aspectos fisiolÓgicos de rhodnius prolixus stal: 1859...
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ASPECTOS FISIOLÓGICOS DE Rhodnius prolixus STAL: 1859
(Hemiptera Reduviidae): I. SUBSTÂNCIAS INIBIDORAS DA ALI-
MENTAÇÃO. lI. FATORES HEMOLÍTICOS E ANTIBACTERIANOS INDUZIDOS
PATRICIA DE AZAMBUJA PENNA
1985
TÍTULO DA TESE
ASPECTOS FISIOLÓGICOS DE Rhodnius prolixus STAL, 1859
(Hemiptera, Reduviidae): I. SUBSTÂNCIAS INIBIDORAS DA ALI-
MENTAÇÃO: II FATORES HEMOLÍTICOS E ANTIBACTERIANO INDUZIDOS
AUTORA
PATRICIA DE AZAMBUJA PENNA
APROVADA EM: 26/julho/1985
WALTER R. TERRA
GONZALO EFRAIN MOYA BORJA
LUIZ FERNANDO FERREIRA DA SILVA
LEON RABINOVICH
ELOI DE SOUZA GARCIA
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE BIOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
ASPECTOS FISIOLÓGICOS DE Rhodnius prolixus STAL, 1859
(Hemiptera, Reduviidae): I. SUBSTÂNCIAS INIBIDORAS DA ALI-
MENTAÇÃO. II. FATORES HEMOLÍTICOS E ANTIBACTERIANO INDUZIDOS
PATRICIA DE AZAMBUJA PENNA
SOB A ORIENTAÇÃO DO PROFESSOR
ELOI DE SOUZA GARCIA
Tese submetida a Universidade
Federal Rural do Rio de Janei-
ro, como requisito parcial pa-
ra a obtenção do grau de Dou-
tor em Medicina Veterinária.
Área de Concentração em Para-
s i t o l o g i a V e t e r i n á r i a .
I t a g u a í , Rio de J a n e i r o
j u l h o , 1985
iv
À Coordenação do Curso de Pós-
Graduação em Medicina Veterinária-Pa-
rasitologia Veterinária, da Universi-
dade Federal Rural do Rio de Janeiro,
pela oportunidade concedida.
Ao CNPq e OMS, pela bolsa de
estudo e recursos proporcionados ao
Laboratório de Fisiologia de Insetos,
propiciando a realização deste traba-
l ho .
À J u l i ana e E l o i
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Eloi S. Garcia, da Fundação Oswaldo
Cruz, pela o r ien tação e apoio.
Ao Professor Gonzalo E. Moya Borja, da Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro, pela orientação e estímulo à
pesquisa no campo da F i s i o l o g i a de Inse tos ;
Ao Professor Hugo Edison B. de Rezende, da Universi-
dade Federal Rural do Rio de Janeiro, pela amizade e apoio
concedido durante a rea l i zação do Curso de Pós-Graduação.
Ao Professor Carlos M. Morel, da Fundação Oswaldo Cruz,
pelo interesse e por ter oferecido as condições de infra-es-
trutura do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular,
sem as quais não poder ia t e r s ido rea l i zado este t r a b a l h o ;
Ao Professor Joacy D. Macarini, da Universidade Fede-
ral Fluminense, pelo incentivo no campo da pesquisa científi-
ca;
Ao Professor Jorge A. Guimarães, da Universidade Fe-
v i i
deral do Rio de Janeiro, pelas sugestões em algumas etapas
desta tese;
Ao Professor Cícero C. de Freitas, da Universidade
Federal Fluminense, pela assistência e colaboração na etapa
f i n a l da tese ;
Ao Marcus Vinícius S. Bastos e Jorge Luis A. Perei-
ra, da Fundação Oswaldo Cruz, pelo dedicado trabalho computa-
c iona l ;
Ao Francisco Gomes, da Universidade Federal Fluminen-
se, e a Genilto Vieira da Fundação Oswaldo Cruz, pelos traba-
lhos de f o t o g r a f i a s ;
Ao Professor Oswaldo Duarte Gonçalves, da Universida-
de Federal Rural do Rio de Janeiro, pela minuciosa revisão ge-
ra l do e s c r i t o ;
Aos demais colegas da Universidade Federal Fluminen-
se e Fundação Oswaldo Cruz, pelo convívio produtivo e agradá-
vel durante a rea l i zação da tese.
BIOGRAFIA
Patrícia de Azambuja Penna, filha de Fernando Adol-
pho Garcia Penna e Tais de Azambuja Penna, nasceu na cidade
do Rio de Janeiro em 15 de Julho de 1954. Fez o curso primá-
rio da Escola Minas Gerais, o primeiro ciclo do secundário no
Colégio Jacobina, e o segundo ciclo no Colégio Brasil Améri-
ca.
Em 1975 ingressou na Universidade do Estado do Rio
de Janeiro, concluindo o Curso de Ciências Biológicas, Moda-
lidade Biomédica, em 1978. Durante sua vida universitária es-
tagiou e desenvolveu uma monografia na disciplina de parasito-
logia para obtenção de grau de Bacharel em Ciências Biológi-
cas.
Em 1979 ingressou no Curso de Pós-Graduação em Medi-
cina Veterinária - Parasitologia da Universidade Federal Ru-
ral do Rio de Janeiro, tendo apresentado sua tese para obten-
ção do grau de Magister Scientiae em 1981. Nesse mesmo ano
inscrita no Curso de Pós-Graduação a nível de Doutorado, con-
ix
tinuou seu trabalho de Fisiologia de Insetos na Universidade
Federal Fluminense e no Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular da Fundação Oswaldo Cruz.
Em 1984, prestando concurso público na Universidade
Federal Fluminense, foi selecionada para o cargo de Profes-
sor-Assistente do Departamento de Biologia Geral, onde atual-
mente está trabalhando.
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ÍNDICE
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO
2. REVlSÃO DE LITERATURA
2. 1 . Pos ição taxonômica
2.2. C ic lo B io lóg ico de Rhodnius pro l ixus
2.3. S is tema Digest ivo
2.4. A l imentação
2.5. Fagoin ib idores
2.6. Precoceno
2.7. Azadi racht ina
2.8. D igestão de sangue
2.9. Imunolog ia de insetos
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Reagentes e out ros mater ia is
3.2 . Equipamentos
3.3. Estabelecimento da colônia de R. prolixus
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3.4. Alimentação e preparo das d ietas
3.5. Preparo das amostras para ensaios da at iv ida-
de hemoIít ica
3.6. Determinação da a t i v i dade hemol í t ica
3.7. Ensaio da a t i v idade p r o t e I í t i c a
3.8. Cultura de Streptococcus mutans
3.9. Inoculação de bactér ias e coleta de hemolin-
fa
3.10. Ensaio da a t i v idade an t ibac te r iana
3.11. Ensaio da atividade de lisozima
3.12. Indução da proteção contra S. mutans
3.13. Preparo das resinas cromatográficas
3.14. Determinação de proteínas
4. RESULTADOS
4.1. Estudo sobre substâncias inibidoras da ali-
mentação
4.2. Estudo sobre o sistema hemoIí t ico do intest i-
no médio
4.3. Estudo sobre o sistema imunológico h u m o r a l
5. DISCUSSÃO
5.1. Atividades "antifeedant" de precocenos e aza-
dirachtinas
5.2. Indução da atividade hemolítica
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5.3. Indução da atividade antibacteriana humoral
6. CONCLUSÕES
7. BIBLIOGRAFIA CITADA
ÍNDICE DE FIGURAS
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Vista dorsal de Rhodnius prolixus (adulto),
sem os tergitos abdominal. Promesentero ("es-
tômago"), posmesentero ("intestino"), proc-
todeum ("reto")
Estrutura química de 7-metoxi-2,2 dimetil-
cromeno (PI); 6-7-dimetoxi-2,2 dimetilcrome-
no (PII); 7-etoxi-6-metoxi-2,2 dimetilcro-
meno (etoxi PII); e 6,7-dimetoxi-2,2 dime-
tilcromeno
Modelo proposto para a biotransformação de
precoceno II (BOWERS, 1980: SODERLUND et al.,
1980)
Estrutura química parcial de Azadirachtina A
(VlGNERON, 1978)
Inibição da alimentação (efeito "antifeedant")
por precocenos e análogos adicionais à die-
FIGURA 1
FIGURA 2
FIGURA 3
FIGURA 4
FIGURA 5
xiv
FIGURA 6
FIGURA 7
FIGURA 8
FIGURA 9
FIGURA 10
FIGURA 11
ta de 4º estádio de Rhodnius prolixus
Efeito de azadirachtina A, azadirachtina B
e 7-acetil-azadirachtina A adicionada à die-
ta de 4º estádio de Rhodnius prolixus
Efeito do pH na atividade hemolítica de con-
teúdo do promesentero de 5º estádio de Rhod-
nius prolixus, em um meio de incubação con-
sistindo de Na2HPO4 0,01M, NaCl 0,15M CaC12
0,45mM e uma concentração definida de eri-
trócitos
Efeito da temperatura na atividade hemolíti-
ca de conteúdo de promesentero de 5º está-
dio de Rhodnius prolixus, em meio de incuba-
ção padrão
Efeito da variação da quantidade de proteí-
na de promesentero de 5º estádio de Rhodnius
prolixus na atividade hemolítica
Curso temporal da hemólise de conteúdo de
promesentero de 5º estádio de Rhodnius pro-
lixus em um meio de incubação padrão
Atividade hemolítica do conteúdo de prome-
sentero de 5º estádio de Rhodnius prolixus
em diferentes períodos de tempo após a ali-
mentação
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FIGURA 12
FIGURA 13
FIGURA 14
FIGURA 15
FIGURA 16
FIGURA 17
Gel-filtração em Biogel P-6 do conteúdo de
promesentero de 5º estádio de Rhodnius pro-
lixus; fracionamento do fator hemoIítico
Cromatografia em coluna de SP-Sephadex C-50
da amostra 1
Observação da mortalidade de adultos de Rhod-
nius prolixus inoculados com 109 células de
Streptococcus mutans, em função do tempo de
corrido após a inoculação primária de 106
células
Cinética da atividade antibacteriana de he-
molinfa de adultos de Rhodnius prolixus ino-
culados com 106 células de Streptococcus mu-
tans
Indução da atividade antibacteriana de hemo-
linfa de adultos de Rhodnius prolixus inje-
tados com 103 a 106 células vivas
de Streptococcus mutans
Gel-filtração em Biogel A 0,5m de hemolinfa
de adultos de Rhodnius prolixus, coletada
no 5º dia após a inoculação de 106 células
de Streptococcus mutans
ÍNDICE DE TABELAS
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TABELA 1
TABELA 2
TABELA 3
TABELA 4
Inibição da alimentação de 4º estádio de
Rhodnius prolixus induzida por precoceno
e análogos
Efeito de ATP sobre a inibição da alimen-
tação de 4º estádio de Rhodnius prolixus
induzida por precoceno II adicionado à
dieta artificial
Inibição da alimentação de 4º estádio de
Rhodnius prolixus induzida por azadira-
chtina A, azadirachtina B e 7-acetil-aza-
dirachtina A
Efeito da concentração de ATP sobre a ini-
bição da alimentação induzida por azadi-
rachtina A adicionada à dieta artificial
de 4º estádio de Rhodnius prolixus
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TABELA 5
TABELA 6
TABELA 7
TABELA 8
TABELA 9
TABELA 10
Observações da atividade hemolítica e pro-
teoIítica de amostras de promesentero (lú-
men ou homogenado de parede), homogenado
de posmesentero, tecido adiposo e hemolin-
fa de 5º estádio de Rhodnius prolixus no
3º e 16º dias após alimentação
Observação da atividade hemoIítica de a-
mostras de promesentero obtidas de ninfas
e adultos de Rhodnius prolixus no 2º e 3º
dia após a alimentação
Efeito da composição do alimento sobre a
atividade homoIítica de promesentero de
5º estádio de Rhodnius prolixus no 3º dia
após a alimentação
Purificação do fator hemoIítico de prome-
sentero de 5º estádio de Rhodnius prolixus
Efeitos de diferentes tratamentos de amos-
tras da preparação bruta ou purificada (a-
mostra 2) do fator hemoIítico
Observação da atividade bacteriana de he-
molinfa de Rhodnius prolixus previamente
inoculados com 106 células de Streptococ-
cus mutans
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TABELA 11
TABELA 12
Atividade antibacteriana de hemolinfa de
Rhodnius prolixus previamente inoculados
com 106 células de Streptococcus mutans e
de lisozima sobre a parede celular de Mi-
crococcus lysodeikticus e Streptococcus
mutans
Efeitos de diferentes tratamentos sobre o
fator antibacteriano de hemolinfa de Rhod-
nius prolixus
RESUMO
Neste trabalho, foram investigados alguns aspectos re-
lacionados à alimentação, digestão e imunidade humoral de
Rhodnius prolixus.
No estudo do efeito "antifeedant" de algumas substân-
cias em ninfas de 4º estádio de R. prolixus, o precoceno II,
adicionado à dieta, inibiu fortemente a alimentação, enquanto
o precoceno I, etoxiprecoceno II e o cromano de precoceno II
apresentaram efeitos menos drásticos. A azadirachtina A, aza-
dirachtina B e 7-acetilazadirachtina A demonstraram efeitos
"antifeedant" mais acentuados que o precoceno II. O mecanismo
de inibição da alimentação por esses compostos foi discutido
com base nos resultados obtidos pelo tratamento simultâneo com
ATP.
Em uma outra etapa, foi evidenciado, em promesentero
de ninfas e adultos R. prolixus, um fator que lisava eritrócito
em solução isotônica, e sugerido o seu papel fisiológico na di-
gestão do inseto. A atividade hemolítica aumentava após a in-
XX
gestão de sangue total, eritrócitos e hemoglobina, mas não de
plasma e estroma de eritrócitos. Os resultados obtidos da pu-
rificação parcial e dos tratamentos químicos sugeriam ser o
fa tor de natureza peptídica e básico.
Finalmente, foi também evidenciado um fator antibac-
teriano, que era induzido na hemolinfa de adultos R. prolixus
por inoculação de Streptococcus mutans, e sugerido o seu pa-
pel fisiológico no mecanismo de defesa do inseto. Esse fator
agiu sobre esta bactéria somente em fase exponencial de cres-
cimento e atingiu nível máximo na hemolinfa no 4º e 5º dias
após a inoculação das bactérias. Uma purificação parcial e
caracterização química sugeriram ser este fator de baixo peso
molecular e de natureza proteica.
ABSTRACT
Aspects concerning feeding, digestion and humoral
immunity of Rhodnius prolixus were investigated. In a study of
the antifeedant effect on fourth-instar larvae of R. prolixus,
precocene II added to the diet strongly inhibited feeding while
precocene, ethoxy precocene II and the chromane of precocene
II showed less drastic effects. Azadirachtin A, azadirachtin
B, and 7-acetyl-azadirachtin A showed stronger antifeedant
effects than precocene II. The mechanism for ihnibition of
feeding by these drugs was discussed based on the results
obta ined by s imul taneous t rea tmen t w i th ATP.
In another stage of the work, a factor which lysed
sheep red cells in an isotonic buffer, was demonstrated in
the anterior part of the midgut of nymphs and adults of R.
prolixus. Fifth-instar larvae fed on whole blood, erythrocytes
and heamoglobin produced large quantities of haemolytic factor,
while those fed on plasma and erythrocyte stroma did not. The
results obtained by purification and chemical treatment
suggested t h a t the f a c t o r i s a bas ic pep t i de .
xxii
Finally, an antibacterial factor was found, which was
induced in the haemolymph of R. prolixus by injection of
Streptococcus mutans. This factor acted on S. mutans only in
the exponential phase of growth, and attained a high level in
the haemolymph on the fourth and fifth days after the bacterial
inoculation. Partial purification and characterization of the
factor showed that it is a peptide of small molecular weight.
The physiological role of this factor may be associated with
the defense mechanism of t h i s b l ood -suck i ng i n s e c t .
I. INTRODUÇÃO
O Rhodnius prolixus Stal, 1859, apresenta ampla dis-
tribuição geográfica do Equador até o México. A sua importância
médica reside no fato de ser um inseto de hábito hematófago e
um dos principais vetores do Trypanosoma cruzi, agente etioló-
gico da Doença de Chagas (DIAS & DIAS, 1978).
O programa de controle de populações de Triatominae
tem sido realizado com o uso de inseticidas convencionais de
largo espectro, que podem representar riscos para o meio ambien-
te e para o homem. Atualmente, têm sido desviadas as atenções
para procedimentos de controle alternativos, como o uso de subs-
tâncias naturais (MARINI-BETTOLO, 1976) ou de microrganismos
(BOMAN & STEINER, 1981). De uma maneira geral, alguns métodos
efetivos no controle da proliferação de insetos, são baseados
no uso de anti-hormônios e de inibidores da alimentação e da
digestão.
