cinética enzimática_2012

Cintica EnzimticaDenise Godoy

Universidade do Estado do Rio de JaneiroProcessos Bioqumicos

ENZIMAS

Introduo

O conhecimento das propriedades cinticas das enzimas importante para compreender as transformaes que ocorrem no interior das clulas que participam dos processos fermentativos e tambm dos reatores enzimticos.

Introduo

ENZIMA APLICAO

Proteases *Fabricao de aspartame*Obteno de insulina humana a partir de insulina suna

Amilase (Bacillus subtilis) *Indstria de fermentao alcolica *Produo de glicose

Tripsina (pncreas animal) Amolecimento de carnes

Papana (mamo) e Bromelina (abacaxi) *Auxiliar digestivo *Amolecimento de carnes

Pepsina (estmago animal) Auxiliar digestivo

Renina (estmago de bezerros) Fabricao de queijo

Pectinase (Aspergilus niger) Retirada de pectina na clarificao de sucos de frutas

Tabela 1: Enzimas aplicadas na indstria

Introduo

Enzimas so protenas (seqncia de aminocidos) com peso molecular muito grande, e com propriedades catalticas. Na maioria das vezes so protenas globulares

http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/prot/estruc.html

Caractersticas Produtos naturais biolgicos;

Alto grau de especificidade;

Reaes baratas e seguras;

Mecanismo turnover: desempenha funesconsecutivas;

Altamente eficientes: aceleram a velocidade dasreaes 108 a 1011 vezes;

Econmicas: reduz a energia de ativao.

Caractersticas

mostrado na tabela 2 uma comparao entre as caractersticas das enzimas e dos catalisadores inorgnicos.

Caractersticas

CARACTERSTICA ENZIMAS CATALISADORES QUMICOS

1 Especificidade ao substrato Alta Baixa2 Natureza da estrutura Complexa Simples3 Sensibilidade temperatura Alta Baixa4 Condies de reao (T, P e pH) Suaves Drsticas (geralmente)5 Custo de obteno (isolamento epurificao)

Alto Moderado

6 Natureza do processo Batelada/contnuo Batelada/contnuo7 Consumo de energia Baixo Alto8 Formao de subprodutos Baixa Alta9 Reutilizao do catalisador Simples/cara Simples10 Atividade cataltica (temperaturaambiente)

Alta Baixa

11- Presena de cofatores Sim No12 Energia de ativao Baixa Alta13 Velocidade de reao Alta Baixa

Tabela 2: Comparao entre as enzimas e os catalisadores inorgnicos.

Caractersticas Stio ativo: regio especfica da superfcie

Constituda por grupos R de aminocidos; Especificidade catalise enzimtica.

Especificidade Enzimtica

A caracterstica mais importante das enzimas a elevada especificidade.

Muitas enzimas possuem um grupo limitado de substratos, mas outras possuem uma especificidade absoluta para um nico substrato.

Especificidade Enzimtica

http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/enz/conform.htmlhttp://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/enz/quim.html

Especificidade Enzimtica Como exemplo de especificidade enzimtica pode ser tomado a

hidrlise enzimtica do amido:

-amilase atua na amilose rompendo a ligao -1,4 produzindo maltose e glicose.

-glicosidase atua na -1,6 produzindo amilose. Com a atuao das duas enzimas no amido produzido maltose e

a glicose. Amiloglicosidase ( ou glicoamilase ) atua na -1,6 e -1,4 de forma

a produzir tambm maltose e glicose a partir do amido.

Velocidade das ReaesE + S ES EP E + P

Catalisador: velocidade da reao NOafetam o equilbrio.

Diagrama de coordenadas da reao:

http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/enz/e-t.html

Atividade Enzimtica Medida da atividade velocidade da reao;

Dosagem Amostra + concentraes de substrato; Velocidade da reao Unidades

Internacionais (U); U = quantidade de enzima capaz de formar 1 mol de P por minuto em condies timas;

Atividade especfica = Umg de protena

Influncia do pH Valor de pH timo = atividade mxima;

Velocidade da reao: pH afasta do timo;

Influncia do pH

pH 5 e 8 = no afeta a atividade;

Declnio entre pH 6,8-8 e 6,8-5 = forma inica no adequada;

5 > pH > 8 = inativao irreversvel.

Influncia da Temperatura T velocidade de reao = energia

cintica;

T muito elevadas = desnaturao da enzima Rompidas as pontes de hidrognio alteraes

estruturas = nova conformao; T desnaturao pouco acima da T tima.

Influncia da TemperaturaInfluncia da Temperatura

Enzimas so termolbeis reaoenzimtica = inativao trmina

Efeito da T na velocidade das reaes coeficiente de temperatura

Velocidade quando a T 10C.

10log3,2 1012 QTTREa

RTekk

'0'

CINTICA ENZIMTICA

Objetivos Medir velocidade das transformaes;

Estudar a influncia das condies de trabalho;

Correlacionar: velocidades fatores;

Otimizao do processo;

Critrios para o controle;

Projetar o reator mais adequado.

Influncia do Substrato Concentrao de substrato [S]: afeta a

velocidade da reao;

Efeito de [S]: varia durante o curso de umareaoS P;

Velocidade inicial (V0): [S] >> [E] tempomuito curto [S] = constante.

Influncia do Substrato

[E] = cte

[S] = V0 linear

[S] = V0

V0 = Vmx

Influncia do Substrato Alguns casos a V0 no pode ser medida No existe tcnica experimental; Equao qumica no representa a

transformao;

Velocidade da reao: Velocidade mdia de consumo ou produo; Variao de uma propriedade no sistema.

