal pode ser questionada porque a concentração de ATP nas células é quase invariante em condições não patológicas.

Exemplo 1:A cínase da frutose é uma enzima hepática. Mas só está a catalisar a fosforilação de frutose se houver frutose.

Frutose-1-P

Cínase da frutose

Frutose

46

As concentrações dos intermediários do metabolismo variam de indivíduo para indivíduo e com o estado metabólico mas mantêm-se em torno de determinados valores. As concentrações dos intermediários do metabolismo dizem-se estacionárias.

Exemplo: A concentração de ATP (e a maioria dos outros compostos existentes nos seres vivos) considerando as várias reações em que intervém como reagente ou produto não está em equilíbrio químico.

...mas a velocidade do conjunto de reações que formam ATP é (quase) sempre igual à velocidade do conjunto de reações em que este se gasta...

⇒ existe nas células uma concentração estacionária de ATP.

Os mecanismosque permitem manter o ATP, os intermediários do metabolismo, a glicose do plasma, etc. em concentrações estacionárias são muito complexos e denominam-se de mecanismos homeostáticos.

Nutrientes

47

A regulação do metabolismo de modo a adaptar-se a diferentes condições (atividade ou descanso, jejum ou estado absortivo, diferentes tipos de dieta, diferentes graus de atividade física ao longo da vida, etc.) é uma condição de sobrevivência.

ATP

contração muscular

nutrientes

O2

ADP+Pi

ureia

CO2 + H2O

transporteativo

trabalhomecânico

Na+

Ca+

Estado absortivo= Glicemia↑

Estado de jejum = Glicemia↓

A adaptação a diferentes condições só é possível porque a atividade das enzimas se modifica quando se alteram essas condições.

glicose

48

As enzimas são sensores do ambiente onde se encontram variando a sua atividade em função de variações nesse ambiente.

As enzimas que catalisam reações fisiologicamente reversíveis catalisam a conversão líquida no sentido direto ou inverso de acordo com a lei da ação das massas,mas não são determinantes no sentido nem na velocidade de fluxo (J) da via metabólica.

As enzimas “marca-passo” de uma via metabólica catalisam reações fisiologicamente irreversíveis e a sua atividade determina a velocidade de fluxo nessa via metabólica.Estas enzimas (1) têm baixa atividade, (2) tem um papel determinante na regulação do metabolismo e (3) são controladas por efetores que só às vezes coincidem com os substratos e produtos.

A B1000

1010

S P0,01

10,01

Glicólise

Page 13: Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo ...ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados...em velocidade de reação /volume de soro sanguíneo Porque as condições de ensaio

49

Aumentar a atividade de uma enzima que catalisa uma reação “de desequilíbrio” (M2 →M3) pode significar um aumento transitório na concentração do intermediário M3 mas, a enzima a jusante que catalisa a conversão reversível M3 ↔ M4 rapidamente repõe a concentração de M3 num valor próximo do original.

J1 = (10) = (1010 – 1000) = 10

J2= (20) = (1020 – 1000) = 20

É na barragem que se controla o caudal (fluxo) de um rio. Mudanças no valor do fluxo (J) na barragem provocam mudanças de fluxo idênticas a montante e a jusante da barragem.

50

1- De instalação lenta (horas ou dias): a quantidade de enzima como a resultante das velocidades da sua síntese e da sua degradação.

Diferentes tipos de mecanismos podem participar na regulação das enzimas marca-passo das vias metabólicas:

2.1- Modificação alostérica (AMP, Ca2+…)

2.2- Modificação covalente (fosforilação e desfosforilação, clivagem hidrolítica…)

2.3- Ciclos de substratos (“fúteis”)

2.4- Acesso ao substrato por regulação do transporte transmembranar (GLUT4, CPT1…) e concentração de substratos

2- De instalação rápida

(segundos ou milissegundos):

3- De instalação rápida mas, geralmente, com papel menosimportante (pelo menos no metabolismo normal)

3.1- Inibição isostérica (competitiva) einibição pelo produto

3.2- pH 3.3- Temperatura

ATP

ADP

M

M-PH2O

Pi

M M

51

1- Mesmo quando o que varia é apenas a concentração da enzima E sem que tenha variado a atividade de cada uma das suas moléculas, se a velocidade da reação que a enzima E catalisa aumentou (/diminuiu), dizemos que a atividade enzímica da enzima E aumentou (/diminuiu). É um mecanismo de instalação lenta.