Recentemente, foram testados por BOWERS et al (1976)
o precoceno, uma substância isolada da planta Ageratum houstonianum,
e por REMBOLD (1980) a azarachtina, obtida do extrato de
Azadirachta indica, em algumas espécies de insetos fitófagos,
e demonstradas as atividades biológicas de anti-hormônios. Foi
constatado que o precoceno II, quando adicionado à dieta de R.
prolixus, inibiu a alimentação (AZAMBUJA et al, 1981). Em do-
ses baixas, este composto agiu inibindo também a hemólise "es-
tomacal" promovendo distúrbios digestivos (AZAMBUJA & GARCIA,
1984).
Este trabalho, teve como objetivo esclarecer alguns
aspectos fisiológicos de R. prolixus, ainda escassos na litera-
tura, dando-se especial atenção a: a) efeitos de precoceno,
azadirachtina e análogos sobre a alimentação de ninfas; b)
evidenciação e caracterização parcial de um fator hemolítico
induzido de intestino médio e de um fator antibacteriano pre-
sente na hemolinfa de insetos previamente inoculados com
Streptococcus mutans.
2. REVlSÃO DE LITERATURA
2.1. POSIÇÃO TAXONÔMICA
O Rhodnius prolixus Stal, 1859, espécie tipo do gêne-
ro, pertence à ordem Hemiptera, família Reduviidae, subfamília
Triatoninae (LENT, 1948; LENT & JURBERG, 1969).
2.2. CICLO BIOLÓGICO
O Rhodnius prolixus, inseto hemimetabólico, sob o pon-
to de vista ontogênico, possui três fases: ovo, ninfa e adulto.
2.2.1. Ovipostura e duração da embriogênese
FRIEND et al. (1965) observaram que, dependendo do nú-
mero de repastos e da quantidade de sangue ingerida por fêmea
de R. prolixus, havia uma variação do ciclo de postura bem co-
mo da quant idade de ovos depos i tados.
Os trabalhos de URIBE (1927) e GALLIARD (1935) demons-
traram que o tempo da incubação dos ovos variava de acordo com
a tempera tu ra , sendo a média, a 27ºC, de 15 d ias .
2 . 2 . 2 . Desenvolv imento pós -embr ioná r i o
Alguns trabalhos destacaram a importância da alimen-
tação para que se processem as ecdises dos cinco estádios nin-
fais (BUXTON, 1930; HARINGTON, 1960). Um repasto sanguíneo sa-
turante, realizado em um curto espaço de tempo, é normalmente,
suficiente para que a muda ocorra (BUXTON, 1930). A quantidade
de sangue ingerida bem como o tempo para que ocorra a muda au-
mentam progressivamente com a evolução dos estádios ninfais
(GARClA et a l . , 1975).
Recentemente foi demonstrado que não só o volume de
sangue ingerido, mas também a fonte doadora do sangue, podem
alterar o período de muda e ovipostura de R. prolixus (LIMA GO-
MES et a l . , 1984a; 1984b).
Realizada a muda imaginal, que é caracterizada princi-
palmente pelas transformações morfológicas da genitália, os adul-
tos tornam-se potencialmente maduros para a reprodução
(WIGGLESWORTH, 1970).
2 .3. SISTEMA DIGESTIVO
De acordo com RAMIREZ PEREZ (1969), o tubo digestivo
de R . p ro l i xus d i v ide -se em t rês segmentos ( f i g u r a 1):
5
Figura 1 - Vista dorsal de Rhodnius prolixus (adulto), sem
os tergitos abdominal. Promesentero ("estôma-
go"), posmesentero ("intestino"), proctodeum
("reto").
a. intestino anterior ou estomodeum, que compreende a cavidade
buca l , a f a r i n g e e o esôfago;
b. i n t e s t i n o médio ou mesentero, que compreende o promesentero
("estômago") e o posmesentero ( " i n t e s t i n o " ) ;
c. i n t e s t i n o p o s t e r i o r ou proctodeum, que compreende o saco re-
ta l e o cone anal .
2.3.1. Estomodeum
Segundo BARTH (1952), não e x i s t e nos i nse tos sugado-
res , uma boca v e r d a d e i r a , mas sim uma boca f unc i ona l que cor -
responde ao lugar onde o jogo de e s t i l e t e s mandibu lares aban-
dona o sulco l a b i a l e penetra na ext remidade a n t e r i o r da cabe-
ça. A cavidade seguinte, limitada em cima pelo pós-clípeo e
nos lados pelas lâminas maxilares, deve ser considerada como a
cavidade bucal .
Dorsalmente apresenta uma lâmina chamada "epifaringe",
a qual é uma invaginação das paredes do pós-clípeo. Também se
conhece como lâmina perfurada porque apresenta orifícios onde
se encontram as células gustativas que são receptores químicos
encarregados de controlar a alimentação. Ventralmente está for-
mado por outra lâmina triangular, chamada "hipofaringe'', que
une os estiletes que vem separados de ambos os lados da farin-
ge, permitindo por sua vez a entrada do meato salivar e do ca-
nal s a l i v a r das max i las (RAMIREZ PEREZ, 1969).
7
A faringe é uma estrutura fortemente esclerotizada, que
se encontra entre a cavidade bucal e o esôfago. Em sua extremi-
dade anterior se reduz a um sulco que penetra no canal alimen-
t a r das m a x i l a s .
O esôfago é um tubo simples que nasce na extremidade
p o s t e r i o r da f a r i n g e e desemboca no p r o m e s e n t e r o .
2 . 3 . 2 . Mesen te ro
O promesentero ou "estômago" é a parte dilatada do tu-
bo digestivo que se encontra entre o tórax e o quinto segmento
abdominal (figura 1). Segundo WIGGLESWORTH (1934), esse órgão
é considerado como um saco de armazenamento, porque nessa re-
gião o alimento é concentrado (pela absorção do excesso de lí-
quido) e retido por várias semanas. Sua forma e cor variam no-
tavelmente de acordo com o grau de alimentação: em jejum exibe
uma cor verde-clara com bolhas de ar no seu interior. Imediata-
mente após a alimentação se torna vermelho; depois de algumas
semanas t o r n a - s e com cor v e r d e - e s c u r a .
Apesar de ser relatado que o promesentero seja um ór-
gão de armazenamento de sangue ingerido, atualmente têm sido
encontradas nessa região enzimas que agem sobre nucleotídios (Rl-
BEIRO & GARCIA, 1979) e carboidratos (RIBEIRO & PEREIRA, 1984).
Uma revisão detalhada sobre o assunto foi recentemente publica-
da (GARCIA, 1985) .
O posmesentero ou "intestino" é um tubo que se comuni-
ca posteriormente com o reto ao nível do desembocamento dos qua-
tro tubos de Malpigh. Originalmente apresenta numerosas circun-
voluções (figura 1). No posmesentero se processa a digestão de
proteínas, carboidratos e lipídeos (GARCIA, 1985).
2.3.3. Proctodeum
A ampola retal é uma estrutura piriforme que consti-
tui a úItima parte do tubo digestivo. Segundo WIGGLESWORTH (1932),
esse órgão desempenha importante papel na absorção de água e
na recuperação de minerais.
2.4. ALIMENTAÇÃO
Na seleção do alimento, a seqüência comportamental de-
sempenhada pelo inseto hematófago se resume em: orientação;
início da alimentação (degustação); continuação do repasto (in-
gestão); e término do repasto (GALUN, 1975).
2.4.1. Orientação
Na localização do hospedeiro, os insetos hematófagos
parecem ser capazes de discriminar gradientes de temperatura no
ar. WIGGLESWORTH & GILLET (1934a; 1934b) demonstraram que as
antenas de R. prolixus são responsáveis pela orientação do in-
seto para a fonte de calor. FRIEND & SMITH (1975) observaram
que para essa espécie o jejum prolongado também é um fator im-
portante para tornar o inseto mais sensível ao estímulo térmi-
co. Nesse inseto, outros fatores de atração têm sido também ob-
servados, como por exemplo, o dióxido de carbono (FRIEND &
SMITH, 1977) e fezes depositadas por ninfas recém-engurgitadas
(SCHOFIELD & PATTERSON, 1977).
2 . 4 . 2 . I n í c i o da a l imentação (degustação)
Uma vez que o R. prolixus esteja sobre a fonte de
alimento, possivelmente, o contato da antena com a superfície
aquecida da pele desencadeia o reflexo da picada (WIGGLESWORTH
& GILLET, 1934a).
As mandíbulas perfuram a pele permintindo assim a ex-
tensão e movimentação das maxilas para o encontro de um vaso
sanguíneo (LAVOIPIERRE et al., 1959). Segundo RIBEIRO & GARCIA
(1979, 1980, 1981), RIBEIRO (1982) e RIBEIRO & SARKIS (1982) a
localização de um vaso sanguíneo em curto espaço de tempo é tam-
bém facilitada pela salivação do inseto. Esses autores mostra-
ram que a saliva contém substâncias biologicamente ativas que
aumentam o tempo de sangramento dos vasos. SMITH & FRIEND (1970),
utilizando "comedouros" artificiais, observaram que nessa fase
da alimentação o inseto experimenta pequenas amostras de dieta
(fase de degustação) que, ao entrarem em contato com certos
r e c e p t o r e s , podem e s t i m u l a r a fase de i nges tão .
2 . 4 .3 . Cont inuação do repas to ( i n g e s t ã o )
Desde 1959, tem sido observada a ação de certos nucleo-
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tídios fosfatados como estimuladores da alimentação para um
grande número de artrópodes hematófagos (HOSOI, 1959; GALUN,
1966; GALUN & MARGALIT, 1969). FRIEND (1965), através de um
estudo dos possíveis compostos que poderiam estimular a alimen-
tação de R. prolixus, observou que praticamente todos os nu-
cleotídios di e trifosfatados, na concentração de 1mM, indu-
ziam a ingestão de uma solução de NaC1 O,15M. SMITH & FRIEND
(1970) demonstraram, por método eletrofisiológico, que a ativi-
dade prolongada e regular de bomba faringeana resultava no en-
gurgitamento do inseto e que tal comportamento era dependente
da presença das substâncias estimuladora da alimentação. RIBEI-
RO & GARClA (1979). e SMITH et al., (1980) observaram a presença
na secreção salivar de R. prolixus de uma enzima que hidroli-
zava o ATP a AMP (atividade apirásica). Recentemente, MACARI-
NI (1983) demonstrou que o difosfoglicerato na concentração de
µM estimulava a alimentação de R. prolixus. Este autor sugeriu
que essa substância seria o principal fagoestimulante fisioló-
gico para os insetos hematófagos, devido a sua presença em al-
tas concentrações nos eritrócitos e a sua resistência à hidró-
l i s e pela ap i r ase .
Por muito tempo, os estiletes mandibulares e maxila-
res dos hemípteros foram considerados estruturas cuticulares
inertes que não possuiam nenhuma inervação, apresentando um pa-
pel passivo no transporte do alimento líquido. O fato das re-
giões antenais e tarsais não entrarem em contato com as dietas
levou os pesquisadores a sugerir que a localização dos quimior-
receptores do canal alimentar seria interna. KRAUS (1957) des-
11
creveu em R. prolixus um grupo de estruturas inervadas dorsais
e anteriores à bomba faringeana e as denominou de sensilas epi-
faringeana. PINET (1963, 1968) observou a presença de oito sen-
silas localizadas nessa área, tendo FRIEND & SMITH (1972) con-
cluído que esses receptores respondem a fatores químicos do
sangue, podendo induzir a alimentação em R. prolixus.
A teoria proposta para explicar o estímulo químico se-
r ia que a molécula estimuladora (fagoestimulante) poderia in-
teragir com sítios moleculares específicos na superfície da mem-
brana dos receptores, induzindo, consequentemente, alguma mu-
dança conformacional ou eletrônica à qual a célula responderia
eventualmente pela produção de um potencial elétrico (FRIEND
& SMITH, 1972).
O sistema quimiorreceptor envolvido neste processo
transmite a informação da composição química do alimento ao sis-
tema nervoso central, codificando-a por impulsos nervosos. Al-
guns trabalhos demonstraram que cada espécie tem um sistema re-
ceptor fisiologicamente característico e distinto de outras
espécies de insetos (SCHOONHOVEN, 1972; DETHIER, 1982).
2 . 4 . 4 . Término do repas to
MADDRELL (1963) elucidou a questão da finalização do re-
pasto quando, tendo seccionado os cordões ventrais de ninfas de R.
prolixus, observou que os insetos assim operados se alimenta-
vam com quantidade de sangue superior à observada nas ninfas
não operadas. Esse autor concluiu que o processo de ingestão é
12
normalmente encerrado por informação nervosa proveniente de re-
ceptores de estiramento local izados na cu t ícu la abdominal.
2.5. FAGOINIBIDORES
As plantas, de maneira geral, produzem substâncias de-
nominadas secundárias que as protegem do ataque de pragas. Al-
guns destes compostos, quando ingeridos pelos insetos, são ca-
pazes de alterar a fisiologia de algumas espécies.
O papel das substâncias secundárias no metabolismo bá-
sico das plantas produtoras não tem sido satisfatoriamente ex-
plicado, não sendo provável o desempenho de uma função especí-
fica (DETHIER, 1982; SCHOONHOVEN, 1972). Entretanto, como es-
tratégia coevolutiva na defesa contra insetos, as substâncias
secundárias podem ter atividade de hormônios, anti-hormônios
(BOWERS et al., 1976; BOWERS, 1984), e/ou agir como inibidores
da alimentação ("antifeedant ou fagoinibidor) (FRAENKEL, 1959;
DETHIER, 1982).
Fagoinibidores são compostos que, quando provados ou
ingeridos pelo inseto, previnem ou interrompem a atividade de
alimentação, temporária ou permanentemente, algumas vezes le-
vando à morte o inseto pelo jejum prolongado (FRAENKEL, 1959,
1969; CHAPMAN, 1974).
Alguns autores descrevem o efeito "antifeedant" em
concentrações (ppm) que reduzem a ingestão do alimento em 50%
(BERNAY & CHAPMAN, 1978) e outros consideram "antifeedant" quan-
do a inibição da alimentação atinge níveis de 80-100% (DETHIER,
13
1982).
Os compostos fagoinibidores são virtualmente encontra-
dos em quase todas as classes químicas mas, especialmente, al-
guns terpenos e alcalóides têm sido relatados como potentes
inibidores da alimentação de insetos (MUNAKATA, 1977; VIGNERON,
1978).
Segundo NAKANISHI (1980), os compostos purificados com
atividade "antifeedant", geralmente, exibem outras atividades,
tendo sido utilizado este parâmetro, inclusive, para o isola-
mento rápido de substâncias bioativas como anti-hormônios de
insetos, antibióticos, antitumorais, etc.
O mecanismo de ação de substâncias fagoinibidoras tem
sido investigado, principalmente, por métodos comportamentais e
eletrofisiológicos (DETHIER, 1982).
2.6. PRECOCENO
Em 1976, BOWERS et al. reveleram a descoberta de dois
compostos com atividade de anti-hormônio juvenil de insetos em
extrato da planta Ageratum houstonianum. Essas substâncias fo-
ram identificadas como 7-metoxi 2,2-dimetil-cromeno e 6,7-di-
metoxi 2,2 dimetil-cromeno, sendo denominadas, respectivamente,
de precoceno 1 (PI) e precoceno II (PII) por promoverem, prin-
cipalmente, a metamorfose precoce em insetos. Posteriormente,
BOWERS (1977) obteve, pela síntese de análogos, uma variedade
de compostos mais ativos que os precocenos naturais (Pl e PII) e
14
observou que os elementos estruturais importantes para o aumen-
to da atividade eram o anel cromeno e a substituição metoxi na
posição 7 por um radical etoxi, obtendo o 6-metoxi 7-etoxi
2,2-dimetil-cromeno (etoxiprecoceno II, EPII). Alguns traba-
lhos mostraram posteriormente ser o EPII o análogo mais ativo
para algumas espécies de insetos (BOWERS, 1977). Na figura 2
estão representados o PI, P I I , EPII e cromano do P I I .
A primeira revelação na literatura apresentando o pre-
coceno como uma possível substância inibidora da alimentação
foi de SLAMA (1978). De fato, esse autor demonstrou que o PII
inibia o crescimento e ovipostura de Pyrrhocoris apterus e
Dysdercus cingulatus de maneira semelhante ao tratamento da die-
ta dessas espécies com Miristicina e Elemicina, dois clássicos
"antifeedant". REMBOLD et al. (1979), observando o desenvolvi-
mento de larvas de Apis mellifera tratadas com PII, reportaram
que as doses maiores do composto induziam um menor ganho de pe-
so corporal em relação ao grupo controle, sugerindo o efeito
"antifeedant". Recentemente, foi demonstrado que altas con-
centrações de PII, adicionadas à dieta de R. prolixus, dimi-
nuiam a quantidade de alimento ingerido pelo inseto (AZAMBUJA
et a l . , 1981a).
Têm sido reportados na literatura inúmeros efeitos de
precocenos sobre insetos, podendo-se destacar: a indução da me-
tamorfose precoce em algumas espécies pertencentes às ordens
Hemiptera, Homoptera e Orthoptera (BOWERS et al., 1976; CHENEVERT
et al., 1981; MIALL, 1980; BELLES & BALDELLOU, 1983; AZAMBUJA
et al., 1981a; MACKAUER et al., 1979; HALES & MITTLER, 1981).
