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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNC1AS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em Fánnaco e Medicamentos

Área de Insumos Farmacêuticos

ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA, TOXICIDADE E

ASPECTOS QUÍMICOs DO ÓLEO-RESINA DE COPAÍBA,

PROVENIENTE DE DIFERENTES ESPÉCIES,

E DE SUAS RESPECTIVAS FRAÇÕES

Ricardo· Gomide Woisky do Rio

Tese para obtenção do grau de

DOUTOR

Orientador:

Prof. Dr Jayme Antônio Aboin Sertié

São Paulo

2001

R585a

DEDALUS - Acervo - CQ

I I I1II II II30100003903

Ficha Cata lográ ficaElaborada pela Divisão de Biblioteca e

Documentação do Conjunto das Químicas da USP.

Rio, Ricardo Gomide Woisky do ~Atividade anti inflamatória, toxicidade e fitoquímica do I

óleo-resina de copaíba, proveniente de diferentes espécies, ede suas respectivas frações / Ricardo Gomide Woisky doRio. -- São Paulo, 200 I.

130p.

Tese (doutorado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticasda Universidade de São Paulo. Departamento de Farmácia.

Orientador: Sertié, Jayme Antônio Aboin

1. Fitoterapia 1. T. 11. Sertié, Jayme Antônio Aboin,orientador.

615.32 CDD

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"'=-

RICARDO GOMIDE WOISKY DO RIO

ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA, TOXICIDADE E

ASPECTOS QUÍMICOS DO ÓLEO-RESINA DE COPAÍBA, PROVENIENTE

DE DIFERENTES ESPÉCIES, E DE SUAS RESPECTIVAS FRAÇÕES

Comissão Julgadora

Tese para obtenção do grau de

DOUTOR l

/ ./ /

4 411 /ic~ ,:/~Prof Dl'JáYrn~Atítônio ;M5oin Sêrtié

OrientadorlPresidente

/

/ Prof. Dr Antônio Salatino

1Q. Examinador

Prof. Dr Paulo Roberto Hrihorowitsch Moreno

2Q• Examinador

Prof. Dr Massuo Jorge Kato

3Q• Examinador

Profa Dra Elfriede Marianne Bacchi

4Q• Examinador

São Paulo, 08 de junho de 2001

- .]

Dedico este trabalho aos meus amigos e amigas

___ ~,l.IIl<'=-~ _

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, PIOf. Dr Jayme Antônio Aboin Sertié, pela orientação,

amizade e cafezinhos para animar o dia.

Ao doutorando Valdir Florêncio Junior da UFRJ pela análise fitoquímica.

Ao PIOf. Dr Antônio Altair Magalhães de Oliveira do Departamento de

Análises Clínicas e Toxicológicas pelas análises hematológicas.

Ao Prof. Dr Antônio Salatino do Departamento de Botânica do IB pelo uso

de seu laboratório para a destilação dos óleos-resinas de copaíba.

Ao PIOf. Dr José Carlos de Freitas e à Bianca do Departamento de

Fisiologia mpelos ensaios de citotoxicidade.

À Dra Nilsa Sumie Yamashita Wadt da UMC pela ajuda nos trabalhos

experimentais de toxicidade subcrônica.

À técnica Guiomar Wiezel do Departamento de Farmacologia do ICB pela

ajuda em todos os trabalhos experimentais.

Ao mestrando Marcelo Rodrigues do Departamento de Farmacologia do

ICB pelo auxílio no trabalho experimental.

À Elisabete C. de Souza Paiva, secretária do Programa de Pós-Graduação

em Fármaco e Medicamentos pela solicitude com que sempre nos acompanhou.

À Benedita E. S. de Oliveira, Elaine Midori Ychico e Jorge A. de Lima da

secretaria de Pós-Graduação pela presteza com que sempre nos atenderam.

Ao CNPQ pelo auxílio financeiro.

A todos que direta ou indiretamente auxiliaram neste trabalho.

-

I.

RESUMO

Espécies do gênero Copaifera (Leguminosae) são nativas de regiões

tropicais da América Latina e África. No Brasil, seu óleo-resina é amplamente

utilizado em medicina popular como antiinflamatório, antisséptico e cicatrizante.

No presente trabalho, avaliou-se, em uma primeira fase, a atividade

antiinflamatória em modelo experimental agudo das seguintes amostras de óleo

resina: comercial, gentilmente cedida pela empresa Pronatus, Copaifera reticulata,

C. multijuga e C. paupera. As amostras foram administradas pela via oral, sendo

selecionada, das amostras identificadas botanicamente, a C. reticulata por

apresentarem maior atividade. A amostra comercial também foi ensaiada no

modelo experimental acima.

Os óleo-resinas foram analisados por cromatografia gasosa acoplada à

espectrometria de massas tendo revelado a presença de sesquiterpenos e

diterpenos. Foram identificados vinte e dois compostos na amostra comercial e

vinte seis na amostra de C. reticulata. Deste total, seis substâncias foram comuns a

ambas as amostras. A seguir, os óleos-resinas foram destilados e separadas suas

respectivas frações sesqui e diterpênicas. Tanto os óleos-resinas quanto suas

frações foram avaliados farmacologicamente.

As atividades farmacológicas testadas foram: atividade antiinflamatória

aguda, subcrônica, crônica e ensaios de toxicidade aguda, subcrônica e

citotoxicidade.

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A atividade antiinflamatória foi testada em cinco modelos: edema de pata

induzido pela carragenina, nistatina e miconazol; indução de fonnação de tecido

granulomatoso e dennatite induzida pelo óleo de cróton. Nos modelos utilizados

as doses testadas foram de 2,47 rnl/kg (DEso no modelo da carragenina) para a

amostra comercial e suas frações sesqui e diterpênicas e 2,02 rnl/kg (Dose

equipotente no modelo da carragenina) para a amostra de C. reticulata e suas

frações sesqui e diterpênicas). Em todos os ensaios realizados com as amostras,

evidenciaram-se intensa atividade antiflogística, com exceção da C. reticulata que

apresentou elevada toxicidade no modelo de indução do tecido granulomatoso.

Nos ensaios de toxicidade aguda, a amostra C. reticulata (DLso = 4,48

m1Ikg) apresentou toxicidade maior que a amostra comercial (DLso > 12,35 m1Ikg).

Suas frações sesquiterpênicas foram bem menos tóxicas que seus correspondentes

óleos-resinas com DLso maiores que 9,14 e 20 m1Ikg, respectivamente para C.

reticulata e amostra comercial: Por outro lado, a fração resinosa (diterpênica)

apresentou alta toxicidade com DLso superiores a 2,85 e 1,2? rnl/kg,

respectivamente para a amostra comercial e C. reticulata.

Nos ensaios de toxicidade subcrônica confmnou-se a toxicidade menor para

a fração sesquiterpênica da amostra de C. reticulata. O óleo-resina de C. reticulata

apresentou toxicidade renal e alterações hepáticas indicando que pode haver um

comprometimento hepático.

sUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 1

1. 1 Plantas medicinais 1

1.2 Processo inflamatório 7

1.3 Constituintes de plantas com atividade antiinflamatória 13

1.4 Estudo de plantas do gênero Copaifera 17

2 OBJETIVOS 20

3 MATERIAL E MÉTODOS 21

3.1 Material 21

3.2 Métodos 22

3.2.1 Estudos fitoquímicos 22

3.2.2 Avaliação farmacológica 23

3.2.2.1 Edema de pata induzido pela carragenina 23

3.2.2.2 Edema de pata induzido pela nistatina 24

3.2.2.3 Edema de pata induzido pelo miconazol 25

3.2.2.4 Formação de tecido granulomatoso 26

3.2.2.5 Dermatite induzida pelo óleo de cróton 27

3.2.2.6 Toxicidade 29

3.2.2.6.1 Estudos de toxicidade aguda 29

3.2.2.6.2 Estudos de toxicidade subcrônica 30

3.2.2.6.3 Estudos de citotoxicidade 31

3.2.3 Análise estatística 32

4 RESULTADOS 33

4.1 Estudos fitoquímicos 33

4.2 Avaliação farmacológica 36

4.2.1 Edema de pata induzido pela carragenina 36

4.2.1.1 Determinação da DEso da amostra CAM 37

4.2.1.2 Atividade da amostra CAM e de suas frações 41

4.2.1.3 Avaliação das amostras CM, CP e CR frente à amostra CAM 45

4.2.1.4 Determinação da Dose Equipotente da amostra CR 46

4.2.1.5 Atividade da amostra CR e de suas frações

4.2.2 Edema de pata induzido pela nistatina

4.2.3 Edema de pata induzido pelo miconazol

4.2.4 Fonnação de tecido granulomatoso

4.2.5 Dennatite induzida pelo óleo de cróton

4.2.6 Toxicidade

4.2.6.1 Estudos de toxicidade aguda

4.2.6.2 Estudos de toxicidade subcrônica

4.2.6.2.1 Toxicidade subcrônica da amostra CAM

4.2.6.2.2 Toxicidade subcrônica da amostra CR

4.2.6.2.3 Toxicidade subcrônica da amostra CRD

4.2.6.3 Estudos de citotoxicidade

5 DISCUSSÃO

6 CONCLUSÃO

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

APÊNDICE

48

52

59

62

65

68

68

70

70

75

82

88

90

107

108

126

1. INTRODUÇÃO

1.1. PLANTAS MEDICINAIS

Remonta às civilizações antigas o uso empírico de drogas de ongem

vegetal, animal e mineral para o tratamento de doenças (SNEADER, 1985). As

primeiras informações relativas à utilização de vegetais para fms terapêuticos são

encontradas nos escritos do imperador chinês Shen Nung (3.000 a.e.), no Código

de Hamurabi (2.000 a. C.), no Papiro de Ebers (1.500 a.C.) e Galeno (131 d.e.)

(KüRüLKüVAS & BURCKHALTER, 1988).

Desde o início da colonização do Brasil, os primeiros viajantes ficaram

surpresos diante da exuberância da vegetação e do uso pelos indígenas de várias

plantas na cura de doenças. Poucos povos primitivos adquiriram conhecimento tão

vasto e complexo sobre as propriedades medicinais de seu ambiente botânico

quanto os indígenas sul-americanos (LÉVI-STRAUSS, 1987). A utilização de

plantas medicinais no Brasil pela população foi influenciada pela riqueza da flora

associado ao uso milenar de ervas pelos pajés tanto dos nativos brasileiros quanto

dos oriundos do continente africano trazidos como escravos.

Entretanto, a pesquisa sistemática de plantas medicinais iniciou-se somente

no século XIX, quando o farmacêutico alemão Friederich Wilhelm Setümer isolou

a morfma, substância responsável pela ação hipnoanalgésica do ópio. Assim como

a morfina, muitos outros fármacos, que compõem o arsenal terapêutico atual,

resultaram da purificação de extratos vegetais e do isolamento de seus princípios

1

ativos (KOROLKOVAS & BURCKHALTER, 1988; CARLINI, 1985). Na

literatura científica são descritos vários exemplos como os alcalóides, antibióticos,

vitaminas e hormônios (KOROLKOVAS & BURCKHALTER, 1988; ANSEL &

POPOVICH,1990).

Um exemplo clássico é a utilização das cascas do salgueiro, Salix alba,

planta que habita locais úmidos. O uso popular desta casca, como antitérmico,

antimalárico e em estados gripais, disseminou-se por todo o mundo. Das cascas

dessa espécie isolou-se o. ácido salicílico que após pequena modificação, deu

origem ao ácido acetilsalicílico, um dos medicamentos mais utilizados em todo o

mundo (DI STASI, 1996; FONT QUER, 1967).

A descoberta da peni1cilina em 1929 por Fleming e sua purificação em

1940 deu origem à pesquisa de novos antibióticos em larga escala, pois

demonstraram ser menos tóxicos em seres humanos e mais eficazes que as

sulfonamidas (DAVIS, 1968).

Apesar da descoberta de inúmeras substâncias de ongem natural com

propriedades medicinais, o uso desses compostos foi relegado a segundo plano em

função do enorme progresso alcançado em sínteses químicas. Contudo, a partir

dos fatos envolvendo os medicamentos talidomida e dietilestilbestrol evidenciou

se a necessidade de se aprofundar as pesquisas de toxicidade (GILMAN et aI.,

1987; KOROLKOVAS & BURCKHALTER, 1988).

O custo de pesquisa envolvendo novas drogas sintéticas elevou-se

consideravelmente, contribuindo para uma redescoberta dos produtos naturais.

Estima-se que o custo de um novo fánnaco para ser lançado no mercado, pronto

2

para o consumo, seja de US$ 500 a US$ 800 milhões. Para cada produto novo

sintético colocado no mercado temos a pesquisa de 23.000 substâncias e para cada

fitoterápico lançado são pesquisados cerca de 400 compostos. O custo de pesquisa

e desenvolvimento para drogas sintéticas chega a ser 15% do faturamento da

empresa (FERREIRA, 1998). No caminho oposto do custo crescente de drogas

sintéticas temos o mercado de fitoterápicos em expansão. A indústria farmacêutica

na Europa e Estados Unidos movimenta um mercado de aproximadamente oito

bilhões de dólares anuais. Além disso, segundo estudos da OMS, cerca de 80% da

população mundial encontra nas medicinas tradicionais formas para satisfazerem

suas necessidades de cuidados primários à saúde, destacando-se a utilização de

preparados à base de plantas (FARNSWORTH et al., 1986).

Outra fonte de dados sobre compostos de origem natural vem da pesquisa

básica na área de química de produtos naturais. Sabe-se que fungos, bactérias e,

principalmente, as plantas têm uma enorme capacidade de biossintetizar

substâncias. Os produtos oriundos do metabolismo secundário desempenp.am uma

função importante no sistema de defesa da planta frente a doenças e herbívoros

(HARBORNE, 1988; GOTTLIEB & KAPLAN, 1982; COLEY, 1980). E, muitas

dessas substâncias demostraram ter atividade farmacológica para seres humanos

aumentando ainda mais o interesse na pesquisa desses compostos. Cjtando como

exemplo, Hypericum perforatum que causa fotossensibilização em animais

provocando sérios danos à derme e o Viscum album tóxico para mamíferos e não

para aves. Essas duas plantas são, atualmente, utilizadas em fitoterapia pelo

homem como antidepressivo e antitun'loral, respectivamente.

3

Apesar da efetiva contribuição da medicina folclórica na introdução de

drogas novas à terapêutica, uma parcela muito pequena de espécies vegetais foi até

agora investigada quanto à identificação de princípios ativos naturais (ANSEL,

1990). Estima-se que a flora brasileira disponha de cerca de 120.000 espécies

vegetais e apesar dessa grande diversidade o Brasil ainda mantém uma atuação

modesta em relação à pesquisa sistemática nesta área e temos ainda o agravante de

que esta exuberante flora pode estar sendo perdida pelo desmatamento e

desaparecimento dos povos da floresta (BRITO & BRITO, 1993; CARLINI, 1988;

GOTTLIEB & MORS, 1978; SIMÕES et aI., 1999).

Diante deste notável império vegetal, o Brasil é um país onde a fitoterapia

encontra um vasto campo para se desenvolver. XAVIER (1991) aponta os

seguintes aspectos primordiais para o progresso da fitoterapia no Brasil: (a)

incentivo ao desenvolvimento científico e tecnológico da fitoterapia, estimulando

sobretudo a formação de recursos humanos e científicos de profissionais

envolvidos com a mesma; (b) desenvolvimento de uma infraestrutura de produção,

calcada no cultivo racional dos taxons, minimizando desta forma a sua exploração

predatória, responsável já por traços nítidos de sua extinção em algumas regiões

do país; (c) reestruturação da política nacional de produção e controle de qualidade

(atualmente incipiente), suprindo a demanda e resguardando satisfatoriamente a

segurança do consumidor.

No Brasil, o estudo farmacológico de plantas medicinais reveste-se

de fundamental importância na introdução à terapêutica de novos fármacos de

origem vegetal, levando-se em conta que aproximadamente 90% das matérias-

4

primas fannacêuticas são importadas e cerca de 80% da população brasileira não

tem acesso aos medicamentos essenciais (BRASIL-CENTRAL DE

MEDICAMENTOS, 1987). A fitoterapia possibilitaria a essa população de mais

baixa renda, que não tem acesso aos medicamentos industrializados, um

medicamento mais barato e de qualidade comprovada (AKERELE, 1988;

MARINI-BETTàLO, 1980).

CARLINI (1988) propõe que o estudo fannacológico de extratos de plantas

brasileiras conste de três etapas. Primeiramente, os testes fannacológicos devem

ser realizados ao acaso, preferencialmente com vegetais utilizados na medicina

popular. Comprovada sua atividade, parte-se para o fracionamento do, extrato

bruto e para os testes fannacológicos das respectivas frações. A seguir, realiza-se o

estudo fannacológico detalhado de substâncias ativas, eventualmente obtidas em

estado puro. Segundo BACCHI (1987), o extrato bruto com ação fannacológica

comprovada e baixa toxicidade' pode ser utilizado na terapêutica com vantagens

sobre substâncias puras dele isolados. A atividade terapêutica do ex~ato bruto

deve-se, muitas vezes, a um conjunto de substâncias com ação sinérgica que

contribui para a obtenção de melhores resultados do que com os compostos

isolados.

Algumas iniciativas foram desenvolvidas no Brasil, como a que foi

proposta pela CEME em 1982: o Programa de Pesquisa de Plantas Medicinais.

Este projeto teve como objetivo o desenvolvimento de uma terapêutica alternativa

e complementar, com embasamento científico, através do estabelecimento de

medicamentos originados a partir da determinação do real valor fannacológico de

5

preparações de uso popular à base de plantas medicinais. Estes preparados seriam

submetidos a uma completa bateria de testes, através dos quais haveria ou não a

confinnação das propriedades terapêuticas a eles atribuídas. A confinnação da

eficácia e tolerabilidade terapêuticas permitiria inclusão das espécies vegetais

estudadas à Relação Nacional de Medicamentos Essenciais-RENAME (BRASIL

CENTRAL DE MEDICAMENTOS, 1990). Recentemente o Ministério da Saúde,

através da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, publicou a Resolução-RDC

nº 17 de 24/02/00 que dispõe sobre o registro de fitoterápicos, que também vem

contribuir para a correta utilização dos medicamentos à base de plantas.

