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Cintica EnzimticaDenise Godoy
Universidade do Estado do Rio de JaneiroProcessos Bioqumicos
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ENZIMAS
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Introduo
O conhecimento das propriedades cinticas das enzimas importante para compreender as transformaes que ocorrem no interior das clulas que participam dos processos fermentativos e tambm dos reatores enzimticos.
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Introduo
ENZIMA APLICAO
Proteases *Fabricao de aspartame*Obteno de insulina humana a partir de insulina suna
Amilase (Bacillus subtilis) *Indstria de fermentao alcolica *Produo de glicose
Tripsina (pncreas animal) Amolecimento de carnes
Papana (mamo) e Bromelina (abacaxi) *Auxiliar digestivo *Amolecimento de carnes
Pepsina (estmago animal) Auxiliar digestivo
Renina (estmago de bezerros) Fabricao de queijo
Pectinase (Aspergilus niger) Retirada de pectina na clarificao de sucos de frutas
Tabela 1: Enzimas aplicadas na indstria
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Introduo
Enzimas so protenas (seqncia de aminocidos) com peso molecular muito grande, e com propriedades catalticas. Na maioria das vezes so protenas globulares
http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/prot/estruc.html
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Caractersticas Produtos naturais biolgicos;
Alto grau de especificidade;
Reaes baratas e seguras;
Mecanismo turnover: desempenha funesconsecutivas;
Altamente eficientes: aceleram a velocidade dasreaes 108 a 1011 vezes;
Econmicas: reduz a energia de ativao.
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Caractersticas
mostrado na tabela 2 uma comparao entre as caractersticas das enzimas e dos catalisadores inorgnicos.
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Caractersticas
mostrado na tabela 2 uma comparao entre as caractersticas das enzimas e dos catalisadores inorgnicos.
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Caractersticas
CARACTERSTICA ENZIMAS CATALISADORES QUMICOS
1 Especificidade ao substrato Alta Baixa2 Natureza da estrutura Complexa Simples3 Sensibilidade temperatura Alta Baixa4 Condies de reao (T, P e pH) Suaves Drsticas (geralmente)5 Custo de obteno (isolamento epurificao)
Alto Moderado
6 Natureza do processo Batelada/contnuo Batelada/contnuo7 Consumo de energia Baixo Alto8 Formao de subprodutos Baixa Alta9 Reutilizao do catalisador Simples/cara Simples10 Atividade cataltica (temperaturaambiente)
Alta Baixa
11- Presena de cofatores Sim No12 Energia de ativao Baixa Alta13 Velocidade de reao Alta Baixa
Tabela 2: Comparao entre as enzimas e os catalisadores inorgnicos.
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Caractersticas Stio ativo: regio especfica da superfcie
Constituda por grupos R de aminocidos; Especificidade catalise enzimtica.
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Especificidade Enzimtica
A caracterstica mais importante das enzimas a elevada especificidade.
Muitas enzimas possuem um grupo limitado de substratos, mas outras possuem uma especificidade absoluta para um nico substrato.
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Especificidade Enzimtica
http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/enz/conform.htmlhttp://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/enz/quim.html
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Especificidade Enzimtica Como exemplo de especificidade enzimtica pode ser tomado a
hidrlise enzimtica do amido:
-amilase atua na amilose rompendo a ligao -1,4 produzindo maltose e glicose.
-glicosidase atua na -1,6 produzindo amilose. Com a atuao das duas enzimas no amido produzido maltose e
a glicose. Amiloglicosidase ( ou glicoamilase ) atua na -1,6 e -1,4 de forma
a produzir tambm maltose e glicose a partir do amido.
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Velocidade das ReaesE + S ES EP E + P
Catalisador: velocidade da reao NOafetam o equilbrio.