15
Figura 2 - Estrutura química de 7-metoxi-2,2 dimetilcromeno
(PI); 6,7-dimetoxi-2,2 dimetilcromeno (PII); 7-eto-
xi-6-metoxi-2,2 dimetilcromeno (etoxi PII), e 6,7-
-dimetoxi-2,2 dimetilcromano.
16
Em Coleoptera, Diptera, Hemiptera e Orthoptera, os
precocenos, dependendo da espécie, promovem a inibição do de-
senvolvimento ovariano e, em alguns casos, esterilidade perma-
nente (BOWERS et al., 1976; KELLY & FUCHS, 1978; LANDERS &
HAPP, 1980; JUDSON et al., 1979; BOWERS & ALDRICH, 1980; TARRANT
et a l . , 1982; FREYEREISEN et a l . , 1981).
Outras atividades induzidas pelos precocenos foram
também evidenciadas, como: atividade ovicida (BOWERS et al.,
1976; TARRANT & CUPP, 1978), diminuição da atividade neurosse-
cretora (UNNITHAN et al., 1978; MASNER et al., 1979; AZAMBUJA
et al., 1981b) e a indução da diapausa (BOWERS et al., 1976).
OHTA et al. (1977) verificaram transformações metabó-
licas do precoceno em várias espécies de insetos. Usando pre-
coceno marcado no radical metil (C14), esses autores demonstra-
ram que 13-24% do C14 não eram recuperados em Trichoplusia ni,
o que sugeria a descarboxilação do composto. Apesar da caracte-
rização dos metabólitos in vivo ser complexa, esses mesmos au-
tores observaram que o principal produto de detoxicação era o
3,4 d i o l ( f i g u r a 3) .
SODERLUND et al. (1980), em investigação in vitro uti-
lizando corpo gorduroso (tecido que possui alta atividade de
monooxigenases) de T. ni, identificaram vários derivados meta-
bólicos do precoceno (inclusive o 3 cromanol) que concordavam
com os compostos observados por OHTA et al. (1977) (figura 3).
PRATT et al. (1980) demonstraram que o corpus allatum
de fêmeas adultas de Locusta migratoria metabolizava o PI for-
17
Figura 3 - Modelo proposto para a biotransformação de preco-
ceno II (BOWERS, 1980; SODERLUND et al., 1980).
18
necendo misturas geométricas cis e trans de dihidrodióis e que
parte da amostra do precoceno podia ser encontrada covalente-
mente l igada a macromoléculas da g lându la .
Em T. ni, SODERLUND et al. (1980) pela observação do
rápido aparecimento do diol sugeriu que a dupla ligação 3,4 so-
fresse uma epoxidação, pela atividade de enzimas do tipo oxida-
se, seguida de uma rápida hidratação (figura 3). Isto pode ser
confirmado pela obtenção de epoxiprecoceno utilizando bromohi-
drina em condições anidras (SODERLUND et al., 1980; JENNINGS &
OTTRIDGE, 1979). De fato, o epóxido pode ser hidratado ou rea-
g i r com qualquer n u c l e o f í l o instantaneamente (BOWERS, 1980).
Resumindo, o precoceno é epoxidado hidratado, conjuga-
do e eliminado do organismo do inseto. Uma pequena quantidade
do composto que alcança o corpus allatum pode ser rapidamente
epoxidada (provavelmente pela alta atividade da enzima que epo-
xida o hormônio juvenil), e então, instantaneamente, reagir com
componentes celulares através de ligações covalentes promoven-
do a destruição da glândula (BOWERS, 1980; BROOKS et al., 1979)
(Figura 3)
2.7. AZADIRACHTINA
A planta Azadirachta indica, uma espécie de árvore dis-
tribuída na Ásia e África, tem sido amplamente utilizada na me-
d i c i na e no con t ro le de pragas ag r í co las (REMBOLD, 1980).
Na literatura está reportado, em um dos primeiros tra-
balhos sobre essa planta, que sua semente causa uma inibição da
19
alimentação de L. migratoria (PRADHAN et al., 1962). Além des-
se efeito, alguns autores têm demonstrado que o extrato da se-
mente pode causar, dependendo da espécie de inseto tratado, a
inibição do crescimento perda de fecundidade e aumento da mor-
t a l i d a d e (STEFFENS & SCHMUTTERER, 1982; ZEBITZ, 1984).
STEFFENS & SCHMUTTERER (1982) observaram que a exposi-
ção de larvas de Ceratitis capitata, a extrato da semente de
A. indica resultava no aumento do período larval e mortalida-
de. Em Aedes aegypti, ZEBITZ (1984) demonstrou que a atividade
do extrato aumentava com o decréscimo da polaridade do sol-
vente orgânico empregado para a extração dos componentes ati-
vos da A. indica.
MEISNER et al., (1983) observaram que as larvas de
Spodoptera litoralis submetidas a dieta compostas de folhas tra-
tadas por pulverização com extrato metanólico seco resultava em
perda de peso, quando se comparava ao peso do inseto controle
alimentado com dieta normal. O extrato testado dessa forma de-
terminou um forte efeito "antifeedant", sendo também evidencia-
do com um regulador do crescimento dessa espécie, pois, o trata-
mento i n i b i u a pupação e promoveu d i s t ú r b i o s na muda.
As estruturas químicas dos principais compostos puri-
ficados de A. indica foram elucidados e atribuídos por LAVIE
et al. (1967) como sendo o meliantriol e por BUTTERWORTH &
MORGAN (1968) e ZANNO et al. (1975) como sendo a azadirachtina
(figura 4).
REMBOLD et al. (1980), na tentativa de isolar os com-
postos de A. indica que poderiam causar distúrbios de metamor-
20
Figura 4 - Estrutura química parcial da Azadirachtina A
(VIGNERON, 1978.
21
fose, independentemente da inibição da alimentação, purifica-
ram e obtiveram uma série de frações que induziam atraso no de-
senvolvimento larval e deformação de pupas e adultos de Ephestia
kuchniella e Apis mellifera. Em Epilachna verivestis, o tra-
tamento promoveu alta percentagem de mortalidade. Posteriormen-
te, REMBOLD et al. (1982), purificando azadirachtina por croma-
tografia Iíquida de alta pressão, demonstraram que o composto
é um potente regulador do crescimento de insetos e possui esta
propriedade independentemente da atividade "antifeedant", pois,
na sua forma pura, o composto não demonstrou nenhuma atividade
de i n i b i d o r da a l imentação nas t r ês espécies ho lome tabó l i cas .
Entretanto, SIEBER & REMBOLD (1983), utilizando o úl-
timo estádio ninfal de L. migratória, notaram que o consumo de
alimento era influenciado pela azadirachtina de forma dependen-
te da concentração da substância na dieta, e que as ninfas sub-
metidas a injeção do composto apresentavam ganho de peso corpo-
ral normal mas tinham uma inibição da ecdise pelo bloqueio da
s ín tese de e c d i s t e r ó i d e s .
Nessa mesma espécie, foi também demonstrado que a aza-
dirachtina alterava a ovogênese, tendo-se concluído que o com-
posto interferia na regulação neuroendócrina e diminuia a sín-
tese de e c d i s t e r ó i d e s (REMBOLD & SIEBER, 1981).
Recentemente, GARCIA & REMBOLD (1984) demonstraram o
efeito da azadirachtina sobre o desenvolvimento de 4º estádio
de R. prolixus. A administração oral do composto levou os au-
tores a estabelecer uma dose-resposta para o efeito "antifeedant"
22
e a inibição da muda. GARCIA & REMBOLD (1984) assim puderam cal-
cular as doses efetivas (DE50) que inibem 50% desses dois parâ-
metros biológicos, e concluíram que a diferença entre elas foi
de 650 vezes. Este dado enfatiza que as atividades "antifeedant"
e inibidora da muda da azadirachtina são fisiologicamente dis-
t i n t o s e independentes e n t r e s i .
2 .8 . DIGESTÃO DE SANGUE
A digestão, em insetos hematófagos, é a seqüência de
modificações que o sangue ingerido sofre até ser transformado em
moléculas s imples que podem ser u t i l i z a d a s pelo organismo.
2 . 8 .1 . O processo h e m o l í t i c o
Segundo BALASHOV (1972), a hemoglobina é essencial pa-
ra suprir as necessidades nutricionais dos insetos hematófagos,
por constituir mais de 50% das proteínas totais do sangue. Entre-
tanto, pouca atenção tem sido dada aos fatores responsáveis pe-
lo processo hemolítico e seu papel fisiológico na digestão dos
i nse tos hematófagos.
Um dos primeiros trabalhos que enfoca esse aspecto foi
realizado por YORKE & MACFIE (1924), quando tentaram demons-
trar atividade hemolítica em homogenatos de glândulas saliva-
res de Glossina taquinides, Culex pipiens fatigans e Aedes
aegypti. Entretanto, não foi evidenciada alteração nas hemácias
incubadas com os homogenatos das glândulas. ADLER & THEODOR
23
(1926), trabalhando com Phlebotomus papatasi também não encon-
traram atividade hemoIítica em extratos de glândulas saliva-
res.
Em 1975, GEERING reportou que homogenato de intestino
médio de A. aegypti apresentava um fator Iítico para hemácias
de coelho que era inibibo por SBTI (inibidor de tripsina). Es-
se autor sugeriu a participação de proteínas digestivas no pro-
cesso hemolítico e, embora não tenha comprovado, também suge-
r iu a existência de fosfol ipases.
GOODING (1977) demonstrou a presença de uma hemolisina
na porção digestiva do intestivo médio de Glossina morsitans.
Esse autor evidenciou o agente hemoIítico no lúmen do intesti-
no e observou que em fêmeas em jejum, as amostras intestinais
apresentavam pequena atividade hemoIítica que aumentava com o
repasto sanguíneo, atingindo a um máximo de efeito Iítico 24-
48 horas após a alimentação.
SPATES & DELOACH (1980) demonstraram também uma ativi-
dade hemolítica em homogenato de intestino médio de Stomoxys
calcitrans. Segundo os autores, essa atividade era aumentada
pela ação de tripsina e ligeiramente inibida pelo SBTI. Na ten-
tativa de purificar a hemolisina, SPATES & DELOACH (1981) ob-
servaram alta atividade hemolítica em extrato lipídico do in-
testino. Posteriormente, SPATES et al. (1982) atribuíram a áci-
dos graxos livres, principalmente os ácidos palmítico, palmito-
leico e oleico, a responsabilidade pelo processo hemoIítico. Se-
gundo SPATES et al. (1982), esses ácidos graxos, por suas ca-
24
racterísticas semelhantes a detergentes, em altas concentra-
ções, l i s a r i a m as hemácias inger idas pelo i nse to .
2.8.2. Mecanismos hemolíticos
Vários mecanismos têm sido postulados para explicar o
rompimento da membrana de hemácias. O mais simples deles seria
uma modificação da osmolaridade do alimento, na região do tubo
digestivo, onde o sangue está sendo concentrado. Um segundo me-
canismo seria a interação direta de moléculas na membrana dos
eritrócitos. Assim, por exemplo, é explicada a ação de certos
ácidos graxos livres com agente Iítico (SPATES et al.,1982), e
ainda, a ação de peptídios básicos como a melitina e a barbato-
lisina, purificados de insetos Hymenoptera. Esses peptídios não
somente interagem com os lipídios da membrana, como promovem a
diminuição da tensão interfacial entre a solução salina e a su-
perfície da hemácia (SCHMIDT, 1982). A ação físico-química dos
peptídios Iíticos sobre a superfície celular resulta no aumen-
to da permeabilidade do eritrócito (HABERMANN, 1972). Um ter-
ceiro mecanismo possível de hemólise seria a ação de enzimas do
tipo fosfolipase, que hidrolisam as ligações ésteres dos com-
postos fosfatídicos (fosfatidilcolina, fosfatidilserina ou fos-
fatidiletanolamina) liberando ácidos graxos e produzindo um de-
rivado liso, o monoacilfosfatídeo (BEARD, 1963; HABERMANN, 1971).
Exemplificando, a lisolecitina (composto lítico) pode ser for-
mada pela hidrólise da ligação 2 acil da fosfatidilcolina (le-
citina), sendo essa reação catalisada pela fosfolipase A.
25
No modelo de dupla camada da membrana, cerca de 30%
dos lipídios são constituídos de fosfolipídios, sendo que os
resíduos de ácidos graxos (hidrofóbicos) estão voltados para
dentro da membrana, enquanto os grupamentos fosforil-base (hi-
drofílicos) formam a superfície externa da membrana. Admite-se
que devido a estar o sítio de ataque da enzima protegido, a
fosfolipase A não lisa diretamente os eritrócitos lavados e
mantidos em soluções isotônicas. Nessa condição, a fosfolipa-
se A induz lise de eritrócitos somente se um substrato acessí-
vel for adicionado ao meio, como por exemplo, gema de ovo (al-
tamente rica em lecitina) ou lipoproteínas do soro. Assim, a
hemólise indireta resultaria da formação de lisocompostos no
meio de incubação (HABERMANN, 1971).
Por outro lado, LANKISCH & VOGT (1972) demonstraram
que, em meio ligeiramente hipotônico, a fosfolipase A lisa eri-
trócitos lavados, sem necessidade de adicionar-se substrato ao
meio. Da mesma forma, se a melitina era incubada juntamente
com a fosfolipase A, ocorreria a potencialização do efeito he-
molítico. Esses autores sugeriram que, em condições de desar-
ranjo estrutural da membrana, a ligação éster de posição 2 (sí-
tio de ataque da fosfolipase A) tornava-se exposta para a a-
ção da enzima. Entretanto, não está claro se a hemólise ocor-
ria pela destruição dos fosfolipídios estruturais, ou pela for-
mação de lisocompostos liberados, ou ainda, se ambos os efei-
tos participariam da atividade biológica da fosfolipase A
(HABERMANN, 1972).
26
2.9. IMUNOLOGIA DE INSETOS
Os insetos possuem um sistema imune que em alguns ca-
sos protege o organismo contra agentes agressores. A manifesta-
ção mais óbvia da imunidade de invertebrados é demonstrada pe-
los hemócitos. A introdução de agentes estranhos na cavidade
corporal promove adesão de hemócitos ao objeto e, dependendo
do tamanho do agente , sua f a g o c i t o s e ou sua encapsulação (LACKIE,
1980, 1981a). Ambos os fenômenos têm sido amplamente investiga-
dos, sendo bem conhecida a ultra-estrutura do envolvimento ce-
lular do sistema imune de invertebrados (LACKIE, 1981b); RATCLIFE,
1982).
Em uma primeira etapa, ocorre a ativação de fenoloxi-
dases localizadas no interior dos hemócitos e sua liberação na
hemolinfa, promovendo a formação de quinonas e melanina de fe-
nóis p r e e x i s t e n t e s (LACKIE, 1980).
Assim, a encapsulação e formação de nódulos é, freqüê-
temente, acompanhada de deposição de melanina ao redor do obje-
to i nvaso r (LACKIE, 1981b).
Tem sido reportado que em algumas espécies a fenoloxi-
dase está associada à resistência ao parasita, sendo que, se nos
insetos hospedeiros essa enzima for inibida, sua resistência i-
munológica é reduz ida (SODERHALL, 1982).
A reação a um agente invasor bacteriano e subsequente
melanização pode prevenir o crescimento celular devido não só
à presença de quinonas, que agem como verdadeiros "desinfetan-
27
tes", mas também como pré-requisito para adesão de hemócitos.
A indicação recente de que a ligação da fenoloxidase
e/ou outras proteínas a superfície estranha é atrativa, pois
tem sido considerada a implicação de opsoninas na fagocitose
em insetos (SODERHALL, 1982).
Em hemolinfa de insetos tem sido também demonstrada a
presença de outros agentes humorais que atuam na defesa con-
tra organismos invasores (DALES, 1979; BRIGGS, 1958; BOMAN &
STEINER, 1981).
Em insetos, de uma maneira geral, à imunidade humo-
ral é caracterizada pelo aparecimento in vivo de atividade an-
tibacteriana e sua concomitante proteção inespecífica contra
i n fecções secundár ias (BOMAN & HULTMARK, 1981).
Quanto ao aspecto bioquímico, no que concerne à imu-
nidade livre de células, extensivos estudos têm sido feitos
utilizando, principalmente, larvas de lepidópteras (HULTMARK
et al., 1980; HOFFMANN et al., 1981). Em Galleria melonella,
Bombyx mori (POWNING & DAVIDSON, 1973), Spodoptera eridania
(ANDERSON & COOK, 1979) e Hyalophora cecropia (HULTMARK et
al., 1980) um dos fatores humorais com atividade antibacteria-
na tem sido identificados como enzimas do tipo lisozima. Nes-
ses insetos os autores puderam relacionar o aparecimento da
a t i v i d a d e enz imát i ca com a inocu lação de mic ro rgan ismos.
De maneira geral, o termo lisozima pode ser aplicado
a acetilmuromidase, que hidrolisa a ligação glicosídica entre
o ácido N-acetilmurâmico e N-acetil-D-glicosamina, constituin-
28
tes da camada glicopeptídica da parede celular de bactérias e
cujas propriedades químicas, tais, como, ponto isoelétrico, pe-
so molecular e estabilídade, sejam bem definidas (GHUYSEN et
a l . , 1966).
O outro fator humoral de defesa de insetos, a que não
tem sido dada muito atenção pelos pesquisadores, é constituído
pelas aglutininas. Elas recebem este nome por sua habilidade
de aglutinar in vitro eritrócitos de vertebrados e, em alguns
casos, ou t ros t i p o s c e l u l a r e s (LACKIE, 1980).
É sabido que, a maioria das aglutininas são do tipo
lectina, isto é, moléculas proteicas cujos receptores se ligam
a carboidratos específicos (SHARON & LIS, 1972). Em hemolinfa
de Periplaneta americana e Schistocerca gregaria, foi observa-
da a presença de hemaglutininas e dependendo da espécie de in-
seto observada, a aglutinação in vitro poderia ser inibida
por açúcares (LACKIE; 1981b).
Recentemente, PEREIRA et al. (1981) observaram a ati-
vidade de diferentes lectinas específicas para alfa e beta ga-
lactose em hemolinfa de R. prolixus. É interessante ressaltar
que os autores detectaram receptores de lectinas em epimasti-
gotas mas não em tripomastigotas de Trypanosoma cruzi.
Entretanto, é ainda discutida a possibilidade de as
aglutininas serem consideradas um dos fatores da imunidade hu-
moral (LACKIE, 1981a). Em Sarcophaga peregrina já foi demons-
trada a indução in vitro do aparecimento dessas moléculas (KOMANO
et a l . , 1983).
29
Recentemente, foi purificado, de hemolinfa de pupas
imunizadas de H. cecropia, uma família de peptídios antibac-
terianos, denominados de cecropinas A, B, C, D, E e F (HULTMARK
et al., 1980, 1982; STEINER et al., 1981). Esses peptídios são
fortemente básicos, de baixo peso molecular (em torno de 4000
daltons), termoestáveis, e com alto grau de homologia em suas
e s t r u t u r a s p r i m á r i a s (BOMAN & STEINER, 1981).
As cecropinas A e B, primeiramente chamadas de P9A e
P9B por HULTMARK et al. (1980), tiveram suas seqüências escla-
recidas por STEINER et al. (1981), tendo sido demonstrada a
presença de 37 resíduos de aminoácidos em ambas as cecropinas.
As observações comparativas entre a cecropina e a me-
litina (de veneno de abelha) levaram os pesquisadores a con-
cluir que ambas as moléculas contêm uma parte fortemente bá-
sica e uma longa cadeia hidrofóbica. Entretanto, a polaridade
de ambas é contrária: enquanto a porção N terminal da cecropi-
na contêm resíduos de aminoácidos básicos, na melitina os úl-
timos resíduos da porção C terminal contêm a seqüência Lis-
Arg-Lis-Arg. Quanto à atividade Iítica, esses peptídios lisam
(em concentrações menores do que l µ M) algumas bactérias Gram
p o s i t i v a s e Gram nega t i vas (BOMAN & HULTMARK, 1981).
HULTMARK et al. (1982), em prosseguimento aos estu-
dos de proteínas com atividade antibacteriana de hemolinfa de
H. cecropia demonstraram seis formas ativas de proteínas indu-
zidas com pesos moleculares entre 20000-23000 daltons. Esses
autores apresentaram uma terceira classe de proteína antibac-
30
teriana do sistema imune de H. cecropia com o nome de Atacina
(HULTMARK et al., 1983).
Assim, as substâncias humorais, quimicamente defini-
das, implicadas no sistema imune de insetos, são representadas
por três classes de proteínas com propriedades distintas: liso-
zimas, cecropinas e atacinas.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. REAGENTES E OUTROS MATERIAIS
Neste trabalho, os reagentes tiveram as seguintes pro-
cedências.
Os precocenos II e análogos: Precoceno I (Sigma Chemi-
cal Co). Precoceno II, etoxiprecoceno II e cromano de precoce-
no II foram gentilmente fornecidos pelo Dr. W.S. BOWERS. New
York State Agriculture Experimental Station, Cornell University,
Geneva, N.Y. USA.
As azadirachtina e análogos: Azadirachtina A, Azadi-
rachtina B e 7-acetilazadirachtina A foram gentilmente doadas
pelo Dr. H. REMBOLD, Max-Planck I n s t i t u t f u r B ioch imie , FRG.
As proteínas: Tripsina (Worthington Biochemical Co).
Azocaseína e SBTI (inibidor de tripsina) (Sigma Chemical Co).
Soroalbumina bovina cristalina (Pentex Biochemicals). Hemoglobi-
na humana purificada gentilmente cedida pelo Dr. J. D. MACARINI,
Departamento de B io log ia Geral , UFF, N i t e r ó i , RJ.
32
Outros reagentes: Coomassie Blue G-250, SP-Sephadex
C-50 120 mesh, Feniltiocarbamida, Adenosina Trifosfato, Lisozi-
ma de ovo, Micrococcus lisodeikticus (Sigma Chemical Co). Bio-
gel P-6 e Biogel A 0,5m (Bio-Rad Lab). Kit para dosagem de he-
moglobina (Roche). Bacto-Peptona, Agar (Difco). Extrato de Le-
vedura (B iob rás ) .
Todos os demais reagentes eram de grau a n a l í t i c o .
3.2. EQUIPAMENTOS
Este estudo envolveu o emprego de:
Centrífugas: International, modelo HN. Beckman, mo-
delo J2-21. Eppendorf, modelo 5414.
Espectrofotêmetro: Hitachi Perkin-Elmer 139 (ultravio-
l e ta e v i s í v e l ) .
Outros equipamentos: Incubadora BOD Fanen, modelo 347.
Banho de água circulante, modelo Masterline 2095 Forma Scien-
tific. Bloco aquecedor VanLab, modelo 13259-005. Banho de tem-
peratura constante Fanen Ltda. Balança analítica Mattler, mode-
Io AE 100. Medidor de pH Micronal B 274. Microscópio estereos-
cópico Carl Zeiss. Microscópio ótico Carl Zeis Jena. Bomba pe-
ristálica LKB 2120. Coletor de frações LKB 2112 Red Rac. Micro-
pipetas e pipetas automáticas Gilson e Finnpipette. Microsse-
r ingas Hamilton Co.
33
3.3. ESTABELECIMENTO DA COLÔNIA DE Rhodnius prolixus
Foram usados insetos de uma colônia de R. prolixus,
mantida em laboratório na temperatura de 28ºC e 60-70% de umi-
dade relativa. Os insetos eram, periodicamente, alimentados com
sangue humano citratado ou sangue de ovelha desfibrinado, atra-
vés de um "comedouro" artificial descrito por GARCIA et al.
( 1 9 8 4 ) .
3.4. ALIMENTAÇÃO E PREPARO DAS DIETAS
Ninfas de 4º estádio de R. prolixus foram separadas ao
acaso da colônia e mantidas em jejum por 20-30 dias. Após esse
p e r í o d o foram c o n s t i t u í d o s grupos de 20-35 i n s e t o s que, e x p o s -
tos ao "comedouro" artificial, sugaram amostras de sangue huma-
no ou dietas artificais, nas quais foram adicionados os compos-
tos a serem t e s t a d o s .
3.4.1. Precoceno I, precoceno II, etoxiprecoceno II e cro-
mano de p recoceno I I
Esses compostos foram diluídos em etanol na concentra-
ção final de 50 mg/ml. Alíquotas dessas soluções foram adicio-
nadas ao sangue alimentar nas proporções adequadas para obter-
se de 10 a 100 µg dos compostos por ml de sangue. Uma dieta
artificial constituída de 1 µl de Tween 80, 30 µl de etanol con-
tendo ou não precoceno II nas concentrações de 10 a 100 µg/ml
34
e 10 ml de ATP 30-3000 µM em NaCI 0,15M também foi utilizada
nas experiências com precoceno II e análogos.
3.4.2. Azadirachtina A (Aza A), azadirachtina B (Aza B) e
7 - a c e t i l a z a d i r a c h t i n a A ( 7 - a c e t i l A z a A)
Esses compostos foram dissolvidos em etanol na con-
centração de 25 mg/ml e adicionadas ao sangue alimentar nas con-
centrações de 1 a 50 µg/ml. Aza A também foi adicionada a uma
dieta artificial constituida de 10-20 µl da solução de etanol
Aza A e 10 ml de ATP 30-3000 µM em NaCl 0,15M.
Em todas as experiências dos itens 3.4.1. e 3.4.2.,
decorridos 30 minutos após o início da alimentação (tempo ne-
cessário para o término do repasto), os insetos foram separados
para pesagem e calculados os pesos do alimento ingerido pela
diferença obtida entre as pesagens anterior e imediatamente a-
pós a a l i m e n t a ç ã o .
3 . 4 . 3 . Frações de sangue
No estudo sobre a atividade hemolítica de R. prolixus
foram usadas frações de sangue citratado de ovelha para alimen-
tação de ninfas de 5º estádio de R. prolixus. Para obtenção das
frações de plasma, eritrócitos lavados e estroma de eritrócitos
procedeu-se da seguin te maneira:
a) Obtenção de plasma e eritrócitos: após a centrifu-
35
gação do sangue a 3000 g por 10 minutos, o plasma foi separado
dos glóbulos e mantido a -20ºC até ser usado. Os eritrócitos fo-
ram lavados por cinco vezes em NaCI 0,15M, sendo que, após a
última centrifugação, os eritrócitos foram ressuspendidos em
NaCl 0,15M em volume correspondente ao volume inicial;
b) Obtenção de estroma de eritrócitos: neste caso, o
sangue citratado de ovelha foi centrifugado a 3000 g por 10 mi-
nutos, e desprezado-se o plasma. Após sucessivas lavagens das
hemácias, utilizando tampão de Na2HP04 e NaH2P04 0,01M, NaCI
0,15M, CaC12 0,45 mM, pH 7,3 as células concentradas foram li-
sadas em tampão fosfato 0,01M, NaCI 5 mM, CaC12 0,45 mM, pH 7,3,
em volume de 1:40. Utilizando este úItimo tampão para manuten-
ção do meio hipotônico, os estromas foram várias vezes ressus-
pendidos, lavados e precipitados por centrifugação de 20000 g
por 15 minutos a 4ºc, até a eliminação da hemoglobina. Após a úl-
tima centrifugação, o precipitado foi ressuspendido para o vo-
lume i n i c i a l em I í q u i d o de Tyrode contendo 30 µM de ATP.
3.5. PREPARO DAS AMOSTRAS PARA ENSAIOS DAS ATIVIDADES HEMOLÍTICA
Adultos e ninfas de todos os estádios de R. prolixus
foram dissecados, em diferentes intervalos de tempo após a ali-
mentação, preparando-se as amostras para análise da atividade
h e m o l í t i c a .
3 .5 .1 . Hemol in fa , t ec ido gorduroso e posmesentero
Preparo da hemolinfa, tecido gorduroso e posmesente-
36
ro: no 3º dia após a alimentação de ninfas de 5º estádio, rea-
lizou-se a coleta da hemolinfa com auxílio de micropipeta, após
secção de uma das coxas do inseto. Após dissecação das ninfas,
amostras do tecido gorduroso e de posmesentero foram também
extraídas. Esses materiais foram homogenizados em tampão Na2HP04
0,01M, NaC1 0,15M, CaC12 0,45 mM, pH 7,3 e centrifugados a
15000 g por 10 minutos. Os sobrenadantes foram guardados a
-20ºC para a n á l i s e p o s t e r i o r .
3 .5 .2 . Conteúdo e parede do promesentero
Os promesenteros de ninfas de 5º estádio foram reco-
lhidos, as paredes rompidas e, após centrifugação a 3000 g por
10 minutos, o sobrenadante foi diluído no tampão acima para
dar aproximadamente 0,2 g proteína/ml (preparação bruta). Após
a lavagem por centrifugação das paredes dos promesenteros, es-
tas foram homogeneizadas no mesmo tampão e centrifugadas a
15000 g por 10 minutos. O conteúdo do promesentero e o sobre-
nadante do homogeneizado das paredes foram também estocados a
-20ºC até o uso.
3 .5 .3 . Suspensão de e r i t r ó c i t o s
Os eritrócitos foram obtidos por centrifugação do san-
gue citrato a 3000 g por 10 minutos, sendo o plasma despreza-
do. Após cinco lavagens em tampão fosfato-salina isotônico, as
células foram ressuspendidas em um volume de 1:30 no mesmo tam-
37
pão (v/v) e estocadas a 4ºC até o uso (não mais de uma sema-
na).
3.6. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE HEMOLÍTICA
O grau de hemólise produzido pelas diferentes amos-
tras foi determinado pela medida da quantidade de hemoglobina
liberada dos eritrócitos no meio de incubação, tendo sido ex-
pressa em % de hemólise. Basicamente, cada tubo foi adicionado
0,1 ml de uma suspensão de eritrócitos e 0,1 a 0,4 ml do mate-
rial bruto ou purificado, ou ainda das diferentes amostras
testadas. Caso fosse necessário, o volume era ajustado com tam-
pão fosfato-salina isotônico para 0,5 ml. Após a mistura, os
tubos foram incubados a 37ºC por 2 a 4 horas e, posteriormen-
te, centrifugados a 3000 g por 10 minutos. A percentagem de he-
mólise foi determinada pelo dosagem da hemoglobina no sobrena-
dante e comparada com a hemólise total (0,1 ml de eritrócitos
adicionados em 0,4 ml de tampão e 0,1 ml desta solução foi adi-
cionada em 1,5 ml do reagente de cianometahemoglobina), padro-
nizado para 0,5 de absorbância a 546 nm. Para cada experimento,
tubos controles, constituídos de eritrócitos em tampão isotô-
nico, foram incubados juntamente com os tubos experimentais, pa-
ra verificação de uma possível hemólise espontânea. A quantida-
de de hemoglobina livre de todos os tubos foi medida antes da
incubação. Uma unidade de hemólise foi definida como a quanti-
dade de material testado necessária para liberar hemoglobina
de 50% dos eritrócitos em 4 horas de incubação a 37ºC. A con-
38
centração de hemoglobina nas preparações foi medida pelo méto-
do da cianometahemoglobina (KAMPEN & ZIJLSTRA, 1961).
3.7. ENSAIO DA ATIVlDADE PROTEOLÍTICA (CASEINOLÍTICA)
Esta atividade foi estimada em homogenatos de posme-
sentero em tampão citrato-fosfato 0,01M, pH 5,5 na proporção
final de 2 intestinos de ninfa de 5º estádio/ml. Após centri-
fugação a 15000 g por 15 minutos, esta atividade foi ensaiada
no sobrenadante, colorimetricamente, usando o método descrito
por GARCIA et al. (1981). Após a incubação de 0,5 ml do homoge-
nato e 0,5 ml da solução de azocaseina 2% por 4 horas a 37ºC, a
reação foi interrompida pela adição de 1 ml de TCA 20%. Esse
material foi centrifigado a 3000 g por 15 minutos sendo que 1
ml do sobrenadante era adicionado 1 ml da Na0H 2N. Uma unidade
caseinolítica foi definida como a amostra de enzima que formava
produtos TCA solúveis suficientes para dar uma variação de ab-
sorbância de 0,1 a 420 nm em 4 horas de incubação a 37ºC.
3.8. CULTURA DE Streptococcus mutans
As células de S. mutans cepa 6715-12 (gentilmente cedi-
da pelo Dr. CÍCERO C. FREITAS, Universidade Federal Fluminense,
Niterói, RJ) eram cultivadas em meio Bacto Peptona líquido, cons-
tituído de: 1 g de Bacto Peptona, 1 g de Extrato de levedura,
0,5 g de NaC1 em um volume final de 100 ml.
A viabilidade dessas células era testada por diluição
39
adequada da cultura líquida sendo posteriormente espalhada uma
alíquota em placa de Petri contendo meio Bacto Peptona, acres-
cido de 1,5% de agar (meio sólido), e contado o número de uni-
dades formadoras de colônicas 24 horas após incubação a 37ºC.
3.9. INOCULAÇÃO DE BACTÉRIAS E COLETAS DE HEMOLINFA
No estudo sobre o sistema imunológico humoral de R.
prolixus foram utilizados adultos (machos e fêmeas, em jejum
por 7-12 dias após a última muda. Com auxílio de uma microsse-
ringa (Hamilton, 10 µ l), era inoculado no tórax 1 µl de meio
de cultura Bacto Peptona, contendo fase estacionária de cres-
cimento de S. mutans (106 células viáveis/inseto). Os inóculos
de 103 células foram obtidos por diluição da cultura em meio
estéril (1:1000) e, aqueles constituídos de 109 células/inseto,
a cultura foi centrifugada (15000 g por 10 minutos), desprezan-
do-se parte do sobrenadante, tendo sido as células ressupendi-
das em volume adequado do meio de cultura Os insetos do grupo
c o n t r o l e receberam 1 µl do meio e s t é r i l .
