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ELAINE FLAMIA TONIOLO

Caracterização da Hemopressina (agonista inverso de receptores canabinóides do tipo 1) na neuropatia

diabética experimental

São Paulo

2015

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de

Doutor em Ciências.

ELAINE FLAMIA TONIOLO

Caracterização da Hemopressina (agonista inverso de receptores canabinóides do tipo 1) na neuropatia

diabética experimental

São Paulo

2015

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências. Área de concentração: Farmacologia Orientadora: Camila Squarzone Dale Versão original

DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)

Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do

Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo

© reprodução total

Toniolo, Elaine Flamia. Caracterização da Hemopressina (agonista inverso de receptores canabinóides do tipo 1) na neuropatia diabética experimental / Elaine Flamia Toniolo. -- São Paulo, 2015. Orientador: Profa. Dra. Camila Squarzone Dale. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Farmacologia. Área de concentração: Farmacologia. Linha de pesquisa: Estudo do efeito antinociceptivo da hemopressina, um agonista inverso de receptores canabinóides do tipo 1. Versão do título para o inglês: Characterization of Hemopressin (inverse agonist of the cannabinoid receptor type1) in experimental diabetic neuropathy. 1. Hemopressina 2. Receptores CB1 3. Neuropatia diabética 4. Dor I. Dale, Profa. Dra. Camila Squarzone II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia III. Título.

ICB/SBIB099/2015

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

______________________________________________________________________________________________________________

Candidato(a): Elaine Flamia Toniolo.

Título da Tese: Caracterização da Hemopressina (agonista inverso de receptores canabinóides do tipo 1) na neuropatia diabética experimental.

Orientador(a): Profa. Dra. Camila Squarzone Dale.

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão

pública realizada a ................./................./................., considerou

( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)

Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................... Nome: .......................................................................................................

Instituição: ................................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: .......................................................................................................

Instituição: ................................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................

Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................

Presidente: Assinatura: ................................................................................................

Nome: .......................................................................................................

Instituição: ................................................................................................

DEDICATÓRIA

Dedico esta tese a pessoas de fundamental importância em minha vida. Aos

meus pais, José Cleto Toniolo e Maria Olinda Flamia Toniolo que nunca

mediram esforços para que eu pudesse buscar todos meus objetivos,

mesmo que para isso fosse necessário passar por muitas privações. A

minha irmã Alessandra Flamia Toniolo, que sempre me incentivou e

acreditou que fosse capaz de conquistar tudo o que desejasse. Ao meu

companheiro Thiago, que esteve ao meu lado me ajudando a superar todas

as angustias, por toda sua dedicação durante todos esses anos, e acima de

tudo pela sua amizade e cumplicidade. Em memória do meu avô Demétrio

Toniolo que sempre me ensinou a acreditar que todos os nossos sonhos são

possíveis de se realizar. Obrigada a todos. Amo muito vocês!

AGRADECIMENTOS

Ao Laboratório de Neuromodulação da Dor, do Departamento de Anatomia do

Instituto de Ciência Biomédicas – Universidade de São Paulo.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de nível Superior (CAPES), à

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP –

2012/50176-5) e Instituto de Ensino e Pesquisa do Hospital Sírio Libanês pelo

apoio financeiro.

A minha Orientadora e amiga Dra. Camila Squarzoni Dale por sua orientação e

atenção no decorrer do desenvolvimento de todo o trabalho e por todas as

oportunidades proporcionadas nesse período.

A todos os membros do Laboratório de Neuromodulação da Dor (Adriano

Cardozo Franciosi, que por incansáveis vezes me ajudou nas extrações dos

tecidos e na quantificação da mielina, além das discussões de artigos e sem

dúvida alguma pela imensa amizade desses 8 anos; Luiz Fábio Dimov, Laura

Yamashita, Patrícia Brigatte, João Inácio Ferrara Júnior, Tabatha Novikov do

Amaral e Regina Paula Bonifácio por completarem esse time sensacional,

proporcionando um ótimo ambiente de trabalho).

A Dra. Lakshmi Devi do Mount Sinai Hospital – Pharmacology and Systems

Terapeutics Departments – New York, por ter me recebido em seu laboratório

para a realização do meu Doutorado Sanduíche e pela orientação dada nesse

período. Além de todos as pessoas de seu laboratório que muito me ajudaram,

além da amizade e companheirismo (Ivone Gomes, Achla Gupta, Wakako

Fujita, Erin Bobeck, Jen Stockert e Darlene Pena).

A todos da minha família que sempre acreditaram na minha capacidade e

torceram por mim em todas as etapas, principalmente aos meus pais e meus

avós (Demétrio, Ignez, Nilson e Ana).

A todos da Secretaria do Departamento de Farmacologia: Mônica, Miriam e

Camila, que sempre estavam dispostas a ajudar. Além de todos os demais

funcionários do Programa de Pós-Graduação do Departamento de

Farmacologia e Anatomia.

Ao Departamento de Farmacologia do Instituto de Ciências Biomédicas da

Universidade de São Paulo.

RESUMO

Toniolo EF. Caracterização da Hemopressina (agonista inverso dereceptores canabinóides do tipo 1) na neuropatia diabética experimental.São Paulo: Instituto de Ciências Biomédica, Universidade de São Paulo; 2015.

A neuropatia periférica diabética (NPD) causada por diabetes mellitus é uma das complicações mais prevalentes, atingindo cerca de 50% dos pacientes portadores da doença. Entre os múltiplos sintomas desta neuropatia, o desenvolvimento da dor crônica é uma das maiores complicações, uma vez que seu surgimento é oriundo de componentes multifatoriais, que ainda hoje são pouco compreendidos. Essa NPD é caracterizada por dor espontânea e estímulos evocados, com alterações na percepção dolorosa, aumentando a hiperalgesia e alodínia. Embora exista progresso no desenvolvimento de novos analgésicos, a necessidade de agentes terapêuticos capazes de bloquear a sensação dolorosa anormal sem afetar as habilidades normais dos pacientes diabéticos ainda não foi encontrada. Os receptores canabinóides do tipo 1 (RCB1) são, dentre os membros da família dos receptores acoplados à proteína G, um dos mais abundantes no sistema nervoso central, além disso, os RCB1 são os principais responsáveis pelo efeito dos canabinóides nas vias nociceptivas, sendo demonstrada a expressão desses receptores em áreas envolvidas na transmissão e processamento nociceptivo, tais como substância cinzenta periaquedutal, córtex cingulado anterior, tálamo, bulbo ventromedial rostral, medula espinal e no gânglio da raiz posterior. A Hemopressina (Hp), um nonapeptídeo (PVNFKFLSH) isolado da cadeia alfa da hemoglobina, é um agonista inverso do RCB1, que induz antinocicepção em roedores submetidos a diferentes modelos de nocicepção experimental. Neste trabalho investigamos o efeito do tratamento oral crônico com Hp (2,5 mg/Kg, por 28 dias) sobre a neuropatia diabética de camundongos submetidos ao modelo de diabetes induzido por injeção de estreptozotocina (STZ - 200mg/kg). Os resultados obtidos demonstraram que o tratamento com Hp reverteu a hipersensibilidade mecânica dos animais avaliados pelo teste de von Frey a partir do 7º dia de avaliação que perdurou por pelo menos 28 dias, sem interferir com a sensibilidade térmica, com os níveis glicêmicos ou com o peso dos animais. O efeito do tratamento com Hp mostrou envolver a participação de RCB1, astrócitos e microglia em nível espinal, avaliados por imunofluorescência. Ainda, a análise histológica do nervo isquiático dos animais demonstrou que o tratamento com Hp evitou a desmielinização nos animais diabéticos, e auxiliou a manutenção dos níveis do NGF avaliado por ELISA. Também foi avaliado o efeito da Hp em camundongos Knockout para os receptores Mu (KO MOR) e Delta (KO DOR) opióides e seus respectivos controles selvagens (WT), submetidos ou não a neuropatia diabética. Os resultados obtidos demonstraram que a hemopressina inibe a sensibilidade térmica nos animais KO MOR e mecânica nos animais diabéticos WT e KO MOR ou KO DOR, avaliados pelo teste de retirada da cauda e por filamentos de von Frey respectivamente. A análise por imunofluorescência da participação da dimerização de RCB1-Mu e RCB1-Delta na coluna posterior da medula espinal nos animais diabéticos sugerem que a Hp participa do controle da

sensibilidade mecânica em animais KO MOR demonstrado pelo aumento da dimerização de RCB1-DOR. Em conjunto, os dados aqui obtidos revelam a Hp como um forte candidato para fins terapêuticos no tratamento da neuropatia diabética. Palavras-chave: Hemopressina. Receptores CB1. Neuropatia diabética. Dor.

ABSTRACT

Toniolo EF. Characterization of Hemopressin (inverse agonist of the cannabinoid receptor type 1) in experimental diabetic neuropathy. [Ph. D. Thesis (Pharmacology)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédica, Universidade de São Paulo; 2015.

Peripheral neuropathy diabetic (PND) caused by diabetes mellitusis is one of the most prevalent complications, affecting about 50% of patients with this disease. Among the many symptoms of this neuropathy, the development of chronic pain is one of the major complications, since its emergence comes from multifactorial components, which are still poorly understood. This PND is characterized by spontaneous pain and evoked stimuli, with changes in painful perception, increased hyperalgesia and allodynia. Although there is progress in the development of new analgesics, the need of therapeutic agents capable of blocking the abnormal painful sensation without affecting the normal skills of diabetic patients still has not been found. Type 1 cannabinoid receptors (CB1R) are among the members of the family of G-protein coupled receptors, one of the most abundant in the central nervous system, furthermore, RCB1 are primarily responsible for the effect of cannabinoids in nociceptive pathways, and the expression of these receptors is observed in areas involved in the transmission and nociceptive processing such as periaqueductal gray, anterior cingulate cortex, thalamus, rostral ventromedial bulb, spinal cord and dorsal root ganglia. Hemopressin (Hp) a nonapeptide (PVNFKFLSH) isolated from hemoglobin alpha chain, is an inverse agonist CB1R, which induces antinociception in rodents subjected to different experimental models of nociception. In this study we investigated the effect of chronic oral treatment with Hp (2.5 mg / kg for 28 days) on diabetic neuropathy in mice subjected to streptozotocin-induced diabetes model (STZ - 200 mg / kg). Results demonstrated that Hp treatement reversed the mechanical hypersensitivity of animals evaluated by the von Frey test from the 7th day of evaluation for at least 28 days, without interfering with the thermal sensitivity, with glucose levels or the weight loss of animals. The effect of Hp showed to involve the participation of RCB1, astrocytes and microglia in the spinal level, evaluated by immunofluorescence. Also, the histological analysis of the sciatic nerve of animals showed that treatment with Hp prevented demyelination in diabetic animals, and assisted in mantaining the levels of NGF evaluated by ELISA. The effect of Hp in Knockout mice for Mu (KO MOR) and Delta (KO DOR) opioid receptors and their respective wild type controls (WT), submitted or not diabetic neuropathy, was also evaluated. The results showed that Hp inhibits thermal sensitivity of KO MOR animals and mechanical sensitivity of diabetic animals, assessed by the tail flick test and by von Frey filaments, respectively. The immunofluorescence analysis of the involvement of CB1R-Mu and CB1R-Delta dimerization in the dorsal horn of the spinal cord of diabetic animals suggest that Hp participates in the control of mechanical sensitivity on KO MOR animals demonstrated by the increase in CB1R-DOR dimerization. Taken together, the data obtained herein shows Hp

as a strong candidate for therapeutic purposes in the treatment of diabetic neuropathy. Keywords: Hemopressin. CB1 receptors. Diabetic neuropathy. Pain.

LISTA DE SIGLAS

AC Adenilato ou Adenilil Ciclase

ACC Anterior Cingulate Cortex / Córtex Cingulado Anterior

ATP Adenosina trifosfato ou Trifosfato de adenosina

cAMP Cyclic Monophosphatase / Adenosina 3',5'- Monofosfato Cíclico

BSA Bovine Serum Albumin / Albumina do Soro Bovino

Ca+2 Cálcio

Canal HCN Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels

Canal Kv Canal de Potássio Voltagem-Dependentes

Canal Nav Canal de Sódio Voltagem-Dependente

CB1R Cannabinoid Receptor Type 1 / Receptor Canabinóide do Tipo 1

CB2R Cannabinoid Receptor Type 2 / Receptor Canabinóide do Tipo 2

CCI Chronic Constriction Injury / Constrição Crônica do Nervo Isquiático

CEUA Comissão de Ética para o Uso de Animais

CNBD Cyclic Nucleotide-Binding Domain / Domínio de Ligação de Nucleótido Cíclico

CPME Coluna Posterior da Medula Espinal

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole

dL Decilitro

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Deoxyribonucleic acid / ácido desoxirribonucleico

DOR Delta Opioid Receptor

DR Núcleo Dorsal da Rafe

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

ERK Extracellular signal-regulated kinase

EUA Estados Unidos da América

fls Folhas

http://en.wikipedia.org/wiki/Cannabinoid_receptor_type_1

http://en.wikipedia.org/wiki/Cannabinoid_receptor_type_1

g Grama

GABA Gamma-AminoButyric Acid / Ácido gama-aminobutírico

GLUT-2 Glucose transporter 2

GNC Cyclic Nucleotide-Gated / Canais Dependentes de Nucleótidos Cíclicos

GPCR G Protein–Coupled Receptor / Receptor Acoplado a Proteína-G

GRP Gânglio da Raiz Posterior

HCl Ácido Clorídrico

Hp Hemopressina

I.C.V. Intracerebroventricular

IgG Imunoglobulina G

IITC Ingress Intel Total Conversion

IL Interleucina

IL – 1ß Interleucina 1ß

IL – 6 Interleucina 6

INPI Instituto Nacional de Propriedade Industrial

i.p. Intraperitoneal

IPEN Instituto de Pesquisas Energéticas Nucleares

i.t . Intratecal

JNK c-Jun N-terminal kinase

KDa Quilodaltons

Kg Quilograma

Kir Canal de Potássio de retificação interna

KO knockout

KPBS Potassium Phosphate-Buffered Saline / Tampão Potássio Fosfato Salina

LIF Fator de Inibição de Leucemia

Log Logaritmo

L4/L5/L6 Gânglio Lombar 4/5/6

M Molar

http://www4.mpbio.com/ecom/docs/proddata.nsf/%28webtds2%29/194727

mA Miliampére

mAb Anticorpo Monoclonal

MAPK Mitogen-activated protein kinases

min Minuto

mg Miligrama

mL Mililitro

mM Milimolar

mm2 Milímetro quadrado

MOR Mu Opioid Receptor

mSNA Modified Spinal Nerve Axotomy

N Normal

nº Número

Na+ Sódio

NaCl Cloreto de Sódio

NF-kB Fator Nuclear kappa B

NGF Nerve Growth Factor / Fator de crescimento neural

nm Nanômetro

NO Óxido Nítrico

NPD Neuropatia Periférica Diabética

NTX Naltrexone

NTB Naltriben

pAb Anticorpo policlonal

PAG Periaqueductal gray / Substância Cinzenta Periaquedutal

PB Phosphate Buffer / Tampão Fosfato

PBS Phosphate Buffer Saline / Tampão Fosfato Salina

pg Picograma

PGE2 Prostaglandina E2

PFA Paraformaldehyde

pH Potencial hidrogeniônico

http://en.wikipedia.org/wiki/Paraformaldehyde

PKB/AKT Protein kinase B ou AKT (PKB/AKT)

PKC Proteína Kinase C

S Segundos

SAL Salina

SBCAL Sociedade Brasileira de Ciência de Animais de Laboratório

SDS Sodium Dodecyl Sulfate / Dodecil Sulfato de Sódio

SFK Família Src-Kinase

SNC Sistema Nervoso Central

SNP Sistema Nervoso Periférico

SP Substância P

STZ Streptozotocin / Estreptozotocina

TBS Tris-Buffered Saline

TBST Tris-Buffered Saline and Tween

TGF-β Fator de Transformação de Crescimento Beta

THC Tetrahydrocannabinol / delta-9-tetra-hidrocanabinol

TNFα Tumor Necrosis Factor Alpha / Fator α de necrose tumoral

TRIS Trisaminometano

TRITC Tetramethylrhodamine

TRPV1 Transient receptor potential vanilloid 1/ Receptor de potencial transiente vaniloide 1

V Volt

WT Wild Type / Selvagem

ZD7288 Bloqueador de Canal HCN Não Selectivo

µg Micrograma

µl Microlitro

μm Micrômetro

μM Miicromolar

LISTA DE SÍMBOLOS

α1 Alfa 1

β Beta

δ Delta

ºC Grau Celsius

< Menor

% Porcentagem

LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO 1- Níveis de glicose sérica de camundongos tratados por via

intraperitoneal com diferentes doses de estreptozotocina (STZ)......................47

GRÁFICO 2- Níveis de glicose sérica (mg/dL) de camundongos injetados com

estreptozotocina (STZ - 200mg/kg (i.p.)) ou Salina (Sal) avaliados ao longo do

tratamento oral com hemopressina (Hp - 2,5 mg/kg) ou Sal.............................49

