Bases Nitrogenadas nos Ácidos Nucleicos

Pirimidinas

Purinas

5-Metildicetopirimidina Dicetopirimidina

Purificação de DNA por gradiente de Cloreto de Césio e visualização por luz U.V.

O CsCl tem sua solução aquosa com uma gravidade específica próxima a do DNA . Quando esta solução é centrifugada por um longo período de tempo e em alta velocidade, atinge-se um equilíbrio com a formação de um gradiente de densidade contínuo, com a porção mais concentrada de CsCl no fundo do

tubo e a porção menos concentrada no topo.

DOSAGEM DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR ABSORÇÃO DE LUZ U.V.

D.O 260nm = 1,0 corresponde a

• 50g/mLde DNA dupla fita

•40 g/mL de DNA ou RNA simples fita

•20 g/mL de oligonucleotídeos.

D.O 260nm/ D.O 280nm : fornece a pureza de uma preparação de ácidos nucleicos (1,8 e 2,0 para DNA e RNA respectivamente). Valores inferiores indicam contaminação com fenol e proteínas.

MARCAÇÃO NÃO RADIOATIVA DO DNA VIA BASES NITROGENADAS

•DIGOXIGENINADIGOXIGENINA: : O DNA é ligado ao glicosídeo digoxigenina-11-UTP

•BIOTINABIOTINA: : O DNA é ligado à biotina

•COMPOSTOS FLUORESCENTESCOMPOSTOS FLUORESCENTES: : O DNA é ligado a compostos fluorescentes como Texas Red.

dUTP- Biotina

dUTP-Digoxigenina

Grupamentos Fosfatos nos ácidos nucleicos

dATP

β α

MARCAÇÃO DO DNAMARCAÇÃO DO DNA

MARCAÇÃO RADIOATIVAMARCAÇÃO RADIOATIVA::

Isótopos: Isótopos: Átomos que tem o mesmo número de prótons e diferentes números de nêutrons são chamados isótopos uns dos outros. Os isótopos são ditos radioativos quando contém uma combinação instável de prótons e nêutrons. A quebra e desintegração do isótopo radioativo, resulta na liberação de energia.

As sondas genéticas podem ser marcadas com nucleotídeos marcados com radiosótopos no fosfato α, por exemplo α 32P .

AÇÚCARES DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Ligação P-O sensível a alkali e enzimas

Ligações FosfodiésterLigações fosfodiéster constituem o núcleo principal da vida já que são parte da constituição básica de todos os ácidos nucleicos.

A hidrólise das ligações fosfodiester são catalisadas pelas fosfodiesterases (quebra do DNA)

Grupos fosfatos das ligações fosfodiester são carregados negativamente

Por quê o mesmo tamanho

molecular pode migrar

diferentemente no gel de

eletroforese?

•Etanol e isopropanol: A natureza higroscópica do DNA forma precipitados quando colocado em presença de etanol ou isopropanol e pequenas concentrações de

cátions monovalentes.

Base-Pareamento nos ácidos nucleicos

Tratamento ácido: depurinação

Química de formação : Rosalind Franklin (1920-1958): Novembro de 1951- Cadeia de fosfato-desoxiribose no exterior com bases no interior havendo entre 2 e 4 hélices co-axiais.

A: desidratada B: Helicoidal alongada

Laboratório de Biofísica do Kings College

Maurice Wilkins 15/12/1916- 05/10/2004

Uma estrutura de ferro e madeira, imitando uma hélice dupla, foi a forma que os biólogos James Watson e Francis Crick encontraram para demonstrar como é a forma da molécula de DNA.

25 de abril de 1953 - Prêmio Nobel em 1962 junto com Maurice Wilkins)

DNA B•Hélice gira para a direita e a rotação entre 2 pares de bases é de 34,6°

•Volta completa da hélice a cada 10,4 pb

•Diâmetro da hélice é de 2,37nm

•Uma volta percorre 3,4nm e cada base adiciona 0,34nm

Estrutura e propriedades dos RNAs80% do material genético das células: rRNA15%: tRNA5%: mRNA2%: sn RNA e scRNA

•Regiões dupla fita (Pontes de H) são rompidas por altas temperaturas e calor (como no DNA!)

•Ligações fosfodiester são rompidas por alkalis (NÃO OCORRE NO DNA!!!!)

BASE PAREAMENTO RNA-DNA (FORMAÇÃO DE HETERODUPLEXES ou

Hélices híbridas)

HETERODUPLEXES

dA : rU (+estável)rA : dT (+ estável)dG : rC (++ estável)dC : rG (+++ estável)

HOMODUPLEXES DNAdC : dG (+ estável)dA : dT

HOMODUPLEXES RNArA : rUrG : rCrG : rU (---- estável)

Tipos de RNA Número aproximado de tipos nas células

Tamanho aproximado Distribuição

tRNA 80-100 75-90 P, E

5S rRNA 1-2 120 P, E

5,8 S rRNA 1 155 E

16S rRNA 1 1.600 P

23 S rRNA 1 3.200 P

18 S rRNA 1 1.900 E

28S rRNA 1 5.000 E

mRNA milhares variável P, E

hn RNA milhares variável E

sc RNA dezenas 90-330 P, E

sn RNA dezenas 58-220 E

P= procariotos, E= eucariotos

Transcrição do mRNA

Cap: Consiste de uma guanina modificada que é ligada ao terminal 5’ do pré-mRNA e é adicionada pela RNA polymerase II. Protege o mRNA de degradação por enzimas que degradam a partir do terminal 5’ e serve como ponto de encontro (“asssemby”) das proteínas necessárias para recrutar a subunidade ribossomal menor para iniciar a tradução.

Cauda Poli A: É uma agregação de adeninas adicionadas pela RNAP II ao terminal 3’do mRNA. Completa a molécula deixando-a pronta para ser transportada para o citoplasma.

mRNA

RNA polimerase II: Transcreve os genes do mRNA (e também o snRNA).

Ribosomos são compostos por moléculas de RNA e proteínas formando grandes complexos que compreendem a maior parte da massa de uma célula. O ribossomo tem um coeficiente de sedimentação de 70S, e pode ser dividido em duas subunidades: 50S e 30S. Estas subunidades são compostas por unidades separadas: a subunidade 50S possui 2 moléculas de RNA, uma de 23S e outra de 5S bem como 34 proteínas diferentes. A subunidade 30S tem como subunidades a molécula de rRNA de 16S e 21 proteínas diferentes.

rRNA

RNA polymerase I (Pol I): Transcreve os genes do rRNA dos precursores 23S e 16SRNA polymerase III (Pol III): Transcreve os genes para o rRNA 5S

tRNA RNA polymerase III (Pol III): Transcreve os genes para os tRNAs.