Um dia após a inoculação, os insetos foram alimenta-
dos com sangue de ovelha. Em diferentes períodos após a alimen-
tação, as patas foram cortadas, sendo a hemolinfa coletada em
microcapilar calibrado e colocada em tubos Eppendorf contendo
alguns cristais de feniltiocarbamida. A hemolinfa foi centrifu-
gada a 15000 g por 5 minutos, sendo posteriormente recolhido o
sobrenadante e f o i mant ido a -20ºC até o uso.
40
3.10. ENSAIO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA
A atividade antibacteriana de hemolinfa de R. prolixus
foi ensaiada em meio de cultura de S. mutans em fase exponen-
cial de crescimento. Mantidos nesta condição a 4ºC, 3 ml do meio
que continha aproximadamente 1 X 108 células viáveis/ml cuja a
leitura da absorbância era de 0,15 a 0,20 a 540 nm, sendo pre-
viamente aquecido a 37ºC por 10 minutos e adicionados 25 µl
(0,7 mg de proteína) da amostra de hemolinfa. Após agitação em
vórtex, a mistura foi incubada a 37ºC tendo sido acompanhado o
crescimento celular pela absorbância medida a 540 nm em diferen-
tes tempos de incubação.
A atividade antibacteriana foi expressa pela leitura
da absorbância ou pelo percentual relativo da atividade antibac-
teriana comparada com a atividade da hemolinfa dos insetos do
grupo c o n t r o l e .
3.11. ENSAIO DA ATIVIDADE DE LISOZIMA
Esta atividade foi medida pela adaptação do método de
POWNING & DAVlDSON (1973). A lisozima (0,8 mg), ou hemolinfa
de insetos vacinados com S. mutans (0,3 mg de proteínas), era
adicionada a paredes celulares purificadas de Micrococcus
lysodeikticus (0,3 mg) suspendido em 1 ml de tampão fosfato
0,01M, NaC1 0,15M, pH 7,0. Após 30 minutos de incubação a 30ºC,
o grau de digestão das células era observado por variação de
absorbância a 450 nm.
41
3.12. INDUÇÃO DA PROTEÇÃO CONTRA S. mutans
Com a finalidade de obter-se informação sobre uma pos-
sível proteção, in vivo induzida por inoculação prévia de S.
mutans, foram usados grupos de 90 insetos adultos que recebe-
ram 106 células em 1 µl do meio de cultura. O grupo controle,
constituído também de grupos de 90 insetos, receberam um inócu-
lo de 1 µl do meio de cultura Bacto Peptona. Decorridos dife-
rentes intervalos, após essa primeira inoculação, 10-15 inse-
tos de cada grupo foram reinoculados com 1 µl do meio de cultu-
ra contendo 109 células. A mortalidade de cada grupo foi obser-
vada 24 horas após o segundo i n ó c u l o .
3 .13. PREPARO DAS RESINAS CROMATOGRÁFICAS
3.13.1. Preparo da resina de Biogel P-6 e Biogel A0, 5m
Na cromatografia de exclusão molecular, as resinas de
Biogel P-6 (poder de resolução de 1000 a 6000 daltons) e de
Biogel A 0,5m (poder de resolução de 10000 a 250000 daltons)
foram suspensas por 24 horas em um volume suficiente de tampão
Na2HP04 0,01M, NaC1 0,15M, pH 6,0. Após esse tempo, procedia-se
se à deaeração por aspiração com pressão reduzida para ambos
os géis. A percolação das resinas foi feita utilizando-se o
mesmo tampão.
3 . 1 3 . 2 . Preparo da res ina de SP-Sephadex C50
Neste caso a resina foi preparada por suspensão em vo-
42
lume suficiente do tampão Na2HP04 0,01M, NaCl 0,05M, pH 6,0 por
48 horas. Após várias lavagens com o mesmo tampão, procedia-se
à deaeração por aspiração com pressão reduzida. A percolação
fo i f e i t a u t i l i z a n d o - s e o mesmo tampão.
3.14. DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS
A concentração de proteínas nas diferentes amostras
foi determinada pela técnica de Coomassie blue descrita por
SPECTOR (1981) utilizando BSA como padrão. Em algumas experiên-
cias determinaram-se as concentrações de proteínas pela absor-
bância a 280 nm.
4. RESULTADOS
4.1. ESTUDO SOBRE SUBSTÂNCIAS INIBIDORAS DA ALIMENTAÇÃO
4.1.1. Efeito de prococeno II e análogos sobre a alimenta-
ção
No estudo do efeito de precoceno e análogos sobre a
alimentação de Rhodnius prolixus, foi observado que, dependen-
do da substância utilizada, ocorria diferentes graus de inibi-
ção da ingestão do alimento. Na figura 5, está demonstrado que
os grupos de ninfas de 4º estádio expostos as dietas que con-
tinham cromano de precoceno II, etoxiprecoceno II e precoceno
I, nas concentrações de 10, 30, 60 e 100 µg dos compostos por
ml de sangue, não ocorreu uma forte diminuição da quantidade
de alimento ingerido. Conforme pode ser notado, somente o pre-
coceno I I induz iu um f o r t e e f e i t o " a n t i f e e d a n t " ( f i g u r a 5) .
A tabela 1 mostra que as doses efetivas (DE50) "anti-
feedant" do cromano de precoceno II, etoxiprecoceno II e pre-
coceno I foram muito maiores (acima de 140 µg/ml) do que a do-
44
Figura 5 - Inibição da alimentação (efeito "antifeedant")
por precocenos e a análogos adicionais à dieta
de 4º estádio de Rhodnius prolixus. Cromano deprecoceno II ; precoceno I ;
precoceno II ; etoxiprecoceno ;
precoceno II em dieta artificial.
45
se de precoceno II (48 µ g/ml). Foi também observada a ativida-
de "antifeedant" na dieta artificial que continha as mesmas con-
centrações de precoceno II testadas no sangue. Nesse caso, a
DE50 de 43 µg/ml da dieta foi semelhante à observada na ali-
mentação em que se adicionava precoceno II ao sangue (DE50 de
48 µ / m l , f i g u r a 5, t abe la 1 ) .
A possibilidade da atividade "antifeedant" do preco-
ceno II em R. prolixus ser inibida pelo ATP (potente fagoesti-
mulante desse inseto) foi testada em grupos de 20-30 insetos,
que foram expostos a dieta artificial que continha 50 µg de
precoceno ll/ml e ATP nas concentrações que variaram de 30 a
3000 µM. Na tabela 2, pode ser observado que a redução da quan-
tidade de alimento ingerido induzida pelo acréscimo de precoce-
no II à dieta não foi dependente da concentração do fagoesti-
mulante tes tado .
4.1.2 Efeito de azadirachtina A, azadirachtina B e 7-ace-
t i l a z a d i r a c h t i n a A sobre a a l imentação
Na alimentação de grupos constituídos de 20-30 insetos
de 4º estádio de R. prolixus com amostras de sangue acrescidas
de azadirachtina A, azadirachtina B ou 7-acetilazadirachtina
A, foi observado que essas substâncias promoveram a inibição
da ingestão do alimento proporcionalmente ao aumento da concen-
tração dos compostos (figura 6). A tabela 3 demonstra que as
doses efetivas (DE50) obtidas para os diferentes compostos e
46
Tabela 1 - Inibição da alimentação de 4º estádio de
Rhodnius prolixus induzida por precocenos e
análogos.
47
Tabela 2 - Efeito de ATP sobre a inibição da alimenta-
ção de 4º estádio de Rhodnius prolixus in-
duzida por precoceno II adicionado à dieta
artificial.
28
Figura 6 - Efeito de azadirachtina A, azadirachtina B e
7-acetil-azadirachtina A adicionada à dieta de
4º estádio de Rhodnius prolixus. Azadirachtina
A ; azadi racht ina B ; 7-acet i l -aza-
dirachtina A .
49
Tabela 3 - Inibição da alimentação de 4º estádio de
Rhodnius prolixus induzida por azadira-
chtina A, azadirachtina B e 7-acetil-aza-
dirachtina A.
50
da azadirachtina A adicionada à dieta artificial não apresenta-
ram d i f e renças s i g n i f i c a t i v a s na i n i b i ç ã o da a l imen tação .
O mecanismo da atividade "antifeedant" foi testada pe-
la presença de ATP acrescentado à dieta artificial contendo
azadirachtina A. A tabela 4 mostra que a ingestão da dieta é
reduzida pela adição de azadirachitina A nas concentrações de
25 a 50 µg/ml. O acréscimo de ATP à dieta (30 a 3000 µM), man-
tendo-se as concentrações de azadirachtina A constantes, cau-
sou um aumento da ingestão da alimentação artificial (tabela
4).
4.2. ESTUDO SOBRE O SISTEMA HEMOLÍTICO DO INTESTINO MÉDIO
Com a finalidade de esclarecer melhor a homólise no
tubo digestivo de R. prolixus, foi realizado um estudo sobre a
poss íve l e x i s t ê n c i a de um agente responsável pelo processo.
4 .2 .1 . Ev idênc ias de um f a t o r h e m o l í t i c o no promesentero
Para evidenciar a presença de um fator hemolítico, fo-
ram testadas amostras do conteúdo de promesentero, homogenatos
de parede "estomacal" ou tecido gorduroso bem como de hemolin-
fa para ensaios in vitro, foram observadas também amostras de
promesentero com a finalidade de esclarecer a possibilidade
do processo hemolítico estar implicado com as enzimas proteoli-
tícas existentes nessa região do tubo digestivo. Nesses ensaios
foram utilizadas ninfas de 5º estádio dissecadas no 3º e 16º
51
Tabela 4 - Efeito da concentração de ATP sobre a ini-
bição da alimentação induzida por azadira-
chtina A adicionada à dieta artificial de 4º
estádio de Rhodnias prolixus.
52
dias após a a l imentação com sangue de ove lha .
Foi observado que no 16º dia, quando a atividade ca-
seinolítica estava aumentada, o homogenato de posmesentero não
induzia hemólise em eritrócitos lavados de ovelhas e mantidos
em solução isotônica. Porém, a atividade hemolítica foi encon-
trada no 3º dia após a alimentação no lúmen "estomacal" (pro-
mesentero) não tendo sido associada com a parede do órgão (ta-
bela 5). No 3º dia após a alimentação, o tecido e hemolinfa de
30 ninfas de 5º estádio foram ensaiados para a atividade hemo-
Iítica, de maneira similar à adotada para o conteúdo do prome-
sentero. Conforme está demonstrado na tabela 5, não foi eviden-
ciada atividade hemolítica nas amostras, excluindo assim a pos-
sibilidade da contaminação por hemolinfa ou tecido gorduroso
que pudessem inadvertidamente ter sido recolhidos juntamente
com o promesentero. Essas observações demonstraram a presença
de um f a t o r h e m o l í t i c o no lúmen do promesentero.
4 .2 .2 . Padronização das condições do ensaio h e m o l í t i c o
a) Efeito de pH e temperatura: No 3º dia após a ali-
mentação, foram obtidos os conteúdos "estomacais" de 5º está-
dio, e determinadas as condições ótimas do ensaio da atividade
hemolítica. Essa atividade apresentou pH ótimo em torno de 7,3
(figura 7), sendo que a temperatura ótima foi de 37ºC, com rá-
pido declínio de hemólise em temperatura acima e abaixo dessa
f a i x a ( f i g u r a 8) .
b) Linearidade do processo de ensaio: Esta cinética
53
Tabela 5 - Observação da atividade hemolítica e proteolí-
tica de amostras de promesentero (lúmen ou ho-
mogenado de parede), homogenado de posmesente-
ro, tecido adiposo e hemolinfa de 5º estádio
de Rhodnius prolixus no 3º e 16º dias após ali-
mentação. Ensaios realizados com 10 mg de pro-
teína das amostras e 2 horas de incubação.
*Uma unidade proteolítica foi definida como a atividade
enzimática sobre azocaseína que causa uma variação de ab-
sorbância de 0,1 em 420 nm após 4 horas de incubação a
37ºC.
ND - não determinado
54
Figura 7 - Efeito do pH na atividade hemolítica de conteúdo
do promesentero de 5º estádio de Rhodnius prolixus,
em um meio de incubação consistindo de Na2HPO40,01M, NaCI 0,15M, CaCI2 0,45mM e uma concen-
tração definida de eritrócitos (ver métodos). O
pH foi ajustado com HCI. A concentração final de
proteínas da preparação bruta foi de 20 mg/ml. A
incubação se efetuou a 37ºC por 4 horas. Cada pon-
to representa a média de duas determinações.
55
Figura 8 - Efeito da temperatura na atividade hemolítica de
conteúdo de promesentero de 5º estádio de Rhodnius
prolixus, em meio de incubação padrão (veja Fig.
7). A concentração final de proteínas da prepara-
ção bruta foi de 20 mg/ml. A incubação se efetuou
a 37ºC por 4 horas. Cada ponto representa a média
de duas determinações.
56
foi determinada pela variação do conteúdo "estomacal" adicio-
nado ao meio de incubação (mg de proteína/ml) em relação a uma
concentração estabelecida de eritrócitos (figura 9) e pela va-
riação do tempo de incubação (figura 10). Dessas observações
concluiu-se que o processo é linear até 20 mg de proteínas/ml
da preparação e por um tempo de 4 horas de incubação a 37ºC em
pH 7,3.
c) Estabilidade: Um estudo preliminar da estabilidade
do fator hemolítico indicou que a sua atividade permanecia inal-
terada por, pelo menos dois meses quando a preparação bruta do
conteúdo do promesentero, era guardada a -20ºC. A 4ºC a estabi-
lidade foi mantida por 12 horas. Além disso, o fator hemolíti-
co não foi alterado quando incubado a 27ºC por, pelo menos, 5
horas.
4 .2 .3 . A t i v i d a d e h e m o l í t i c a em n i n f a s e adu l tos
A atividade hemolítica do conteúdo "estomacal" pôde
ser detectada em todos os estádios ninfais e adultos de S.
prolixus (tabela 6), quando os insetos foram alimentados com
sangue de ovelha e dissecados para obtenção dos promesenteros en-
tre o 2º e o 3º dias após a alimentação. Embora tenham sido pa-
dronizadas as condições de ensaio hemolítico com 20 mg de pro-
teínas do conteúdo "estomacal" por ml do meio de incubação e
mantida a temperatura de 37ºC por 2 horas para todos os está-
57
Figura 9 - Efeito da variação da quantidade de proteína de
promesentero de 5º estádio de Rhodnius prolixus
na atividade hemolítica. Meio de incubação pa-
drão (veja Fig. 7). A quantidade de proteína
acrescentada está expressa em mg/ml da mistura da
incubação. Os ensaios foram realizados a 37ºC por
4 horas. Cada ponto representa a média de duas
determinações.
58
Figura 10 - Curso temporal da hemólise de conteúdo de prome-
sentero de 5º estádio de Rhodnius prolixus em
um meio de incubação padrão (veja Fig. 7). A con-
centração de proteína da preparação bruta adi-
cionada foi de 20 mg/ml da mistura de incubação.
Os ensaios foram efetuados a 37ºC. Cada ponto
representa a média de duas determinações.
59
Tabela 6 - Observação da atividade hemolítica de amos-
tras de promesentero obtidas de ninfas e a-
dultos de Rhodnius prolixus no 2º e 3º dia
após a alimentação. Ensaios realizados com
amostras de 20 mg de proteínas e 2 horas de
incubação.
* Amostras de no mínimo se i s i n s e t o s .
* * Média ± E. P. de c i nco d e t e r m i n a ç õ e s .
60
dios ninfais e adultos, foi observada grande variabilidade no
grau de hemólise entre os grupos. Enquanto houve pouca ativida-
de hemolítica nos promesenteros de 1º, 2º e 3º estádios, essa
atividade alcançou níveis significativamente maiores em 4º e
5º estádios e nos insetos adultos (p < 0,01, tabela 6).
4 .2 .4 . Aspecto temporal da secreção do f a t o r h e m o l í t i c o
Os grupos constituídos de seis ninfas de 5º estádio de
R. prolixus, mantidos em jejum por 20 dias após a última mu-
da, foram alimentados com sangue de ovelha para que fosse, pos-
teriormente, observado o aspecto temporal do aparecimento da
atividade hemolítica no conteúdo do promesentero. Em diferen-
tes dias após a alimentação, os insetos foram dissecados e as
atividades hemolíticas ensaiadas. Nos conteúdos "estomacais" ob-
tidos de insetos em jejum ou imediatamente após a alimentação,
as atividades hemolíticas não foram detectadas mas, poucas ho-
ras depois, aumentava rapidamente, mostrando-se máxima entre o
2º e 4º dia (figura 11). Após esse período, o nível hemolítico
diminuia gradualmente até o 12º dia quando atingia níveis se-
melhantes aos encontrados nos insetos em jejum, tornando-se
constante até à próxima alimentação. O modelo de lise dos eri-
trócitos in vivo segue o mesmo padrão da atividade observada
in vitro, ou seja, maiores níveis hemolíticos são encontrados
somente nos p r ime i r os dias após a a l imen tação .
