aspectos epigenéticos del gen btbd3 en niños
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Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños
diagnosticados con TDAH en una muestra de
pacientes colombianos.
Óscar Gerardo Rodríguez Angarita
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina,
instituto de genética, Colombia
2018
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños
diagnosticados con TDAH en una muestra de
pacientes colombianos.
Óscar Gerardo Rodríguez Angarita
Tesis o trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al tíıtulo de
Magister en Neurociencias
Director
MD, MSc. Humberto Arboleda Granados
Grupo de Investigacion:
Grupo de Neurociencias – Universidad Nacional de Colombia
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina,
instituto de genética, Colombia
2018
Los teóricos realizan los experimentos en
sus cerebros. Los experimentadores utilizan,
además, las manos. Aquéllos son
pensadores y éstos artesanos. El teórico
actúa en un lugar prístino, limpio de ruido,
vibraciones y suciedad. El experimentador
desarrolla intimidad con la materia, como el
escultor con la arcilla. El teórico inventa sus
compañeros, como ingenuo Romeo que
sueña su Julieta ideal. Los amores del
experimentador son sudor, quejas y
esperanza.
James Gleick
Agradecimientos
Las investigaciones para éste trabajo no habrían sido posibles sin el apoyo
económico de Colciencias. El Instituto de Genética también contribuyó al
desarrollo de éste trabajo, abriéndome las puertas y permitiendo tener la
experiencia de formarme como investigador, también agradezco a la línea de
investigación en Neurodesarrollo, en el marco de la cual se desarrolló mi trabajo.
Diferentes personas han contribuído con ésta tesis de manera directa e
indirecta. El profesor Humberto Arboleda, mi director de tesis, por sus invaluables
consejos y su ejemplo de disciplina y amor por la ciencia. Xiomara Rodríguez
quien comparte su vida conmigo y me ha apoyado en momentos difíciles y
potencia mi momentos felices. Mi familia, que se ha convertido en mi estandarte y
son un cimiento fundamental en todo mi proceso de desarrollo académico.
Varios colegas me han ayudado. Quiero mencionar especialmente a Diana
Cifuentes, Angie Alvarado y Gabriela Concha, quienes aparte de ser buenas
amigas, con paciencia me ayudaron, sobretodo en el proceso de aprendizaje de
los procedimientos de laboratorio. A María Fernanda Mahecha, por sus asesorías
y en general a todo mis profesores, compañeros de aula y de laboratorio con
quienes sostuve conversaciones inspiradoras que me motivaron a seguir
adelante.
También quisiera agradecer a la evolución, por la selección natural que hizo
de coffea y Camellia sinensis, que gracias a su contenido de cafeína me ayudaron
a mantener mi sistema nerviosos estimulado, además de que varias ideas para la
tesis fueron en un inicio bosquejos en las servilletas de cafetería.
Resumen y Abstract IX
Resumen El TDAH es un trastorno comportamental altamente heredable, persistente
y frecuente. La etiología del trastorno no está clara. Sin embargo, se han descrito
similitudes neuroanatómicas entre trastorno de déficit de atención e hiperactividad
(TDAH), trastorno obsesivo compulsivo (TOC) y espectro autista (EA). Por otra
parte, se encontrado asociación significativa entre variantes genómicas en el gen
BTBD3 y TOC y áreas diferencialmente metiladas en este mismo gen asociadas a
TDAH. Este trabajo se propuso determinar el patrón de metilación de un área del
gen BTBD3 en una muestra de pacientes Colombianos diagnosticados con TDAH.
Adicionalmente se generaron comparaciones en los niveles de metilación en
función de diversas variables clínicas. De manera complementaria, se
desarrollaron análisis no considerados en los objetivos del trabajo, se generó un
análisis de interacción proteína-proteína (PPi) alrededor del gen BTBD3 y un
análisis de expresión y co-expresipon del gen en cerebro prenatal y adulto. Esto
con el fin de tener un entendimiento más profundo de la función de BTBD3 en el
neurodesarrollo y la conducta
El diagnósticos de TDAH no se asocia con cambios en la metilación. Se
observa relación de la metilación con estrés prenatal, el tipo de parto, estrés
durante el embarazo, si fue o no un embarazo deseado, si hubo algún riesgo para
el embarazo durante el tercer trimestre, tipo de parto enfermedades al nacer,tipo
de alimentación, región de nacimiento edad del padre y de la madre. La red de
interacciones entre proteínas está dominado por procesos asociados al
metabolismo mediado por ubiquitinación. La desestabilización topológica mostró
cambios significativos en topológica y enriquecimiento funcional. El análisis de
expresión mostró que el gen BTBD3 tiende a estar más expresado en cerebro
prenatal que en adulto pero con co-expresiones más débiles.
Palabras clave: TDAH, metilación, PPi, BTBD3, desestabilización
topológica, BSP PCR, análisis de expresión.
X Resumen y Abstract
Abstract
Introduction: ADHD is a behavioral disorder highly heritable, persistent and
frequent. The etiology of the disorder is not clear. Nevertheless, neuroanatomical
similarities has been described between attention deficit hyperactivity disorder
ADHD, obsessive compulsive disorder (OCD) and autistic spectrum (AS).
Moreover, there is significant association between genomic variants in BTBD3 and
OCD and differentially methylated areas in the before mentioned gene associated
to ADHD. This work attempt to determine the methylation pattern in a region of
BTBD3 in a sample of Colombian patients diagnosed with ADHD. Additional,
methylation was compared as function of clinical variables. in a complementary
way, it was performed several not before considered analysis in the goals of the
investigation, it was developed a protein-protein (PPi) interaction analysis
surrounding the BTBD3 gene and an expression and coexpression analysis of the
gene in the prenatal and adult brain. This with the goal get a more profound
understanding of the BTBD3 function in the neurodevelopment and in the behavior
The diagnosis of ADHD is not associated with changes in methylation.
Relations are observed when diagnosis interact with prenatal stress, type of
delivery, stress during pregnancy, if it was a desired pregnant, risks in the third
trimester of pregnancy, type of delivery, diseases at birth, type of feeding, region of
birth, age of father and mother. The network of interactions between proteins is
dominated by metabolism mediated by ubiquitination. Topological destabilization
showed significant changes in topological and functional enrichment. The
expression analysis show than the BTBD3 gene tend to be more expressed in the
prenatal brain than in the adult brain but with lower coexpression.
Key words: ADHD, methylation, PPi, BTBD3, topological destabilization,
BSP PCR, expression analysis.
Contenido
1. Introducción. 18
2. Justificación. 21
3. Trastorno de déficit de atención e hiperactividad. 22
3.1 TDAH y Sistema excitador. 22
4. Epigenética 24
4.1. Señalización y factores epigenéticos. 25
4.2 Metilación de ADN. 27
4.3. Dinámica epigenética. 30
5. BTBD3. 33
5.1. BTBD3 y Neurodesarrollo. 34
5.2. BTBD3 y TDAH. 35
6. Objetivos. 37
6.1 General. 37
6.2 Específicos. 37
7. Metodología. 38
7.1. Metilación 38
7.1.1. Muestra. 38
7.1.2. Criterios de inclusión y exclusión. 39
7.1.3. Extracción de ADN. 39
7.1.4. Conversión con bisulfito. 40
7.1.5. BSP PCR. 41
7.1.6. Purificación y reacción de secuencia. 42
7.1.7. Análisis de metilación. 43
7.2. Análisis de redes. 43
7.3. Análisis de expresión y co-expresión. 45
7.4. Análisis estadístico. 46
7.5. Enriquecimiento funcional. 47
8. Resultados 49
8.1. Patrón de metilación en BTBD3. 49
8.1.1. Factores ambientales asociados a la elevación de la metilación. 51
8.1.2. Factores in utero asociados a la elevación de la metilación. 53
8.1.3. Factores postparto asociados a la elevación de la metilación. 55
8.2. Red de Interacción Proteína Proteína (PPi) del gen BTBD3. 59
8.3. Patrón de expresión del gen BTBD3 en el cerebro prenatal y adulto. 68
8.3.1. co-expresión del gen BTBD3 70
9. Discusión. 77
9.1. Patrón de metilación. 77
9.2. Red PPi 82
9.2.1. Detección de comunidades. 84
9.2.2. Análisis topológico 86
9.3. Expresión y co-expresión de BTBD3. 89
9.3.1. Expresión por área. 89
9.3.2. co-expresión. 94
10. Conclusiones. 97
11. Perspectivas 100
12. Anexos. 102
12.1. Mediciones topológicas de la red. 102
12.2. Enriquecimiento funcional de la red completa y desestabilizada. 116
12.3. Enriquecimiento funcional de la red con los nodos que poseen mayor
coeficiente topológico 124
12.4. Protocolo general de electroforesis. 128
12.5. Protocolo de conversión con bisulfito. 129
12.6. Protocolo de purificación de ADN y preparación de reacción de secuencia.
131
13. Referencias. 134
Contenido 13
Abreviaturas
Término
AIBS Allen institute for brain science
CBC Corteza cerebelosa
EA Espectro autista
EdgeB Centralidad de intermediación de arista
GD Giro dentado
PageR Centralidad de rango de page
TDAH/ADHD Trastorno de déficit de atención e hiperactividad
PK Proteínas kinasas
TOC/OCD Trastorno obsesivo compulsivo
GWAS Estudios de asociación de genoma completo
SNP Polimorfismo de un solo nucleótido
5meC 5 metilcitosina
K Lisina
ADN Ácido desoxiribonucleico
ARN Ácido ribonucleico
snoARN ARN nucleolar pequeño
miARN Micro ARN
lncARN ARN largo no codificante
HDAC Deacetilasas de histonas
HAT Acetiltransferasa de histonas
DNMT DNA metiltransferasas
TET Metilcitosina dioxigenasa tet
5hmC 5-hidroximetilcitosina
5caC 5-carboxilmetilcitosina
Abreviatura Término
5fC 5-formilcitosina
R Arginina
H3K4me metilación en la lisina 4 de la histona 3
H3K9me Metilación en la lisina 9 de la histona 3
H3K27me3 Trimetilación de la lisina 27 en la histona 3
HMT Metiltransferasa de histonas
S Serina
HDM Demetilasa de histonas
PP Fosfatasas
BTB complejo bric-a-brac–tramtrack–broad / pox virus and zinc finger
BTBD3 BTB/POZ domain containing 3
KD knockdown
KO Knockout
NMDA Receptor N-methyl-D-aspartate
PCR Reacción en cadena de polimerasa
PTR Pretectum
MTc Tectum mesencefálico
THM Tálamo
MTg Tegmento mesencefálico
HTM Hipotálamo
PnTg Tegmento pontino
NEDD8 neural precursor cell expressed, developmentally downregulated 8
NR3C1 Receptor de glucocorticoides
HiF Formación hipocampal
Contenido 15
Abreviatura Término
CbCx Corteza cerebelosa adulta
VT Tálamo ventral
WM Materia blanca
Betw Centralidad de intermediación
Eigen Centralidad de autovector
Closs Centralidad de cercanía
Degree Centralidad de grado
HPA eje hipotálamo pituitaria suprarrenal
CRH Hormona liberadora de corticotropina
ACTH Hormona adrenocorticotropa
CS Síndrome de Cushing
Ppi Interacción proteína-proteína
BSP Bisulfite Sequencing PCR
ESME Epigenetic Sequencing Methylation analysis software
Sf sufrimiento fetal
SfC sufrimiento fetal y cianosis
DieVF disqueratosis intraepitelial benigno familiar
BpE Bajo de peso y estatura
PS pobre succión
GO gene ontology
ML Machine Learning
1. Introducción.
El TDAH es una patología caracterizada por la incapacidad para sostener y
controlar la atención así como por la emisión de conductas impulsivas (American
Psychiatric Association, 2009a) acompañado por déficit en funciones ejecutivas. El
TDAH es altamente frecuente (Bell, 2011a), persistente (de Zwaan, Gruß, et al.,
2011) y heredable (Thapar, Cooper, Eyre, & Langley, 2013a). Sin embargo, las
bases genéticas de la patología no se han establecido (Johnson, 2015a; Zhou et
al., 2008). Al ser un fenómeno con repercusiones sociales; fracaso escolar, laboral
y dificultades de socialización, se asocia con elevación en niveles de estrés
psicosocial (Hirvikoski, Lindholm, Nordenström, Nordström, & Lajic, 2009). Se ha
hipotetizado que una incorrecta corticogenesis juega un papel predominante en la
emergencia del fenotipo TDAH, debido a que se ha observado un retraso en la
maduración del encéfalo de quienes la padecen (Shaw et al., 2007).
En éste sentido el gen BTBD3 resulta un marcador importante en desarrollo
y mantenimiento de la patología, ya que este participa en los procesos de
orientación de dendritas hacia axones activos e incluso orienta las dendritas
cuando la expresión de los axones es ectópica (Matsui et al., 2013). Se ha
asociado específicamente a ls columnas corticales que inician en la capa 4 de la
corteza (L4) y la arborización de las conexiones tálamocorticales (Wang et al.,
2017). La actividad de este gen se encuentra conservada desde D. melanogaster
hasta H. sapiens (“RefSeq: NCBI Reference Sequence Database,” n.d.). Lo que
sugiere la importancia de la función de este en la correcta organización del
sistema nervioso. Por otra parte estudios de asociación de genoma completo
(GWAS) han mostrado que el SNP rs6131295, el cual está corriente abajo del gen
BTBD3 se asocia significativamente con patologías como trastorno obsesivo
compulsivo (TOC) (Browne, Gair, Scharf, & Grice, 2014; Stewart et al., 2013). Un
estudio encontró similitud estructural entre los encéfalos de pacientes con TOC,
TDAH y espectro autista (EA) (Ameis et al., 2016). Lo que sugiere marcas
genéticas similares en las tres patologías. Sin embargo, los estudios GWAS de
TDAH no muestran resultados consistentes (Romanos et al., 2008; Zhou et al.,
2008). Lo anterior indicaría la participación de procesos tanto genéticos como
epigenéticos en el desarrollo y mantenimiento de la patología.
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
19
Los estudios de genética facilita establecer relaciones entre estructura
genotípica y un fenotipo, esto es especialmente claro en los modelos de herencia
mendelianos, en los cuales la presencia de un alelo dominante (heterocigoto), o
dos recesivos o dominantes (homocigoto), lleva a la expresión de un fenotipo
particular, en patrones de segregación generacional vertical (alelo dominante) u
horizontal (alelos recesivos), en los cuales hay que considerar los porcentajes de
penetrancia y expresividad del fenotipo (Nussbaum, McInnes, & Willard, 2007). Sin
embargo, el genotipo y el fenotipo no siempre guardan relación, la mayoría de los
fenotipos patológicos o ventajosos son producto de interacciones bioquímicas
complejas, es decir, que pueden intervenir más de un gen y factores ambientales.
El efecto del ambiente sobre la conducta y el organismo, además de la diferencia
en los tejidos de un mismo organismo abrieron las puertas a la conceptualización
sobre la epigenética. Esta hace referencia al estudio de los cambios en la
expresión genética en los que no se altera la secuencia de nucleótidos del ADN
(LaSalle, Powell, & Yasui, 2013a).
La metilación del ADN es un proceso en el cual un grupo metilo (CH3) se
agrega al carbono 5 de la Citosina (5meC), generalmente en áreas donde estos
nucleótidos están seguidos de guaninas. La metilación se presenta en zonas
promotoras, intragénicas e intergénicas y dependiendo de dónde se presente la
metilación la consecuencia para el funcionamiento del genoma será diferente. Las
área de mayor influencia de la metilación se denominadas islas CpG; sitios en el
genoma enriquecidos en Guaninas y Citosinas, de aproximadamente 200 pb en
donde el porcentaje de CG es superior al 50% y donde la tasa de CpG observadas
/ CpG esperadas es superior al 0.6 y generalmente asociadas a promotores
(Gardiner-Garden & Frommer, 1987a; Hackett & Surani, 2013a; Ku, Jeon, & Park,
2011a). Debido a que los cambios epigenéticos regulan la expresión de los genes,
han emergido en campo de la investigación psiquiátrica.
BTBD3 es un gen poco estudiado, no existen aún estudios cristalográficos y
tampoco se conoce su panorama exacto de expresión así como su desarrollo
ontológico. En este escenario resulta importante determinar el panorama
epigenético del gen en su región reguladora en una muestra de pacientes con
diagnóstico de trastornos comportamentales. Se seleccionó la técnica BSP PCR
para obtener los porcentajes de metilación individuales de cada CpG del amplicón
20 1. Introducción.
estudiado. Aun así la técnica de conversión con bisulfito no es capaz de
diferenciar entre las distintas marcas epigenéticas del ADN, algunas asociadas a
demetilación. Debido al escaso conocimiento del funcionamiento del gen
2. Justificación.
Las etapas del neurodesarrollo, pre y postnatal, son periodos sensibles en
los que el organismo se encuentra en medio de procesos de cambio que pueden
ser alterados fácilmente. Dichas alteraciones pueden ser constitutivas, es decir,
que son producto del genotipo y/o debido a factores ambientales que generan
cambios en la manera como se expresa el ADN. Cualquiera de estos pueden
llevar a trastornos del neurodesarrollo, que generalmente se asocian con déficit
en las capacidades intelectuales (Millan, 2013a). Entre estos trastornos el TDAH
sobresale por su frecuencia y por la afectación que puede tener en la vida de
quienes lo padecen. Establecer los componentes moleculares de este trastorno
permitiría generar estrategias de diagnóstico y tratamiento más eficaces. Debido a
la similitud neuroanatómica entre diferentes trastornos del desarrollo con TDAH y
a la emergencia de BTBD3 como un gen asociado a estas patologías (Ameis et
al., 2016; Stewart et al., 2013; Yue et al., 2016)). Se propone indagar la relación
entre este gen y el TDAH en una muestra de pacientes Colombianos.
3. Trastorno de déficit de atención e
hiperactividad.
El trastorno de déficit de atención e hiperactividad (TDAH) se constituyó
como una entidad patológica en los años sesentas cuando era denominada como
“reaccion hiperquinética infantil” (Russell A. Barkley, 2005), el TDAH es uno de los
trastornos del comportamiento más frecuentes, se presenta en un 3% a 7% de la
población infantil (Bell, 2011b), con predominancia en varones (Thapar & Cooper,
2016). Se caracteriza por la incapacidad para sostener la atención y un patrón
persistente de conductas impulsivas e hiperactivas (American Psychiatric
Association, 2009b). Además presenta un alto grado de persistencia; se ha
descrito que entre un 30% a 60% de las personas que padecieron TDAH en la
niñez lo mantiene en la adultez (de Zwaan, Barbara, et al., 2011). Es un trastorno
altamente heredable, se estima en un 78% (Thapar, Cooper, Eyre, & Langley,
2013b). Los factores genéticos del TDAH se han estudiado ampliamente, sin
embargo, la etiología del trastorno no ha sido establecida (Johnson, 2015b; Zhou
et al., 2008).
3.1 TDAH y Sistema excitador.
El TDAH, debido a sus características, se ha asociado al incremento de
eventos socialmente estresantes como el fracaso escolar y dificultades en la
socialización (Hirvikoski, Tatja, et al., 2009). Aunque estos eventos estresores no
son traumáticos, si ponen al sujeto en situaciones de estrés crónico, y aunque
dicho estrés no es alto, es perjudicial. Se ha asociado, el estrés crónico en la niñez
y la adolescencia, con una menor capacidad de control neurohormonal debido a
incremento de la metilación de la región 1f del gen NR3C1 (L. J. van der Knaap et
al., 2014).
Se ha postulado que uno de los elementos más importantes que influyen en
el desarrollo del TDAH es un patrón de baja excitabilidad general, es decir, déficit
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
23
en la capacidad para activar las áreas del cerebro asociadas a la regulación
comportamental (Nigg, Hill Goldsmith, & Jennifer, 2004). Este elemento no solo
lleva a una baja capacidad para activar el sistema motivacional, sino que también
implica un sistema inhibidor comportamental hipoactivo, (R. A. Barkley, 1997), esto
es, las redes neuronales asociadas a la inhibición del sistema límbico no generan
suficiente actividad debido a la baja cantidad de neurotransmisores excitadores,
de modo que el sistema límbico no es modulado adecuadamente.
En general se ha observado que el patrón de respuesta ante estrés de los
sujetos diagnosticados con TDAH difiere de los sujetos que no (Johnson, 2015b).
Un estudio encontró que la cantidad de cortisol basal (hormona producida durante
evento estresantes) de niños con TDAH es menor que los controles (Ma et al.,
2011). Diferencias en la respuesta del cortisol también son observables en la
adultez; se encontró, en adultos con TDAH, que el nivel basal de cortisol es similar
a los controles. Sin embargo, este presenta un patrón de elevación significativo
frente al estrés, es decir, que el aumento de cortisol frente a un estímulo
estresante es significativamente mayor en sujetos con TDAH con respecto a
controles (Raz & Leykin, 2015).
La desregularización del sistema excitador y del sistema emocional y de
inhibición comportamental puede asociarse al retraso en el desarrollo de la corteza
prefrontal que se ha observado en niños con TDAH. Un estudio que comparó
imágenes de resonancia magnética de pacientes TDAH versus controles, encontró
un retraso en el engrosamiento cortical en los pacientes con respecto a los
controles, especialmente las áreas frontales (Shaw et al., 2007). Mientras los
controles alcanzaron el grosor máximo a los 7.5 años, los niños TDAH lo
alcanzaron a lo 10.5 años (Shaw et al., 2007). Dicho retraso puede asociarse a la
incorrecta organización cortical producto de cambios en la metilación de genes
reguladores de la organización dendrítica y axonal como BTBD3 (Kazuhiko
Igarashi, Kurosaki, & Roychoudhuri, 2017). Esto puede llevar a que
neurotransmisores asociados al aprendizaje (glutamato), emociones (5-HT) y
motivación (dopamina), no estén presentes de manera suficiente o necesaria en el
sistema nerviosos, esto guarda relación con el fenotipo inatento de los niños
TDAH.
24 3. Trastorno de déficit de atención e hiperactividad.
Estos datos en conjunto apuntan a una desregularización de la actividad
encefálica general, que al menos en niños con TDAH, implicaría una incorrecta
organización cortical, lo que sugiere cambios en los patrones de metilación que
alteran la expresión de genes asociados a la maduración encefálica. Esto podría
estar indicando que existen procesos de maduración y ambientales que están
generando variaciones en las firmas epigenéticas ya establecidas en los niños.
Con esta base, se hipotetiza que los patrones epigenéticos alterados
(hipermetilación o hipometilación) se asocian a los eventos estresantes producto
de las condiciones sociales propias del TDAH, y estos a su vez contribuyen al
desarrollo y mantenimiento de la patología.
4. Epigenética
Los estudios de genética facilitan establecer relaciones entre estructura
genotípica y un fenotipo particular, esto es especialmente claro en los modelos de
herencia mendelianos, en los cuales la presencia de un alelo dominante
(heterocigoto), o dos recesivos o dominantes (homocigoto), lleva una alta
probabilidad de expresar de un fenotipo, en patrones de segregación generacional
vertical (alelo dominante) u horizontal (alelos recesivos) (Nussbaum, McInnes, &
Willard, 2015). Sin embargo, el genotipo y el fenotipo no siempre guardan relación
directa, la mayoría de los fenotipos patológicos (o ventajosos) son producto de
interacciones bioquímica complejas, es decir, que pueden intervenir más de un
gen y factores ambientales. Esta baja correlación entre genotipo y fenotipo abrió la
puerta a las ideas que permitieron la aparición del concepto de epigenética. La
epigenética estudia las modificaciones postraduccionales en la cromatina
heredables y su efecto sobre la transcripción que estas pueden tener (LaSalle,
Powell, & Yasui, 2013b).
Aunque los estudios de epigenética han cobrado relevancia, en tiempos
recientes, no son nuevos. El término “epigenética” fue acuñado por Conrad
Waddington, quien cuestionó el paradigma imperante de su época, según el cual,
existía una relación directa entre genotipo y fenotipo; en su lugar hipotetizó que
debía existir una relación entre genes, ambiente y la expresión del fenotipo (Millan,
2013b; Waddington, 1956). El efecto de la epigenética sobre el fenotipo es
apreciable cuando se observan un par de células, cada una de un tejido diferente
pero de un mismo organismo, estas comparten la misma secuencia de ADN, sin
embargo, se diferencian en la manera como expresan el ADN, esto le confiere su
identidad a cada célula. Estas diferencias en las células de un mismo organismo
se deben al control en la expresión debido a las modificaciones en la cromatina
que generan variaciones en la cantidad de transcritos y en consecuencia afecta la
producción de proteínas. Estos cambios son impulsados por factores como
tiempo, espacio y las circunstancias en las que se encuentra el organismo. Los
procesos epigenéticos permiten que la célula, y por ende el tejido, el órgano y el
sistema, tengan identidad propia, esto es, los procesos epigenéticos participan en
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una muestra de pacientes colombianos
25
la diferenciación celular, establecimiento de patrones de expresión (Maunakea,
Chepelev, Cui, & Zhao, 2013) y mantenimiento de su identidad, a través de
procesos como la impronta genética, procesos activos y pasivos de demetilación
del ADN, modificaciones postraduccionales de las histonas y acción de ARNs no
codificantes (Bartolomei & Ferguson-Smith, 2011; Hackett & Surani, 2013b).
4.1. Señalización y factores epigenéticos.
Los procesos epigenéticos dependen de cascadas de señalización que
regulan su función. En general se proponen 3 elementos fundamentales en esta
cascada: epigeneradores, iniciador epigenético y mantenedores epigenéticos
(Berger, Kouzarides, Shiekhattar, & Shilatifard, 2009). Los epigeneradores son las
señales ambientales o madurativas que activan los iniciadores. El iniciador
epigenético hace referencias a proteínas que actúan como factores de
transcripción y que reclutan a los mantenedores. Los mantenedores epigenéticos
actúa sobre las histonas o modificando el patrón de metilación del ADN (figura 1)
(Berger et al., 2009; Stankiewicz, Swiergiel, & Lisowski, 2013).
figura 1. esquema de la cascada de señalización que lleva a generar cambios epigenéticos.
tomado de (Berger et al., 2009; Stankiewicz et al., 2013).
A diferencia del código genético, en el cual la información de interés está
contenida en la secuencia de nucleótidos, el patrón epigenético está determinado
26 4. Epigenética
por la acción de diferentes componentes moleculares que interactúan de manera
dinámica (figura 2); metilación del ADN (Berger et al., 2009; Stankiewicz et al.,
2013); modificaciones en proteínas histonas, que tienen áreas con residuos de
aminoácidos sensibles a cambios postraduccionales, adicionalmente, los
nucleosomas enteros pueden ser modificados (eyectados, cambiados,
desplazados) (LaSalle et al., 2013b; Millan, 2013b); ARNs no codificantes que van
intervenir de manera directa en la formación, maduración y función del ARN
mensajero (mARN); ARN nucleolar pequeño (snoARN) interviene en le proceso de
splicing del ADN; micro ARN (miARN) y ARN largo no codificante (lncARN) se
unen al mARN evitando que este sea transcrito y participa en formación de
heterocromatina (Millan, 2013b; Siprashvili et al., 2012).
Estos diferentes componentes actúan en una dinámica de sistema, es decir,
que son interdependientes, multicausales y con respuestas no lineales. Así, por
ejemplo, la metilación del ADN es capaz de reclutar HDAC (deacetilasas de
histonas), asociadas a formación de heterocromatina (Kim, J.-M., To, & Seki,
2012; Kouzarides & Tony, 2007) o HAT (acetiltransferasas de histonas), la cuales
pueden ejercen un efecto opuesto a HDAC (Du, Johnson, Jacobsen, & Patel,
2015; LaSalle et al., 2013b), es decir, los cambios en la metilación de los
nucleótidos afectan de manera directa a la condensación de la cromatina y por
ende la manera como se expresan poblaciones de genes. Del mismo modo,
cambios en las histonas o en la metilación del ADN pueden llevar a una mayor o
menor expresión de los ARN no codificantes, lo que impactaría el proceso de
traducción a proteínas y/o la condensación de la cromatina (Hackett & Surani,
2013b; Millan, 2013b).
Los estudios en epigenética han abierto la discusión sobre la posible
existencia de un código epigenético; similar a lo que ocurre con el código de ADN.