Atualmente o estudo de plantas medicinais, ou mais abrangentemente

produtos naturais, está relacionado com vários temas polêmicos, a saber:

conservação do meio-ambiente, bio-pirataria e preservação dos povos indígenas.

FARNSWORTH (1988), analisando informações sobre as 119 drogas derivadas de

plantas que são hoje utilizadas correntemente no mundo, verificou que 74% delas

têm o mesmo uso que o das plantas das quais derivaram. Isto reforça a idéia de

que a pesquisa de novos fármacos tem muito a ganhar com uma abordagem

etnofarmacológica. Essa abordagem, sendo feita por instituições de pesquisa de

certa forma ajudaria na preservação do conhecimento indígena e do meio

ambiente. Com a publicação da Lei nº 9.279 de 14/05/96 que trata da questão das

patentes aliada à ação dos institutos de pesquisa e universidades, poder-se-ia em

parte coibir a evasão de potenciais fitoterápicos através da bio-pirataria.

6

1.2. PROCESSO INFLAMATÓRIO

A inflamação é a reação do organismo frente a um estímulo exógeno ou

endógeno capaz de gerar agressão celular. A resposta inflamatória ocorre no tecido

conjuntivo vascularizado e nos seus componentes extravasculares. Pode ser

caracterizada como um processo de defesa em muitas patologias, entretanto, em

seu decurso podem oCOrrer efeitos deletérios para o organismo (TROWBRIDGE

& EMLING, 1996; COTRAN et al.,1996).

Os fatores que podem desencadear a inflamação são múltiplos e de natureza

variável podendo ser dos seguintes tipos: 1) biológicos - seres vivos que no tecido

produzem inflamação, como bactérias, vírus, protozoários, helmintos, etc. Estes

representam a causa mais freqüente do processo inflamatório; 2) químicos

produtos químicos de natureza bastante variada como ácidos, álcalis, cáusticos,

óleo de cróton, terebentina, nitrato de prata, formaldeído e proteínas vegetais

(carragenina). Substâncias liberadas de células ou tumores em pr~cesso de

necrobiose; 3) fisicos - calor excessivo causando queimaduras, frio intenso

(congelamento), radiação, eletricidade ou ação de fatores mecânicos como

traumatismos, fraturas, etc; 4) imunológicos - embora sejam de natureza química

ou celular agrupam-se separadamente por constituir uma resposta inflamatória

bastante complexa, além do que muitas inflamações incluem na sua patogenia um

mecanismo de natureza imune, como a participação do complemento (GARCIA

LEME, 1977).

7

Qualquer que seja o agente lesivo a resposta inflamatória aguda tem

duração relativamente curta caracterizando-se por um ou mais dos sinais clássicos:

dor, calor, eritema, edema e perda de função; exsudação de líquido e de proteínas

plasmáticas e migração de leucócitos, predominantemente neutrófil'os, são as

principais características. Observam-se alterações no calibre vascl.11ar com

aumento do fluxo sangüíneo e a circulação tomando-se mais lenta, o sangue fica

mais viscoso devido à saída de líquido da circulação e aderência de leucócitos na

parede do vaso para preparar a migração para o tecido. A microvascularização

sofre alterações estruturais acarretando no aumento da permeabilidade vascular

por contração da célula endote1ial desencadeada por mediadores como histamina,

bradicinina, leucotrienos, etc; agressão endotelial direta resultando em necrose ou

agressão mediada por leucócitos também são fatores que contribuem no aumento

da permeabilidade vascular. A fagocitose e a liberação de enzimas por macrófagos

e por neutrófilos constituem dois dos principais beneficios derivados da

acumulação de leucócitos no foco inflamatório. (RYAN & MAJNO, 1977;

GARCIA-LEME, 1989, COTRAN et al., 1996).

A interação de leucócitos com o endotélio de vênulas pós-capilares

(marginação leucocitária) está entre as primeiras respostas da defesa do hospedeiro

à injúria ou infecções. Os leucócitos, envoltos pela camada de eritrócitos, ocupam

a área central da corrente sangüínea (zona axial) e o plasma a área mais adjacente

ao endotélio (zona plasmática). A posição das células nos vasos depende do seu

tamanho relativo. Em mamíferos, os glóbulos brancos ocupam o centro da

corrente sangüínea e os glóbulos vermelhos, a periferia. Em outras classes,

8

anfibios por exemplo, o tamanho celular é inverso e se observa disposição celular

no vaso oposta àquela observada em mamíferos (FAHREUS, 1929).

Durante o desenvolvimento da resposta inflamatória, a distribuição dos

leucócitos e eritrócitos circulantes altera-se. Nos estágios iniciais do processo

inflamatório, por ação de mediadores químicos, ocorre vasodilatação, com

conseqüente diminuição da velocidade do fluxo sangüíneo e aumento da

permeabilidade vascular. Assim, a zona axial torna-se relativamente mais ampla e

a zona plasmática reduzida com o deslocamento dos leucócitos para essa região

(FLOREY, 1970; WILHELM, 1977). Nestas condições, leucócitos passam

rolando sobre o endotélio com velocidade menor que os eritrócitos, localizados

agora no centro da corrente sangüínea, e passam então a aderir, momentaneamente

à parede do vaso. A duração do contato celular aumenta gradualmente, fmalmente,

os leucócitos permanecem aderidos ao endotélio. O comportamento de rolar e a

aderência destas células ocorrem em vênulas da microcirculação, especialmente

em vênulas pós-capilares e somente quando a lesão é muito extens~ pode-se

observar esse comportamento dos leucócitos nas arteríolas (MAYROVITZ et al.,

1980).

Em vênulas pós-capilares da microcirculação, a aderência está inicialmente

localizada nas proximidades do foco da lesão. À medida que progride a reação

inflamatória, toda a superficie endotelial do vaso sangüíneo é recoberta por

leucócitos aderentes (ALLISON et aI., 1955). A lactoferrina, proteína básica

contida nas granulações específicas dos neutrófilos, parece exercer atividade

promotora da aderência celular uma vez que estudos realizados in vitro com esta

9

proteína purificada têm demonstrado a indução da aderência de neutrófilos a

monocamadas de células endoteliais mantidas em cultura (BOXER et aI., 1982;).

As moléculas de adesão são estruturas expressas na superficie celular,

sendo responsáveis pelo reconhecimento de outras células, componente da matriz

extracelular ou de superfícies sintéticas. Muitas dessas estruturas de superfície

estão ligadas ao citoesqueleto celular por uma cauda citoplasmática e estão

situadas de maneira tal que possam mediar a·comunicação entre as membranas

celulares. Embora não se conheça o mecanismo exato de transmissão dessas

informações da superfície celular para o núcleo, receptores de superficie podem

emitir sinais orientando eventos celulares que podem mudar o fenótipo,

movimento, expressão gênica ou ativação geral do estado de uma célula

(RAMPART, 1994). As moléculas de adesão estão classificadas em cinco grandes

grupos conforme sua estrutura química, e muitas desempenham funções

importantes na interação dos leucócitos com as células endoteliais como:

integrinas, imunoglobulinas, seletinas, caderinas e carboidratos (ALBELDA &

BUCK, 1990; CARLOS & HARLAN, 1990; OSBORN, 1990; VADAS &

GAMBLE, 1990).

A ocorrência de manifestações tão uniformes em vários tipos de lesão

indica que os fenômenos característicos da inflamação são devidos à liberação e

atuação de substâncias endógenas - os mediadores químicos da resposta

inflamatória. Originam-se no plasma na forma de precursores a serem ativados ou

estão em grânulos intracelulares; dese~penham, em sua maioria, sua atividade

10

biológica através da ligação a receptores específicos em células alvo; são capazes

de estimular a liberação de mediadores por parte das próprias células alvo; atuam

sobre um ou mais tipos de células alvo; uma vez ativados e liberados da célula a

maioria desses mediadores têm duração curta; a maioria tem efeitos

potencialmente nocivos (COTRAN et al., 1996).

A histamina é considerada como o principal mediador da fase imediata do

aumento da permeabilidade vascular e está amplamente distribuída nos mastócitos

presentes no tecido conjuntivo, é também encontrada em basófilos e plaquetas

sangüíneas. Diversos estímulos podem liberar a histamina pré-formada em

grânulos de mastócitos, como por exemplo traumatismos, reações imunes,

fragmentos de complemento etc. Com ação semelhante à histamina, a serotonina é

encontrada em plaquetas sangüíneas e em células enterocromafinicas (COTRAN

et al., 1996).

As prostaglandinas formàm-se a partir do ácido araquidônico liberado dos

fosfolipídeos da membrana das células lesadas por ação catalítica da f~sfolipase

A2, fosfolipase C e lipase digliceridica. As enzimas cicloxigenase e hiperoxidase

catalisam as etapas seqüenciais da síntese dos prostanóides (prostaglandinas

clássicas e tromboxanos), enquanto as lipoxigenases transformam o ácido

araquidônico em leucotrienos e outros compostos (eicosanóides), envolvidos em

diferentes ações. As prostaglandinas são vasodilatadoras, exceto tromboxano A2.

Este último estimula a agregação plaquetária, ao contrário da prostacic1ina. A

PGD2 é liberada pelos mastócitos ativados por estímulos alérgicos ou outros. A

PG~ inibe a ação de linfócitos e outras células que participam das respostas

11

, alérgicas ou inflamatórias. Além de promoverem vasodilatação, as prostaglandinas

sensibilizam os nociceptores (hiperalgesia) e estimulam os centros hipotalâmicos

. da termorregulação. Os leucotrienos aumentam a permeabilidade vascular e

atraem os leucócitos para o sítio da lesão (FUCHS & WANNMACHER, 1992).

Diversos fenômenos da inflamação são mediados por proteases

plasmáticas. Os componentes do Sistema Complemento como o C3a e o CSa

influenciam os fenômenos vasculares aumentando a permeabilidade vascular e

promovem a adesão, quimi<:>taxia e ativação leucocítária. O Sistema Cinina resulta,

em última instância, na liberação do peptídeo vasoativo bradicinina, um potente

agente que aumenta a permeabilidade vascular. A etapa final do Sistema de

Coagulação é a conversão de fibrinogênio em fibrina onde são formados

fibrinopeptídeos que induzem aumento da permeabilidade vascular e atividade

quimiotática em relação a neutrófilos.

A inflamação crônica é de duração mator com destruição tecidual e

tentativas de cura, ocorrendo a proliferação de vasos sangüíneos e tecido

conjuntivo. Ao contrário da inflamação aguda que tem basicamente infiltração

neutrofilica, a inflamação crônica caracteriza-se por infiltração de macrófagos,

linfócitos e plasmócitos refletindo uma reação persistente à agressão. O macrófago

é a figura central na inflamação crônica produzindo uma série de substâncias

biologicamente ativas sendo que algumas delas são fatores quimiotáticos, podem

ser tóxicas para as células, e induzem proliferação de fibroblastos.

12

1.3. CONSTITUINTES DE PLANTAS COM ATIVIDADE

ANTIINFLAMATÓRIA

Encontramos no reino vegetal várias classes de compostos com atividade

fannacológica sendo a maioria decorrente do metabolismo secundário.

Basicamente, há três pontos de origem e produção de compostos secundários,

diferenciados segundo seus precursores: 1) ácido chiquímico, como precursor de

inúmeros compostos aromáticos; 2) aminoácidos, fonte de alcalóides e peptídeos;

3) acetato, que através de duas rotas biossintéticas origina compostos, como

poliacetilenos, terpenos, esteróides e outros. Analisando-se apenas os metabólitos

secundários obtidos de espécies lenhosas que apresentam algum tipo de atividade

biológica, encontramos um número de 940 compostos naturais ativos, distribuídos

em dezenas de classes distintas de substâncias químicas. Esses dados não incluem

os componentes naturais obtidos de espécies não lenhosas, o que provavelmente

indicaria a presença de um número bem maior de substâncias. A Figura 1 mostra

a distribuição de grupos substâncias isoladas a partir de espécies lenhosas com

atividade farmacológica já descrita na literatura (DI STASI, 1996).

13

de compostos mostraram ter atividade, destacando-se algumas.

14

benzenóides

f1avonóides

Grupos de compostos

terpenos

Iignanas

cumarinas

alcalóides

300

400

100

200

Nas últimas décadas houve um grande avanço no entendimento da

Fig. 1 Distribuição de substâncias naturais biologicamente ativas presentesem espécies lenhosas, nas classes químicas de compostossecundários (DI STASI, 1996).

Número de

compostos com

diferentes

atividades

farmacológ icas

desenvolvimento de novas substâncias com atividade antiflogística. Várias classes

bioquímica da fisiopatologia da inflamação, favorecendo a descoberta e o

- Ácidos carboxílicos fenólicos, fenóis, flavonóides e

derivados de fenilpropanos

Após o desenvolvimento do ácido acetilsalicílico a partir do ácido

salicílico, vários análogos estruturais foram testados sem o mesmo sucesso obtido

com o AAS. Outras plantas foram investigadas por conterem ácido salicílico ou

álcool salicílico, como por exemplo Populus tremula, Filipendula ulmaria e

Gaultheria procumbens. Foram isolados de Primula ssp. os ésteres 4 e 5 do ácido

metoxisalicílico e testados frente a sistemas de cicloxigenase. O 4-metil éster do

ácido metoxisalicílico foi o inibidor mais ativo apresentando um valor de 50 % a

uma concentração de 250 J..lM. Os compostos eugenol, rimoI e carvacrol

encontrados nos óleos essenciais de Syzygium aromaticum, Thymus vulgaris e

Ledum palustre podem ser considerados como estruturas análogas às dos

derivados salicílicos. Estes compostos apresentam resultados in vitro semelhantes

aos encontrados para a indometacina. O composto carvacrol apresentou atividade

inibitória sobre a cicloxigenase somente na presença de adrenalina usada como

cofator (WAGNER et aI., 1987a; WAGNER et aI., 1987b

).

Outra classe de compostos bastante interessante são os flavonóides,

principalmente por apresentarem baixa toxicidade e exibirem atividade

farmacológica. Entre os compostos investigados temos a galangina, catequina e

quercetina que apresentam ação sobre a cicloxigenase (EVANS et aI., 1987;

KIMURA et al., 1986).

Vários trabalhos descrevem a atividade inibitória dos compostos fenólicos

no modelo do sistema de 5-lipoxigenase. A presença de uma estrutura catecólica

15

--~ir' ,- .- (l ~ ..,' ~g" 'T'O:C~;", ... ~·,."~.~c··ZIm "'.\'. .... .. 5: A. _. ~, ',. _.

16

parece ser essencial para a atividade inibitória da 5-lipooxigenase, o que pennite

sugerir que tais inibidores atuem por mecanismo de supressão do radical oxigênio

livre. Verificou-se que compostos mais polares como os ácidos cafeico e

clorogênico foram inativos, portanto um certo grau de lipossolubilidade parece ser

requisito necessário para um inibidor de lipoxigenase. Segundo YOSHIMOTO et

al. (1983) e RaPE et al. (1983) os fenóis puros (eugenol e timol) e os flavonóides

somente apresentam atividade farmacológica quando aplicados topicamente,

contudo esses mesmos compo~tos quando presentes em extratos totais, apresentam

atividade farmacológica quando administrados por via oral.

- estruturas análogas ao ácido araquidônico

Uma substância isolada da família Zingiberaceae, o gingerol, apresentou

poderosa atividade inibitória da cicloxigenase. Os alquilcatecóis de Toxicodendron

radicans de cadeia C17 ou CI5, com vários graus de insaturação , conhecidos como

urushiol, apresentaram atividade no teste de cicloxigenase. Retinóides que

apresentam um grupamento ácido como vitamina A e etretina foram eficientes

contra lipoxigenase a uma concentração de 50 JlM.

- triterpenos , esteróides e sesquiterpenos

A maior parte desse tipo de substâncias exerce sua atividade antiflogística

por intervenção nos mecanismos de reação imunológica. Como exemplo, a hiper

reatividade do sistema complemento, caracterizado pela formação de imuno

complexos e fatores de inflamação humoral, é um fator que contribui para o

quadro clínico da artrite reumatóide. Um inibidor clássico da via do complemento

é o ácido rosmarínico e outros ésteres do ácido cafeico. O ácido a, f3-boswellico

!"

extraído de Boswellia serrata também é um potente inibidor a uma concentração

de O, 1 ~M. Outras substâncias como a ·aescina, saikosaponinas de Bupleurum

falcatum e saponinas de Dodonea viscosa agem inibindo o sistema complemento.

(WAGNER et al., 1987b; WAGNER et aI., 1996; HIAI et aI., 1981).

1.4. ESTUDO DE PLANTAS DO GÊNERO COPA/FERA

O gênero Copaifera L. (Fabaceae) é nativo de regiões tropicais da América

Latina (DWYER, 1951), desde o Brasil até Honduras, onde 30 espécies são

descritas, e no oeste da África com 4 espécies descritas (DWYER, 1954).

Conhecida no Brasil como copaibeiras e populannente como pau d'óleo, as

árvores são encontradas com freqüência na Amazônia e em regiões centrais do

Brasil, são bastante ramificadas e chegam a medir de 18 a 30 metros de altura.

à óleo-resina de copaíba é obtido a partir de perfurações no tronco da

árvore da qual exsuda um líquido de consistência viscosa com coloraçãQ variando

do amarelo claro até colorações escuras. A partir do óleo-resina obtém-se o

destilado por destilação à vácuo com rendimento de 60-90% (LEUNG, 1980). Das

15 espécies encontradas no Brasil (FREIZB, 1937), as mais conhecidas pelo

emprego medicinal são: Copaifera ojjicinalis, C. reticulata, C. langsdorfii e C.

multijuga. O óleo, segundo alguns autores, tem a função de proteger a planta do

ataque de herbívoros e microrganismos, especialmente fungos (DWYER, 1954).