61
Figura 11 - Atividade hemolítica do conteúdo de promesente-
ro de 5º estádio de Rhodnius prolixus em dife-
rentes períodos de tempo após a alimentação. Ca-
da ponto representa seis determinações (média
± E.P.). Ensaio feito com 0,1 ml da preparação
bruta e 2 horas de incubação.
62
4 .2 .5 . Frações sanguíneas e a t i v i d a d e h e m o l í t i c a
Com a finalidade de determinar se alguns componentes
do sangue poderiam induzir a produção ou liberação do fator he-
molítico no promesentero, grupos constituídos de cinco ninfas
de 5º estádio foram alimentados com sangue de ovelha, plasma,
eritrócitos lavados de ovelhas e ressuspendidos ao volume ori-
ginal em NaC1 0,15M, hemoglobina humana (15g/100 ml de plasma)
e estroma de eritrócitos de ovelhas em líquido de Tyrode (vo-
lume original). No 3º dia após a alimentação com essas dietas,
os insetos foram dissecados, determinando-se as atividades he-
molíticas dos diferentes grupos. Na tabela 7 pode ser observa-
do que a atividade hemolítica estava associada à alimentação do
inseto com sangue total, eritrócitos intactos ou hemoglobina,
tendo sido o grau hemolítico semelhante entre os dois últimos
grupos, enquanto nos demais não houve indução da atividade he-
m o l í t i c a no conteúdo "es tomaca l " .
4 .2 .6 . P u r i f i c a ç ã o do f a t o r h e m o l í t i c o
O estudo da purificação do fator hemolítico foi abor-
dado visando à posterior caracterização bioquímica do fator.
a) Gel-filtração em coluna de Biogel P-6: Inicialmen-
te, a preparação bruta do conteudo "estomacal" foi submetida a
gel-filtração em coluna de Biogel P-6 (coluna de 1 X 17 cm). Na
figura 12 está demonstrado um fracionamento obtido por esse
63
Tabela 7 - Efeito da composição do alimento, sobre a
atividade hemolítica de promesentero de 5º
estádio de Rhodnius prolixus no 3º dia após
alimentação. Ensaios realizados com amostras
do conteúdo de promesentero de 20 mg de pro-
teína e 2 horas de incubação.
* Média ± E.P. de cinco de terminações.
64
Figura 12 - Gel-filtração em Biogel P-6 do conteúdo de prome-
sentero de 5º estádio de Rhodnius prolixus; fra-
cionamento do fator hemolítico. Condições: coluna
1 X 17 cm, empacotada com gel e equilibrada com
tampão fosfato 0,01M, NaCl 0,1M pH 6,0. Amostra:
2 ml da preparação bruta. Eluição: mesmo tampão
de equilíbrio; frações de 1 ml coletadas a um flu-
xo de 16 m l /h .
65
processo. Pode ser observado um pico largo de proteína eluído
com Na2HP04 0,01M, NaC1 0,015M, pH 6,0, que corresponde ao pico
de hemoglobina e outros componentes de pesos moleculares ele-
vados, o qual foi desprovido de atividade hemolítica. O fator
hemolítico foi eluído nas frações correspondentes a um volume
de e l u i ç ã o de 35 a 50 ml amostra 1, f i g u r a 12).
b) Cromatografia em coluna de SP-Sephadex: Uma alíquo-
ta de 3 ml da amostra 1 após ser diluída para a concentração fi-
nal de 100 µg proteína/ml em Na2HP04 0,01M, NaC1 0,05M, pH
6,0, foi aplicada a uma coluna preparada com SP-Sephadex C-50
(0,5 X 6,0 cm), equilibrada com o mesmo tampão e com o fluxo
ajustado para 76 ml/h/cm2. Após a lavagem da coluna com três
volumes do tampão de equilíbrio para remoção de material não
absorvido, o fator hemolítico foi eluído com Na2HP04 0,01M,
NaC1 0,1M, pH 6,0, em frações de 1,0 ml. A figura 13 ilustra
esses resultados. Para posterior caracterização do fator hemo-
Iítico, as frações ativas foram combinadas (amostra 2) e, pos-
teriormente, utilizadas. Na tabela 8 estão sumarizados os re-
sultados dos procedimentos de purificação do fator hemolítico,
sendo que foram obtidas purificações nas etapas de gel-filtra-
ção e cromatografia de troca iônica de, respectivamente, 200 e
1200 vezes, com a l t o rendimento 73%).
4 . 2 .7 . Ca rac te r i zação química do f a t o r h e m o l í t i c o
Alguns experimentos foram feitos com a finalidade de
66
Figura 13 - Cromatografia em coluna de SP-Sephadex C-50 da
amostra 1. Condições: coluna 0,5 X 6 cm equili-
brada com tampão fosfato 0,01M, NaCI 0,05M,
pH 6,0. Amostra: alíquota da amostra 1 diluída
(100 µg de proteína/ml de tampão fosfato). Elui-
ção após a lavagem da coluna com tampão de e-
quilíbrio, o fator hemolítico foi eluído com
tampão fosfato 0,01M, NaCl 0,1M, pH 6,0. Fra-
ções de 1 ml foram coletadas e um fluxo de 76
ml/h/cm2.
67
Tabela 8 - Purificação do fator hemolítico de promesentero de
5º estádio de Rhodnius prolixus.
*Este percentual foi calculado como se amostra 1 tivesse sido toda purificada.
68
se obter informações sobre a natureza química do fator hemolí-
tico. A amostra da preparaçäo bruta "estomacal" ou do fator
hemolítico purificado (amostra 2) foi submetida a diferentes
tratamentos e comparada aos tubos controles, não tratados e
mantidos em idênticas condições. Nesses ensaios, as atividades
h e m o l í t i c a s foram sempre est imadas em d u p l i c a t a s .
O fator hemolítico purificado (1 ml da amostra 2) foi
submetido a diálise em membrana com poros para 10000 daltons,
contra 1 litro de Na2HP04 0,01M, NaC1 0,15M, pH 0,6, por 18
horas a 4ºC, tendo sido renovado uma vez o tampão fosfato. O
tubo de diálise foi submetido a rotação em plano horizontal pe-
la utilização de um agitador magnético. Foi feito controle man-
tendo a amostra 2 a 4ºC por 18 horas tendo sido constatado que
nestas condições não ocorreu perda da atividade hemolítica, en-
quanto que na amostra submetida à diálise o fator não foi recu-
perado. O fator hemolítico foi estável quando submetido a amos-
tra 2 em tampão Na2HP04 0,01M, NaC1 O,15M, pH 7,3, a 100ºC por
10 minutos. Após a adição de etanol a frio (concentração final
de 70%) à amostra 2, a mistura foi centrifugada e o sobrenadan-
te aquecido a 50ºC até a eliminação do álcool. A incubação de
eritrócitos com a amostra assim tratada resultou na completa re-
cuperação da atividade hemolítica no sobrenadante alcoólico. A
preparação bruta "estomacal" constituída de 20 mg de proteína/
ml foi tratada com tripsina (1 mg/ml) a 37ºC por 2 horas, ten-
do sido a reação parada pela adição de SBTI (1 mg/ml). Após a
incubação da mistura com a suspensão de eritrócitos foi obser-
69
vada uma inativação de 85% da atividade hemolítica. Foram fei-
tos controles com SBTI acrescentado à amostra 2 (sem tripsi-
na), e incubado com hemácias nas condições anteriores. Nesse
caso não ocorreu inibição da hemólise. Também foi observado que
a incubação de tripsina e SBTI, nas concentrações testadas, di-
retamente com hemácias de ovelha, não resultou em hemólise. Es-
ses resu l tados estão sumarizados na tabe la 9.
4.3 ESTUDO SOBRE O SISTEMA IMUNOLÓGICO HUMORAL
Com a finalidade de estudar o sistema imunológico hu-
moral de R. prolixus, foi realizada uma série de experiências.
4.3.1. Evidenciação da proteção contra Streptococus mutans
in vivo:
Testes preliminares mostraram que a inoculação de 109
células de S. mutans em adultos de R. prolixus induziu em 24 ho-
ras alta mortalidade (aproximadamente 90%). Na figura 14, está
demonstrado que no grupo de insetos que havia sido previamente
inoculado com o meio de cultura, estéril, uma alta mortalidade
era também observada após a inoculação de 109 bactérias. Na ino-
culação dessa concentração celular em adultos que tinham rece-
bido, previamente, injeção com 106 células de S. mutans, foi
observado que a percentagem de mortalidade variava com o tempo
decorrido após a primeira inoculação. Pode ser claramente ob-
servado que, nesse grupo, ocorria a indução da proteção, já no
70
Tabela 9 - E f e i t o s de d i f e r e n t e s t ra tamen tos de amostras da
preparação bruta da purificada (amostra 2) do fa-
tor hemolítico.
* Ver Métodos. * * M i s t u r a de amostras p u r i f i c a d a s (ver métodos)
71
Figura 14 - Observação da mortalidade de adultos de Rhodnius
prolixus inoculados com 109 células de Streptococcus
mutans, em função do tempo decorrido após a inocu-
lação primária de 106 células. Cada ponto represen-
ta a média de 10-15 insetos observados 24 horas a-
pós a ínoculação secundária (109 células). Insetos
imunizados ; Insetos controles que receberam
uma inoculação primária de 1µl do meio Bacto Pep-
tona em substituição à injeção de 106 células de
S. mutans .
72
3º dia após o inóculo primário. O pico máximo da atividade pro-
tetora foi atingido no 5º dia após a inoculação de 106 células
e a percentagem de sobrevivência foi mantida até o 7º dia. A
partir desse dia a mortalidade aumentou, gradualmente, alcan-
çando os va lo res do grupo c o n t r o l e , 1 1 dias após a imunização.
4.3.2. Evidência da atividade antibacteriana em hemolin-
fa l i v r e de hemócitos
A indução da atividade antibacteriana pôde ser obser-
vada na hemolinfa de insetos injetados com 106 células de S.
mutans, quando testada a hemolinfa coletada cinco dias após a
inoculação da bactéria no inseto. O lote controle (hemolinfa ob-
tida de insetos injetados com o meio de cultura puro) não apre-
sentou efeito algum sobre o crescimento da bactéria (figura 15).
O modelo de curva mostrado na figura 15 foi observado indepen-
dentemente do sexo dos insetos adultos utilizados. Normalmente,
após 5 horas de incubação a 37ºC, o crescimento da bactéria
era r e s t a b e l e c i d o nos t e s t e s do grupo e x p e r i m e n t a l .
No estudo sobre o efeito do fator antibacteriano so-
bre o crescimento e viabilidade, foi demonstrado que a incuba-
ção de células de S. mutans com hemolinfa ativa de R. prolixus
resultou em decréscimo da contagem de unidades formadoras de
colônias somente quando as bactérias se encontravam em fase
exponencial de crescimento. Nessa condição, ocorreu um decrés-
cimo de 1,1 X 108 para 5,4 X 105 unidades, o que indica a ação
73
Figura 15 - Cinética da atividade antibacteriana de hemolinfa
de adultos de Rhodnius prolixus inoculados com
106 células de Streptococcus mutans. A hemolinfa
foi coletada no 5º dia após a inoculação e ensaia-
da em meio de cultura de Streptococcus mutans, con-
forme as condições descritas em Material e Méto-
dos. Grupos: controle ; imunizado .
74
bactericida do fator (tabela 10). Por outro lado, se S. mutans
em fase estacionária era incubado com hemolinfa ativa, não ocor-
ria modificação do número de unidades formadoras de colônias,
ind icando a ausência de e f e i t o b a c t e r i c i d a .
4.3.3. Aparecimento da atividade antibacteriana na hemolin-
fa
A atividade antibacteriana foi investigada na hemolin-
fa de insetos adultos, que receberam inóculos de 103 (grupo I)
e 106 (grupo II) células de S. mutans, ou em insetos que rece-
beram somente inóculo do meio estéril (grupo III). Nesse expe-
rimento foram usados tubos que continham uma concentração pré-
determinada de células de S. mutans, em fase exponencial de cres-
cimento, a 37ºC, os quais foram acrescentadas amostras de he-
molinfa procedentes dos três grupos (padronizada a concentra-
ção final de 0,25 mg de proteínas/ml do meio de cultura para
todos os grupos). O desenvolvimento da bactéria, após 2 horas
de incubação a 37ºC, foi monitorada, e o resultado expresso co-
mo percentagem de a t i v i d a d e a n t i b a c t e r i a n a .
A figura 16 mostra as atividades encontradas nos gru-
pos I e II sendo, claramente, evidenciadas as diferenças entre
os insetos que receberam 103 células e os inoculados com 106
células. Embora nos grupos I e II alguma atividade antibacteria-
na tenha sido encontrada na hemolinfa, um dia após a inocula-
ção, a atividade aumentou, rapidamente, atingindo o máximo no
Tabela 10 - Observação da atividade bacteriana de hemolinfa de
Rhodnius prolixus previamente inoculados com 106
células de Streptococcus mutans.
75
76
Figura 16 - Indução da atividade antibacteriana em hemolinfa
de adultos de Rhodnius prolixus injetados com 103
e 1 0 6 c é l u l a s v i v a s d e
Streptococcus mutans. As amostras foram ensaia-
das em meio de cultura de Streptococcus mutans,
conforme descrito em Material e Métodos.
77
5º e 6º dia, e então declinou gradualmente, desaparecendo no
12º dia após a inoculação com S. mutans. Nos insetos que rece-
beram meio estéril (grupo III), a atividade antibacteriana per-
maneceu nula.
4 .3 .4 . A t i v i d a d e a n t i b a c t e r i a n a e a t i v i d a d e de l i s o z i m a
No ensaio sobre a atividade de lisozima foi observa-
do que o S. mutans resistiu à ação Iítica dessa enzima sendo,
como esperado, a suspensão de Micrococcus lysodeikticus sen-
sível a essa ação enzimática (tabela II). Por outro lado, pôde
ser também observado que o fator antibacteriano de R. prolixus
não agiu sobre o substrato de lisozima (tabela II). Assim, foi
excluída a possibilidade do fator antibacteriano ter atividade
do t i p o l i s o z i m a .
4 .3 .5 . P u r i f i c a ç ã o p a r c i a l do f a t o r a n t i b a c t e r i a n o
Com a finalidade de purificar o fator responsável pe-
la atividade antibacteriana, hemolinfa obtida de insetos adul-
tos previamente inoculados com 106 células viáveis de S. mutans
foi submetida a gel-filtração em coluna de Biogel A 0,5m (1,25X
16 cm). Nas condições padronizadas, o fracionamento resultou
em um pequeno pico de 280 nm, correspondente a proteínas de al-
to peso molecular e sem atividade antibacteriana. Essa ativida-
de pôde ser eluída no segundo pico, cujas frações correspondiam
a proteínas de pesos moleculares menores, sendo o volume de
78
Tabela 11 - Atividade antibacteriana de hemolinfa de Rhodnius
prolixus previamente inoculados com 106 células de
Streptococcus mutans e de lisozima sobre a parede
celular de Microcooccus lysodeikticus e Streptococcus mutans.
* Células ressuspendidas em tampão fosfato 0,01M NaCI 0,15M pH 7,0
**Células ressuspendidas em meio Bacto peptona líquido
79
e l u i ç ã o deste p ico de 75 a 85 ml ( f i g u r a 17).
4 . 3 . 6 . Ca rac te r i zação química do f a t o r a n t i b a c t e r i a n o
A natureza química da atividade antibacteriana pôde
ser investigada por diferentes tratamentos de amostras de hemo-
linfa ativa (purificada ou não), obtidas de R. prolixus previa-
mente inoculados com 106 células de S. mutans. Sempre as ativi-
dades foram comparadas às informações preliminares com amostras
c o n t r o l e s não submetidas a t r a t amen to .
Foi observado que a atividade antibacteriana da hemo-
linfa de insetos imunizados demonstrou alto grau de estabilida-
de quando submetida a congelamento e descongelamento ou mantida
a temperatura ambiente (tabela 12). Foi também constatado que
a atividade da hemolinfa era mantida após um tratamento de 30
minutos a 60ºC, em tampão fosfato 0,01M, NaCI 0,15M pH 6,4. Na
mistura de frações com atividade antibacteriana (amostra A), ob-
tida após purificação em Biogel A 0,5m pôde ser observado que
o fator responsável pela atividade antibacteriana resistia a
100ºC por 10 minutos, pH 5,3, tendo sido recuperados 100% da
atividade no sobrenadante (centrifugado a 15000 g por 10 minu-
t o s ) .