Influncia do Substrato

Vitor Henri (1903): E liga-se ao S para formar ES passo obrigatrio;

Leonor Michaelis e Maud Menten (1913) E combina-se reversivelmente com SES

k1E + S ES k-1

ES se rompe E e Pk2

ES E + P

Influncia do Substrato Qualquer instante da reao: E e ES;

[S] = velocidade da reao [S];

Vmx = todas as molculas de E estiverem naforma ES enzima saturada;

[S]: estado pr-estacionrio ES; Estado estacionrio [ES] = cte; V0 estado estacionrio.

Equao Michaelis-Menten

Curva: possui amesma forma para amaioria das enzimas;

Expressa pelaEquao de Michaelise Menten;

Hiptese: limitante quebra de ES E + P.

Equao Michaelis-Menten Equao da velocidade para uma reao

catalisada enzimaticamente e com um nicosubstrato;

Relao quantitativa entre a V0, a Vmx e a [S]inicial relacionadas atravs de Km.

SKSVV

m

mx

0

Equao Michaelis-Menten

Relao numrica:V0 metade de Vmx;

km = afinidade pelosubstrato; KKmm afinidadeafinidade

mxVV 21

0

Vmx proporcional [E].

Significado de Km e Vmx Equao Michaelis e Menten = dependncia

hiperblica;

Mecanismos de reao diferentes catalisamreaes com 6 ou 8 passos;

Significado e magnitude de Vmx e Km varia;

Km: depende de aspectos especficos domecanismo de reao.

Parmetros Cinticos Lineweaver-Burk

mxmxm

VSVK

V111

Parmetros Cinticos Mtodo de Hanes S

VVK

VS

mxmx

m 1

Parmetros CinticosParmetros Cinticos

Mtodo de Eadie-Scatchard SV

KVV mmx

Parmetros Cinticos Exemplo:

[S] (g/L) Vo (g/L.h)0,25 0,780,51 1,251,03 1,662,52 2,194,33 2,357,25 2,57

0,0

1,0

2,0

3,0

0 2 4 6 8[S] (g/L)

Vo

(g/L

.h)


Exemplo: Lineweaver-Burk

y = 0,228x + 0,3668R2 = 0,9991

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

0 1 2 3 4 51/[S] (L/g)

1/Vo

(L.h

/g)

LgK

VK

hLgV

V

SV

VSVK

V

mmx

m

mxmx

mxmx

m

622,0228,0

73,23668,01Portanto,

3668,01228,01

111

0

0


Exemplo: Mtodo de Hanes

y = 0,3595x + 0,2419R2 = 0,9993

0,00,51,01,52,02,53,0

0 2 4 6 8[S] (g/L)

[S]/V

o (h

)

LgK

VK

hLgV

V

SVS

SVV

KVS

mmx

m

mxmx

mxmx

m

672,02419,0

78,23595,01Portanto,

3595,02419,0

1

0

0

Reao de 1 Ordem

[S]

Reao de 1 Ordem

Determinar S utilizadoou P formado durantequalquer intervalo detempo Equaointegrada de 1 ordem.

0

0log3,2 ttkSS

Reao de 1 Ordem

t1/2 = tempo demeia vida temponecessrio paraconverter em Pmetade do Spresente.

kt 693,0

21

Reao de Ordem Zero

[S] >> Km

S

SVV mx0

mxVV 0

Inibio Enzimtica

Inibio Enzimtica

Um inibidor uma substncia que reduz a atividade de uma enzima.

H 2 tipos de inibio: Reversvel Irreversvel

Inibio Enzimtica

Inibio Irreversvel O inibidor se liga covalentemente ao stio ativo da

enzima. Ele pode agir de modo a destruir o stio ativo.

Inibio Enzimtica Inibio Reversvel Ligao no-covalente ao stio ativo da enzima.

A atividade pode ser restaurada removendo o inibidor. Inibio Competitiva (IC) Inibio Acompetitiva (IA) Inibio No-Competitiva (INC) Inibio pelo Substrato

E + S ES E + Pkb

k-b

kcat

+I

ki

EI

+I

ki

EIS

IC

IA

+ S

INC

Inibio Enzimtica Inibio Competitiva

Afeta a afinidade ES; muda o km mas no muda Vmx;

S e I competem pelo mesmo stio de ligao; I e S so mutuamente excludentes por

impedimento estrico; A ligao do I ou do S provoca mudana de

conformao que no permite a ligao de outro S ou I, logo no tem a possibilidade de forma ESI.


0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 500

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

s, g/L

v, 1

/hcom inibio competitiva

alfa=0 alfa=2 alfa=4 alfa=6 alfa=8 alfa=10

Inibio Enzimtica Inibio Acompetitiva


0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

s, g/L

v, 1

/hCom inibio acompetitiva

alfa=1 alfa=2 alfa=4 alfa=6 alfa=8 alfa=10

Inibio Enzimtica Inibio No-competitiva


0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 500

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

s, g/L

v, 1

/h

Com inibio no-competitiva

alfa=alfai alfa=2 alfai=1.5alfa=4 alfai=3 alfa=6 alfai=5 alfa=8 alfai=6.5alfa=10 alfa=8

Inibio Enzimtica Inibio pelo Substrato

Ocorre em altas concentraes de substrato em 20% de todas as enzimas conhecidas (p. ex., a invertase inibida pela sacarose). causado por mais de uma molcula se ligando a diferentes substios do stio ativo. Se o complexo resultante inativo, esse tipo de inibio causa uma reduo na taxa de reao.

Inibio Enzimtica Inibio pelo Substrato

cinética enzimática_2012

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