Referente a la metilación en el ADN se ha observado que durante los proceso de
replicación del ADN existen mecanismos que permiten que las hebras nuevas
mantengan el patrón de las hebras paternas, es decir, que durante la replicación
celular se hereda el patrón de metilación (Feng et al., 2010), esto lleva a suponer
que una vez establecido un patrón de metilación este será relativamente estable y
se transmitirá en los procesos de división celular. Con respecto a las histonas, el
código epigenético se refiere a la posible relación que existe entre la secuencia de
aminoácidos de la cola de las histonas y sus modificaciones postraduccionales. Se
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una muestra de pacientes colombianos
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sugiere que estas secuencias tienen una mayor importancia como puntos
activadores de otras proteínas que como puntos de anclaje para dichas proteínas
(Rando, 2012). Adicionalmente, el patrón de modificaciones postraduccionales de
las histonas también son transmitidos durante la mitosis y la meiosis. Lo anterior
sugiere cierta estabilidad en los patrones epigenéticos que ya se han establecido.
Una vez se forma el cigoto, las diferente vías de diferenciación, como wnt o notch
(Fiuza & Arias, 2007; Komiya & Habas, 2008) permiten la reorganización del
epigenoma para generar los diferentes tejidos. Sin embargo, la secuencia de
nucleótidos del ADN es mucho más estable y permanece prácticamente inalterada
durante todo el periodo de vida del organismo, por su parte el patrón epigenético
se modifica ante señales madurativas y ambientales de manera más dinámica que
el ADN.
Figura 2. muestra los diferentes niveles de actividad epigenética: ADN, histonas, nucleosomas y
ARN no codificantes. Tomado de (Griffiths & Hunter, 2014).
4.2 Metilación de ADN.
Es un proceso en el cual un grupo metilo (CH3) se agrega al carbono 5 de
la Citosina (5meC), generalmente en áreas donde estos nucleótidos están
seguidos de guaninas, denominados dinucleótidos CpGs (figura 3). La metilación
se presenta tanto en zonas promotoras, intragénicas e intergénicas y dependiendo
de dónde se presente la metilación la consecuencia para el funcionamiento del
genoma será diferente. Las área de mayor influencia de la metilación se
denominadas islas CpG; sitios en el genoma enriquecidos en Guaninas y
Citosinas de aproximadamente 200 pb en donde el porcentaje de CG es superior
al 50% y donde la tasa de CpG observadas / CpG esperadas es superior al 0.6 y
28 4. Epigenética
generalmente asociadas a promotores (Gardiner-Garden & Frommer, 1987b;
Hackett & Surani, 2013b; Ku, Jeon, & Park, 2011b). En el genoma de los
mamíferos el 80% de los CpGs no asociados a islas se encuentran metilados,
mientras que los CpG asociados a islas están demetilados (Baylin & Jones, 2016).
Las islas CpG son puntos de anclaje para los factores de transcripción, lo que
implica que estas zonas deben permanecer demetiladas, de modo que las
proteínas puedan interactuar con el ADN (Li & Zhang, 2014). Pero otra familia de
proteínas, denominadas proteínas con dominio de unión a CpG metilada, utiliza
las CpG metiladas como punto de anclaje y de ese modo puede interactuar con
otros complejos proteicos. Así los procesos de metilación del ADN alteran la
expresión del ADN impidiendo que ciertas proteínas interactúen con el ADN y al
mismo tiempo sirviendo de punto de anclaje para otras.
Los procesos de metilación están a cargo de enzimas denominadas DNA
metiltransferasas (DNMT). Existen dos tipos: de mantenimiento y de novo. Las de
mantenimiento permiten que durante el proceso de replicación del ADN las hebras
nuevas mantengan el patrón de metilación de las dos hebras paternas, la enzima
de mantenimiento se denomina DNA metiltransferasa 1 (DNMT1) (Bestor, 1998;
Provençal & Binder, 2015; Wu & Zhang, 2010). Las enzimas de novo, por su parte,
actúan en función de las condiciones ambientales o internas de la célula y genera
nuevas metilaciones. Estas enzimas son DNA metiltransferasa 3a y 3b (DNMT3a y
3b) son fundamentales en los procesos de establecimiento de la identidad de las
líneas celulares durante el desarrollo (LaSalle et al., 2013b; Okano, 1998). Estos
dos procesos están interrelacionados, y se asocian al desarrollo de enfermedades
en función de las condiciones ambientales. Esto es, si un evento particular genera
un patrón de metilación adverso en un momento determinado de la vida, dicho
patrón de metilaciones serán producto de la acción de DNMT3a y 3b, si estas
células afectadas continúan reproduciéndose, ya sea por mitosis o meiosis, los
cambios en la metilación se extenderá por la acción de los mecanismo de
replicación de ADN y de las enzimas de mantenimiento (DNMT1). Así un evento
ambiental puede tener consecuencias tiempo después de ocurrido y en un área
mayor a la afectada originalmente. Ahora bien, las células neuronales
postmitóticas no entran en mitosis ni en meiosis una vez diferenciadas, lo que
lleva a pensar que, algunos de los patrones de metilación adversos en el sistema
nervioso central se pueden establecer tanto en periodos de diferenciación celular
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una muestra de pacientes colombianos
29
(prenatales) como en periodos posteriores del desarrollo. Fenómeno que se
observa en procesos de estrés postnatal (L. Eiland & Romeo, 2013; McEwen,
Gray, & Nasca, 2015; Provençal & Binder, 2015; Lisette J. van der Knaap,
Oldehinkel, Verhulst, van Oort, & Riese, 2015; Vukojevic et al., 2014; Yehuda et
al., 2015).
Figura 3. Arriba muestra la unión de la citosina y la guanina con los puentes de hidrógeno. Abajo
igual que arriba, pero con la citosina metilada.
Cuando la metilación se da en las regiones promotoras de los genes se
asocia con silenciamiento de estos (LaSalle et al., 2013b; Millan, 2013b), Este
fenómeno es debido a que la metilación impide que los factores de transcripción
interactúen con el ADN (Stankiewicz et al., 2013), adicionalmente la metilación del
ADN recluta proteínas que metilan o deacetilan las histonas, así, el silenciamiento
de una región del ADN puede llevar a la represión en la transcripción de muchos
otros genes (Mifsud et al., 2011). Es importante tener en cuenta que los procesos
de metilación no son lineales, es decir, mientras que la metilación en el promotor
puede silenciar un gen y sirve como punto de anclaje para otras proteínas, este
mismo proceso en el cuerpo del gen puede asociarse a procesos como aumento
de la transcripción o inclusión aberrante de exones en el splicing (Du et al., 2015;
LaSalle et al., 2013b; Maunakea et al., 2013). Es de resaltar que procesos de
hipometilación del promotor también pueden implicar una baja en la transcripción
(Franklin et al., 2010a). Lo que indica que la influencia de la metilación en la
expresión no solo se da por el silenciamiento de los genes, sino que también es
capaz de alterar el producto de transcripción.
30 4. Epigenética
Sin embargo, el proceso de metilación de ADN no es estático, existen
mecanismos asociados a la eliminación de la metilación en las citosinas. Se ha
observado la participación de la familia de enzimas metilcitosina dioxigenasa Ten-
Eleven Translocation (TETs) en la transformación del ADN metilado (5meC) a 5-
hidroximetilcitosina (5hmC), 5-carboxilmetilcitosina (5caC) o 5-formilcitosina (5fC)
(Hackett & Surani, 2013b; Mifsud et al., 2011; Tahiliani et al., 2009). Estos diversos
derivados de la 5meC se han asociados a procesos dinámicos de demetilación del
ADN. Es importante señalar que estas marcas epigenéticas producidas por las
enzimas TET representan dificultades a nivel de investigación, sobretodo al usar la
técnica de cuantificación de metilación de ADN más frecuente, la conversión con
bisulfito. Esta técnica permite comparar la metilación de una región de interés del
ADN (o de todo el genoma) transformando las Citosinas no metiladas en Uracilos,
mientras las Citosinas metiladas permanecen inalteradas; la dificultad que
representa esta técnica está en que el bisulfito tampoco cambia los demás
derivados de las TETs (figura 4), es decir, que al tratar el ADN con bisulfito, la
lectura de la secuenciación no es capaz de diferenciar entre 5meC, 5hmC, 5caC o
5fC (Hackett & Surani, 2013b). Esto implica que lo que puede, en un momento
dado, ser interpretado como un proceso de hipermetilación de un gen, podría ser
una marca asociada a la demetilación y por ende a cambios en la expresión.
Figura 4. representación de la estructura de la citosina metilada y los diferentes derivados de las
enzimas TET. 5mC, 5-metilcitosina; 5hmC, 5-hidroximetilcitosina; 5fC, 5-formilcitosina; 5caC, 5-
caboxilcitosina. Adaptado de (Booth et al., 2013a; Li & Zhang, 2014).
4.3. Dinámica epigenética.
Mientras que la estructura genética se considera altamente estable, la
epigenética es muy dinámica, se modifica en función señales madurativas y
estímulos ambientales. Los patrones epigenéticos, además, pueden ser
heredados transgeneracionalmente sin seguir las leyes de segregación
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una muestra de pacientes colombianos
31
mendeliana (Soloway, 2006) a través de tres procesos principales: 1) cambios
comportamentales de los padres o cuidadores, esto es, si una marca epigenética
particular genera un fenotipo comportamental en los cuidadores, las conducta
asociadas pueden generar las mismas marcas epigenéticas en las crías; un
estudio encontró que madres ansiosas, en monos rhesus, lleva al desarrollo de
crías con conductas de ansiedad crónica (McEwen et al., 2015), en este mismo
sentido se ha descrito, en ratas hembras, que la calidad del cuidado materno
influye en la expresión del receptor de estrógenos 1b en el área preóptica medial,
las variaciones en este receptor modifica la calidad del comportamiento materno,
lo que a su vez genera una expresión similar de dicho receptor en las crías por
efecto de la crianza (Champagne et al., 2006). 2) procesos prenatales adversos.
Cambios en la permeabilidad del útero por glucocorticoides (GC) y sobre
exposición del feto a estrés genera daños en diversas estructuras del sistema
nervioso central (Lucassen et al., 2009; Provençal & Binder, 2015). 3) patrones
epigenéticos en las células germinales que se transfieren en la formación del
zigoto; se han observado, en roedores, que la alteración artificial de de microRNA
en células germinales del padre tiene un efecto en el desarrollo de la cría
(Grandjean et al., 2009a). Otro estudio en roedores encontró que, protocolos de
condicionamiento de miedo con olor en la generación F0 generan un patrón de
hipometilación en el gen Olfr1 que persiste en la generación F1, incluso con cría
cruzada (Dias & Ressler, 2014a). y 4) la dieta, debido al efecto directo de la dieta
sobre el metabolismo es un elemento fundamental en la alteración del epigenoma.
Un estudio encontró que la restricción calórica en monos rhesus, se asociaba con
un mejor estado de salud general y una vida más longeva (Messaoudi et al.,
2010). Debido a que el TDAH es altamente heredable (Thapar, Cooper, Eyre, &
Langley, 2013c), pero sus bases genéticas no son claras, es posible que uno o
varios de estos procesos de transmisión epigenética estén interviniendo en el
desarrollo y mantenimiento del trastorno.
La dinámica de las marcas epigenéticas implican que existen mecanismos
que permiten cambiar los patrones que se han establecido. Los procesos
epigenéticos más descritos en las histonas se dan en los residuos de aminoácidos
que se encuentran en las colas de estas: la metilación se produce en argininas (R)
o lisinas (K), se han asociado con condensación de la cromatina. Sin embargo,
32 4. Epigenética
una marca epigenética como metilación en la lisina 4 de la histona 3 (H3K4me) se
asocia con facilitación de la transcripción, mientras que una marca como H3K9me
o H3K27me3 es represiva (Kouzarides & Tony, 2007; Mifsud et al., 2011; Rice &
Allis, 2001; Yung, Stuetzer, Fischle, Martinez, & Cavalli, 2015). Este proceso
depende de las enzimas metiltransferasas de histonas (HMT). La fosforilación se
ha observado asociados tanto a potenciación como represión de la transcripción,
aquí participan las proteínas kinasas (PK) (Stankiewicz et al., 2013; Yung et al.,
2015). En la fosforilación un grupo fosfato se une a una serina (S), en este caso se
ha detectado que S sirve como punto de anclaje para proteínas metiladoras como
PRC2 (Yung et al., 2015). La acetilación se ha relacionado con facilitación en la
transcripción, en este caso actúa la acetiltransferasa de histonas (HAT). En este
proceso grupo acetilo (COCH3) se una a K. El grupo acetilo neutraliza la carga de
K. Por lo que K pierde su capacidad para interactuar electrostáticamente con
zonas cargadas negativamente en otras histonas o con el ADN, lo cual facilita la
descondensación de la cromatina (Kim et al., 2012; Kouzarides & Tony, 2007;
Mifsud et al., 2011; Rice & Allis, 2001). Adicionalmente en las histonas existen
proteínas que se encargan de eliminar las modificaciones postraduccionales: la
actividad contraria de HAT está a cargo de las de HDAC, que elimina las
acetilaciones; el proceso opuesto de HMT lo desempeñan las demetilasa de
histonas (HDM), encargada de suprimir las metilaciones y mientras las PK se
encarga de fosforilar son las fosfatasas (PP) son las encargadas de eliminar
dichas fosforilaciones (Stankiewicz et al., 2013; Yung et al., 2015)
5. BTBD3.
La proteína BTB (complejo bric-a-brac–tramtrack–broad) también
denominado como POZ (pox virus and zinc finger) es un dominio que suele hacer
parte de las proteínas con función de factor de transcripción en las que se
presenta un dominio de dedos de zinc (Kazuhiko Igarashi et al., 2017; Siggs &
Beutler, 2012). Produce un motif de interacción proteína proteína (Bardwell &
Treisman, 1994). Este dominio se encuentra cerca del área N-terminal de la
fracción de dedos de zinc y hace parte de los receptores citosólicos que reclutan
co-represores como N-CoR o SMRT, así como deacetilasas de histonas en
regiones promotoras (Huynh & Bardwell, 1998; Kazuhiko Igarashi et al., 2017;
Siggs & Beutler, 2012). Sin embargo, un estudio de cristalografía mostró que, los
diferentes dominios BTB tienen diferentes afinidades, así por ejemplo, el dominio
BTB de la proteína LRF no interacciona con SMRT mientras el dominio BTB en
BCL6 si lo hace (Stogios, Chen, & Privé, 2007). Sugiriendo la capacidad del
dominio BTB para generar cambios en la transcripción de manera especializada.
El genoma humano codifica 44 proteínas BTB (Stogios, Downs, Jauhal, Nandra, &
Privé, 2005). Las proteínas con dominio BTB permanecen en el citosol y en
función de una señal forman dímeros y posteriormente se traslocan al núcleo
donde reconoce secuencias y recluta otras proteínas (figura 5) (Stogios et al.,
2007)
La familia de proteínas BTB participan en embriogénesis, desarrollo de
linfocitos, oncogénesis y desarrollo encefálico. Entre estas se encuentran: BCL6,
PLZF, Kaiso, HIC1, FAZF y LRF/ZBTB7, BTBD3 (Kelly & Daniel, 2006; Matsui et
al., 2013; Siggs & Beutler, 2012). En una proteína como BACH el dominio BTB
media los procesos de dimerización (homodímeros y heterodímeros) y de
interacción con correpresores (Kazuhiko Igarashi et al., 2017; K. Igarashi et al.,
1998; Yoshida et al., 1999). Por su parte la proteína BTBD3 (BTB/POZ domain
containing 3) es codificada por un gen que se ubica en el cromosoma 20p12.2
(“BTBD3 BTB domain containing 3 [Homo sapiens (human)] - Gene - NCBI,” n.d.).
Y se asocia a procesos de desarrollo cortical (Matsui et al., 2013).
34 5. BTBD3.
5.1. BTBD3 y Neurodesarrollo.
Se ha descrito que durante la primera semana postnatal, en ratones, este
gen participa en la organización de la corteza somatosensorial primaria, elicitando
la formación de las conexiones tálamo-corticales con la capa 4 (L4), orientando las
dendritas de las neuronas espinosas estrelladas (corteza granular) hacia axones
activos. Cuando el gen BTBD3 es transfectado, en zonas donde regularmente no
se expresa, elicita patrones de orientación dendrítica similares a los que genera en
las zonas donde su expresión es canónica (Matsui et al., 2013).
En modelos knockdown (KD) para BTBD3 se ha observado que las
dendritas se ramifican anormalmente con respecto a los animales con la función
inalterada, así como una reducción en la poda sináptica (Matsui et al., 2013).
Modelos Knockout (KO) para el gen NMDA (receptor N-methyl-D-aspartate)
muestran que BTBD3 permanece en el citosol y genera patrones de ramificación
dendrítica anormal (Matsui et al., 2013). Lo que sugiere que señales
despolarizantes de la neurona activan el proceso de translocación de BTBD3
hacia el núcleo (Matsui et al., 2013). La eliminación, en ratones, de la función de
BTBD3 a través KO del gen Lhx2, el cual es un factor de transcripción que induce
la transcripción de BTBD3, genera cambios en la respuesta electrofisiológica,
expresión de c-fos, incapacidad para formar las barreras corticales de L4 así como
patrones de ramificación anormal, indicando que la hipofunción de BTBD3 se
asocia a déficits en procesamiento sensorial (Wang et al., 2017).
Las proteínas represoras de la transcripción como BACH (figura 5), que
contienen BTB, suelen tener sitios de reconocimiento de secuencia similares a los
que tienen factores de transcripción positivos con dominios bZIP, como NRF2.
Esto permite que entre ambos grupos de proteínas, represoras y activadoras, se
generen intercambios rápidos que facilitan establecer patrones de transcripción
específicos de acuerdo a tiempo y espacio (Kazuhiko Igarashi et al., 2017). Esta
capacidad para cambiar rápidamente de activación a inhibición de la transcripción
es esencial para los procesos de neurodesarrollo durante el periodo postnatal.
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
35
Figura 5. A: dominios de la proteína BACH1. Las líneas verdes indican residuos de cisteína-prolina. El dominio BTB en rojo; CLS, señal de localización citoplasmática y dominio bZIP. Tomado de (Kazuhiko Igarashi et al., 2017). B: estructura cristalográfica del dominio BTB de la proteína LRF. Los recuadro punteados muestran la interfaz de dimerización cerrada; el recuadro sólido muestra la interfaz de dimerización abierta Tomado de (Stogios et al., 2007). C: esquema general de señalización de las proteína con dominio BTB; una señal despolarizante induce la dimerización de las proteínas con dominio BTB, el cual se transloca al núcleo donde recluta correpresores y/o modificadores post traduccionales de histonas.
5.2. BTBD3 y TDAH.
Aunque no se han realizado estudios del grado de expresión del gen en
encéfalos humanos, al comparar el nivel de expresión del gen en la corteza visual
de ratones y hurones se encontró que este gen solo estaba expresado en la
corteza visual de hurones, los cuales dependen más de la información visual que
los ratones (Matsui et al., 2013). Lo que sugiere que la función de reorientación y
poda que induce el gen BTBD3 es esencial para controlar grandes flujos de
información que requieren un procesamiento intenso. Esto queda reflejado en el
desarrollo del cuerpo calloso, que tiene periodos críticos en el periodo postnatal
(Lebel, Walker, Leemans, Phillips, & Beaulieu, 2008), mismo periodo en que genes
asociados a la organización encefálica, como BTBD3 o Lhx2, se encuentran en su
pico máximo de expresión en ratones (Matsui et al., 2013; Wang et al., 2017).
36 5. BTBD3.
Estudios de neuroimagen en niños y adolescentes diagnosticados con
TDAH muestran que existen alteraciones estructurales en la materia blanca con
respecto a controles. Un estudio de asociación de imágenes de difusión y
mediciones comportamentales, en niños y adolescentes con desórdenes del
neurodesarrollo, encontró que, los pacientes TDAH, EA, TOC comparten
similitudes en la disrupción de la materia blanca en el esplenio del cuerpo calloso
comparado con controles. Adicionalmente, TDAH y EA presenta similitudes en las
alteraciones de la materia blanca en tracto corticoespinal, rodilla del cuerpo
calloso, y el fascículo fronto occipital inferior (Ameis et al., 2016). Lo que sugiere
alteraciones tempranas de la organización de la materia blanca.
Por otra parte estudios GWAS han mostrado que el SNP rs6131295, el cual
está en una región cercana del gen BTBD3, se asocia significativamente con
patologías como TOC (Browne et al., 2014; Stewart et al., 2013). Lo cual indica
que las alteraciones en el gen BTBD3 pueden estar asociadas al desarrollo de
patologías del neurodesarrollo y que dichas patologías comparten marcadores
biológicos. Sin embargo, los estudios GWAS de TDAH no muestran resultados
consistentes (Romanos et al., 2008; Zhou et al., 2008). La inconsistencia en la
asociación entre genotipos y la patología sugieren la participación de procesos
epigenéticos en el desarrollo y mantenimiento de la patología.
Los estudios en epigenética del gen BTBD3 son escasos. Sin embargo un
estudio de metilación de DNA del genoma completo (EWA) encontró tres regiones
del gen BTBD3 diferencialmente metiladas en muestras de sangre de pacientes
TOC al compararlos con controles (Yue et al., 2016). En conjunto, los datos
asociados a las similitudes entre los trastornos del neurodesarrollo referentes a la
estructura encefálica, la participación del gen BTBD3 en la correcta organización
encefálica junto con la significacia del SNP rs6131295 en TOC, convierten el gen
BTBD3 en un candidato para el estudio de patología del neurodesarrollo
6. Objetivos.
6.1 General.
Determinar el/los perfiles de metilación del gen BTBD3 en niños con
diagnóstico de TDAH en una muestra de la población de Bogotá.
6.2 Específicos.
● Comparar los niveles de metilación del gen BTBD3 en niños con
diagnóstico de TDAH y un grupo control
● Analizar los niveles de metilación del gen BTBD3 y su relación con
características clínicas de TDAH (inatención o hiperactividad).
● Evaluar, mediante bases de datos, las proteínas que interactúan con
BTBD3 así como su enriquecimiento funcional (este objetivo no hace
parte de objetivos planteados originalmente, se desarrolló con el fin
de establecer de manera más clara la función de éste gen en el
desarrollo y la conducta)
● Evaluar, mediante bases de datos, el patrón de expresión del gen
BTBD3 en cerebro prenatal y adulto (este objetivo no hace parte de
objetivos planteados originalmente, se desarrolló con el fin de
establecer de manera más clara la función de éste gen en el
desarrollo y la conducta)
7. Metodología.
De modo general, a una muestra de niños y adolescentes colombianos, con
y sin TDAH se les tomó una muestra de sangre e historia clínica, se extrajo el
ADN, está pasó por un proceso de conversión con bisulfito, la muestra bisulfitada
se amplificó mediante PCR, se secuenció y se extrajeron los porcentajes de
metilación en cada CpG. Adicionalmente y aunque no estaba contemplado en los
objetivos de este trabajo se desarrolló un análisis PPi, en el que se obtuvieron las
proteínas que interactúan con BTBD3 y se analizaron mediante teoría de grafos y
finalmente se utilizaron datos de microarreglos para determinar el patrón de
expresión del gen en el encéfalo prenatal y auto, junto con los genes
coexpresados en ambos periodos del desarrollo. A continuación se describe con
más detalle cada uno de los procedimientos.
7.1. Metilación
7.1.1. Muestra.
Las muestras para el análisis fueron escogidas del banco de sangre del
Instituto de Genética de la universidad Nacional de Colombia. El material de
análisis fue obtenido de diferentes instituciones, incluyendo colegios distritales e
instituciones hospitalarias. Se seleccionaron 50 casos y 50 controles. Edades
entre 5 a 17 años media = 10.4; 𝜎= 3.2. 48 mujeres 52 hombres. Tanto los casos
como los controles venían previamente diagnosticados, sin embargo, se les
practicaron pruebas Psiquiátricas y Neuropsicológicas que derivaron en
diagnósticos secundarios.
Se entrevistó a cada paciente y familiar, con presencia de uno de los
psiquiatras del servicio y un profesional en psicología para realizar el diagnóstico
basado en los criterios del DSM-V (American Psychiatric Association, 2009a). Se
aplicará tanto a pacientes y controles escalas de tamizaje y severidad para
corroborar los diagnósticos de psiquiatría.
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
39
7.1.2. Criterios de inclusión y exclusión.
Cincuenta (50) pacientes entre 5 a 17 años con diagnóstico de TDAH.
Se seleccionaron 50 participantes entre 5 a 17 años que compartan características
sociodemográficas con los seleccionados en el grupo de pacientes. Los
participantes no deben tener condiciones neurológicas que afecten el desarrollo,
como haber sufrido traumas craneoencefálicos, epilepsia, consumo de sustancias
psicoactivas directas, entre otros. No disposición a participación en el estudio
pese a cumplir las condiciones. Tanto para el grupo de casos como el control, se
excluirán los participantes que obtengan un puntaje de Cociente Intelectual menor
a 70, en la Escala Wechsler de Inteligencia para niños WISC IV. En el caso de los
participantes del grupo control: por medio de historia clínica y escalas
diagnósticas, se corroboró que no existen indicadores de dificultades del
desarrollo, del aprendizaje o trastornos de conducta.
7.1.3. Extracción de ADN.
El protocolo de extracción de ADN se realiza de acuerdo a las
recomendaciones de promega (Oktafiani, n.d.). La muestra de sangre son
obtenidas del banco de muestras del Instituto de Genética de la Universidad
Nacional. La muestra debe ser mezclada durante 10 minutos. Se agrega 20µl de
solución de proteinasa K (PK) en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml.
Posteriormente se añaden 200μl de sangre al tubo que contiene la solucion de
proteinasa K (PK), y se mezcla brevemente. Se añaden 200μl de buffer de Lisis
Celular (CLD) al tubo. Tapar y mezclar por vortex durante al menos 10 segundos.
A continuación se incuba a 56°C durante 10 minutos. Se retira el tubo del área de
incubamiento. Luego se añaden 250μl de buffer de unión (BBA), tapar el tubo, y se
mezcla mediante agitación con vórtex durante 10 segundos. En un tubo colector
con un tubo de union ReliaPrep™, se adiciona el contenido del tubo con la sangre
y el buffer de unión. Se centrifuga por un minuto a máxima velocidad.
40 7. Metodología.
Posteriormente se debe descartar el tubo colector y se usa un nuevo tubo colector
adicionando 500μl de solucion de lavado de columna (CWD) a la columna y se
centrifuga durante 3 minutos a velocidad máxima. Desechar el flujo que se
produce. Este último paso se repite dos veces, de modo que se completen tres
lavados. La columna se pone en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. A
continuación añadir 50-200μl de agua libre de nucleasa a la columna. Centrifugar
durante 1 minuto a velocidad máxima. Finalmente Desechar la columna ReliaPrep
™, y guardar la solucion obtenida.
7.1.4. Conversión con bisulfito.
En el proceso de conversión con bisulfito cada Citosina no metilada se
convertirá en Uracilos y posteriormente en la amplificación pasan a ser Timinas
(Patterson, Molloy, Qu, & Clark, 2011). Debido a que la extracción de ADN se
realiza de sangre, el ADN amplificado proviene de un lisado de diferentes tipos de
células, en el proceso de secuenciamiento se obtiene el porcentaje de metilación
de cada CpG. En la figura 6 se puede observar la secuencia de referencia regular
y bisulfitada.
La muestra de sangre de pacientes y controles es tomada con previo
consentimiento informado junto con las historias clínicas de los pacientes,
controles y familiares. Estas permanecen de manera confidencial en las
instalaciones del Instituto de Genética de la Universidad Nacional. El ADN será
extraído usando el kit ReliaPrepminiprep (Promega) y será sometido a tratamiento
con bisulfito usando EZ DNA Methylation kit (Zymo-Research), posteriormente
será normalizado a una concentración de 15 ng/ul usando mediciones
espectrométricas en Nanodrop 2000. Para la técnica BSP PCR, se usarán primers
diseñados para las diferentes regiones de interés (tabla 1) siguiendo las
recomendaciones para esta técnica (“MethPrimer-Design MSP/BSP primers and
predict CpG islands - Li Lab, PUMCH,” n.d.).