Diagrama de coordenadas da reao:
http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/enz/e-t.html
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Atividade Enzimtica Medida da atividade velocidade da reao;
Dosagem Amostra + concentraes de substrato; Velocidade da reao Unidades
Internacionais (U); U = quantidade de enzima capaz de formar 1 mol de P por minuto em condies timas;
Atividade especfica = Umg de protena
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Influncia do pH Valor de pH timo = atividade mxima;
Velocidade da reao: pH afasta do timo;
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Influncia do pH
pH 5 e 8 = no afeta a atividade;
Declnio entre pH 6,8-8 e 6,8-5 = forma inica no adequada;
5 > pH > 8 = inativao irreversvel.
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Influncia da Temperatura T velocidade de reao = energia
cintica;
T muito elevadas = desnaturao da enzima Rompidas as pontes de hidrognio alteraes
estruturas = nova conformao; T desnaturao pouco acima da T tima.
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Influncia da TemperaturaInfluncia da Temperatura
Enzimas so termolbeis reaoenzimtica = inativao trmina
Efeito da T na velocidade das reaes coeficiente de temperatura
Velocidade quando a T 10C.
10log3,2 1012 QTTREa
RTekk
'0'
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CINTICA ENZIMTICA
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Objetivos Medir velocidade das transformaes;
Estudar a influncia das condies de trabalho;
Correlacionar: velocidades fatores;
Otimizao do processo;
Critrios para o controle;
Projetar o reator mais adequado.
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Influncia do Substrato Concentrao de substrato [S]: afeta a
velocidade da reao;
Efeito de [S]: varia durante o curso de umareaoS P;
Velocidade inicial (V0): [S] >> [E] tempomuito curto [S] = constante.
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Influncia do Substrato
[E] = cte
[S] = V0 linear
[S] = V0
V0 = Vmx
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Influncia do Substrato Alguns casos a V0 no pode ser medida No existe tcnica experimental; Equao qumica no representa a
transformao;
Velocidade da reao: Velocidade mdia de consumo ou produo; Variao de uma propriedade no sistema.
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Influncia do Substrato
Vitor Henri (1903): E liga-se ao S para formar ES passo obrigatrio;
Leonor Michaelis e Maud Menten (1913) E combina-se reversivelmente com SES
k1E + S ES k-1
ES se rompe E e Pk2
ES E + P
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Influncia do Substrato Qualquer instante da reao: E e ES;
[S] = velocidade da reao [S];
Vmx = todas as molculas de E estiverem naforma ES enzima saturada;
[S]: estado pr-estacionrio ES; Estado estacionrio [ES] = cte; V0 estado estacionrio.
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Equao Michaelis-Menten
Curva: possui amesma forma para amaioria das enzimas;
Expressa pelaEquao de Michaelise Menten;
Hiptese: limitante quebra de ES E + P.
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Equao Michaelis-Menten Equao da velocidade para uma reao
catalisada enzimaticamente e com um nicosubstrato;
Relao quantitativa entre a V0, a Vmx e a [S]inicial relacionadas atravs de Km.
SKSVV
m
mx
0
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Equao Michaelis-Menten
Relao numrica:V0 metade de Vmx;
km = afinidade pelosubstrato; KKmm afinidadeafinidade
mxVV 21
0
Vmx proporcional [E].
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Significado de Km e Vmx Equao Michaelis e Menten = dependncia
hiperblica;
Mecanismos de reao diferentes catalisamreaes com 6 ou 8 passos;
Significado e magnitude de Vmx e Km varia;
Km: depende de aspectos especficos domecanismo de reao.