H2OSíntese proteica

v1

v2

Se a velocidade de síntese de uma determinada enzima (v1) é maior que a velocidade com que se degrada (hidrolisa) na célula (v2) a concentração e a atividade dessa enzima aumenta. Na condição inversa a concentração e a atividade da enzima diminuem.

v1 > v2 ⇒ v2 > v1 ⇒

RNAm

RNAm

52

2.1- A complexidade dos processos de regulação de enzimas induzida por hormonas e neurotransmissores tem levado a que a expressão “sítio alostérico” não se use neste contexto mesmo quando seria adequada.

O recetor da insulina pode ser visto como uma enzima alostérica com o seu centro alostérico ativador virado para o lado extracelular (onde se liga a insulina) e o centro ativo no lado citoplasmático.

A ligação da insulina induz uma alteração conformacional no recetor que se torna capaz de catalisar a fosforilação de resíduos tirosina de proteínas designadas de Substratos do Recetor da Insulina (IRS).

Efeitos da insulina

Insulina ligada ao seu recetor

Expressões equivalentes são: “domínio regulador”, “local de ligação da hormona/neurotransmissor ao recetor que tem atividade enzimática”.

Page 14: Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo ...ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados...em velocidade de reação /volume de soro sanguíneo Porque as condições de ensaio

53

2.2, 2.1 e 1- A controlo da atividade das enzimas pode envolver mais de um mecanismo sendo o conjunto dos mecanismos de análise complexa.

Ca2+

O Ca2+ entra nas fibras musculares quando estas são estimulas pelo nervo motor e um dos efeitos é a estimulação alostérica da fosfátase da desidrogénase do piruvato…

A insulina aumenta no sangue quando a glicemia aumenta: a insulina ativa a fosfátase e reprime o gene codificador da cínase da desidrogénase do piruvato…

O Ca2+ e a insulina estimulam a oxidação do piruvato.

54

glicose

Frutose-6-P

Frutose-1,6-bisP

CO2 + H2O

ATP

ADPH2O

Pi

v = 9 v = 10

Frutose-6-P

Frutose-1,6-bisP

CO2 + H2O

ATP

ADPH2O

Pi

v = 9 v = 100AMP

J=91;J=100-9

glicose

2.3- A existência de “ciclos de substrato ” (antigamente chamados de “fúteis”) permite amplificar o efeito de um sinal.

O AMP ativa a glicólise muscular porque estimula a cínase da frutose-6-P. Se este aumento for de 10 vezes, o facto de esta enzima fazer parte de um ciclo de substrato permite compreender que o aumento no fluxo (J) possa ser de 91 vezes.

J=1; J=10-9

J=1; J=10-9

J=91;J=100-9

55

2.4- A acessibilidade aos substratos. Nas fibras musculares a entrada de glicose (e a sua subsequente metabolização) é limitada pelo número de transportadores (GLUT4) presentes na membrana sarcoplasmática.

Contração muscular ou insulina

Quer o exercício físico quer a insulina estimulam a entrada de glicose para as fibras musculares porque nestas condições, de forma rápida, vesículas intracelulares contendo GLUT4 fundem-se com a membrana sarcoplasmática.

A insulina e o exercício físico estimulam a remoção da glicose do plasma para as células.

56

Concentrações de glicose possíveis

na veia porta

A entrada (GLUT2) e a fosforilação da glicose no fígado (cínase da glicose/hexocínase IV) é regulada diretamente pela concentração de glicose na veia porta e nos hepatócitos.

Ativ

idad

e do

GLU

T2 Concentrações

de glicose possíveis

no hepatócito

Ativ

idad

e d

a H

exo

cín

ase

IV

Quer o GLUT 2 quer a hexocínase IV são sensíveis às variações fisiológicas da concentração de glicose na veia porta e no citoplasma dos hepatócitos.

Page 15: Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo ...ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados...em velocidade de reação /volume de soro sanguíneo Porque as condições de ensaio

57

1- De instalação lenta: a quantidade de enzima como a resultante das velocidades da sua síntese e da sua degradação.

2.1- Controlo alostérico (AMP, Ca2+…)2.2- Modificação covalente 2.3- Ciclos de substratos (“fúteis”)2.4- Acesso ao substrato por regulação do transporte transmembranar

(GLUT4, CPT1…) e concentração de substrato

2- De instalação rápida:

3- De instalação rápida mas, geralmente, com papel menosimportante (pelo menos no metabolismo normal)

3.1- Inibição isostérica (competitiva) e inibição pelo produto

3.2- pH3.3- Temperatura

Estudamos até agora os mecanismos 1, 2.1, 2.2, 2.3 e 2.4. Falta referir os 3.1, 3.2 e 3.3.