GABRIEL SOARES DE SOUZA (1540-1592), em seu "Tratado

Descritivo do Brasif' (CARRARA & MElRELLES, 1996), menciona o uso do

11 : '1 '1 i.: c ,i~

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Uoiversi~;\l'-.I d~ f-ião Paulo-

17

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óleo de copaíba para fins medicinais sendo conhecido pelos indígenas como

"árvore da virtude". As propriedades medicinais do óleo de copaíba já eram

conhecidas pelos nativos Latino-Americanos que provavelmente observaram os

animais deixando-se impregnar pelo óleo que exsudava do seu tronco para curar

feridas.

Na região amazônica o óleo é conhecido em mercados populares por vários

nomes: panchimouti, copaibarana, copaibo, copaiva etc. No Brasil o óleo-resina

tem amplo uso na medicina popular como antiinflamatório quando administrado"

oralmente ou aplicado topicamente (BASILE et al., 1988). Observam-se, também,

os seguintes usos: antitumoral, antitetânico, antisséptico urinário, broncodilatador,

anti-sifilítico e cicatrizante (LEWIS & ELVIN-LEWIS, 1977; DE FEO, 1992)

Entre as várias propriedades do óleo de copaíba, as seguintes têm sido

estudadas cientificamente: antiinflamatória (BASILE et al., 1988), analgésica

(FERNANDES et al., 1992), cercaricida (GILBERT et aI., 1972), veneno de peixe

(MAHAJAN et al., 1972), repelente de insetos (LACEY et al., 1981; JüNES et al.,

1983), antimicrobiana (LIMA et al., 1995), antiúlcera (PAIVA, et al., t998) e

antitumoral (OHSAKI et al., 1994).

O estudo químico do óleo-resina de copaíba revelou a presença de

sesquiterpenos e diterpenos, variando qualitativa e quantitativamente de acordo

com a procedência e a espécie estudada. Os seguintes pesquisadores investigaram

fitoquimicamente o óleo de copaíba: MONACHE et al., 1971, LANGENHEIM et

aI., 1986, MACEDO & LANGENHEM, 1989, VEIGA-Jr et aI., 1995, PINTO et

al., 1997 e MONTI et aI., 1999.

18

o uso de Ressonância Magnética Nuclear permite traçar um perfil básico

para Os óleos de copaíba podendo d}stribuí-Ios em três grupos com relação à

composição apoIar (hidrocarbonetos sesquiterpênicos): (I) ricos em cariofileno,

(II) ricos em l3-bisaboleno e (lII) mistos (cariofileno e l3-bisaboleno). Com relação

à composição polar (ácidos diterpênicos) caracterizam-se dois tipos: alto e baixo

teores de compostos furânicos (GRAMOSA et aI., 1996). Para alguns compostos

isolados de espécies de Capaifera como cariofileno e calameneno (sesquiterpenos)

são atribuídas propriedades antiinflamatórias, espasmolíticas e antibacterianas

(FERRARl et aI., 1971).

O uso popular na região amazônica e a crescente industrialização e

comercialização por laboratórios de fitoterapia estimularam a avaliação

antiínflamatória do óleo-resina de copaíba. No presente estudo foram escolhidas

amostras de espécies identificadas botanicamente e uma amostra comercial da

região de Manaus largamente' utilizada como fitoterápico.

19

2. OBJETIVOS

Constituem objetivos do presente trabalho avaliar:

I. Atividade antiin:flamatória das seguintes amostras:

Ia.

• amostra comercial da região de Manaus

Ib. Das três amostras ~baixo selecionar a que tiver maior atividade:

• amostra da espécie Copaifera reticulata

• amostra da espécie Copaifera multijuga

• amostra da espécie Copaifera paupera

11. Toxicidades aguda e subcrônica das amostras comercial da região de

Manaus e da espécie Copaifera reticulata

111. Citotoxicidade da amostra da espécie Copaifera reticulata

IV. Composição química das amostras comercial da região de Manaus e da

espécie Copaifera reticulata, e suas respectivas frações.

20

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. MATERIAL

Óleo-resina: o material foi obtido através de coleta de árvores de várias

espécies da região próxima a Manaus pela empresa Pronatus do Amazonas Ind. E

Com. F. Cosmo LT (amostra designada pela sigla CAM). As amostras de

Copaifera multijuga (CM) ~ C. paupera (CP) foram fornecidas pela Universidade

Federal do Acre. A amostra de C. reticulata (CR) foi fornecida pelo IBAMA de

Belém/PA. As amostras CAM e CR foram submetidas a uma destilação

fracionada a 125-140°C sob pressão reduzida afun de se obter seu óleo essencial

ou destilado e sua respectiva resina. Sendo as frações denominadas por: CAMD

(destilado da amostra CAM), CAMR (resina da amostra CAM), CRD (destilado

da amostra CR) e CRR (resina da amostra CR).

Animais: utilizaram-se ratos Wistar machos (180±20 g) e camundongos

Swiss machos pesando entre 25 e 30 g, estes últimos utilizados somente no ensaio

de dermatite pelo óleo de cróton. Os animais foram mantidos em gaiolas

apropriadas no mínimo por uma semana antes do início dos experimentos com

fornecimento de ração Nuvilab CR-l® (Nuvital) e água ad libitum. A ração foi/

interrompida 24 horas antes dos experimentos. Em cada experimento os animais

foram divididos em grupos com 5 ou 6 animais em cada grupo.

21

3.2. MÉTODOS

3.2.1. Estudos fitoquímicos: As amostras CAM e CR foram analisadas

pelo Doutorando Valdir Veiga Junior do Centro de Tecnologia do Instituto de

Química da UFRJ. Os componentes do óleo-resina foram detectados através de

técnicas cromatográficas e espectroscópicas, utilizando-se cromatografia gasosa de

alta resolução e cromatografia gasosa de alta resolução acoplada a espectrometria

de massas. Os compostos foram identificados utilizando-se o conjunto de dados de

índice de Kóvats e espectrometria de massas. Os índices de Kóvats foram obtidos

em coluna SE-54, comparados com dados de padrões e de índices de literatura. Os

espectros de massas foram obtidos por impacto de elétrons, em aparelho HP-5897

com analisador quadrupolo, comparados com espectros padrões e com a

espectroteca Wiley. A programação utilizada foi uma taxa de 2°C/min, de 110 a

l30°C, seguida de taxa de 8,5°C/rilin até 290°C. O hidrogênio foi utilizado como

gás de arraste a uma vazão de 2 ml/min. A injeção foi realizada em mod~ split,

com uma divisão de 1:20. As temperaturas do injetor e do detetor foram de 270°C

e de 300°C, respectivamente. Foram injetados 2 !lI de solução c1orofónnica (ou

em dic1orometano) dos óleos citados. Utilizou-se uma coluna de 25 m de

comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 !lm de espessura de fase do tipo

SE-54 (5% fenil e 1% vinil em metil silicone).

22

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3.2.2. Avaliação farmacológica

3.2.2.1. Edema de pata induzido pela carragenina

o efeito inibitório de diferentes doses da amostra CAM sobre o edema de

pata induzido pela carragenina foi comparado ao controle (óleo de milho Mazola)

com o objetivo de se verificar a relação dose/efeito e estabelecer a DEso.

Comparou-se a DEso da amostra aos efeitos inibitórios do fosfato dissódico del

dexametasona (Prodome), fenilbutazona cálcica (Boehringer De Angeli) e ao

grupo controle.

Administrou-se o óleo-resina (CAM) por via oral, dissolvido no óleo de

milho, nas doses 0,90 mL/kg, 1,26 mL/kg, 1,76 rnL/kg, 2.47 mL/kg, 3,46 mL/kg,

4,84 mL/kg, 6,78 mL/kg. A dexametasona e a fenilbutazona foram administradas

nas doses de 0,2 mg/kg (BASILE et aI., 1988) e 50 mg/kg (SERTIÉ et aI., 1988),

respectivamente.

Sessenta minutos após a administração oral das drogas, injetou-se

subcutaneamente 0,1 mL de carragenina (Sigma, Lambda tipo IV) a 1 % em

solução fisiológica estéril na região subplantar da pata posterior esquerda de cada

animal não anestesiado e 0,1 mL de solução fisiológica estéril na mesma região da

pata posterior direita, conforme técnica descrita por WINTER et aI. (1962).

o volume das patas até a articulação tíbio-társica foi determinado por

período de 24 horas (com leituras na 1ª, 3ª ,5ª ,7ª ,9ª e 24ª horas) após a injeção da

carragenina pelo método pletismográfico de VAN ARMAN et al. (1965). Aos 300

23

minutos registrou-se o pico máximo do edema experimental. O deslocamento da

coluna de mercúrio foi medido com auxílio de transdutor de pressão modelo P 23

ID e registrado no polígrafo Gould, modelo RS 3400.

Também foram avaliadas as amostras CM, CP e CR (dose de 2,47 rnL/kg,

DEso determinada com a amostra CAM) comparando-as com a amostra CAM

(2,47 mL/kg) A amostra CR (2,02 mL/kg, dose equipotente - DEq - à DEso

determinada para CAM) foi avaliada frente às drogas padrões dexametasona e

fenilbutazona. As frações CAMD, CAMR (2,47 mL!kg), CRD e CRR (2,02

rnL/kg) também foram avaliadas. Todos os ensaios foram feitos comparando-se ao

grupo controle, 4,0 rnL/kg (óleo de milho Mazola).

O aumento percentual das patas foi calculado através da expressão:

E(%) = ~Q X 100Vo

Onde:

E(%) ~ aumento percentual do volume da pata esquerda

Vo ~ volume da pata direita (solução fisiológica)

vx ~ volume da pata esquerda (carragenina)

3.2.2.2. Edema de pata induzido pela nistatina

o edema de pata induzido pela nistatina segue metodologia preconizada por

SCHIATTI et al. (1970). Injetou-se subcutaneamente 0,1 mL (47.600 U) de

suspensão de nistatina a 9,°% (Squibb) na região subplantar da pata posterior

24

esquerda de cada animal não anestesiado. Na pata posterior direita, injetou-se

volume equivalente de solução fisiológica estéril.

Após seis horas, os animais foram tratados por via oral com as amostras

CAM (2,47 rnL/kg) e CR (2,02 rnL/kg), com indometacina (Sigma) na dose de

5,0 mg!kg (ARRIGONI-MARTELLI et al., 1971) e com óleo de milho Mazola

(4,0 rnL/kg).

O volume das patas até a articulação tíbio-társica foi determinado pelo

método pletismográfico des~rito por VAN ARMAN et al. (1965) na 6ª, 8ª, 10ª

(pico máximo do edema experimental), 12ª, 24ª e 48ª hora após a injeção da

nistatina. O deslocamento da coluna de mercúrio foi medido com o auxílio de

transdutor de pressão modelo P 23 ID e registado no polígrafo Gould, modelo RS

3400. Calculou-se o aumento percentual do volume das patas.

As amostras CAMD (2,47 rnL/kg) versus CAM (2,47 rnL/kg) e CRD (2,02

rnL/kg) versus indometacina também foram avaliadas e comparadas ao grupo

controle (óleo de milho Mazola).

3.2.2.3. Edema de pata induzido pelo miconazol

O edema de pata induzido pelo miconazol segue metodologia preconizada

por HANADA et al. (1994). Injetou-se subcutaneamente 0,1 roL de uma solução

composta por nitrato de miconazol (Searle), (2,0 mg por pata), dissolvido em uma

solução 0,5% de CMC em solução fisiológica estéril na região subplantar da pata

posterior esquerda de cada animal não anestesiado. Na pata posterior direita,

25

injetou-se volume equivalente de solução 0,5% de CMC em solução fisiológica

estéril.

Após sessenta minutos, os animais foram tratados por via oral com as

amostras CAM (2,47 mL!kg) e CR (2,02 mL!kg), com nimesulida (Schering

Plough) na dose de 2,5 mgikg (SWINGLE & MOORE, 1984) e com óleo de milho

Mazola (4,0 rnL/kg).

O volume das patas até a articulação tíbio-társica foi determinado pelo

método pletismográfico descrito por VAN ARMAN et alo (1965) na 5ª, 7ª, 9ª, 24ª

(pico máximo do edema experimental), 48ª, 72ª, 96ª hora após a injeção do

miconazol; as leituras diárias foram efetuadas até o décimo primeiro dia. O

deslocamento da coluna de mercúrio foi medido com o auxílio de transdutor de

pressão modelo P 23 ID e registado nO polígrafb Gould, modelo RS 3400.

Calculou-se o aumento percentual das patas.

3.2.2.4. Formação de tecido granulomatoso

O efeito da administração oral das amostras CAM (2,47 rnL!kg), CR, CRD

e CRR (todas na dose de 2,02 rnL/kg) na inibição da fonnação de tecido

granulomatoso induzido por cilindros de algodão foi avaliado segundo

metodologia preconizada por MEIER et alo (1950), modificada por

NIEMEGGERS et a!. (1975).

Em condições assépticas e sob anestesia com éter etílico, efetuou-se incisão

longitudinal ventral em cada animal e implantou-se através de divulsão do tecido

26

subcutâneo quatro cilindros de algodão hidrófilo branco (Johnson & Johnson) de 5

mm de comprimento pesando 40 mg cada, em quatro pontos eqüidistantes da

incisão. Os cilindros de algodão foram previamente esterilizados por

autoclavagem em lotes de quatro unidades pesando 160 mg e, imediatamente antes

do implante, foram tratados com solução de ampicilina a 10% (Biossintética).

Administraram-se, a seguir, por via oral, doses únicas diárias das amostras,

0,2 mg/kg (BASILE et al., 1988) de dexametasona (Prodome) e óleo de milho

Mazola (4,0 rnL/kg). O tra,tamento foi iniciado duas horas após o implante dos,

cilindros de algodão e prolongou-se por seis dias.

No sétimo dia, os animais foram sacrificados com éter etílico e os

granulomas foram removidos por dissecação e submetidos à secagem em estufa a

60°C por 24 horas.

Em seguida, seus pesos brutos foram determinados em balança analítica

(Marte); o peso do granuloma foi calculado pela diferença entre os pesos secos

inicial e fmal.

3.2.2.5. Dermatite induzida pelo óleo de cróton

O método utilizado foi o descrito por TUBARO et al. (1985) modificado

por SERTIÉ et aI. (1991), no qual a inflamação cutânea foi induzida pela

aplicação de 200 Jlg de óleo de cróton (Sigma) dissolvidos em 20 JlL de

acetona/água (7:3) na superficie da orelha direita dos camundongos. Na orelha

esquerda, foi aplicado o mesmo volume de acetona/água. Trinta minutos após a

27

aplicação deste estímulo, foi realizado o tratamento tópico na orelha estimulada,

em seis animais por grupo, com a amostra CR (0,747 J..lL/orelha/20 J..lL solvente),

naproxeno (1,0 mg/orelha/20 J..lL solvente) e o controle. A dose administrada para

a amostra CR foi calculada em função do peso médio da orelha do animal. A

resposta antiinflamatória foi avaliada após 6 horas da aplicação do estímulo,

quando os animais foram mortos e un:'l.a amostra de 6 mm de diâmetro da orelha

foi retirada e estabelecida a diferença do peso entre a amostra da orelha controle

(esquerda) e a orelha estimulada (direita), os resultados obtidos foram expressos

em peso (mg).

Para avaliar a amostra CRI) foi feita uma modificação do método

preconizado por SERTIÉ et aI. (1991) no qual a amostra ensaiada e a droga padrão

são dissolvidas no solvente acetona/água (7:3). A modificação realizada foi a de

substituir o solvente por uma emulsão composta por Polawax 16%,

Propilenoglicol 5%, óleo mineral 2% e água q.s.p. A amostra CRD foi dissolvida

na emulsão até a obtenção da concentração 0,747 J..lL/orelha/30 mg emulsão e a

droga padrão solubilizada para obter concentração de 1,0 mg/orelha/30 mg

emulsão. O grupo controle foi representado pela emulsão. A aplicação do óleo de

cróton segue o mesmo procedimento adotado por SERTIÉ et aI. (1991).

28

---

3.2.2.6. Toxicidade

3.2.2.6.1. Estudos de toxicidade aguda

Para a detenninação da Dose Letal 50% (DLsü) (THOMPSON & WEIL,

1952; BRITO, 1994; CHAN et al., 1982) foram realizados ensaios, administrando

se doses únicas e observando-se número de mortes no período de 72 horas, com as

amostras:

(I) CAM nas doses de 9,49 e 13,28 ml/kg (doses utilizadas na detenninação

da DEsü da amostra CAM, que é igual a 2,47 ml/kg), 9,88 ml/kg (4 x DEsü de

CAM) e 12,35 ml/kg (5 x DEsü de CAM);

(11) CAMD na dose de 20,0 ml/kg (54% de 15 x DEsü de CAM);

(III) CAMR na dose de 2,85 ml/kg (46% de 2,5 x DEsü deCAM);

As porcentagens acima indicam a quantidade das frações presentes no óleo

resina bruto (amostra CAM).

(IV) CR nas doses de 3,48, 4,04 (2 x DEq de CR), 4,69 e 5,44 ml/kg, com

razão igual a 1,16. As doses foram calculadas a partir da DEq da amostra CR, que

é igual a 2,02 mJJkg ;

(V) CRD nas doses de 3,05 ml/kg (64% de 4,76 ml/kg - DLsü máxima de

CR) e 9,14 ml/kg (64% de 4,76 ml/kg);

(VI) CRR nas doses de 1,10, 1,29 e 1,52 ml/kg (36% de 4,22 ml/kg - DLsü

mínima de CR) com razão igual a 1,18.

29

As porcentagens acima indicam a quantidade das frações presentes no óleo

resina bruto (amostra CR).

Os animais (5 por grupo) foram tratados, em dose única, por via oral e

avalioú-se, após 72 horas, o número de animais mortos. O padrão de

comportamento dos animais (depressão, excitação, convulsão, estereotipia,.piloereção, diarréia) foi observado diariamente durante o penodo do experimento.