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Parmetros Cinticos Lineweaver-Burk
mxmxm
VSVK
V111
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Parmetros Cinticos Mtodo de Hanes S
VVK
VS
mxmx
m 1
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Parmetros CinticosParmetros Cinticos
Mtodo de Eadie-Scatchard SV
KVV mmx
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Parmetros Cinticos Exemplo:
[S] (g/L) Vo (g/L.h)0,25 0,780,51 1,251,03 1,662,52 2,194,33 2,357,25 2,57
0,0
1,0
2,0
3,0
0 2 4 6 8[S] (g/L)
Vo
(g/L
.h)
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Parmetros CinticosParmetros Cinticos
Exemplo: Lineweaver-Burk
y = 0,228x + 0,3668R2 = 0,9991
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
0 1 2 3 4 51/[S] (L/g)
1/Vo
(L.h
/g)
LgK
VK
hLgV
V
SV
VSVK
V
mmx
m
mxmx
mxmx
m
622,0228,0
73,23668,01Portanto,
3668,01228,01
111
0
0
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Parmetros CinticosParmetros Cinticos
Exemplo: Mtodo de Hanes
y = 0,3595x + 0,2419R2 = 0,9993
0,00,51,01,52,02,53,0
0 2 4 6 8[S] (g/L)
[S]/V
o (h
)
LgK
VK
hLgV
V
SVS
SVV
KVS
mmx
m
mxmx
mxmx
m
672,02419,0
78,23595,01Portanto,
3595,02419,0
1
0
0
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Reao de 1 Ordem
[S]
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Reao de 1 Ordem
Determinar S utilizadoou P formado durantequalquer intervalo detempo Equaointegrada de 1 ordem.
0
0log3,2 ttkSS
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Reao de 1 Ordem
t1/2 = tempo demeia vida temponecessrio paraconverter em Pmetade do Spresente.
kt 693,0
21
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Reao de Ordem Zero
[S] >> Km
S
SVV mx0
mxVV 0
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Inibio Enzimtica
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Inibio Enzimtica
Um inibidor uma substncia que reduz a atividade de uma enzima.
H 2 tipos de inibio: Reversvel Irreversvel
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Inibio Enzimtica
Inibio Irreversvel O inibidor se liga covalentemente ao stio ativo da
enzima. Ele pode agir de modo a destruir o stio ativo.
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Inibio Enzimtica Inibio Reversvel Ligao no-covalente ao stio ativo da enzima.
A atividade pode ser restaurada removendo o inibidor. Inibio Competitiva (IC) Inibio Acompetitiva (IA) Inibio No-Competitiva (INC) Inibio pelo Substrato
E + S ES E + Pkb
k-b
kcat
+I
ki
EI
+I
ki
EIS
IC
IA
+ S
INC
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Inibio Enzimtica Inibio Competitiva
Afeta a afinidade ES; muda o km mas no muda Vmx;
S e I competem pelo mesmo stio de ligao; I e S so mutuamente excludentes por
impedimento estrico; A ligao do I ou do S provoca mudana de
conformao que no permite a ligao de outro S ou I, logo no tem a possibilidade de forma ESI.
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Inibio Enzimtica Inibio Competitiva
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Inibio Enzimtica Inibio Competitiva
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Inibio Enzimtica Inibio Competitiva
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Inibio Enzimtica Inibio Competitiva
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 500
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
s, g/L
v, 1
/hcom inibio competitiva
alfa=0 alfa=2 alfa=4 alfa=6 alfa=8 alfa=10
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Inibio Enzimtica Inibio Competitiva
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Inibio Enzimtica Inibio Acompetitiva
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Inibio Enzimtica Inibio Acompetitiva
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
s, g/L
v, 1
/hCom inibio acompetitiva
alfa=1 alfa=2 alfa=4 alfa=6 alfa=8 alfa=10
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Inibio Enzimtica Inibio Acompetitiva
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Inibio Enzimtica Inibio No-competitiva
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Inibio Enzimtica Inibio No-competitiva
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 500
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
s, g/L
v, 1
/h
Com inibio no-competitiva
alfa=alfai alfa=2 alfai=1.5alfa=4 alfai=3 alfa=6 alfai=5 alfa=8 alfai=6.5alfa=10 alfa=8
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Inibio Enzimtica Inibio No-competitiva
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Inibio Enzimtica Inibio pelo Substrato
Ocorre em altas concentraes de substrato em 20% de todas as enzimas conhecidas (p. ex., a invertase inibida pela sacarose). causado por mais de uma molcula se ligando a diferentes substios do stio ativo. Se o complexo resultante inativo, esse tipo de inibio causa uma reduo na taxa de reao.
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Inibio Enzimtica Inibio pelo Substrato