apostila de bioquímica finalizada

7/21/2019 Apostila de Bioquímica Finalizada

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BIOQUIMICA BÁSICAROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS

PROF. Dr. LUIZ FERNANDO ROMANHOLO FERREIRA

ARACAJU-SE



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SUMÁRIO

ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS

1. Normas Básicas de Segurança no Laboratório.............................................................................02

2. Vidrarias e Equipamentos do Laboratório....................................................................................03

3. Noções de Espectofotometria......................................................................................................07

4. Prática 01 Coleta de sangue, separação e armazenamento do plasma........................................10

5. Prática 02 Dosagem de Glicose...................................................................................................11

6. Prática 03 Dosagem de Uréia.......................................................................................................13

7. Prática 04 Dosagem de Amilase .................................................................................................15

8. Prática 05 Dosagem de Creatinina ..............................................................................................17

9. Prática 06 Dosagem de Proteínas Totais......................................................................................19

10. Prática 07 Dosagem de Ácido Úrico..........................................................................................21

11. Prática 08 Dosagem de Colestreol – HDL..................................................................................2312. Prática 09 Dosagem de Colesterol Total ....................................................................................25

13. Prática 10 Dosagem Triglicerídeos ............................................................................................27

Atual ização em Junho/2014



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Normas Básicas de Segurança no Laboratório de

Bioquímica

1. Permanência no laboratório

Coloque os seus objetos pessoais (mochilas, casacos, etc.) no armário atribuído aesse fim.

A entrada no laboratório só é permitida mediante uso de jaleco com manga comprida, estando este,

devidamente abotoado.

A permanência no laboratório só é permitida em uso de sapatos fechados (tênis),calça comprida, estando

PROIBIDO o uso de sandálias abertas ou sapatilhas.

Os cabelos deverão estar totalmente presos, de modo a evitar o contato com o material ou com os

reagentes. Use sempre óculos de segurança

Use luvas, sempre que for necessário. Remova-as antes de tocar em portas, maçanetas, livros, cadernos

e outros objetos.

Evite usar anéis no laboratório, porque sob eles podem alojar-se solventes ou reagentes irritantes.

Não se recomenda o uso de lentes de contato no laboratório. As lentes de contato são difíceis de

remover quando penetram nos olhos corpos estranhos. No caso de usar lentes de contato deve sempre

usar óculos de proteção. Mantenha a bancada de experimentos limpa e arrumada, bem como todas as passagens

permanentemente desobstruídas.

Não deve fumar, beber, comer ou guardar alimentos dentro do laboratório.

Lave sempre as mãos ao sair do laboratório.

2. Manuseio de Produtos Químicos

Todo e qualquer tipo de procedimento só deverá ser executado mediante orientação da professora. Nunca pipete líquidos com a boca. Nunca ingira, inale ou toque com as mãos nos produtos químicos. Evite a abertura simultânea de vários frascos do mesmo produto. Nunca use uma quantidade de reagente superior à necessária para a experiência. Certifique-se do estado de limpeza das pipetas ou espátulas que introduz nos frascos de reagentes para

evitar os perigos de contaminação. Nunca utilize um equipamento ou um aparelho sem ter compreendido o seu funcionamento.

Fonte: “Manual De Segurança Em Laboratórios DoDepar tamento De Química e Bioquímica , Comissão de Segurança do DQB, 2005.



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Instrumentação para Uso No Laboratório em

tividades de Bioquímica

Vidrarias e Equipamentos utilizados em laboratório

Balão de fundo chato: Utilizado como recipiente

para conter líquido ousoluções, ou fazer reaçõescom desprendimento degases.

Balão Volumétrico: Possibilita medidas devolumes exatos. Possuivolume definido e nele se

preparam as soluções.

Béquer: Serve para fazerreações entre soluções,dissolver substânciassólidas, efetuar reações de

precipitações e aquecerlíquido. Mede volumesaproximados.

Erlenmeyer: Utilizado emtitulações, aquecimento de

líquidos, para dissolversubstâncias e proceder areações entre soluções.

Proveta: Não pode seraquecida e serve paramedir e transferir volumesde líquidos que, emboranão exatos, são mais

precisos do que de um béquer ou Erlenmeyer.

Funil de Haste longa: Também não pode seraquecido. Usado na filtraçãoe para a retenção de

partículas sólidas.

Tubo de ensaio: Empregado para fazer reações em pequena escala, principalmente em testes dereação em geral. Pode seraquecido cuidadosamentedireto sob a chama do bicode Busen.

Bureta: Aparelho utilizado

em análises volumétricas para dispensar líquidos comgrande exatidão. Pode livrar-se de quantidades devolumes variáveis, devido àsmarcas de graduação eextensão.

Condensador: Utilizado nadestilação e tem comofinalidade condensarvapores gerados peloaquecimento de líquidos.

Pipeta Graduada: Utilizada para medirvolumes pequenos evariáveis. Possui precisão

superior à da proveta. Não pode ser aquecida.



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Pipeta Volumétrica: Utilizada para medir etransferir volume delíquidos, não podendo seraquecida, pois possui

grande precisão demedida. Mede um únicovolume, o que caracterizasua precisão.

Pipetador tipo pêra:Acoplado a uma pipeta

ajuda a “puxar” e a“expelir” pequenos

volumes de líquidos.

Pisseta: Frasco de plásticousado para lavagens demateriais ou recipientesatravés de jatos de água,álcool ou outros solventes.

Pipetas Automáticas: Utilizada para medirvolumes em microlitro.

Pipeta Pasteur: Indicada para transferência deamostras.

Vidro Relógio: Utilizado para pesar pequenasquantidades de substâncias,

para evaporar pequenas

quantidades de soluções,cristalizar substâncias ecobrir becker e outrosrecipientes.

Centrífuga:Acelera o processo

de decantaçãoatravés de alta

velocidade derotação.

Espectrofotômetro:Realiza leituras deabsorbâncias das

amostras.

Banho- Maria:Utilizado paraaquecer as amostras

na temperaturadesejada,favorecendo asreações.

Vórtex (Agitador):Agitar amostras emtubos de ensaio.



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Equipamentos utilizados no Laboratório

Centrífuga: Serve para acelerar o processo de decantação. São aparelhos que, por meio da força centrífuga,forçam uma substância insolúvel em uma mistura líquido-sólido a se precipitar rapidamente.

Banho-Maria: É um aquecedor de água termostatizado por meio de resistência elétrica que atinge a tempertura

máxima de 100ºC.

Estufa: É utilizada para secagem de material cujo controle de teperatura se dá por meio de termostado, emgeral alcança até 300ºC.

Mufla: Produz altas temperaturas. É utilizada, por exemplo, para calcinação com alcance de até 1.200ºC.

Agitador magnético: Equipamento destinado a homogeneizar soluções que podem ou não possuir aquecimento próprio.

Capela: É uma câmera de exaustão na qual são manuseadas substâncias ou realizados experimentos queoriginam gases tóxicos ou inflamáveis.

Chuveiro e lava – olhos: Equipamento de segurança utilizado no caso de acidentes no laboratório.

Esses são os principais materiais e equipamentos que serão utilizados nas atividades práticas. Uma vezfamiliarizado com o ambiente do laboratório e com os principais materiais e equipamentos, o aluno aprenderá atécnica de pipetagem que é utilizada na maior parte das atividades práticas.

Atividade Prática: Instrumentação para uso do laboratório

Objetivo:Aprender a transferir pequenos volumes com precisão: Técnica de Pipetagem.

Materiais:Béquer com água destiladaPonteiras para pipetas automáticasRecipiente para descarte de ponteirasPipetas graduadas de 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 e 10,0 ml.Pipetas volumétricasPipetas automáticas

Papel absorventePipetador ou pêra de sucçãoTubos de ensaioEstante para tubos de ensaio

*ReagenteSolução de azul metileno a 2%

MétodoÉ importante, antes do início do trabalho, verificar se as pipetas estão limpas e livres de qualquer avaria. Pipetascom duplo risco são de sopro e as que possuem somente a tarja e um risco não devem ser sopradas. Para pipetas

de sopro manipule o bulbo do pipetador para forçar o ar através da pipeta, a fim de remover a última porção delíquido da ponta.



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Pipetagem com pipetas graduadas e volumétricas Colocar água destilada em um béquerAcoplar o pipetador ou a pêra de sucção na pipetaIntroduzir a pipeta na água destiladaAplicar sucção e encher a pipeta acima da marca de calibraçãoRemover a pipeta da água destiladaLimpar com papel ou gaze. Segurar a pipeta a posição vertical e esvaziar vagarosamente até que o

menisco inferior apenas toque a marca e calibração.Trocar a ponta em um receptáculo limpo e seco para eliminar qualquer gota pendente.Levar a pipeta até o tubo de ensaio e na posição vertical esvaziar livremente.

Pipetagem com pipetas automáticasAjustar o volume a ser pipetadoColocar a ponteira indicada para a pipetaPressionar o êmbolo da pipeta até a primeira trava e aspirar a amostra da ponteira;Pressionar o botão, ele funcionará com um êmbolo.Pressione até o primeiro estágio para sugar o líquido e até o segundo para desprezá-lo.Levar a pipeta até o tubo de ensaio e apertar o êmbolo até o final para descartar o líquido.Dispensar a ponteira utilizada em um recipiente;Proceder a limpeza e organização da bancada;



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Noções de Espectrofotometria

ABSORCIOMETRIAConsiste num método analítico, baseadona propriedade que têm muitas espécies iônicas ou moleculares em

solução, de absorver radiações ultravioletas (UV) e visível.

FAIXAS ESPECTRAIS:Ultravioleta (UV) < 400 nm ( λ) Violeta 400 – 450 nmAzul 450 – 500 nmVerde 500 – 570 nmAmarelo 570 – 590 nmAlaranjado 590 – 620 nmVermelho 620 – 760 nmInfravermelho > 760 nm

CONDIÇÕES PARA UMA DETERMINAÇÃO ABSORCIOMÉTRICA

1. A amostra deve possuir propriedade absorventes;

2. Ou se convertida por reações apropriadas.

TIPOS DE ABSORCIÔMETROS

Fotômetros (Colorímetros) – região do visível

Espectrofotômetros – monocromadores de prisma - região do visível ou ultravioleta (UV).

COMPONENTES BÁSICOS1. Fonte de energia radiante contínua - Lâmpada de tungstênio.2. Dispositivo para isolar faixas espectrais.3. Cuba para amostra.4. Detector (transdutor), para converter a energia radiante em dispositivo para medir a magnitude do sinal

elétrico.

FIG. 1 Componentes dos instrumentos usados na medida de Transmitância

FONTE SELETOR DA

RADIA ÃOCUBA DETECTOR INDICADOR



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Lente Colinada Lente de Foco Plano Focal

Fenda de Entrada Prisma Fenda de Saída

FIG 2. Monocromador Prismático

Quando se faz passar um feixe de radiação monocromática, através de uma solução contendo uma espécieabsorvente para o comprimento de onda (λ ), da radiação, uma parte da energia é absorvida, a parte restante é

transmitida pelo meio.

TRANSMITÂNCIA (T):

T = P/P0 ; P = Potência radiante transmitida

P0 = Potência radiante incidente

Potência Radiante: É a quantidade de energia transportada por segundo, através da unidade de seçãotransversal.

% T = P/P0 X 100 (Representa a fração da energia radiante incidente, que é transmitida pela solução).

1,0 1,0A

T

0,5 0,5

0,0 0,0Concentração

FIG. 3 Absorbância e Transmitância de uma solução para comprimento de onda dado em função da concentração.

DENSIDADE ÓPTICA (D.O.) = ABSORBÂNCIA (A)

b

b = 1 cm

CUBETA

D.O. = ε b. c.