3.2.2.6.2. Estudos de toxicidade subcrônica

O ensaio de toxicidade subcrônica seguiu metodologia preconizada por

CHAN et aI. (1982), modificada por SERTIÉ et a!. (1988); BRITO (1994);

SERTIÉ et a!. (1990) realizado com as amostras CAM nas doses de 2,47 e 4,84

ml/kg, CR na dose de 2,02 ml/kg e CRD na dose de 2,02 ml/kg com grupos de

seis ou cinco animais. Avaliou-se a toxicidade com as doses sendo administradas

diariamente por 30 dias e de dois em dois dias a contar do primeiro, m~diu-se o

consumo médio de ração e água. O peso corporal foi anotado individualmente. No

31Q dia os animais foram pesados, sacrificados e os seguintes órgãos frescos foram

pesados em balança analítica (Marte): figado, rins, baço, pulmão e coração.

Cálculou-se o peso relativo de cada órgão em função de seu peso corporal. O

padrão de comportamento dos animais (depressão, excitação, convulsão,

estereotipia, píloereção, diarréia e constipação) foi observado diariamente durante

o penodo do experimento.

30

--------~-...._O:~-----------~-

A toxicidade subcrônica foi avaliada ainda através de determinação de

parâmetros bioquímicos e hematológicos (STEVENS & GALLO, 1982), com

exceção da amostra CAM. As análises hematológicas e bioquími.cas foram

realizadas no Depto de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas da USP. As análises bioquímicas realizadas foram:

dosagem de uréia, aspartato transferase, fosfatase alcalina, creatinina, alanina

transferase e proteínas totais.

As amostras de sangpe dos animais foram coletadas da artéria abdominal,

com seringa de plástico contendo 500 J.J1 de EDTA 0,2 M, sob anestesia com éter

etílico.

3.2.2.6.3. Estudos de citotoxicidade

Os ensaios foram realizados em ovos de ouriço do mar segundo

metodologia desenvolvida por FREITAS & SAWAYA (1986). Utilizou-se a

espécie Lytechinus variegatus. Os animais foram induzidos a eliminarem os

gametas pela injeção de KCI 0,5 N na cavidade celômica (perivisceral). Após o

término da eliminação dos gametas, os óvulos foram colocados em um recipiente

com água do mar filtrada. Os espermatozóides foram coletados, concentrados e

mantidos à baixa temperatura até o uso. Após a liberação dos gametas, 50 ~l de

espermatozóides, diluídos em 2450 ~l de água do mar filtrada, foram colocados

junto aos óvulos para promover a fecundação. Após ocorrer a fecundação, os

zigotos (inóculo) foram distribuídos em frascos, sendo que cada experimento

31

possuia um frasco controle e frascos testes, em escala logarítmica da dose. Todos

os frascos continham água do mar filtrada (1,0 rnl) no qual a amostra foi

dissolvida e o inóculo(l,O rnl) totalizando 2,0 rnl de solução. A amostra CR foi

adicionada logo após a fecundação e os ovos mantidos no banho com agitação

suave. Após ocorrer a primeira divisão (aproximadamente 40 minutos), uma

alíquota de 500 ~l da cada frasco foi retirada e fixada no mesmo volume de

formalina 10 %. Para cada amostra fixada contou-se, em microscópio, 100

embriões para a obtenção da percentagem de alterações ou de inibição da divisão.

Foram realizados dois tipos de ensaios: a) o óleo-resina dissolvido na água

do mar com agitação por vórtex por 5 minutos nas doses de 10,0, 5,0, 2,5, 1,25 e

0,625 ~ de óleo/rnl de água do mar com inóculo; b) óleo-resina dissolvido em

água do mar e dimetil sulfóxido (DMSO) com agitação por vórtex por 5 minutos

nas doses de 7,5, 5,0, 2,5 e 1,25 ~l/rnl.

3.2.3. Análise estatística

Os resultados foram submetidos à análise de variância, seguido de Tukey

ou teste "1" de Student (programa Instat lI). O método de determinação da DEso foi

a regressão linear modelo I (SOKAL & ROHLF, 1969).

32

4. RESULTADOS

4.1. Estudos fitoquímicos

Da destilação fracionada do óleo-resina de copaíba da amostra CAM

obteve-se 54,0 % de destilado, equivalente ao total de sesquiterpenos e 46,0 % de

resina, equivalente ao total de diterpenos. Da amostra CR obteve-se 64,0 % de

destilado equivalente à fraç&o sesquiterpênica e 36,0 % de diterpenos.

A análise por cromatografia gasosa-espectrometria de massas da amostra

CAM revelou a presença de 13 compostos sesquiterpênicos e 10 diterpênicos

(Tabela 1 e Figura ·40 em apêndice), para a amostra CR 15 compostos

sesquiterpênicos e 15 diterpênicos (Tabela 2 e Figura 41 em apêndice).

33

Tab.l Composição química do óleo-resina de copaíba da amostra CAM.COMPOSTOS

a-cubebenoa-copaeno~-cubebeno

~-carioflleno

a-bergamotenoa-humulenoa-amorfeno

D-germacrenop-bisaboleno8-cadinenocariofllenolmultigenol

óxido de cariofllenototal de sesquiterpenos

eperuato de metilaclerodenoato de tnetila

copalato de metilacolavenato de metila

hardwickiato de metilapinifolato de dimetila

agatato de metilall-hidroxi-copalato de metilall-acetoxi-copalato de metila

Não identificadototal de diterp'enos

PERCENTUAL1,821,920,72

36,042,885,440,921,970,630,860,350,390,54

54,480,390,368,852,531,170,838,834,6416,641,28

45,52

34

Tab.2 Composição química do óleo-resina de copaíba da amostra CR.COMPOSTOS

B-elemeno~-cariofileno

a-bergamotenoa-gualeno~-farneseno

a-humulenovalenceno

a-aromadendrenoa-selineno

Não identificado~-bisaboleno

~-sesquifelandreno

a-bisabolenocedrol

cubenoltotal de sesquiterpenos

16-caurenocaurano

Não identificadoclerodanoato de metilalabdanoato de metila

Não identificadocativato de metilaNão identificado

caurenoato de metilacopalato de metila

cauranoato de metilalabdadienoato de metila

danielato de metilapinifolato de dimetila

agatato de dimetilatotal de diterp'enos

PERCENTUAL4,473,4010,700,561,230,401,17

10,966,701,64

22,391,362,190,360,64

68,160,650,420,241,760,830,471,450,867,110,566,991,237,121,810,36

31,84

35

4.2. Avaliação farmacológica

4.2.1. Edema de pata induzido pela carragenina

A injeção intraplantar de 0,1 mL de carragenina a 1% em solução

fisiológica provocou incremento progressivo no volume das patas a partir de 60

minutos após a injeção do agente flogístico. A análise das Tabelas 3 e 4 permite

observar que o tempo em que ocoma o pico de edema máximo variava segundo o

biotério de origem dos animais. Assim, os ratos provenientes do Biotério Central

do Instituto de Ciências Biomédicas da USP (lCBUSP) apresentaram pico de

edema máximo na 5ª hora (Tabela 3); já, nos fornecidos pelo Biotério da

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP (VETUSP) o pico de

edema máximo foi atingido na 7ª hora (Tabela 4).

Tab.3 Determinação do pico de edema máximo de pata de rato induz~do pelacarrag~nina emratqs provenientes do biotério central do ICBUSP.

Aumento do volUine da pata (%),

Animais lªhora 3ªhora 5ªhora 7ªhora 9ªhora 24ªhora

1 18,18 56,06 55,00 40,91 38,10 18,18

2 27,27 54,55 65,00 54,55 40,91 23,81

3 18,18 45,46 55,00 42,86 33,33 19,05

4 21,51 66,67 75,00 56,52 40,91 30,00

5 16,67 59,09 73,68 61,91 37,92 30,00

6 27,27 54,55 56,52 41,67 36,36 27,27

Média 21,51 56,06 63,37 49,74 37,92 24,72Erro Padrão 1,93 2,82 3,79 3,69 1,18 2,14

36

37

TabA Determinação do pico de edema máximo de pata de rato induzido pelacarragenina em ratos provenientes do biotério central da VETUSP.

Aumento do volume da pata (%)

Animais lªhora 3ªhora 5ªhora 7ªhora 9ªhora 24ªhora

1 14,29 62,50 62,50 62,50 50,00 50,00

2 14,29 62,50 44,44 50,00 50,00 25,00

3 8,70 50,00 55,56 62,50 62,50 37,50

4 10,00 37,50 50,00 58,33 37,50 25,00

5 . 19,05 53,13 53,13 58,33 50,00 34,38

6 13,27 53,13 53,13 58,33 50,00 , 34,38

Média 13,27 5~,13 53,13 58,33 50,00 34,38Erro Padrão 1,49 3,79 2,44 1,86 3,23 3,79

4.2.1.1. Determinação da DEso da amostra CAM

o efeito do pré-tratamento pela via oral com a amostra CAM na inibição

do edema foi avaliado aos 420 minutos após a injeção da carragenina (tempo de

evolução do edema máximo em ratos provenientes da VETUSP). A porcentagem

de redução do volume das patas, neste tempo, variou de 49,49 (1,26 mL/kg) a

32,66 % (4,84 mL/kg) com a amostra CAM (Tabela 5).

38

Tab. 5 Efeito, após 420 minutos, da administração pela via oral da amostraCAM na evolução do edema de pata induzido pela carragenina em ratosprovenientes da VETUSP.


Controleóleo de milho CAM (mL/kg)

(mL/kg)Animais 4,0 0,90 1,26 1,76 2,47 3,46 4,84 6,78

1 65,12 49,04 45,00 45,85 45,45 35,79 33,33 30,43

2 52,38 45,46 49,49 40,91 45,00 25,00 32,66 30,43

3 80,95 47,62 61,90 55,00 41,87 45,00 35,00 30,43

4 57,14 47,37 45,00 50,00 40,00 30,00 26,32 33,33

5 70,00 52,38 40,00 44,44 40,00 36,84 36,84 38,10

6 65,12 52,38 55,56 38,89 38,89 42,11 31,82 30,00

Média 65,12 49,04 49,49 45,85 41,87 35,79 32,66 32,12Erro

Padrão 4,08 1,16 3,27 2,42 1,13 3,03 1,47 1,29

o pré-tratamento pela via oral com a amostra CAM inibiu o

desenvolvimento do edema de maneira dose-dependente no intervalo de dose

entre 1,26 mL/kg a 4,84 mLlkg. A evolução dos valores experimentais estão

expressos na Figura 2.

52

aurrentodovolurreda 42

pata(%)

32

-0.04576 0.10037 0.24551 0.39270 0.53008 0.68485 0.83123

logdose

Fig. 2 Efeito da administração, pela via oral, após 420 minutos, daamostra CAM no edema de pata induzido pela carragenina emratos. Reta experimental da relação dose-efeito no intervalo dedose entre 0,90 e 6,78 m1!kg. Cada ponto representa a média ±

E.P.M. de 6 animais.

39

A regressão linear (Figura 3) ··obtida da relação dose-efeito da amostra

40

0.684850.10037 0.2~1 0.39270

logdose

20

Fig. 3 Efeito da administração, pela via oral, após 420 minutos, da amostraCAM no edema de pata induzido pela carragenina em ratos.Regressão linear da relação dose-efeito no intervalo de dose entre1,26 e 4,84 ml/kg. r = - 0,7497 e y = 52,8602 - 29,8382 x.

•60

ti.aumen O

do 50

volume I.

da 40-1 • •

pata(%) 30

linear r = - 0,7497. O valor da dose eficaz média 50% (DEso) foi de 2,47 ml/kg.

CAM entre as doses de 1,26 a 4,84 ml/kg apresentou coeficiente de correlação

--- ---~'"'..---..--

4.2.1.2. Atividade da amostra CAM e de suas frações

Após a determinação da DEso da amostra CAM (2,47 mLlkg) procedeu-se

ao estudo comparativo frente às drogas padrões dexametasona (0,2 mglkg) e

fenilbutazona (50,0 mglkg) (Tabela 6).

Tab. 6 Efeito, após 420 minutos, da administração pela via oral da amostraCAM e de drogas padrões no edema de pata induzido pelacarragenina em ratos.


Controle/óleo de CAM Dexametasona FenilbutazonaAnimais milho 4,0 mLlkg 2,47 mLlkg 0,2 mg!kg 50,0 mglkg

1 75,00 44,44 25,00 55,55

2 75,76 55,55 22,22 50,00

3 78,95 55,55 31,58 55,55

4 78,95 50,00 23,53 50,00

5 72,22 44,44 16,67 50,00

6 73,68 50,00 21,05 52,11

75,76 50,00* 23,34 52,11MédiaErro 1,12 2,03 2,01 2,59

Padrão*significativamente diferente do controle e da dexametasona (Tukey; p<O,OOl).

41

42

Fig. 4 Efeito da administração, pela via oral, da amostra CAM (2,47mLlkg), dexametasona (0,2 mglkg) e fenilbutazona (50,0 mglkg) noedema de pata induzido pela carragenina em ratos. Cada pontorepresenta a média ±E.P.M. de 6 animais.

A Figura 4 mostra a evolução do edema de pata induzido pela carragenina

90 ~-contr

80 -cam(1)

~-dexa

S 70 -fenil='- --. 60o ;:.R;> o'--"

o ~ 50"c;) ~.s o.. 40l=: ~(1)"'0

30~ 20

10O

1 3 5 7 9 24

tempo(hs)

em ratos tratados com a amostra CAM e padrões administrados pela via oral.

(a) significativamente diferente do controle e da dexametasona (Tukey; p<O,OOl)(b) significativamente diferente do controle (Tukey, p<0,05) e da dexametasona

(Tukey; p<O,OOl)

43

Fig. 5. Efeito da administração pela via oral, na dose de 2,47 mL/kg,das amostras CAM e CAMD no edema de pata induzido pelacarragenina em ratos. Cada ponto representa a média ± E.P.M.de 6 animais.

(a) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OS)

A seguir avaliou-se o efeito das amostras CAMD (Figura 5) e CAMR

8)-+-contr

-;uj -""cam

I -'-camdO) (í)e~-. ~0:;:R;>~ 40Oro"'O~

:I)00.$5cd0)"'0 ~eª 10

O

1 ·3 5 7 9 24

tempo(hs)

carragenina em ratos.

(Figura 6) na dose de 2,47 mL/kg sobre o edema de pata induzido pela

(a) CAM significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,Ol) e CAMRsignificativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OOl)

44

Fig.6 Efeito da administração pela via oral, na dose de 2,47 mL/kg, dasamostras CAM e CAMR no edema de pata induzido pelacarragenina em ratos. Cada ponto representa a média ± E.P.M.de 6 animais.

l20 l-+-contr

-+-cam

~ 100 ~ "r" -'-carnr~

Q)

8 ali=,-. I a-';::R0 0;;> '-"o~ 00~"So~

"S 40Q)

8

ª ~

O

1 3 5 7 9 24tempo(hs)

4.2.1.3. Avaliação das amostras CM, CP e CR frente à amostra CAM

Foi avaliado o efeito das amostras CM, CP e CR sobre o edema de pata

induzido pela carragenina em ratos. O estudo foi feito comparando-se com a

amostra CAM utilizando-se para as amostras a dose de 2,47 rnL/kg administrada

pela via oral (Tabela 7 e Figura 7).

Tab. 7 Efeito, após 300 minutos, da administração pela via oral das amostrasCAM, CM, CP e CR no edema de pata induzido pela carragenina em ratos.


Animais Controle/óleo de CAM CM CP CRmilho 4,0 rnL/kg 2,47 2,47 rnL/kg 2,47 2,47

rnL/kg rnL/kg rnL/kg1 75,00 70,00 25,00 77,78 53,89

2 92,28 65,98 55,55 40,00 60,00

3 94,12 66,67 33,33 62,50 55,56

4 100,00 68,42 66,67 57,57 55,56

5 100,00 58,82 81,25 50,00 44,44

6 92,28 65,98 52,36 57,57 53,89

Média 92,28 65,98 * 5236 ** 5757 ** 53 89 **, , ,

Erro Padrão 4,59 1,92 10,39 6,32 2,57

* significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OI)** significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,001)

45

CAM:

4.2.1.4. Determinação da Dose Equipotente da amostra CR

46

crcpcm

y ml/kg (Dose Equipotente de CR)

"f,h.'.~Ü,

contr cam

(a) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,Ol)(b) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O;OOl)

12010080(i)

40

20O

Efeito, após 300 minutos, da administração pela via oral, na dose de2,47 ml/kg, das amostras CAM, CM, CP e CR no edema depata induzido pela carragenina em ratos. Cada ponto representaa média ± E.P.M. de 6 animais.

53,89 (% de inibição de CR)

65,98 (0/0 de inibição de CAM) - 2,47 mJJkg (DEso de CAM)

Com os dados obtidos na Tabela 7 calculou-se, a seguir, a dose

Iy = 2,02 m1Ikg I

ro"'O

Q)

E..2--o~> e--o ro"'O~o~~

5E

ª

Fig.7

equipotente da amostra CR por extrapolação do resultado obtido com a amostra

_.----.._- -_._------_.

47

Fig. 8 Efeito da administração pela via oral das amostras CAM (2,47m1Ikg) e CR (2,02 m1Ikg) no edema de pata induzido pelacarragenina em ratos. Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 6ammms.

Prosseguindo, comparou-se o efeito da amostra CAM (2,47 m1Ikg) com a

"\

100 -, -+-contr

~--1 ~ -'-camd

00--1 r .......... ..........cr. "'t:)

(1)

§ 70...... ---- roo~>~o d 50

"'t:)"d

.s o.. 40~ 30~ 20

10O

1 3 5 7 9 24

tempo(hs)

da doses.

de pata induzido pela carragenina em ratos objetivando-se avaliar a equipotência

amostra CR (2,02 m1Ikg) (Figura 8) administradas pela via oral sobre o edema

(a) CR significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OI)(b) CR e CAM significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OOI)

4.2.1.5. Atividade da amostra CR e de suas frações

(Tabela 8 e Figura 9).