GRÁFICO 3- Peso corpóreo de camundongos injetados com estreptozotocina

(STZ - 200mg/kg (i.p.)) ou Salina (Sal) avaliados ao longo do tratamento oral

com hemopressina (Hp - 2,5 mg/Kg) ou Sal......................................................51

GRÁFICO 4- Efeito da injeção de estreptozotocina (STZ - 200mg/k (i.p.)) ou

Salina (Sal) e do tratamento oral com hemopressina (Hp - 2,5 mg/kg (p.o.)) ou

Sal sobre a sensibilidade mecânica de camundongos avaliados por filamentos

de von Frey........................................................................................................53

GRÁFICO 5- Efeito da injeção de estreptozotocina (STZ - 200mg/kg (i.p.)) ou

Salina (Sal) e do tratamento oral com hemopressina (Hp - 2,5 mg/kg (p.o)) ou

Sal sobre a sensibilidade térmica de camundongos avaliados pelo teste

plantar................................................................................................................55

GRÁFICO 6- Análise quantitativa para receptor CB1 ativado de amostras da

coluna posterior da medula espinal de camundongos avaliado por

imunofluorescência............................................................................................57

GRÁFICO 7- Análise quantitativa donúmero de células marcadas para

receptores CB1 na coluna posterior da medula espinal de camundongos,

avaliado por imunofluorescência.......................................................................59

GRÁFICO 8- Análise quantitativa da intensidade integrada por mm2 para a

expressão de astrócitos na coluna posterior da medula espinal de

camundongos, avaliado por imunofluorescência...............................................61

GRÁFICO 9- Análise quantitativa do número de células marcadas para

microglia na coluna posterior da medula espinal de camundongos, avaliado por

imunofluorescência............................................................................................63

GRÁFICO 10- Análise quantitativa da espessura de mielina para as fibras Aδ e

Aβ.......................................................................................................................65

GRÁFICO 11- Níveis de NGF (pg/mL) no nervo isquiático de camundongos

normais ou diabéticos injetados com estreptozotocina (STZ - 200 mg/kg (i.p.))

tratados por 7(A), 14 (B) ou 28 (C) dias com hemopressina (Hp - 2,5 mg/kg

(p.o.)) ou Salina (Sal).........................................................................................67

GRÁFICO 12- Efeito da hemopressina (Hp - 2,5 mg/kg (p.o.)) ou Salina (Sal)

na sensibilidade mecânica (avaliado pelo teste de von Frey filamentos) (A) ou

(B) na sensibilidade térmica (avaliado pelo teste de retirada da cauda) em

animais selvagem (WT), knockout Mu opióide (KO MOR) ou knockout Delta

opióide (KO DOR)..............................................................................................69

GRÁFICO 13- Efeito da Efeito do tratamento de Naltrexone (NTX - 1mg/kg) ou

Naltriben (NTB- 1mg/kg) em animais WT tratados hemopressina (Hp - 2,5

mg/kg (p.o.)) ou Salina (Sal) na sensibilidade mecânica (avaliado pelo teste de

von Frey filamentos) (A) ou (B) na sensibilidade térmica (avaliado pelo teste de

retirada da cauda) em animais selvagem (WT).................................................70

GRÁFICO 14- Efeito do tratamento com hemopressina (Hp) ou salina (Sal) em

animais selvagem (WT) ou knockout para receptores Mu (KO MOR) ou Delta

opióide (KO DOR) na sensibilidade mecânica...................................................72

GRÁFICO 15- Níveis de glicose sérica (mg/dL) em animais selvagem (WT) ou

Knockout para receptores Mu (KO MOR) ou Delta opióide (KO DOR).............73

GRÁFICO 16- Peso corpóreo dos animais selvagem (WT) ou knockout para

receptores Mu (KO MOR) ou Delta opióide (KO DOR).....................................74

GRÁFICO 17- Análise quantitativa do número de células marcadas para os

receptores dimerizado CB1-MOR ou CB1-DOR na coluna posterior da medula

espinal de camundongos Selvagem (WT) ou knockout Mu (KO MOR) ou Delta

(KO DOR) opióides avaliado por imunofluorescência.......................................76

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1- Fotomicrografias representativas da imunofluorescência para os

receptores dimerizado CB1-MOR ou CB1-DOR na coluna posterior da medula

espinal de camundongos Selvagem (WT) ou knockout Mu (KO MOR) ou Delta

(KO DOR) opióides............................................................................................77

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO........................................................................................22

1.1 Dor Neuropática...................................................................................22

1.2 Sistema canabinóide e seu envolvimento na nocicepção..............28

1.3 Hemopressina......................................................................................31

2 OBJETIVOS............................................................................................34

3 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................36

3.1 Animais.................................................................................................36

3.2 Modelo experimental de neuropatia periférica diabética................37

3.3 Testes comportamentais..................................................................38

3.3.1 Teste de sensibilidade ao estímulo mecânico............................38

3.3.2 Teste de sensibilidade ao estímulo térmico............................... 39

3.4 Drogas.................................................................................................40

3.5 Imunofluorescência...........................................................................41

3.6 Imunofluorescência utilizando anticorpos sensíveis ao estado de

ativação.....................................................................................................42

3.7 Histologia............................................................................................43

3.8 ELISA para Quantificação de NGF do Nervo Isquiático..................43

4 RESULTADOS........................................................................................46

5 DISCUSSÃO...........................................................................................78

6 CONCLUSÃO.........................................................................................89

REFERÊNCIAS ..........................................................................................90

APÊNDICE

A - Outros experimentos realizados......................................................111

22

1 INTRODUÇÃO

1.1 Dor Neuropática

A dor se apresenta como uma sensação desagradável que é de suma

importância para a proteção e integridade do organismo. A mesma pode se dividir

em distintas categorias. Fisiologicamente, a sensação dolorosa é desencadeada por

estímulos potencialmente lesivos de inúmeras origens, como a ativação de

receptores de membrana localizados nas terminações distais dos neurônios

nociceptivos. Estes receptores são específicos para as determinadas modalidades,

sendo estes ativados por estímulos de alta intensidade (Woolf, Ma, 2007). Essa

função de alerta que a dor apresenta, é também importante após a lesão tecidual,

uma vez que sinaliza respostas de precauções a área lesada (Scholz, Woolf, 2007).

Como por exemplo, na dor inflamatória onde a presença de diferentes eventos é

necessária para a ativação neuronal. A inflamação tecidual desencadeia a produção

de uma série de moléculas (histamina, cininas, prostaglandinas, entre outras),

oriundas do sistema imune ou mesmo do próprio tecido lesado, sendo que algumas

delas irão sensibilizar receptores resultando na diminuição do limiar de ativação do

nociceptor levando a uma condição de hiperalgesia (Dray, 1995; Kidd, Urban, 2001).

Diferente do que ocorre com a dor nociceptiva e a inflamatória, em que a

sensação dolorosa é sanada com o cessar do estímulo ou resolução do processo

inflamatório, a dor neuropática, que pode ser oriunda da disfunção ou lesão do

sistema nervoso central (SNC) ou periférico (SNP), pode apresentar uma sensação

dolorosa contínua mesmo após a cura da lesão, a qual pode progredir para níveis

debilitantes e prejudicar a qualidade de vida e execução das tarefas cotidianas do

paciente. Essa característica de irreversibilidade do quadro nociceptivo ocorre

quando neurônios do sistema nociceptivo assumem uma nova condição fenotípica,

dessa maneira a dor passa a apresentar um caráter patológico (Zimmermann, 2001).

23

Após a lesão do nociceptor, há um aumento na transcrição ou alteração de tráfego

de canais de sódio, bem como redução nos canais de potássio. Com isso, ocorre um

aumento na excitabilidade da membrana de modo que potenciais de ação são

gerados espontaneamente (atividade ectópica), resultando em mudanças do limiar e

transmissão das propriedades nociceptivas, contribuindo para o surgimento da

hipersensibilidade e dor espontânea. Tais alterações podem ocorrer nos terminais

periféricos (chamada de sensibilização periférica) com lesão axonal, ou nas sinapses

centrais, ou ainda gerar alterações nas propriedades da membrana. Algumas dessas

alterações podem ocorrer rapidamente como a redução do limiar de dor para calor,

pela fosforilação imediata dos receptores que transmitem calor, como o receptor de

potencial transiente vanilóide 1 (TRPV1). Outros requerem transporte retrógrado de

sinais para o corpo celular para a ativação de cascatas de transdução e alterações

do transporte de proteínas para os terminais periféricos ou centrais (Latremoliere,

Woolf, 2009; Scholz, Woolf, 2007; Svensson, Yaksh, 2002).

O aumento da transmissão sináptica para a coluna posterior da medula

espinal (CPME) (sensibilização central) inicia-se quase que imediatamente como

resultado da atividade de fosforilação e trafego de receptores ou canais iônicos.

Essa sensibilização central pode ser sustentada por alterações estruturais no

contato sináptico ou ainda redução dos mecanismos inibitórios (Latremoliere; Woolf,

2009; Scholz, Woolf, 2007). Dessa maneira fibras mielinizadas de grande calibre, do

tipo Aβ, normalmente envolvidas na transmissão dos impulsos não nocivos, são as

que apresentam maior quantidade de impulsos ectópicos na vigência de lesão

nervosa periférica. Estas fibras enviam projeções colaterais para a CPME. Este fato

está diretamente associado com a sensibilização central, sendo que na vigência de

lesão nervosa periférica, essa característica contribui para o desenvolvimento da dor

espontânea, de alodínia e de hiperalgesia (Devor, Wall, 1990), uma vez que estas

fibras promovem a liberação de neurotransmissores excitatórios na medula espinal,

como a substância P (SP) e o glutamato, sensibilizando os neurônios da CPME

(Devor, Wall, 1990; Gracely, Lynch, Bennett, 1992). Durante este fenômeno, a

sensibilização dos feixes nervosos sensitivos ascendentes torna-os susceptíveis à

estimulação por mecanoceptores (fibras Aβ), além dos nociceptores (Caviedes,

Herranz, 2002; Zimmermann, 2001). Para que o fenômeno de alodínia se

24

desenvolva algumas mudanças ocorrem ao longo de toda a via nociceptiva, tal como

a reorganização central das vias aferentes. Além disso, terminações aferentes

somatossensoriais do tipo Aδ e C, quando lesadas, diminuem a liberação de ácido

gama-aminobutírico (GABA) pelos neurônios inibitórios espinais, o que contribui para

a perda dos mecanismos inibitórios de controle da dor, somados à diminuição da

liberação de serotonina e noradrenalina pelos neurônios inibitórios descendentes

(Besson, 1999; Caviedes, Herranz, 2002; Zimmermann, 2001).

O tratamento da dor neuropática em humanos é frequentemente ineficaz,

principalmente devido ao inadequado entendimento dos mecanismos celulares e

moleculares envolvidos no desenvolvimento e manutenção deste tipo de dor (Aley,

Levine, 2003; Erichsen, Blackburn-Munro, 2002; Sah, Ossipo, Porreca, 2003). Os

tratamentos utilizados na prática clínica incluem antidepressivos tricíclicos,

antiepilépticos tradicionais, administração sistêmica de anestésicos locais, agentes

tópicos, analgésicos narcóticos e não narcóticos e lesões neurocirúrgicas (Attal,

2000; Galer, 1995; Sah, Ossipo, Porreca, 2003). Sendo que a grande maioria está

designada a bloquear a neurotransmissão, o que em geral limita sua efetividade uma

vez que uma série de mediadores inflamatórios continuam a ativar os neurônios

nociceptivos contribuindo para a hipersensibilidade dolorosa. Nesse sentido, tem

sido demonstrado, em doenças e lesões do sistema nervoso que resultam em dor

neuropática, a presença de mediadores inflamatórios na medula espinal. Dentre

estes mediadores podemos citar algumas citocinas inflamatórias como a interleucina

1-beta (IL-1β), interleucina-6 (IL-6), fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), fator de

inibição de leucemia (LIF) e fator de transformação de crescimento beta (TGF-β), as

quais são principalmente produzidas por macrófagos residentes, linfócitos, células

de Schwann, fibroblastos, neurônios sensoriais e células da glia, na medula espinal

(Bruce-Keller, 1999; Skundric, Lisak, 2003) que apresentam papel importante no

desenvolvimento e manutenção da dor neuropática. Levando em consideração o

envolvimento das células da glia no desenvolvimento e manutenção da dor

neuropática, foi demonstrado que tanto a ativação de microglia quanto de astrócitos

são observadas na medula espinal após lesão do SNC e SNP (Scholz, Woolf, 2007;

Watkins, Milligan, Maier, 2003a; Watkins, Maier, 2003b). A ativação de células da

glia também é observada em modelos inflamatórios, pós-trauma (DeLeo, 2004; Qin

25

et al., 2006; Raghavendra, Tanga; Sweitzer et al., 1999), e em desordens centrais

desmielinizantes (Markoullis et al., 2014; Ostrem et al., 2014). Ainda é demonstrado

que as células da glia presentes na medula espinal possuem papel importante na

facilitação da dor e que inibidores gliais são capazes de modificar a reposta dolorosa

(Marchand, Perretti, MacMahon, 2005; Sweitzer, Schubert, DeLeo, 2001; Watkins et

al., 1997). Dessa forma a condição patológica da dor neuropática produz uma série

de mudanças na via somatossensorial (Fields, Heinricher, Mason, 1991;

Zimmermann, 2001).

Estima-se que, das 382 milhões de pessoas afetadas pelo diabetes (IDF,

2013), 60 a 70% são acometidos por alguma forma de neuropatia, ou desenvolverão

a complicação em algum momento de sua vida. A neuropatia periférica diabética

(NPD) é a manifestação mais usual, ocorrendo em cerca de 50% dos pacientes

(Boulton et al., 2005; Feldman et al., 2005, Toth et al., 2010). O diabetes mellitus é

consequência de problemas na secreção e/ou ação da insulina. É descrita por ser

uma doença metabólica de caráter multifatorial, caracterizada por hiperglicemia

crônica e disfunções no metabolismo de lipídeos, carboidratos e proteínas; onde na

ausência de tratamento, a cetoacidose e a hiperosmolaridade sanguínea podem

levar ao coma e à morte (Alberti, Zimmet, 1998). A NPD é caracterizada por uma

lenta e progressiva perda de sensibilidade que se correlaciona diretamente com a

duração do diabetes e com o controle glicêmico inadequado. Entre os múltiplos

sintomas desta neuropatia, o desenvolvimento da dor crônica é uma das maiores

complicações, uma vez que seu surgimento é oriundo de componentes multifatoriais,

que ainda hoje são pouco compreendidos (Cheng et al., 2010; Toth et al., 2010;

Vincent et al., 2011). Essa NPD que tipicamente envolve as extremidades é

caracterizada por dor espontânea e estímulos evocados, com alterações na

percepção dolorosa, aumentando a sensibilidade a estímulos nocivos (hiperalgesia)

e sensibilidade a estímulos leves ou estímulos que previamente não eram dolorosos

(alodínia). Esses fatores afetam fortemente a qualidade de vida dos pacientes

portadores desta síndrome (Barrett et al., 2007; Cao et al., 2010; Rondón et al.,

2010; Said, 2007).

26

Em seres humanos e em modelos experimentais em animais, a neuropatia

diabética comumente se manifesta como uma polineuropatia sensorial simétrica

distal. As alterações sensoriais se iniciam nas porções mais distais dos membros,

como nos pés, e, ao longo do tempo, avançam para regiões mais proximais (Said,

2007). Sendo demonstrado em nervos periféricos de pacientes com NPD a

presença de infiltrado inflamatório (composto de macrófagos e linfócitos T e B)

(Dyck, Giannini, 1996), degeneração axonal (Thomas, Tomlinson, 1993),

desmielinização segmental em decorrência de disfunções das células de Schwann

(Johnson et al., 1986; Pittenger, Vinik, 2003) e menor capacidade da regeneração

(Cameron, Cotter, 1997). Juntas, essas trocas estruturais resultam na redução da

inervação epidermal, redução da amplitude nos potenciais de ação do nervo

sensorial e diminuição da velocidade de condução (Johnson, Ryals, Wright, 2007).

A degeneração distal dos axônios periféricos atinge tanto fibras de pequeno

calibre, quanto de calibres maiores, sendo o fator de crescimento do nervo (NGF) o

principal mediador responsável pela sobrevivência e manutenção destas fibras

cutâneas. Nesse sentido, foi demonstrado que camundongos knockout homozigotos

para NGF não desenvolvem adequadamente neurônios sensoriais de pequeno

calibre derivados da crista neural, bem como neurônios simpáticos (Crowley et al.,

1994; Leinninger, Vincent, Feldman, 2004). Ainda, foi demonstrado em ratos

submetidos à modelo experimental de diabetes induzida por estreptozotocina (STZ),

uma redução dos níveis de NGF diretamente associada com a presença de

neuropatia diabética, bem como transporte retrogrado de NGF no nervo isquiático

dos animais sendo este processo dependente da relação existente entre receptores

do tipo p75 e trk A, responsáveis por mediar a sinalização do NGF, (Hellweg et al.,

1991; Steinbacher, Nadelhaft, 1998). Além disso, o NGF também é um importante

regulador da síntese de SP em neurônios do gânglio da raiz posterior (GRP)

associada com a atividade das fibras sensoriais primárias (fibras C e Aδ) (Lindsay,

Harmar, 1989), sendo observadas correlações entre a presença de sintomas

dolorosos e alterações nos níveis de SP no fluído cerebroespinal e no nervo sural de

pacientes com polineuropatia diabética (Tsigos et al., 1993).