Se debe adicionar 20 μl de ADN purificado a 130 μl de reactivo de
conversión (CT) en un tubo de PCR, se mezcla la muestra y se centrifuga
brevemente. Posteriormente se ponen el/los tubos de PCR en un termociclador
con el siguiente protocolo: 98°C por 8 minutos; 64°C por 3.5 horas y
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
41
almacenamiento de 4°C durante un máximo de 20 horas. Posteriormente se
adicionaron 600 μl de buffer de union M en una columna Zymo-Spin™ IC y poner
la columna en un tubo colector. Poner el contenido de la PCR en la columna
Zymo-Spin™ IC, tapar el tubo y mezclar varias veces. A continuacion se centrifuga
a máxima velocidad por 30 segundos, descartar el fluido del tubo colector. Agregar
100 µl de buffer de lavado M a la columna y centrifugar por 30 segundos. Después
se añaden 200 µl de buffer de desulphonation M a la columna y dejar reposar en la
sala a temperatura ambiente (20-30 °C) entre 15-20 minutos. Después de la
incubación, centrifugar a máxima velocidad durante 30 segundos. A continuación
se añaden 200 µl de buffer de lavado M a la columna y se centrifuga por 30s a
máxima velocidad, este proceso se repite una vez más. Colocar la columna en un
tubo de microcentrífuga de 1.5 ml. Adicionar 10 µl de buffer de elución directo en
la matrix de la columna. Finalmente centrifugar a máxima velocidad por 30s para
eluir el ADN.
7.1.5. BSP PCR.
Este método permite amplificar productos de ADN bisulfitados,. Para el
proceso de amplificación de los productos de conversión con bisulfito se diseñaron
primers con los siguientes criterios: de entre 25 a 30 pb, primers forward y reverse
con TM similar, debían contener múltiples T que provengan de C convertidas, los
primers no deben contener CpGs y el amplicón debe ser de entre 100 a 200 pb
(Clark, Statham, Stirzaker, Molloy, & Frommer, 2006). Los primers fueron
probados in silico para comprobar su especificidad, se utilizó la herramienta online
BiSearch (Tusnády, Simon, Váradi, & Arányi, 2005).
Por cada muestra en un tubo de PCR se ponen 2µl del la ADN eluido en la
conversión con bisulfito, 8.7 µl de agua, 1.5 µl NaCl, 2 µl Buffer, 1.6 µl de dNTPs, 2
µl primer forward y reverse y 0.2 µl Taq polimerasa Maxima Hot Start (Thermo
Scientific). Durante el proceso de estandarización se estableció que para cada
sujeto se debían hacer dos tubos de PCR, de modo que el ADN de ambos se
mezcle y se fortaleciera la señal al secuenciar. Se aplicó el siguiente programa
térmico
42 7. Metodología.
1. 5 minutos a 95 °C. Hot start activation, activación de la Taq polimerasa.
2. 30 segundos a 95 °C. Denaturación del ADN.
3. 30 segundos a 58 °C. Anillaje con los primers.
4. 45 segundos a 72 °C. Extensión o polimerización del ADN
5. se repite desde el paso 2 al paso 4 cuarenta veces.
6. 4 minutos a 72 °C. Extensión final del ADN.
7. Infinite hold a 12 °C
Posteriormente se comprueba la PCR usando 3 µl de producto amplificado
en un gel de agarosa al 1.5% (Patterson et al., 2011). Protocolo completo en
anexos.
7.1.6. Purificación y reacción de secuencia.
El resultado de la amplificación de la PCR debe ser mezclado en un tubo de
eppendorf de 1.5 Ml con acetato de amonio (NH4Ac) y etanol al 100%, luego de
centrifugar esta mezcla se deben realizar varios lavados con etanol al 75%.
Después de descartar el sobrenadante se debe dejar evaporar por completo el
etanol y el ADN se debe resuspender en agua. Protocolo completo en anexos.
Durante el proceso de estandarización, al purificar los amplificados estos no
generaban una señal con la suficiente calidad para ser leídos por el Epigenetic
sequencing methylation analysis (ESME) (Lewin, Schmitt, Adorján, Hildmann, &
Piepenbrock, 2004). Posterior al secuenciamiento. De modo que por cada sujeto
se generaron dos amplificaciones que al ser mezclados en la purificación
conseguían la señal adecuada.
Se comprueba la concentración del ADN resuspendido en el Nanodrop
2000, la concentración ideal de ADN para evitar errores de secuenciamiento es de
1 ng/µl. Si la concentración era mayor la mezcla se diluía con agua.
Posteriormente se hace la reacción de secuencia, para esto se ponen, en un tubo
de eppendorf de 1.5, 4.5 µl de producto de PCR con 0.5 de primer, para cada
muestra se debe mandar a secuenciar por separado el primer forward y el reverse.
Protocolo completo en anexos
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
43
7.1.7. Análisis de metilación.
Los productos purificados de ADN son enviados a secuenciar mediante el
método Sanger. Los resultados de secuenciamientos son leídos por el software
ESME (Lewin et al., 2004), este software presenta varios niveles de control de
calidad que permiten estimar el porcentaje de metilación en cada CpG (figura S4).
De manera breve ESME recibe el archivo .abi y un archivo con la secuencia de
referencia, se realiza un control de entropía, se alinea la secuencia de referencia y
la secuencia a medir, se genera una normalización de la señal del
electroferograma y se calcula el porcentaje de metilación en cada CpG.
7.2. Análisis de redes.
Con el el fin de determinar los elementos moleculares y funcionales con los
que interactúa BTBD3 se desarrollará un análisis de interacción proteína-proteína
(PPi). Para esto se obtendrán datos predictivos y experimentales de las proteínas
que interactúan con BTBD3 de la base de datos STRING (Szklarczyk et al., 2017).
Posteriormente, se utilizarán estas interacciones para generar un grafo en el cual
los nodos representan las proteínas y en aristas las interacciones entre estas.
Sobre dicho grafo se aplicarán seis diferentes criterios matemáticos para detectar
los nodos más centrales; criterios topológicos y finalmente la red se desestabiliza y
se comparara su enriquecimiento funcional.
Se determinarán seis criterios de centralidad. Betweenness centrality
(Betw): en donde para un vértice 𝜈𝑖 en un grafo conectado, Betw es dado
por1
2𝛴𝜈𝑠 ≠ 𝜈𝑖
𝛴𝜈𝑡 ≠ 𝜈𝑖
𝜎𝜈𝑠 𝜈𝑡(𝜈𝑖)
𝜎𝜈𝑠 𝜈𝑡
donde 𝜎𝜈𝑠 𝜈𝑡es el número de rutas cortas (shortest
path) de 𝜈𝑠 a 𝜈𝑡, y 𝜎𝜈𝑠𝜈𝑡(𝜈𝑖)es el número de rutas cortas de de 𝜈𝑠 a 𝜈𝑡que pasan
por 𝜈𝑖 . Eigenvector centrality (Eigen): para un grafo no dirigido y conectado se
aplica 𝐴. 𝑐 = 𝜆1𝑐, donde 𝜆1es el Eigen más grande de la matriz adyacente del
grafo 𝐴. Closeness centrality (Closs): si 𝑑 es la matriz de distancia (la matriz
44 7. Metodología.
cuadrada(𝑑𝑖,𝑗)consiste en todas las distancias del grafo desde el vértice 𝜈𝑖 al
vértice 𝜈𝑗 ) entonces el promedio de distancia 𝑙𝑖 desde el vértice 𝜈𝑖 a todos los
demás vértices conectados es dado por 𝛴𝑗 𝑑𝑖,𝑗
𝑘 donde la suma es tomada sobre
todos los (𝑑𝑖,𝑗)finitos y 𝑘es el número de vértices conectados a 𝜈𝑖 . Pagerank
centrality (PageR): requiere especificar los pesos 𝛼satisfactorio para 0 ≤ 𝛼 ≤ 1 y
de manera opcional tomar una lista de centralidades iniciales 𝛽cuyo valor suma 1.
Degree Centrality (Degree): se define como el número de aristas que conducen
desde o hacia un nodo, Degree se encuentra entre 0y 𝑛 − 1, donde 𝑛es el número
de vértices en un grafo. Edgebetweenness centrality (EdgeB): es definido
por𝐸𝑑𝑔𝑒𝐵(𝑒) = 𝛴𝜈𝑖𝛴𝜈𝑗
𝜎𝜈𝑖𝜈𝑗(𝑒)
𝜎𝜈𝑖𝜈𝑗
, donde 𝜎𝜈𝑖𝜈𝑗denota el número de rutas cortas
entre los vértices 𝜈𝑖 y 𝜈𝑗 y deja que 𝜎𝜈𝑖𝜈𝑗(𝑒) denote el número de rutas cortas entre
los vértices 𝜈𝑖 y 𝜈𝑗que van a través de la arista 𝑒. Cada una de estas ecuaciones
da un índice numérico a cada nodo (vértice) y arista, estos índices se organizarán
en un histograma de modo que se pueda visualizar la distribución de las
centralidades.
Posteriormente, la red pasará por desestabilización topológica (DT). En
éste análisis se toman todos los nodos que interactúan de modo directo con
BTBD3 y se eliminan de la red principal, de este modo se obtienen dos redes, la
red principal y la red sin los nodos que interactúan con BTBD3, en esta nueva red,
la red sin los nodos que interactúan con BTBD3, se vuelven a aplicar los análisis
topológicos y se obtienen las distribuciones. Las distribuciones de la red principal y
la subred sin BTBD3 se comparan usando el test Kruskal Wallis para
distribuciones no paramétricas. De modo que se pueda comprobar si las
centralidades de la red sufren cambios significativos al eliminar BTBD3.
La red pasará por dos tipos de análisis de enriquecimiento funcional. En el
primero se generarán comunidades al interior de la red, esto es, los nodos que
tengan mayor correlación se agrupan en subcomunidades. Se extraerá el
enriquecimiento funcional de la red al suman cuántas proteínas están dedicadas a
cada una de las funciones ontológicas: procesos biológicos, subunidades
proteicas PFAM, subunidades proteicas INTERPRO, vías de señalización KEGG,
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
45
funciones moleculares y componentes celulares. Posteriormente se comparan los
enriquecimientos funcionales en la red principal y la red desestabilizada, de modo
que se pueda establecer qué funciones se pierden o reducen al eliminar BTBD3
de la red principal.
7.3. Análisis de expresión y co-expresión.
De modo que se pueda establecer los principales sitios (hubs) de expresión
del gen BTBD3 en el encéfalo humano y de este modo establecer relaciones
anatomo funcionales y anatomo patológicas, se utilizará la base de datos del AIBS
(Hawrylycz et al., 2012; J. A. Miller et al., 2014) de donde se extraerán datos de
experimentos de microarreglos que se desarrollaron en encéfalos humanos, tanto
en estado prenatal como adulto, y de este modo determinar el patrón de expresión
temporoespacial del gen.
Los datos del AIBS se obtendrán de microarreglos desarrollados en de 4
cerebros en estado prenatal que van desde las 15 semanas postnatal hasta las 21
semanas postnatal. Por su parte las mediciones para el cerebro adulto se
desarrollaron en 12 encéfalos, que iban de los 24 años a los 57 años. De estos, 8
cerebros eran de hombres y 4 de mujeres; 4 afroamericanos, 6 caucásicos y 2
hispanos. El nivel de expresión del gen fue medida usando dos sondas (id.
A_23_P102759, id. A_24_P134356). En el encéfalo prenatal se tomaron medidas
para 23 núcleos encefálicos y en el caso del adulto fueron 27, que cubren áreas
corticales y subcorticales.
Los datos de las áreas en cerebro prenatal y cerebro adulto se compararán
usando el test estadístico K-sample T, esto permitirá establecer si la variación de
expresión del gen en ambos periodos del desarrollo es significativa.
Adicionalmente se se obtendrán datos de genes co-expresados con BTBD3 en
ambos periodos del desarrollo, los datos se correlacionarán usando el Spearman
test, esto permitirá establecer la manera cómo se relacionan los diferentes genes.
Finalmente a ambos grupos de genes se les hará un análisis de enriquecimiento
funcional, de modo que se pueda establecer en su contexto qué funciones son
más importantes en cada periodo del desarrollo.
46 7. Metodología.
7.4. Análisis estadístico.
Se utilizará el software ESME para obtener los porcentajes de metilación de
las CpGs individuales (Lewin et al., 2004). Para comparar los vectores de acuerdo
a cada una de las variables clínicas se utilizará el test Kruskal Wallis para
distribuciones no paramétricas. Este test permite determinar si la distribución de
dos o más grupos es igual. Kruskal Wallis es la versión no paramétrica del test
ANOVA (Kruskal & Wallis, 1952). Posteriormente se desarrollarán modelos de los
datos utilizando un clasificador lineal basado en Machine Learning (ML) para
determinar el patrón de selección y el modelo más apropiado. ML se refiere a una
metodología utilizada para modelar datos, similar al modelado que se realiza en la
estadística convencional, pero a diferencia de esta, en ML existen algoritmos que
generan los modelos de manera automática (Flach, 2012)
En el caso de las PPi se obtienen datos topológicos de la red de
interacciones, la red es desestabilizada y la distribución de ambas redes, original y
desestabilizada, es comparada usando el test de Kruskal Wallis. Adicionalmente
se utilizará ML para detectar correlaciones internas en la red y generar un
esquema de las comunidades al interior de la misma. Los datos obtenidos de
AIBS, se organizarán de acuerdo a si son prenatales o adultos, los niveles de
expresión de las áreas del cerebro prenatal suficientemente desarrolladas como
para compararlas con cerebro adulto se testearán usando el test K-Sample T para
vectores con distribución paramétrica. Adicionalmente los datos de co-expresión
se correlacionarán con el test Spearman para distribuciones no paramétricas. El
análisis de topológico, las estimaciones de distribución de los vectores, las
correlaciones, los test estadísticos inferenciales y los algoritmos de Machine
Learning vienen incluídos como funciones en el Software Mathematica 11.2.
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
47
7.5. Enriquecimiento funcional.
Se extraerán los enriquecimientos funcionales de las redes completa y
desestabilizada: componentes celulares, funciones moleculares, subunidades
proteicas INTERPRO, vías de señalización KEGG, subunidades proteicas PFAM y
procesos biológicos. Y se comparará la cantidad de proteínas dedicadas a cada
función en las dos redes, con el fin de determinar qué procesos se veían afectados
por la desestabilización topológica. FInalmente se determinan qué funciones se
pierden al generar la desestabilización topológica.
Figura 6. Características de la región amplificada. La tabla muestra las coordenadas y
características del gen BTBD3. La gráfica muestra la posición relativa del gen en el cromosoma.
Los rectángulos rojos representan los exones del gen BTBD3 con la zona de inicio de la
transcripción (TSS) señalada. El recuadro azul representa al área amplificada, la cual se encuentra
a 307 pares de bases corriente arriba del TSS. Abajo se muestran las secuencias regular y
convertida con bisulfito con los dinucleótidos CpG señalados en negrilla y con un superíndice. La
secuencia de interés (en azul), se encuentra en la coordenada cromosómica 11.871.010 -
11.871.190.
48 7. Metodología.
Tabla 1. Primers y secuencias
Primer Coordenada Secuencia de referencia
Coordenadas de las CpGs
Fw : 5’-
TAGATTATTGAAGAG
TGTAGT -3’
chr20:11871010 CCAGATCACTGAAG
AGTGTAGTCGTTAG
GTATTACGAGACCT
CTATTTATGCACCCT
CCTTATCTGTTAGAG
AGAGGGCTGGCATC
AGTGCCTAAAAAGG
AGCCCCAAAGCCAA
ATGCAATCGGCCCT
CTATTACCGGAGGA
TGCCCTGTATCCCG
CACATCCACTCTGC
CAGTGCAAGT
CpG1: 11.871.033
CpG2: 11.871.045
CpG3: 11.871.132
CpG4: 11.871.146
CpG5: 11.871.165
Rv: 5’-
ACTTACACTAACAAA
ATAAATATA -3’
Reporte de los primers utilizados para amplificar la región de interés, la coordenada amplificada en
el genoma, la secuencia amplificada y las coordenadas de cada CpG en el cromosoma 20.
8. Resultados
8.1. Patrón de metilación en BTBD3.
A una muestra de pacientes (diagnosticados con TDAH) y controles con
edades entre 5 y 17 años se les tomó muestra de sangre e historia clínica.
Posteriormente fueron pareados por edad y sexo. Se extrajo el ADN de las
muestras de sangre, este ADN fue bisulfitado y se amplifico la región (“Human
hg19 chr20:11,870,949-11,871,848 UCSC Genome Browser v362,” n.d.).
Posteriormente se secuenció y se extrajeron los porcentajes de metilación en cada
CpG con el software ESME (Lewin et al., 2004). Las diferencias en porcentajes de
metilación se analizaron utilizando test no paramétricos multivariados. En general
todos los dinucleótidos CpGs del amplicón muestran valores de porcentaje de
metilación cercanos a 0% (figura 7), lo que es concordante con diferentes estudios
de metiloma (figura S3). Los valores descriptivos de los porcentajes de metilación
fueron, CpG1: Min = 0, Max = 0.06, 𝜒= 0.0028, Mediana = 0; CpG2: Min = 0, Max
= 0.11, 𝜒= 0.0074, Mediana = 0; CpG3: Min = 0, Max = 0.255 , 𝜒= 0.0083, Mediana
= 0; CpG4: Min = 0, Max = 1, 𝜒= 0.039, Mediana = 0; CpG5: Min = 0, Max = 0.1, 𝜒=
0.0053, Mediana = 0. Los porcentajes de metilación de acuerdo al diagnóstico
inicial (caso, control) no mostraron diferencia (figura 7).
Dichos porcentajes de metilación mostraron distribuciones mixtas: CpG1, 2
y 5 Uniform distribution; CpG3: Weibull Distribution; CpG4: Student T Distribution.
Los valores de metilación se compararon en función de las diferentes variables
clínicas. Las variables que arrojaron valores significativos en al menos una CpG se
agruparon en tres categorías: ambientales (figura 8 a la 10), durante el embarazo
(figura 11 a la 13) y postparto (figura 14 E a la 16). Ninguna de las demás
variables de la historia clínica se asoció a cambios significativos en los porcentajes
de metilación (tabla 2). Sin embargo, las interacciones entre variables si arrojaron
significancia.
50 8. Resultados
Usando métodos de modelamiento de datos basados en machine Learning,
se desarrollaron clasificadores lineales para cada variable. Posteriormente se
evaluó la eficacia de cada clasificador y se trazaron las probabilidades de cada en
variable en función del porcentaje de metilación de cada CpG. Las variables
Región de nacimiento y enfermedad al nacer fueron las que mejor se ajustaron al
modelo, es decir, con un Accuracy de clasificación >69% (figura 17 y 18). Los
participantes que no tuvieron ninguna enfermedad al nacer muestran mayor
probabilidad de clasificación en cualquier nivel de metilación, esto es, el no
padecer enfermedades al momento de nacer (N/A) es un factor que facilita que se
generen porcentajes de metilación a la alta o a la baja (figura 17). La CpG2
muestra que el bajo peso y estatura al nacer se asocia con elevación en los
porcentajes de metilación. En la CpG3 el sufrimiento fetal muestra tendencia a
tener una mayor relación con niveles más elevados de metilación. En el caso de la
CpG4 la relación es con la Cianosis. En la CpG5 solo la variable N/A mantiene
relación con bajos y altos niveles, es decir que esta CpG no parece ser
influenciada por enfermedades al nacer (figura 24).
Por su parte en la variable Región de nacimiento la CpG 1, 2 y 4 mostró
que Bogotá tiene mayor relación con niveles elevados de metilación. Las CpG 3 y
5 muestran con proceso inverso, esto es, los niveles más bajos de metilación se
asocian más con las personas nacidas en Bogotá y a medida que el porcentaje de
metilación aumenta su asociación con Otras regiones aumenta (figura 18).
Mostrando una influencia diferencial en función de la región de nacimiento, con
mayor influencia en los niveles elevados de metilación de parte de los nacidos en
Bogotá.
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
51
Figura 7. Distribución del porcentaje general de metilación en cada CpG de acuerdo a si es caso o
un control. La mayoría de los valores son cercanos a 0 %. Sin embargo, parece existir una
tendencia en las CpG 3 y 4 a la hipermetilación. Cada CpG tiene el p-value en la parte superior.
8.1.1. Factores ambientales asociados a la elevación
de la metilación.
Figura 8. Porcentaje de metilación en función de la región de nacimiento. Los sujetos se agruparon
de acuerdo a si habían nacido en Bogotá o en otras regiones del país. El p-value se muestra en la
parte superior, basado en el test kruskal wallis. Se observa una diferencia significativa en la CpG2;
figura B, en donde se ve una tendencia a la hipermetilación de las personas que nacieron en
Bogotá.
52 8. Resultados
Figura 9. Porcentaje de metilación en función de la edad del padre al momento de la toma de
muestra de sangre. Las edades de los padres fueron agrupadas en rangos de 10 años. La CpG3
muestra diferencia significativa hacia la hipermetilación en participantes cuyos padres están entre
los 40 a 49 años. La CpG5, figura C, muestra tendencia hacia la hipermetilación en los
participantes con padres entre 20 a 29 años de edad. Se utilizó el test Kruskal Wallis.
Figura 10. Porcentaje de metilación en función de la edad de la madre al momento de la toma de
muestra de sangre. Las edades de las madres fueron agrupadas en rangos de 10 años. La CpG3,
figura C, muestra diferencia significativa hacia la hipermetilación en participantes cuyas madres
están entre 30 a 39 años, aunque por la forma de la distribución pareciera que quien tiene mayor
influencia son las madres de rangos entre 20 a 29 los test posteriores mostraron que son las
madres del rango posterior. Se utilizó el test Kruskal Wallis.
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
53
8.1.2. Factores in utero asociados a la elevación de la
metilación.
Figura 11. Porcentaje de metilación en función de la percepción de estrés durante el embarazo
(estrés prenatal). Se agruparon de acuerdo a si la madre del participante afirma o no haber tenido
estrés durante el embarazo. La CpG4, figura D, muestra diferencia significativa hacia la
hipermetilación cuando la mamá del participante reporta haber sufrido de estrés durante el periodo
de embarazo. Se utilizó el test Kruskal Wallis.
Figura 12. Porcentaje de metilación en función del reporte de la madre respecto a si había sido o
no un embarazo deseado. Las CpG 1 y 2, figura A y B respectivamente, muestra una diferencia
significativa hacia la hipermetilación cuando la madre reporta que sí fue un embarazo deseado. Se
utilizó el test Kruskal Wallis.
54 8. Resultados
Figura 13. Porcentaje de metilación en función de los riesgos para el embarazo durante el tercer
trimestre. La CpGs 4, figura D, muestra hipermetilación significativamente más alta cuando el
reporte de riesgo en el tercer trimestre es negativo. Se utilizó el test Kruskal Wallis.
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
55
8.1.3. Factores postparto asociados a la elevación de
la metilación.
Figura 14. Porcentaje de metilación de acuerdo al tipo de parto. La CpG5, figura E, muestra una
metilación significativamente más elevada como efecto de un parto vaginal. La CpG4, figura D,
muestra una tendencia hacia la hipermetilación cuando se reporta un parto vaginal. Se utilizó el
test Kruskal Wallis.
Figura 15. Porcentaje de metilación en función de si el participante tuvo o no alguna enfermedad al
nacer. Los participantes fueron agrupados en las categorías Sí (si padeció alguna enfermedad al
nacer) o No. La CpG4, figura D, muestra un patrón de hipermetilación en los participantes que
padecieron alguna enfermedad al nacer. Se utilizó el test Kruskal Wallis.
56 8. Resultados
Figura 16. Porcentaje de metilación en función del tipo de alimentación durante los primeros
meses de vida. La CpG1, figura A, muestra que los participantes alimentados únicamente con
leche materna tienen un porcentaje de metilación significativamente más elevado que los demás.
Se utilizó el test Kruskal Wallis.
Tabla 2. Resumen de las variables clínicas que no mostraron significancia.
CpG1 CpG2 CpG3 CpG4 CpG5
p-value
Semanas de gestación 0.76 0.74 0.77 0.49 0.82
riesgos primer trimestre 0.54 0.81 0.66 0.43 0.6
riesgos segundo trimes 0.16 0.31 0.2 0.26 0.7
estado de ánimo prenatal 0.91 0.67 0.44 0.13 0.48
orden gestación 0.88 0.92 0.29 0.95 0.71
tipo de vivienda 0.12 0.18 0.14 0.27 0.11
Estrato 0.76 0.32 0.09 0.93 0.44
Estado civil padres 0.1 0.2 0.61 0.23 0.34
Antecedentes psiquia 0.21 0.34 0.72 0.96 0.24
Asma 0.64 0.42 0.82 0.16 0.6
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
57
Lateralidad 0.2 0.4 0.42 0.9 0.08
rinitis 0.53 0.56 0.58 0.23 0.8
dermatitis 0.64 0.68 0.51 0.43 0.71
otitis 0.88 0.52 0.16 0.73 0.1
Amigdalitis 0.72 0.56 0.23 0.38 0.72
Varicela 0.80 0.85 0.76 0.38 0.24
Adenoide 0.44 0.39 0.62 0.43 0.28
gastritis 0.85 0.75 0.19 0.18 0.41
febriles 0.44 0.39 0.62 0.43 0.81
enf. respiratorias 0.88 0.95 0.86 0.63 0.6
medicamento 0.48 0.43 0.9 0.95 0.14
edad niños 0.65 0.54 0.6 0.16 0.19
diagnóstico inicial: Caso o control
0.34 0.69 0.59 0.8 0.7
Diagnóstico secundario 0.9 0.5 0.6 0.7 0.1
Sexo 0.61 0.96 0.33 0.3 0.57
Peso al nacer 0.99 0.93 0.53 0.36 0.93
Talla al nacer 0.73 0.89 0.09 0.4 0.45
Parto x estrés prenatal 0.5 0.6 0.3 0.01 0.1
Parto x estrés prenatal x diagnóstico inicial
0.2 0.4 0.6 0.04 0.4
La primera columna muestra la variable, las demás columnas representan cada una de las CpGs, y
los valores p de cada comparación se listan debajo.
58 8. Resultados
Figura 17. Distribución de porcentaje modelamiento basado en machine learning de cada una de
las enfermedades de los participantes al nacer como función del porcentaje de metilación. En la
parte superior de cada figura se ve el porcentaje de precisión con la que pueden ser clasificadas
cada una de las características modeladas. Las CpGs 1, 2, 3 y 4 fueron modeladas usando Logistic
Regression, la CpG5 se modeló utilizando Nearest Neighbors. Sf = sufrimiento fetal, SfC =
sufrimiento fetal y cianosis, DieVF = disqueratosis intraepitelial benigno familiar, BpE = Bajo de
peso y estatura, PS = pobre succión
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
59
Figura 18. Distribución de porcentajes modelamiento basado en machine learning de acuerdo a la
región de nacimiento de los participantes. En la parte superior de cada figura se ve el porcentaje de
precisión con la que pueden ser clasificadas cada una de las características modeladas. La CpG 1
y 4 se modeló utilizando un algoritmo de Random Forest. Para la CpG2 se utilizó el algoritmo
Decision Tree. En la CpG 3 y 5 se utilizó Logistic Regression.
8.2. Red de Interacción Proteína Proteína (PPi)
del gen BTBD3.
El análisis de interacciones del gen BTBD3 muestra una red extendida de
305 nodos y 12497 interacciones (figura 19). Esta red se generó utilizando datos
procedentes de minería de texto, bases de datos, co-expresión, co-ocurrencia y
datos experimentales obtenidos en la base de datos STRING (Szklarczyk et al.,
2017). De los 305 nodos 44 interactúan de manera directa con BTBD3 formando
una subred (figura 21E). Las proteínas que interactúan de manera directa con
BTBD3 se encuentran asociados a: transición G2/M del ciclo celular mitótico,
proceso catabólico de proteasa dependiente de la ubiquitina dependiente de SCF,
procesos catabólico de proteína dependiente de ubiquitina, ritmo circadiano,
desestabilización de proteínas, ruta de señalización Notch, nedilación de
proteínas, meiosis ovocitaria, ruta de señalización Wnt, procesamiento de
proteínas en retículo endoplásmico (figura 19 y tabla suplementaria S1).
60 8. Resultados
El análisis topológico de red sugieren que al tener un alto coeficiente de
agrupamiento (0.818), se trata de una red robusta (tabla 3). Adicionalmente se
tuvieron en cuenta las medidas topológicas referentes a: Betweenness centrality
(Betw) se define como la centralidad de un nodo en función del número de rutas
más cortas (Shortest path) que lo atraviesan (Durant & Wagner, 2017). La
distribución muestra que la mayoría de los nodos tienen un bajo Betw (figura 20).