A amostra CR (2,02 m1Ikg), administrada pela via oral, foi avaliada frente

48

55,84

45,46

55,84

54,55

60,00

55,56

63,64

Fenilbutazona50,Om~

66,67

50,00

57,90

47,37

42,86

52,38

52,86

Dexametasona0,2m~

71,47

72,73

70,00

77,78

68,42

68,42

71,47 *

CR2,02 m1Ikg


97,54

118,00

100,00

100,00

91,30

85,00

90,91

Controle/óleo demilho 4,0 m1Ikg

1

2

3

4

5

6

MédiaErro

Padrão 4,73 1,44 3,44 2,50

Animais

às drogas padrões dexametasona (0,2 mg/kg) e fenilbutazona (50,0 mg/kg) no

pico de edema máximo (300 minutos), seguindo o mesmo modelo experimental

Tab. 8 Efeito, após 300 minutos, da administração pela via oral da amostra CR ede drogas padrões no edema pe pata induzido pela carr~geninaem ratos.

* significativamente diferente do controle e dexametasona (Tukey; p<O,01), efenilbutazona (Tukey; p<0,05).

49

120~contr

~ 100 - -cr"'tj

Q) I r .J..~_ -'-fenilE::s,-.... rol 1..- T ~ -+-dexa-~0 0>----o ~ (j)"'tj~

00..E 40Q)

E

ª ~

o1 .3 5 7 9 24

tempo(hs)

Fig. 9 Efeito da administração pela via oral da amostra CR (2,02 ml!kg),dexametasona (0,2 mglkg) e fenilbutazona (50,0 mg/kg) no edema depata induzido pela carragenina em ratos. Cada ponto representa amédia ±E.P.M. de 6 animais.

(a) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,Ol), fenilbutazona edexametasona (Tukey; p<O,OOl)

(b) significativamente diferente do controle e dexametasona (Tukey; p<O,01), efenilbutazona (Tukey; p<0,05)

(c) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OOl) e dexametasona(Tukey; p<O,Ol)

(d) significativamente diferente do controle (Tukey; p< 0,05) e dexametasona(Tukey; p<O,OOl)

------

50

As amostras CRD (2,02 mlJkg) (Figura 10) e CRR (2,02 mlJkg) (Figura

11) foram avaliadas pela via oral frente à amostra CR (2,02 mlJkg) no edema de

pata induzido pela carragenina em ratos.

l:l-+-contr

~----cr

C'j~ -+-crd

"'O0e ffi=~--z.00>--oC'j 4)"'O~oc.

+->s=0

:jsã ~l

1 3 5 7 9 24

telll'o(hs)

Fig. 10 Efeito da administração pela via oral no edema de pata induzidopela carragenina em ratos com as amostras CR e CRD, na dosede 2,02 mlJkg. Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 6ammalS.

(a) CR significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,Ol) e CRDsignificativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OS)

IL-'-.4 $.- 2,0 p '. -~, .."- .~ )

_Mil d pq ~~; iMW"5 U .--~

Fig. 11 Efeito da administração pela via oral no edema de pata induzidopela carragenina em ratos com as amostras CR e CRR, na dosede 2,02 m1JKg. Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 6animais.

51

~l -+-contre;:s

00-1"O T ~crQ)

e ít}-i v-- ~" """-crr=',,-..-,

(í)o~>~oc\s 50"01a

40o~~= ?{)Q)

e~ª 10o

1 3 5 7 9 24

tempo(hs)

(a) CR significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OS) e CRRsignificativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OI)

(b) significativamente diferente do controle (tukey; p<O,OS)

52

4.2.2. Edema de pata induzido pela nistatina

o edema de pata induzido pela nistatina evoluiu progressivamente até a

10ª hora com aumento de volume das patas de 60,0% (Tabela 9).

Tab. 9 Determinação do pico de edema máximo de pata induzido pela nistatinaem ratos. ..


Animais 4ª hora 6ª hora 8ª hora 10ª hora 12ª hora 24ª hora 48ª hora

1 22,73 55,00 48,01 68,42 57,00 53,81 47,37

2 20,83 42,80 60,00 65,00 65,00 65,00 35,14

3 20,83 43,48 38,10 60,08 50,00 45,00 30,00

4 17,39 36,36 42,86 50,00 50,00 45,00 25,00I~.

5 25,00 45,83 59,09 59,09 70,00 66,67 40,00

6 18,18 33,33 40,00 57,90 50,00 47,37 33,33

Média 20,83 42,80 48,01 60,08 57,00 53,81 35,14Erro Padrão 1,15 3,11 3,90 2,59 3,56 4,03 3,19

o efeito da administração pela via oral da amostra CAM na dose 2,47

mlIkg foi avaliado na 6ª , 8ª, 10ª, 12ª, 24ª e 48ª hora após a administração da

nistatina (Figura 12). O óleo-resina e a droga padrão indometacina (5,0 mg/kg)

foram administrados na 6ª hora e a leitura foi realizada no tempo de edema

máximo (l0ª hora) (Tabela 10).

,_=.... &81 tt«;n =:

53

1'ab. 10 Efeito, na IOª hora, da administração pela via oral da amostra CAM e daindometacina no edema de pata induzido pela l}Ístatinª el!l ratos.


Animais Controle/óleo de CAM indometacinamilho 4,0 mlIkg 2,47 mlIkg 5,O,mg!kg

1 68,42 50,00 47,37

2 65,00 45,00 36,36

3 60,08 42,86 40,96

4 50,00 47,37 42,11

5 59,09 40,00 36,84

6 57,90 45,00 42,11

Média 60,08 45,04 * 40,96Erro Padrão , . 2,59 1,42 1,65* significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OO I)

54

(a) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OOI)(b) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OS)(c) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,Ol)

Fig. 12. Efeito da administração pela via oral no edema de pata induzidopela nistatina em ratos com a amostra CAM (2,47 ml/kg) e daindometacina (S,O mglkg). Cada ponto representa a média ±E.P.M. de 6 animais

íO -+-contr

(j)~ ----cam

~k--r .... ---.-indo

'"O(1) i)S::::s,- LX)o~>--o~ ?Q'"01a00.~

3)~(1)

S

ª lOl ,,1:

O

4 6 8 10 12 24 48

tetqJo(hs)11

I~

CAM. A dose utilizada para as amostras foi de 2,47 ml/kg (Figura 13).

55

48241210

tempo(hs)

864

--+-contr

80 l ----cam

70 I-+-camd

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"'OQ) 50E

..2-.. 40O;::R;;> o'"-'"o c:lj 30"'01a

~o. 20Q)

E:::t 10c:lj

O

o efeito da amostra CAMD, administrada pela via oral, foi avaliado sobre

o edema de pata induzido pela nistatina em ratos e comparado com a amostra

Fig. 13. Efeito da administração pela via oral no edema de pata induzido pelanistatina em ratos com as amostras CAM e CAMD, na dose de 2,47tnlJkg. Cada ponto representa a média ±E.P.M. de 6 animais

(a) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OI)(b) CAM significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OS) e CAMD

significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,Ol)(c ) CAM significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OI) e CAMD

significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OS)

fi • t . ti'1ítfi"tflt'*:11iP..,'t1::;;

56

o efeito das amostras CR e CRD, na dose de 2,02 ml/kg, foi avaliado

comparativamente com a indometacina (5,0 mg/kg) sobre o edema de pata

induzido pela nistatina em ratos. Os resultados obtidos encontram-se na Tabela

11 e Figuras 14 e 15.

"

Tab. 11 Efeito, na 10ª hora da administração pela via oral da amostra CR e da,'Ij~1

indometacina no edema de pata induzido pela nistatina em ratos.Aumento do volume da pata (%)

Animais Controle/óleo de CR indometacinamilho 4,0 ml/kg 2,02 mlIkg 5,0 mglkg

1 47,63 54,55 52,17 \1

2 63,64 50,00 30,44 11

3 63,64 46,00 43,51 lil

4 63,64 40,00 47,83

5 54,17 45,46 45,46

6 58,33 40,00 41,67

Média 58,54 46,00 * 43,51Erro Padrão 2,66 2,32 3,01* significativamente diferente do controle (Tukey; p<0,05)

57

(a) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OI)(b) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OS)(c) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OOl)

Fig. 14 Efeito da administração pela via oral no edema de pata induzidopela nistatina em ratos com a amostra CR (2,02 m1Ikg) eindometacina (5,0 mglkg). Cada ponto representa a média ±E.P.M. de 6 animais

-+-contr70l -cr

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O

4 6 8 10 12 24 48

tempo(hs)

58

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-~0 0 30>'-'o~

"'O "!ao~ ~~Q)

S 10

ª OI I I I I I I I

4 6 8 10 12 24 48

tempo(hs) 4:1

Fig. 15 Efeito da administração pela via oral no edema de pata induzidopela nistatina em ratos com a amostra CRD (2,02 mJJkg) eindometacina (5,0 mglkg). Cada ponto representa a média ±E.P.M. de 6 animais

(a) CRD significativamente diferente do controle (Tukey; p<0,05)(b) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,00 I)

I ""

faculdad" L .> r , ...,~vlll!(;~!I

Universidade de São Paul

4.2.3. Edema de pata induzido pelo miconazol

o edema de pata induzido pelo miconazol evoluiu progressivamente até a

11ª hora com aumento de volume das patas de 46 % e decaimento, a partir desse

ponto, até o 11º dia após a administração do agente flogístico (Tabela 12).

Tab. 12 Determinação do pico de edema máximo de pata de rato induzido pelomiconazo1. ,


Animais 5ªhora 7ªhora 9ªhora 11ªhora 24ªhora 48ªhora 72ªhora 96ªhora 120ªhora. ,

1 4,35 18,18 18,18 30,00 30,00 20,00 10,00 10,00 10,53

2 4,55 20,00 30,00 50,00 50,00 20,00 15,79 15,00 16,67

3 12,50 27,27 25,64 55,00 33,33 19,05 20,00 14,29 20,00

4 9,09 20,00 25,00 46,00 20,00 21,25 10,53 11,11 11,11

5 9,09 14,29 25,00 50,00 33,03 22,22 13,08 11,11 11,77

6 9,09 20,00 30,00 45,00 31,82 25,00 9,09 15,00 16,67

Média 8,08 19,96 25,64 46,00 33,03 21,25 13,08 12,75 14,46Erro

Padrão 3,17 1,72 1,78 3,51 3,95 0,87 1,71 0,92 1,58

o efeito da administração pela via oral das amostras CAM na dose 2,47

m1Ikg e CR na dose de 2,02 m1Ikg foi avaliado na 5ª, 7ª, 9ª, 11ª, 24ª hora, 2º dia

e, assim, subsequentemente até o 11Q dia após a administração do agente

edematogênico. O óleo-resina e a droga padrão nimezulida (2,5 mg/kg) foram

administrados uma hora após a injeção intraplantar do agente flogístico e a

leitura do pico de edema máximo foi realizada na 11ª hora.

A Figura 16 mostra que a amostra CAM apresentou aumento do volume

da pata de 33%, resultado próximo ao observado com a droga padrão utilizada

(32%), sendo que para o controle o valor foi de 46%. Para a amostra CR o

59

:I!

f''I

'I

61

(Oi-'-contr

3)~--'-cr

Q)I T ~nirrez

S,.2,- 4)o~>~

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O ~I

5 7 9 TI ~ 43 72 9) ]J):W~

tempo(hs)

Fig. 17 Efeito da administração pela via oral da amostra CR (2,02 ml/kg) e dadroga padrão nimezulida (2,5 mglkg) no edema de pata induzidopelo miconazol em ratos. Cada ponto representa a média ±E.P.M. de 6 animais

(a) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OOl)(b) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,Ol)

4.2.4. Formação de tecido granulomatoso

A administração pela via oral das amostras CAM (2,47 m1Ikg) e CRD na

dose de 2,02 m1Ikg inibiram de fonna significativa a fonnação de tecido

granulómatoso como mostram as Figuras 18 e 19. Foram realizados três

experimentos com a amostra CR e ao longo do tratamento ocorreram óbitos no

2º, 3º, ou 4º dia. No último dia do experimento o grupo, inicialmente com seis

animais, ficava reduzido a\.2 ou 3 animais o que inviabilizava estatisticamente

o ens8.1o.

62

(a) significativamente diferente do controle (Tukey; p<0,05) e significativamentediferente da dexà.Illetasona (Tukey; p<O,OOI)

63

dexa

a

cal1l

350

300,-....OQ

8 250--ou(1)ti)

200~

8o-ª

15050o

100~

~(1)Q.,

50

O

contr

Fig.18 Efeito da administração pela via oral da amostra CAM (2,47 m1Jkg)e da dexametasona (0,2 rnglkg) na inibição da formação de tecidogranulornatoso induzida por cilindro de algodão em ratos. Cadabarra representa á média ± E.P.M. de 6 animais.

350..-...eJ)

3008~

ou 250(l)cn.~

8 200o--';:s§ 150MeJ)

o~ 100ocn.(l)

~ 50

O

crntr crd dexa

Fig.19 Efeito da administração pela via oral da amostra CRD (2,02 ml/kg) eda dexametasona (0,2 mglkg) na inibição da formação de tecidogranulomatoso induzida por cilindro de algodão em ratos. Cadabarra representa a média ± E.P.M. de 6 animais.

(a) significativamente diferente do controle e da dexametasona (Tukey; p<O,OOl)

64

4.2.5. Dermatite induzida pelo óleo de cróton

Após indução de dermatite pelo óleo de cróton e aplicação tópica das

amostras CR e CRD na dose de 0,747 J..lllorelha e do naproxeno (1,0 mg/orelha)

foram obtidos os resultados expressos nas Tabelas 13 e 14 e Figuras 20 e 21.

Tab. 13 Efeito inibitório da amostra CR e da droga padrão na dermatiteinduzida pelo óleo de cróton.

Aumento do peso da orelha (%)Aniinais controle CR naproxeno

(aceto~a/água) (0,747 ttllorelha) (1?0 mglorelha)1 84,17 12,50 14,292 66,67 40,00 11,913 87,50 50,00 14,294 83,33 28,57 0,005 100,00 32,88 16,676 83,33 33,33 14,29

Média 84,17 32,88 * 11,91Erro Padrão 4,36 5,09 2,46

* significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OOI) e naproxeno(Tukey; p<O.OI).

Tab. 14 Efeito inibitório da amostra CRD e da droga padrão na dermatiteinduzida pelo óleo. de cróton.

Aumento do peso da orelha (%)Animais controle CRl> naproxeno

(eniul~ão) (0,747 gllorelha) (1,0 mg/orelha)1 44,60 37,72 55,702 49,30 58,00 40,303 69,22 32,80 23,204 121,00 15,70 34,405 34,50 29,30 34,906 96,70 40,60 19,30

Média 69,22 35,69 * 34,63ErroPadrãó 13,72 5,70 5,30

* significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,05)

65

il,:!I~,

IFIli~

f.ll

66

100

90~

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ro...c::- 70(l)Moro 60'"'OoCI:l

50(l)o..o

'"'O 40o"S 30(l)

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20

1~~ • IIL, ti

I I il'

contr Cf naprox ':1··

Fig.20 Efeito inibitório da amostra CR (0,747 J.lVorelha) e donaproxeno (1,0 mg/orelha) na dermatite induzida pelo óleo decróton. Cada barra representa a média ± E.P.M. de 6 animais.

(a) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OOI) esignificativamente diferente do naproxeno (Tukey; p<O,OI)


67

Fig.21 Efeito inibitório da amostra eRD (0,747 J,J1Jorelha) e donaproxeno (1,0 mg/orelha) na dermatite induzida pelo óleo decróton. Cada barra representá a média ± E.P.M. de 6 animais.

100

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L.- ._,--_._..-.--_.~---_ ....._... _._-_.."~' ..."

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68

4.2.6. Toxicidade

4.2.6~1. Estudos de toxicidade aguda

A administração oral da amostra CAM na dose de 9,49 ml/kg não

ocasionou nenhum óbito mas alguns animais apresentaram sinais de diminuição

da motilidade espontânea. Quando a dose foi aumentada para 13,28 ml/kg dois

animais foram a óbito e ,ps demais apresentaram sinais semelhantes aos

observados com a dose anterior. Duas outras doses foram administradas: 9,88 e

12,35 ml/kg e todos os animais sobreviveram indicando que a DLso para a

amostra CAM é superioF a 12,35 ml/kg.

Para a amostra CAMD administrou-se a dose de 20,0 ml/kg não

ocasionando óbitos ou alterações comportamentais indicando que a DLso é

superior a 20,0 ml/kg.

A amostra CAMR foi ensaiada na dose de 2,85 ml/kg, dose na qual não

ocorreram óbitos nem alterações comportamentais, indicando que a sua DLso é

maior que 2,85 ml/kg.

Dose (ml/kg) Nº Mortos/Total animais OLso

ml!kg.

ml!kg.

69

4,48 ml/kg

(4,22 a 4,76 ml/kg)

0/5

0/5

4/5

5/5

3,48

4,04

4,69

5,44

Os ensaios de toxicidade para a amostra CR apresentaram os resultados

Com a amostra CRR ensaiaram-se três doses: 1,09, 1,29 e 1,52 ml!kg.

A amostra CRD, ensaiada nas doses 3,05 e 9,14 ml!kg, não apresentou

descritos na Tabela 15 e calculou-se sua Dbso a partir desses dados observados.

óbito ou alterações comportamentais indicando que sua OLso é superior a 9,14

Tab. 15 Detenninação da DLso, pela via oral, da amostra CR em ratosj!0r 72 horas.

Nesta última dose dois animais morreram indicando que a DLso é superior a 1,29

70

4.2.6.2. Estudos de toxicidade subcrônica

4.2.6.2.1. Toxicidade subcrônica da amostra CAM

A variação do peso relativo (peso do órgão/peso corporal) do figado, rins e

baço nos animais tratados, diariamente, durante 3Odias com a amostra CAM nas

doses de 2,47 e 4,84 mlJkg encontra-se representado pelas Figuras 22, 23 e 24.