27

Um mecanismo celular preciso para a hiperalgesia e alodínia na NPD ainda

não é totalmente conhecido, mas a literatura demonstra, em modelo experimental de

diabetes em ratos, um aumento na expressão de canais de sódio do tipo Nav1.3 em

neurônios GRP e uma diminuição dos canais do tipo Nav1.8 (Cheng et al., 2014).

Adicionalmente, estes autores também observaram a ativação da micróglia na

CPME desde a primeira semana da indução do diabetes, sendo esse efeito

sustentado por pelo menos 6 meses, com consequente aumento da fosforilação de

p38, sendo a alodínia mecânica persistente correlacionada positivamente com a

sustentação da ativação da microglia e o aumento da fosforilação de p38 (Cheng et

al., 2014). Além disso, o aumento da excitabilidade de neurônios sensoriais

primários exerce um papel crítico no desenvolvimento da neuropatia diabética (Hong

et al., 2004; Jagodic et al., 2007). Embora a degeneração dos nervos, a isquemia, os

déficits de fatores neurotróficos e a hiperatividade dos neurônios tenham sido

apontados como responsáveis pelo desenvolvimento e fisiopatologia da NPD, os

tratamentos existentes até o momento (pregabalina, duloxetina e tapentadol-

medicamentos que possuem aprovação nos EUA para o tratamento da dor

neuropática diabética) são ainda ineficazes e apenas poucos pacientes portadores

de NPD beneficiam-se de algum alívio da dor (Barrett et al., 2007; Boulton, 2005;

Christoph, De Vry, Tzschentke, 2010; Freeman, 2013; Tesfay, Kempler, 2005; Vinik,

1999).

Dessa maneira, até o momento, além do controle glicêmico, não existe um

tratamento viável para a doença em humanos. Assim, embora exista progresso no

desenvolvimento de novos analgésicos, a necessidade de agentes terapêuticos

capazes de bloquear a sensação dolorosa anormal sem afetar as habilidades

normais dos pacientes diabéticos ainda não foi encontrada.

28

1.2 Sistema canabinóide e seu envolvimento na nocicepção

Desde os tempos antigos a erva Cannabis sativa tem sido utilizada

medicinalmente. Particularmente, seu principal composto ativo o delta-9-

tetrahidrocanabinol (THC) liga-se a dois tipos de receptores canabinóide, CB1 e

CB2, sendo seus efeitos mediados por ligação a receptores acoplados a proteína G

(GPCRs) (Begg et al., 2005; Pertwee, 2001). GPCRs representam uma das maiores

superfamílias de proteínas, com cerca de 1.000 receptores em vertebrados (Howard

et al., 2001). O clássico paradigma da função de GPCR estipula que estes se

localizam na superfície da célula sendo ativados pela ligação de agonistas. Isto

conduz à ativação da proteína G e inicia várias alterações nas vias de sinalização

intracelular. Após a ativação, a maioria dos GPCRs sofrem endocitose da superfície

celular e são translocados para endossomos de baixo pH, permitindo que o ligante

seja separado antes que o receptor seja reciclado de volta para a superfície da

célula ou sejam enviados através endossomas para os lisossomos para degradação

(Ferguson, 2001). Evidências crescentes demonstram que alguns GPCRs não são

totalmente inativos na ausência de ligante, apresentando assim uma atividade

constitutiva, com níveis basais elevados de sinalização intracelular (Seifert, Wenzel-

Seifert, 2002). A caracterização farmacológica para os ativadores constitutivamente

dos GPCRs leva à definição de três classes de ligantes diferentes: agonistas,

antagonistas neutros, e os agonistas inversos (Milligan, Bond, 1997).

O receptor canabinóide do tipo 1, é um dos mais abundantes GPCRs no

sistema nervoso central, com um alto nível de expressão no córtex, hipocampo,

gânglios basais, e cerebelo (Matsuda et al., 1990). Além disso, os receptores CB1

são os principais responsáveis pelo efeito dos canabinóides nas vias nociceptivas,

sendo demonstrada a expressão desses receptores em áreas do sistema nervoso

central e periférico envolvidas na transmissão e processamento nociceptivo,

incluindo substância cinzenta periaquedutal (PAG), córtex cingulado anterior (ACC),

tálamo, bulbo ventromedial rostral, CPME e no gânglio da raiz posterior (Farquhar-

29

Smith et al., 2000; Glass, Dragunow, Faull, 1997; Herkenham, 1991a; Herkenham et

al. 1991b; Hohmann, Herkenham, 1999; Hoot et al., 2010; Iversen, Kelly, Chapman,

2001; Maione et al., 2006; Walker, Huang, 2002;). A presença de receptores CB1 em

fibras aferentes do tipo Aβ ou Aδ, também sustenta seu papel na modulação da dor

neuropática (Hohmann, Herkenham, 1999). Além disso, receptores para CB1

também estão presentes nos queratinócitos da epiderme e em fibras finas na derme

(Veress et al., 2013). Receptores CB1 estão acoplados a proteínas Gi/Go, e o

resultado de sua ativação é a inibição da enzima adenilato ciclase (AC) levando a

diminuição dos níveis de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) na maioria dos

tecidos e células; ativação da proteína quinase ativada por mitógeno; inibição de

canais de Ca2+ do tipo L, P, Q, e N; ativação de canal de potássio de retificação

interna (Kir) e inibição de canais de Na+ (Howlett et al., 2002; Kim et al., 2005).

Adicionalmente, receptores CB1 são ativados por ligantes endógenos

derivados de lipídeos de membrana chamados de endocanabinóides (Battista et al.,

2006; Boyd, 2006; Di Marzo, Petrosino, 2007). Inúmeros trabalhos têm proposto um

papel importante para o sistema endocanabinóide em diferentes condições

fisiológicas e fisiopatológicas, dentre elas estão Doença de Parkinson, Alzheimer,

depressão, inflamação, obesidade e dor neuropática (Battista et al., 2006; Boyd,

2006; Di Marzo, Petrosino, 2007). O envolvimento do Sistema Endocanabinóide em

uma série de doenças de relevância epidemiológica tem gerado interesse cada vez

maior na descoberta de compostos que modulem receptores canabinóides que

possam ser úteis no tratamento de tais doenças. Interesse especial vem sendo

atribuído ao efeito antinociceptivo induzido por canabinóides, alvo este que

representa boas promessas clínicas (Gilron, Coderre, 2007; Iversen, Chapman,

2002; Pertwee, 2001; Walker, Huang, 2002). Na nocicepção, foi demonstrado que o

Sistema Endocanabinóide atua na regulação da via descendente de dor, em

diferentes níveis da via nociceptiva, modulando a inibição da AC, a ativação de

canais de potássio e a inibição dos canais de cálcio, exercendo efeito inibitório sobre

a liberação de transmissores, agindo de maneira distinta, mas paralela àquela que

envolve os opióides (Iversen, Chapman, 2002; Rang et al., 2007). Além de agir no

gânglio da raiz posterior inibindo diretamente canais de sódio (Kim et al., 2005).

30

Experimentalmente, tem sido amplamente demonstrado que a administração

sistêmica de agonistas e agonistas inversos de receptores CB1 induz efeitos anti-

hiperalgésicos e antinociceptivos em diferentes modelos comportamentais e

eletrofisiológicos de avaliação da resposta dolorosa (Fox et al., 2001; Jaggar et al.,

1998; Li et al., 1999; Lichtman, Martin, 1991; Meng et al., 1998). Nesse sentido, foi

demonstrado que a administração periférica de anandamida, um agonista endógeno

de CB1, inibe hiperalgesia mecânica e térmica induzidas por carragenina

(Richardson, Kilo, Hargreaves, 1998) e inibe o comportamento doloroso induzido por

formalina em camundongos (Calignano et al., 1998). Em condições neuropáticas,

uma série de estudos demonstram que tanto o CB1 (Agarwal et al., 2007) quanto o

CB2 (Guindon, Hohmann, 2008) estão envolvidos na antinocicepção induzida por

canabinóides na periferia (Guindon, Beaulieu, 2006). Nesse sentido, foi demonstrado

que o tratamento com agonista de receptor CB1, WIN 55,212-2, reverte a

hiperalgesia e alodínea em modelo de neuropatia trigeminal em ratos e em modelo

de neuropatia induzida por lesão da medula espinal (Hama, Sagen, 2009; Liang,

Huang, Hsu, 2007). Em contrapartida aos efeitos de agonistas de CB1 na

nocicepção experimental, foi também demonstrado que o rimonabanto (SR141716A)

um agonista inverso para CB1 (Rinaldi-Carmona et al., 1994) inibe a hiperalgesia

mecânica e térmica e a alodínea observadas em modelo de dor neuropática induzida

por constrição crônica do nervo isquiático (CCI), sendo esse efeito mediado pela

inibição de TNF-α, prostaglandina E2 (PGE2) e óxido nítrico(NO) (Costa et al.,

2005).

Embora sejam vistos como alvo promissor para o desenvolvimento de

fármacos para o tratamento de diferentes condições fisiopatológicas, ensaios

clínicos e pré-clínicos demonstram que o THC e outros agonistas de CB1

geralmente produzem efeito indesejado no SNC. Agonistas de CB1 são em geral

psicoativos e apresentam risco de dependência, dificultando a otimização de doses

em ensaios clínicos e pré-clínicos (Pertwee, 2001). Dessa forma, o desenvolvimento

de fármacos capazes de ligar-se a receptores canabinóides sem ação psicoativa,

oferece potencial terapêutico sem o risco de efeitos adversos, tornando-se

ferramentas valiosas para o tratamento de inúmeras desordens relacionadas ao

sistema canabinóide (McCarberg, Barkin, 2007).

31

1.3 Hemopressina

Dados obtidos pelo nosso grupo demonstram que hemopressina (Hp), um

agonista inverso do receptor CB1, modula a sinalização mediada por esse receptor

(Heimman et al., 2007). A Hp é um nonapeptídeo (PVNFKFLSH) que corresponde a

um fragmento da cadeia α1 (95-103) da hemoglobina (protein database;

www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), que foi originalmente isolado de homogenato de

cérebro de ratos como um substrato para a endopeptidase 24.15 (Rioli et al., 2003).

A Hp induz antinocicepção em roedores submetidos a diferentes modelos de

nocicepção experimental (Dale et al., 2005a; Hama, Sagen, 2011; Heimman et al.,

2007). Este efeito ocorre por inibição da ativação nociceptiva espinal, diretamente

em neurônios sensoriais, envolvendo perifericamente a participação de receptores

CB1 e de canais de potássio ativados por cálcio de baixa voltagem (Dale et al.,

2005a; Dale, Pagano, Rioli, 2005b). Interessantemente, este peptídeo possui efeito

analgésico quando injetado localmente, administrado por via oral ou quando injetado

por via intratecal (i.t.) (Dale et al., 2005a; Hama, Sagen, 2011; Heimman et al.,

2007). Seu efeito não induz alterações na atividade locomotora dos animais e não

interfere com o tempo de sono induzido por barbitúrico, indicando ausência de

anormalidades motoras ou efeito sedativo, sugerindo que a Hp possa ser um

candidato ao desenvolvimento de uma nova terapêutica (Heimman, et al., 2007).

Mais recentemente foi demonstrado que a Hp ativa substratos neuronais distintos no

cérebro, incluindo regiões nociceptivas como a PAG e núcleo dorsal da rafe (DR)

(Dodd et al., 2013). Dados recentes obtidos por nosso grupo demonstram que a Hp

não interfere com o tempo de natação dos animais indicando ausência de efeito

depressor no SNC (dados não publicados) atribuídos aos compostos ligantes de

canabinóides disponíveis hoje no mercado, embora apresente efeito ansiogênico

quando administrados via oral, intraperitoneal (i.p.) e intracerebroventricular (I.C.V.),

sendo este último via receptores TRPV1. Apesar de esse efeito ansiogênico ser

demonstrado quando a Hp foi administrada via i.p. não foi possível detectar o

peptídeo no cérebro quando realizado espectrometria de massa, demonstrando que

32

a Hp não atravessa a barreira hematoencefálica e isso sugeriria que a Hp possa ser

degradada por peptidases em fragmentos menores e esses por sua vez, causar

esse efeito ansiogênico (Fogaça et al., 2015). A descoberta de que a Hp, funcione

como agonista inverso de CB1 e apresente efeito antinociceptivo sugere a

possibilidade de que a atividade do receptor canabinóide possa ser modulada por

peptídeos derivados de proteínas precursoras maiores, o que aumentaria a

complexidade do sistema endocanabinóide. Nesse sentido, foi demonstrado em

cérebro de camundongos a presença de formas N-terminal estendidas de Hp

contendo 11 (VD-hemopressina - VDPVNFKLLSH) e 12 (RVD-hemopressina -

RVDPVNFKLLSH) resíduos, os quais também atuam como moduladores endógenos

com atividade em RCB1 (Gomes et al., 2009; Gomes et al., 2010). Em conjunto

esses dados sugerem que a Hp possa atuar como um “neuropeptídeo não clássico”

a exemplo das hemorfinas, peptídeos derivados das cadeias α e β da hemoglobina

que interagem com receptores opióides (Brantl et al., 1986). Dados recentes da

literatura sugerem que um mecanismo comum está envolvido na antinocicpção

induzida por Hp, VD-Hemopressina e WIN55,212-2 (Pan et al., 2014).

Além de seus efeitos na nocicepção, foi também demonstrado que a

hemopressina diminui a ingestão de alimento em animais normais e obesos (Dodd et

al., 2010), sendo este efeito dependente de RCB1 uma vez que nenhum efeito do

tratamento com a Hp foi visto em camundongos CB1-/- (Dodd et al., 2013).Dados

recentes obtidos por nosso grupo demonstram que o tratamento com Hp em animais

obesos diminui o peso e restabelece os níveis glicêmicos dos mesmos (dados não

publicados).

Considerando os efeitos da hemopressina sobre a dor neuropática, dados

obtidos por nosso grupo demonstraram que a administração oral de Hp inibe a

hiperalgesia mecânica de ratos submetidos ao modelo de CCI, sendo este efeito

observado por até 6 horas após uma única administração, e reverte a alodínia

mecânica, mas não térmica, de camundongos submetidos ao modelo de neuropatia

diabética induzida por estreptozotocina após tratamento com Hp (Toniolo et al.,

2014a; Toniolo, Franciosi, Dale, 2014b). Também foi observado nos animais com

CCI que o tratamento com Hp diminui a ativação neuronal em nível medular bem

33

como o influxo de cálcio nos neurônios GRP sugerindo que a antinocicepção

observada seja decorrente de um efeito direto da Hp nesses neurônios. Ainda, o

efeito antinociceptivo é independente da ativação de serotonina e noradrenalina,

mas é dependente de canais de potássio periféricos e envolve a participação de

anandamida (Toniolo et. al, 2014a). Mais recentemente, foi demonstrado que o

tratamento com Hp in vitro, não afeta a proliferação e nem a morte celular, mas

promove diferenciação e maturação de células progenitoras de oligodendrócitos

presentes na zona subventricular (Xapelli et al., 2014).

Em conjunto, os dados acima apresentados tornam a Hp um forte candidato

para fins terapêuticos, tendo sua patente depositada junto ao Instituto Nacional de

Propriedade Industrial (INPI) no ano de 2009 (PCT 244782353 concedido em

03/2/2011).

34

2 OBJETIVOS

I) Avaliar o efeito do tratamento com Hp sobre a hiperglicemia e peso corporal em

animais com neuropatia diabética;

II) Investigar o efeito da Hp sobre a sensibilidade mecânica,avaliado por filamentos

de von Frey e a sensibilidade ao estímulo térmico quente, avaliado pelo teste plantar

de camundongos C57BL/6/JUnib com neuropatia diabética;

III) Avaliar o efeito do tratamento com Hp sobre a expressão de receptores

canabinóides do tipo 1 no corno posterior da medula espinal de camundongos

diabéticos, utilizando anticorpos sensíveis ao estado de ativação;

IV) Avaliar o efeito do tratamento com Hp sobre o número de receptores para CB1,

microglia, e sobre a intensidade integrada de astrócito, na coluna posterior da

medula espinal de animais diabéticos, por imunofluorecência;

V) Avaliar o efeito do tratamento com Hp sobre a desmielinização do nervo isquiático

dos camundongos portadores de neuropatia diabética, por histologia;

VI) Verificar o efeito do tratamento com Hp sobre os níveis de NGF por meio do

ELISA no nervo isquiático dos animais diabéticos;

VII) Avaliar o efeito da Hp em camundongos Selvagens e Knockout para os

receptores Mu e Delta Opióide sobre a sensibilidade mecânica, avaliado por

filamentos de von Frey e a sensibilidade ao estímulo térmico quente, avaliado pelo

teste de retirada de cauda;

35

VIII) Avaliar o efeito da Hp em camundongos Selvagens e Knockout para os

receptores Mu e Delta Opióide submetidos ao modelo de neuropatia diabética sobre

a sensibilidade mecânica, avaliado por filamentos de von Frey;

IX) Avaliar o efeito da Hp em camundongos Selvagens e Knockout para os

receptores Mu e Delta Opióide com neuropatia diabética sobre o número de

receptores dimerizados CB1- Mu e CB1-Delta na coluna posterior da medula espinal

por Imunofluorecência.