58

∆G’ ≈ -18 kJ; Keq/QR ≈ 1000

3.1- O produto como inibidor das enzimas marca-passo. Na reação catalisada pela desidrogénase da glicose-6-P (via das pentoses-P) a reação inversa não existe mas o NADPH compete com o NADP+ pelo local de ligação deste no centro ativo (inibição isostérica e competitiva).

NADP+

NADPH

6-fosfo-gliconolactona

+NADP+

NADPHNADPH

A desidrogénase da glicose-6-fosfato é ativada sempre que a concentração intracelular de NADPH desce.

Para além de regulada ao nível da transcrição (a desidrogénase da glicose-6-P é induzida pela insulina) a descida da concentração intracelular de NADPH (um dos produtos) também estimula a atividade da enzima.

59

fosfodiestérase

H2O

Subunidades reguladoras

Subunidades catalíticas

Domínio semelhante aos substratos

Sítio ativo

ATP

PPi

AMP

AMPc

AMPc

A PKA (cínase de proteínas dependente do

AMPc) dissociada das unidades reguladoras é ativa e catalisa a fosforilação de enzimas…

PKA inativa (ligada e subunidades reguladoras)

A PKA é uma enzima que na forma inativa tem o seu sítio ativo bloqueado pela ligação a subunidades reguladoras que contêm um domínio “pseudosubstrato” (inibição isostérica e competitiva ). A ligação do AMP cíclico às subunidades reguladoras induz a dissociação das subunidades catalíticas que são ativas.

3.2- Pensa-se que a variação do pH não tem, em geral, um papel importante na regulação das enzimas intracelulares mas…

a) No estômago o pH do suco gástrico é ácido e as enzimas deste suco têm pH ótimo ácido.

b) O suco pancreático neutraliza o quimo ácido que vem do estômago(H+ + HCO3

- → CO2 + H2O)e as enzimas do suco pancreático e as enzimas digestivas intestinais têm pH ótimo neutro.

Page 16: Conceitos de “substrato de via metabólica”, coenzima, grupo ...ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados...em velocidade de reação /volume de soro sanguíneo Porque as condições de ensaio

61

3.3- No homem, a alteração de atividade das enzimas das células em situações de abaixamento da temperaturacorporal ou de febre poderá ser importante …mas não desempenha um papel relevante na regulação do metabolismo normal.

As enzimas e transportadores humanos (ao contrário do que acontece com outros seres vivos) foram selecionados de forma a manterem velocidades de fluxo adequadas à vida (nas vias anabólicas e catabólicas) numa estreita gama de temperaturas.

Francisco Lázaro(1888-1912)

Os órgãos para transplante são transportados a baixas temperaturas de forma a lentificar os processos catabólicos nomeadamente a hidrólise de proteínas (enzimas, transportadores, actina-miosina, etc.)

62

1. Rakus, D., Maciaszczyk, E., Wawrzycka, D., Ulaszewski, S., Eschrich, K. & Dzugaj, A. (2005) The origin of the high sensitivity of muscle fructose 1,6-bisphosphatase towards AMP, FEBS Lett. 579, 5577-81.

2. Sugden, M. C. & Holness, M. J. (2006) Mechanisms underlying regulation of the expression and activities of the mammalian pyruvate dehydrogenase kinases, Arch Physiol Biochem. 112, 139-49.

3. Veiga-da-Cunha, M., Courtois, S., Michel, A., Gosselain, E. & Van Schaftingen, E. (1996) Amino acid conservation in animal glucokinases. Identification of residues implicated in the interaction with the regulatory protein, J Biol Chem. 271, 6292-7.

4. Jeukendrup, A. E. (2002) Regulation of fat metabolism in skeletal muscle, Ann N Y Acad Sci. 967, 217-35.

5. Sterk, J. P., Stanley, W. C., Hoppel, C. L. & Kerner, J. (2003) A radiochemical pyruvate dehydrogenase assay: activity in heart, Anal Biochem. 313, 179-82.

6. Voet, D. & Voet, J. G. (2004) Biochemistry, 3rd edn, John Wiley and Sons, Inc., USA.

7. Nelson, D. L. & Cox, M. M. (2005) Lenhinger principles of biochemistry, 4ª edn, New York.

8. Thorens, B. (1996) Glucose transporters in the regulation of intestinal, renal, and liver glucose fluxes, Am J Physiol. 270, G541-53.

Bibliografia utilizada: