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Avanços Tecnológicos utilizando método PCR para Detecção Rápida de Sorotipos de Salmonella em Amostras de AvesTRANSCRIPT
Avanços Tecnológicos utilizando
método PCR para Detecção
Rápida de Sorotipos de
Salmonella em Amostras de Aves
Viviana Fino
Líder Técnica e de Vendas
DuPont Nutrição & Saúde
2 2
• Salmonelose e Salmonella
• Sorotipagem Tradicional da Salmonella
• Sorotipagem da Salmonella baseada em PCR
• Análises Rápidas e Multiplexadas da Salmonella
usando o Sistema DuPontTM BAX®
Resumo
3
Salmonelose e Salmonella
4 4
Fonte da imagem: CDC dos EUA
A Salmonella pertence ao gênero de
bactérias em forma de bastonetes, gram-
negativas e se divide em duas espécies,
Salmonella bongori e Salmonella enterica;
Definida por antígenos de superfície, a
Salmonella - possui > 2.500 sorovares
Salmonella
5 5
~ 94 milhões de casos de gastroenterite com 155.000 mortes
anualmente no mundo todo, e 80,3 milhões destes casos são
de origem alimentar; (Majowicz et. al. 2010)
~ 1,2 milhão de casos da doença nos Estados Unidos, com ~
23.000 internações e 450 mortes (CDC)
Fontes
• Alimentos: Ovos contaminados, aves, carne, leite ou sucos não
pasteurizados, queijos, frutas e legumes crus contaminados
(brotos de alfafa, melão), temperos e nozes
• Animais e seu ambiente: Principalmente répteis (serpentes,
tartarugas, lagartos), anfíbios (sapos), pássaros (pintinhos),
petiscos e ração para animais domésticos.
Período de
Incubação 12 a 72 horas
Sintomas Diarreia, febre, cólicas abdominais, vômito
Duração da
Doença 4 a 7 dias
Salmonelose
6 6
Fontes típicas
de
contaminação
por Salmonella
Fonte da imagem: CDC dos EUA
7 7
Porcentagem de isolados não humanos de Enteritidis por tipo e fonte nos EUA (1968-2011)
N=37.557
Epidemiologia dos Sorovares mais Comuns
Porcentagem de isolados não humanos de Typhimurium por tipo e fonte nos EUA (1968-2011)
N=55.931
Porcentagem de isolados não humanos de Heidelberg por tipo e fonte nos EUA (1968-2011)
N=52.889
US Center for Disease Control and Prevention (Centro de Controle e Prevenção de Doenças)
Clínica
Não Clínica
Clínica
Não Clínica
Clínica
Não Clínica
8 8 http://www.magrama.gob.es/es/ganaderia/temas/sanidad-animal-e-higiene-ganadera/INFORME_final_2012_tcm7-284851.pdf
Distribuição dos 10 mais comuns sorotipos de
Salmonella em humanos, na União Europeia, 2011
9 9
Regulamentação Governamental e Programas de Controle
10
Sorotipagem Tradicional da Salmonella
11 11
A Sorotipagem da Salmonella e sua Importância
Os sorotipos são grupos dentro de uma espécie única de
microrganismos, tais como bactérias ou vírus, que compartilham
estruturas distintas de superfície.
As bactérias Salmonella são vistas ao microscópio, mas podem ser
separadas em vários sorotipos com base em duas estruturas em sua
superfície:
Antígeno O: a porção externa da cobertura da superfície das
bactérias
Antígeno H: estrutura delgada, filiforme de flagelos
Fonte da imagem: CDC dos EUA
12 12
A Sorotipagem da Salmonella e sua Importância
Distribuição dos sorovares em cada
espécie e subespécie (OMS, 2007)
As informações sorológicas são úteis para
a classificação epidemiológica de cepas e
para a investigação de surtos
13 13
Método Tradicional de Sorotipagem
Os complexos antígeno-anticorpo se formam (aglutinação)
quando uma cultura da Salmonella é misturada com um antissoro
específico que combate os componentes da superfície da
Salmonella
O teste de aglutinação em lâminas é feito em uma lâmina de
vidro e interpretado a olho nu com uma fonte de luz diante de um
fundo preto
Fonte da imagem: Statens Serum Institut
A: Reação positiva da aglutinação
B: Reação negativa da aglutinação
14 14 Fonte da imagem: Statens Serum Institut
Método Tradicional de Sorotipagem da Salmonella
15 15
Sorotipagem Completa de S. Enteritidis e S. Infantis
Fonte da imagem: Statens Serum Institut
16 16
Desafios e Limitações do Método Tradicional
Trabalhoso, caro e demorado (até 5 dias para finalizar)
Exige conhecimento especializado e > 250 reagentes com rigorosa
garantia de qualidade
É executado principalmente em laboratórios de referência,
forçando muitas empresas a enviar os isolados para a sorotipagem
completa
Pode atrasar a identificação dos isolados, impedindo o avanço na
investigação e contenção de surtos
17
Sorotipagem da Salmonella baseada em
PCR
18 18
Métodos Moleculares para Sorotipagem
Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE do inglês,
Pulse-Field Gel Electrophoresis)
O DNA genômico de enzima restrita da Salmonella é
dividido, sob condições de campos elétricos alternados,
em vários fragmentos
O sorotipo é determinado pelos padrões de polimorfismo
do comprimento do fragmento
19 19
Métodos Moleculares para Sorotipagem
Vantagens
Alta resolução (precisão na determinação da sorovariedade
varia entre 75% e 99%)
Disponibilidade de uma base de dados de PFGE
sofisticada (PulseNet)
Perfis de PFGE representativos de isolados de Salmonella Newport (Egorvoa et. al. 2008)
20 20
Métodos Moleculares para Sorotipagem
Limitações
Sorovares múltiplos podem possuir padrões de PFGE
idênticos
Um único sorovar pode apresentar uma diversidade de
PFGE que é específica da cepa
Tecnologia representativa
Método de PFGE para Salmonella desenvolvido pelo
FDA/CDC dos EUA
21 21
Ribotipagem
Os fragmentos do DNA da Salmonella, a partir da digestão
enzimática, são separados eletroforeticamente e hibridizados
por uma sonda operon ribossomal
Métodos Moleculares para Sorotipagem
22 22
O sorotipo também é determinado
pelos padrões de polimorfismo do
comprimento do fragmento
Vantagens
Alta resolução (a capacidade
de discriminação pode alcançar
o nível de cepa)
Instalações para a análise dos
padrões de bandas menos
complexas
Tecnologia representativa
Sistema de Caracterização
Microbiana DuPontTM
RiboPrinter®
Métodos Moleculares para Sorotipagem
23 23 Shi et. al. 2013
Representação linear de genes rfb
de 9 sorogrupos da Salmonella
Métodos de PCR para Sorotipagem
Polimorfismo do comprimento dos fragmento de restrição por PCR
(PCR-RFLP -PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism)
Restrição enzimática do DNA amplificado por RCP (antigenos O e H)
O sorotipo é determinado pelos padrões das bandas
Vantagens
É tecnicamente fácil de executar
Limitações
A capacidade de discriminação
depende de uma região genômica
muito restrita
A disponibilidade de base de dados é
limitada
24 24
Perfis RAPD representativos de 29 Salmonella Enteritidis Isolados (Lin et. al. 1996)
Métodos de PCR para Sorotipagem
Vantagens
Elevada capacidade de discriminação oa
relação custo-benefício
Limitações
Baixa reprodutibilidade devido às
condições rigorosas como a sequência do
Primer e as condições da PCR
Uma única sorovar pode apresentar vários
padrões diferentes
DNA polimórfico amplificado aleatoriamente por PCR (Random
amplified polymorphic DNA-PCR)
Amplificação aleatória do DNA do genoma da Salmonella com Primers
mais curtos (~10 bp)
O sorotipo é determinado por padrões de polimorfismo do comprimento do
fragmento amplificado
25 25
Perfis de DGGE representativos da
Salmonella Enteritidis
Isolados (Marciel et. al. 2013)
Métodos de PCR para Sorotipagem
Vantagens
Boa relação custo-benefício
Permite a identificação taxonômica porque as
bandas podem ser excisadas, reamplificadas e
sequenciadas
Limitações
Não confiável para a separação de fragmentos