Closeness centrality (Closs) se refiere a la centralidad basada en la media de
longitudes de todos los Shortest Path desde el nodo medido hasta cualquier otro
nodo que pueda ser alcanzado en la red (Estrada, 2012). Closs tiene su pico de
frecuencia más alto entre 0.55 y 0.6 (figura 20), las proteínas o nodos que
muestran los valores más elevados en este índice son: RPS27A, UBA52, RBX1,
UBC, UBB, CUL1, SKP1, BTRC. SKP2, RNF7, BTBD1, BTBD6, FBXW5,
ANAPC10, FBXW7, CUL3, CDC34, FBXW11, CDC20, UBE2D1, implicadas en
Proceso catabólico de proteína celular, proceso catabólico de proteína
dependiente de ubiquitina mediado por proteasoma, ubiquitinación de proteína ⼀
Las reacciones químicas y las vías que resultan en la descomposición de una
proteína o péptido por hidrólisis de sus enlaces peptídicos, iniciadas por la unión
covalente de ubiquitina y mediadas por el proteasoma.(Gene Ontology
Consortium, n.d.)⼀, proceso del ciclo celular mitótico, respuesta al estímulo.
Eigenvector centrality (Eigen) es una medida de centralidad que se basa en la
suma de la centralidades de sus vecinos, a mayor de centralidad de estos, mayor
Eigen tiene el nodo, lo que implica elevada interconectividad (Estrada, 2012). Los
puntos mejor interconectados en esta red son las proteínas: SKP1, CUL1, RBX1,
RPS27A, UBA52, UBC, UBB, SKP2, BTRC, relacionado a proceso catabólico de
la proteína celular, regulación del proceso metabólico de la macromolécula ⼀
regulación de la descomposición de moléculas grandes⼀, regulación de la
respuesta al estímulo, comunicación celular, vía de señal del receptor de la
superficie celular, regulación del ciclo celular. Page rank (PageR) centrality es una
medida que permite identificar qué nodos en una red son fundamentales para el
funcionamiento de la misma, los nodos que mejor puntúan en este análisis son:
RPS27A, CUL1, SKP1, UBA52, RBX1, UBC, UBB, BTRC, responsables de
procesos como comunicación celular, proceso viral, regulación del proceso
metabólico celular, respuesta al estrés, vía estimulante de la señal del receptor de
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
61
lectina de tipo C. Degree centrality (Degree) este criterio de centralidad que está
definido por la cantidad de aristas que llevan al nodo y/o salen de este. los nodos
con mayor Degree son: RPS27A, UBA52, CUL1, SKP1, RBX1, UBC, UBB, BTRC,
SKP2, que se han asociado a regulación del proceso metabólico celular,
comunicación celular, vía de señal del receptor de la superficie celular, respuesta
inmune innata, respuesta al estrés, regulación negativa de la transcripción. Edge
betweenness centrality (EdgeB) es una medida de centralidad para aristas
(interacciones). La medida de esta centralidad se da en función de la cantidad de
Shortest path que pasan por la arista medida. Este criterio de centralidad tiene una
distribución tipo Poisson (figura 20). En este caso las interacciones más
importantes son: RHOBTB3 <-> CUL3, BTBD6 <-> RHOBTB3, BTBD6 <-> IMP4,
RHOBTB2 <-> CUL3, BTBD3 <-> IMP4, RHOBTB2 <-> BTBD1, RHOBTB2 <->
BTBD6. El listado completo de las medidas topológicas de la red se encuentran en
la tablasuplementaria S1.
Con el fin de identificar el total de los nodos más influyentes en la red, los
puntajes de todos los criterios topológicos fueron normalizados a Z y se tomaron
todos los nodos que se encontraban por encima de la primera desviación
estándar: 16 de Betw, 27 de Closs, 110 de Eigen, 31 de PageR, 44 de Degree. Al
ser combinados en una sola lista, y al eliminar los nombres repetidos, se
obtuvieron 116 genes. Los procesos biológicos más enriquecidos a este subgrupo
son la ubiquitinación y metabolismo de proteínas. El resto de elementos
enriquecidos en la red pueden ser encontrados en la figura suplementaria S2, las
características de la red y el listado de genes pertenecientes a esta están en la
tabla suplementaria S2.
El análisis de desestabilización topológica permite determinar si los
procesos biológicos asociados a un sistema se ven afectados al eliminar
determinados componentes de este. Se identificaron todos los nodos que
interactúan de manera directa con BTBD3 (figura 21 A y E) y se eliminaron de la
red principal. Posteriormente se compararon las distribuciones topológicas de la
red original con los de la red desestabilizada. Se observaron diferencias
significativas en Eigen, PageR, Degree y EdgeB (figura 21 G, H, I, J, K y L).
Una de las características más importante de las redes son las
emergencias de comunidades al interior de estas, es decir, grupos de nodos que
se encuentran altamente interconectados, lo que los lleva a formar subgrupos en
62 8. Resultados
una red. Usando algoritmos incorporados en el software Mathematica 11, se
detectaron 3 diferentes comunidades en la red principal (figura 21B) las cuales
representan unidades funcionales dentro de la red. Los procesos biológicos, así
como las vías de señalización y el conjunto de genes pertenecientes a cada grupo
están resumidos en la tabla 4.
Figura 19. Red PPi del gen BTBD3. Red de interacción predicha basada en minería de texto,
bases de datos, co-expresión y co-ocurrencia. Se incluyen datos de interacción encontrados
experimentalmente. El patrón de colores en nodo y vértices se refieren al análisis topológico de los
mismos. Red analizada en cytoscape utilizando datos de la base de datos STRING (Szklarczyk et
al., 2017).
Tabla 3. resumen de las características de la red
Clustering coefficient 0.818
Connected components 1
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
63
Network diameter 4
Network radius 2
Network Centralization 0.441
Shortest paths 92720 (100%)
Characteristic path length 1.9226
avg. number of neighbors 81948
Number of nodes 305
Number of edges 12497
Network density 0.27
Isolated nodes 0
Number of self-loops 0
Figura 20. Análisis de frecuencia de los componentes topológicos de la red. Betweenness
centrality: centralidad de intermediación; Closeness centrality: centralidad de cercanía; Eigenvector
centrality: centralidad de auto vector; Pagerank centrality: centralidad de rango de página; Degree
centrality: centralidad de grado; Edge betweenness centrality: centralidad de intermediación de
arista. El eje Y representa la frecuencia y el eje X muestra el valor centralidad de acuerdo a cada
criterio de centralidad.
64 8. Resultados
Figura 21. Análisis topológico y de desestabilización topológica. A. grafo simplificado de la red de
la figura 19. Se resalta la subred BTBD3 en rojo, es decir, los nodos que interactúan de manera
directa con BTBD3. B. grafo de comunidades emergentes de la red de la sección A. C. grafo
resultante al eliminar la subred BTBD3. D. grafo de la subred BTBD3 con este gen señalado en
rojo. E. comparación de distribución de Betweenness centrality (Betw) de la red completa y la red
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
65
en la que se elimina la subred de BTBD3. F. distribución Eigenvector centrality (Eigen) en red
completa y red sin la subred BTBD3. G. Closeness centrality (Closs) entre la red completa y la red
desestabilizada (sin la subred BTBD3). H. distribución de centralidad de Pagerank (PageR) en la
red original versus la red desestabilizada. I. Degree centrality (Degree) en las dos redes. J. Edge
betweenness centrality (EdgeB) en la red original comparada con la red desestabilizada. KW: test
Kruskal Wallis.
Tabla 4. resumen de procesos biológicos, las vías de señalización KEGG y el
conjunto de proteínas enriquecidos en cada una de las comunidades de la figura
21B.
Procesos biológicos GO Rutas KEGG Proteínas pertenecientes al grupo
Grupo 1
Modificación de proteínas por conjugación de proteínas pequeñas (97), Ubiquitinación de proteínas (93), Proceso catabólico de la proteína dependiente de modificación (80), Proteólisis implicada en el proceso catabólico de la proteína celular (81), Proceso catabólico de proteínas celulares (81), Proteólisis (85), Proceso catabólico proteosomal de las proteínas (60), Proceso de modificación de proteínas celulares (99), Poliubiquitinación de proteínas (44), Proceso metabólico de la proteína celular (98), Regulación positiva del proceso catabólico de la proteína celular (26), Regulación de la transición de fase del ciclo celular (29), Proceso metabólico de la macromolécula celular (100), Regulación de la separación de la cromátida hermana mitótica (15), Regulación negativa de la ubiquitinación de proteínas (20), Regulación de la transcripción del promotor de ARN polimerasa II en respuesta al estrés (12), Reparación post-replicación (11), Regulación del proceso de modificación de proteínas (39), Regulación negativa de la organización de organelos (18), Fisión de organelos (21), Respuesta celular al
Proteólisis mediada por ubiquitina (62), Meiosis ovocitaria (15), Ciclo celular (15), Procesamiento de proteínas en retículo endoplásmico (13), Maduración de ovocitos mediada por progesterona (10), Ritmo circadiano (6), Enfermedad de parkinson (8), Infección por HTLV-I (10), Carcinoma de células renales (5), Infección por herpes simple (6)
ANAPC7, ANAPC5, SOCS3,TCEB1,COPS6, ANAPC2, CDC23, CDC27, CDC16, SKP1, RBX1, ANAPC1, ANAPC10, ANAPC4, CDC20, FZR1, ANAPC11, CUL1, NEDD8, CUL4A, UBE2C, SKP2, IMP4, FBXL19, TCEB2, FBXW7, VHL, UBA3, UBE2M, UBA52, CUL2, CUL5, CUL4B, UBE2D2, BTRC, UBE2B, UBE2F, HACE1, CUL3, RNF7, CDC34, FBXL3, UBE2K, UBB, UBE2A, UBC, UBE2D1, UBA1, FBXL4, UBA6, UBE2E3, UBE2S, FBXW11, TRAF7, UBE2N, UBE2L3, UBE2I, NEDD4, UBE2R2, CCNF, UBE2L6, UBE2D3, FBXO2, UBE2E2, RAB9A, PLIN3, UBA7, UBE2G1, UBE2E1, UBE2D4, UBE2U, FBXO32, TRIM63, SPOP, KDM2A, KEAP1, RHOBTB3, TRIP12, FBXO44, FBXO6, CUL7, FBXW8, DET1, FBXO9, KDM2B, FBXO18, FBXL2, FBXO4, CAND1, SPOPL, FBXL20, USP47, FBXL5, UBE2G2, ASB2,
66 8. Resultados
estrés (37), Regulación de la proteólisis (25), Ubiquitinación de histonas (8), Respuesta celular a hipoxia (11), Proceso metabólico de DNA (22), Respuesta de daño en el ADN, detección de daño en el ADN (7), Simbiosis, que abarca el mutualismo a través del parasitismo (21), Organización de organelos de un solo organismo (33), Ritmo circadiano (8), Regulación positiva de la morfogénesis de la dendrita (4), Vía de señalización Notch (), Regulación del desarrollo de dendritas (6), regulación de la morfogénesis de dendritas (5), Regulación de la respuesta al estrés (21), Transducción de la señal intracelular (24)
FBXW5, FBXL13, SPSB4, SPSB1, FBXL8, FBXW12, FBXO21, FBXO10, FBXO17, FBXL12, FBXW2, FBXL7, FBXO22, FBXO27, FBXO41, PARK2, FBXL6, FBXO31, FBXO30, CACUL1, FBXO45, FBXL17, VPRBP, FBXO7, FBXW4, RHOBTB2, ARHGDIA, ARHGDIB, FBXW9, FBXL15, ASB1, SPSB2, FBXL16, ASB6, ARHGDIG, FBXL14, FBXL18, BTBD1, FBXO25, BTBD6, ABTB1, BTBD2, FBXO39, MARCH2, ABTB2, BTBD9, BTBD11, BTBD3, MARCH3
Grupo 2
Biogénesis del ribosoma (63), Proceso metabólico del rRNA (53), Procesamiento de rRNA (52), Procesamiento de ncRNA (53), Biogénesis de componentes celulares (66), Biogénesis de la subunidad pequeña ribosómica (17), Proceso metabólico del ARN (60), Expresión génica (58), proceso metabólico de la macromolécula celular (61), Hidrólisis del enlace fosfodiéster de RNA (11), Proceso metabólico (65), Metilación del rARN (3).
Biogénesis ribosómica en eucariotas (32), Degradación de ARN (8)
WDR36, RRP9, EXOSC9, EXOSC1, DCAF13, NOP58, UTP6, NOP56, PDCD11, BMS1, PWP2, UTP20, NOP14, KRR1, EXOSC2, EXOSC3, MPHOSPH10, RRP7A, NOL6, EXOSC5, UTP14A, NOB1, BYSL, BOP1, EXOSC6, EXOSC7, RPF2, RRS1, DDX52, UTP15, UTP18, EBNA1BP2, TBL3, HEATR1, WDR43, CIRH1A, EXOSC4, WDR12, PES1, WDR3, RPP38, FBL, RPS9, WDR75, UTP3, NHP2L1, WDR46, RCL1, IMP3, TSR1, BRIX1, PNO1, NOP2, RBM28, NHP2, NOC4L, GNL3, MKI67IP, UTP14C, DHX37, RIOK2, LTV1, ENSG00000204775, NOC2L, MRTO4, NIP7, DDX56, ENSG00000248354, RRP15, GRWD1,
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
67
KIAA0020, NOL10, UTP11L, DDX49, DIEXF, NAT10, DDX47, RPF1, GNL3L, WDR74, RRP36, DIMT1, NSUN6, MAK16, POLR1E, TFB2M, NGDN, FCF1, RTCA, NOP16
Grupo 3
Transición de fase del ciclo celular mitótico (25), Regulación de la vía de señalización canónica Wnt (21), Regulación negativa de la vía de señalización Wnt (17), Transición G1/S del ciclo celular mitótico (19), Regulación del ciclo celular (30), Proceso metabólico proteico (48), Proceso de modificación de proteínas celulares (40), Recubrimiento de vesículas COP-II (8), Regulación negativa de la respuesta al estímulo (28), Regulación negativa de la transcripción del promotor de ARN polimerasa II (22), Regulación de la transducción de señales (34), Proceso metabólico de la macromolécula celular (53), Regulación negativa del proceso apoptótico (22), Regulación positiva de la proteólisis (16), Regulación negativa de la comunicación celular (24), Respuesta celular al estrés (27), Regulación del proceso metabólico del compuesto nitrogenado (40), Ruta de señalización Notch (8), regulación del ritmo circadiano (7), Formación de patrón proximal / distal (5), respuesta a droga (11), Respuesta a lípidos (14), Vía de señalización del receptor intracelular (8), Desarrollo del epitelio (15), Vía de señalización del receptor TRK de la neurotrofina (9), Morfogénesis de órganos embrionarios (9), Regulación positiva de la proliferación neuroblástica (4), Respuesta
Vías asociadas a cáncer (27), Hepatitis B (18), Ciclo celular (16), Ruta de señalización PI3K-Akt (14), Ruta de señalización (p53) (), Vía de señalización de la hormona tiroidea (9), Vía de señalización FoxO (9), Vía de señalización Hedgehog (7), Ritmo circadiano (6), Vía de señalización de neurotrofinas (7), Procesamiento de proteínas en el retículo endoplasmático (7), Ruta de señalización AMPK (5), Ruta de señalización NF-Kappa B (4), Meiosis ovocitaria (4).
CDK2, CDKN1A, CCNE1, COPS5, COPS2, COPS4, COPS7A, PSMD11, PSMA6, CDK4, CCND1, CCNE2, GPS1, PSMD7, SEC24A, SEC23A, PSMA4, SEC31A, SEC13, RPS27A, DDB1, CRY2, ARNTL, COPS8, PSMD14, SEC24D, CDKN1B, CRY1, CCNA2, IKBKB, NFKB1, RB1, CTNNB1, APC, PER2, AXIN1, CKS1B, CDK6, CSNK1E, PLK1, CCNA1, SUFU, GLI1 SEC24B, HIF1A, DDB2, TP53, NFKBIA, CSNK1D, GSK3B, SEC24C, RBL2, DTL, FBXO5, NFKB2, MYC, CRBN, GLI2, BHLHE41, EP300, CKS2, SEC16A, CSNK1A1, NOTCH1, ckshs1, FAM123B, GLI3, FOXO3, FOXO1, LMAN1, NFKBIE
68 8. Resultados
a hormonas esteroideas (10), Regresión de notocordio (2), Desarrollo de tejidos (18), Desarrollo del cerebro (12), Senescencia prematura inducida por estrés (3), Vía de señalización del receptor del factor de crecimiento epidérmico (6), Suavizado de la vía de señalización que participa en la regulación de la proliferación de las células precursoras de las células granulares cerebelosas (2)
El número entre paréntesis representa la cantidad de genes involucrados en el proceso. La
columna genes muestra una lista de todos los genes en el grupo.
8.3. Patrón de expresión del gen BTBD3 en el
cerebro prenatal y adulto.
Usando la base de datos de microarreglos del Allen institute for brain
science (AIBS), sobre el perfil transcripcional del cerebro, se obtuvo el patrón de
expresión del gen BTBD3 en fase prenatal y adulta. Los datos muestran que el
gen tiene una alta expresión en corteza cerebelosa (CBC), pretectum (PTR),
tectum mesencefálico (MTc), tálamo (THM), tegmento mesencefálico (MTg),
hipotálamo (HTM) y tegmento pontino (PnTg) durante el periodo prenatal (figura
22A). No obstante, las demás áreas permanecen dentro de la primera desviación
estándar lo que sugiere la importancia de este gen durante periodos de
neurodesarrollo temprano. En el periodo adulto se ve una alta expresión en
formación hipocampal (HiF), corteza cerebelosa adulta (CbCx), tálamo ventral (VT)
y materia blanca (WM) (figura 22B). Las demás áreas permanecen dentro de la
primera desviación estándar a excepción del núcleo pontino y el estriado, en lo
cuales el gen se observa hipo expresión.
Se compararon áreas del cerebro prenatal lo suficientemente desarrolladas
como para encontrarlas en el cerebro adulto. Al comparar el nivel de expresión de
cerebros prenatales con adultos se observa que, con excepción del subtálamo,
donde no existe diferencia y el claustro (CL) en donde BTBD3 está hiper
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
69
expresado en adulto, todas las demás áreas muestran una reducción significativa
de la expresión del gen en la adultez (figura 22C).
Figura 22. A: nivel de expresión del gen BTBD3 en el cerebro prenatal humano, organizado de
menor a mayor expresión. Las mediciones fueron tomadas en cerebros de fetos en las semana 15,
16 y 21 post concepción. Se utilizaron 4 cerebros uno 15 semanas; uno de 16 semanas y dos de
21 semanas. B: nivel expresión del gen BTBD3 en el cerebro adulto humano organizado de menor
a mayor nivel. Las mediciones se realizaron en cerebros de 24, 31, 39, 49, 55 y 57 años. Los
cerebros donantes fueron 4 afroamericanos, 6 caucásicos y 2 hispanos. Ocho de estos cerebros
pertenecían a hombres y 4 a mujeres. C: comparación del nivel de expresión del gen en las
estructuras encefálicas que se encuentran presentes tanto en adultos como en prenatales. Se
compararon usando el test k-Sample T para distribuciones paramétricas, se muestran tanto el valor
del estadístico como el valor p. Las líneas punteadas en A, B y C representan las desviaciones
estándar. Cla: claustro; BFp: prosencéfalo basal; THM: tálamo; SubTH: subtálamo; HTM:
hipotálamo; CBC: corteza cerebelosa; MTg: tegmento mesencefálico. Los datos fueron procesados
a partir de los datos de expresión de microarreglo del AIBS (Hawrylycz et al., 2012; J. A. Miller et
al., 2014).
70 8. Resultados
8.3.1. co-expresión del gen BTBD3
Con datos obtenidos del AIBS se determinaron los genes que presentan el
mayor nivel de co-expresión con BTBD3 tanto en cerebro prenatal como en
cerebro adulto. Las correlaciones muestran que, el cerebro prenatal está
dominado por correlaciones modestas que no superan el 0.5 de coeficiente de
correlación. Al buscar entre los genes que muestran co-expresión con BTBD3
tanto en el cerebro prenatal como en el cerebro adulto se encontró que los genes
A_24_P471121 y CCNE1, asociados al proceso de división celular, se encuentran
co-expresados con BTBD3 tanto en periodo prenatal como adulto (figura 23 y 24).
El gen CCNE1 (ciclina E1) tiene funciones como cofactor de transcripción y
receptor de andrógenos, adicionalmente participa en el desarrollo del hígado,
regeneración de órganos, respuesta a nitrógeno orgánico, respuesta a estímulo de
citoquinas y crecimiento antral del folículo ovárico.
A diferencia del cerebro prenatal, en el cerebro adulto se observaron
correlaciones con valores más significativos entre el gen BTBD3 y otros genes. El
gen que mostró una covariación más significativa con BTBD3 fue DHX29, el cual
tiene funciones de unión a ATP, de helicasa y participa en el proceso de
traducción de proteínas. Los genes fueron correlacionados usando el coeficiente
de correlación de Spearman (Figura 24). Las gráficas tienen en la parte superior el
valor de coeficiente y p-value asociado al test de hipótesis. Se analizaron los
enriquecimientos en procesos biológicos, funciones moleculares, componentes
celulares y los elementos compartidos de los genes co-expresados en ambos
estados del desarrollo (Figura 25).
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
71
Figura 23. Genes co expresados con BTBD3 en cerebros prenatales. Los genes muestran niveles
moderados de correlación, siendo el gen PDLIM5 el que muestra el nivel coeficiente de correlación
más elevado. Dos genes, A_24_P471121 y CCNE1, muestran co-expresión tanto en cerebros
72 8. Resultados
prenatales como adultos. Los niveles de expresión se correlacionaron usando el Test de
Spearman. Los datos se obtuvieron del instituto allen (Hawrylycz et al., 2012; J. A. Miller et al.,
2014)
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
73
Figura 24. Genes co-expresados con BTBD3 en cerebro adulto. Se seleccionaron los genes que
mostraron niveles de correlación de al menos 0.7. Se utilizó el test Spearman. Los datos se
obtuvieron del instituto allen (Hawrylycz et al., 2012; J. A. Miller et al., 2014).
74 8. Resultados
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
75
figura 25. Nube de palabras que representa el enriquecimiento funcional en los genes co-
expresados con BTBD3 en estado prenatal y adulto. A. enriquecimiento en procesos biológicos en
estado prenatal y adulto. B. procesos biológicos compartidos entre los genes co-expresados en
estado prenatal y adulto. C. Componentes celulares enriquecidos en ambos estadios de desarrollo.
D. componentes celulares compartidos en los genes co-expresados en ambos estadios. E.
76 8. Resultados
funciones moleculares enriquecidas en los genes co-expresados. F. funciones moleculares
compartidas.
9. Discusión.
Este trabajo analizó el patrón de metilación en una región del gen BTBD3
en una muestra de niños y adolescentes con diagnóstico de trastornos del
neurodesarrollo Colombianos. En diferentes estudios la región amplificada
muestra un patrón de hipometilación, a excepción de condiciones patológicas
asociadas a cáncer (figura S3). Los resultados obtenidos están en concordancia
con los trabajos reportados en el (“Human hg19 chr20:11,870,949-11,871,848
UCSC Genome Browser v362,” n.d.) (figura S3), es decir, que la mayoría de los
sujetos mostraron porcentajes de metilación cercanos a cero. En este mismo
sentido queda claro que los patrones de metilación en diferentes tejidos son
similares, incluyendo sangre y cerebro (figura S3), lo que valida el trabajo actual
que fue desarrollado en sangre. Adicionalmente se estableció el interactoma de
BTBD3, esto es, el conjunto de proteínas con las que este gen interactúa, de
modo que, al realizar una simulación de desestabilización topológica, se pudiera
establecer qué funciones ontológicas desaparecen, lo que podría explicar por qué
experimentos de knockout (KO) o knock down (KD) que afectan a este gen
muestran que las dendritas dejan de polarizarse como en condiciones regulares.
Finalmente se utilizaron bases de datos de expresión genética que permitieron
determinar el patrón temporoespacial de expresión de BTBD3, esto facilita hacer
relaciones anatomo-funcionales y anatomo-patológicas en eventos de fallas en la
expresión del gen. A continuación se discuten cada una las secciones de
resultados.
9.1. Patrón de metilación.
Se utilizaron las técnicas de conversión con bisulfito y amplificación por
BSP PCR para determinar el porcentaje de metilación de una región corriente
arriba del gen primer exón de BTBD3, en la región reguladora. Los porcentajes de
metilación fueron calculados y posteriormente se hicieron comparaciones basadas
en métodos factoriales entre los porcentajes de metilación y cada una de las
variables de la historia clínica. Adicionalmente se modelaron diferentes variables
78 9. Discusión.
utilizando Machine Learning que, permiten visualizar los patrones de asociación
entre la metilación y los componentes individuales de las variables.
Al comparar los porcentajes de metilación de todos los participantes se
observó que estos tienden a estar cerca de 0% (figura 7). Estos valores en los
porcentajes de metilación coinciden con los reportados en estudios de metiloma,
en los que la región estudiada permanece hipometilada a excepción de
condiciones asociadas a cáncer, en los que esta zona tiende a la hipermetilación
(figura S3). Sin embargo, los dinucleótidos CpG 3 y 4 parecen mostrar una
tendencia a la hipermetilación con picos máximos de metilación de 25% y 100%
respectivamente (figura 7). Debido a la cercanía de esta región con la isla CpG del
gen BTBD3 (figura S3), y que solo el 20% de las CpGs no pertenecientes a islas
CpG están demetiladas (Baylin & Jones, 2016), y ya que el promotor tiende a estar
entre 100 y 1000 pb corriente arriba, es plausible asumir que la secuencia
amplificada hace parte de la región reguladora del gen BTBD3 y por ende los
cambios en la metilación de esta pueden tener un efecto en la transcripción del
gen. Sin embargo, se requieren estudios de expresión de la proteína para
corroborarlo.
Nuestros resultados sugieren que existen factores ambientales, in utero y
postparto que afectan la metilación del gen BTBD3. La variable factor ambiental
que mostró asociación con el incremento en la metilación es la región de
nacimiento del participante. En esta variable el dinucleótido CpG2 mostró una
variación significativa en el porcentaje de metilación entre los que nacieron en
Bogotá versus otras regiones (figura 8 B). Un posible evento asociado a la
variación en la metilación en esta variable es el clima; temperatura y humedad. Un
estudio encontró que el descenso en la temperatura estaba asociada con
hipometilación en los genes ICAM-1, asociado a respuesta inmune, e
hipermetilación del gen CRAT, asociado al metabolismo de lípidos, mientras el
incremento de la temperatura tiene mayor relación con hipometilación de TLR-2,
participa en la inducción de la apoptosis, por su parte el incremento en la humedad
se asocia con hipometilación de ICAM-1 y F3 (Bind et al., 2014). La temperatura
media en Bogotá los últimos 18 años fue de 14°C con humedad media del 78%
(“Wolfram|Alpha: Making the world’s knowledge computable,” n.d.). Lo que implica
temperaturas bajas y alta humedad, aunque el estudio no determinó el efecto en el
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
79
gen BTBD3, es posible que el clima tenga efectos diferenciales en el metiloma que
también están influenciando el gen BTBD3.
La edad de la madre y del padre al momento de recoger la muestra también
muestran influencia sobre la metilación, ambas en la CpG3 (figura 9C y 10C). En
este sentido un estudio que interrogó 27578 CpGs en recién nacidos, encontró
correlación entre 144 de estas CpGs (pertenecientes a 142 genes) y la edad de
los padres. La tendencia fue que a medida que aumenta la edad de los padres
tiende a disminuir la metilación global del recién nacido y dicha relación es más
fuerte entre la edad materna y la metilación del hijo. Entre el grupo de genes a los
que pertenecen las CpGs diferencialmente metiladas, se encuentran genes
asociados a la regulación del desarrollo neurológico (Adkins, Thomas, Tylavsky, &
Krushkal, 2011). Este factor resulta interesante, ya que existen diferentes formas
en las que una marca epigenética puede ser transmitida, vía células germinales,
estrés in utero o pautas de crianza (McEwen et al., 2015). Debido al momento de
la recolección de las muestras de sangre es posible que las variaciones en la
metilación estén más asociadas a las pautas de crianza. Nuestros resultados
muestran que entre menos es la edad de la madre mayor es el porcentaje de
metilación, lo que concuerda con el estudio antes reportado.
Las variables que influenciaron la elevación en la metilación durante el
embarazo o in utero pueden relacionarse con el estrés percibido o fáctico (figura
11 D, 12 A y B y 13 D). Es decir, si las madres de los participantes creían haber
tenido estrés o si por condiciones de enfermedad o traumatismo lo recibieron. El
estrés tiene un efecto significativo en el panorama epigenético; un patrón
epigenético establecido puede ser transferido a la siguiente generación si dichas
firmas epigenéticas se establecen en las células germinales (óvulos o
espermatozoides). Sin embargo, se ha observado que el patrón epigenético
impreso en las células germinales es “reiniciado” cuando se forma el zigoto y la
mayoría de las metilaciones son borradas, vía métodos pasivos y activos de
demetilación (Bohacek & Mansuy, 2015a; Booth et al., 2013b; Hackett & Surani,
2013c). Este proceso parece ser una estrategia de protección contra posibles
firmas epigenéticas aberrantes y para devolverle a las células sus características
pluripotentes (Hackett & Surani, 2013d). No obstante, existen reportes de firmas
epigenéticas que pasan de una generación a otra sin que intervenga la crianza
(Dias & Ressler, 2014b; Grandjean et al., 2009b). Un estudio, en ratones C57Bl6/J
80 9. Discusión.
encontró que el estrés por separación materna, en la generación F0, generaba un
patrón de hipermetilación de las células germinales masculinas de la generación
F1 en los genes MeCP2 y CB1, dicho patrón persiste en el cerebro de las hembras
F2, mientras que el gen CRFR2 se hipometiló con el mismo patrón de herencia
(Franklin et al., 2010b). Este estudio también mostró que, aunque CRFR2 estaba
hipomelitado su transcrito estaba regulado a la baja, indicando una relación no
lineal entre los patrones de metilación del promotor y expresión (Franklin et al.,
2010c). Lo anterior sugiere que una marca epigenética que se estableció por
crianza o ambiente puede después, ser transmitida vía células germinales. No es
claro qué factores moleculares y ambientales determinan que una marca
epigenética se genere y posteriormente se transmita a la siguiente generación.
Estos procesos de pérdida de marcas epigenéticas también involucran las
histonas. Se ha descrito que durante la espermatogénesis la mayoría de las
histonas son reemplazadas por protaminas, lo que lleva a una pérdida global de
las modificaciones generadas en estas proteínas (Bohacek & Mansuy, 2015b).
Por su parte las variables postparto que contribuyen al aumento en la
metilación se asocian al tipo de parto, la presencia o no de enfermedades al nacer
y el tipo de alimentación durante el desarrollo temprano. Los participantes nacidos
por parto vaginal presentan un incremento significativo de la metilación en en la
CpGs 5 (figura 14 E). El parto vaginal se ha asociado con un incremento en
catecolaminas y cortisol durante el alumbramiento, este fenómeno facilita la
activación del sistema inmunitario inflamatorio (Yektaei-Karin et al., 2007) y la
respiración postparto (Olver, Walters, & Wilson, 2004). Adicionalmente se ha
asociado el parto por cesárea con el posterior desarrollo de asma (Metsälä et al.,
2008) y leucemia (Cnattingius et al., 1995). En un estudio se observó que el
porcentaje de metilación global en sangre de niños recién nacidos por cesárea era
mayor a los que nacieron por parto vaiginal. Sin embargo, cinco días después los
niveles de metilación global entre los dos grupos no difería (Schlinzig, Johansson,
Gunnar, Ekström, & Norman, 2009). Este desfase temporal en el porcentaje global
metilación durante el alumbramiento podría tener consecuencias a la salud y en
teoría podría llevar a alterar el patrón epigenético posteriormente. Sin embargo,
nuestros resultados muestran un cambio de metilación a la alta en niños nacidos
por parto vaginal y debido a que esta es una región hipometilada (figura S3) es
posible suponer un efecto diferencial por el tipo de parto en regiones específicas
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
81
del genoma no reportadas aún. Adicionalmente al comparar en conjunto el tipo de
parto y el estrés preconcepción se observa una interacción entre estos dos
factores asociados a la elevación de la metilación en la CpG4, KW: 9.75, p = 0.01.
Ésta misma CpG mostró significancia al considerar juntos tipo de parto, estrés
prenatal y diagnóstico inicial CpG4, KW: 14.1, p = 0.04 (Tabla 2). Esto indica que
al parecer el tipo de parto es un factor sumatorio que interactúa con otras variables
y contribuye a la elevación en la metilación en la CpG4.
El efecto sobre el epigenoma de enfermedades y traumatismos en los
periodos del desarrollo temprano pueden tener consecuencias tiempo después de
que el evento epigenerador ha tenido lugar, ya que un evento ambiental que
establezca una marca epigenética puede propagarse gracias a las enzimas de
mantenimiento (DNMT) y propagarse por un tejido hasta que se manifieste el
efecto. Eventos adversos pueden alterar el funcionamiento del eje HPA cambiando
la firma epigenética en los genes NR3C1 (Weaver et al., 2004), Avp (Murgatroyd &
Spengler, 2014) y Crh (Elliott, Ezra-Nevo, Regev, Neufeld-Cohen, & Chen, 2010).
El desarrollo neuronal se ve truncado ya que se afectan las firmas epigenéticas de
las neurotrofinas BDNF (Roth, Lubin, Funk, & Sweatt, 2009) y Gad1 (T.-Y. Zhang
et al., 2010). Esta variable mostró significancia en la CpG4 entre los que habían
tenido algún tipo de enfermedad al nacer y los que no, mostrando el efecto sobre
esta región en función de las adversidades en periodos del desarrollo temprano.
Usando métodos de análisis basados en machine learning se modelaron las
variables enfermedad al nacer y lugar de nacimiento en función del patrón de
metilación de cada CpG. El modelo sugiere que haber padecido enfermedades
asociadas a diarrea o la ictericia se relacionan con mayores niveles de metilación
en la CpG1. En la CpG2 hasta el 10% de metilación se tiene una mayor asociación
con condiciones saludables, sin embargo, bajo peso y estatura (BpE) tiene
mayores probabilidades de generar niveles altos de metilación en esta CpG. La
CpG3 tiene mayor nivel de asociación con condiciones saludables hasta el 27% de
metilación, niveles más elevados se asocian con SF. Los porcentajes altos y bajos
de metilación en la CpG4 y 5 se ven más influenciados por condiciones saludables
(figura 17). Por su parte el modelado en función de la región de nacimiento mostró
una mayor asociación entre los bajos niveles de metilación y haber nacido en un
lugar distinto a Bogotá en la CpG1. En los dinucleótidos CpG 2 y 4 la variable
Bogotá puede influenciar la aparición de niveles bajos y altos de metilación,
82 9. Discusión.
poniendolo como un factor sumatorio, que puede ser influenciado por otras
variables. En las CpGs 3 y 5 hasta alrededor del 17% de metilación existe una
mayor relación con la variable Bogotá, los niveles más elevados se asocian con
personas nacidas en otras regiones (figura 18).
9.2. Red PPi
El análisis PPi permite revelar el panorama de interacción de una o más
proteínas y usando teoría de grafos se pueden establecer los elementos más
centrales en dichas interacciones. En este grupo de observaciones se
determinaron los procesos biológicos más importantes asociados a BTBD3, gene
ontology (GO), se desarrolló una distinción de comunidades emergentes en la red
de interacciones y un estudio topológico o de centralidades.
La PPi alrededor del gen BTBD3 generó una red extendida de 305 nodos
(proteínas) y 12497 aristas (interacciones), con alto grado de robustez, es decir,
un alto coeficiente de agrupamiento (0.812). Lo que implica que la red de procesos
en los que se encuentra inmerso el gen BTBD3 tiene un alto grado de estabilidad,
gracias a elementos redundantes, por ejemplo el proceso metabólico tiene 219
proteínas ejecutando dicha función (figura S1), lo que queda de manifiesto en la
figura suplementaria S1, donde se observa que por ejemplo más de 200 proteínas
tienen funciones metabólicas en esta red y que gran número de proteínas tienen
funciones de ubiquitinación. De estos 305 nodos, 44 interactúan directamente con
BTBD3. La red directa de BTBD3 está enriquecida en procesos asociados a la
transformación de proteínas vía ubiquitinación y neddylation de proteínas, proceso
en el que NEDD8 (neural precursor cell expressed, developmentally down-
regulated 8) es conjugado con su proteína diana, la cual tiene una subunidad de
Cullina. Un estudio de inmunohistoquímica encontró la presencia de NEDD8 en
cuerpos de Lewy, ovillos neurofibrilares en Alzheimer y enfermedad de neuronas
motoras (Mori et al., 2005). Con lo cual es posible hipotetizar que trastornos
neurodegenerativos y del neurodesarrollo comparten mecanismos y etiologías
comunes.
Uno de los procesos más abundantes de esta red de interacciones son las
transformaciones de proteínas vía ubiquitinación (figura S1), esta es fundamental
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
83
durante la sinaptogénesis, ya que el proceso de cambio dinámico de las neuronas
está mediado por constantes modificaciones de la arquitectura celular, las cuales
se posibilitan por la constante degradación y renovación del panorama proteico en
función de la ubiquitinación y posterior degradación en el proteosoma. En este
sentido se ha descrito que la perturbación de la homeostasis del sistema de
ubiquitinación en roedores, al knockear la deubiquitinasa Usp14, genera defectos
en el desarrollo de las conexiones neuromusculares (Chen et al., 2011), el mismo
estudio encontró que, en las primeras semanas del periodo postnatal se genera un
pico de expresión del sistema de ubiquitina, lo que sugiere la importancia de este
en la organización del sistema nervioso durante dicho periodo (Chen et al., 2011).
Este pico de expresión coincide con los de BTBD3 y Lhx2 asociados a
organización cortical (Matsui et al., 2013; Wang et al., 2017).
Otro proceso asociado a esta red es la reproducción celular tanto en mitosis
como meiosis ovocitaria, lo que sugiere la participación de BTBD3 no solo en la
maduración de la corteza sino también en su génesis. Los genes de esta subred
también participan en proceso de diferenciación y mantenimiento del destino
celular a través de la vía Notch, esta permite la diferenciación de las células en
función de su posición con respecto a las otras, ya sea inhibiendo la diferenciación
de estas; inhibición lateral o promoviendo la diferenciación de sus vecinas;
activación lateral (Fiuza & Arias, 2007; Yoon & Gaiano, 2005). El papel de la vía
Notch en el desarrollo sistema nervioso va más allá de establecimiento y
mantenimiento de la identidad de las células, se ha encontrado expresado en el
cono de crecimiento axonal en la mosca de la fruta (Giniger, 1998). En
concordancia con lo anterior, un estudio describe que, al generar una cepa de
ratones knockout para Notch1, estos presentan dificultades en la capacidad de
memoria, sugiriendo la participación de este gen, y por ende de la red, en el
desarrollo de las habilidades cognitivas (Costa, Honjo, & Silva, 2003). BTBD3
permite que las dendritas se reorienten en función de diversas señales y el
knockout de Notch genera dificultades en memoria, indicando complementariedad
de estos genes en el proceso de plasticidad sináptica. Bloquear la señal de Notch,
activando Numb o Dx, promueve la expansión de las neuritas. Otros estudios
encontraron que la deleción de Numb perturba la maduración neuronal en el
cerebelo. La deleción de Numb interrumpe la arborización axonal en los ganglios
sensoriales (Huang et al., 2005; Klein, Zilian, Suter, & Taylor, 2004). En esta red
84 9. Discusión.
también se encuentran genes de la vía Wnt, la cual se asocia a destino celular,
gastrulación, control de la polarización celular, migración neuronal y
sinaptogénesis vía modulación del citoesqueleto (Komiya & Habas, 2008; Salinas,
2007). Estudios en roedores muestran que afectar la vía Wnt, a través de de
knockout del gen Gpr177, lleva a malformaciones en el cerebro y el cráneo;
ausencia de mesencéfalo. También se ven afectadas la palatogenesis,
morfogénesis dental y la formación de las glándulas salivales y serosas (Fu, Ivy
Yu, Maruyama, Mirando, & Hsu, 2011; Fu, Jiang, Mirando, Yu, & Hsu, 2009).
9.2.1. Detección de comunidades.
La detección de comunidades en una red permite identificar subgrupos con
altos grados de interconección (Reichardt & Bornholdt, 2006). Estas representan
unidades funcionales dentro de un sistema. En la red descrita en este trabajo
emergieron 3 diferentes comunidades (figura 21B). Cada uno de estos grupos
cuenta con procesos y vías enriquecidas. El subgrupo 1 es el más grande de los
tres, con 144 proteínas, entre las que se incluye BTBD3. Este grupo está
enriquecido en procesos biológicos asociados a transformación de proteínas,
reparación de ADN, respuesta a estrés, desarrollo de dendritas entre otras.
Es de resaltar, con respecto al estrés y la morfogénesis del tejido nervioso
que, este fenómeno afecta la formación dendrítica tanto en humanos como en
roedores. Se ha observado, en roedores, que el estrés agudo es capaz de causar
retraso en la formación de las espinas dendríticas en la amígdala basolateral, lo
que puede llevar a la aparición de fenotipos de ansiedad, mientras que el estrés
crónico genera hipertrofia de esta misma zona (McEwen et al., 2015).
Adicionalmente diferentes estudios han encontrado que el estrés durante la
adolescencia puede generar atrofia en las neuronas piramidales prefrontales e
hipocampales, así como hipertrofia del los núcleos basolaterales de la amígdala
(Lisa Eiland, Ramroop, Hill, Manley, & McEwen, 2012; L. Eiland & Romeo, 2013).
Debido a que el estrés es un epigenerador (Stankiewicz et al., 2013), la exposición
crónica a este genera perturbaciones aberrantes en el metiloma, esto es
corroborado por un estudio que interrogó 450000 CpGs en niños retirados de sus
hogares por los servicios sociales a causa de maltrato versus controles, se
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
85
observó que las proporciones de metilación en los niños que fueron maltratados
se habían invertido, es decir, la zonas hipermetiladas en controles se habían
hipometilado en casos y las áreas hipometiladas en controles se encontraban
hipermetiladas en casos (Yang et al., 2013). En esta misma dirección un estudio
describió, en el cerebro postmortem de adolescentes suicidas, una expresión
disminuida del receptor de glucocorticoides NR3C1 (Pandey, Rizavi, Ren, Dwivedi,
& Palkovits, 2013). De este modo el estrés se ha convertido en un importante
factor remodelador del panorama epigenético y que además tiene un impacto en el
funcionamiento de la red descrita en este trabajo.
El grupo 2 (figura 21B) consta de noventa proteínas, principalmente
asociadas al procesamiento de ARN; ARN ribosomal (rARN) y ARN no codificante
(ncARN). El intrincado proceso de interacciones del sistema de ARNs que incluyen
mARN y ncARN controlan en gran medida el desarrollo del sistema nervioso
central a través de la modificación de la cromatina, control del splicing, imprinting,
transcripción y traducción (Mattick, 2004). Debido a los procesos en los que
participa el ARN es de esperar que la expresión y funcionamiento del ARN sea
seminal en cualquier periodo del desarrollo y que la alteración en cualquiera de
sus componentes lleve al desarrollo de patologías. Un ejemplo es el síndrome X
frágil causado por la pérdida de la función de la proteínas FMRP, la cual transporta
mARN e interactúa con ARNi (Jin, Alisch, & Warren, 2004). Otro estudio encontró
que, al transcribirse el mARN del gen CEBPA se transcribe un ARN que se asocia
con la enzima DNMT1 y previene la metilación del gen CEBPA (Di Ruscio et al.,
2013), es decir, que la transcripción de un gen puede modular su futuro patrón de
expresión vía modificación de la metilación de ADN por ARN.
En el último grupo hay 71 nodos o proteínas (figura 21B), principalmente
relacionadas a ciclo celular, regulación de la transcripción, transformación de
proteínas, recubrimiento vesicular, transducción de señal, ciclo circadiano,
respuesta a hormonas esteroideas, desarrollo de tejidos (vías Notch y Wnt),
respuesta a drogas, proliferación celular y desarrollo de cerebelo (tabla 4). El
recubrimiento vesicular se refiere al proceso en el que la membrana de las
vesículas se enriquece con proteínas, estas van a permitir tráfico intracelular;
transporte de lípidos, proteínas etc., los sistemas de tráfico más conocidos
implican las proteínas de recubrimiento Clathrin; que actúa en una vía de
endocitosis, COP-II; exporta proteínas desde el retículo endoplasmático y COP-I;
86 9. Discusión.
transporte al interior del cuerpo de Golgi y de Golgi hacia el retículo
endoplasmático. Estas interactúan con proteínas SEC para formar sistemas de
transporte cerrados (Faini, Beck, Wieland, & Briggs, 2013). Ambos grupos de
proteínas se encuentran presentes en el interactoma de BTBD3 (tabla
suplementaria S1). Alterar el sistema de tráfico impediría a una célula desempeñar
cualquier tipo de función, desde el metabolismo hasta la acomodación de
proteínas en el espacio intracelular. El otro aspecto llamativo de este grupo es el
ciclo circadiano, este se refiere al control periódico de los ritmos biológicos que se
presentan en ciclos de 24 horas. Es notable que el ciclo circadiano es uno de los
elementos alterados con más frecuencia en diversas enfermedades mentales;
depresión, esquizofrenia, trastorno bipolar entre otras (Jagannath, Peirson, &
Foster, 2013). El control del ciclo circadiano está a cargo de un sistema de
retroalimentación negativa, en el que los genes CLOCK y BMAL1 elicitan la
transcripción de genes asociados al metabolismo. Adicionalmente transcriben los
genes Per y Cry (presentes en el interactoma de BTBD3 tabla S1), los que a su
vez reprimen la acción de CLOCK y BMAL1. Este proceso de transcripción y
represión se da en ciclo de aproximadamente 24 horas (Wulff, Gatti, Wettstein, &
Foster, 2010). De los aspectos explorados en la red, uno de los que mayor
relación tienen con las capacidades cognitivas es el sueño. Perturbaciones de este
impiden la ocurrencia del sueño REM, fase en la se consolida la memoria,
adicionalmente la regulación de los los estados emocionales se ven altamente
afectados. En este sentido un estudio encontró que cuando un grupo de sujetos
tratan de consolidar memoria emocional, esta se ve perjudicada cuando se evita
que los participantes pasen por ciclos de sueño REM (Nishida, Pearsall, Buckner,
& Walker, 2009).
9.2.2. Análisis topológico
El análisis topológico permite identificar que elementos en una red son los
más centrales de acuerdo a diversos criterios matemáticos. Estas centralidades
son fundamentales para determinar qué nodos e interacciones son fundamentales
para el funcionamiento de la red. Con el fin de determinar la importancia de los
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
87
nodos asociados a BTBD3 en la red principal, se eliminaron todos los nodos que
interactúan de manera directa con BTBD3 (desestabilización topológica),
posteriormente se compararon la distribución de las características topológicas de
la red original con la red desestabilizada: Betweenness centrality (Betw) o
centralidad de intermediación identifica nodos en la red que son cruciales para el
flujo de información. Al desestabilizar la red, Betw no presenta cambios (figura
21G), indicando que la subred BTBD3 no participa en los procesos de centralidad
de nodos individuales. Por su parte Eigenvector centrality (Eigen) o centralidad de
autovector identifica nodos en la red que están conectados a muchos otros nodos
con altas interconecciones; con alto coeficiente topológico. La distribución de esta
medida topológica presenta cambios significativos en la red desestabilizada, lo
que implica que los subgrupos altamente interconectados se redistribuyen en la
red, si algún proceso biológico dependía de estas redes podría haberse visto
afectado de modo negativo (figura 21H). Closeness centrality (Closs) o centralidad
de cercanía identifica nodos en la red que son importantes para la rápida difusión
de la información en una red. Esta medida no se encuentra alterada al
desestabilizar la red, lo que sugiere que, a pesar de la pérdida de los 44 nodos
asociados a BTBD3, la velocidad con la que la red propaga sus procesos no se ve
afectada. Pagerank centrality (PageR) o centralidad de rango de Page es una
medida que permite identificar qué nodos en una red son fundamentales para el
funcionamiento de la misma, al desestabilizar la red se observa un cambio
altamente significativo (figura 21J), la gráfica sugiere que algunos nodos con alto
puntaje en este criterio fueron eliminados, pero lo que el sistema redistribuye los
nodos con alto nivel de PageR, de modo que, al perder algunos elementos de la
red, se pierden ciertas funciones pero el sistema en general sigue funcionando,
esto se denomina robustez del sistema. Degree centrality (Degree) o centralidad
de grado identifican nodos en la red por su influencia sobre otros nodos en su
vecindario inmediato, es decir, centralidades locales. La red desestabilizada, en
este criterio, es significativamente diferente, la red original muestra que este
elemento estaba más distribuído en la red, al eliminar la subred BTBD3, la
cantidad de nodos con altos puntajes en Degree disminuyeron y desarrollaron una
distribución leptocúrtica (figura 21K). Lo que sugiere que los puntos centrales de
flujo de información locales se vieron altamente perturbados, es posible que
localidades con funciones bien establecidas hayan visto perturbada su función.
88 9. Discusión.
Edge betweenness centrality (EdgeB) o centralidad de intermediación de arista
identifica las aristas que son cruciales para los flujos de información, a diferencia
de las medidas anteriores que definen la centralidad de los nodos, este índice
identifica las interacciones más centrales. Al desestabilizar al red este criterio
cambia significativamente. Este cambio podría implicar, como algunos casos
anteriores, la redistribución de las centralidades, pero debido a la redundancia del
sistema es difícil determinar si los procesos biológicos se han afectado de modo
que impida a la red continuar funcionando. Una comprobación de lo descrito en el
proceso de desestabilización topológica exigiría desarrollar experimentos de
laboratorio en el que se eliminen de manera selectiva, vía knockout o knockdown,
genes con alto grado de centralidad de esta red.
Al analizar la topología y el enriquecimiento de los nodos con mayor
centralidad de la red principal (figura S2). Las funciones observadas en esta
subred no distan mucho de los de la red principal o de la subred de BTBD3 o de la
red desestabilizada. Esto indica que la red tiene un alto grado de cohesión debido
a la homogeneidad en las funciones, dominios proteicos, procesos biológicos y
componentes a lo largo y ancho de la red. Es decir, que casi sin importar las
subdivisiones funcionales o topológicas que se le realicen a esta red los mismos
enriquecimientos de la red principal van a persistir.
Estos datos en conjunto apuntan a que la función de polarización dendrítica
que ejerce el gen BTBD3 (Matsui et al., 2013), está mediada por el efecto que
tiene este gen en la transcripción de genes reguladores del citoesqueleto, la
degradación de proteínas, el control de los ciclos circadianos y el procesamiento
de ncARN. Esto es, el control en la transcripción que ejerce BTBD3 permitiría que
los genes reguladores de la sinaptogénesis, morfogénesis dendrítica, degradación
proteica y procesamiento de ncARN aumentarán o disminuirán en función de la
señales despolarizantes de los axones vecinos. Debido a que BTBD3 interactúa
con genes asociados al desarrollo, pero que también parecen participar en
procesos neurodegenerativos (Mori et al., 2005) se fortalece la hipótesis que la
neurodegeneración puede rastrearse en patologías del neurodesarrollo.
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
89
9.3. Expresión y co-expresión de BTBD3.
Con el fin de establecer el papel del gen BTBD3 en la conducta, se
utilizaron datos del AIBS para establecer el patrón de expresión encefálico (dónde
y cuánto se expresa el gen) de BTBD3. De esta manera se pueden establecer
relaciones anatomofuncionales y anatomopatológicas. Adicionalmente se
estableció el panorama de co-expresión en ambos momentos del desarrollo, así
es posible conocer el panorama de interacción del gen.
Los datos del AIBS se obtuvieron utilizando microarreglos en 4 cerebros
prenatales de 15 a 21 semanas postconcepción y en 6 cerebros adultos de 24 a
57 años (Hawrylycz et al., 2012; J. A. Miller et al., 2014). En el cerebro prenatal las
zonas de hiperexpresión del gen BTBD3 corresponden a la corteza cerebelosa
(CBC), mesencéfalo (pretectum (PTR), tegmento mesencefálico (MTg), tectum
mesencefálico (MTc)), tálamo (THM), hipotálamo (HTM), y tegmento pontino
(PnTg). No se encontraron regiones de hipoexpresión, es decir, con expresión por
debajo de la primera desviación estandar (figura 22A). Por su parte el cerebro
adulto muestra hipoexpresión en el estriado (Str) y en el núcleo pontino (Bpons).
Las zonas hiper expresadas corresponden a formación hipocampal (HiF), corteza
cerebelosa adulta (CbCx), tálamo ventral (VT), materia blanca (WM) y claustro
(CL) (figura 22B)
9.3.1. Expresión por área.
Los datos de expresión sugieren que el cerebelo mantiene un patrón de
hiperexpresión tanto en estado prenatal como en adulto, con una diferencia
significativa entre estos dos periodos, mostrando reducción en la expresión en la
adultez (figura 22A, B y C). Esto indica la importancia de BTBD3 en el desarrollo y
mantenimiento de esta estructura encefálica. El cerebelo humano se encuentra en
la zona posterior del encéfalo y se conecta al resto del encéfalo a través del tallo
cerebral vía pedúnculos cerebelosos; Pedúnculo superior: lleva información del
cerebelo a la corteza cerebral; pedúnculo medio: conecta la corteza cerebral al
cerebelo y el pedúnculo inferior: transmite información del cerebelo al sistema
90 9. Discusión.
vestibular y la médula espinal y de la oliva inferior al cerebelo (Stoodley &
Limperopoulos, 2016). Es de señalar que tanto el lóbulo anterior como lóbulo VIII
del cerebelo contienen representaciones senriomotoras (Grodd, Hülsmann, Lotze,
Wildgruber, & Erb, 2001), mientras el lóbulo posterior se conecta con áreas de
control cognitivo y emocional (Stoodley & Schmahmann, 2010).
La red entre el cerebelo y el cerebro, ponen a esta estructura como un
punto clave en el desarrollo del cerebro. El cerebelo se ha asociado con mayor
frecuencia al aprendizaje de secuencias motoras implícitas. Sin embargo, existen
reportes que indican que daños en esta estructura afectan a largo plazo el
volumen de materia gris y blanca en el área prefrontal dorsolateral, área
premotora, cortezas sensoriomotoras, y regiones occipitales inferiores
(Limperopoulos, Chilingaryan, Guizard, Robertson, & Du Plessis, 2010). Lo que
implica que tanto áreas asociadas al control motor como las de control ejecutivo
dependen del funcionamiento cerebeloso. En este sentido se ha determinado que
el hemisferio lateral posterior del cerebelo (Crus I y Crus II) se relacionan con el
desarrollo de funciones cognitivas. Bebés prematuros, con reducción del volumen
en regiones laterales del cerebelo, muestran déficits en funciones ejecutivas y
visoespaciales (Allin et al., 2005). Sujetos con TDAH han mostrado hipoactividad
en el cerebelo anterior, Crus I bilateral (Massat et al., 2012; Mattfeld et al., 2016).
En suma, daños en los hemisferios posteriores laterales y en el vermis del
cerebelo se asocian con los síntomas de TDAH, autismo y dislexia, esto es debido
a las relaciones frontoparietales y límbicas con las que dichas áreas hacen
conexión. De este modo, alteraciones en la función de BTBD3, que impidan la
correcta organización cortical del cerebelo podría afectar el desempeño de
funciones motoras, cognitivas y emocionales.
Durante el desarrollo prenatal PTR es la segunda área con mayor expresión
del gen BTBD3 (figura 22), ésta área hace parte del mesencéfalo, PTR participa
en el procesamiento visual subcortical (Benevento, Rezak, & Santos-Anderson,
1977; Collewijn, 1975). Adicional al procesamiento visual, ésta área se ha
asociado con la regulación del ciclo circadiano. En un estudio se lesionó
químicamente el PTR en ratas albinas, se observó una reducción significativa del
sueño REM inducido (A. M. Miller, Miller, Obermeyer, Behan, & Benca, 1999).
Resultados similares se encontraron en un estudio que analizó PnTg, en este
estudio se describe que existen diferencias significativas en la medición de N-
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
91
acetil aspartato, entre los sujetos control y los que presentan desórdenes del
sueño REM (L. Zhang et al., 2016). Lo anterior es congruente con los datos de
análisis de interactoma, en el que se encontraron vías KEGG y proteínas
asociadas al ciclo circadiano (figura S1).