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LEI DE BEER

Relaciona a Transmitância e a Concentração da espécie absorvente.

Log P0/P == - log T == A == ε.b.c; onde:

A = Absorbânciaε = Absortividade molar

b = Espessura da cubeta

c = Concentração da substância absorvente;

Parâmetros Importantes:A (Absorbância) - Energia absorvida por uma dada amostra.T (Transmitância) – Energia transmitida para o meio.

C (Concentração) – Quantidade da substância a ser analisada (mg/dl).

Ex.: Verde escuro Verde claro Água destilada

Energia E E

1 2 3

C > C < C = 0A > A < A = 0T < T > T = 100%

Observações:A e C são grandezas diretamente proporcionais ( A α C )

A e T são inversamente proporcionais.

A = 1 ; C = 1 .T T (Lei de Beer )



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Prática

Coleta de sangue, separação e armazenamento do plasma

SANGUE

Líquido vermelho, que corresponde a 7 a 8% do peso do corpo. Apresenta valor de pH, em torno de 7,4 (7,35 – 7,45). Densidade: 1,055 – 1,065. Viscosidade: 3,5 – 5,5. Contém cerca de 20% de matéria sólida. Constituído por elementos figurados: hemácias, leucócitos e plaquetas. Suspenso num líquido

amarelo está o plasma sanguíneo.

FUNÇÕES DO SANGUE* Transporte rápido e eficiente de substâncias de um local do organismo para outro;

* Impedir hemorragia devido ação das plaquetas;* Manutenção do equilíbrio ácido-base (pH) “Tampão Biológico”

OBSERVAÇÕESQuando o sangue é removido do leito vascular, normalmente se torna um sólido (gel), devido a

coagulação. Logo após essa formação o mesmo (coágulo) se desprende, ocorrendo o aparecimento de umlíquido normalmente límpido (soro sanguíneo).

O soro sanguíneo é, portanto, o líquido que se separa da parte sólida, resultante da coagulação do plasma ou do sangue.

PLASMA5% do peso corporal;É formado de 90% de água e 10% de substâncias sólidas;Densidade: 1,025 – 1,035;Viscosidade: 1,5 – 2,0;

pH entre 7,35 – 7,45

TÉCNICA DE SEPARAÇÃO

Sobrenadante (Plasma sanguíneo)

Coleta Centrifugação por 5 minutos

a 3500 rpmElementos Figurados: Hemácias,

Leucócitos e plaquetas.# NÃO ESQUECER

EDTA: Etileno Diamino Tetracético (Anticoagulante);Se houver a coleta de sangue sem o EDTA o sangue formaria coágulo, e logo após, se centrifugado

haveria a separação do soro dos elementos figurados do sangue.

1

Sangue+

EDTA

Sangue



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Prática

Dosagem de glicose

FINALIDADESistema enzimático para determinação da glicose no sangue, líquor e líquidos ascítico, pleural e

sinovial por método cinético ou de ponto final.

PRINCÍPIOAo adicionar-se glicose em uma solução tampão de fosfato em pH 7,4 contendo Glicose Oxidase,

Peroxidase, 4-Aminoantipirina (4-AAP) e p-Hidroxibenzoato, processam-se as seguintes reações:

Glicose + O2 + GOD Acido Glucônico + H2O2H2O2 + 4AAP POD 4-Antipirilquinomina + 4H2O

O produto formado pela oxidação do 4- AAP (4-Antipirilquinomina) é de coloração avermelhada esua intensidade diretamente proporcional à concentração de glicose na solução. A cor é medida emespectrofotômetro à 500 nm.

METODOLOGIAGlicose Oxidase

Cor: Rosa

REAGENTESReagente 1(Reagente de cor): Contendo solução tampão/enzimasSolução Padrão de glicose.

AMOSTRAPlasma (em jejum).

EQUIPAMENTOSAgitador (Vortex);Banho-Maria mantido à 37ºC.Espectrofotômetro (calibrado em 500 nm).