36

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Animais

Foram utilizados camundongos machos da linhagem C57BL/6/JUnib pesando

entre 25-30 gramas, fornecidos pelo biotério do Instituto de Pesquisas Energéticas

Nucleares (IPEN). Os mesmos foram mantidos em local apropriado, com controle da

temperatura (2 oC; 22 ºC), e luminosidade (ciclo claro e escuro de 12:12 horas), com

acesso livre à água e ração. Os mesmos foram mantidos no biotério após a chegada

por um período mínimo de três dias antes de serem utilizados nos experimentos.

Para a realização dos experimentos, os animais foram manipulados de acordo

com os Princípios Éticos de Experimentação Animal adotado pela Sociedade

Brasileira de Ciência de Animais de Laboratório (SBCAL) e seguindo as normas da

Comissão de Ética para o Uso de Animais (CEUA) da Universidade de São Paulo

(Protocolo: nº 157 nas fls. 112 do livro 02) e do Hospital Sírio Libanês (Protocolo:

CEUA201106).

Os experimentos com animais Selvagens ou knockout homozigotos para os

receptores Mu ou Delta opióide foram realizados no Laboratório da Dra. Lakshmi

Devi do Mount Sinai Hospital – Pharmacology and Systems Terapeutics

Departments – New York, seguindo as normas da Comissão de Ética para o Uso de

Animais do local. Esses animais foram fornecidos pelo The Jackson Laboratory.

37

3.2 Modelo experimental de neuropatia periférica diabética

A estreptozotocina (STZ) é uma glicosamina-nitrosureia que tem sido

largamente utilizada experimentalmente como indutora de diabetes mellitus do tipo I,

a mesma é captada pelas células B de Langerhan pancreáticas que contêm

transportadores de glicose GLUT-2 (Akbarzadeh et al., 2007; Elsner et al., 2000;

Szkudelski, 2001). Dentre os mecanismos propostos para a citotoxicidade produzida

pela STZ estão a alcalinização do DNA celular e subsequente ativação da poli-ADP

ribose sintetase que causam depleção rápida e letal de NAD nas células

pancreáticas, com subsequente redução no nível de ATP e posterior inibição da

síntese e secreção da insulina, ou ainda, evidências indicam que os radicais livres

podem ter um papel essencial no efeito diabetogênico da STZ (Bennett, Pegg, 1981;

Szkudelski, 2001; Takasu et al., 1991).

Dessa maneira, para a indução do diabetes, camundongos receberam injeção

única intraperitoneal de STZ (200 mg/Kg; Sigma), dissolvida em salina estéril 0.9%,

após restrição alimentar de 4 horas (Coppey et al., 2011; Davidson et al., 2009). O

diabetes foi confirmado nos camundongos após 7 dias da injeção de STZ através

dos níveis de glicose sanguínea extraído da cauda dos animais, utilizando-se tiras

de teste ACCU-CHEK (Roche Diagnostics) para verificação da hiperglicemia (≥ 16

mmol/l ou 300 mg/dl – normal 5-8 mmol/l). Os animais que receberam somente

salina estéril 0.9% foram utilizados como controle .

A neuropatia diabética foi constatada pela avaliação do limiar de sensibilidade

mecânica após o 7º dia da injeção de STZ utilizando-se filamentos de von Frey.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Szkudelski%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11829314


38

3.3 Testes comportamentais

Para todos os modelos comportamentais, foi realizado previamente o teste

inicial (tempo 0) e após 7 dias da injeção de STZ . Após a avaliação

comportamental foi iniciado o tratamento com Hp ou Salina (Sal) e após 7, 14 ou 28

dias do tratamento, os testes comportamentais foram realizados no dia seguinte a

última dose de Hp ou Sal (ou seja, no 8º, 15º ou 29º dia). Além disso, nos mesmos

dias após a realização dos testes comportamentais foram inferidos os níveis de

glicose sanguínea e o peso corporal dos animais.Todos os animais passaram por

habituação previa nos respectivos equipamentos antes da realização dos

experimentos.

3.3.1 Teste de sensibilidade ao estímulo mecânico

A avaliação da sensibilidade ao estímulo mecânico baseou-se no método de

Chaplan e colaboradores (1994) onde são utilizados filamentos von Frey. Os

filamentos de von Frey consistem em filamentos de nylon de diferentes diâmetros

responsáveis por empregar diferentes intensidades de força. Tal teste consiste em

um conjunto de nove filamentos que foram aplicados sobre a região plantar da pata

posterior de cada animal.

Os filamentos utilizados foram: 0.07 g, 0.16 g, 0.4 g, 0.6 g, 1.0 g, 1.4 g, 2.0 g,

4.0 g, 6.0 g. Sendo que o limiar de retirada da pata foi determinado pelo aumento ou

diminuição sequencial da força. O teste foi iniciado sempre com o filamento de 1.0 g

e a contagem da de respostas foi iniciada quando a primeira resposta foi negativa e

a segunda positiva. A partir desta resposta negativa/positiva, foram registradas mais

quatro respostas, respeitando-se sempre o princípio de que uma resposta positiva é

sempre seguida por um estímulo (filamento) inferior ao anterior, enquanto que uma

resposta negativa é sempre seguida por um estímulo (filamento) superior ao

anterior. Uma resposta é considerada positiva quando o animal retira a pata ao

39

estímulo mecânico, e negativa quando o animal não possuiu reação alguma. O limiar

de retirada da pata do animal foi analisado observando os padrões de respostas,

onde estes padrões foram inseridos no cálculo a seguir:

50% g = 10 [ Xf + K.γ]

Sendo que:Xf é o valor do último filamento em gramas que é convertido em log de

base 10; K: é o valor da sequência de seis respostas as quais os dados foram

retirados da tabela (Chaplan et al., 1994); e ϒ: é a média da diferença (em log) entre

os filamentos apresentados.

3.3.2 Teste de sensibilidade ao estímulo térmico

O teste plantar de sensibilidade ao estímulo térmico foi realizado de acordo

com o método descrito por Hargreaves e colaboradores (1988). Este teste utiliza

como estímulo o calor induzido por energia radiante utilizando o aparato IITC Life

Science. A sensibilidade ao estímulo térmico foi definida como a latência em

segundos da permanência da pata do animal sobre o foco de luz. O feixe de luz

radiante foi direcionado à superfície plantar da pata posterior esquerda do animal por

três vezes com intervalos de cinco minutos, esse feixe foi ajustado a 30% da

intensidade máxima de aquecimento, com cutoff de 20 segundos. Os resultados

foram analisados pela comparação das médias das medidas iniciais e/ou finais, ou

ainda comparando-se as medidas obtidas nos diferentes grupos experimentais.

Para o teste de retirada de cauda, foi utilizado o mesmo aparato utilizando os

seguintes parâmetros: o feixe de luz foi ajustado a uma intensidade de 10%, com

cutoff de 20 segundos.

40

3.4 Drogas

Hemopressina (Hp) (Proteimax) - agonista inverso de RCB1 foi dissolvida em

salina e administrada por via oral na dose de 2,5 mg/Kg (Toniolo et al., 2014);

Naltrexone hydrochloride (NTX) (Tocris) - antagonista opióide de largo

espectro foi dissolvido em salina e administrado por injeção intraperitoneal na

dose de 1 mg/Kg (Dym et al., 2012), 20 minutos antes do teste

comportamental;

Naltriben mesylate (NTB) (Tocris) - antagonista seletivo para δ opióide foi

dissolvido em 50 mM de DMSO e administrado por injeção intraperitoneal na

dose de 1 mg/Kg (Saitoh et al., 2011), 20 minutos antes do teste

comportamental;

Salina ou DMSO foram utilizados para os grupos controles. Somente os

animais selvagens receberam injeção dos antagonistas NTB ou NTX, onde foram

administrados separadamente ou concomitantemente com Hp.

3.5 Imunofluorescência

Os animais foram anestesiados com quetamina e xilazina (1:1, 10 μL / 10 g de

peso corpóreo) e submetidos à perfusão transcardíaca, com solução salina 0.9% por

um minuto (5 mL / min - a temperatura ambiente), seguida de solução de

formaldeído 4% (PFA) por nove minutos (5 mL / min - a 4 ºC), dissolvido em tampão

fosfato 0,1 M (PB, pH 7,4). Após a perfusão, a medula espinal foi coletados e

armazenados em PFA por 6 h e após este período, o material foi transferido para

uma solução de sacarose a 30% em PB onde ficaram armazenados até o momento

do corte.

Os tecidos referentes a medula espinal foram cortados em uma espessura de

20 μm em micrótomo deslizante de congelamento (Leica, EUA). Os cortes foram

coletados em placa de cultivo de 8 unidades contendo solução anti-freenzing (PB

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Saitoh%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21565223

41

0.05 M, sacarose e etilenoglicol) e mantidos a -20 ºC até o momento da realização

do experimento.

No momento do ensaio, os cortes foram mantidos sob agitação constante a

temperatura ambiente, e submetidos às seguintes etapas: a) 3 lavagens de 10

minutos cada em PB 0,1 M; b) 2 lavagens de 5 minutos em solução de

permeabilização (para 25 mL: 24,925 mL de PBS e 75 µl de TritonX-100); para a

marcação de CB1-Mu ou CB1-Delta os tecidos não passaram por esse item b; c)

somente para o anticorpo para marcação de microglia foi realizada a seguinte etapa

adicinal: os tecidos foram levados ao banho-maria por 30 minutos à 75 ºC em

Tampão citrato 10 mM (0,294 g de citrato de sódio e 100 mL de água destilada); d)

incubação por 2 horas em em temperatura ambiente em solução de bloqueio (Para

25 mL: 23 mL de KPBS, 1,25 mL NDS e 75 µl de TritonX-100); e) incubação de 16

horas a 4 ºC sob agitação em anticorpo primário específico para Anti-cannabinoid

receptor CB1 (1:750, Calbiochem) e Anti-glial fibrillary acidic protein, clone GA5

(1:800, Millipore) ou Anti-Iba-1/AIF1 (1:750, Millipore), Anti-CB1-Mu ou Anti-CB1-

delta (1:500, produzidos pela Dra. Achla Gupta do Laboratório da Dra. Lakshmi

Devi). Todos foram diluídos em solução de diluição (para 10 ml: 30 µl de TritonX-

100, 0,1 g de BSA e 9,970 mL de KPBS); f) 3 lavagens de 5 minutos em KPBS; g)

incubação por 2 horas em temperatura ambiente na ausência de luz com anticorpos

secundários fluorescentes AlexaFluor® 488-conjugated AffiniPure Donkey anti-rabbit

IgG (verde) (1:800, Jackson ImmunoResearch Laboratories) e/ou CYTM3- conjugated

AffiniPure Donkey anti-mouse IgG (vermelho) (1:800, Jackson ImmunoResearch

Laboratories) ou ainda Tetramethylrhodamine (TRITC)-conjugated AffiniPure Donkey

anti-rat IgG (vermelho) (1:100, Jackson ImmunoResearch Laboratories) diluídos em

solução de diluição decrita acima; h) 3 lavagens de 5 minutos em KPBS) os cortes

foram montados nas lâminas com 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)

(InvitrogenTM/Life Technologies) e as lamínulas foram vedadas com esmalte. Os

cortes foram mantidos a 4 ºC e a imunorreatividade foi capturada no microscópio de

fluorescência (80i, Nikon) no mesmo dia ou no dia seguinte à reação, para posterior

análise. Foram capturadas imagens da imunomarcação para CB1, astrócito,

microglia, CB1-Mu e CB1-Delta respectivamente. Posteriormente a aquisição das

fotografias, as mesmas foram quantificadas no programa ImageJ, onde foram

42

realizadas a densidade integrada para a marcação de astrócito e realizado a

contagem de número de células marcadas para CB1, microglia, CB1-Mu e CB1-

Delta.

3.6 Imunofluorescência utilizando anticorpos sensíveis ao estado de ativação

Para esse ensaio foi utilizado anticorpo sensível à alteração conformacional

que reconhecem seletivamente alterações na região N-terminal da proteína G,

resultantes da ativação do receptor (Gupta el al., 2007).

Para tanto, os cortes da medula espinal, foram obtidos dos animais após a

perfusão como descrito previamente. Quando o ensaio foi realizado, os cortes foram

incubados por 4 horas em solução de bloqueio (BSA 0,1%; sacarose 0,5% em 10

mL de PBS), após essas 4 horas foi adicionado o anticorpo primário fluorescente

específico para o receptor CB1 (1:8000 - Proteimax) diluído em PBS, o qual

permaneceu por 16 horas à 4 ºC. Após esse período foram realizadas 4 lavagens de

20 minutos cada com PBS em temperatura ambiente. Os cortes foram mantidos na

ausência de luz, e mantidos em 4 °C até o momento da leitura. A intensidade de

imunofluorescência foi detectada pelo sistema de imagem Odyssey (LI-COR,

Biosciences).

A identificação da região selecionada para a quantificação da medula espinal

foi determinada por comparação com imagens do Paxinos e Franklin’s (2012). A

região de interesse (CPME) foi definida e a intensidade integrada, correspondente a

pixels/mm2, foi determinada pelo software Odyssey (Kearn, 2004).

43

3.7 Histologia

Após a perfusão transcardíaca dos animais como descrito no item 3.5 o nervo

isquiático foi retirado na porção mais distal e colocado em solução de PFA 4% de 16

a 18 horas a 4 °C. Após esse período o material foi lavado por 3 vezes de 10

minutos em PB e pós-fixado em tetróxido de ósmio 1% em PB por 1 hora em

temperatura ambientemantido sob agitação leve. Posteriormente foi lavado por 3

vezes de 10 minutos em PB e colocado em álcool 50% e acondicionado a 4 °C até o

momento do corte. Em seguidao material passou por desidratação crescente em

álcool (70%, 95% por duas vezes e 100% por duas vezes), seguido por dois banhos

de parafina a 60 ºC, posteriormente foram obtidos cortes transversais de 5μm da

porção distal do nervo isquiático com navalha de aço descartável (Leica 818 high

profile) e colocados no banho-maria a 45 ºC. Os cortes foram aderidos em lâminas

histológicas. Em seguida foi realizada a coloraçãode azul de toluidina a 1% em

bórax, após esse procedimento foi colocado a lamínula sobre os cortes e a mesma

foi fixada com Enttelan®. Após a secagem, as lâminas foram fotografadas, e

quantificadas por G Ratio Image J (http://gratio.efil.de/), onde foram considerados os

seguintes parâmetros para a espessura de mielina: fibras Aδ (1-6 μm) e fibras Aβ (6-

12 μm) (Kandel, Schwartz, Jessee, 2003).

3.8 ELISA para Quantificação de NGF do Nervo Isquiático

Primeiramente foi realizada a extração e dosagem de proteína total do nervo

isquiático. As amostras de nervo isquiático foram mantidas a -80 ºC após a extração

do animal até o momento da extração da proteína total. Para tal, as amostras foram

mantidas a 4 ºC e imediatamente adicionado 100 µl de Tampão de lise (137 mM de

NaCl, 20 mM de Tris HCl, 1% de NP40, 10% de glierol, 100 µl de inibidor de

44

protease (Sigma) e 100 µl de inibidor de fosfatase (Roche)). O tecido foi

homogeneizado e mantido por 15 minutos a 4 ºC sob agitação. Em seguida as

amostras foram centrifugadas a 10.000g por 15 minutos a 4 ºC, e o sobrenadante foi

retirado e armazenado em dois tubos, um contendo 5 µl para a dosagem de

proteínas totais e o restante para a dosagem do NGF. Ambos os tubos foram

mantidos a -80 ºC até a realização do experimento.

Para a dosagem de proteína foi utilizado o protocolo DC Protein Assay (BIO

RAD). Foram preparados seis diluições para servir de proteína padrão/curva padrão

nas concentrações de: 125, 250, 500, 1000, 1500 e 2000 µg/mL. Foi utilizado a

relação de 1:2 para as amostras (5 µl da amostra para 10 µl do tampão de lise).

Todas as amostras foram dosadas em duplicatas, onde em cada poço foi pipetado 5

µl da amostra + 25 µl da solução A´ (20 µl do reagente S para cada 1 mL do

reagente A) + 200 µl do reagente B, após adicionar todos os componentes, a placa

foi incubada por 15 minutos em temperatura ambiente e em seguida foi realizada a

leitura para absorbância (750 nm). (Epoch (Biotek)).

Para a quantificação de NGF foi seguido o protocolo NGF Emax® Immuno

Assay System (Promega). Onde no primeiro dia foi realizado o revestimento da placa

(Imuno Maxisorp (Thermo Scientific)) com 100 µl por poço de anti-NGF pAb diluído

em carbonate coating buffer (10 µl de anti-NGF pAb para 10 mL de carbonate

coating buffer- 0,025 M de bicarbonato de sódio, 0,025 M de carbonato de sódio em

pH 9.7). Em seguida a placa foi selada e incubada overnighta 4 ºC com agitação

leve.