maiores de 500 bp
A separação pode ser às vezes difícil devido à
comigração entre os fragmentos
Eletroforese em Gel com Gradiente de Denaturação (PCR-DGGE-
PCR-Based Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
Os fragmentos amplificados por PCR do DNA da Salmonella são separados no
gel de poliacrilamida com um gradiente desnaturante de DNA produzido com
ureia e formamida
Então, estes fragmentos de comprimento idêntico são separados pela variação
na composição das sequências de nucleótidos
26 26
Dendrogramas de perfis de REP-RCP de 54
isolados da Salmonella
(Dunkley et. al. 2007)
Sequência Palindrômica Extragênica
Repetitiva (Repetitive Extragenic
Palindromic-PCR)
Visa os elementos repetitivos interespaçados e
conservados no genoma da Salmonella
O sorotipo é determinado por padrões de
polimorfismo do comprimento do fragmento
Vantagens
Alta resolução (até o nível de cepa)
As regiões visadas têm uma composição da
sequência altamente conservada
Limitações
Dificulta a diferenciação entre sorotipos
homólogos e polifiléticos
A reprodutibilidade pode ser uma limitação em
alguns estudos
Métodos de PCR para Sorotipagem
27 27
Análise multiplexada de PCR dos
30 sorotipos de Salmonella com
maior prevalência (Kim et. al. 2006)
Vantagens Boa relação custo-benefício e sensível
É reprodutível
Pode ser usado com outros métodos de tipagem (por ex. PFGE)
Limitações Análise em gel
A condição de PCR pode ser tendenciosa
Exige vários conjuntos de Primers
Métodos de PCR para Sorotipagem
PCR Multiplexado
Detecção por PCR de genes presentes em sorotipos específicos de
Salmonella e não outros
28 28
PCR multiplexada em tempo real
Detecção de mais de um alvo em uma única reação/tubo de PCR por meio de mudanças na fluorescência
Favorece alto rendimento e automação
Normalmente combinada com inibidores de PCR para controle interno
Design de sequências oligo exige um grande competência profissional
Número limitado de canais detectores em plataformas de PCR comumente usadas Fonte da imagem: Biosearch
Métodos de PCR para Sorotipagem
29
Análises Rápidas e Multiplexadas da Salmonella usando o Sistema DuPontTM BAX®
30
Sistema DuPontTM BAX® de Análise por PCR em Tempo Real para
Detecção de Salmonella Enteritidis e Typhimurium (SE/ST)
Poultry Industry
Salmonella Enteritidis & Typhimurium
DuPontTM BAX® Real Time PCR
31 31
Sistema DuPontTM BAX® de Análise por PCR em Tempo Real
para Detecção de Salmonella Enteritidis e Typhimurium (SE/ST)
Enriquecimento típico da Salmonella Lise bruta
~ 30 min
Detecção ~ 1 h
Resultados Finais
32 32
Sensibilidade
Inclusão
Exclusividade
Sistema DuPontTM BAX® de Análise por PCR em Tempo Real
para Detecção de Salmonella Enteritidis e Typhimurium (SE/ST)
33
Sistema DuPontTM BAX®
Altamente Multiplexada
para Detecção de 7 tipos do Salmonella
Salmonella spp.
Salmonella Infantis
Salmonella Enteritidis
Salmonella Heidelberg
Salmonella Hadar
Salmonella Typhimuriu
m
Salmonella Virchow
34 34
Tagging Oligonucleotide Cleavage and Extension (TOCETM)
Métodos de PCR para Sorotipagem
PCR multiplexado
35 35
A temperatura de fusão pode ser ajustada de acordo com o
comprimento e a composição das sequências receptoras
Métodos de PCR para Sorotipagem
PCR multiplexado
36 36
Reação em um tubo para detecção do gênero de Salmonella e 6 sorotipos comuns
Enriquecimento típico de Salmonela Lise ~ 30 min Detecção ~ 2,5 hr
Sistema DuPontTM BAX® Altamente Multiplexada para Detecção
de 7 tipos do Salmonella
37 37
Sensibilidade
Inclusão e Exclusividade
Reação em um tubo para detecção do gênero de Salmonella e
6 sorotipos comuns
Sistema DuPontTM BAX® Altamente Multiplexada para Detecção
de 7 tipos do Salmonella
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Benefícios
As análises multiplexadas por PCR do Sitema DuPont™ BAX®
para detecção de Salmonella é uma configuração para a reação
em 1 tubo, podendo ser usada como triagem e sorotipagem
primária ou método secundário de sorotipagem para o gênero
Salmonella e sorovares comuns.
Lisados produzidos do enriquecimento de alimentos podem ser
testados diretamente, sem a necessidade de purificação
adicional. O LOD (limite de detecção) de cada alvo foi
demonstrado ser de 104 cfu/mL sob condições de multiplexação.
39 39
Benefícios
As análises demonstraram uma excelente inclusão e
exclusividade.
Em comparação com o método Kauffmann-White e outros
métodos moleculares de sorotipagem, este método oferece
outros benefícios como:
• Maior facilidade de uso • Menor tempo para obter
resultados • Manuseio mínimo das
amostras • Menor custo
• Processa até 96 amostras por lote
• Alta precisão • Robusto e resistente a
inibidores de PCR de matrizes alimentares
Obrigada! [email protected]