Não houve alterações no coração e pulmões.

..

0,08 -, h

0,07

o 0,06;>.-~ 0,05-Q)1-0

o 0,0400Q)Q., ~

0,03

0,02

0,01

° contr cam-2,47 cam4,84

Fig. 22 Peso relativo do figado de rato após 30 dias de tratamento pela viaoral da amostra CAM nas doses de 2,47 e 4,84 mlJkg. Cada barrarepresenta a média ± E.P.M. de 6 animais.

(a) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OOl)(b) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,001) e

significativamente diferente de CAM- 2,47 (Tukey; p<O,OS)

o,oo:J1 a

0,0085O>.- 0,008. ...-~-Q)~

~ O,fIJ15Q)

~

QtIJ1,

0,~5

contr cam-2,47 cam-4,84

Fig. 23 Peso relativo dos rins de rato após 30 dias de tratamento pela viaoral da amostra CAM nas doses de 2,47 e 4,84 m1Jkg. Cada barrarepresel'lta a média ± E.P.M. de 6 animais.


71

(a) significativamente diferente do controle (Tukey; p<O,OOI) esignificativamente diferente de CAM-2,47 (Tukey; p<O,OS)

Fig. 24 Peso relativo do baço de rato após 30 dias de tratamento pela viaoral da amostra CAM nas doses de 2,47 e 4,84 m1Ikg. Cada barrarepresenta a média ± E.P.M. de 6 animais.

72

cam-~47 cam-4,84

0,001

contr

0+-1 -

0,0015

0,003

0,0025

0,002

o,(ffi)

o>• ...-i

~~

(1)~

o'(J'J(1)

o.

73

250 l

--+-contr

---cam-2,47r-....

200 100-+-cam-4,84

'-'"-~M 150O

~u 100~~

~ 50

O

Os gráficos das Figuras 25, 26 e 27 mostram o aumento do peso corporal,O consumo de ração e água, respectivamente, no ensaio feito por um período detrinta dias administrando-se doses diárias,. pela via oral, de 2,47 m1Jkg e 4,84m1Jkg da amostra CAM.

o 3 6 9 12 15 18 21 24 TI 30

dias

Fig. 25 Evolução do peso corporal de ratos, após trinta dias de tratamento pelavia oral da amostra CAM nas doses diárias de 2,47 e 4,84 m1Jkg. Cadaponto representa a média de 6 animais.

'ti.

74

--+-con tr-cam-~47

-cam-4,84

o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30dias

O 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Fig. 26 Consumo de ração durante 30 dias de tratamento pela via oralda amostra CAM nas doses diárias de 2,47 e 4,84 ml/kg. Cadaponto representa a média de 6 animais.

dias

Fig. 27 Consumo de água durante 30 dias de tratamento pela via oral daamostra CAM nas doses diárias de 2,47 e 4,84 ml/kg. Cadaponto representa a média de 6 animais.

.......... contr300 -, ---c a m - 2,47

-'-cam-4,84

--.. 250OI}'-'O 200~C\So-C\S~

150

100

550r--.. 5008 450'-'

C\S 400,~ 350

300250 I i i i i I I i i I I

4.2.6.2.2. Toxicidade subcrônica da amostra CR

A variação do peso relativo (peso do órgão/peso corporal) do flgado, rins e

baço nos animais tratados, diariamente, durante 30 dias com a amostra CR na

dose de 2,02 ml!kg encontra-se representado pelas Figuras 28, 29 e 30. Não

houve alterações no coração e pulmões.

0,07 I a

o,~

0,05O;> 0,(».-~-Q) 0,03~

O~ 0,02Q)

~

0,01

O

contr cr-2,02

Fig. 28 Peso relativo do flgado de rato após 30 dias de tratamentopela via oral da amostra CR na dose de 2,02 m1/kg. Cadabarra representa a média ± E.P.M. de 5 animais para ocontrole e 4 para a amostra CR.

(a) diferença para o controle extremamente significativa (teste" t "; p<O,OOOl)

75

O,W.., ,a

O,aRS

O O,aE.>.-~-~ 0,0075OCf)Q.)o..

0,007

o,anscontr cr-~02

Fig. 29 Peso relativo dos rins de rato após 30 dias de tratamentopela via oral da amostra CR na dose de 2,02 ml/kg. Cadabarra representa a média ± E.P.M. de 5 animais para ocontrole e 4 para a amostra CR.

(a) diferença para o controle extremamente significativa (teste" t "; p<O,OOOl)

76

0,003

0,0025

o0,002>"-~-(1)

0,0015$..ol

oCI)(1)

~ 0,001

o,ro>.s

O

contr cr-2, 02

Fig. 30 Peso relativo do baço de rato após 30 dias de tratamentopela via oral da amostra CR na dose de 2,02 mlJkg. Cadabarra representa a média ± E.P.M. de 5 animais para ocontrole e 4 para a amostra CR..

(a) significativamente diferente do controle (teste "t"; p = 0,0494)

77

78

-contr~ 300 ~ -cr-2,ü2OI)

~;'-" 250ta.... 200ofr 150oCo)

o 100cn50 I

11<L>o..O

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31

dias

o consumo de ração e água, respectivamente, no ensaio feito por trinta dias com a

Fig. 31 Evolução do peso corporal de ratos, após 30 dias de tratamento pela viaoral da amostra CR na dose diária de 2,02 ml/kg. Cada ponto representaa média de 5 animais para o controle e 4 para a amostra CR.

Os gráficos das Figuras 31, 32 e 33 mostram o aumento do peso corporal,

amostra CR administrando-se dose diária de 2,02 ml/kg.

(a) significativamente diferente do controle (teste "t"; p=0,0317)(b) significativamente diferente do controle (teste "t"; p=0,0133)(c) diferença para o controle muito significativa (teste "t"; p = 0,0084)(d) diferença para o controle muito significativa (teste "t"; p = 0,0053)(e) diferença para o controle muito significativa (teste "t"; p = 0,0074)

-'-contr

79

~~

----c r - 2, 02

~

o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

dias

dias

o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

250-contr

200 l -'Õij

cr-2,02

"'-"

~~150

~ 100M

50O

500C 4005 300~ 200,~ 100

O I I .I I I I I I I I i I i I

Fig. 33 Consumó de água durante 30 dias de tratamento pela via oral da amostraCR na dose diária de 2,02 tn1Jkg. Cada ponto representa a média de 5animais para o controle e 4 para a amostra CR.

Fig. 32 Consumo de ração durante 30 dias de tratamento pela via oral da amostraCR na dose diária de 2,02 mI/kg. Cada ponto representa a média de 5animais para o controle e 4 para a amostra CR.

Decorridos trinta dias, os animais foram sacrificados e verificados os

parâmetros hematológicos e bioquímicos (Tabelas 16, 17, 18 e 19).

Amostra Eritr. Hb Ht VCM (Jl) HCM (f.1f.1g) CHCM (%)

(106/mm3) (g%) (%)

80

PT

6,8 ± 0,1d6,40 ± 0,03

URÉIA

mgldl

46,4 ± 1,8

62,5 ± 4,lc

ALT = alanina transferasePT = proteínas totais

VCM = volume corpuscular médioHCM = hemoglobina corpuscular médiaCHCM = concentração de hemoglobina corpuscular média

CR

Controle 46,8 ± 2,8 45,8 ± 5,4 34,8 ± 4,1 1,1 ± 0,1

52,8 ± 4,8 593 ± 1 2a 51,5 ± 9,2 1 7 ± °2b

" "

Amostra AST ALT ALP CREAT

U/L U/L U/L mgldl

(a) não muito significativamente diferente do controle (teste "t"; p=0,0673)(b) muito significativamente diferente do controle (teste "t"; p=0,0046)(c) muito significativamente diferente do controle (teste "t"; p=0,0055)(d) muito significativamente diferente do controle (teste "f'; p=0,0066)

(a) significativamente diferente do controle (teste "t"; p=0,0182)(b) significativamente diferente do controle (teste "t"; p=0,044)(c) significativamente diferente do controle (teste "t"; p=0,0403)(d) significativamente diferente do controle (teste "t"; p=0,0241)

Legenda:Eritr. = eritrócitosHb = hemoglobinaHt = hematócrito

Controle 5,0 ± 0,2 15,7 ± 0,2 43,8 ± 0,2 87,6 ± 3,8 31,4 ± 1,4 35,6 ± 0,5

CR 5,4 ± 0,2 14 °± °6a 39,3 ± 2,lb 73,3 ± 4,2c 26,0 ± 1,ld 35,8 ± 0,5, ,

Tab. 16 Valores de hemograma do grupo controle e do tratado com a amostraCR na dose de 2,02 m1Jkg ao final de trinta dias de tratamento. Cada valorrepresenta a média ± E.P.M. de 4 (CR) e 5 (Controle) animais.

Tab. 17 Série bioquímica do grupo controle e do tratado com a amostra CR nadose de 2,02 m1Jkg ao final de trinta dias de tratamento. Cada valor representa amédia ± E.P.M. de 4 (CR) e 5 (Controle) animais.

Legenda:AST = aspartato transferaseALP = fosfatase alcalinaCREAT = creatinina

81

LEU

(/mm3)

7.000 ± 573

5.000 ± 1192

(%)

MON

3,8 ± 1,0

4,0 ± 1,8

LIN

(%) (%)

0,2 ± 0,2 78,8 ± 2,4

° 77,0 ± 1,73

ausente =

raro = rdiscreto = dmoderado= macentuado = a

(%)

0,8 ± 0,5

°BAS = basófJ10s LEU = leucócitos

LIN = linfócitosMON = mon6citos

(%)

15,8 ± 2,4

17,3 ± 0,5

(%)

0,6 ± 0,4

1,8 ± 1,2CR

Controle

Amostra BAST SEG EOS BAS

Tab. 19 Alterações eritrocitárias individuais do grupo controle e do tratado comtra CR na dose de 2.02 mlJkg ao final de trinta dias de tratament,

Tab. 18 Leucograma do grupo contróle e do tratado com a amostra CR na dosede 2,02 m1Jkg aó final de trinta dias de tratamento. Cada valor representa a média± E.P.M. de ~(CR) e 5 (Controle) animais.

Legenda:BAST = bastonetesSEG = segmentadosEOS = eosinófilos

, . ..Amostra MICRO MACRO HIPÓ POLI CREN ALVO

Controle -- -- -- -- -- --Controle -- -- -- m -- --Controle -- m -- n'I. m --

Controle -- -- -- a -- --Controle -- a m m -- --

CR -- a m m -- m

CR -- a d m a --Clt -- m -- m a r

CR m d d r a --Legenda:MICRO = tnicrocitoseMACRO = macrocitoseHIPO = hipocromiaPOLI = policromasiaCREN = crenadasALVO = hemáceas em alvo

i".~ ..} _"~"... ,.~_~... ,.'-' ,...1,::- = ~ ~~ ~,~;~" .,f'.......2:,,~~:....~;:'.;" J, ~!~ .... _ ~-,- .t+ ,,._ 41---- #I.&e,: iMi'lW!kªU . ••"4lI4neu qXZ.,A,PSW:;U s. ... ..w----

~ o

o efeito sobre o peso relativo do figado e rins da administração oral diária

e por trinta dias da amostra CRD na dose de 2,02 m1Ikg está representado pelas

Figuras 34 e 35, respectivamente.

o,(J7 I a

o,OS

O 0,(1);;>.-~

.~ 0,(»~

~ 0,00Q.

0,02

0,01

O

contr crd-2,02

Fig. 34 Peso relativo do figado de rato após 30 dias de tratamentopela via oral da amostra CRD na dose de 2,02 m1Ikg. Cadabarra representa a média ± E.P.M. de 5 animais.

(a) diferença para o controle extremamente significativa (teste" t "; p<O,OOOI)

82

It

IR%. )ii. li;, ; . .--,",.~--~

83

0,(0) I a

0,<m5O>.-d o,~-Q)~

O~ 0,0075~

Itil.

0,007I

jj!

<~I!

0,00í5 '

contr crd-402

Fig. 35 Peso relativo dos rins de rato após 30 dias de tratamento pela viaoral da amostra CRD na dose de 2,02 m1Ikg. Cada barra representaa média ± E.P.M. de 5 animais.

(a) diferença para o controle muito significativa (teste" t "; P = 0,0016)

I

administrando-se dose diária de 2,02 mlJkg da amostra CRD.

,

84

dias

12 15 18 21 24 27 3096

-contr

-crd-2,02

3o

dias

'Iculdaao uu lu., .~.,~I __."'0-Universidade di São Paulo

o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Fig. 36 Evolução do peso corporal de ratos, após 30 dias de tratamentopela via oral da amostra CRD na dose diária de 2,02 mlJkg.Cada ponto representa a média de 5 animais

Fig. 37 Consumo de ração durante 30 dias de tratamento pela via oral daamostra CRD na dose diária de 2,02 mlIkg. Cada pontorepresenta a média de 5 animais.

300

250

200

150

100

50o I I i i i I I i i i I I I I , I

Os gráficos das Figúras 36, 37 e 38 mostram o aumento do peso corporal,

-contr

300 l ---crd-2,02

,,-.... 25000'-"

ta 200~oE:-o 150ooti:!Q) 100c::l.

50

'bO'-"o

~t':Se

o consumo de ração e~ respectivamente, no ensaio feito por trinta dias

-contr

-crd-2,02

~:l

~',I'

Jtt

r,I

"

"l~l

'li.

.f

85

dias

o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Fig. 38 Consumo de águà durante 30 dias de tratamento pela via oral daamostra CRD na dose diária de 2,02 m1Ikg. Cada pontorepresenta a média de 5 animais

450

.-....400-E 350'-'

C':S 300.~ 250

200150 I I i { I j. I I I I I I I I I

-_._----------_._---------- ----------

parâmetros hematológicos e bioquímicos (Tabelas 20,21 e 22).

Decorridos trinta dias, os animais foram sacrificados e verificados os

"-,

86

ausente =raro = rdiscreto = dmoderado= macentuado = a

,

AMOSTRA MICRO MACRO HIPO POLI CREN ALVO

Controle -- -- m a -- --Controle -- -- m a -- --Controle -- -- m a -- --Controle -- -- m a -- --

\.

CRD -- -- d a -- --CRD -- -- m a -- --CRD -- -- d a -- r

CRD -- -- -- a -- --CRD -- -- -- a -- --

Tab. 20 Alterações eritrocitárias individuais do grupo controle e do tratado comCRD na dose de 2.02 mlJkg ao final de trinta dias d

Legenda:MICRO = microcitoseMACRO = macrocitoseRIPa = hipocromiaPOLI = policromasiaCREN = crenadasALVO = hemáceas em alvo

Amostra :8AST SEG EOS DAS LIN MON

Tâb. 22 Série bioquímica do grupo controle e do tratado com a amostra CRD nadose de 2,02 m1Jkg ao fmal de trinta dias de tratamento. Cada valor representa amédia ± E.F.M. de 5 animais.

Tab. 21 Leucograma do grupo controle e do grupo tratado com à amostra CRDao fmal de trinta dias de tratamento. Cada valor representa a média ± E.P.M. de 5(CR) ou 4 (Controle) animais.

'.'11

87

PTr'

UREIA

mg/dl

38,6 ± 2,3 6,5 ± 0,1

40,8 ± 1,4 6,4 ± 0,1

mg/dl

CREAT

0,8 ± 0,1

0,7 ± 0,04

ALP

UIL

154,4±5I,I

116,6 ± 35,6

ALT =alanina transferasePT = proteínas totais

35,6 ± 3,4

62,4 ± 2,2~

35,4 ± 6,0

47,8 ± 4,3

Controle

CRD

Amostra AST ALT

UIL UIL

(a) considerado extremamente significativo em relação aocontrole (teste "t"; p==O,0002)

(a) não muito significativamente diferente do controle (teste "t"; p=O,0662)

(%) (%) (%) (%) (%) (%)

Controle 2,8± 1,1 13,3 ± 1,7 0,3 ± 0,3 ° 79,0 ± 2,1 4,8 ± 0,7

CRD 6,0 ± I,Oa IO,2± 1,5 0,6 ± 0,4 ° 79,2 ± 2,4 4,0 ± 1,6

Legenda:BAST:::: bastonetes BAS= basófilosSEG= segmentados LIN= linfócitosEOS= eosinófilos MON = monócitos

Legenda:AST = aspartato transferaseALP = fosfatase alcalinaCltEAT == creatininà

39.

4.2.6.3. Estudos de citotoxicidade .

Os resUltados dos ensaios de citoxicidade com a amostra CR solubilizada

88

Inibição da divisão celular (%)\

CR+DMSO '"DOSE CR + AGITAÇAO(J,.L1 óleo/ ml água mar)

10,000 -------------- 100,00 ± 0,00

7,500 100,00 ± 0,00 * ----------------

5,000 80,57 ± 2,25 84,59 ± 5,69

2,500 62,36 ± 9,71 61,63 ± 0,68

1,250 49,36 ± 2,90 38,34 ± 8,85

0,625 --------------- 35,57 ± 1,46

com DMSO e sob vórtex estão descritos na Tabela 23 e representados na Figura

Tab. 23 Efeito da administração da amostra CR sobre o desenvolvimentode ovos de ouri~o do mar.

* cada valor (%) representa a média ± E.P.M. da inibição da divisão celularem relação ao controle (ausência de inibição) de três valores.

A amostra C:fU) foi avaliada no mesmo intervalo de dose não ocorrendo

Fig. 39 Efeito da administração da amostra CR, solubilizada em DMSO, e atravésde vórtex sobre o desenvolvimento de ovos de ouriço do mar. Dosesadministradas no intervalo entre 10 e 0,625 J,J1 óleo/ml de água mar.Cada barra representa a média ± E.P.M. de três valores.