No dia seguinte a placa foi removida de 4 ºC e o conteúdo dos poços foram

descartados, em seguida a placa foi batida por três vezes em papel toalha para a

remoção do líquido residual. Posteriormente a placa foi lavada por uma vez com

TBST (100 µl por poço) e o conteúdo dos poços foi descartado. Foram adicionados

200 µl por poço do Block & Sample 1X Buffer (34.4 mL de água deionizada para 8,6

mL de Block & Sample 5X Buffer) e incubado por 1 hora em temperatura ambiente

sem agitação. Após esse período de bloqueio, o Block & Sample 1X Buffer foi

descartado, e o líquido residual foi removido. A placa foi lavada uma vez com TBST

(200 µl por poço) e a retirada do líquido residual foi realizada.

45

Em seguida, foram pipetados 100µl por poço da curva padrão nas

concentrações de 3.9, 7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125 e 250 pg/mL, utilizando o NGF

Standard (1 µg/mL) diluindo-o para as respectivas concentrações em Block &

Sample 1X Buffer. Para as amostras foi utilizada uma diluição de 1:1,75. Foi

pipetado o volume de 100 µl da amostra por poço (em duplicata), e em seguida a

placa foi incubada por 6 horas em temperatura ambiente com agitação. Após a

incubação a placa foi lavada por 5 vezes com TBST e posterior a cada lavagem foi

realizada a retirada do excesso de líquido como descrito previamente.

Posteriormente, foi adicionado 100 µl de anti-NGF mAb por poço (diluição de 1:4000

- 2.5 µl anti-NGF mAb para 10 mL de Block & Sample 1X Buffer) e em seguida a

placa foi selada e incubada overnight a 4 ºC sem agitação.

No dia seguinte foi diluído o anti-Rat IgG, HRP Conjugado em Block & Sample

1X Buffer (na concentração de 1:100), e pipetado 100 µl por poço, o mesmo foi

incubado por 2.5 horas em temperatura ambiente com agitação. Após a incubação

foram realizadas 5 lavagens com TBST e posterior a cada lavagem foi realizada a

retirada do excesso de líquido. Na sequência foi adicionado 100 µl de TMB One

Solution por 10 minutos sob agitação. A reação foi parada adicionando 100 µl de 1N

de ácido clorídrico. A leitura foi realizada medindo a absorbância em 450 nm

(Synergy 2 Multi-Mode Reader (Biotek)).

46

4 RESULTADOS

4.1 Padronização do modelo de diabetes do tipo 1 em camundongos C57BL/6/JUnib

Inicialmente foi realizada a padronização da dose de estreptozotocina a ser

utilizada no presente trabalho, uma vez que a literatura reporta uma gama de doses

para a indução do diabetes mellitus em camundosngos. Assim foram testadas as

doses mais comuns usadas para a linhagem escolhida para o desenvolvimento

deste projeto. Camundongos foram injetados por via intraperitoneal (i.p.) com injeção

única nas doses de 100, 150, 200 ou 250 mg/kg, ou ainda 40 ou 50 mg/kg por 5 dias

consecutivos (Gráfico 1A). Dentre todas as doses testadas as doses de 200 ou 250

mg/kg apresentaram diferença significativa quando comparadas com o grupo salina.

Sendo selecionada a menor dose de STZ (200 mg/kg) com a máxima eficácia para a

realização dos experimentos subsequentes (Gráfico 1A). Esta padronização de dose

foi novamente padronizada para os ensaios com os animais Knockout para os

receptores Delta opióide ou Mu opióide. Para tanto, animais selvagem (WT-

controle) foram injetados com diferentes doses de STZ e nestes animais a dose

eficaz para a indução do diabetes foi de 150 mg/kg (Gráfico 1B).

47

0 7

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0

S a lin a

S T Z 1 5 0 m g /k g

S T Z 1 0 0 m g /k g

S T Z 2 0 0 m g /k g

S T Z 2 5 0 m g /k g

S T Z 5 x 4 0 m g /k g

S T Z 5 x 5 0 m g /k g

***

***

T e m p o (d ia s )

Gli

co

se

no

sa

ng

ue

(m

g/d

L)

A

T e m p o (d ia s )

Gli

co

se

no

sa

ng

ue

(m

g/d

L)

0 7

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0

S a lin a

S T Z 1 0 0 m g /k g

S T Z 1 5 0 m g /k g

***

B

Gráfico 1 - Níveis de glicose sérica de camundongos tratados por via intraperitoneal com diferentes doses de estreptozotocina (STZ). (A) Camundongos C57BL/6/JUnib e (B) Selvagem, controle dos animais knockout para receptores Mu ou Delta opióides. As medidas de glicose foram realizadas antes da injeção de STZ (tempo 0) e após 7 dias do tratamento. Os dados correspondem à média ± e.p.m.de 4-7 animais por grupo. ***p< 0,001 em relação ao grupo Salina. (ANOVA de duas vias, seguido do pós-teste de Bonferroni).

48

4.2 Efeito do tratamento com Hp sobre os níveis de glicose

A dosagem sanguínea de glicose (previamente descrito) foi realizada antes de

qualquer tratamento (tempo 0) e 7 dias após a injeção de STZ ou Sal e novamente

após 7, 14 ou 28 dias após o tratamento com Hp ou Sal. Foi possível observar que

os animais do grupo controle (Sal+Sal e Sal+Hp) não apresentaram alterações nos

níveis de glicose no sangue com o passar do tempo, demonstrando que o

tratamento com Hp não é capaz de interferir com os níveis glicêmicos dos animais.

Por outro lado, no grupo de animais diabéticos tratados com Hp (STZ+Hp) observou-

se uma evolução no desenvolvimento do diabetes, assim como o grupo de animais

diabéticos tratados com salina (STZ+Sal), demonstrando que o tratamento com Hp

não interferiu no aumento dos níveis glicêmicos nos mesmos (Gráfico 2).

49

0 7 815

29

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0

S a l+ H p

S T Z + S a l

S T Z + H p

***

***

*** ******

*********

S a l+ S a l

T ra ta m e n to c o m H p

A pós

S T Z

T e m p o (d ia s )

Gli

co

se

no

sa

ng

ue

(m

g/d

L)

Gráfico 2 - Níveis de glicose sérica (mg/dL) de camundongos injetados com

estreptozotocina (STZ - 200 mg/kg (i.p.)) ou Salina (Sal) avaliados ao longo do tratamento oral com hemopressina (Hp - 2,5 mg/kg) ou Sal. Os níveis de glicose foram mensurados antes de qualquer tratamento (tempo 0) e 7 dias após a injeção de STZ ou Sal para verificar a presença da hiperglicemia ou a normalidade dos níveis de glicose, os animais foram tratados com Hp ou Sal por 7, 14 ou 28 dias. Sendo mensurados os níveis de glicose no dia seguinte a última administração de Sal ou Hp (8º, 15º, ou 29º dia). Os dados correspondem à média ± e.p.m. de 8-10 animais por grupo. ***p<0,001 em relação ao grupo Sal+Sal e Sal+Hp. (ANOVA de duas vias, seguido de pós-teste de Bonferroni).

50

4.3 Efeito do tratamento com Hp sobre o peso corpóreo

Os animais foram pesados antes de qualquer tratamento (tempo 0), 7 dias

após a injeção de STZ ou Sal e após 7, 14 ou 28 dias de tratamento com Hp ou Sal.

A Hp não comprometeu o ganho de peso nos animais do grupo controle (Sal+Hp),

uma vez que o ganho de peso foi semelhante ao grupo Sal+Sal. Ainda, o tratamento

com Hp não foi capaz de prevenir a perda de peso nos animais diabéticos, uma vez

que o grupo STZ+Hp apresentou grande perda de peso assim como o grupo

STZ+Sal (Gráfico 3).

51

0 7 8 1 5 2 9

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

S a l+ H p

S T Z + H p

S T Z + S a l

*** *** ****** ***

******

S a l+ S a l

**


A pós

S T Z

T e m p o (d ia s )

Pe

so

(g

)

Gráfico 3 - Peso corpóreo de camundongos injetados com estreptozotocina (STZ - 200 mg/kg (i.p.)) ou Salina (Sal) avaliados ao longo do tratamento oral com hemopressina (Hp - 2,5 mg/Kg) ou Sal. O peso foi aferido antes de qualquer tratamento (tempo 0) e 7 dias após a injeção de STZ ou Sal. Após esse período, os animais foram tratados com Hp ou Sal por 7, 14 ou 28 dias sendo o peso aferido no dia seguinte a última administração de Sal ou Hp (8º, 15º, ou 29º dia).Os dados correspondem à média ± e.p.m. de 8-10 animais por grupo. **p<0,01; ***p<0,001 em relação ao grupo Sal+Sal (ANOVA de duas vias, seguido de pós-teste de Bonferroni).

52

4.4 Efeito do tratamento com Hp na sensibilidade mecânica

A medida da sensibilidade mecânica foi realizada antes de qualquer

tratamento (tempo 0), 7 dias após a injeção de STZ ou Sal e novamente após 7, 14

ou 28 dias após o tratamento com Hp ou Sal.

Os resultados obtidos demonstram que os animais dos grupos controle

(Sal+Sal e Sal+Hp) não apresentaram alterações na sensibilidade ao estímulo

mecânico, demonstrando que a Hp por si só não induz mudanças no limiar sensitivo

mecânico desses animais (Gráfico 4). Já os grupos que receberam injeção i.p. de

STZ apresentaram alodínia mecânica a partir do 7º dia da injeção, perdurando por

pelo menos 28 dias (Gráfico 4). O tratamento dos animais diabéticos com Hp (grupo

STZ+Hp), reverteu a alodínia mecânica dos animais em todos os tempos avaliados

(Gráfico 4).

53

0 7 815

29

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

S T Z + S a l

S T Z + H p

S a l+ H p

***

*** ******

S a l+ S a l


A pós

S T Z

T e m p o (d ia s )

Lim

iar (

g)

Gráfico 4 - Efeito da injeção de estreptozotocina (STZ - 200 mg/kg (i.p.)) ou Salina (Sal) e do tratamento oral com hemopressina (Hp - 2,5 mg/kg (p.o.)) ou Sal sobre a sensibilidade mecânica de camundongos avaliados por filamentos de von Frey. Os animais foram avaliados antes de qualquer tratamento (tempo 0) e após 7 dias da injeção com STZ ou Sal. Uma vez confirmada a neuropatia os animais foram tratados com Hp ou Sal por 7, 14 ou 28 dias, sendo a sensibilidade mecânica aferida nos dias 8, 15, ou 29 após os tratamentos. Os dados correspondem à média ± e.p.m. de 8-10 animais por grupo.***p<0,001 em comparação com o grupo Sal+Sal e Sal+Hp. (ANOVA de duas vias, seguido do pós-teste de Bonferroni).

54

4.5 Monitoramento das alterações de sensibilidade ao estímulo térmico durante o tratamento com Hp

Os resultados demonstram que os grupos controles que receberam injeção

i.p. de Sal e tratamento com Sal ou Hp não apresentaram diferença na latência ao

estímulo térmico. Adicionalmente, a Hp por si só não induziu alterações na

sensibilidade ao estímulo térmico dos animais como observado no Gráfico 5.

Entretanto, animais tratados com STZ+Sal apresentaram perda da sensibilidade ao

estímulo térmico após 14 dias da injeção de STZ, sendo este efeito observado até o

28º dia de avaliação (Gráfico 5). Resultados semelhantes foram observados para os

animais STZ+Hp com a perda da sensibilidade ao estímulo térmico, observada a

partir do 14º dia persistindo até o 28º dia de tratamento quando comparado com os

grupos controles (Gráfico 5).

55

0 7 8

15

29

0

5

1 0

1 5

2 0

S a l+ S a l

S a l+ H p

S T Z + S a l

S T Z + H p

***/# #


A pós

S T Z

T e m p o (d ia s )

La

tên

cia

(s

)

**/ #

*/# #

*/ #

Gráfico 5 - Efeito da injeção de estreptozotocina (STZ - 200 mg/kg (i.p.)) ou Salina (Sal) e do tratamento oral com hemopressina (Hp - 2,5 mg/kg (p.o)) ou Sal sobre a sensibilidade térmica de camundongos avaliados pelo teste plantar. Os animais foram avaliados antes de qualquer tratamento (tempo 0), 7 dias após a injeção de STZ ou Sal, e após o tratamento com Hp ou Sal por 7, 14 ou 28 dias, sendo o teste plantar aferido 8, 15, ou 29 dias após os tratamentos. Os dados correspondem à média ± e.p.m. de 5 animais por grupo. *p<0,05; **p<0,01;***p<0,001 (comparados com o grupo Sal+Sal), #p<0,05; ##p<0,01 (comparados com o grupo Sal+Hp) (ANOVA de duas vias, seguido de pós-teste de Bonferroni).

56

4.6 Efeito da hemopressina sobre o estado de ativação de receptores CB1 na coluna posterior da medula espinal de camundongos diabéticos

Os resultados obtidos demonstram que a STZ induz um aumento na

expressão de receptores CB1 ativados (RCB1) após 7 dias de sua administração

(Gráfico 6A), sendo que este aumento não é mais detectado ao 14º dia após a STZ

(Gráfico 6B), mas é novamente detectado aos 28 dias de avaliação (Gráfico 6C). O

tratamento crônico com Hp foi capaz de aumentar a expressão de RCB1 em animais

controle após 28 dias de tratamento (Gráfico 6C). No que se refere ao grupo de

animais injetados com STZ, o tratamento com Hp aumentou a expressão de RCB1

ativado 7 dias após o tratamento (Gráfico 6A) sendo que este efeito permaneceu

após 28 dias de tratamento (Gráfico 6C).

57

Gráfico 6 - Análise quantitativa para receptor CB1 ativado de amostras da coluna posterior da medula espinal de camundongos avaliado por imunofluorescência. Os dados representam o padrão de marcação para receptor CB1 ativado em camundongos normais ou animais diabéticos injetados com estreptozotocina (STZ - 200 mg/kg (i.p.)) tratados por 7(A), 14 (B) ou 28 dias (C) com hemopressina (Hp - 2,5 mg/kg (p.o.)) ou Salina (Sal). Além disso é apresentado a imagem digital de cortes da medula espinal de camundongos após 7 (D), 14 (E) ou 28 dias (F) de tratamento, ilustrando a marcação determinada pelo Odyssey. Os dados correspondem à média ± e.p.m. de 4-6 animais por grupo. *p<0,05 e **p<0,01 (comparados com o grupo Sal+Sal);#p<0,05(comparados com o grupo Sal+Hp) e $p<0,05(quando comparados os grupos STZ+Sal vs STZ+Hp) (ANOVA de uma via, seguido de pós-teste de Bonferroni).

58

4.7 Efeito do tratamento com hemopressina sobre a expressão de receptores CB1, astrócitos e micróglia no corno posterior da medula espinal

Os resultados demonstram que o tratamento com STZ induziu um aumento

na expressão de receptores CB1 no 14º e 28º dias de avaliação quando comparados

com o grupo de animais tratados com salina (Gráfico 7B e C). Por outro lado, o

tratamento com Hp foi capaz de dimunuir a expressão de RCB1 na coluna posterior

da medula espinal dos animais injetados com STZ no 14º e 28º dias de avaliação

(Gráfico 7B e C). Nenhuma alteração na expressãode RCB1 foi observada aos 7

dias de avaliação (Gráfico 7A). Interessantemente, a Hp por si só induziu um

aumento na expressão de RCB1 aos 28 dias de avaliação (Gráfico 7C).

59

Gráfico 7 - Análise quantitativa donúmero de células marcadas para receptores CB1 na coluna posterior da medula espinal de camundongos, avaliado por imunofluorescência. Os dados representam o padrão de marcação para receptor CB1 em camundongos normais ou diabéticos injetados com estreptozotocina (STZ - 200 mg/kg (i.p.)) tratados por 7(A), 14 (B) ou 28 dias (C) com hemopressina (Hp - 2,5 mg/kg (p.o.)) ou Salina (Sal). (D-F) Fotomicrografias representativas do padrão de marcação obtida por microscopia de fluorescência (aumento de 20 x) da expressão de receptores CB1 nos diferentes grupos avaliados. Os dados correspondem à média ± e.p.m. de 5-6 animais por grupo. *p<0,05 e ***p<0,001 (comparados com o

grupo Sal+Sal); ##

p<0,01 e ###

p<0,001 (comparados com o grupo Sal+Hp) e $p<0,05 e $$p<0,01 (quando comparados os grupos STZ+Sal vs STZ+Hp). (ANOVA de uma via, seguido de pós-teste de Bonferroni).

60

De maneira semelhante ao observado para RCB1, a STZ induziu aumento

para astrócitos na coluna posterior da medula espinal dos animais diabéticos no 14º

e 28º dias de avaliação (Gráfico 8B e C) sendo este aumento novamente revertido

pelo tratamento com Hp (Gráfico 8B e C). Ainda, nenhuma alteração na expressão

de astrócitos foi observada aos 7 dias de avaliação (Gráfico 8A).