MATERIAL3 tubos de ensaioGalcria para tubosPipeta automática de 20 µL e 1000 µL

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PROCEDIMENTOIdentificar três tubos de ensaio com B (Branco), T (Teste) e P (Padrão)

Branco Padrão Teste

Reagente 1 (Rgt) 2000µL 2000 µL 2000 µLPadrão -- 20 µL --Amostra -- -- 20 µL

Homogeneizar e deixar por 5 min em Banho-Maria à 37ºC. Retirar do banho e fazer a leitura daabsorbância a 500 nm.

CÁLCULO

Glicose mg/dL: Absorbância do Teste X 100

Absorbância do Padrão

VALORES DE REFERÊNCIA:70 A 99 mg/dL

INTERPRETAÇÃOCondições para o desenvolvimento de HIPERGLICEMIA:

Diabetes;

Asfixia;

Hipertireoidismo; Traumatismos Cerebrais;

Tratamentos com Adrenocorticóides e ACTH;

Pancreatite;

HIPOGLICEMIA Após exagerado esforço físico;

Hipotireoidismo;

Distúrbios da absorção intestinal;

Trato desordenado com insulina ou hipoglicemiantes orais; Anorexia nervosa;



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Prática

Dosagem de UREIA

FINALIDADESUtilizado para a determinação quantitativa da uréia presente no soro e plasma.

PRINCÍPIOEm meio alcalino na presença de salicilato, nitroprussinato de sódio e hipoclorito, os íons amônios

reagem dando origem a um composto cromógeno de cor azul esverdeado. A intensidade da cor formadaé diretamente proporcional à concentração de uréia na amostra analisada.

METODOLOGIAUrease Modificada.Cor: VerdeLaboratório: Laborclin

REAGENTESReagente (RGT) 1: Mistura de salicilato de sódio, nitroprussinato de sódio.

Reagente (RGT) 2: Hipoclorito de sódio e hidróxido de sódio.Padrão (STD): Solução de uréia 80mg/dL.

AMOSTRASoro ou plasma.

EQUIPAMENTOSVórtex;Banho-Maria à 37ºC

Espectrofotômetro (Calibrado em 600 nm)

MATERIAL3 Tubos de ensaio;2 pipetas graduadasPipetas automáticas de 1000µL e de 20µLGaleria para tubos

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PROCEDIMENTOIdentificar três tubos de ensaio B (Branco), T (Teste) e P (Padrão).


Reagente 1 (Rgt) 1000µL 1000µL 1000µLPadrão -- 10µL --Amostra -- -- 10µL

Homogeneizar e incubar por 5min. Em banho-maria a 37ºC.

Branco Padrão TesteReagente 2 (Rgt) 1000µL 1000µL 1000µL

Homogeneizar e incubar a 37ºC, por 5 minutos. Acertar o zero do aparelho com o branco ,em 600 nm e ler as absorbâncias do Teste e Padrão.

CÁLCULO:

Uréia mg/dL= Absorbância doTeste x 60Absorbância do Padrão

VALORES DE REFERÊNCIA10 a 52mg

INTERPRETAÇÃOCostuma-se classificar a elevação da azotemia (excesso de uréia no sangue) em pré-renal, renal e

pós-renal.

AZOTEMIA PRE-RENAL:- Traumatismo craniano- Distúrbios renais- Tratamento com Sulfonamida.- Transfusão de sangue incompatível.

AZOTEMIA RENAL:- Distúrbios renais

AZOTEMIA PÓS-RENAL:- Obstrução uretral por cálculo- Tumores compressivos da bexiga.- Obstrução prostática

TAXA DE UREIA DIMINUÍDA- Insuficiência hepática aguda.



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Prática

Dosagem de Amilase

FINALIDADE

Reagente para a determinação da atividade enzimática da amilase em amostras de soro, plasma,urina, suco pancreático e líquido duodenal.