Além disso, foi demonstrado que o fator antibacteriano
foi dializável quando a diálise era feita por 18 horas a 4ºC,
contra tampão fosfato 0,01M, NaC1 0,15M, em membrana de diáli-
se com poros para 12000 de peso molecular (tabela 12). Essa ati-
vidade, por outro lado, pôde ser destruída por tratamento com
80
Figura 17 - Gel-filtração em Biogel A 0,5m de hemolinfa de adul-
tos de Rhodmius prolixus, coletada no 5º dia após
a inoculação de 106 células de Streptococcus mutans.
condições: coluna de 1,25 X 15 cm. empacotada com
o gel e equilibrada com tampão fosfato 0,01M, NaCl
0,15M, pH 6,4. Uma amostra de 40 mg de proteí-
nas/ml foi aplicada na coluna e eluída com o mes-
mo tampão de equilíbrio. Frações de 1,4 ml foram
coletadas a um fluxo de 16,8 ml/hora. As frações
foram ensaiadas em meio de cultura de Streptococcus
mutans para observação da atividade antibacteria-
na como descrito em Material e Métodos.
81
Tabela 12 - Efeitos de diferentes tratamentos sobre o fator an-
tibacteriano da hemolinfa de Rhodnius prolixus.
* Ver Método.
** Mistura de amostra purificada ver figura 17.
82
tripsina (20 mg proteína/ 1 mg tripsina) em tampão fosfato 0,01M,
NaC1, 0,15M, pH 7,3, em incubação de 30ºC por 30 minutos, ten-
do sido inibida a reação pela adição de 1 mg de SBTI/ml. Preli-
minarmente a esse experimento, foi constatado que o tratamento
de hemolinfa ativa sendo imediatamente acrescentada de tripsi-
na e SBTI, não inibia a atividade antibacteriana. Nas concen-
trações utilizadas, essas substâncias também não promoviam a
inibição do crescimento bacteriano quando adicionadas ao meio
de incubação.
Assim, como demonstra a tabela 12, nessas condições a
t r i p s i n a i n a t i v o u mais de 90% da a t i v i d a d e a n t i b a c t e r i a n a .
Esses dados sugerem que o fator antibacteriano seja
de natureza peptidica, com peso molecular baixo, provavelmente
menor que 12000 d a l t o n s .
5. DISCUSSÃO
5.1. ATIVlDADES FAGOINIBIDORAS DE PRECOCENOS E AZADIRACHTINA
Neste trabalho, as observações com diferentes clas-
ses de compostos (cromenos e triterpenos) adicionados à dieta
de Rhodnius prolixus, resultaram em diferentes efeitos sobre
a ingestão do a l imen to .
Foi evidenciado que as mudanças na estrutura dos cro-
menos testados promovia um maior ou menor grau de inibição da
alimentação, sendo que somente o precoceno II induziu um for-
te efeito "antifeedant". Esses dados indicaram que os radi-
cais 6,7 dimetoxi, no grupamento 2,2 dimetil cromeno (PII). São
essenciais para a propriedade "antifeedant". Se um desses ra-
dicais é substituído por 7 etoxi (etoxi PII), ou H (PI), a a-
t i v i d a d e " a n t i f e e d a n t " é d im inu ída .
Na espécíe estudada não foi possível inibir a ação
do PII pelo aumento de ATP à dieta, o que indicou a possibili-
dade do PII agir não só como um verdadeiro fagoinibidor, mas
também, indiretamente, em conseqüência de sua elevada toxici-
84
dade aos insetos. Sabe-se que, em concentrações altas, o pre-
coceno II induz grande mortalidade em R. prolixus (AZAMBUJA et
a l . , 1981a) .
Segundo SCHOONHOVEN (1982), as substâncias com proprie-
dades "antifeedant" podem ser ao mesmo tempo tóxicas, embora
muitos inibidores da alimentação não exerçam danos físiológi-
cos aos i n s e t o s .
A possibilidade de ser o PII um verdadeiro "antifeedant"
foi levantada em alguns trabalhos, mas o fato das espécies tes-
tadas serem de hábitos alimentares contínuos tornou controver-
tida essa questão entre os pesquisadores (SCHOONHOVEN, 1982).
Nesse caso, o efeito inibidor da alimentação é, geralmente, me-
dido indiretamente pela avaliação do ganho de peso corporal a
longo prazo, o que torna as conclusões sujeitas a erros. SLAMA
(1978) observou que, quando o PI era adicionado à dieta
Pyrrhocoris apterus, o composto inibia o crescimento, promoven-
do também uma alta percentagem de mortalidade dos insetos tra-
tados. Este mesmo autor demonstrou que o precoceno, tal como
Miristicina e Elemicina (dois potentes fagoinibidores), alterava
o ganho de peso corporal e ovipostura de fêmeas de Pyrrhocoris.
apterus e Dysdercus cingulatus. Em contraste, BOWERS & ALDRICH
(1980) observaram uma dessincronização de fêmeas adultas de
Oncopeltus fasciatus a se alimentarem, quando eram tratadas com
doses subtóxicas de PII. Entretanto, BOWERS 1981) demonstrou
que, em concentrações de PII que promoviam a esterilização, a
principal diferença de peso entre os O. fasciatus, normais e
85
tratados com PII, era devido à inibição do desenvolvimento ova-
riano nos insetos alimentados com o composto, excluindo assim
a propriedade "antifeedant" do precoceno para a referida espé-
cie. Recentemente, foi reportado que o PII adicionado em altas
concentrações à dieta de R. prolixus, reduzia a quantidade de
sangue ingerido pelo inseto, sendo sugerido ser o PII um poten-
te "antifeedant" para R. prolixus (AZAMBUJA et al., 1981a).
Quando às características do PII, essa substância po-
de ser incluída na relação dos principais "antifeedant", como
os de anéis aromáticos metoxilados descritos por MUNAKATA (1975).
Neste trabalho, foi observada a inibição da alimenta-
ção induzida pelo PII e verificou-se que dose crescentes de ATP
na dieta não alteravam esse efeito. Alguns mecanismos de ação
de substâncias fagoinibidoras foram revisados por CHAPMAN (1974),
DETHIER (1982) e SCHOONHOVEN (1982), principalmente em insetos
fitófagos de importância econômica. Entretanto, algumas expli-
cações quanto ao mecanismo de ação do PII em R. prolixus podem
ser suger idas .
Se o precoceno agisse como um verdadeiro "antifeedant",
essa substância poderia modificar, de maneira reversível, a a-
tividade dos receptores a fagoestimulante, alterando assim o
sinal de reconhecimento do sistema nervoso central a presença
de ATP. DETHIER (1982) relatou que algumas substâncias extraí-
das de plantas, como o ácido tânico e certos alcalóides, ini-
bem os receptores de açúcar em certas espécies de insetos fitó-
fagos. É interessante notar que, da mesma maneira, um composto
purificado da árvore Ziziphus jujuba altera também a resposta
86
do homem à percepção de sacarose (KENNEDY & HALPERN, 1980).
Uma explicação alternativa seria a possibilidade do
PII, agir pelo estímulo e/ou inibição de quimiorreceptores pou-
co específicos, promovendo um padrão mais complexo de ativida-
de celular, determinando um modelo de atividade multineural,
irregular, que codificaria a inibição do comportamento alimen-
t a r ao sistema nervoso c e n t r a l .
Alguns trabalhos de neurofisiologia, desenvolvidos em
larvas de Danaus plexippus, nos quais alguns compostos são a-
plicados na sensila galeal, indicaram que três ou mais células
responderam a 59% dos casos envolvidos na aplicação de um sim-
ples composto "antifeedant", e que uma resposta multicelular
era obtida em 100% dos casos na exposição de alimentos não a-
c e i t á v e i s pela c i t ada espéc ie (DETHIER, 1980).
Em alguns trabalhos tem sido demonstrada a toxicidade
tecidual de precoceno (BOWERS et al., 1976; BOWERS, 1981). Os
estudos, relacionados à biotransformação in vitro desse compos-
to, indicaram que 99% do precoceno foram metabolizados em dife-
rentes tecidos, especialmente no trato digestivo e no tecido
gorduroso onde, sabiamente, também ocorrem enzimas do tipo mo-
nooxigenase, capazes de epoxidar o precoceno, tornando-o cito-
t ó x i c o (BOWERS, 1980; SODERLUNO et a l . , 1980).
Baseado no estudo de preparação de oxidases do corpo
gorduroso e identificação dos metabólitos, SODERLUND et al.
(1980) propuseram um modelo de biotransformação oxidativa de
PII, tendo sido demonstrado, em tal estudo, que a transforma-
87
ção de dióis variava entre 5 a 60 minutos, dependendo da linha-
gem de Trichoplusia ni utilizada como fonte enzimática.
A rápida metabolização do PII foi reportada por
SCHOONEVELD (1979) quando observou mudanças degenerativas das
células do corpus allatum, 90 minutos após o tratamento do in-
seto com PII. Assim, uma necrose rapidamente induzida pela a-
ção tóxica dos produtos de precocenos diretamente sobre os te-
cidos de R. prolixus principalmente no trato digestivo, pode-
r i a e x p l i c a r a d im inu ição da a l imen tação .
E sabido que a potência do PI, PII e etoxi PII, como
agentes antijuvenilizantes, varia dependendo do composto e da
sensibilidade do inseto (BOWERS, 1980), de forma que a diferen-
ça das atividades fagoinibidoras para o R. prolixus poderia ser
devida à especificidade das monooxigenases intestinais para o
PI.I.
O esc la rec imen to do mecanismo de s e l e t i v i d a d e do pre-
coceno, a nível dos tecidos ou do organismo inteiro, parece ser
a preocupação atual dos pesquisadores. SODERLUND et al. (1980),
utilizando ensaios in vitro para determinar a sensibilidade in-
trínseca de tecidos, tal como o corpus allatum de O. fasciatus,
ao PI, PII e etoxi PII, observaram que a potência dos precoce-
nos variava com o método de tratamento. A atividade anti-alla-
totrópica do PI, in vitro, era igual à de PII, sendo que in
vivo era 20 vezes menor. Dessa forma, SODERLUND et al. (1980)
sugeriram a presença de um ou mais mecanismos extra allatum,
que poderiam l i m i t a r a expressão i n t r í n s e c a dos precocenos.
88
Por outro lado, o presente estudo também mostrou que
mudanças na estrutura dos triterpenos testados pela adição de
Aza A, Aza B ou 7-acetil Aza A no alimento de R. prolixus não
composto em Spodoptera frugiperda e Heliothis zea. Tem sido
alterava a inibição da alimentação. As evidências das DE50, se-
melhantes nos três compostos, não resultaram em uma significa-
t i v a perda no e f e i t o f a g o i n i b i d o r .
A inibição da alimentação promovida pela Aza A foi su-
gerida por GARCIA & REMBOLD (1984) como um efeito indireto des-
se composto, pela sua interferência sobre o sistema endócrino
de R. prolixus.
Entretanto, uma explicação alternativa, quanto ao me-
canismo de ação da Aza A como "antifeedant", seria pelo blo-
queio da atividade de quimiorreceptores que normalmente respon-
dem a fagoestimulantes (DETHIER, 1982) com poucas exceções, es-
te mecanismo pode ser revertido pelo aumento de fagoestimulan-
te (BERNAYS & CHAPMAN, 1978).
Assim as informações obtidas nesta etapa indicaram que
o efeito "antifeedant" promovido pela Aza A, possivelmente, es-
taria relacionado a quimiorreceptores da alimentação. Esta hi-
pótese foi suportada pela observação de que concentrações cres-
centes de ATP, adicionadas à dieta artificial que continha Aza
A, i n i b i r a m o e f e i t o " a n t i f e e d a n t " .
A atividade fagoinibidora do extrato de Azadirachta
indica foi observada em várias espécies de insetos. MCMILLAN
et al (1969) assinalaram a inibição da alimentação por esse
89
também testada e verificada a diminuição do alimento ingerido
quando esse composto é adicionado a dieta de Schistocerca gregaria
(GILL & LEWIS, 1971) e Locusta migratoria (PRADHAN & JOTWANI,
1968).
Em S. gregaria, a concentração que causou inibição
da alimentação foi µg/1 (BUTTERWORTH & MORGAN, 1968). No pre-
sente estudo, foi observado que ocorria maior resistência de
R. prolixus a azadirachtina, sendo que a concentração efetiva
i n i b i t ó r i a obt ida fo i de µg/ml .
A azadirachtina não pode ser considerada um "antifeedant"
universal, pois não provoca alteração no comportamento alimen-
t a r de algumas espécies de inse tos (VIGNERON, 1978).
A questão dos quimiorreceptores responsáveis pelo es-
tímulo ou inibição da alimentação tem sido amplamente estuda-
da em várias espécies de insetos fitófagos. Têm sido reporta-
dos receptores sensíveis a "antifeedant" ocorrendo na sensila
estilocomica maxilar e epifaringe de larvas de lepidoptera
(ISHIKAWA et al., 1969; SCHOONHOVEN, 1969). Em Bombyx mori,
um receptor localizado na maxila responde a vários alcalóides,
que agem como inibidores da alimentação (ISHIKAWA, 1966). Lar-
va de Pieris brassicae, bem como de várias outras espécies,
também possuem um ou mais receptores de "antifeedant"
(SCHOONHOVEN, 1973, 1982).
Em S. gregaria e L. migratoria, HASKELL & SCHOONHOVEN
(1969) demonstraram a existência de uma célula especializada
que respondia à presença de azadirachtina. Entretanto, BLANEY
90
(1980) observou que insetos com uma variedade enorme de célu-
las quimiorreceptoras (cerca de 15000), tal como a L. migratoria,
não produz um modelo de atividade nervosa simples na presença
de um único " a n t i f e e d a n t " .
Com base nas extensivas investigações dos diferentes
mecanismos que envolvem a percepção de compostos "antifeedant"
pelos insetos, a nível sensorial, tem sido demonstrado que os
sistemas de receptores de diferentes espécies, embora possuam
morfologia idêntica, são consideravelmente diferentes no sen-
tido fisiológicos (SCHOOCHOVEN, 1982). Aparentemente, não exis-
tem duas espécies com sistemas sensoriais idênticos fisiologi-
camente (SCHOONHOVEN, 1973; 1 9 8 2 ) .
Poucos trabalhos têm levantado a questão quanto à
substância com atividade fagoinibidora para insetos hematófa-
gos. Dentre eles destacam-se o trabalho de SALAMA (1966), que
reportou a rejeição de dietas que continham álcoois (butanol
e pentanol) por Aedes aegypti e R. prolixus e de GALUN et al.
(1969), que observaram que o metilfenildiazarecarboxilato ini-
bia a alimentação de Ornithodoros tholozani, Glossina austeni,
A. aegypti e Culex molestus.
Em estudo eletrofisiológico mais detalhado, associa-
do à morfologia de R. prolixus, PINET et al. (1969) observa-
ram células sensoriais bipolares, localizadas na estrutura
de inervação do estiletes maxilares e mandibulares. Na estru-
tura maxilar, esses autores encontraram receptores que eram
sensíveis a variações de umidade do ar. BERNARD et al. (1970)
91
também observaram alterações elétricas nessas estruturas em
Triatoma infestans, quando submetidos a estímulos térmicos.
Em R. prolixus, FRIEND & SMITH (1971a; 1971b) avalia-
ram e correlacionaram as mudanças da resistência elétrica en-
tre o inseto e a dieta, na presença, ou ausência, do fagoesti-
mulante ATP, com as fases de degustação e ingestão do alimen-
to. Entretanto, esses estudos eletrofisiológicos são ainda
preliminares para se avaliar e caracterizar a sensibilidade
dos receptores (localizados nos estiletes mandibulares e maxi-
l a r e s ) a f a g o e s t i m u l a n t e s e " a n t i f e e d a n t " .
5.2 INDUÇÃO DA ATIVIDADE HEMOLÍTICA
No presente trabalho, foi demonstrado a presença de
um fator hemolítico no intestino médio de ninfas de adultos
de R. prolixus.
Na literatura, poucos são os trabalhos que abordam a
questão da existência de fatores que seriam responsáveis pelo
processo h e m o l í t i c o de i n s e t o s hematófagos (GOODING, 1977).
GOODING (1977), em Glossina morsitans, e SPATES &
DELOACH (1980), em Stomoxys calcitrans, observaram que as a-
mostras de homogenados intestinais apresentavam níveis altos
de atividade hemolítica para eritrócitos lavados e incubados
em soluções isotônicas, somente se os insetos eram, previamen-
te, alimentados com sangue total. Entretanto, se os insetos
fossem alimentados com outras dietas, como plasma e estroma
92
de eritrócitos, os níveis de atividade hemolítica eram mais
baixos.
Esses dados estão de acordo com os encontrados neste
trabalho, pois em R. prolixus também pôde ser demonstrada a
relação da atividade hemolítica com a dieta ingerida. Nessa
espécie, os resultados sugerem que o estímulo da produção de
hemolisina estaria associado ao conteúdo de eritrócitos, tal
como, provavelmente, nas outras espécies hematófagas. Esse a-
chado exclui a possibilidade de, em R. prolixus, a distensão
abdominal ser reguladora do processo hemolítico, entretanto,
nada se pode ainda concluir sobre a natureza química do estí-
lo.