61

Gráfico 8 - Análise quantitativa da intensidade integrada por mm2 para a expressão de astrócitos na coluna posterior da medula espinal de camundongos avaliado por imunofluorescência. Os dados representam o padrão de marcação para astrócitos em camundongos normais ou diabéticos injetados com estreptozotocina (STZ - 200 mg/kg (i.p.)) tratados por 7(A), 14 (B) ou 28 dias (C) com hemopressina (Hp - 2,5 mg/kg (p.o.)) ou Salina (Sal). (D-F) Fotomicrografias representativas do padrão de marcação obtida por microscopia de fluorescência (aumento de 20 x) da expressão de astrócitos nos diferentes grupos avaliados. Os dados correspondem à média ± e.p.m. de 5-6 animais por grupo. *p<0,05 e ***p<0,001 (comparados com o grupo Sal+Sal); ##p<0,01 e ###p<0,001 (comparados com o grupo Sal+Hp) e $p<0,05 e $$p<0,01 (quando comparados os grupos STZ+Sal vs STZ+Hp). (ANOVA de uma via, seguido de pós-teste de Bonferroni).

F

62

Com relação à marcação para micróglia, nenhuma alteração foi detectada na

expressão de IBA1-A na CPME após 7 dias de tratamento (Gráfico 9A). No grupo

avaliado após 14 dias, observou-se uma diminuição na expressão de micróglia nos

animais STZ sendo este efeito revertido pelo tratamento com Hp (Gráfico 9B). Por

outro lado, aos 28 dias de avaliação observou-se uma diminuição no número de

células microgliais apenas no grupo STZ+Hp, quando comparados com o grupo

controle e STZ+Sal (Gráfico 9C).

63

Gráfico 9 - Análise quantitativa do número de células marcadas para micróglia na coluna posterior da medula espinal de camundongos, avaliado por imunofluorescência. Os dados representam o padrão de marcação para receptor IBA-1/A em camundongos normais ou diabéticos injetados com estreptozotocina (STZ - 200 mg/kg (i.p.)) tratados por 7(A), 14 (B) ou 28 dias (C) com hemopressina (Hp - 2,5 mg/kg (p.o.)) ou Salina (Sal). (D-F) Fotomicrografias representativas do padrão de marcação obtida por microscopia de fluorescência (aumento de 20 x) da expressão de microglia nos diferentes grupos avaliados. Os dados correspondem à média ± e.p.m. de 5-6 animais por grupo. ***p<0,001 (comparados com o grupo Sal+Sal); ###p<0,001 (comparados com o grupo Sal+Hp) e $p<0,05 e $$p<0,01 (quando comparados os grupos STZ+Sal vs STZ+Hp). (ANOVA de uma via, seguido de pós-teste de Bonferroni).

64

4.8 Efeito do tratamento com hemopressina sobre a mielina do nervo isquiático de camundongos diabéticos

Os resultados obtidos demonstram que não foram observadas alterações

significativas na espessura da mielina das fibras Aδ e Aβ para o grupo avaliado após

7 dias de tratamento (Gráfico 10A). Por outro lado, após 14 dias de tratamento foi

observada uma diminuição na espessura da mielina dos animais tratados com STZ

quando comparados aos grupos controles. Ainda, o tratamento com Hp foi capaz de

reestabelecer a mielina dos animais diabéticos (Gráfico 10B).

65

Gráfico 10 - Análise quantitativa da espessura de mielina para as fibras Aδ e Aβ. Os dados correspondem à quantificação da espessura (µm) da mielina para as fibras do nervo isquiático de camundongos normais ou diabéticos, injetados com estreptozotocina (STZ - 200 mg/kg (i.p.)) e após 7(A) ou (B) 14 dias de tratamento com hemopressina (Hp - 2,5 mg/kg (p.o.)) ou Salina (Sal). (C-D) Fotomicrografias representativas de cortes do nervo isquiático de camundongos marcados com azul de toluidina, ilustrando o padrão de marcação para fibras mielinizadas dos diferentes grupos avaliados. As imagens correspondem a secções de 5 µm obtidas por microscopia (100 x). Os dados correspondem à média ± e.p.m. de 6-12 animais por grupo. *p<0,05 (comparados com o grupo Sal+Sal); ##p<0,01 (comparados com o grupo Sal+Hp) e $p<0,05(quando comparados os grupos STZ+Sal vs STZ+Hp). (ANOVA de uma via, seguido de pós-teste de Bonferroni).

66

4.9 Efeito do tratamento com hemopressina sobre o fator de crescimento do nervo (NGF) no nervo isquiático de camundongos diabéticos

O tratamento com STZ induziu uma diminuição progressiva dos níveis de

NGF no nervo isquiáticos dos animais quando comparados com o grupo controle em

todos os tempos avaliados (Gráfico 11). Ainda, o tratamento com Hp foi capaz de

induzir um aumento dos níveis de NGF nos grupos de animais diabéticos no 7º e 28º

dias de avaliação (Grafico 11 A e C) sem interferir no entanto com os níveis de NGF

no 14º dia de avaliação (Grafico 11B). Interessantemente, a Hp por si só não foi

capaz de ineterferir com os níveis de NGF de animais normais no 7º e 14º dias de

avaliação (Grafico 11 A e B) no entanto, aos 28 dias de tratamento foi observado

aumento nos níveis de NGF para o grupo de animais controle tratados com

hemopressina (Grafico 11C).

67

Gráfico 11 - Níveis de NGF (pg/mL) no nervo isquiático de camundongos normais ou diabéticos injetados com estreptozotocina (STZ - 200 mg/kg (i.p.)) tratados por 7(A), 14 (B) ou 28 (C) dias com hemopressina (Hp - 2,5 mg/kg (p.o.)) ou Salina (Sal). Os dados correspondem à média ± e.p.m. de 5-8 animais por grupo. *p<0,05, **p<0,01 (comparados com o grupo Sal+Sal);#p<0,05, ##p<0,01 (comparados com o grupo Sal+Hp) e $$p<0,01(quando comparados os grupos STZ+Sal vs STZ+Hp). (ANOVA de uma via, seguido de pós-teste de Bonferroni).

68

4.10 Efeito da Hp em camundongos knockout para receptores Mu ou Delta opióide na realização do teste ao estímulo quente (teste de retirada de cauda - Tail Flick) ou teste de sensibilidade ao estímulo mecânico (von Frey)

A avaliação comportamental do efeito da hemopressina em animais Knockout

(KO) para receptores Mu ou Delta opióides demonstrou que o tratamento com Hp

em animais selvagem (WT) não foi capaz de induzir alterações na sensibilidade

mecânica ou térmica destes animais nos diferentes tempos avaliados (Gráfico 12 A

e B). Dados semelhantes foram observados quando animais KO para receptores Mu

(KO MOR) ou Delta (KO DOR) foram avaliados no teste de sensibilidade mecânica,

onde não foram observadas alterações da resposta comportamental frente ao

tratamento com Hp (Gráfico 12 A). Por outro lado, foi observado um aumento na

latência dos animais KO MOR aos 70, 120 e 240 minutos e KO DOR aos 70

minutoas de avaliação quando comparados aos animais WT (Gráfico 12 B), mas o

tratamento com Hp não alterou o efeito observado com relação aos KO (Gráfico 12

B). Para se avaliar a possível participação de receptores opióides no efeito agudo da

Hp, animais selvagem tratados com Naltrexone (NTX) ou Naltriben (NTB) também

foram avaliados e os resultados obtidos demonstram que o tratamento com Hp não

induziu alterações na resposta nociceptiva mecânica (Gráfico 13 A) ou térmica dos

animais (Gráfico 13 B).

69

Gráfico 12- Efeito da hemopressina (Hp - 2,5 mg/kg (p.o.)) ou Sal ina (Sal) na sensibi l idade mecânica (avaliado pelo teste de von Frey f i lamentos) (A) ou (B) na sensibil idade térmica (aval iado pelo teste de ret irada da cauda) em animais selvagem (WT), knockout Mu opióide (KO MOR) ou knockout Delta opióide (KO DOR). O tempo 0 representa a medida basal e os tempos de 60, 70, 120 e 240 minutos representam as medidas real izadas após a administração de Hp ou Sal. Os dados correspondem à média ± e.p.m. de 5-9 animais por grupo. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 comparado com o grupo WT+Sal. # #p<0,01 comparado com o grupo WT+Hp. $p<0,05 comparado ao grupo KO MOR tratado com Salina e @p<0,05 KO DOR tratado com Salina. (ANOVA de duas vias, seguido do pós -teste de Bonferroni).

70

Gráfico 13- Efeito do tratamento com Naltrexone (NTX - 1 mg/kg) ou Naltr iben (NTB- 1 mg/kg) em animais WT tratados com hemopressina (Hp - 2,5 mg/kg (p.o.)) ou Salina (Sal) na sensibil idade mecânica (aval iado pelo teste de von Frey f i lamentos) (A) ou (B) na sensibil idade térmica (aval iado pelo teste de ret irada da cauda) em animais selvagem (WT). O tempo 0 representa a medida basal e os tempos de 20, 30, 60, 90 e 180 minutos representam as medidas real izadas após a administração de NTX ou NTB. Os dados correspondem à média ± e.p.m. de 5-9 animais por grupo. (ANOVA de duas vias, seguido do pós-teste de Bonferroni).

71

4.11 Efeito do tratamento crônico com Hp em animais knockout para receptores Mu ou Delta opióide submetidos ao modelo de neuropatia diabética e avaliados para o teste de sensibilidade mecânica

Foi possível observar que após 7 dias da injeção de STZ tanto os animais

selvagem (WT) quanto os animais animais knockout para receptores opiódes do tipo

Mu (KO MOR) ou tipo Delta (KO DOR) apresentaram o desenvolvimento da

neuropatia, representado pela diminuição significativa do limiar mecânico dos

animais. O tratamento dos animais diabéticos por 14 dias com Hp foi capaz de

reestabelecer o limiar mecânico não somente dos animais WT como também dos

animais KO MOR e KO DOR (Gráfico 14). Mais ainda, o efeito induzido pela Hp foi

significativamente maior no grupo de animais KO MOR quando comparados com os

grupos de animais WT e KO DOR (Gráfico 14).

Com relação aos níveis glicêmicos, foi possível observar um aumento

progressivo na glicemia de todos os grupos de animais tratados com STZ, sendo

que mais uma vez este efeito não foi revertido pelo tratamento com Hp (Gráfico 15).

De maneira semelhante ao observado para o animais C57BL/6/J, no que se

refere ao peso corporal, foi possível observar que o tratamento com STZ induziu

diminuição no peso dos animais e que o tratamento com Hp não foi capaz de

prevenir a perda de peso nos animais (Gráfico 16).

72

0 715

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

Lim

iar (

g)

W T + H p


W T + S a l

K O D O R + S a l

K O D O R + H p

K O M O R + S a l

K O M O R + H p

* * *

* * *

A pós

S T Z

T e m p o (d ia s )

* * *$ $ $

Gráfico 14 - Efeito do tratamento com hemopressina (Hp) ou salina (Sal) em animais selvagem (WT) ou knockout para receptores Mu (KO MOR) ou Delta opióide (KO DOR) na sensibilidade mecânica. Para a indução do diabetes os animais formam injetados com estreptozotocina (STZ; 150 mg/kg) e após 7 dias foram avaliados para o teste de sensibilidade mecânica (teste de filamentos von Frey). Confirmada a presença da neuropatia, os animais foram tratados com hemopressina (Hp - 2,5 mg/kg (p.o.)) ou Salina (Sal) diariamente por 14 dias, sendo a sensibilidade mecânica aferida no dia seguinte à última administração de Sal ou Hp (15º dia). Os dados correspondem à média ± e.p.m. de 4-6 animais por grupo.***p<0,001 (comparado com o WT+Sal, KO DOR+Sal ou KO MOR+Sal) e $$$p<0,001 (comparado KO DOR+Hp/WT+Hp x KO MOR+Hp). (ANOVA de duas vias, seguido do pós-teste de Bonferroni).

73

0 715

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0


K O D O R + H p

K O M O R + S a l

K O M O R + H p

W T + H p

K O D O R + S a l

W T + S a l

A pós

S T Z

T e m p o (d ia s )

Gli

co

se

no

sa

ng

ue

(m

g/d

L) *

**

Gráfico 15 - Níveis de glicose sérica (mg/dL) em animais selvagem (WT) ou Knockout para receptores Mu (KO MOR) ou Delta opióide (KO DOR). Para a indução do diabetes os animais foram injetados com estreptozotocina (STZ - 150 mg/kg) sendo os níveis de glicose aferidos antes de qualquer tratamento (0), 7 dias após a injeção de STZ. Uma vez confirmado o diabetes os animais foram tratados com hemopressina (Hp - 2,5 mg/Kg (p.o.)) ou Salina (Sal) diariamente por 14 dias, sendo a glicemia aferida no dia seguinte à última administração de Sal ou Hp (15º dia).Os dados correspondem à média ± e.p.m. de 4-6 animais por grupo. *p<0,05; p<0,01 ou p<0,001 (comparado com WT+Sal; WT+Hp; KO DOR+Sal ou KO DOR+Hp). (ANOVA de duas vias, seguido do pós-teste de Bonferroni).

74

0 715

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

K O D O R + S a l

W T + S a l

K O D O R + H p

W T + H p

K O M O R + S a l

K O M O R + H p


A pós

S T Z

T e m p o (d ia s )

Pe

so

(g

)

* **

Gráfico 16- Peso corpóreo dos animais selvagem (WT) ou knockout para receptores Mu (KO MOR) ou Delta opióide (KO DOR). Para a indução do diabetes os animais foram injetados com STZ (150 mg/kg) sendo o peso aferido antes de qualquer tratamento (tempo 0), e 7 dias após a injeção de STZ. Os animais foram então tratados com hemopressina (Hp -2,5 mg/kg (p.o.)) ou Salina (Sal) diariamente por 14 dias. Sendo o peso aferido no dia seguinte à última administração de Sal ou Hp (15º dia). Os dados correspondem à média ± e.p.m. de 4-6 animais por grupo. *p<0,05; p<0,01 ou p<0,001 (comparado com WT+Hp; KO DOR+Sal e KO DOR+Hp). (ANOVA de duas vias, seguido de pós-teste de Bonferroni).

75

4.12 Efeito do tratamento com Hp em animais knockout para receptores Mu ou Delta opióide submetidos ao diabetes sobre a expressão de receptores CB1-MOR ou CB1-DOR na CPME

Os resultados aqui obtidos demonstram que o tratamento com Hp induziu um

aumento na expressão do dímero CB1-MOR apenas no grupo de animais selvagens

(WT), não sendo observadas alterações na expressão deste dímero para os grupos

de animais knockout para receptores Mu ou Delta (Gráfico 17A e Figura 1A). Por

outro lado, a análise da expressão do dímero CB1-DOR, demonstrou que esta

expressão não estava alterada para o grupo de animais WT tratados com Hp. Ainda,

os animais para KO MOR apresentaram aumento na expressão de CB1-DOR e o

tratamento com Hp induziu um aumento ainda maior na expressão de CB1-DOR

nesses animais (Gráfico 17B e Figura 1C).

Quando comparada a expressão de CB1-MOR no grupo de animais KO DOR

com a expressão de CB1-DOR no grupo de animais KO MOR ambos tratados com

Hp, observou-se um aumento significativo na expressão do dímero no grupo KO

MOR quando comparados os grupos de animais KO DOR (Gráfico 17C e Figura 1B).

76

Gráfico 17 - (A-C) Análise quantitativa do número de células marcadas para os receptores dimerizado CB1-MOR ou CB1-DOR na coluna posterior da medula espinal de camundongos Selvagem (WT) ou knockout Mu (KO MOR) ou Delta (KO DOR) opióides avaliado por imunofluorescência. Os animais foram injetados com estreptozotocina (STZ - 150 mg/Kg (i.p.)) e após 7 dias foi iniciado o tratados com hemopressina (Hp - 2,5 mg/Kg (p.o.)) ou Salina (Sal) por 14 dias. Os dados correspondem à média ± e.p.m. de 4-6 animais por grupo. **p<0,01 (comparado com o grupo WT+Sal (CB1-MOR)); ***p<0,001); (comparados com o grupo WT+Sal ou WT+ Hp (CB1-DOR));##p<0,01 (comparados com o grupo KO MOR+Sal (CB1-DOR)) e $$$p<0,001 (comparados com o grupo KO DOR+Hp (CB1-MORx KO MOR + Hp (CB1-DOR)). (ANOVA de uma via, seguido de pós-teste de Bonferroni).

77

Figura 1 - (A-C) Fotomicrografias representativas da imunofluorescência para os receptores dimerizado CB1-MOR ou CB1-DOR na coluna posterior da medula espinal de camundongos Selvagem (WT) ou knockout Mu (KO MOR) ou Delta (KO DOR) opióides. Os animais foram injetados com estreptozotocina (STZ - 150 mg/Kg (i.p.)) e após 7 dias foi iniciado o tratados com hemopressina (Hp - 2,5 mg/Kg (p.o.)) ou Salina (Sal) por 14 dias. O tecido foi cortado a 20µm e as fotos obtidas por microscopia de fluorescência (aumento x20) marcados com Dapi, CB1-MOR ou CB1-DOR, ilustrando o padrão de marcação para os diferentes grupos avaliados.