Como tercera área en nivel de expresión se encuentra MTc, ésta también
forma parte del mesencéfalo. MTc contiene los colículos superiores, asociados a
reflejos visuales, y los colículos inferiores, que son áreas de procesamiento
auditivo (Angeles Fernández-Gil, Palacios-Bote, Leo-Barahona, & Mora-Encinas,
2010). Por su parte MTg corresponde a la zona intermedia entre el MTc y la base
del tallo cerebral, esta estructura contiene núcleos somatosensoriales, la sustancia
negra, el núcleo rojo, el núcleo de la oliva inferior y la formación reticular. Esta
última se extiende desde el cordón espinal hasta tálamo y el hipotálamo,
adicionalmente se conecta con el cerebelo, el núcleo rojo y la sustancia negra,
entre sus funciones se encuentran la coordinación de movimientos finos,
conciencia, arousal, vigilia y reflejo de postura (Angeles Fernández-Gil et al.,
2010). La concentración de estas funciones en dicha área la hace fundamental
para la iniciación de los estados atencionales. En el modelo neuropsicológico de
Mesulam, el sistema atencional inicia en el zona reticular, generando los
fenómenos atencionales básicos, como la orientación y la alerta, paulatinamente
va ascendiendo hacia la corteza, que permite capacidades atencionales más
sofisticadas (Mesulam, 2000). Debido al nivel de expresión de BTBD3 en estas
zonas mesencefálicas y a la importancia de estas en los procesos de control motor
y atencionales, fallos en la expresión del gen, ya sea por eventos genéticos o
epigenéticos podrían llevar a un detrimento en las capacidades cognitivas que
utilizan los procesos atenciones como base, adicionalmente, en estas zonas se
encuentran regiones asociadas a trastornos neurodegenerativos como el
Parkinson, el cual también se encuentra en los análisis de enriquecimiento del
interactoma de BTBD3 (Tabla 4).
El THM es una estructura situada lateral al tercer ventrículo, se ha descrito
como un nodo importante en el procesamiento y relevo de información sensorial
hacia la corteza cerebral, el cerebelo y el Str. Cada uno de los subnúcleo
talámicos es esencial para el flujo de información hacia distintas áreas de corteza,
y cada núcleo puede ser categorizado en función de sus proyecciones. Se ha
descrito que los núcleos mediodorsal y pulvinar son necesarios para los procesos
92 9. Discusión.
de integración de información fronto-parietal, dicha red está relacionada con
procesos cognitivos complejos (Dorph-Petersen & Lewis, 2017). Un estudio
reciente encontró que alteraciones en el tálamo izquierdo, menor cantidad de N-
metil aspartato, en gemelos monocigotos y dicigotos se ha vinculado con síntomas
de espectro autista (EA), mostrando una relación entre la función del tálamo, la
lateralización y la severidad de los síntomas de EA (Hegarty et al., 2018). Otros
núcleos talámicos afectan la flexibilidad cognitiva. Se ha observado que lesiones
del núcleo reuniens, en el tálamo ventral medial de ratas, les impide desempeñar
el paradigma set shifting, en el que se requiere que el animal seleccione un
estímulo que previamente no generaba recompensa para esta vez la obtenga
(Linley, Gallo, & Vertes, 2016).
Por su parte VT, estructura que mostró hiperexpresión de BTBD3 en
adultos. Se ha asociado a las conductas de búsqueda y recompensa, un estudio
que registró los potenciales de acción en el globo pálido y VT durante la ejecución
de una tarea de aprendizaje estímulo-respuesta basada en recompensa, encontró
que VT muestra una importante activación durante el desempeño de estas tareas
(Schroll et al., 2015). Debido al papel como nodo esencial, que ejerce THM, en la
comunicación entre la periferia y áreas subcorticales con la corteza cerebral, su
funcionamiento es seminal en los procesos atencionales. Si la reorganización
dendrítica se ve alterada en función de la falla en BTBD3, no solo el
procesamiento sensorial, sino también la integración de estímulos que facilitan los
procesos cognitivos superiores experimentarían un detrimento.
En el cerebro adulto HiF sobresale por ser el área con mayor expresión del
gen BTBD3. Esta zona, localizada en lo profundo del lóbulo temporal, se ha
asociado con la formación de memoria y control del eje HPA (O’Mara, 2006). Esta
región se compone de giro dentado (GD), regiones de la 1 a la 4 del cuerno de
amón (CA 1, 2, 3 y 4), subiculum, presubiculum, para subiculum, fimbria, células
granulares del giro dentado, fisura hipocampal y capa molecular (Whelan et al.,
2016). Debido a las funciones asociada a HiF, memoria explícita episódica,
memoria espacial e inhibición tónica hipotalámica (Burgess, Maguire, & O’Keefe,
2002; McEwen et al., 2015), es lógico pensar que la arquitectura de las
poblaciones celulares contenidas en ésta área deben modificarse constantemente,
de modo que faciliten los procesos mnésicos a corto plazo, que durante la fase de
sueño REM se consolidaran en la memoria a largo plazo. Se ha observado, en
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
93
roedores, que las vías de señalización Semaforinas-plexinas, en el hipocampo
modulan la dinámica de microtúbulos, permitiendo que se desarrollen las neuritas
y la arborización las dendritas (Laht, Otsus, Remm, & Veske, 2014). El análisis PPi
mostró que existen al menos 19 genes que interactúan con BTBD3 (APC, CCNE1,
CCNF, CDC16, CDC20, CDC27, CDK2, CDK6, CSNK1A1, CSNK1D, CTNNB1,
CUL7, DTL, FBXL7, FBXO31, FBXW11, GSK3B, KEAP1, PLK1) y que tienen
función de microtubule organizing center, dicha función se pierde al desestabilizar
la red PPi (figura S1), lo anterior es consonante con estudios que muestran que al
eliminar la función de BTBD3, se pierde la capacidad para generar columnas
corticales y polarizar dendritas (Matsui et al., 2013; Wang et al., 2017).
La desregularización de diversas regiones hipocampales se han asociados
con TDAH. Un estudio encontró baja densidad del receptor D5 en el hipocampo de
modelos animales para TDAH (Medin et al., 2013). Por otra parte un estudio
basado en modelos de machine learning encontró que cambios en el volumen
hipocampal pueden ser usado de manera efectiva para distinguir entre casos y
controles (Rangarajan, Suresh, & Mahanand, 2014). Lo anterior apunta a que la
desregularización de HiF puede asociarse a un descontrol del eje HPA,
incapacidad para generar memoria nueva y dificultades en la conexión con la
corteza frontal, fenómenos relacionados a diferentes patologías neuropsicológicas
y neuropsiquiátricas.
El eje HPA es como se denomina a una cadena de reacciones
neurohormonales que dan inicio en el núcleo paraventricular de HTM. Cuando
este núcleo hipotalámico es estimulado produce hormona liberadora de
corticotropina (CRH), ésta hormona actúa sobre sus receptores en la
adenohipófisis, lo que lleva a la liberación de hormona adrenocorticotropa (ACTH)
(Harkness, Stewart, & Wynne-Edwards, 2011). la cual viaja a través de la vena
porta hasta la glándulas suprarrenales, una vez allí, ACTH estimula la corteza
suprarrenal para que libere glucocorticoides (Wolf, 2003). El cortisol permite que el
organismo disponga de más energía para enfrentar la amenaza suprimiendo el
sistema inmune y acelerando el metabolismo, detiene otros ejes neurohormonales,
para la liberación de interleuquinas (Tsigos, Constantine, & Chrousos, 2002) y
genera feedback negativo en el eje HPA.
La exposición crónica a glucocorticoides se ha asociado a detrimento en los
sistemas cognitivos. Un modelo interesante de estudio sobre los efectos del
94 9. Discusión.
cortisol crónico sobre el organismo es el síndrome de Cushing (CS). Esta
patología es causada por mutaciones que generan tumores en glándulas
suprarrenales o pituitaria y en consecuencia hiperactividad de las glándulas
suprarrenales (Lerario, Moraitis, & Hammer, 2014). Esta condición genera una
sobreproducción de cortisol, este elicitar mayor actividad de la vía cAMP/PKA
(Lerario et al., 2014). Las personas expuestas a estos altos niveles de cortisol
presentan déficits en funciones cognitivas como atención, funciones ejecutivas y
memoria no verbal. En un estudio realizado en pacientes CS, se encontró que
después de ser tratados (remover quirúrgicamente el tumor ya sea de la pituitaria
o de las glándulas suprarrenales) no se generaba mejoría significativa en
funciones ejecutivas y atención (Forget, Hélène, André, Isabelle, & Henri, 2016).
Esto indica, que los daños producidos por la exposición a glucocorticoides son de
mediano y largo plazo en el sistema cognitivo y se asocian con los síntomas de
TDAH.
El CL es una estructura subcortical la cual ha cobrado importancia
recientemente por su papel en la integración global de los procesos cognitivos. En
un estudio se aplicó un estímulo eléctrico a ésta área lo que tuvo como efectos
comportamentales la detención de lectura, inicio de mirada fija, ausencia de
respuesta ante comandos verbales, auditivos o visuales, movimientos respiratorios
reducidos. Adicionalmente el paciente reportó que no recordaba nada de lo
sucedido durante el procedimiento (Koubeissi, Bartolomei, Beltagy, & Picard,
2014). Al estimular CL se detectó un aumento en la actividad sincrónica del lóbulo
parietal y frontal posterior, esto sugiere que el encéfalo, ante dichas condiciones,
es incapaz de organizar en integra todos los procesos y estímulos necesarios para
generar la conciencia. Al ser un nodo tan importante de integración sensorial, CL
debe mantener un patrón de interconexiones muy bien afinado, posibilitado, entre
otros por la alta expresión de BTBD3. No se conoce una relación directa entre esta
estructura y los trastornos de neurodesarrollo, sin embargo, su papel como
integrador puede afectar las funciones cognitivas básica.
9.3.2. co-expresión.
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
95
Aunque el nivel de expresión del gen BTBD3 tiende a ser más elevado en
estado prenatal (figura 22C) su correlación con otros genes es más bajas (figura
23), lo que podría estar indicando un patrón dinámico de expresión genómica
durante el desarrollo prenatal, esto es, el genoma empiezan a establecer patrones
de expresión que determinarán la identidad celular, por tal razón los patrones de
expresión no son tan fijos. Mientras que en el cerebro adulto, se observa una
correlación más fuerte entre los diferentes genes y BTBD3 (figura 24), asociada a
un patrón de expresión ya establecido. También es de resaltar que solo 2 genes
muestran co-expresión en estado prenatal y adulto. Esto sugiere un cambio brusco
en el panorama de interacciones entre este gen y los demás.
La ontología de genes permite determinar los procesos y funciones
enriquecidas en un grupo de genes. Este tipo de análisis se realizó en el grupo de
genes co-expresados en estado prenatal y estado adulto (figura 25). La nube de
palabras muestra el enriquecimiento de acuerdo a la categoría ontológica y un
inserto que muestra las funciones compartidas. Los procesos biológicos más
abundantes en los genes co-expresado en estado prenatal son desarrollo de
sistema nervioso, procesos metabólicos, regulación de la transcripción
dependiente de ADN, regulación de la presión sanguínea, transporte de iones de
sodio, desarrollo organismico multicelular, transporte de iones de potasio y
reducción de oxidación (figura 25A). Esto es, aparte de las funciones de desarrollo
los genes co-expresados en este periodo se asocian al control iónico y control
vascular. Por su parte, en el estado adulto los proceso biológicos más
enriquecidos son: iniciación de la transcripción del promotor de la ARN polimerasa
II, splicing de mARN nuclear vía espliceosoma, regulación de la transcripción,
fosforilación de aminoácidos en proteínas, regulación positiva de la transcripción
del promotor de ARN polimerasa II, elongación del ARN del promotor de la ARN
polimerasa II, respuesta al daño del ADN (figura 25A). Lo que indica que en la
adultez el panorama de co-expresión está dominado por procesos de regulación
de la transcripción y activación de proteínas vía fosforilación, esto es concordante
con los enriquecimientos encontrados en el grupo dos del interactoma de BTBD3
(figura 21B tabla 4).
Sin embargo, funciones como ciclo celular, división celular, regulación
positiva de la transcripción dependiente de ADN, transporte de iones de potasio y
fosforilación de aminoácidos, se conservan tanto en estado prenatal como adulto
96 9. Discusión.
(figura 25B). Los datos anteriores sugieren que el panorama de co-expresión de
BTBD3 participa tanto en el desarrollo del sistema nerviosos como en control de la
expresión. A pesar de esto el grupo de genes con los que co-expresa es
radicalmente distinto, sugiriendo que la función de BTBD3 es dependiente de
tiempo y espacio en el organismo.
10. Conclusiones.
Se determinaron los perfiles de metilación de una región reguladora gen
BTBD3 en niños con diagnóstico de TDAH en una muestra de la población
Colombiana. Los resultados sugieren que los porcentajes de metilación del área
estudiada no se asocian con el diagnóstico. A pesar de esto, existen interacciones
significativas con las variables tipo de parto y el estrés prenatal. La metilación en
la región estudiada es susceptible a cambios en las primeras fases del desarrollo,
posteriormente se fija y permanece más estable. De manera más general, se
observa una relación entre el estrés y el momento de desarrollo sobre la
metilación de esta región; a mayor estrés y menor edad, más elevado es el
porcentaje de metilación, sobretodo en las CpG 3 y 4. Dichos porcentajes son
concordantes con los que reporta el USCS, en donde se muestra que los niveles
de metilación de esta zona son similares en diferentes tejidos, incluyendo sangre y
cerebro.
La comparación de los niveles de metilación en función de las variables
clínicas sugiere que, diferentes factores ambientales inciden en los porcentajes de
metilación. Estos factores pueden ser de tipo estresor, como las condiciones a las
que se estuvo sometido durante el periodo preparto, el tipo de alimentación o el
haber padecido enfermedades durante periodos tempranos de desarrollo. Sin
embargo, factores que pueden ser considerados previos y externos al individuo
también podrían generan cambios en la metilación, esto es, la edad de los padres
o la región de nacimiento. Estos factores pueden constituir blancos de intervención
para evitar el desarrollo de procesos de metilación aberrantes.
El análisis PPi, a partir de datos obtenidos de la base de datos STRING,
permitió establecer que la red de interacciones en las que estaría inmerso BTBD3
se encuentra dominada por procesos metabólicos vía ubiquitinación de proteínas.
Esto explicaría porque los estudios de knockdown, del gen BTBD3, encuentren
que las neuronas pierden su capacidad de polarización dendrítica, es decir, que al
eliminar BTBD3 la célula ve afectada su capacidad para degradar proteínas,
modificar su entramado de microtúbulos y en general renovar el panorama
proteico. La desestabilización topológica sugiere que, al eliminar BTBD3 se
98 10. Conclusiones.
generaría pérdida de funciones metabólicas y de transducción de señal, lo que al
parecer desembocaría en incapacidad de la célula para reaccionar y adaptarse a
las señales externas. Las proteínas y las interacciones observadas en esta red no
solo ofrecen un marco de entendimiento sobre el fenómeno de la polarización
dendrítica, sino que pueden ser blancos de investigación o terapéuticos desde el
punto de vista farmacológico. Aunque en este estudio no se determinó la cantidad
de proteína BTBD3, y los estudios previos que han disminuído la función de
BTBD3, tampoco han medido el aumento o disminución de otras proteínas, podría
ser relevante establecer si, al disminuir la función de BTBD3 disminuye la función
de otros sistemas, como el sistema de procesamiento de ARN o el de
ubiquitinación, los cuales emergieron en el análisis PPi. Los análisis de redes
permiten pasar del estudio de asociación de variables genéticas a examinar uno o
varios genes en su contexto funcional, de manera que se puedan establecer
nuevos blancos terapéuticos o investigativos.
Aunque la metilación del área estudiada no mostró relación directa con el
diagnóstico inicial de TDAH, los patrones expresión de BTBD3 en el encéfalo
humano tanto en periodo prenatal como adulto y su función biológica de
orientación dendrítica, mediada por las proteínas con las que interactúa BTBD3,
sugieren la importancia de este gen para buen funcionamiento y desarrollo del
sistema nervioso central. Usando datos del AIBS se determinó que los niveles más
elevados de expresión del gen se localizan en áreas asociadas al control motor
fino y grueso, formación de memoria, inhibición de ejes neurohormonales, control
del ritmo circadiano, arousal, conciencia y control ejecutivo. Adicionalmente, la
expresión de BTBD3 tiende a ser mayor en estado prenatal que en estado adulto.
Quizá debido a los procesos de sinaptogénesis y en general establecimiento
estructural del encéfalo durante el periodo prenatal. Sumado a lo anterior, se
observa que el patrón de co-expresión es más débil durante el periodo prenatal
que durante la adultez. Posiblemente por la misma razón, durante el periodo
prenatal las células nerviosas aún se encuentran en fases de diferenciación,
establecimiento de identidad y de patrones de expresión, lo que hace que haya
mayor variabilidad en los niveles de expresión. Por su parte, en la adultez se
observan patrones más fijos, los que explicaría que la menor expresión de BTBD3
pero una correlación mayor con los genes con los que se co-expresa. También se
observa que durante el periodo prenatal el patrón de expresión se asocia a
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
99
desarrollo del sistema nervioso mientras que en la adultez los genes están
enfocados a regulación de la transcripción.
A nuestro entender este es el primer estudio que indaga la relación entre la
metilación del gen BTBD3 y el TDAH, en el que adicionalmente se tuvieron en
cuenta un gran número de variables clínicas, y el uso de bases de datos para
generar relaciones anatomofuncionales asociadas a los lugares de mayor
expresión del gen y la determinación del entramado de interacciones proteicos y
sus enriquecimientos funcionales
11. Perspectivas
Para dar mayor robustez a los resultados, se debe incrementar la muestra,
adicionalmente es importante indagar otras regiones del gen, como la isla CpG o
zonas intergénicas y la relación de la metilación de dichas áreas con
polimorfismos. Aunque los resultados sugieren que la metilación en el área
estudiada es susceptible a cambios durante periodos tempranos y posteriormente
se fija y es más estable, deberían hacerse estudios longitudinales que abarquen la
adultez y la vejez, en los que se pueda establecer la evolución de la patología con
los cambios en la metilación.
Aunque existen estudios de pérdida de función del gen, estos solo han
evaluado los efectos en áreas específicas del cerebro de ratones. Estudios de
reducción de la función del gen y sus consecuencias comportamentales ayudarían
a dilucidar los efectos que dicha reducción de función podría tener en la
coordinación motora, formación de memoria, control ejecutivo y neurohormonal.
En este mismo sentido y basándonos en la PPi, se debería evaluar el efecto que la
disfunción de BTBD3 tiene sobre los sistemas de ubiquitinación, procesamiento de
ncARN, transporte intracelular, recubrimiento vesicular etc.
Debido a su centralidad (alto coeficiente topológico) los genes RPS27A,
UBA52, CSNK1D, IMP4, DCAF13, RBX1, RHOBTB2, UBC, UBB, CUL3, CUL1,
BTBD6, CSNK1E, SKP1, BTRC, TP53, SKP2, RNF7, BTBD1, FBXW5, ANAPC10,
FBXW7, CDC34, FBXW11, CDC20, UBE2D1, CDC23, CDC16, TRIP12, FBXW2,
UBE2R2, UBE2C, ANAPC11, CCNF, CDC27, CUL2, ANAPC1, FZR1, ANAPC5,
UBE2N, ANAPC4, ANAPC2, UBE2E1, UBE2D2, ANAPC7, FBXO17, CUL5 y
UBA1 son importantes blancos de estudio desde el punto de vista genético y
epigenético.
El patrón de expresión del gen sugiere que áreas como el cerebelo, la
formación hipocampal, tálamo, claustro y tallo cerebral deberían ser blancos de
observación en estudios de neuroimagen, tanto en procesos de desarrollo como
degenerativos, ya que son importantes hubs de expresión para BTBD3.
12. Anexos.
12.1. Mediciones topológicas de la red.
EdgeBetweennessCentrality
BetweennessCentrality
ClosenessCentrality
EigenvectorCentrality
DegreeCentrality
PageRankCentrality
RHOBTB3 <-> CUL3 663.24 RPS27A 8363.11 RPS27A 0.763819 SKP1
0.00837815 RPS27A 215 RPS27A
0.0078996
BTBD6 <-> RHOBTB3 602.817 UBA52 2738.66 UBA52 0.698851 CUL1
0.00835712 UBA52 183 CUL1
0.0070135
BTBD6 <-> IMP4 581.415 CSNK1D 1805.3 RBX1 0.689342 RBX1
0.00830400 CUL1 183 SKP1
0.00690263
RHOBTB2 <-> CUL3 570.296 IMP4 1093.95 UBC 0.683146 RPS27A
0.00825949 SKP1 181 UBA52
0.00681117
BTBD3 <-> IMP4 549.169 DCAF13 931.699 UBB 0.683146 UBA52
0.00818853 RBX1 177 RBX1
0.00670437
RHOBTB2 <-> BTBD1 519.406 RBX1 846.469 CUL1 0.672566 UBC
0.00817244 UBC 173 UBC
0.00649812
RHOBTB2 <-> BTBD6 498.854
RHOBTB2 838.915 SKP1 0.669604 UBB
0.00817244 UBB 173 UBB
0.00649812
BTBD1 <-> IMP4 444.34 UBC 822.254 BTRC 0.649573 SKP2
0.00814006 BTRC 164 BTRC
0.00619975
SEC24A <-> CSNK1D 424.865 UBB 822.254 SKP2 0.638655 BTRC
0.00809462 SKP2 160 SKP2
0.00585466
SEC31A <-> TCEB2 421.124 CUL3 811.628 RNF7 0.637317 FBXW7
0.00787208 FBXW7 144 CUL3
0.00555477
SEC23A <-> UBE2B 421.103 CUL1 794.112 BTBD1 0.6294 UBE2D1
0.00779425 CUL3 143 FBXW11
0.00521084
CSNK1D <-> SEC24D 420.835 BTBD6 759.941 BTBD6 0.626804 RNF7
0.00779179 FBXW11 142 FBXW7
0.0052108
CSNK1D <-> SEC24B 420.835 CSNK1E 748.978 FBXW5 0.625514 CUL3
0.00776779 RNF7 141 RNF7
0.00512112
CSNK1D <-> LMAN1 420.835 SKP1 739.258
ANAPC10 0.62423 FBXW11
0.00774180 UBE2D1 136 BTBD6
0.00491707
CSNK1D <-> SEC24C 420.835 BTRC 727.724 FBXW7 0.614141
ANAPC11
0.00773506 CCNF 136 CDC20
0.00491202
DCAF13 <-> RBX1 418.889 TP53 600.514 CUL3 0.614141 CDC16
0.00772514 CDC20 135 CCNF
0.00488454
RHOBTB2 <-> KEAP1 418.873 PSMD14 497.468 CDC34 0.614141 CCNF
0.00769401 CDC16 135 UBE2D1
0.0048561
UBA52 <-> 412.369 BTBD1 491.689 FBXW11 0.612903 CDC27
0.00768883 CDC23 134 CDC16
0.00481407
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
103
MRTO4
UBA52 <-> BOP1 400.508
RHOBTB3 488.479 CDC20 0.610442 CDC23
0.00767890 CUL2 133 BTBD1
0.00480457
UBA52 <-> PES1 384.457 BTBD3 470.889 UBE2D1 0.605578 CDC20
0.00767867 CDC27 133 CUL2
0.00479206
RHOBTB2 <-> ARHGDIA 380.453 FBXW11 414.284 CDC23 0.604374
ANAPC10
0.00767175
ANAPC11 133 CDC23
0.00477947
RHOBTB2 <-> ARHGDIG 380.453 SKP2 407.468 CDC16 0.603175 CUL2
0.00763812 FBXW5 132 CDC27 0.004731
RHOBTB2 <-> ARHGDIB 380.453 UBE2B 375.154 TRIP12 0.60198 FBXW5
0.00763297
ANAPC10 132 FBXW5
0.00472715
NOP56 <-> RPS27A 377.306 NHP2L1 335.761 FBXW2 0.600791 ANAPC1
0.00762876 UBE2C 129
ANAPC11
0.00471309
RAB9A <-> SEC24A 374.636 NHP2 332.781 UBE2R2 0.599606 FZR1
0.00761772 FZR1 129 UBE2C
0.00467997
RPS27A <-> NOB1 370.487 RNF7 325.213 UBE2C 0.599606 UBE2C
0.00761754 BTBD1 129
ANAPC10
0.00467253
UTP11L <-> RPS27A 369.813 IMP3 278.365
ANAPC11 0.599606 ANAPC5
0.00761442 FBXL3 128 FBXL3
0.00463454
UBA52 <-> EXOSC2 369.085 SEC24A 278.026 CDC27 0.598425 UBE2N
0.00760684 ANAPC1 128 FZR1
0.00456524
RPS27A <-> UTP6 368.939 CUL4A 276.77 CCNF 0.598425 ANAPC4
0.00760018 UBE2N 127 CUL5
0.00454682
NOP14 <-> RPS27A 368.939 FBXL3 259.984 FZR1 0.594912 ANAPC2
0.00759701 CUL5 127 FBXL15
0.00451904
WDR46 <-> RPS27A 368.939 CDC20 251.009 CUL2 0.594912 UBE2E1
0.00758389 CDC34 127 CDC34
0.00451557
TBL3 <-> RPS27A 368.939 UBE2C 247.138 UBE2N 0.59375 UBE2D2
0.00758369 BTBD6 127 ANAPC1
0.00450996
RPS27A <-> MPHOSPH10 368.939 FBXW7 236.298 FBXL3 0.59375 CDC34
0.00757922 ANAPC5 127 UBE2N
0.0044779
RPS27A <-> KRR1 368.939 FBXW5 234.155 ANAPC5 0.592593 ANAPC7
0.00756824 FBXO17 126 ANAPC5
0.00446971
RPS27A <-> DDX52 368.939 KEAP1 225.652 ANAPC1 0.592593 BTBD1
0.00754648 FBXL15 126 CSNK1D
0.0044677
RPS27A <-> DDX49 368.939 TCEB2 216.176 UBE2D2 0.590291 FBXO17
0.00754414 ANAPC4 126 FBXO17
0.00445516
DDX47 <-> RPS27A 368.939 NOL6 213.31 ANAPC4 0.590291 CUL5
0.00754218 ANAPC2 126 FBXO32
0.00443529
RPS27A <-> UTP18 368.939 WDR12 206.528 ANAPC2 0.590291 UBA1
0.00754204 UBE2D2 125 UBE2B
0.00443144
104 12. Anexos.