PRINCÍPIOO soro é indicado com solução de amido tamponado em pH=7,0.O amido solúvel em contato como iodo forma um componente azul. Á medida que a molécula de

amido é hidrolisada pela amilase sérica, a cor produzida muda progressivamente de azul até incolor. Dentrode certos limites, a alteração produzida na cor pelo amido degredado com o iodo é proporcional àconcentração de amilase no soro.

METODOLOGIACaraway modificado

REAGENTESSubstrato (SUB): Solução estério de amido tamponado pH=7,0.Tampão (TAM): Ácido benzóico 0,20%; Fosfato monoácido de sódio 90g/L.Reagente de cor (RGT): Solução de iodo.

AMOSTRA

Soro, plasma, líquido duodenal, ascítico, pleural ou urina. A enzima é estável por 48h atemperatura de 15 – 25 ºC e por vários meses à temperatura de 2 – 8ºC.

EQUIPAMENTOS Banho-maria a 37ºC.Espectrofotômetro (calibrado em 660nm)

MATERIAL2 tubos de ensaio

Galeria para tubosPipeta graduada de 5mL.Pipeta automática de 250µLPipeta automática de 500µLPipeta automática de 10µL

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PROCEDIMENTO

Reagentes Controle Amostra (T)SUB 250µL 250µLTAM 250µL 250µL

Homogeneizar e colocar em Banho-Maria 37ºC por 2minutos

Plasma -- 10µLHomogeneizar e colocar em Banho-Maria por 37ºC por 7 minutos e 30 segundos.

RGT (Iodo) 500µL 500µLÁgua Destilada 4 mL 4 mL

Homogeneizar e efetuar as leituras fotométricas (660nm), acertando ozero com água destilada.

CÁLCULO:Amilase (U%) = (Ac – At) x 800

AcAc: Absorbância do controleAt: Absorbância do teste

VALOR DE REFERÊNCIA60 A 160 U%

INTERPRETAÇÃO

A amilasemia (presença e quantidade de amilase no plasma sanguíneo) se acha elevadaespecialmente na pancreatite aguda, podendo atingir 500 U%.

Outros distúrbios associados à amilasemia são:- úlcera péptica- parotidite- litíase salivar- infecções (febre tifóide, malária, pneumonia, sarampo, meningite meningocócica, tifo)- gravidez ectópica rota- após administração de opiáceos

- Obstrução Intestinal.

A hipoamilasemia (Diminuição excessiva da produção da amilase) ocorre em:- Hepatopatias graves;- Grandes queimados;- Diabetes;- Insuficiência Cardíaca Congestiva (ICC);- Pneumonia (as vezes)



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Creatina

Quinase

Prática

Dosagem de creatinina

FINALIDADEReagentes para a determinação da creatinina presente no soro, plasma e urina humana.

PRINCÍPIOA creatinina, em meio alcalino, reage com ácido pírico formando um complemento de cor amarelo-

alaranjada (reagente Jaffe).As proteínas são precipitadas com reagente túngstico. O sobrenadante é decantado para outro tubo

e adicionado reagentes pírico. A adição de solução alcalina ao próprio tubo gera picrato alcalino quereage com a creatinina.

Creatinina + ATP -------------- > Fosfocreatina (Rico em energia) --- > Músculo em Repouso

Creatinina Músculo em Contração

Urina

METODOLOGIAJaffe modificado

Laboratório: In Vitro

REAGENTESÁcido Acético (AC): acidificanteÁcido pícrico (AP): sol 0,054MSolução alcalina (RGT): sol Na OH 6MSolução padrão (PAD): creatinina 50mg/100mL

AMOSTRA

Soro, plasma, urina ou líquido amniótico.