78

5 DISCUSSÃO

A hemopressina (Hp), um nonapeptídeo (PVNFKLLSH) que corresponde a

um fragmento da cadeia α1 (95-103) da hemoglobina, é um agonista inverso do

receptor CB1, que atua modulando a sinalização mediada por esse receptor

(Heimman et al., 2007). Dados da literatura demonstram que a Hp inibe a

nocicepção em diferentes modelos experimentais (Hama, Sagen, 2011; Heimann et

al., 2007) sem no entanto induzir os efeitos depressores no Sistema Nervoso Central

(SNC) comuns de compostos moduladores de receptores CB1(Heimann et al.,

2007). Além disso, a administração oral de Hp é capaz de bloquear os sinais de dor

neuropática em ratos submetidos a um modelo experimental de dor neuropática

induzida por constrição crônica do nervo isquiático (CCI) (Toniolo et al., 2014),

demonstrando que este peptídeo tem uma ação sistêmica que não é influenciada

pela digestão gástrica, o que poderia ser explicado pela tendência da Hp em formar

agregados nanoestruturais (Bomar et al., 2012), o que poderia protegê-la contra a

degradação rápida num ambiente in vivo explicando a duração do seu efeito por via

oral, tornando-a desta forma, um forte candidato para fins terapêuticos.

Os resultados aqui apresentados demonstram que o tratamento crônico com

Hp por via oral em camundongos, submetidos a um modelo experimental de

neuropatia diabética, reverte a hipersensibilidade mecânica avaliada pelo teste de

von Frey quando comparado com o grupo de animais controle, tratados apenas com

salina (Sal). O efeito antinociceptivo induzido pela Hp foi observado a partir da

primeira avaliação, após 7 dias de tratamento, e em todos os dias subsequentes de

avaliação da sensibilidade dolorosa. Interessantemente, este efeito foi mantido por

pelo menos 17 h após a última dose do tratamento, uma vez que os animais

recebiam Hp diariamente às 16:00 e somente no dia posterior às 9:00 eram

realizados os testes comportamentais, sugerindo que tratamentos mais longos com

a Hp, possam manter um efeito mais duradouro na prevenção da dor. Esses dados

corroboram com dados obtidos por nosso grupo que demonstram que uma única

79

administração oral de Hp em animais submetidos ao modelo de CCI, o efeito foi

mantido por 6 horas (Toniolo et al., 2014). Além disso, a Hp por si só não causou

alterações em animais controle (naive) sugerindo que o efeito observado seja

específico para o quadro doloroso. Dados obtidos pelo nosso grupo demonstram o

envolvimento de canais de potássio K+ ativado por cálcio no efeito antinociceptivo

induzido pela Hp no modelo de CCI, sugerindo que a Hp realiza o controle indireto

de canais de K+ periféricos no efeito analgésico observado, via alterações de

concentração de cálcio, uma vez que a Hp reduz o influxo de Ca2+ em neurônios do

GRP (Toniolo et al., 2014). Ainda, sabe-se na maioria dos tecidos e células, à

ativação de recepotres CB1 segue-se a inibição de adenilato ciclase (AC), que gera

diminuição dos níveis de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), inibição de

canais de Ca2+ e ativação de canais de potássio (Howlett et al., 2002; Kim et al.,

2005). Assim seria plauzível sugerir que a antinocicepção induzida pela Hp possa

ocorrer por efeito indireto em canais de potássio, especificamente na subunidade

Kv1.4, uma vez que é demonstrado que mais de 90% dos neurônios de menor

tamnaho do GRP co-expressam Kv1.4 e receptores CB1, o que sugere uma ação

sinérgica funcional entre Kv1.4 e CB1 (Binzen et al., 2006; Everill, Rizzo, Kocsis,

1998; Gold, Shuster, Levine, 1996; Safronov, Bischoff, Vogel, 1996). Esses canais

desempenham um papel importante na criação do potencial de repouso da

membrana e no controle da frequência de disparo do potencial de ação e

repolarização (Kim et al., 2002; Rettig et al., 1994; Xu, Enyeart, Enyeart, 2001).

Assim, a Hp, uma vez ligada nos receptores CB1 poderia regular a abertura desses

canais de potássio e assim modificar o potencial de repouso da membrana e a

frequência de disparo do potencial de ação desses neurônios do GRP, alterando a

transmissão do impulso e modificando o limiar mecânico dos animais. Ainda, a

ativação de Kv1.4 é regulada pelo seu grau de fosforilação (Nitabach et al., 2002;

Roeper, Lorra, Pongs, 1997; Tao et al., 2005). O equilíbrio entre canais Kv1.4

fosforilados e desfosforilados é regulada por alterações nas concentrações

intracelulares de Ca2+ (Roeper, Lorra, Pongs, 1997). Gerando uma segunda

possibilidade do efeito da Hp via a sinalização do cálcio.

Embora o tratamento com Hp tenha sido efetivo em reverter o quadro

doloroso, nenhuma alteração foi observada com relação aos níveis de glicose

80

sanguínea dos animais os quais continuaram a ter uma evolução no

desenvolvimento do diabetes. A estreptozotocina (STZ), utilizada neste modelo

experimental, causa a morte de células B pancreáticas, induzindo um diabetes

persistente. Assim, neste modelo não seria possível observar se a Hp é capaz de

melhorar o quadro glicêmico, como o observado recentemente em estudo realizado

por nosso grupo em animais obesos, onde o tratamento com Hp é capaz de

reestabelecer os níveis glicêmicos dos mesmos (dados não publicados).

Adicionalmente, a Hp também não causou alteração no peso dos animais que

progrediram com perda tanto no grupo tratado quanto no grupo controle, embora já

tenha sido demonstrado que a hemopressina diminui a ingestão de alimento em

animais normais e obesos (Dodd et al., 2010, 2013), sendo este efeito dependente

de RCB1. Assim, é possível que no modelo aqui escolhido não tenha sido possível

detectar alterações no peso em virtude da típica perda de peso ocasionada pelo

quadro diabético dos animais.

Por outro lado, embora o tratamento com Hp tenha sido efetivo em reverter a

alodínia mecânica, nenhuma alteração foi observada frente ao tratamento com Hp

no que se refere à sensibilidade ao estímulo térmico quente. Mais interessante foi o

fato de ao contrário do observado para a sensibilidade mecânica, os animais

diabéticos apresentaram um quadro de perda da sensibilidade dolorosa, que não foi

afetada pelo tratamento com Hp. A literatura é controversa no que se refere à

latência apresentada no teste de sensibilidade térmica em quadros diabéticos.

Alguns autores demonstram a presença de hiperalgesia seguida de perda da

sensibilidade térmica e outros relatam diretamente perda de sensibilidade. Isto se

deve em parte devido aos detalhes metodológicos, como o uso de diferentes

espécies, membros avaliados e métodos de aplicação de calor. Nesse sentido, foi

demonstrado que ratos diabéticos com deficiência de insulina, exibem hiperalgesia

térmica transiente durante as primeiras semanas de diabetes, que progride para

uma hipoalgesia dentro de 2-3 meses (Calcutt, Freshwater, Mizisin, 2004). Essas

características também são comuns em camundongos, que apresentam ora

hiperalgesia ora hipoalgesia (Toth et al., 2010). Os resultados aqui obtidos

demonstram que o tratamento com STZ induziu hipoalgesia térmica nos animais

perdurando pelos 28 dias avaliados. Esta hipoalgesia não foi alterada pelo

81

tratamento com a Hp, sugerindo que o efeito deste peptídeo seja específico para o

tratamento da sensibilidade mecânica. Baseando-se em situações clínicas,

pacientes com neuropatia diabética dolorosa leve apresentam hiperalgesia para

estímulos térmicos, enquanto que pacientes com estágios mais avançados da

doença apresentam tipicamente uma hipoalgesia (Obrosova, 2009). Apesar da

hipoalgesia não ser um quadro muito bem estabelecido em ratos e camundongos, a

perda da sensibilidade geralmente está associada a uma diminuição de nociceptores

térmicos na epiderme nos animais, assim como em pacientes diabéticos (Kennedy,

Wendelschafer-Crabb, Johnson, 1996).

Uma vez avaliado o efeito da hemopressina sobre a nocicepção, o passo

seguinte foi investigar os possíveis mecanismos envolvidos neste efeito. Para tanto,

avaliou-se o efeito do tratamento crônico com Hp sobre a expressão de receptores

CB1 sensíveis ao estado de ativação do receptor de interesse. A escolha de se

avaliar o efeito da Hp sobre a expressão de receptores CB1 na coluna posterior da

medula espinal deu-se uma vez que demonstramos anteriormente que a reversão da

hiperalgesia em animais com CCI está relacionado com a diminuição da ativação

neuronal nas lâminas superficial da medula espinal (I-IV), áreas que estão

associados com a sensibilidade exteroceptiva, que recebem os terminais de fibras

A-delta e fibras C. Além disso, nestes animais a Hp também foi capaz de inibir a

mobilização de cálcio em nos neurônios do gânglio da raiz posterior (GRP) da

medula espinal, reforçando a ideia de que a antinocicepção observada seja

decorrente de um efeito direto da Hp nesses neurônios (Toniolo et al., 2014), o que

também poderia está ocorrendo com os animais que receberam Hp na neuropatia

diabética, uma vez que observamos reversão da sensibilidade mecânica dos

mesmos.

Os resultados obtidos demonstraram que a Hp foi capaz de induzir um

aumento na expressão de receptores CB1 ativados em animais diabéticos após 7

dias de tratamento. Este efeito não foi mais detectado aos 14 de tratamento, sendo

que aos 28 dias a Hp foi capaz de induzir aumento da ativação de receptores CB1

no grupo controle tratado com Hp e em ambos os grupos diabéticos. Em seguida, foi

avaliado o padrão de expressão de receptores CB1, microglia e a densidade

82

integrada de astrócitos na medula espinal dos animais diabéticos, tratados ou não

com Hp. Os resultados obtidos com a quantificação dos receptores CB1,

demonstram uma diminuição da expressão de receptores CB1 após 14 e 28 dias de

tratamento com Hp nos animais diabéticos. Neste último grupo, mais uma vez a Hp

induziu aumento na expressão de receptores CB1 nos animais normais. Em

conjunto, esses dados demonstram que não há uma relação entre quantidade de

receptores CB1 e seu estado de ativação, frente ao tratamento com Hp, no entanto,

o tratamento com Hp foi capaz de interferir tanto com a ativação dos receptores

CB1, quanto com sua quantidade. Nesse sentido, a literatura demonstra que

camundongos CD1 tratados com STZ exibem uma tendência para o aumento dos

níveis de expressão para CB1 na medula espinal ao longo do tempo (Toth et al.,

2010), corroborando com os resultados aqui obtidos que demonstram um aumento

na ativação dos receptores CB1 com maior tempo de indução do diabetes.

Com relação ao padrão de expressão de células da glia, os resultados obtidos

demonstram um aumento na intensidade integrada de astrócitos na CPME dos

animais diabéticos após 14 e 28 dias. Ainda, o tratamento com Hp foi capaz de

reverter a intensidade integrada a valores semelhantes aos grupos controles. Dessa

maneira, nossos dados corroboram com inúmeros trabalhos presentes na literatura

que demonstram que o diabetes do tipo 1 ou do tipo 2 levam a um aumento de

expressão de astrócitos na CPME (Crown, 2012; Duach et al., 2012; Kim, Kwon,

Kwon, 2012;Liao et al., 2011). Neste caso, o tratamento crônico com Hp foi capaz

de induzir a diminuição de astrócitos na medula espinal dos animais, enquanto que

os animais diabéticos continuaram a apresentar uma intensidade integrada para

astrócitos elevada. Uma possível explicação seria que a desmielinização de fibras

periféricas (estímulos aferentes nocivos), leva a uma projeção sináptica para a

medula espinal com posterior ativação de neurônios dolorosos sensitivos.

Consequentemente uma vez que a neuropatia diabética é sustentada ocorre a

ativação de astrócitos no entorno desses neurônios espinais levando ao aumento da

liberação de ATP (Adenosina Trifosfato) nesses astrócitos. Uma vez que isso ocorre,

as células microgliais próximas desses astrócitos (cerca de 50 a 100 mm) são

atraídas para a fonte de ATP e sofrem alterações morfológicas tornando-se ativadas.

Essa ativação leva a uma interação destas células com os neurônios em nível

83

molecular, gerando a liberação de inúmeros agentes neuroinflamatórios (Vallejo et

al., 2010). Uma possível explicação seria que o tratamento com Hp estaria

diminuindo a liberação desses agentes neuroinflamatórios, ou que a Hp esteja

induzindo estas células a liberar agentes neuroinflamatórios e estes por sua vez

possam estar ativando o sistema endocanabinóide e assim induzindo analgesia.

Esta hipótese baseia-se em dados recentes obtidos por nosso grupo em ratos

submetidos ao modelo de CCI, que demonstram que a antinocicepção induzida pela

Hp depende da liberação periférica de anandamida (Toniolo et al., 2014). Esta

sugestão também é reforçada por dados que demonstram que o tratamento

subcutâneo com anandamida ou AM404 (um inibidor da receptação de anandamida)

reverte a hiperalgesia observada em ratos avaliados no teste da formalina (Schreiber

et al., 2012).

Com relação as células microgliais já foi demonstrado que em condições

normais, estas células estão em repouso em um estado séssil. No entanto, as

células microgliais são os sensores mais susceptíveis em caso de qualquer lesão ou

disfunção do sistema nervoso, sendo rapidamente ativadas (Kettenmann et al.,

2011). Esta ativação pode ser iniciada pelas alterações bioquímicas nos tecidos

periféricos, como por exemplo a hiperglicemia que induz uma redução da integridade

da função elétrica neuronal e aumenta o estresse oxidativo no nervo periférico

(Catanzaro et al., 2013). A lesão e a reação inflamatória levam a alterações das

propriedades funcionais e estruturais das células de Schwann e axônios que

conduzem a libertação de citocinas, incluindo a interleucina (IL) 1β, IL-6 e fator de

necrose tumoral alfa (TNF-α). Estas citocinas pró-inflamatórias exibem efeitos sobre

a homeostase de células gliais na medula espinal (Skundric, Lisak, 2003). Ainda, a

alta concentração de glicose em si também altera o microambiente local da medula

espinal e pode ativar a microglia. Nesse sentido, foi demonstrado em um estudo in

vitro que quando comparados baixo teor de glicose (10 mM), com glicose elevada

(35 mM) ocorre um aumento na secreção de IL-8 em cultura primária microglial, via

espécies reativas de oxigênio, Proteína Kinase C (PKC) e fator nuclear kappa B (NF-

kB) e que essa resposta é dependente do tempo (Quan, Du, Wang, 2007). Foi

também demonstrada ativação da micróglia espinal em animais tratados com STZ,

(Courteix, Eschalier, Lavarenne, 1993), a qual pode persistir por até 6 meses (Cheng

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schreiber%20AK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22959964

84

et al., 2014). A ativação da micróglia induz mudanças tanto na morfologia quanto em

sua função. As alterações morfológicas incluem hipertrofia das células e aumento

de espessura, retração de processos e aumento do número de células (Tsuda et al.,

2008; Wodarski et al., 2009). As mudanças morfológicas de microglia são

acompanhados pela ativação de moléculas de sinalização intracelular que estão

implicadas nas funções microgliais, incluindo a fosforilação de p38 - proteína cinase

ativada por mitógeno (MAPK) (Daulhac et al, 2006; Toth et al, 2010), c-Jun N-

terminal quinase (JNK) (Daulhac et al., 2006), extracellular signal-regulated kinase

(ERK) e a família Src-quinase (SFK) (Tsuda et al., 2008). Importantemente, a

fosforilação de p38, ERK e JNK ocorre em micróglia e em neurônios, mas não em

astrócitos (Daulhac et al., 2006). A descoberta de fosforilação de moléculas de

sinalização intracelular confirma a ativação funcional da micróglia e indica que a

hiperglicemia muda a micróglia de um estado de repouso séssil para um fenótipo

ativado. Particularmente, a inibição da micróglia por administração sistêmica ou

espinal por inibidor metabólico não-seletivo de células gliais (fluorocitrato) ou pelo

inibidor seletivo de micróglia (minociclina), demonstraram abolir a hipersensibilidade

térmica e mecânica associadas ao diabetes (Pabreja et al, 2011; Talbot et al, 2010),

confirmando que a hipersensibilidade dolorosa atribuída no NPD é dependente da

ativação da micróglia espinal. Deve ser lembrado também que os pacientes

diabéticos não necessariamente desenvolvem NPD e o sucesso do tratamento da

hiperglicemia nem sempre atenuam a estabelecida NPD (Skundric, Lisak, 2003;

Tomlinson, Gardiner, 2008a/b), o que implica que a NPD ou a ativação da micróglia

nem sempre é dependente de níveis elevados de glicose no sangue. Provavelmente,

a hiperglicemia é responsável pela indução metabólica e alterações enzimáticas; e

por produzir malondialdeído, peroxidação lipídica, carbonilação de proteínas,

superóxido dismutase e glutadiona redutase (Catanzaro et al, 2013; Pabreja et al,

2011). Após a indução desses produtos, os mesmos podem operar

independentemente da hiperglicemia para alterar as propriedades estruturais e

funcionais de micróglia (Wang, Couture, Hong, 2014).