CIRH1A <-> RPS27A 368.939 CDC23 193.999 HACE1 0.589147 FBXO4
0.00752423 FBXO32 125 ANAPC2
0.00442943
WDR3 <-> RPS27A 368.939
ANAPC10 192.896 UBE2B 0.588008 UBE2S
0.00752097 UBE2E1 124 ANAPC4
0.00442745
WDR43 <-> RPS27A 368.939 CCNF 177.89 CUL5 0.588008 FBXL19
0.00751937 FBXO44 124 FBXO2
0.00439723
DIEXF <-> RPS27A 368.939 CDC34 177.689 ANAPC7 0.588008 FBXO9
0.00751937 FBXO4 124 FBXO44
0.00439713
BMS1 <-> RPS27A 368.939 NEDD8 175.817 UBE2S 0.586873 FBXL3
0.00751440 FBXO2 124 UBE2D2
0.00439648
WDR75 <-> RPS27A 366.42 RPP38 174.214 UBE2E1 0.586873 FBXL15
0.00751300 ANAPC7 124 FBXO4
0.00436771
PWP2 <-> RPS27A 365.909 FBXW2 173.649 DCAF13 0.586873 FBXO32
0.00751199 VHL 123 ANAPC7
0.00434793
RPS27A <-> UTP3 365.775 TRIP12 172.732 VHL 0.585742 VHL
0.00750985 UBE2S 123 UBA1
0.0043406
RHOBTB2 <-> PLIN3 365.533
CSNK1A1 168.671 UBE2K 0.585742 UBE2K
0.00750853 UBA1 123 UBE2E1 0.00434
RCL1 <-> RPS27A 365.425 CDK2 163.086 FBXO4 0.585742 FBXO44
0.00750748 FBXO9 123 VHL
0.00433564
NOC4L <-> RPS27A 365.135 HACE1 154.375 UBA1 0.584615 FBXO2
0.00750619 FBXO31 123 HACE1
0.00433392
UTP14C <-> RPS27A 364.157 CUL4B 152.992 FBXO32 0.584615 FBXO31
0.00750050 FBXL19 123 UBE2S
0.00433236
RPS27A <-> BYSL 362.76 CUL2 150.916 FBXO17 0.584615 BTBD6
0.00749799 FBXO6 122 FBXO31
0.00433031
RRP7A <-> RPS27A 358.611 NOP58 147.28 FBXL15 0.584615 UBA3
0.00749624 FBXO27 122 FBXO9
0.0043244
FCF1 <-> RPS27A 357.381 PNO1 147.144 UBA3 0.582375 HACE1
0.00748494 FBXL7 122 FBXL19
0.0043244
TSR1 <-> RPS27A 356.353 PSMA6 144.675 FBXO44 0.582375 FBXL5
0.00748257 FBXL5 122 FBXO6
0.00429051
HEATR1 <-> RPS27A 355.015 UTP15 142.619 FBXO2 0.582375 FBXO6
0.00748257 UBA3 121 FBXO27
0.00429051
RIOK2 <-> RPS27A 354.301 UBE2D1 139.793 UBE2M 0.581262 FBXO27
0.00748257 HACE1 121 FBXL7
0.00429051
SEC24A <-> UBE2C 352.928 SEC13 138.122 KEAP1 0.581262 FBXL7
0.00748257 UBE2M 120 FBXL5
0.00429051
LTV1 <-> RPS27A 351.813 CDKN1A 132.322 FBXO9 0.581262 UBA7
0.00748191 UBE2K 120 UBA3
0.00424596
UBA52 <-> EXOSC3 351.616 PLK1 131.628 FBXO31 0.581262 UBA6
0.00746398 UBE2B 120 UBE2M
0.00421964
RPS27A 350.486 DDB1 130.392 FBXL19 0.581262 UBE2D3 0.007460 VPRBP 119 TRIP12 0.004193
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
105
<-> RRP36
19 9
RPS27A <-> PNO1 349.817 CDC16 127.9 VPRBP 0.580153 UBE2A
0.00745630 UBE2D3 119 VPRBP
0.00418584
UBA52 <-> EXOSC1 346.975 DHX37 125.803 UBE2A 0.580153 UBE2M
0.00745608 UBA7 119 UBE2K
0.00418564
BTBD3 <-> SEC16A 345.066 FBXL15 124.793 UBA7 0.580153 UBE2B
0.00744185 TRAF7 119 TRAF7
0.00418327
UBA52 <-> EXOSC7 343.995 RPS9 123.815 FBXO6 0.580153 TCEB1
0.00743310 UBE2A 118 KEAP1
0.00418124
RPS27A <-> UTP20 338.165 EP300 121.585 FBXO27 0.580153 TRAF7
0.00743015 UBA6 118 UBE2D3
0.00416098
DCAF13 <-> RNF7 336.443 FBXO32 119.91 FBXL7 0.580153 CUL7
0.00740961 TRIP12 118 UBA7
0.00414875
PDCD11 <-> RPS27A 331.849 PDCD11 118.368 FBXL5 0.580153 VPRBP
0.00740886 TCEB1 117 DET1
0.00413726
CUL4A <-> GRWD1 320.491 RRP9 116.798 UBA6 0.579048 TRIP12
0.00739783 FBXW8 117 TCEB2
0.00412431
WDR36 <-> RPS27A 318.081 PSMA4 112.679 TRAF7 0.579048 FBXW8
0.00738875 DET1 117 UBE2A
0.00411628
UTP14A <-> RPS27A 312.527 CDC27 110.749 IMP4 0.579048 UBE2E3
0.00736722 UBE2R2 116 UBA6
0.00410895
ANAPC10 <-> UTP15 308.915 CUL5 106.992 FBXW8 0.579048 UBE2L3
0.00736588 CUL7 116 FBXW8
0.00409138
FBXW5 <-> DCAF13 307.846 FBL 102.385 TCEB2 0.577947 UBE2R2
0.00736441 UBE2L3 115 TCEB1
0.00407892
NOP2 <-> CDK2 300.112 BRIX1 101.126 TCEB1 0.577947 UBE2F
0.00736326 TCEB2 115 UBE2R2
0.00405861
EXOSC6 <-> UBA52 295.936
ANAPC11 100.847 UBE2D3 0.57685 TCEB2
0.00736312 KEAP1 115 FBXO41
0.00404338
IMP4 <-> BTBD2 294.09 CCNE1 99.8211 CUL7 0.57685 DET1
0.00735010 UBE2G1 114 IMP4
0.00403904
CSNK1E <-> SEC16A 293.803 GSK3B 96.3489 UBE2L3 0.575758 KEAP1
0.00734109 UBE2F 114 CUL7
0.00403803
SEC24A <-> UBE2B 289.932 POLR1E 96.1974 DET1 0.574669 UBE2G1
0.00733718 UBE2E3 114 DCAF13
0.00403587
RPS27A <-> NOP58 289.9 UBE2R2 94.9734 TP53 0.573585 FBXL4
0.00732825 SOCS3 114 UBE2L3
0.00400729
UBA52 <-> EXOSC5 283.886 CDKN1B 93.9408 SOCS3 0.573585 FBXL20
0.00732235 FBXO41 114 UBE2G1
0.00398463
DHX37 <-> TRIP12 283.022 PSMD11 90.0378 UBE2F 0.571429 SOCS3
0.00732054 FBXL4 113 SOCS3
0.00397741
RHOBTB3 <-> BTBD3 281.559 WDR36 87.9048 UBE2E3 0.571429 UBE2U
0.00731369 UBE2U 112 UBE2F
0.00396552
106 12. Anexos.
BTRC <-> CSNK1D 279.281 FZR1 87.8773 FBXO41 0.571429 UBE2E2
0.00730746 UBE2E2 112 UBE2E3
0.00396063
UBA52 <-> EXOSC9 271.144 EXOSC4 86.623 UBE2G1 0.570356 UBE2D4
0.00729375 NEDD4 112 FBXL4
0.00395325
SEC13 <-> CDC20 266.614 BTBD2 86.2021 FBXL4 0.570356 NEDD4
0.00728386 FBXW2 112 UBE2G2
0.00393993
RPS27A <-> RRP9 261.38 NOC2L 83.3801 PSMD14 0.569288 UBE2L6
0.00728255 FBXL20 112 FBXW12
0.00390471
PSMD14 <-> RPF1 260.7 BYSL 81.8453 FBXL20 0.569288 FBXO41
0.00727856 UBE2L6 111 NEDD4
0.00389947
NOL6 <-> CDC34 258.576 UTP14A 81.0914 UBE2U 0.568224 FBXO22
0.00726590 UBE2G2 111 FBXW2
0.00389027
EBNA1BP2 <-> CCNE1 257.343 FBXO2 78.6006 UBE2E2 0.568224 FBXL13
0.00726398 UBE2D4 111 UBE2E2
0.00389022
GNL3 <-> TP53 252.191 FBXO17 78.1211 PARK2 0.568224 FBXO7
0.00726040 TRIM63 111 UBE2U
0.00388657
UTP15 <-> RPS27A 251.571 CACUL1 77.9642 NEDD4 0.568224 PARK2
0.00726036 PARK2 111 TRIM63
0.00388626
NOL6 <-> UBE2R2 248.309 FBXO44 77.0429 UBE2L6 0.567164 FBXL18
0.00725608 FBXW12 111 FBXL20
0.00388563
DHX37 <-> RPS27A 247.71 PSMD7 76.6695 UBE2G2 0.567164 FBXW2
0.00724861 FBXO7 111 FBXL18
0.00388444
SEC13 <-> HACE1 246.994 CTNNB1 75.4344 UBE2D4 0.567164 FBXW9
0.00724619 FBXO22 111 FBXO7
0.00386061
CSNK1D <-> FBXW11 246.097 PES1 74.6638 TRIM63 0.567164 FBXL12
0.00724619 FBXL18 111 PARK2
0.00386009
UBA52 <-> FBL 244.67 NFKB1 71.4697 IMP3 0.567164 ASB1
0.00724137 FBXW9 110 FBXO22
0.00385734
UBA52 <-> WDR12 243.879 UBE2N 68.9872 FBXW12 0.567164 FBXW12
0.00724054 FBXW4 110 IMP3
0.00385617
RHOBTB2 <-> BTBD3 242.977 ANAPC1 68.9126 FBXO7 0.567164 TRIM63
0.00723613 FBXL14 110 UBE2L6
0.00385148
TP53 <-> NAT10 241.988 NOP56 67.3862 FBXO22 0.567164 FBXW4
0.00723559 FBXL13 110 UBE2D4
0.00384852
SEC31A <-> CSNK1D 241.984 FBXO4 65.3857 FBXL18 0.567164 UBE2G2
0.00723426 FBXL12 110 FBXL14
0.00384777
FBXW2 <-> RRP9 239.884 NOP2 65.0181 FBXW9 0.566108 FBXL14
0.00723307 ASB1 110 FBXW4
0.00382935
CSNK1D <-> SEC23A 237.323 ANAPC5 63.9509 FBXW4 0.566108 ASB2
0.00722718 SPSB4 109 ASB1
0.00382164
RPS27A <-> CUL3 233.623 UBA1 63.7845 FBXL14 0.566108 SPSB4
0.00722718 SPSB2 109 FBXW9
0.0038191
RPS27A <-> FBL 231.338 GRWD1 63.5234 FBXL13 0.566108 SPSB2
0.00722718 SPSB1 109 FBXL12
0.0038191
FBXW2 <-> 231.017 UBE2S 63.3874 FBXL12 0.566108 SPSB1
0.00722718 FBXO30 109 FBXL13
0.00381404
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
107
WDR12
FBXL3 <-> CSNK1D 229.356 TSR1 63.3126 ASB1 0.566108 FBXO30
0.00722718 FBXO21 109 SPSB4
0.00378014
RB1 <-> PNO1 227.885
EBNA1BP2 62.1841 SPSB4 0.565056 FBXO21
0.00722718 FBXO10 109 SPSB2
0.00378014
PSMD14 <-> TFB2M 226.916 VHL 61.8697 SPSB2 0.565056 FBXO10
0.00722718 FBXL8 109 SPSB1
0.00378014
RHOBTB3 <-> ARHGDIA 223.547 ANAPC2 61.1161 SPSB1 0.565056 FBXL8
0.00722718 FBXL16 109 FBXO30
0.00378014
RHOBTB3 <-> ARHGDIB 223.547 UTP11L 59.6704 NHP2L1 0.565056 FBXL16
0.00722718 ASB6 109 FBXO21
0.00378014
RHOBTB3 <-> ARHGDIG 223.547 LTV1 59.405 FBXO30 0.565056 ASB6
0.00722718 ASB2 109 FBXO10
0.00378014
PSMD14 <-> BRIX1 223.236 EXOSC5 58.8609 FBXO21 0.565056 CACUL1
0.00420665 DCAF13 101 FBXL8
0.00378014
NOC2L <-> CDKN1A 217.019 RIOK2 58.645 FBXO10 0.565056 CUL4A
0.00361060 IMP4 99 FBXL16
0.00378014
CSNK1D <-> RPS27A 216.544 CCNA1 58.3907 FBXL8 0.565056 PSMD14
0.00340907 IMP3 97 ASB6
0.00378014
POLR1E <-> EP300 216.285 DET1 58.2861 FBXL16 0.565056 NEDD8
0.00340331 NOP58 94 ASB2
0.00378014
CDC23 <-> EXOSC4 214.163 UBE2D2 57.9494 ASB6 0.565056 CUL4B
0.00306138 WDR36 93 NOP58
0.0037533
RHOBTB3 <-> PLIN3 212.822 CDK4 57.7077 ASB2 0.565056 SPOP
0.00297867 UTP15 93 TP53
0.00374116
UBC <-> IMP3 210.381 FBXO31 57.5878 CUL4A 0.561922 PSMD11
0.00292648 RRP9 93 NOP56
0.00372594
IMP3 <-> UBB 210.381 CCND1 57.4 CSNK1D 0.561922 PSMD7
0.00292302 PDCD11 93 PDCD11
0.00371673
RPS27A <-> IMP4 210.348 ANAPC4 57.3609 WDR36 0.560886 CDK2
0.00280644 NOP56 93 WDR36
0.00371597
NHP2 <-> CDK4 208.282 WDR46 57.199 UTP15 0.559853 SPOPL
0.00274990 WDR46 92 UTP15
0.00370871
NOL6 <-> RPS27A 205.715 WDR43 57.199 NOP58 0.559853 TP53
0.00271225 WDR43 92 RRP9
0.00370816
RHOBTB2 <-> RAB9A 203.082 WDR3 57.199 PDCD11 0.558824 FBXL2
0.00262980 WDR3 92 FBL
0.00368792
UBB <-> NHP2 201.299 UTP6 57.199 UTP14A 0.557798 CDKN1B
0.00254521 WDR12 92 WDR46
0.00367854
UBC <-> NHP2 201.299 UTP18 57.199 NOL6 0.557798 CCNA2
0.00244971 UTP6 92 WDR43
0.00367854
BRIX1 <-> FBXO5 199.99 TBL3 57.199 RRP9 0.556777 PLK1
0.00242935 UTP18 92 WDR3
0.00367854
NOC2L <-> TP53 196.514 NOP14 57.199 PNO1 0.556777 NFKB1
0.00241732 TBL3 92 UTP6
0.00367854
MARCH 196.111 MPHOS 57.199 NOP56 0.556777 PSMA4 0.002411 NOP14 92 UTP18 0.003678
108 12. Anexos.
3 <-> IMP4
PH10 35 54
IMP4 <-> MARCH2 194.968 KRR1 57.199 FBL 0.556777 PSMA6
0.00238887
MPHOSPH10 92 TBL3
0.00367854
DCAF13 <-> CRBN 180.342 DIEXF 57.199 WDR46 0.555759 CDKN1A
0.00233975 KRR1 92 NOP14
0.00367854
BTBD6 <-> RPS27A 180.054 DDX52 57.199 WDR43 0.555759 FBXO18
0.00227909 FBL 92
MPHOSPH10
0.00367854
UBA52 <-> EXOSC4 177.253 DDX49 57.199 WDR3 0.555759 COPS5
0.00225274 DIEXF 92 KRR1
0.00367854
PDCD11 <-> NFKB1 174.866 DDX47 57.199 UTP6 0.555759 BTBD2
0.00220214 DDX52 92 DDX52
0.00367854
UBA52 <-> IMP3 167.204 CIRH1A 57.199 UTP18 0.555759 COPS6
0.00217363 DDX49 92 CIRH1A
0.00367854
UBA52 <-> NHP2 165.741 BMS1 57.199 TBL3 0.555759 ABTB1
0.00213274 DDX47 92 BMS1
0.00367854
RPP38 <-> UBB 165.44 TFB2M 56.1956 NOP14 0.555759 CCNE1
0.00212033 CIRH1A 92 DIEXF
0.00367854
RPP38 <-> UBC 165.44 FBXO5 55.6517 NEDD8 0.555759 USP47
0.00209671 BMS1 92 DDX49
0.00367854
RPS27A <-> KEAP1 165.208 UBE2G2 55.433
MPHOSPH10 0.555759 CCNA1
0.00209010 UTP3 91 DDX47
0.00367854
CSNK1E <-> FOXO3 164.971 PWP2 55.0514 KRR1 0.555759 ABTB2
0.00207437 RCL1 91 WDR12
0.00367609
POLR1E <-> GSK3B 162.451 UTP3 54.7496 DIEXF 0.555759 CCND1
0.00204996 PWP2 91 BYSL
0.00366273
CUL4A <-> DCAF13 162.274 RCL1 54.5668 DDX52 0.555759 UBE2I
0.00202585 NOC4L 91 NHP2L1
0.00365765
NFKBIE <-> RPS27A 161.56 NOC4L 54.382 DDX49 0.555759 BTBD3
0.00202208 NHP2L1 91 PWP2
0.00364408
UBB <-> NHP2L1 159.744 FBXO9 54.2965 DDX47 0.555759 FBXO5
0.00201241 BYSL 91 UTP3
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0.00200641 WDR75 90 NOC4L
0.00364356
BTRC <-> BHLHE41 158.899 WDR75 53.9644 CIRH1A 0.555759 BTBD9
0.00200641 UTP14A 90 RCL1
0.00364339
RPS27A <-> COPS7A 156.669 MRTO4 52.9454 BMS1 0.555759 FBXO25
0.00200641 RPF1 90 UTP14A
0.00361222
RPS27A <-> RBL2 156.268 FBXO6 52.4792 UTP3 0.554745 FBXO39
0.00200641 NOL6 90 WDR75
0.00360896
NHP2 <-> RPS27A 155.977 FBXO27 52.4792 RCL1 0.554745 DDB1
0.00180795 UTP14C 89 RPF1
0.00360677
IMP3 <-> RPS27A 154.96 FBXL7 52.4792 PWP2 0.554745 CCNE2
0.00179490 UTP11L 89 PSMD14
0.00360346
DCAF13 <-> CDKN1B 154.193 FBXL5 52.4792 NOC4L 0.554745 CTNNB1
0.00167303 PNO1 88 NOL6
0.00359935
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
109
UBE2I <-> NOP58 153.431 UTP14C 52.3294 BYSL 0.554745 CDK4
0.00164260 HEATR1 88 UTP11L
0.00358717
CUL4B <-> DCAF13 151.191 FBXO41 50.9147 DHX37 0.553734 EP300
0.00162799 DHX37 88 UTP14C
0.00357479
RPS27A <-> FBXO44 149.99 SPOP 50.8737 WDR75 0.552727 CDK6
0.00162424 RRS1 86 CSNK1E
0.00357474
DTL <-> DCAF13 149.672 UBE2M 49.9133 UTP11L 0.552727 NFKBIA
0.00162208 PSMD14 86 PNO1
0.00354195
FBXO2 <-> RPS27A 148.655 TRIM63 49.023 UTP14C 0.551724 MYC
0.00157975 NIP7 86 HEATR1
0.00353854
NOTCH1 <-> WDR12 148.041 SEC16A 48.932 HEATR1 0.551724 DTL
0.00156662 MRTO4 86 DHX37
0.00353537
RPS27A <-> FBXL15 146.349 RRP7A 48.6063 FCF1 0.549729 COPS8
0.00138993 FCF1 86 FCF1
0.00347076
GPS1 <-> RPS27A 146.202 ANAPC7 48.0297 TSR1 0.548736 DDB2
0.00136370 TSR1 85 NIP7
0.00346853
CCNF <-> RPS27A 145.682 FCF1 46.9318 RPS9 0.548736 CKS1B
0.00135779 TP53 85 RRS1
0.00346115
SPOPL <-> RPS27A 145.524 SEC31A 46.931 RPP38 0.548736 COPS4
0.00133950 BRIX1 85 MRTO4
0.00346091
RPS27A <-> COPS4 144.286 HEATR1 46.7921 PSMD11 0.548736 KDM2A
0.00128721 PES1 83 TSR1
0.00343478
UBC <-> RPS9 143.361 VPRBP 46.5289 WDR12 0.546763 CAND1
0.00127219 LTV1 83 BRIX1
0.00342954
UBB <-> RPS9 143.361 SPOPL 46.297 LTV1 0.546763 GSK3B
0.00127218 BOP1 83 LTV1
0.00336534
NFKB2 <-> RPS27A 143.179 DTL 45.888 CUL4B 0.546763 COPS2
0.00127163 TFB2M 82 RRP7A
0.00334428
RPS27A <-> SPOP 143.076 NOB1 45.7706 RRP7A 0.544803 IKBKB
0.00125028 RRP7A 82 PES1
0.00334311
FBXL7 <-> RPS27A 142.535 TRAF7 45.5729 NOB1 0.544803 HIF1A
0.00118248 NOB1 82 BOP1
0.00333871
FBXO6 <-> RPS27A 142.535 RB1 44.8504 RIOK2 0.543828 GPS1
0.00117386 NHP2 82 TFB2M
0.00333618
FBXO27 <-> RPS27A 142.535 SEC23A 44.1706 RRP36 0.542857 GLI3
0.00113977 MKI67IP 82 NOB1
0.00331868
FBXL5 <-> RPS27A 142.535 UBA3 43.4128 CDK2 0.541889 GLI1
0.00113269 DDX56 82 NHP2
0.00331697
RPS27A <-> FBXO9 142.416 UBE2E1 42.7636 NHP2 0.540925 ckshs1
0.00112618 RPF2 81 MKI67IP
0.00331584
FBXL19 <-> RPS27A 142.416 RPF1 42.393 CACUL1 0.539964 GLI2
0.00106838 RIOK2 81 DDX56
0.00330754
DCAF13 <-> RPS27A 142.267 BOP1 41.9575 UTP20 0.539007 NOTCH1
0.00104999
KIAA0020 81 RIOK2
0.00329686
FBXO31 142.162 RRP36 39.0583 CDKN1B 0.539007 KDM2B 0.001046 EBNA1B 81 EBNA1B 0.003284
110 12. Anexos.
<-> RPS27A
12 P2 P2 78
FBXO45 <-> RBX1 142.068 EXOSC9 38.7045 CDKN1A 0.539007 NFKB2
0.00102616 RRP36 80 CUL4A
0.00328266
FBXO41 <-> RPS27A 141.623 DDB2 38.1549 BTBD3 0.539007 CKS2
0.00102095 RBM28 80
KIAA0020
0.00327248
FBXO17 <-> RPS27A 141.619 MYC 35.533 PSMD7 0.537102 RB1
0.00100113 NAT10 80 RPF2
0.00326876
HIF1A <-> RPS27A 141.365 UBE2I 34.7065 MRTO4 0.537102
CSNK1A1
0.00097366
ENSG00000248354 80 DIMT1
0.00326546
RPS27A <-> SKP1 141.176 GNL3 34.6623 DDB1 0.537102 SUFU
0.00096219 DIMT1 80 RRP36
0.00326313
FAM123B <-> RPS27A 141.074 FBXW8 33.4512 PSMA6 0.535211
FAM123B
0.00095470 CACUL1 80
ENSG00000248354
0.00323834
CUL1 <-> RPS27A 141.028 UBE2D3 32.5888 PSMA4 0.535211 AXIN1
0.00087445 RPS9 79 NAT10
0.00323681
FBXO32 <-> RPS27A 140.697 COPS5 32.4365 PES1 0.534271 RBL2
0.00086304 RPP38 79 RBM28
0.00323374
FBXW11 <-> BHLHE41 138.856 NOTCH1 32.0784 BOP1 0.534271 PER2
0.00085609 NOL10 79 RPS9
0.00321991
BTRC <-> CSNK1E 138.848 UBE2K 31.7866 NFKB1 0.532399 FBXL6
0.00085333 GRWD1 79 RPP38
0.00321901
FBXW12 <-> RPS27A 138.359 RAB9A 31.7297 CCNE1 0.529617 COPS7A
0.00085182 GNL3 79 GNL3
0.00321446
FBXW7 <-> RPS27A 138.031 UTP20 29.6024 BTBD2 0.528696 APC
0.00082144
ENSG00000204775 79 PSMD11
0.00320948
CACUL1 <-> RPS27A 136.92 FBXW12 29.2324 EP300 0.525952 NFKBIE
0.00075674 CUL4A 79
ENSG00000204775
0.00320309
CUL4B <-> NHP2L1 136.812 NAT10 28.7527 PLK1 0.525043 FBXO45
0.00067422 CSNK1D 79 GRWD1
0.00320006
UBA52 <-> RPP38 136.436 HIF1A 28.4957 GSK3B 0.525043 DCAF13
0.00066473 POLR1E 78 NOL10
0.00319952
RPS27A <-> GLI1 136.015 UBE2A 28.417 UBE2I 0.522337 CRY2
0.00063354 NOP2 77 CACUL1
0.00318943
SUFU <-> RPS27A 135.766 DIMT1 27.9902 CTNNB1 0.521441 NHP2L1
0.00063188 NOC2L 77 POLR1E
0.00318377
FBXL18 <-> RPS27A 135.705 COPS6 26.9176 EXOSC2 0.520548 CRY1
0.00062624 NGDN 77 PSMD7
0.00317619
FBXO4 <-> RPS27A 135.357 CCNA2 26.2743 DTL 0.520548 CSNK1E
0.00062210 UTP20 76 NGDN
0.00314304
WDR36 <-> TP53 134.679 UBA7 24.8603 CCND1 0.520548 CSNK1D
0.00061128 NSUN6 76 NOC2L
0.00313681
FBXL14 <-> 134.245 EXOSC6 23.8058 SPOP 0.519658 FBXL17
0.00059833 GNL3L 76 NOP2
0.00313253
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
111
RPS27A
COPS8 <-> RPS27A 134.018 FBXL4 22.9476 EXOSC4 0.517888 IMP3
0.00058105 WDR74 75 UTP20
0.0031256
IKBKB <-> RPS27A 132.619 TCEB1 22.5163 FBXO5 0.517007 FOXO3
0.00056601 CSNK1E 75 NSUN6
0.00309567
UTP14A <-> TP53 132.021 SOCS3 22.152 EXOSC5 0.517007 RPS9
0.00054606 PSMD11 74 GNL3L
0.00309489
RPS27A <-> FBXL4 131.323 EXOSC2 22.0852 COPS5 0.517007 NHP2
0.00054496 PSMD7 73 WDR74
0.00307488
COPS2 <-> RPS27A 131.197 UBE2G1 21.9114 SPOPL 0.516129 RPP38
0.00054216 RTCA 72 CDK2
0.00299236
CSNK1E <-> FBXW11 130.916 GLI2 21.618
CSNK1A1 0.516129 IMP4
0.00051230 RRP15 72 RRP15
0.00297287
PSMD11 <-> NHP2L1 130.904 UBE2L3 21.0071 CCNA1 0.514382
MARCH2
0.00050599 MAK16 72 MAK16
0.00295898
SKP2 <-> RPS27A 130.7 UBA6 20.826 CDK4 0.512648 NOL6
0.00045870 NEDD8 71 RTCA
0.00295886
UBE2G1 <-> RPS27A 130.454 FBXL18 20.5861 CCNA2 0.512648 FOXO1
0.00045728 EXOSC2 69 CUL4B
0.0029454
COPS6 <-> RPS27A 129.997 CUL7 18.4582 EXOSC6 0.511785 CRBN
0.00043112 CUL4B 69 CDKN1A
0.00291059
CSNK1E <-> FBXL3 129.656 NFKBIA 17.9065 EXOSC9 0.510924 WDR12
0.00042237 CDK2 69 CDKN1B
0.00288247
PSMD14 <-> NOP58 129.574 IKBKB 17.5433 EXOSC3 0.510924 FBL
0.00040467 EXOSC5 65 NEDD8
0.00288026
CUL5 <-> RPS27A 128.469 FBXL14 17.145 NOTCH1 0.510067 UTP15
0.00040315 CDKN1B 65 EXOSC2
0.00286351
CCNA2 <-> RPS27A 128.258 GLI1 16.6475 EXOSC1 0.509213 RRP9
0.00039944 PSMA6 64 PSMA4
0.00285801
RPS27A <-> CCND1 128.253 FOXO1 15.7306 DDB2 0.509213 DHX37
0.00039034 PSMA4 64 PSMA6
0.00285799
UBE2G2 <-> RPS27A 127.865 CDK6 15.5237 EXOSC7 0.507513 NOP58
0.00038358 CDKN1A 64 PLK1
0.00276746
GLI3 <-> RPS27A 127.69 NEDD4 14.1285 COPS6 0.507513 EXOSC4
0.00036165 EXOSC4 62 EXOSC5
0.00273306
RAB9A <-> RHOBTB3 127.555 UBE2F 13.1053 RB1 0.503311 WDR36
0.00035976 SPOP 61 CCND1
0.00267149
RPS27A <-> FBXO7 127.147 AXIN1 12.3368 GLI2 0.502479 PDCD11
0.00035718 PLK1 60 EXOSC4
0.00262444
CCNE2 <-> RPS27A 126.665 EXOSC3 12.3056 NFKBIA 0.498361 UTP14A
0.00035106 EXOSC6 59 SPOP
0.00258895
SPSB4 <-> RPS27A 126.591 NIP7 10.795 CCNE2 0.498361 BYSL
0.00033818 EXOSC9 58 EP300
0.00258848
112 12. Anexos.