Tem sido reportado na literatura que as hemolisinas
de insetos hematófagos estão distribuídas na porção posterior
do intestino médio onde, sabidamente, se encontram as enzimas
proteolíticas (GEERING, 1975; GOODING, 1977; SPATES & DELOACH,
1980). Em alguns casos, os resultados obtidos de tratamento
dos homogenados ativos com tripsina, ou inibidor de tripsina,
sugerem que as proteases estariam envolvidas no processo hemo-
lítico (SPATES & DELOACH, 1980).
Em R. prolixus, um exame mais detalhado do apareci-
mento do fator revelou que a atividade hemolítica era mínima
nos insetos em jejum e atingia níveis máximos 2 a 4 dias após
a alimentação com sangue. Nessa espécie, o agente hemolítico
foi encontrado no lúmen da região anterior do intestino médio
("estômago" ou promesentero), mas não na parede do órgão ou
93
na porção posterior do intestino médio (intestino ou posmesen-
tero). Nesse trabalho, o fato da distribuição da hemolisina
ser restrita ao lúmen do promesentero, concorda com os acha-
dos de WIGGLESWORTH (1943) e PICK (1951, 1953), quando obser-
varam a presença de cristais de hemoglobina livres no "estô-
mago" de R. prolixus. Nessa espécie, é possível que a hemoli-
sina seja secretada da parede do promesentero imediatamente
após a sua síntese, ou que seja ativada no lúmen do órgão. .
Alguns agentes conhecidamente hemolíticos têm sido
purificados e caracterizados de estádios larvares, ou insetos
adultos, que não exercem o hematofagismo. Dentre esses agen-
tes, destacam-se as fosfolipases, que hidrolisam fosfolipí-
dios, formando lisocompostos e ácidos graxos livres (SCHMIDT,
1982). Enzimas do tipo fosfolipase foram encontradas em homo-
genados totais de larvas de Culex pipiens fatigans, Aedes aegypti
e Anopheles stephensis (HANUMANTHA-RAO & SUBRAHMANYAN, 1969a;
1969b; 1970).
A caracterização de fatores hemolíticos de insetos
hematófagos têm sido restrita a poucas espécies.
Em A. aegypti, GEERING (1975) demonstrou uma ativi-
dade hemolítica em intestino das formas adultas tendo o autor
sugerido a participação de fosfolipases no processo digesti-
vo dessa espécie.
Em S. calcitrans, SPATES & DELOACH (1981) observaram
atividade hemolítica somente em extrato lipídico obtido de ho-
mogenado de intestino médio. Posteriormente, foi caracteriza-
94
do, por cromatografia em camada fina, que a hemólise nessa es-
pécie seria produzida por ácidos graxos livres, que estariam
presentes em altas concentrações no intestino médio (SPATES et
a l . , 1982).
GOODING (1977), estudando hemolisina de G. morsitans.
sugeriu, pelo tratamento dos insetos com puromicina, que esse
fator seria de natureza proteica. Em estudo preliminar, demons-
trou que o fator era inativado por fervura e que não passava
at ravés de membrana de d i á l i s e .
Neste trabalho, em R. prolixus, alguns experimentos
preliminares excluíram a possibilidade de o fator hemolítico a-
gir como uma enzima do tipo fosfolipase pois a pré-incubação de
lecitina com conteúdo "estomacal" não resultou em aumento da
atividade hemolítica quando hemácias lavadas eram incubadas
com as amostras. Também pôde ser constatado que a amostra puri-
ficada do fator hemolítico, pré-incubada com lecitina e anali-
sada em c roma tog ra f i a de camada f i n a , não r e s u l t o u na formação
de l i s o l e c i t i n a e ácidos graxos l i v r e s .
No processamento das duas etapas cromatográficas para
purificação do fator hemolítico foi obtido aproximadamente uma
purificação de 1200 vezes, com um rendimento de 73%. Na primei-
ra etapa, utilizando uma coluna de Biogel P-6, o fator pôde ser
separado da hemoglobina e proteínas plasmáticas de alto peso mo-
lecular. Na segunda etapa, o fator semi purificado, obtido da
gel-filtração, pôde ser fracionado em cromatografia de troca
iônica, utilizando SP-Sephadex. As investigações posteriores
95
sobre as propriedades do fator hemolítico de R. prolixus suge-
riram que o agente poderia ser de natureza peptídica, de bai-
xo peso molecular e, provavelmente, de característica básica
(observado pela adsorção em SP-Sephadex pH 6,0). Esses acha-
dos indicam, portanto, que o fator hemolítico de R. prolixus
seja distinto daqueles encontrados por GEERING (1975) e SPATES
et a l . (1982) .
Em venenos de insetos, pertencentes à classe Hymenop-
tera, têm sido caracterizados fatores que lisam diretamente
hemácias lavadas e mantidas em solução isotônica. Desses fato-
res, destacam-se a melitina de Apis mallifera (SCHMIDT, 1982),
uma hemolisina semelhante a melitina de Pogonomyrmex badius
(SCHMIDT & BLUM, 1978) e a barbatolisina de Pogonomyrmex barbatus
(BERNHEIMER et al., 1980). Estes compostos já são relativamen-
te bem estudados e caracterizados como peptídeos de baixo pe-
so molecular e básicos (SCHMIDT, 1982; BERNHEIMER et aI, 1980).
Neste trabalho, as observações das características do
fator hemolítico, purificado, sugerem que o R. prolixus pos-
sui uma classe de agente responsável pela hemólise, distinta
das encontradas nas outras espécies de insetos hematófagos, e
provavelmente semelhante aos fatores encontrados em venenos de
Hymenoptera.
Em R. prolixus, o papel fisiológico desse fator deve
estar associado à lise da membrana dos eritrócitos e, portan-
to, à liberação de hemoglobina. Nessa espécie, a passagem da
hemoglobina livre para o posmesentero antecipa o contato dire-
96
to das enzimas proteolíticas com o substrato proteico facili-
tando, p rovave lmente , o processo d i g e s t i v o .
5.3. INDUÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA HUMORAL
Neste estudo, foi evidenciada a presença de um fator
antibacteriano na hemolinfa de Rhodnius prolixus previamente
inoculado com células vivas de Streptococcus mutans.
Em algumas espécies de insetos, tem sido observada a
indução de atividade antibacteriana na hemolinfa quando o in-
seto é inoculado tom diferentes bactérias, ou mesmo em respos-
ta ao dano físico provocado pela injeção (LACKIE, 1980, 1981a;
BOMAN & STEINER, 1981; BOMAN & HULTMARK, 1981).
A indução desses f a t o r e s com a t i v i d a d e a n t i b a c t e r i a n a
em insetos está, geralmente, associada a um período de tempo
que decorre a partir da inoculação, sendo que a atividade máxi-
ma é alcançada em horas, ou dias, dependendo da espécie inves-
tigada. Em R. prolixus, esse pico foi observado entre o 5º e 6º
dias após a inoculação de S. mutans. Em O. fasciatus, GINGRICH
(1964) observou que o nível máximo era alcançado em 24 horas
após a injeção de Pseudomonas aeruginosa.
Nesse caso, em R. prolixus, a injeção do meio de cul-
tura, isento de bactérias, não induziu o aparecimento da ativi-
dade antibacteriana na hemolinfa testada contra S. mutans.
Foi também observado que a inoculação de uma concentra-
ção sub letal de bactérias induzia a resistência de R. prolixus a
97
uma posterior inoculação, cuja concentração de S. mutans, era,
normalmente, letal ao inseto. Por outro lado, a cinética do
aparecimento e desaparecimento da atividade antibacteriana na
hemolinfa dos insetos vacinados coincidia com o grau de prote-
ção (observado pela sobrevivência) dos insetos desafiados em
diferentes intervalos de tempo após a vacinação. Esses dados
sugerem que o papel fisiológico do fator antibacteriano pode-
ria estar relacionado a um tipo de defesa imunológica do in-
seto.
POWNING & DAVIDSON (1973; 1976), em Galleria mellonella
e Bombyx mori, ANDERSON & COOK (1979), em Spodoptera eridania,
e POWNING & IRZYKIEWICZ (1967), em Periplaneta americana, re-
portaram uma atividade induzida, do tipo lisozima, na hemolin-
fa dessas espécies de i n s e t o s .
As observações de que a hemolinfa obtida de adultos
de R. prolixus, previamente inoculados com S. mutans, não a-
gia sobre Micrococcus lysodeikticus, um dos organismos mais
susceptíveis à atividade lítica de lisozima (FLEMING, 1922),
somadas às observações de que células de S. mutans, ressuspen-
didas em tampão fosfato, e incubadas com lisozima, não resul-
tavam em alteração de absorbância lida a 450 nm, excluíram a
possibilidade da atividade antibacteriana de R. prolixus ser
do t i p o l i s o z i m a .
Em insetos, têm sido também demonstrados outras ati-
vidades antibacterianas, diferentes de lisozima, que possuem
natureza química não proteica e são termo estáveis, como as
98
encontradas em hemolinfa imune de O. fasciatus (GINGRICH,
1964), G. mellonella (HINK & BRIGGS, 1968) e L. migratoria
(HOFFMANN, 1980).
Em outras espécies de insetos, tem sido evidenciada
a presença de atividade antibacteriana de natureza proteica,
termo lábil, ou termorresistente (BOMAN & HULTMARK, 1981; BOMAN
& STEINER, 1981; OKADA & NATORI, 1984).
Em Hyalophora cecropia, HULTMARK et al. (1983) iden-
tificaram uma classe de proteína, a atacina, com peso melecu-
lar entre 20000 e 23000 daltons, que agia sobre Escherichia coli
somente em fase exponencial de crescimento, mas não apresen-
tava atividade antibacteriana quando a E. coli era ressuspen-
dida em tampão e incubada com a t a c i n a .
Em R. prolixus, uma caracterização química prelimi-
nar indicou ser o fator antibacteriano sensível à tripsina e,
portanto, relacionado à natureza proteica. Além dessa caracte-
rística, os resultados obtidos neste trabalho, da fervura e
da diálise, sugerem a possibilidade de tal fator ser de baixo
peso molecular. Esse dado é reforçado pela obtenção da ativi-
dade, quando fracionada em coluna de Biogel A 0,5m, nas fra-
ções correspondentes a moléculas de pesos moleculares peque-
nos.
Atualmente, já está bem definida uma classe de fato-
res antibacterianos como sendo peptídios básicos de pesos mo-
leculares baixos (até 5000), que são resistentes ao aquecimen-
to a 100ºC. Nessa classe, os seguintes peptídios podem ser in-
99
cluídos: a sarcotoxina isolada de Sarcophaga peregrina (OKADA
& NATORI, 1983) e a cecropina de H. cecropia (HULTMARK et al.,
1980; STEINER et al., 1981), ou peptídios semelhantes à cecro-
pina, isolados de outras espécies de Lepidoptera (BOMAN &
STEINER, 1981; HOFFMANN et a l . , 1981).
ANDREU et al. (1983) observaram que a cecropina, na-
tural ou sintética, age sobre algumas espécies de bactérias
Gram positivas e Gram negativas, como Pseudomonas aeruginosa,
Micrococcus lutens, Bacillus megaterium e Escherichia coli.
Um aspecto interessante foi detalhado, por esses autores, quan-
do demonstraram que pequenas alterações nas extremidades ami-
no-terminal ou carboxi-terminal do peptídeo poderiam promover
a alteração da atividade antibacteriana em relação às diferen-
tes espécies dos microrganismos t es tadas .
A cecropina, em contraste com seu espectro de ação,
pois age em várias espécies de bactérias, não lisa eritróci-
tos lavados (STEINER et al., 1981). Por outro lado, a meliti-
na ataca, indiscriminadamente, a membrana de bactérias e tam-
bém de células de eucariontes (STEINER et al., 1981; BOMAN &
HULTMARK, 1981).
Neste trabalho, foi observado que a atividade anti-
bacteriana induzida em hemolinfa de R. prolixus; se restrin-
gia ao S. mutans. Os ensaios preliminares realizados com
Streptococcus fecalis e E. coli mostraram que a hemolinfa,
obtida de insetos vacinados com S. mutans, não apresentava ne-
nhuma ação sobre esses microrganismos. O fator antibacteriano
100
também não demonstrou atividade hemolítica. Esses resultados,
embora preliminares, sugerem que deve haver uma certa espe-
cifidade na ação do fator antibacteriano. Entretanto, esta in-
terpretação deve ser vista com cautela, pois a observação da
atividade deve ser estendida a outras espécies de bactérias e
outras cé l u l as de e u c a r i o n t e s .
Quanto ao efeito do fator antibacteriano sobre S.
mutans, foi observado que havia um decréscimo na contagem de
unidades formadoras de colônias (atividade bactericida) somen-
te quando a bactéria estava em fase exponencial de crescimen-
to. Quando as células de S. mutans eram ressuspendidas em tam-
pão, esse efeito não ocorria. Este dado pode indicar a possi-
bilidade do mecanismo de ação do fator humoral de R. prolixus
ser semelhante ao da atacina, isolada de H. cecropia por
HULTMARK et a l . (1983).
No momento, algumas experiências estão sendo desen-
volvidas para explicar aspectos da defesa humoral de R. prolixus,
ainda não e s c l a r e c i d o s :
a) Quais as espécies de bactérias ou componentes mo-
leculares que poderiam induzir o aparecimento desse fator hu-
moral;
b) Qual seria o tecido responsável pela síntese e/ou
l i b e r a ç ã o do f a t o r a n t i b a c t e r i a n o ;
c) Como poderia o fator agir sobre a bactéria: se por
101
ação f i s i c o - q u í m i c a , do t i p o d e t e r g e n t e , ou c a t a l í t i c a ;
d) Poderia a atividade antibacteriana ser estendida
a células eurarióticas, especialmente protozoários; que sabi-
damente parasitam o R. prolixus;
De maneira geral, a questão sobre a imunologia humo-
ral de insetos está concentrada em alguns tópicos pouco escla-
recidos, tais como se poderia o inseto produzir uma resposta
específica a um determinado antígeno, poderia esta resposta es-
tar relacionada a uma memória imunológica ou qual seria a ba-
se gené t i ca e mo lecu la r da imuno log ia de i n s e t o s .
Espera-se que nos próximos anos esses pontos possam
ser bem conhecidos para melhor compreensão dos mediadores hu-
morais da resistência dos insetos à infecção por microrganis-
mos.
6. CONCLUSÕES
Neste trabalho, os resultados observados sobre alguns
aspectos da fisologia de Rhodnius prolixus permitem concluir
que:
No estudo sobre as substâncias inibidoras da alimen-
tação em n in fas de 4º e s t á d i o :
a) O precoceno II tem uma atividade "antifeedant" sen-
do a quantidade de alimento ingerido dependente da concentra-
ção do composto ad ic ionado à d i e t a .
b) Os análogos de precocenos II (cromano de precoce-
no II, precoceno I e etoxiprecoceno II) não apresentaram ati-
vidade "antifeedant" até doses de 100 µg/ml de sangue.
c) A adição de ATP à dieta artificial que continha
precoceno I I não a l t e r o u a i n i b i ç ã o da a l imen tação .
103
d) A adição de azadirachtina A, azadirachtina B e
7-acetilazadirachtina A ao sangue alimentar promoveu a inibi-
ção da ingestão do alimento, sendo que as doses efetivas para
esses compostos foram semelhantes.
e) O acréscimo de ATP à dieta, mantendo-se constan-
tes as concentrações de azadirachtina A, promoveu o aumento
da ingestão do a l imen to .
q
No estudo sobre o s istema h e m o l í t i c o :
a) Ninfas e adultos de R. prolixus possuem no intes-
t i n o médio um f a t o r h e m o l í t i c o r e s t r i t o ao promesentero.
b) A atividade hemolítica em ninfas de 5º estádio foi
induzida pela ingestão de sangue total, eritrócitos ou hemo-
globina, atingindo um nível máximo do 2º ao 4º dias após a a-
l imen tação .
c) Uma purificação parcial (gel-filtração em Biogel
P-6 e cromatografia de troca iônica em SP-Sephadex) e caracte-
rização bioquímica revelou que o fator hemolítico é de natu-
reza p e p t í d i c a , bás ica , e de baixo peso mo lecu la r .
No estudo sobre a a t i v i d a d e a n t i b a c t e r i a n a i nduz ida :
a) Insetos adultos de R. prolixus, previamente inocu-
104
lados com dose sub letal de Stroptococcus mutans, foram pro-
t e g i d o s à um d e s a f i o secundá r i o com dose l e t a l des ta b a c t é r i a .
b) A hemolinfa, livre de hemócitos, dos insetos inocu-
lados com dose sub-letal de células de S. mutans, possuía uma
atividade antibacteriana (bactericida), in vitro, contra a bac-
t é r i a i n o c u l a d a , em fase e x p o n e n c i a l de c r e s c i m e n t o .
c) A atividade antibacteriana atingiu nível máximo
em hemolinfa dos insetos no 5º dia após a inoculação de S.
mutans, e diferiu, da atividade do tipo lisozima por não agir
sobre suspensão de Micrococcus lysodeikticus (substrato de liso-
zima).
d) Uma parcial purificação (gel-filtração em Biogel A
0,5m) e caracterização por tratamentos químicos revelaram ser o
fator antibacteriano de natureza proteica e de baixo peso mole-
cular.
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