Os resultados aqui obtidos demonstraram que a injeção de STZ induziu uma

diminuição do número de células marcadas para IBA 1/A, após 14 dias. Ainda, o

tratamento com Hp restabeleceu esse número. Além disso, após 28 dias foi possível

85

observar que os animais diabéticos tratados com Hp apresentaram menor

quantidade de células marcadas para micróglia quando comparado com os demais

grupos. Vale ressaltar que os estudos realizados citados anteriormente normalmente

realizam os experimentos após no mínimo um mês de indução do diabetes, e como

foi demonstrado em um dos estudos uma dependência temporal para que ocorra a

ativação da microglia é requerido (Quan, Du, Wang, 2007), isso pode não ter

ocorrido nos tempos estabelecidos para esse projeto com relação ao número de

células, mas não pode ser descartada a possibilidade de terem ocorrido alterações

estruturais nas células microgliais que não foram analisadas no presente trabalho.

Mais ainda, o tratamento com Hp poderia restringir o aumento da densidade

microglial na coluna posterior da medula espinal e dessa forma limitar o

desenvolvimento do estado neuropático doloroso. Esta hipótese estaria de acordo

com dados que demonstram efeitos semelhantes em camundongos tratados com

canabidiol (Toth et al., 2010).

No que se refere à análise histológica, foi observado que a injeção de STZ

induziu desmielinização do nervo isquiático dos camundongos após 14 dias de

maneira semelhante ao descrito para pacientes diabéticos em estado avançado da

doença, que apresentam severo comprometimento periféricas de fibras do tipo

mielinizadas largas (Aβ) (Ali et al., 1989). Mais interessante foi o fato de que o

tratamento com Hp foi capaz de prevenir a desmielinização. Ainda, o tratamento com

Hp impediu a diminuição de níveis do fator de crescimento do nervo (NGF) no nervo

isquiático dos animais. O NGF é uma neurotrofina considerada crítica para a

sobrevivência e manutenção de seletivas populações neuronais em

desenvolvimento, tanto no sistema nervoso periférico como no central (Crowley et

al., 1994). Além disso, o NGF demonstrou ser o principal mediador responsável pela

manutenção das fibras cutâneas de pequeno ou grande calibre, uma vez que

camundongos knockout homozigotos para NGF não desenvolvem adequadamente

neurônios sensoriais de pequeno calibre derivados da crista neural, bem como

neurônios simpáticos (Crowley et al., 1994; Leinninger, Vincent, Feldman, 2004).

Nossos dados corroboram com os dados que demonstram que ratos submetidos à

modelo experimental de diabetes induzida por STZ apresentam redução dos níveis

de NGF. Tal diminuição de NGF está diretamente associada com a presença de

86

neuropatia diabética, sendo este processo dependente da relação existente entre

receptores do tipo p75 e trk A responsáveis por mediar a sinalização do NGF, além

do transporte retrogrado de NGF no nervo isquiático dos animais (Hellweg et al.

1991; Steinbacher, Nadelhaft, 1998). O NGF também é um importante regulador da

síntese de Substância P, em neurônios do gânglio da raiz posterior, associada com

a atividade das fibras sensoriais primárias (fibras C e Aδ) (Lindsay, Harmar, 1989).

Adicionalmente, já foi demonstrado que pacientes com polineuropatia diabética

apresentam correlações entre a presença de sintomas dolorosos e alterações nos

níveis de SP no fluído cerebroespinhal e nervo sural (Tsigos et al., 1993). Dessa

maneira é possível sugerir que a Hp, poderia estar auxiliando na manutenção dos

níveis do NGF e consequentemente preservando a integridade das fibras periféricas,

uma vez que foi observada preservação da espessura da mielina no nervo isquiático

o que, consequentemente, auxiliaria na reversão da sensibilidade mecânica

observada nos animais diabéticos tratados com Hp.

Com relação a caracterização do efeito da Hp em camundongos knockout

(KO) para receptores Mu (MOR) ou Delta (DOR) opióide e seus respectivos

controles selvagens (WT), primeiramente foi observado que o tratamento com Hp

não foi capaz de induzir alterações nociceptivas nos animais WT. Por outro lado,

quando os animais KO MOR receberam Hp, os mesmos passaram a apresentar um

aumento na latência a partir de 70 min, o que não se observou para os animais KO

DOR tratados com Hp e avaliados em modelo de sensibilidade térmica. Já quando

foi realizado o teste para avaliar a sensibilidade ao estímulo mecânico, o tratamento

com Hp não induziu alterações nociceptivas tanto para os animais WT quanto para

os animais KO MOR ou KO DOR. A literatura demonstra que os receptores

canabinóides partilham um certo número de características em comum com

receptores opióides, e as interações entre estes dois receptores parecem modular a

sua atividade (Cichewicz, 2004; Ledent et al., 1999). Além disso, trabalhos têm

explorado as propriedades de sinalização dos receptores canabinóides e opiódes e

demonstram que ambos são largamente co-distribuídos em regiões do Sistema

Nervoso Central e Periférico que estão associadas com regiões envolvidas nas vias

ascendentes e descendentes do controle da dor (Bausch et al., 1995; Berrendero et

al., 2003b; Finnerup, Sindrup, Jensen, 2010; O’Connor, Dworkin, 2009). Ainda, a

87

ativação de ambos os tipos de receptores pode produzir analgesia em humanos e

em modelos experimentais de dor neuropática (Bie, Pan, 2007; Maldonado,

Valverde, 2003; Pertwee, 2001). Estudos prévios mostraram uma interação inibitória

indireta entre os dois receptores, onde a atividade de DOR é aumentada no cérebro

de camundongos CB1R-/- (Urigüen et al., 2005), enquanto que a atividade do

receptor para CB1 é aumentada em cérebros de camundongos DOR-/- (Berrendero

et al., 2003a; Rozenfeld et al., 2012), indicando que DOR pode modular a atividade

de receptores CB1 e vice e versa.

Classicamente, receptores acoplados à proteína G (GPCRs) até pouco tempo

atrás eram descritos por serem expressos como monomeros e que cada GPCR

individualmente sinalizava por meio de seu próprio "pool" de proteínas G (Mackie,

2005). No entanto, posteriormente foi demonstrado que GPCRs podem existir e

funcionar como dímeros ou multidímeros de ordem superior (Jordan; Devi, 1999).

Nos últimos anos tem sido demonstrado a dimerização entre receptores CB1 e

receptores MOR e DOR (Bushlin, Rozenfeld, Devi, 2010; Bushlin et al., 2012;

Jordan, Devi, 1999; Rios, Gomes, Devi, 2006; Rozenfeld et al., 2012;).

Considerando que o tratamento com Hp induziu aumento na latência dos animais

KO MOR e, que esse peptídeo se liga ao receptor CB1 e necessita do mesmo para

exercer seus efeitos, é possível sugerir então que ocorra uma dimerização entre

receptores CB1-DOR, assim como demonstrado por Bushlin e colaboradores

(Bushlin et al., 2012), podendo dessa maneira ser responsável por anular o efeito da

Hp nos animais desprovidos de DOR. Adicionalmente, apesar dos dados obtidos

através da utilização do antagonista não reproduzirem os dados obtidos no animal

KO, isso vem reforçar a ideia de que o efeito não dependa da inibição da

sinalização de DOR e sim da interação direta entre CB1/DOR.

Quando foi avaliado o efeito da Hp sobre a neuropatia diabética nesses

animais, foi possível observar que tanto os animais WT quanto os KO DOR e MOR

tratados com Hp diariamente por 14 dias apresentaram o limiar mecânico

restabelecido a níveis basais, sendo que o grupo KO MOR tratado com Hp

apresentou um efeito analgésico significativamente maior que os animais KO DOR e

WT tratados com Hp. Tais resultados podem ser atribuídos a uma maior dimerização

88

entre RCB1-DOR, como foi confirmado nos resultados obtidos com a

imunofluorescência para este dímero nos animais diabéticos tratados com Hp. Além

disso, nossos dados corroboram com dados que demonstraram aumento nos níveis

da dimerização entre RCB1-DOR em animais com dor neuropática induzida pela

transecção do nervo espinal L5 (Bushlin et al., 2012).

Em conjunto, os dados aqui obtidos demontram que a Hp apresenta um

importante efeito biológico que reforça sua relevância como agente terapêutico no

tratamento da neuropatia diabética e possivelmente outras algias de origem

neuropática, além de gerar inúmeras possibilidades exploratórias para estudos

futuros.

89

6 CONCLUSÃO

Os dados aqui obtidos demonstram que a Hp reverte a hipersensibilidade

mecânica em camundongos com neuropatia diabética, sendo

que este efeito é específico para o tratamento da nocicepção e envolve a

participação de receptores CB1, astrócitos e micróglia em nível espinal. A Hp

também previne a desmielinização do nervo isquiático dos animais

diabéticos, e auxilia na manutenção dos níveis do NGF. Ainda, a Hp participa no

controle da sensibilidade ao estímulo térmico quente em animais KO MOR e

participa do controle da sensibilidade mecânica de animais KO MOR diabéticos

pelo aumento da dimerização de RCB1-DOR na medula espinal.

90

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Xu+et+al.%2C+2007+AKT+pain

111

APÊNDICE A - Outros experimentos realizados

Dados da literatura demonstram que a alodínia mecânica de ratos diabéticos

induzidos por STZ está positivamente correlacionada com o aumento de p-38 e

canais Nav1.3 no GRP, observado a partir de 7 dias e que se mantém por pelo

menos 6 meses (Cheng et al, 2014). Foi também demonstrado que o aumento da

regulação de Nav1.3 está associada com reações inflamatórias (He et al., 2010) e

que a hiperglicemia por longo prazo induz uma resposta inflamatória exacerbada

(Gonzalez-Clemente et al., 2005; Kawamura et al, 2008). Ainda, a literatura

demonstra que a neuropatia diabética em ratos tratados com STZ, está associada

com a fossorilação de ERK e JNK em seus estágios iniciais (Dauch et al., 2012) e

que a ativação de AKT pode contribuir para o desenvolvimento da dor neuropática

(Xu et al., 2007). Assim, seria possível especular que a reversão da alodínia

mecânica nos animais com neuropatia diabética poderia se dar pela ação da Hp

nesses canais Nav1.3, e se este por sua vez mudaria a sinalização intracelular.

Assim, com o intuito de se avaliar os possíveis mecanismos envolvidos na reversão

da alodínia mecânica dos animais diabéticos pelo tratamento com Hp, foi avaliado,

por imunodetecção, o estado de fosforilação das proteínas ERK1/2, JNK, AKT e p38

em culturas de células F11 tratadas com Hp e/ou ICA121431 (bloqueador específico

para Nav1.3 e Nav1.1 de canais de sódio dependentes de voltagem - Tocris). Os

resultados apresentados são parciais.

Para tanto, células da linhagem F-11, derivadas de gânglio da raiz dorsal da

medula espinal (ATCC®) foram tratadas com 25mM de glicose (Sigma) por 5 dias

(seguindo o protocolo de Mizisin et al.,1996) com o intuito de mimetizar condições

hiperglicêmicas, assim como o realizado nos animais. Após esse tratamento as

células foram tratadas com Hp (1 µM dissolvida em salina), ICA 121431 (1 µM

dissolvida em DMSO 100 mM) ou Hp+ICA121431 todos os fármacos foram

preparados em solução contendo inibidor de protease e fosfatase (Sigma). As

culturas celulares foram tratadas em por 1 ou 5 minutos (Sampaio et al., 2014). Após

esse tratamento as culturas receberam adição do tampão contendo 2% de dodecil

sulfato de sódio (sodium dodecyl sulfate - SDS) em 50 mM Tris HCl pH 6.8 contendo

112

0.01% de bromofenol e inibidor de protease e fosfatase. As células foram coletadas

e mantidas a -80ºC até a realização do Western blotting para as proteínas ERK1/2,

JNK, AKT, p38 em suas formas fosforiladas.

Para cada amostra, a concentração de proteína utilizada foi de 30 µg. Foi

então adicionado tampão de amostra (contendo 3-βmercaptoetanol como agente

desnaturante), agitado e aquecido a 60ºC por 30 minutos. O gel utilizado na

eletroforese foi de 10% (ERK1/2 e AKT) e 15% (p38, JNK). A eletroforese foi

realizada com tampão Tris-Glicina, por 3 horas, 100 V e 400 mA. A transferência foi

realizada overnight a 30 V e 110 mA. Após a transferência as membranas foram

incubadas em solução de bloqueio (TBS-T, 0,1% Tween 20 e 5% de albumina

bovina) por 1 hora em temperatura ambiente. Após o bloqueio, as membranas foram

lavadas 4 vezes em TBS-T por 15 minutos e incubadas com anticorpo primário

overnight (Phospho e total-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) Antibody,

Phospho-Akt (Ser473) , Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182 e Phospho-SAPK/JNK

(Thr183/Tyr185) (Cell Signaling Technology) para forma fosforilada da proteína,

diluído 1:1000 em solução 30% Odyssey infrared imaging system e TBS-T, mantido

na câmara fria, sob agitação. Após a incubação no anticorpo primário, as

membranas foram lavadas em TBS/T por 15 minutos, 4 vezes, e então incubadas

com o anticorpo secundário diluído 1:1000 por 1 hora à temperatura ambiente

(Odyssey Goat anti-mouse IRDye 680RD (vermelho) e Odyssey Goat anti-Rabbit

800 (verde)), sob agitação. As membranas foram novamente lavadas por 4 vezes de

15 minutos em TBS/T e a revelação realizada no Odyssey (LI-COR, Biosciences). A

intensidade das bandas foi analisada em software do equipamento.

Os resultados obtidos demonstram que o tratamento das culturas de células

F11 por 5 dias com 25mM de glicose induziu diminuição no número de total células

no quarto e quinto dias de tratamento, assim como o protocolo demonstrado por

Mizisin e colaboradores (1996) (Gráfico 1). Ainda, a administração de Hp e/ou

ICA121431 por 1 ou 5 minutos nas culturas de células F11 tratadas por 5 dias com

25mM de glicose não induziu a fosforilação das proteínas ERK1/2, JNK, AKT ou p38

(Gráfico 2).

113

T e m p o (d ia s )

Nú

me

ro

de

cé

lula

s x

10

4

0 1 2 3 4 5

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

C o n tro le

2 5 m M d e G lic o s e

***

***

Gráfico 1 - Curva de crescimento para cultura de células F11 sob situações de

hiperglicemia ou condição normal. Células F11 foram colocadas para crescer

somente em DMEM (Controle) ou em DMEM suplementado com 25mM de

glicose. Uma média de 1.83 X 104 células foram semeadas em cada poço da

placa de cultura de 6 poços e contadas 1,2, 3, 4, 5 dias mais tarde. As

contagens são médias ±SD de medições em quadriplicata do número de

células por poço a cada ponto de tempo, e as contagens no ponto de tempo

de 5 dias foram analisadas com ANOVA de uma via, com múltiplas

comparações com pós-teste de Student-Newman-Keuls. O número de células

do grupo controle foi maior quando comparado com o grupo tratado com 25

mM de glicose (***p<0,001) após 4 e 5 dias.

114

T ra ta m e n to

Fo

sfo

ril

ad

o/T

ub

uli

na

(p

AK

T)

HP

ICA

121431

Hp

+IC

A121431

0

5

1 0

1 5

2 0

p A K T 6 0 K D a

T u b lin a 5 3 K D a

Hp 1

min

Hp 5

min

ICA

121431 1

min

ICA

121431 5

min

Hp+IC

A121431 1

min

Hp+IC

A121431 5

min

C

T ra ta m e n to

Fo

sfo

ril

ad

o/T

ub

uli

na

(p

JN

K)

HP

ICA

121431

Hp

+IC

A121431

0

5

1 0

1 5

2 0

5 4 K D a

5 3 K D a

p J N K

T u b u lin aH

p 1

min

Hp 5

min

ICA

121431 1

min

ICA

121431 5

min

Hp+IC

A121431 1

min

Hp+IC

A121431 5

min

B

T ra ta m e n to

Fo

sfo

ril

ad

o/T

ub

uli

na

(p

p3

8)

HP

ICA

121431

Hp

+IC

A121431

0

5

1 0

1 5

2 0

Hp 1

min

Hp 5

min

ICA

121431 1

min

ICA

121431 5

min

Hp+IC

A121431 1

min

Hp+IC

A121431 5

min

T u b u lin a

p p 3 8

5 3 K D a

4 3 K D a

D

T ra ta m e n to

pE

RK

1/2

/tE

RK

1/2

HP

ICA

121431

Hp

+IC

A121431

0

5

1 0

1 5

2 0

A

Gráfico 2- Efeito da administração de hemopressina (Hp - 1µM dissolvida em salina) e/ou ICA 121431 (1 µM dissolvida em DMSO 100 mM) por 1 ou 5 minutos em culturas de células F11 tratadas por 5 dias com 25 mM de glicose. Os painéis superiores aos gráficos representam um filtro de Western blot dos extratos das células F11 submetidas à administração de Hp e/ou ICA121431. Os gráficos representam a análise quantitativa de fosfo-ERK1/2 (A), fosfo-JNK (B), fosfo-AKT (C) ou fosfo-p38 (D) nos diferentes grupos experimentais. Os resultados estão expressos como a razão dos níveis da intensidade do sinal da proteína fosforilada pela proteína total (forma não fosforilada) para ERK1/2 (A) e pela razão dos níveis da intensidade do sinal da proteína fosforilada pela Tubulina (B, C e D). Para A e B; n=2. Para C e D n=1.

caracterização da hemopressina (agonista inverso de ... · agonista inverso do rcb1, que induz...

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