89

0,6251,252,557,5

concentração(ul/ml)

10

inibição da divisão celular

120 I IiIdmso

o 100 .-j - - II!!I a g i ta ç ã ol('jrn.- ,,-....~ ~ 80-o '-"('j ~

-o '3 60~-u-. Q)._ o

~ 40l=:.-

20

O

5. DISCUSSÃO

o óleo-resina de copaíba é extraído do tronco de árvores do gênero

Copaifera através de perfuração até o cerne. O que se observa, no entanto, é a

derrubada da árvore com o auxílio de machado para a obtenção do óleo. Esse

método é bastante utilizado pelos seringueiros na entressafra da extração da

borracha. A planta é muito difundida por toda a região amazônica e a população a

utiliza para diversos fms: cicatrizante, antiinflamatória, antisséptica, expectorante

etc (BASILE et al., 1988).

O óleo de copaíba foi inicialmente estudado quanto à sua propriedade

antiinflamatória por BASILE et alo (1988) e sua composição química vem sendo

bastante pesquisada atualmente por pesquisadores brasileiros (PINTO et al., 1997;

VEIGA-JR et al., 1995).

Os terpenóides, classe de compostos encontrados no óleo-resina de copaíba,

distribuem-se amplamente na natureza e são encontrados em abundância nas

plantas superiores. O número de diferentes terpenóides isolados de fontes naturais

é de aproximadamente vinte mil, muito superior ao de qualquer outro grupo de

produtos naturais. Os terpenóides vegetais têm papel proeminente nas discussões

sobre ecologia química, pois desempenham funções importantes como repelente

de insetos, feromônios, hormônios vegetais etc. As moléculas de terpenóides estão

envolvidas em quase todas as interações possíveis entre plantas e entre plantas e

animais (TERANlSHI et al., 1993).

90

Os terpenóides são deftnidos como produtos naturais cuja estrutura pode ser

dividida em unidades de isopreno e, por isso, esses compostos são chamados de

isoprenóides. As unidades de isopreno originam-se biossinteticamente do acetato

pela via do ácido mevalônico e' têm cadeias ramiftcadas, com cinco átomos de

carbono que contém uma dupla ligação (HARBORNE, 1988).

Segundo BASILE et alo (1988) o óleo-resina de copaíba apresenta em sua

composição compostos terpênicos. A análise qualitativa mostrou a presença de

ácido copálico e sesquiterp~nos como l3-bisaboleno, l3-carioftleno, l3-cubeleno,

aromadendreno, l3-elemeno, humuleno e a-copaeno. Os compostos presentes em

maior quantidade foram o l3-bisaboleno, l3-carioftleno e l3-cubeleno.

A destilação fracionada das amostras CAM e CR do óleo-resina de copaíba

foi realizado no Laboratório de Fitoquímica do Instituto de Biociências da USP.

Da destilação obteve-se a fração destilado cuja composição química é constituída

por sesquiterpenos, moléculas com quinze átomos de carbono e a fração resina

composta por diterpenos, substâncias com vinte átomos de carbono. O maior

rendimento de destilado da amostra CR (64%) em comparação à amostra CAM

(54%) acarreta na maior fluidez de CR facilitando sua solubilização nas

experimentações farmacológicas.

Comparando-se a fração sesquiterpênica das duas amostras observa-se que

apenas quatro substâncias, de um total de vinte e três compostos identiftcados

nestas frações, são comuns a ambas: l3-carioftleno, a-bergamoteno, a-humuleno e

l3-bisaboleno. Os ácidos diterpênicos presentes nas duas amostras totalizam vinte e

cinco compostos, sendo que vinte e um foram aqui identiftcados. Desse total

91

apenas duas substâncias são comuns às duas amostras: copalato de metila e

pinifolato de dimetila ('tabelas I e 2 e Figura 42 em apêndice).

Constata-se que as duas amostras apresentam grandes diferenças em relação

à sua composição química confmnando dados de literatura que evidenciam a

riqueza de compostos presentes em amostras de óleo-resina de copaíba de várias

espécies (CASCON et al., 1996~ FERRARI et aI., 1971~ GRAMOSA et al., 1996~

LANGENHEIM et al., 1986; PINTO et al., 1997; VEIGA-IR et al., 1995).

A análise de uma amostra de C. reticulata coletada em Belém, estado do

Pará (CRP), revela a presença de 18 compostos sesquiterpênicos e 4 diterpênicos

(Tabelas 24 e 25 em apêndice) que não são encontrados na composição da

amostra aqui estudada (CR). Analisando amostras de C. multijuga, coletadas em

dezembro (CM-I) e agosto (CM-2) da mesma árvore na reserva Ducke, Manaus,

estado do Amazonas, evidenciaram-se diferenças quanto à composição química.

Observa-se a presença 19 compostos comuns às duas amostras de um total de 27

identificados em ambas (Tabela 25 em apêndice). Outra amostra de C. ml!ltijuga

(CM-3) coletada em Manaus mas em região diversa das duas amostras acima

verifica-se que 10 substâncias estão presentes em CM-3 e que não ocorrem tanto

em CM-I quanto em CM-2. Esses dados demonstram que há uma variação na

composição química de amostras de espécies de Copaifera tanto intra-específica

como inter-específica. Os dados fitoquímicos das amostras CRP, CM-I, CM-2 e

CM-3 foram fornecidos pelo Instituto de Química da UFRJ.

Sob o aspecto quantitativo a amostra CAM apresenta grandes quantidades

de p-cariofileno (36,04%) na fração sesquiterpênica e quantidades consideráveis

92

de copalato de metila (8,85%), agatato de metila (8,83%) e l1-acetoxi-copalato de

metila (16,64%). Enquanto que a amostra CR contém como principais compostos,

na fração sesquiterpênica, o a-aromadendreno (10,96%) e o l3-bisaboleno

(22,39%). Na fração resinóide destacam-se o caurenoato de metila (7,11%),

cauranoato de metila (6,99%) e danielato de metila (7,12%) (Tabelas 1 e 2).

A amostra CRP apresenta o sesquiterpeno l3-cariofileno como sendo o

majoritário, contribuindo com 40,22% do total do óleo-resina, enquanto que'em

CR representa somente 3,40% do total. O composto l3-bisaboleno que representa

22,39% da amostra CR está presente na amostra CRP em apenas 0,75% do total.

Evidenciando-se diferenças quantitativas entre amostras da mesma espécie.

Os ensaios farmacológicos foram realizados com ratos provenientes dos

biotérios do ICBUSP e da FMVZUSP por uma questão de programação e

disponibilidade desses animais pelos referidos biotérios. Ao longo do período

experimental observou-se que os animais provenientes do ICBUSP apresentavam

pico de edema máximo aos 300 minutos após a administração do agente flogístico

e os animais oriundos da FMVZUSP pico aos 420 minutos após a injeção da

substância edematogênica (Tabelas 3 e 4).

Essa diferença de resposta inflamatória com a mesma raça de animais pode

estar relacionada às condições de manejo peculiares a cada biotério. Os biotérios

das duas institutições seguem normas padrões de criação mas podem ocorrer

variações como alimentação - uso de ração de marcas diferentes - ou maior ou

menor carga bacteriana já que se constatou a presença de bactérias do gênero

Mycoplasma de forma endêmica nos biotérios da USP. No entanto, para uma

93

conclusão mais precisa dever-se-ia aprofundar em estudos hematológicos,

histológicos e bioquímicos com os animais· dos dois biotérios (ROSENKRANZ et

aI., 1987; LAUDO TÉCNICO-BIOTÉRIO CENTRAL-ICBUSP, 1998).

É conhecido que a inflamação é uma resposta do tecido à qualquer tipo de

injúria, seja induzida por agente mecânico, químico ou por microrganismos. Esta

resposta inflamatória envolve um complexo conjunto de ativações enzimáticas,

liberação de mediadores, extravasamento de fluídos corpóreos, migração celular,

colapso e reparo tissular (COTRAN et al., 1996).

Os efeitos antiinf1amatórios podem ser obtidos por uma grande variedade

de agentes químicos não existindo correlação evidente entre suas atividades

farmacológicas e estruturas químicas. Este fato, associado à complexidade do

processo inflamatório, demonstra que o uso de diferentes modelos experimentais

são essenciais nas triagens farmacológicas de substâncias potencialmente

antiinf1amatórias (BASILE et al.,' 1988).

A carragenina é um mucopolissacarídeo obtido de algas marjnhas da

espécie Chondros crispus e tem sido utilizada tradicionalmente em laboratório

para induzir edema agudo de pata em animais (WINTER et al., 1962). Muitos

mediadores estão envolvidos no edema induzido pela carragenina, incluindo

histamina, serotonina, cininas e as PGs (WILLIS, 1969 ). É necessário considerar

o papel desses mediadores no edema induzido pela carragenina, obtendo-se

informações quanto à natureza da irritação, sítio de resposta inflamatória e o

padrão dos mediadores fannacológicos liberados (DI ROSA & SORRENTINO,

1970).

94

---

Este .modelo de inflamação é identificado por três diferentes fases de

liberação de mediadores durante o desenvolvimento do edema.

A partir de experimentos usando antagonistas de histamina e serotonina ,

determinou-se uma fase inicial em que há liberação de histamina e serotonina no

período de °a 1,5 h, cujos mediadores são liberados ao mesmo tempo e em

concentração satisfatória para produzir efeitos sobre a permeabilidade vascular. A

segunda fase da resposta inflamatória (1,5 a 2,5 h) é mediada por cininas, com

papel transitório de aumelltar a permeabilidade vascular após a injeção de

carragenina (DI ROSA & SORRENTINO, 1970). A última fase da resposta

inflamatória (2,5 a 6,Oh) é mediada por uma substância que não é a histamina,

serotonina ou cininas mas demonstra-se que a prostaglandina está presente em

exsudatos induzidos por carragenina (WILLIS, 1969).

Os antiinflamatórios não esteroidais (AINES) agem pela inibição da

ciclooxigenase e demonstrou-se essa atividade através de ensaios correlacionando

essa inibição tanto in vitro quanto in vivo (VANE, 1971). Foi estabelecido que a

isoforma ciclooxigenase-1 elabora prostaglandinas envolvidas no processo de

citoproteção, enquanto a ciclooxigenase-2 é induzida no local da inflamação

(VANE, 1994). Os antiinflamatórios esteroidais impedem que os neutrófilos

participem da resposta inflamatória aguda e, desse modo, diminuem a quantidade

de enzimas, tais como a fosfolipase A2 para a síntese de prostaglandinas

(VINEGAR et al., 1982).

Foi estabelecida uma correlação dose-efeito (Figura 3) com a amostra

CAM, que era a disponível no momento, da qual determinou-se sua DEso que foi a

95

dose de trabalho no decurso das experimentações farmacológicas. O efeito da

administração oral da amostra CAM inibiu o desenvolvimento do edema de pata

induzido pela carragenina em ratos de maneira dose-dependente resultado

semelhante ao encontrado por BASILE et al., (1988) pesquisando outra amostra de

óleo-resina de copaíba.

A análise da Figura 4 revela que a amostra CAM, na dose de 2,47 ml/kg,

inibiu significativamente o desenvolvimento do edema com comportamento

semelhante à droga padrão fenilbutazona, um AINE consagrado na terapêutica, a

partir da 5ª hora após a administração da carragenina, contudo, dentro das doses

utilizadas á. dexametasona mostrou-se claramente mais eficaz. Esse resultado

evidencia que o óleo-resina reduz o edema induzido pela carragenina somente em

altas doses sugerindo uma baixa atividade dos componentes antiínflamatórios da

mistura e/ou as suas presenças em baixas concentrações. Esse dado pode

eventualmente representar unia limitação para seu uso prolongado pela

possibilidade de aparecimento de efeitos deletérios ao organismo.

As frações CAMD e CAMR (Figuras 5 e 6) inibem o edema induzido pela

carragenina de forma semelhante ao observado com a amostra CAM na dose de

2,47 tn1Jkg. A porcentagem de destilado presente na amostra CAM é de 54% e de

resina é de 46% o que leva a supor que a ação antiinflamat6ria de CAM é devido à

ação conjunta das duas frações. No entanto, as amostras CAMD e CAMR quando

administradas isoladamente inibem o edema de pata induzido pelo mesmo agente\

flogístico, demonstrando haver urtla equipotência com a amostra CAM na dose de

2,47 m1Ikg. Esse resultado indica que esta atividade decorra tanto de

96

sesquiterpenos, presentes na amostra CAMD, quanto dos' diterpenos, presentes na

amostra CAMR.

Na Figura 7 e Tabela 7 amostras de outras espécies de copaíba

apresentaram resultados semelhantes entre si quando testadas na dose de 2,47

m1Ikg tendo como referência a amostra CAM. Dentre as amostras estudadas

destaca-se a amostra CR pois esta mostrou-se mais eficaz que a amostra CAM e

foi a que apresentou menor desvio padrão denotando maior sensibilidade na ação

antiinf1amatória. Além disso,\é a que apresentou menor viscosidade facilitando sua

solubilização nos solventes utilizados nos ensaios fannacológicos, sendo ainda a

amostra que se obteve em maior quantidade.

A seguir, comparou-se a atividade antiinf1amatória entre as amostras CAM

e CR com a finalidade de se estabelecer uma equipotência das doses (Figura 8).

Pelo resultado apresentado a dose de 2,02 m1Ikg utilizada para CR é equipotente a

2,47 m1Ikg utilizada para a amostra CAM.

No ensaio com as drogas padrões a amostra CR inibiu significativamente o

edema induzido pela carragenina (Tabela 8 e Figura 9), no entanto mostrou-se

menos potente que a dexametasona e fenilbutazona na 3ª e 5ª horas. A partir da 7ª

hora teve comportamento semelhante à fenilbutazona, contudo a dexametasona

mostrou-se claramente mais eficaz. Apesar da amostra CR ter uma potência maior

que a amostra CAM podemos reafmnar as mesmas observações feitas em relação

à amostra CAM no que se refere à dose uti.lizada ser relativamente elevada,

podendo limitar seu uso em terapias prolongadas.

97

FERNANDES et al. (1992) encontraram valores de inibição do edema de

pata induzido pela carragenina de até 65% em relação ao controle quando foi

administrado, p.O., o óleo-resina de C. cearensis na dose de 500 mg/kg

(aproximadamente 0~5 ml/kg). Neste trabalho não é descrita a composição química

do óleo-resina mas tomando-se por base a composição de C. cearensis (Tabelas

24 e 25 em anexo) cedida pelo IQUFRJ observa-se uma grande variação dos

compostos identificados quando comparados com as amostras CAM e CR. Em

outro artigo, BASILE et al. (1988) determinaram a dose eficaz 50% igual a 1,79

mlJkg. Esta dose provoca uma inibição do edema de pata induzido pelo mesmo

agente flogístico de aproximadamente 40% em relação ao controle. Neste trabalho

alguns compostos foram identificados que não estão presentes nas amostras

estudadas. A diferença na atividade antiinflamatória poderia ser explicada pela

variação na composição química dos diferentes óleos pesquisados.

O edema de pata induzido pela nistatina é um modelo utilizado na triagem

fannacológica de drogas AINEs e esteróides caracterizando-se p0t: reação

inflamatória de média duração atingindo efeito máximo seis a oito horas após a

injeção da nistina (SeRIATTI et al., 1970; ARRIGONI-MARTELI et aI., 1971;

BASILE et àl., 1984).

A nistatina é um antibiótico poliênico que altera a membrana do lisossoma

determinando a liberação do conteúdo intracelular de natureza predominantemente

enzimática. A teação destas substâncias com substratos citoplasmáticos e

extracelulares constitui fator importante na reação inflamatória do tecido. Rá um

interesse crescente no estudo desse modelo, pois especula-se, na patogenia da

98

artrite reumatóide, sobre a importância da fragilidade da membrana lisossômica,

que rompe-se com facilidade liberando seu conteúdo no espaço extracelu1ar

(SCHIATTI et al., 1970).

Tanto a amostra CAM quanto a CR inibiram significativamente o edema

induzido pela nistatina (Figuras 12 e 14) com atividade semelhante à droga

padrão indometacina, agente AINE clássico, utilizada em modelo de inflamação

subcrônico. As frações CAMD (Figura 13) e CRD (Figura 15) apresentaram

inibição com comportamel\to semelhante à amostra CAM e a droga padrão

indometacina, respectivamente. Cabe salientar que, os dados obtidos neste modelo

indicam que o óleo-resina e suas frações, provenientes de diferentes amostras,

foram capazes de inibir o processo inflamatório subcrônico já desencadeado,

aspecto relevante na terapêutica de diversas patologias clinicas. Outro aspecto a

ser destacado é a atividade prolongada da amostra indicando que provavelmente

não está sendo devidamente metabolizada e/ou é eliminada mais lentamente pelo

orgamsmo.

O miconazol é um derivado imidazólico utilizado como agente antimicótico

de largo espectro de ação. Apesar do uso da nistatina (um composto poliênico),

como agente flogístico padrão (SCHIATTI et al., 1970), o econazol vem sendo

estudado desde os anos 80 na indução de inflamação aguda na cavidade pleural,

bem como seu mecanismo de ação(OGA et al., 1983; HANADA et aI., 1985;

HANADA & OGA, 1991). O miconazol, um análogo estrutural do econazol, foi

utilizado como agente flogístico em pata de rato e pesquisaram-se as alterações no

99

100

local da inflamação e os mecanismos implicados neste evento (HANADA et al.,

1994).

No edema induzido pelo miconazol, considerado um modelo de inflamação

crônico também houve inibição do edema de pata para as amostras CAM e CR

(Figuras 16 e 17). Ao longo de todo o experimento as amostras tiveram

comportamento semelhante, no pico de edema máximo (11ª hora), à droga padrão

nimesulide e ambas inibiram significativamente em comparação ao grupo

controle. A nimesulide parece ser um fraco inibidor de prostaglandinas, no

entanto, inibe a função leucocitária, principalmente de leucócitos

polimorfonucleares no que se refere à liberação de seus mediadores (GILMAN et

al., 1987). Como as amostras apresentaratn inibição do edema de forma

semelhante ao observado com a nimesulide, seriatn, então, eventualmente, seus

mecanismos de ação coincidentes aos descritos em relação à droga padrão?