RPS27A <-> FBXL8 126.591 GLI3 10.7677 IKBKB 0.497545 NOP56
0.00033664 EXOSC3 58
RHOBTB2
0.00258361
ASB2 <-> RPS27A 126.591 UBE2E3 10.2207 COPS2 0.497545 UTP6
0.00033603 SPOPL 57 NFKB1
0.00256016
SPSB1 <-> RPS27A 126.591 PER2 9.78068 GLI3 0.495922
MPHOSPH10
0.00033603 NFKB1 57 BTBD3
0.00254175
FBXO10 <-> RPS27A 126.591 COPS2 9.36373 GLI1 0.495922 UTP18
0.00033603 CCND1 57 EXOSC6
0.00252119
FBXL16 <-> RPS27A 126.591 FOXO3 9.00775 COPS8 0.494309 TBL3
0.00033603 EXOSC7 55 EXOSC3
0.00249601
SPSB2 <-> RPS27A 126.591 FBXW4 8.98911 AXIN1 0.493506 NOP14
0.00033603 EXOSC1 55 EXOSC9
0.00249066
RPS27A <-> FBXO30 126.591 PARK2 8.92309 APC 0.491115 KRR1
0.00033603 CCNA2 55
RHOBTB3
0.00248591
ASB6 <-> RPS27A 126.591 RRS1 8.63564 COPS4 0.489533 DDX52
0.00033603 COPS5 53 CTNNB1
0.0024832
FBXO21 <-> RPS27A 126.591 FBXO7 8.62592 TFB2M 0.488746 BMS1
0.00033603 EP300 52 SPOPL
0.00246403
FBXL13 <-> RPS27A 126.462 APC 8.56083 SUFU 0.488746 CIRH1A
0.00033603 CTNNB1 51 CCNA2
0.00244188
FBXW9 <-> RPS27A 126.382 CCNE2 8.39556 CRBN 0.488746 WDR43
0.00033603 FBXL2 49 COPS5
0.00238591
RPS27A <-> FBXL12 126.382 CKS1B 7.71257 HIF1A 0.487961 WDR3
0.00033603 DDB1 49 EXOSC1
0.00238025
UBE2U <-> RPS27A 126.294 FBXL2 7.70197 PER2 0.487179 WDR46
0.00033603 CCNE1 49 EXOSC7
0.00237984
RPS27A <-> ASB1 126.241 COPS8 7.66159 GPS1 0.4864 DDX49
0.00033603 CCNA1 49 MYC
0.00235251
FBXW4 <-> RPS27A 126.224 UBE2E2 7.15151
FAM123B 0.484848 DDX47
0.00033603 MYC 48 DDB1
0.00235043
TRIM63 <-> RPS27A 126.142 UBE2U 6.49708 NFKB2 0.48254 DIEXF
0.00033603 COPS6 47 CDK4
0.00226896
FBXO22 <-> RPS27A 126.11 CRY2 6.3182 CRY2 0.481775 NOC4L
0.00033429 CDK4 47 CCNA1
0.00224522
RPP38 <-> RPS27A 126.013 COPS4 6.31023 CRY1 0.481775 RCL1
0.00033427 BTBD2 46 GSK3B
0.00223986
UBA52 <-> NHP2L1 125.912 EXOSC1 6.27662 RPF1 0.479495 UTP3
0.00033421 BTBD3 44 CCNE1
0.00222754
PSMD14 <-> WDR12 125.77 CRY1 6.03366 BRIX1 0.479495 PWP2
0.00033406 GSK3B 43 SEC24A
0.00219785
TRAF7 <-> RPS27A 125.565 FBXO22 6.031 RBL2 0.47874 PNO1
0.00033200 FBXO18 43
CSNK1A1
0.00219129
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
113
RPS27A <-> TCEB2 124.754 ARNTL 5.87974 COPS7A 0.475743 WDR75
0.00032950 UBE2I 41 COPS6
0.00215597
RPS27A <-> UBE2D4 124.491 MKI67IP 5.26529 FOXO1 0.475 HEATR1
0.00032890 CDK6 41 BTBD2
0.00214185
CSNK1D <-> DDB1 124.439 FBXO18 5.13155 NFKBIE 0.474259 UTP11L
0.00032856 CCNE2 41 FBXL2
0.00211496
PARK2 <-> RPS27A 124.258 ASB1 4.98782 NOC2L 0.47352 UTP14C
0.00032733 ABTB1 41 CDK6
0.00200465
CUL2 <-> RPS27A 124.098 FBXL20 4.66431 FOXO3 0.471318 TSR1
0.00032506 USP47 40 SEC13
0.0019978
UBE2E2 <-> RPS27A 123.843 EXOSC7 4.60515
MARCH2 0.469136 FCF1
0.00032340 NFKBIA 40 NFKBIA
0.00195498
UBE2L6 <-> RPS27A 123.834 RRP15 4.31473 CDK6 0.467692 LTV1
0.00032104 FBXO5 40 CCNE2
0.00194298
RPS27A <-> FBXL20 123.669 WDR74 4.26862 MYC 0.466974 PES1
0.00031706
CSNK1A1 40 FBXO18
0.00192626
UBE2F <-> RPS27A 123.653 NGDN 4.23098 GRWD1 0.466974 RIOK2
0.00031340 ABTB2 39 UBE2I
0.00188581
DET1 <-> RPS27A 123.39 DDX56 3.79532 NAT10 0.466258 MRTO4
0.00031174 FBXO39 38 SEC16A
0.00186993
CSNK1D <-> TP53 123.07 UBE2L6 3.6701 GNL3 0.465544 RRP7A
0.00031151 FBXO25 38 ABTB1
0.00186822
NEDD4 <-> RPS27A 122.331 NFKB2 3.41809 ARNTL 0.464122 NOB1
0.00031002 DTL 38 DTL
0.00186665
UBE2E3 <-> RPS27A 121.377 ABTB1 3.32556 FBXL2 0.462006 BOP1
0.00030833 BTBD9 38 SEC23A
0.00186057
RPS27A <-> NFKBIA 121.15
ENSG00000248354 3.2465 NOP2 0.459909 RRP36
0.00030820 BTBD11 38 SEC31A
0.00185974
RPS27A <-> BTBD1 120.923
ENSG00000204775 3.19412 POLR1E 0.457143
MARCH3
0.00030373 DDB2 36 FBXO5
0.00184728
RPS27A <-> UBE2B 120.862
KIAA0020 3.16811 FBXO18 0.457143 EXOSC5
0.00030309 RB1 34 NOTCH1
0.00183472
UBE2C <-> RPS27A 120.829 GPS1 3.09256 ABTB1 0.455772 UTP20
0.00029985 NOTCH1 34 USP47
0.00183062
UBE2D3 <-> RPS27A 120.751 FBXW9 2.98121 USP47 0.45441 ARNTL
0.00028947 IKBKB 33 DDB2
0.00181963
CSNK1E <-> SEC13 120.422 FBXL12 2.98121 DIMT1 0.45441
RHOBTB2
0.00028554 COPS8 33 SEC24D
0.00181583
COPS5 <-> RPS27A 119.908
BHLHE41 2.60998
BHLHE41 0.45441 EXOSC9
0.00028528 COPS2 33 SEC24C
0.00181583
RPS27A <-> UBE2S 119.759 March2 2.50741 CKS1B 0.453055 BRIX1
0.00028120 CKS1B 33 SEC24B
0.00181583
CSNK1D 119.758 UBE2D4 2.32915 ABTB2 0.453055 RPF1 0.000280 GLI3 32 LMAN1 0.001815
114 12. Anexos.
<-> CCNA1
79 83
RPS27A <-> UBE2M 119.507 USP47 2.30786 FBXO39 0.452381 TFB2M
0.00027347 GLI1 32 RB1
0.00179844
SOCS3 <-> RPS27A 117.803 CAND1 2.303 FBXO25 0.452381 EXOSC2
0.00027330 COPS4 32 ABTB2
0.0017962
CDC27 <-> RPS27A 117.502 RPF2 2.15973
EBNA1BP2 0.452381 EXOSC6
0.00026934 HIF1A 31 FBXO39
0.00176289
FBXW8 <-> RPS27A 117.472 ckshs1 2.0253 BTBD9 0.452381 GRWD1
0.00025473 GLI2 31 FBXO25
0.00176289
UBA3 <-> RPS27A 117.008 RBL2 1.94349 BTBD11 0.452381 NOC2L
0.00025448 GPS1 28 BTBD9
0.00176289
CSNK1D <-> PLK1 116.886 CRBN 1.789 CAND1 0.449704 NAT10
0.00025235 ckshs1 26 BTBD11
0.00176289
FOXO1 <-> CSNK1D 116.748 RBM28 1.7685
MARCH3 0.44904 EXOSC3
0.00024854 AXIN1 26 IKBKB
0.00176058
UBA1 <-> RPS27A 116.076 NOL10 1.71965 SEC13 0.447059
EBNA1BP2
0.00024525 CAND1 25 GLI1
0.00173352
TCEB1 <-> RPS27A 116.054
FAM123B 1.67563 ckshs1 0.444444 GNL3
0.00024491 NFKB2 24 HIF1A
0.00171839
UBE2L3 <-> RPS27A 116.054 SUFU 1.57322 SEC24A 0.44186 RRS1
0.00024417 FOXO3 24 GLI3
0.00171024
RPS27A <-> NHP2L1 115.987 NSUN6 1.43958 KDM2A 0.438672 EXOSC1
0.00024299 SUFU 23 COPS2
0.00169948
UBA6 <-> RPS27A 115.607 CKS2 1.39859 CKS2 0.438672 NOP2
0.00024293 NOP16 23 COPS8
0.00168617
UBA7 <-> RPS27A 115.31 RTCA 1.35274 RRS1 0.43741 EXOSC7
0.00024256 CKS2 23 CKS1B
0.00167829
UBE2A <-> RPS27A 115.262 KDM2A 1.31706 NIP7 0.436782 NIP7
0.00024161 APC 23 GLI2
0.00167712
VPRBP <-> RPS27A 114.832 GNL3L 1.06706 DDX56 0.434907 DIMT1
0.00024161 COPS7A 22 COPS4
0.00164829
CDC16 <-> RPS27A 114.8 March3 0.959246 KDM2B 0.434286 POLR1E
0.00023740 RBL2 21
ARHGDIG
0.00161083
ANAPC11 <-> RPS27A 114.622 FBXL13 0.922987 MKI67IP 0.433048 MKI67IP
0.00023410 FOXO1 21
ARHGDIB
0.00161083
CUL7 <-> RPS27A 114.176 MAK16 0.892923
KIAA0020 0.433048 RPF2
0.00023326
FAM123B 21
ARHGDIA
0.00161083
CDC20 <-> RPS27A 113.784 COPS7A 0.740612
ENSG00000204775 0.433048 DDX56
0.00023191 PER2 20 GPS1
0.00150132
SEC13 <-> PLK1 113.779 FBXL17 0.613655 RPF2 0.432432 RBM28
0.00022872 KDM2A 20 AXIN1
0.00149844
RPS27A 113.735 KDM2B 0.447851 ENSG00 0.432432 KIAA002 0.000225 NFKBIE 17 FOXO3 0.001464
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
115
<-> HACE1
000248354
0 98 22
UBA52 <-> RPS9 113.104 FBXL6 0.406528 RBM28 0.431818
ENSG00000204775
0.00022577 KDM2B 17 RAB9A
0.00143046
RPS27A <-> VHL 112.414 NFKBIE 0.370779 NOL10 0.430595
ENSG00000248354
0.00022514 CRY2 16 ckshs1
0.00142207
ANAPC7 <-> RPS27A 111.978 NOP16 0.360112 WDR74 0.429379 NOL10
0.00022322 CRY1 16 APC
0.00137587
ANAPC1 <-> RPS27A 111.871 ABTB2 0.232127 NGDN 0.429379 NSUN6
0.00021816 FBXL6 14 NFKB2
0.00136427
UBE2E1 <-> RPS27A 111.457 SEC24D 0.111111 GNL3L 0.429379 GNL3L
0.00021784 SEC13 13 FOXO1
0.00134747
CSNK1D <-> BHLHE41 111.331 SEC24C 0.111111 FBXL6 0.429379 NGDN
0.00021289 CRBN 13 CAND1
0.00133804
ANAPC4 <-> RPS27A 111.254 SEC24B 0.111111 NSUN6 0.428773 WDR74
0.00020795 ARNTL 13 PER2
0.00133498
ARNTL <-> BTRC 111.167 LMAN1 0.111111 SEC23A 0.427567 RTCA
0.00020758 SEC24A 12 SUFU
0.00133437
ARNTL <-> CSNK1D 111.131 SPSB4 0 FBXL17 0.427567
BHLHE41
0.00020215
RHOBTB2 11 CKS2
0.00130923
FZR1 <-> RPS27A 110.804 SPSB2 0 SEC31A 0.426966 RRP15
0.00020052 FBXL17 11 COPS7A
0.00129673
ANAPC2 <-> RPS27A 110.781 SPSB1 0 RRP15 0.426966 MAK16
0.00019905
BHLHE41 11 NOP16
0.00128439
CSNK1D <-> SEC13 110.293 PLIN3 0 RTCA 0.42577 SEC13
0.00016933 SEC31A 10
FAM123B
0.00125783
RPS27A <-> ANAPC5 110.075 FBXO45 0 MAK16 0.424581
RHOBTB3
0.00015529 SEC23A 10 RBL2
0.00125599
IMP3 <-> NEDD8 109.755 FBXO39 0 FBXO45 0.42047 SEC24A
0.00014177 SEC16A 10 PLIN3
0.0012302
RPS27A <-> PSMD7 108.266 FBXO30 0
RHOBTB2 0.412483 SEC23A
0.00007508
MARCH2 10 CRY1
0.00119685
RPS27A <-> UBE2K 108.035 FBXO25 0
RHOBTB3 0.409152 SEC31A
0.00007439 FBXO45 10 CRY2
0.00119135
UBE2D1 <-> RPS27A 107.187 FBXO21 0 SEC16A 0.392765 NOP16
0.00006980 SEC24D 9 KDM2A
0.00112765
UBE2D2 <-> RPS27A 106.849 FBXO10 0 NOP16 0.389245 SEC16A
0.00002775 SEC24C 9 ARNTL
0.00111225
UBE2N <-> RPS27A 105.082 FBXL8 0. SEC24D 0.36983 SEC24D
9.96917*10^-6 SEC24B 9 NFKBIE
0.00110561
RPS9 <-> RPS27A 104.75 FBXL16 0 SEC24C 0.36983 LMAN1
9.96917*10^-6
RHOBTB3 9
BHLHE41 0.001038
CTNNB1 104.457 BTBD9 0 SEC24B 0.36983 SEC24C 9.96917* LMAN1 9 KDM2B 0.001034
116 12. Anexos.
<-> CSNK1D
10^-6 7
NHP2 <-> NEDD8 100.34 BTBD11 0 LMAN1 0.36983 SEC24B
9.96917*10^-6
MARCH3 7 CRBN
0.000969677
CSNK1A1 <-> DIMT1 98.9046 ASB6 0 RAB9A 0.321693 RAB9A
5.17681*10^-6 RAB9A 4 FBXL6
0.000940677
CUL1 <-> FBXO45 97.8851 ASB2 0 PLIN3 0.295432
ARHGDIG
3.96072*10^-6
ARHGDIG 4 FBXL17
0.000865477
PES1 <-> DDB2 97.5163
ARHGDIG 0
ARHGDIG 0.293153
ARHGDIA
3.96072*10^-6
ARHGDIB 4
MARCH2
0.000830679
EXOSC6 <-> PSMA6 96.9103
ARHGDIB 0
ARHGDIB 0.293153
ARHGDIB
3.96072*10^-6
ARHGDIA 4 FBXO45
0.00079854
CSNK1E <-> BHLHE41 96.1884
ARHGDIA 0
ARHGDIA 0.293153 PLIN3
3.9365*10^-6 PLIN3 3
MARCH3
0.00074011
tabla S1. Medidas topológicas
12.2. Enriquecimiento funcional de la red completa y
desestabilizada.
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
117
118 12. Anexos.
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
119
120 12. Anexos.
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
121
122 12. Anexos.
Figura S1. enriquecimiento en cada una de las categorías ontológicas de las proteínas
pertenecientes a la red completa (figura 19) y la red desestabilizada (figura 21C). Cada
diagrama de barras muestra el conteo de cuántas proteínas en la red se asocian a cada
función. Cada uno de los conteos está junto al conteo de la red desestabilizada (red sin
subred BTBD3). Cada figura tiene un inserto donde se listan las funciones que
desaparecen en la red desestabilizada.
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
123
124 12. Anexos.
12.3. Enriquecimiento funcional de la red con los nodos que
poseen mayor coeficiente topológico
Figura S2. Red PPi de los nodos más significativos de la red principal. A grafo de la red
con los 116 nodos más importantes en los criterios de análisis topológico. B nube de
palabras con los procesos más enriquecidos en la subred con los nodos más importantes.
C nube de palabras que resume los componentes celulares más enriquecidos en la red. D
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
125
enriquecimiento de las funciones moleculares de la red. E rutas de señalización KEGG
presentes en la red. F enriquecimiento de dominios proteicos Pfam. Entre más grande sea
la palabra mayor cantidad de proteínas dedicadas a la función.
Genes
RPS27A, UBA52, CSNK1D, IMP4, DCAF13, RBX1, RHOBTB2, UBC, UBB, CUL3, CUL1, BTBD6, CSNK1E, SKP1, BTRC, TP53, SKP2, RNF7, BTBD1, FBXW5, ANAPC10, FBXW7, CDC34, FBXW11, CDC20, UBE2D1, CDC23, CDC16, TRIP12, FBXW2, UBE2R2, UBE2C, ANAPC11, CCNF, CDC27, CUL2, ANAPC1, FZR1, ANAPC5, UBE2N, ANAPC4, ANAPC2, UBE2E1, UBE2D2, ANAPC7, FBXO17, CUL5, UBA1, FBXO4, UBE2S, FBXL19, FBXO9, FBXL3, FBXL15, FBXO32, VHL, UBE2K, FBXO44, FBXO2, FBXO31, UBA3, HACE1, FBXL5, FBXO6, FBXO27, FBXL7, UBA7, UBA6, UBE2D3, UBE2A, UBE2M, UBE2B, TCEB1, TRAF7, CUL7, VPRBP, FBXW8, UBE2E3, UBE2L3, UBE2F, TCEB2, DET1, KEAP1, UBE2G1, FBXL4, FBXL20, SOCS3, UBE2U, UBE2E2, UBE2D4, NEDD4, UBE2L6, FBXO41, FBXO22, FBXL13, FBXO7, PARK2, FBXL18, FBXW9, FBXL12, ASB1, FBXW12, TRIM63, FBXW4, UBE2G2, FBXL14, ASB2, SPSB4, SPSB2, SPSB1, FBXO30, FBXO21, FBXO10, FBXL8, FBXL16, ASB6
Tabla S2. Genes pertenecientes a la subred de los genes con mayor coeficiente
topológico
126 12. Anexos.
figura S3. Representación del patrón de metilación de la región de interés (sombreado
azul claro) en diferentes condiciones y tejidos obtenidos en diferentes estudios de
metiloma (lista de la izquierda). Las líneas azules oscuras representan regiones
hipometiladas, se puede observar que en leucemia y otros tipos de cáncer el área
hipometilada disminuye. La línea verde en la parte superior representa la isla CpG y la
línea azul inmediatamente superior es el primer exón de BTBD3 (“Human hg19
chr20:11,870,949-11,871,848 UCSC Genome Browser v362,” n.d.).
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
127
figura S4. Representación esquemática de los controles de calidad del software ESME.
Tomado de (Lewin et al., 2004)
128 12. Anexos.
12.4. Protocolo general de electroforesis.
MATERIALES Y REACTIVOS
Materiales
- Cámara de electroforesis
- Fuente de poder
- Beakers de diferentes volúmenes
- Balanza
- Plancha de agitación
- Plancha de calentamiento
- Tubos Eppendorf
Reactivos
-Agarosa
-Buffer de corrido TBE (Mezcla lista para preparar, diluyendo en agua destilada en una
proporción de 17g por litro)
-Marcador de tamaño (Ladder)
-Hydragreen
Protocolo
A. Preparación del Buffer de Corrido TBE
Mezclar el TBE en polvo (listo para preparar) con agua destilada en una proporción de
17g por litro.
Se debe preparar suficiente Buffer para preparar el gel y para el corrido,
aproximadamente 500 ml
B. Preparación del buffer de carga (Blue Loading BufferPack de Biolabs)
De acuerdo a las indicaciones de la ficha técnica en un tubo Eppendorf se debe tomar 1
volumen del agente reductor (Reducing Agent) que está a una concentración de 30x y
mezclar con nueve volúmenes del Blue loading buffer.
Procedimiento
1. Preparación del gel de agarosa (Preparación de un gel al 1.5%)
1.1. Pesar 1.5 g de agarosa
1.2. Añadir la agarosa a 100 ml de buffer TBE en un matraz.
1.3. Calentar la mezcla en un horno de microondas o plancha de calentamiento hasta que
se observe que toda la agarosa se ha fundido (50 seg en microondas)
1.4. Dejar enfriar la solución de agarosa hasta una temperatura de unos 50 °C y añadir 2
µl de HydraGreen
1.5. Mientras la solución de agarosa se enfría, preparar el molde en el que se va a hacer
el gel sellando los bordes con cinta de enmascarar, o colocándolo en el dispositivo
previsto para ello, y colocando el peine en la posición deseada.
1.6. Verter cuidadosamente la solución de agarosa sobre el molde nivelado, evitando la
formación de burbujas. Dejar que solidifique durante al menos 30 min.
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
129
Nota: Si el objetivo del gel es evaluar los productos de la PCR, entonces el gel debe estar
más concentrado (2%)
2. Preparación de las muestras
2.1. Mezclar las muestras de ADN (4 µl de muestra) con 2 µl del Buffer de carga.
Nota: En este caso el gel tiene como finalidad evaluar la calidad del ADN, si el gel se va
a realizar para evaluar los productos de la PCR, se debe incluir el marcador de tamaño (2
µl) que también debe estar mezclado con Buffer de carga. En este caso a las muestras de
ADN no se les agrega Buffer de carga, ya que la master mix para PCR ya la tiene.
3. Carga de las muestras y corrida del gel
3.1. Una vez que el gel ha solidificado retirar el sellado de los bordes y colocar el molde
con el gel en la cámara de electroforesis.
3.2. Añadir buffer TBE hasta que cubra el gel unos 3-5 mm.
3.3. Retirar cuidadosamente el peine para que queden libres los pocillos para las
muestras.
3.4. Cargar en los pocillos las muestras que se prepararon en el punto 2.1
Nota: De acuerdo a las recomendaciones de la ficha técnica para el Buffer de carga; se
recomienda calentar las muestras a 95°C durante 3-5 min y luego centrifugarlas durante
15 -20 segundos antes de cargarlas.
3.5. Conectar los cables a la fuente de poder y aplicar un voltaje de 80 V durante 30- 40
minutos.
Nota: Siempre se deben ubicar las muestras desde el ánodo (conexión negra) y
verificar la formación de burbujas para garantizar que si está funcionando correctamente
la cámara y los conectores
12.5. Protocolo de conversión con bisulfito.
MATERIALES Y REACTIVOS
Materiales y equipos
- Micropipetas de diferentes volúmenes
- Tubos Eppendorf de 1.5 ml
- Columnas (Zymo-Spin IC Column)
- Puntas para micropipetas
- Gradilla
- Microcentrífuga
- Baño seco
- Termociclador
- Vortex
Reactivos
130 12. Anexos.
- Reactivo de conversion CT (CT conversion reagent)
- Buffer de dilución (M- Dilution Buffer)
- Buffer de disolución (M-Dissolving Buffer)
- Buffer de lavado (M-Wash Buffer)
- Buffer de unión (M-Binding Buffer)
- Buffer de desulfonación (M- Desulphonation Buffer)
- Buffer de elución (M-Elution Buffer)
- Agua destilada
- Etanol
Protocolo
A. Preparación del Reactivo de Conversión CT
Agregar 900 µl de agua, 300 µl de Buffer de dilución (M- Dilution Buffer) y 50 µl de Buffer
de disolución (M-Dissolving Buffer) a un tubo de Reactivo de Conversión CT (CT
conversión reagent).Mezclar a temperatura ambiente con agitador vortex por 10 minutos.
Nota: Es normal ver restos del reactivo de conversión no disueltos. Cada tubo del reactivo
de conversión (CT conversión reagent) está diseñado para la conversión de 10 muestras
de ADN.
Almacenamiento: El reactivo de conversión CT (CT conversión reagent) es sensible a la
luz. Para mejores resultados, el reactivo de conversión CT (CT conversión reagent) debe
ser usado inmediatamente después de la preparación. Si el reactivo no va a ser usado
inmediatamente, puede almacenarse hasta una semana a 4°C o hasta un mes a -20 °C.
Si se ha guardado el reactivo en solución, debe calentarse hasta 37°C y agitar con vortex
antes de usar.
B. Preparación del Buffer de Lavado:
Añadir 24 ml de Etanol al 100% a 24 ml de Buffer de lavado antes de usar.
Procedimiento:
1. Añadir 130 µl del reactivo de conversión CT (CT conversión reagent) a 20 µl de una
muestra de ADN en un tubo de PCR. Si el volumen de la muestra de ADN es menos
de 20 µl, completar la diferencia con agua. Mezclar la muestra, dando suaves golpes
al tubo o pipeteando varias veces, luego centrifugar para que el líquido vaya al fondo.
2. Colocar el tubo con la muestra en un termociclador y realizar los siguientes pasos:
- 98°C por 10 minutos
- 64°C por 2.5 horas
- 4°C almacenar hasta por 20 horas
Nota: El almacenamiento a 4°C es un paso opcional.
3. Añadir 600 µl de Buffer de unión (M-Binding Buffer) a una columna (Zymo-Spin IC
Column) y ubicar la columna en un tubo colector.
4. Cargar la muestra del paso dos al interior de la columna que contiene el Buffer de
unión (M-Binding Buffer). Cerrar la tapa y mezclar invirtiendo la columna varias veces.
5. Centrifugar a 10000 g por 30 segundos .Descartar el fluido del tubo colector.
6. Añadir 100 µl de Buffer de lavado (M-Wash Buffer) a la columna. Centrifugar a la
mayor velocidad por 30 segundos.
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
131
7. Añadir 200 µl de Buffer de desulfonación (M- Desulphonation Buffer) a la columna y
dejar a temperatura ambiente entre 15 y 20 minutos. Después de la incubación,
centrifugar a la mayor velocidad por 30 segundos.
8. Añadir 200 µl de Buffer de lavado (M-Wash Buffer) a la columna. Centrifugar a la
mayor velocidad por 30 segundos.Añadir otros 200 µl de Buffer de lavado (M-Wash
Buffer) y centrifugar por 30 segundos adicionales.
9. Colocar la columna en un tubo Eppendorf de 1.5 ml. Añadir 10 µl de Buffer de elución
(M-Elution Buffer) directamente a la matriz de la columna.Centrifugar por 30 segundos
a la máxima velocidad para la elución del ADN.
Nota: El ADN está listo para el análisis inmediato o puede ser almacenado en o por
debajo de -20°C para usar después. Para almacenamiento a largo plazo, guardar a -70°C.
Se recomienda utilizar 1-4 µl del ADN eluido por cada PCR, sin embargo, pueden ser
utilizados hasta 10 µl dependiendo de los requerimientos del experimento, pero pequeños
volúmenes de elución tendrán un ADN más concentrado.
Alternativamente, agua o TE (pH 6.0) pueden ser utilizados para elución si es requerido
en los experimentos.
12.6. Protocolo de purificación de ADN y
preparación de reacción de secuencia.
Nota: Todos los reactivos utilizados para la purificación deben estar fríos. Se recomienda
ponerlo en hielo. Las cantidades de NH4Ac y de etanol al 100% están hechos para 34 µl
de producto de PCR, es decir, dos tubos de PCR.
1. En un tubo de eppendorf de 1.5 ml adicione 3.4 µl de acetato de amonio
(NH4Ac) a 34 µl de producto de PCR.
2. Adicionar 68 µl de etanol al 100%
3. Centrifugar por 30 minutos a 15000 rpm en una centrífuga refrigerada a
4°C.
4. Descartar el sobrenadante cuidadosamente.
5. Adicionar 200 µl de etanol frío al 75%
6. Centrifugar por 20 minutos a 15000 rpm en una centrífuga refrigerada a
4°C.
7. Descartar el sobrenadante cuidadosamente.
8. Repetir los pasos del 5 al 7.
9. LLeve los tubos a SpeedVac por 5 minutos o dejar los tubos abiertos hasta
que el etanol se evapore por completo.
10. Resuspender en 15 µl de agua y guardar las muestras a 4°C.
11. Medir la concentración de ADN y diluir en agua si es necesario.
Para enviar las muestras al servicio de secuenciamiento del instituto de Genética
(SSigMol)
132 12. Anexos.
1. Poner 4.5 µl de producto de PCR purificado en un tubo de eppendorf de 1.5
ml.
2. Añadir 0.5 µl de primer a una concentración de 10 µM.
A
Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una
muestra de pacientes colombianos
133
B
figura S5. A Electroferograma representativo del proceso de secuenciamiento. B Gel de
electroforesis, los pacientes se representan con A y los controles con B, C- se refiere al
control negativo, MP es el marcador de peso molecular 50 pb DNA ladder..
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