As amostras CAM e eRD inibiram de forma significativa a formação de

tecido granulomatoso em ratos (Figuras 18 e 19), porém com atividade

antiinflamatória inferior à da dexametasona. Este modelo permite avaliar o

estímulo do componente proliferativo do processo inflatnatório (SWINGLE &

SHIDEMAN, 1972). Os eventos envolvidos na formação do granuloma no local

de implante dos cilindros de álgodão compreendem inicialmente o acúmulo de

fluido e material protéico com infiltração de neutrófilos. O granuloma no sétimo

dia de evolução é caracterizado pela formação de cápsula fibrosa vascularizada,

que contém nbroblastos e células mononucleares infiltrantes (BAILEY et al.,

-

1982). :Provavelmente, ocorra inibição da migração leucocitária, especialmente os

mononuc1eares.

O método de indução por granuloma caracteriza-se por um processo

inflamatório no qual o animal é submetido ao estresse da operação e de um longo

período sob anestesia acarretando numa debilidade no pós-operatório. Talvez por

essa razão a amostra CR tenha se mostrado bastante tóxica nesse modelo, no qual

foi submetida a três experimentos e os animais iam a óbito no 22, 3º ou 42 dia de

experimentação. ,

O óleo de cróton é um irritante vascular, e as drogas antiinflamatórias não

esteroidais são inibidoras da dermatite induzida pelo óleo de cróton e de seus

derivados, em inflamações, vasculares típicas (SWINGLE et al., 1981). A

dermatite induzida pelo óleo de cróton é um modelo experimental utilizado para

demonstrar o efeito tópico de drogas antiinflamatórias. A resposta inflamatória é

geralmente quantificada pela medida do aumento de peso das orelhas de

camundongos em um intervalo de tempo único, onde o efeito do óleo de cróton é

máximo.

No modelo do óleo de cróton a amostra CR e CRD inibiram de forma

significativa a inflamação contudo a amostra CR apresentou menor efeito

inibitório que o observado com o naproxeno, droga clássica que age sobre a

enzima cic100xigenase tendo uma potência vinte vezes maior que a aspirina, inibe

a função leucocitária e apresenta menor efeito colateral que seus derivados

estruturais (Figuras 20 e 21). No ensaio com a amostra CRD optou-se pelo uso de

uma emulsão como excipiente para solubilizar a amostra pois esta tem a

101

102

característica de ser volátil e houve perda de material quando efetuou-se o ensaio

padrão com o veículo acetona/água. No· entanto, verificou-se comportamento

semelhante ao naproxeno podendo indicar uma potência equivalente a essa droga

padrão. a naproxeno foi utilizado na forma de pó que pode não ter tido uma boa

solubilização na emulsão dificultando a sua absorção dando um resultado abaixo

do esperado como visto no experimento feito com a amostra CR.

a levantamento bibliográfico de atividade antiinflamatória dos compostos

presentes nas duas amostras estudadas mostrou que apenas o cariofileno foi

pesquisado mais detalhadamente. MARTIN et al. (1993) demonstraram que o J3

cariofileno inibiu o edema de pata induzido pela carragenina de maneira dose

dependente nas doses de 150 e 300 mg/kg; no edema de pata induzido por PGE1 o

J3-cariofileno inibiu nas doses de 300 e 600 mg/kg sendo que aos 45 minutos após

a administração do agente flogístico obteve-se o máximo de atividade.

Em outro trabalho, SHIMIZU et al. (1990) constataram a atividade

inibitória do óxido de cariofileno na contração de íleo de cobaia induzida por

histamina sugerindo que se houver uma ação antiinflamatória esta poderia ser por

interferência no processo de permeabilidade vascular mediada pela histamina.

Os dois óleos pesquisados apresentam cariofileno em sua composição e

apenas a amostra CAM tem óxido de cariofileno mas em pequena proporção,

0,54%. Apesar da amostra CAM conter 360/0 de cariofileno e a amostra CR

somente 3,4%, esta última apresentou-se mais ativa nos modelos de inflamação

aqui estudados.

Os experimentos de toxicidade aguda revelaram que a amostra CR

(DLso = 4,48 ml/kg) (Tabela 15) mostrou-se bem mais tóxica que a amostra CAM

(item 4.2.6.1) com DLso > 12,35 m1Ikg. Éste fato também é observado no ensaio

feito na formação de tecido granulomatoso (item 4.2.4), no qual os animais

tratados com a amostra CR não resistiram até o fmal do experimento. As frações

destilado (CAMD > 20 m1Ikg e CRD > 9,14 ml/kg) mostraram-se bem menos

tóxicas que as frações resina (CAMR > 2,85 m1Ikg e CRD > 1,29 ml/kg) (item

4.2.6.1) indicando que a toxiçidade do óleo-resina tanto da amostra CAM quanto

da CR está associada, em grande parte, à sua fração diterpênica.

No levantamento bibliográfico feito para os compostos das duas amostras,

um trabalho descreve a toxicidade do óleo essencial de Cannabis sativa sobre

planárias. Dois de seus componentes também são encontrados nas amostras, o 13

cariofileno que não apresentou toxicidade e o óxido de cariofileno que mostrou-se

ser altamente tóxico (FOURNIER et al., 1978).

A amostra CR apresentou baixa margem de segurança evidenciada por sua

baixa atividade antiinf1amatória necessitando de uma alta dose para fazer efeito.

Para a amostra CR a DLso foi pouco mais que o dobro da DEso. BASILE et aI.

(1988) e FERNANDES et alo (1992) obtiveram valores parecidos para DLso, 3,79

e 3,1 ml/kg (valores aproximados), respectivamente, mostrando que o óleo-resina

de copaíba não apresenta alta margem de segurança. Çontudo, com a obtenção da

fração destilado da amostra a toxicidade diminui drasticamente aumentando· a

margem de segurança, uma vez que a amostra continua tendo ação

antiinf1amatória na dose eficaz estabelecida para seu correspondente óleo-resina.

103

A amostra CAM foi submetida ao estudo de toxicidade subcrônica na dose

de 2,47 m1Ikg (OEso) e na dose de 4,84 mlIkg. Ao fmal de 30 dias de tratamento,

com doses diárias, constataram-se alterações nos pesos do figado, rins e baço

(Figuras 22, 23 e 24). Com relação ao figado houve um aumento de peso dose

dependente. Para o baço houve alteração significativa na maior dose (4,84 ml/kg).

Analisando a evolução do peso corporal ao longo do tratamento constata-se que

houve uma alteração não muito significativa para a maior dose no 28Q e 31Q dia

sugerindo que o peso corporal manteve-se com uma taxa normal de crescimento

ao longo da experimentação.

A amostra CR indicou toxicidade subcrônica na dose de 2,02 ml!kg.

Fígado, rins e baço apresentaram alterações de peso bastante significativas

(Figuras 28, 29 e 30). O peso corporal evoluiu sem alterações até o 13Q dia e a

partir do 16Q dia começou a apresentar diminuição de peso significativa, mantendo

esse comportamento até o 31Q dia quando já apresentava alterações significativas

de peso. O consumo de ração foi menor, ao longo do tratamento, para <? grupo

tratado o mesmo não ocorrendo com relação ao consumo de água onde os dois

grupos não apresentaram diferenças (Figuras 31,32 e 33).

Os valores diminuídos de Ht e VCM e normais de Eritrócitos (Tabela 16)

podem sugerir uma microcitose eritrocitária apesar de esta não ser sido detectada

(Tabela 19). Os valores alterados de hemoglobina de CR (Tabela 16),

hipocromia, policromasia, hemácias crenadas e em alvo (Tabela 19) podem

indicar uma anemia pré-existente pois em alterações eritrocitárias de CRD

(Tabela 20) tanto o controle como o grupo tratado apresentam hipocromia e

104

policromasia. A microcitose detectada em CR pode ser justificada por uma

possível anemia pré-existente.

Para a amostra CR, as análises bioquímicas (Tabela 17) indicam somente

uma alteração não muito significativa de ALT não havendo alteração de AST nem

de ALP. Espera-se que, em uma lesão ou disfunção hepática, esses valores estejem

aumentados (LIMA et al., 1977). ALP é considerado um marcador de necrose e

seu valor não alterado indica que não houve, toxicidade hepática. No entanto, o

valor de PT encontra-se ~uído de forma muito significativa indicando um

comprometimento hepático em relação à perda de capacidade de síntese protéica.

o valor aumentado de creatinina de forma muito significativa (quase 600/0) indica

dano glomerular e talve~ tubular e o valor aumentado de uréia confIrma dano renal

(PESCE & KAPLAN, 1987).

o peso aumentado de fígado e rins pode ter sido causado por formação de

edema.

o tratamento por 30 dias com a amostra CRD apresentou aumento muito

significativo de peso para fígado e rins (Figuras 34 e 35). Ao longo do

experimento não houve alteração de peso do grupo tratado. O consumo de água e

ração ficaram inalterados quando comparados ao controle. A Tabela 20 mostra

alterações eritrocitárias tanto no controle quanto no grupo tratado que estão

comentadas acima.

A análise bioquímica mostrou uma alteração de ALT extremamente

significativa, no entanto todos os outros parâmetros permaneceram inalterados

nada podendo-se afirmar sobre uma possível hepatoxicidade (Tabela 22).

BIBLIOTECAFaculdade da C:ênciz." F:lr,r" 'Jl/::a;

Universidade de SoJo P,,!)Ir

105

Creatinina e uréia não apresentann alterações indicando , apesar do aumento de

peso dos rins, não haver toxicidade renal (Tabela 22).

Comparando as amostras CAM, CR e CRD com relação aos parâmetros

peso de figado, rins, baço e peso corporal, CR apresentou alterações significativas

para todos. CAM e CRD não mostraram alterações significativas para peso de

baço e peso corporal. Na avaliação bioquímica a amostra CR evedenciou

toxicidade renal e possivelmente hepática, enquanto CRD não evedenciou

toxicidade. Essas diferenças entre as amostras poderiam ser explicadas em função

de suas composições químicas, no entanto fica claro que o fracionamento do óleo

resma, obtendo-se seu destilado (fração sesquiterpênica), diminui

consideravelmente as toxicidades aguda e crônica.

Os resultados de citotoxicidade evideciaram que a fração destilado (CRD)

da amostra ca mostrou-se bem menos tóxica. Na maior dose (lO J.lVml água do

mar) CRI) não provocou inibição 'sobre o desenvolvimento de ovos de ouriço do

mar. O efeito da adição de tensoativo praticamente não alterou o resultado de

citotoxicidade. Não há na literatura científica relato de citotoxicidade para o óleo

resina de copaíba, no entanto MALPEZZI et alo (1994) relatam citotoxicidade

quase mil vezes menor para outro produto natural, extrato hidroalcoólico de

Petiveria alliacea.

106

------------_._----~

107

6. CONCLUSÕES

1) A amostra comercial de óleo de copaíba, proveniente de Manaus, bem

como suas frações sesquiterpênica e diterpênica apresentam atividade

antiinflamatória nos modelos estudados.

2) A amostra da espécie Capaifera reticulata, proveniente de Belém-PA,

bem como suas frações ~esquiterpênica e diterpênica apresentam atividade

antiinflamatória nos modelos estudados.

3) A amostra da espécie Capaifera reticulata apresentou toxicidade maior

que a amostra comercial.

4) As frações sesquiterpênicas das duas amostras estudadas apresentam

toxicidade menor do que seus correspondentes óleo-resinas.

5) As frações diterpênicas das duas amostras estudadas apresentam

toxicidade maior do que seus correspondentes óleo-resinas.

6) As amostras comercial e Capaifera retuculata apresentaram os seguintes

compostos sesquiterpênicos em comum: [3-cariofileno, u-bergamoteno, u

humuleno e [3-bisaboleno. Para os ácidos diterpênicos somente duas substâncias

são comuns a ambas as amostras: ácido copálico e ácido pinifólico.

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125

APÊNDICE

Tab.24 Composição sesquiterpênica de amostras de C. multijuga (CM-I, CM-2 eCM-3), C. reticulata (CRM e CR), comercial (CAM) e C. cearensis (CC).

COMPOSTOS CM-I CM-2 CM-3 CRM CR CAM CCa-elemeno - - p p~-elemeno - - - - p

a-cubebeno p p p p - p p~-cubebeno - - - - - - pa-copaeno p p p p - p p

calareno p p p plongifoleno - - p p - - p~-cariofileno p p p p p p p

a-bergamoteno p p p p p p pa-guaieno - - - - p~-farneseno - - - - p

~-sesquifelandreno - - p p p - pa-humuleno p p p p p p pvalenceno - - - - p

a-curcumeno p p - p - - pa-amorfeno - - - - - p

gama-amorfeno p p p p - - pO-germacreno p p p p - p p

a-aromadendreno p - - - p - pB-germacreno p - p p - - pa-bisaboleno - - - - p~-bisaboleno - - p p p p p

gama-cadineno p p p põ-cadineno p p p p - p pa-cadineno p p p p - - pa-selíneno - - - p p - p

j3-vetiveneno p p p p - - pa-cariofilenol p - p - - p p

ledol - - p - - - pmultigenol - - - p - P

óxido de cariofileno p p p p - p Pguaiol - - p - - - pcedrol p - p p p - p

cubenol - - - - pcadaleno p - p p - - pa-cadinol p p - p - - P

óxido de ~-bisaboleno - - p~-bisabolol - - p p - - p

acetoxi-cariofileno - - p- : ausênciap : presença

126

..........

_.-

- --_.-

Tab.25 Composição diterpênica de amostras de C. multijuga (CM-I, CM-2 eCM-3), C. reticulata (CRM e CR), comercial (CAM) e C. cearensis (CC).

COMPOSTOS CM-I CM-2 CM-3 CRM CR CAM CC3-metil-6-pentanoato de metila - - - - - - p

16-caureno - - - p pcaurano - - - - p

clerodanoato de metila - - - - p pclerodenoato de metila - - - - - plabdanoato de metila - - - - p

cativato de metila - - - - - p14-norcadin-S-en-4-ona p p

caurenoato de metila - - - p pcauranoato de metila - - - - p

labdadienoato de metila - - - - pdanielato de metila '\ - - - - p

colavenato de metila - - - p - p phardwickiato de metila - - - p - p p

eperuato de metila - p p - - p pcopalato de metila p p p p p p p

pinifolato de dimetila - p p - p pclorechinato de metila - - - p

c1erodadendioato de dimetila - - - - - - pclerodanoato de metila - - - - p p p

agatato de dimetila p p p p pagatato de metila - - - - - p

ll-hidroxi-copalato de metila - p p - - p11-acetoxi-copalato de metila - - p p - pl1-acetoxi-agatato de metila p p

- : ausênciap: presença

127

128

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Fig. 40 Cromatograma em fase gasosa do óleo-resina de copaíba da amostra

comercial proveniente da região de Manaus.

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Fig. 41 Cromatograma em fase gasosa do óleo-resina de copaíba da amostra da

espécie Copaifera reticulata proveniente de Belém/PA.

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A

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E

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B

D

COOH

F

Fig. 42 Terpenóides identificados nos óleos-resinas de copaíba das amostras

comercial, proveniente da região de Manaus, e da espécie Copaifera

reticulata proveniente de BelémlPA. A: ~-cariofileno; B: u

bergamoteno; C: a-humuleno; O: ~-bisaboleno; E: ácido copálico; F:

ácido pinifólico.

-- --- •...,-- .-iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiíillílliiilli..-------· -

ABSTRACT

Species of the genus Copaifera (Leguminosae) are native of tropical

regions in Latin America and Africa. In Brazil, its oil-resin is wideIy utiIized in

popular medicine as anti-inflammatOIY, antiseptic and cicatrizing medicine.

In the present work, we initia11y evaluated the acute anti-inflammatory

activity of the following samples: commercial, Copaifera reticulata, C. multijuga

and C. paupera. AlI th~ sampIes were administered by oral route. This initial

pharmacological evaluation revealed that the C. reticulata was c1early more

effective. In the second part of this work, the C. reticulata and the commercial

sampIes, kind1y provided by Pronatus-Manaus, were investigated.

The oil-resins of the selected samples were analyzed by gas

chromatography connected with mass spectrometry, revealing the presence of

sesquiterpens and diterpens. Twenty two compounds in the commercial sampIe

and twenty six in the C. reticulata were identified. Then afier, the oil-resins were

distilled and separated in their respective sesqui and diterpens fractions. Both oil

resins and their fractions were pharmacologically evaluated.

The pharmacological evaluations were: acute, sub-chronic and chronic anti

inflammatory activities and acute, sub-chronic toxicities and cito-toxicities assays.

The anti-inflammatory activity was studied in five experimental models:

carrageenan, nistatin and miconazole paw oedema; induction of granulomatous

tissue formation and croton oil dermatitis. The administered doses by oral route

were 2.47 ml/kg (EQso for carrageenan model) to commercial·sample and its

sesqui and diterpens fractions, and 2.02 ml/kg to C. reticulata sample and its

sesqui and diterpens fractions. AlI the assays carried out with the selected samples

showed intense anti-flogistic activity, except for C. reticulata that exhibited high

toxicity in the granulomatous tissue model.

In the acute toxicity studies, C. reticulata (LDso = 4.48 mlJkg) revealed

greater toxicity in comparison with the commercial sample (LDso > 12.35 ml!kg).

Its sesquiterpens fractions were less toxic that its correspondent oil-resins with

LOso higher than 9.14 and 20 m1Jkg, for C. reticulata and commercial sample,

respectively. On the other hand, resin fraction (diterpenic) presented high toxicity

with LDso higher than 2.85 and 1.29 mlJkg for commercial and C. reticulata

samples, respectively.

The sub-chronic assays, confmned the less toxicity for the C. reticulta

sesquiterpenic fraction. The C. reticulata oil-resin presented renal toxicity and

hepatics alterations.

biblioteca digital de teses e dissertações da usp...suas frações sesquiterpênicas foram bem...

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