EQUIPAMENTOSVórtexEspectrofotômetro calibrado a 510 nm. Pipetas

MATERIALTubos de ensaioGaleria para tubos

Pipeta automática de 1000µL, 500µL , 250µL , 100µL

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PROCEDIMENTOIdentificar os tubos de ensaio com B (branco) , P (padrão) e T (teste)

Branco Padrão TesteReagente (RGT) 2000µL 2000µL 2000µL

Amostra -- -- 250µLÁgua Destilada 250µL -- --Padrão -- 250µL --AP (ácido pícrico) 500µL 500µL 500µL

Agita de coloca em banho-maria por 5min; Fazer a leitura da absorbância a 510 nm;

AC (ácido acético) 100µL -- 100µL

Agita e aguarda 5 minutos, zera o espectrofotômetro com água destiladae faz a leitura de T2.Obs.: NÃO COLOCAR EM BANHO-MARIA

CALCULOCreatinina mg/dL: (AT1 – AT2) x 3

AP VALORES DE REFERÊNCIA

Soro ou plasma: 0,4 a 1,4 mg/dL

INTERPRETAÇÃOA creatinina é o elemento nitrogenado do sangue menos variável. Ele é o anidrido da creatinina

que se forma pela perda do ácido fosfórico da fosfocreatina muscular. É eliminada pelos rins emquantidade singularmente constante, através da filtração glomerular e excreção tubular ativa.

Valores acima de 5mg/dL são indícios de: Insuficiência renal, quando a taxa de uréia se encontra elevada;

Nefrite incipiente;

Glomerulonefrite crônica, com uremia; Obstrução urinária, por afecções da próstata, bexiga ou ureter;

Oligúria reflexiva provocada pela nefrolitíase



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Prática

Dosagem de PROTEÍNAS TOTAIS

FINALIDADEReagente para determinação de proteínas em soro e outros líquidos biológicos.

PRINCÍPIOAs proteínas reagem com o reativo de biureto e formam um complexo de coloração azul-violácea,

cuja intensidade é proporcional à concentração de proteínas presentes na amostra.

METODOLOGIABiureto modificadoLaboratório: In Vitro

Cor: Azul

REAGENTESRGT – Reagente de cor concentrado: Tartarato de sódio e potássio 45g/L; Hidroxido de sódioPAD – Padrão: Albumina bivina 4,0 g/dL; Azida sódica 0,5g/L.

AMOSTRASoro, plasma, líquido pleural ou sinovial

MATERIAL3 Tubos de ensaio1 estante para tubosPipetas automáticas de 1000µL e 40µL

EQUIPAMENTOSEspectrofotômetro calibrado em 550nm.

PROCEDIMENTO

Identificar os tubos de ensaio com B (branco) , P (padrão) e T (teste)

Branco Padrão TesteReagente (RGT) 2000µL 2000µL 2000µLAmostra -- -- 40µLPadrão -- 40µL --

Homogeneizar e aguardar 10 min. Acertar o zero com o Branco. Efetuar aleitura fotométrica em 550 nm.

Obs: NÃO VAI PARA BANHO-MARIA

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CÁLCULO:Proteínas Totais g/100mL = Absorbância do Teste x 4


VALORES DE REFERÊNCIA

6,0 a 8,0g/100mL

INTERPRETAÇÃOAs proteínas contendo aminoácidos na estrutura participa da formação de Acetilcoa, indispensável

para energia.Os índices de normalidade variam com o método de dosagem empregado. Os valores podem

aumentar de 1 g se o paciente permanece de pé por meia hora ou mais, antes da colheita do sangue, emvirtude da hemoconcentração pela transdução capilar aumentada (aumenta a pressão venosa).

Na restrição alimentar, embora tenha sido demonstrado que a pequena ou nula ingestão dealimentos protéicos, por períodos limitados, não afeta o nível normal de proteinemia, a privação de

peptídeos por longo espaço de tempo (guerra, pobreza, ignorância) conduz a franca hipoproteinemia esuas conseqüências, entre elas o chamado “edema de nutrição” (hipoalbuminemia).



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Prática

Dosagem de ÁCIDO ÚRICO

FINALIDADETeste enzimático e colorimétrico para determinação do Ácido Úrico em fluidos utilizandoreagente líquido pronto para uso.

PRINCIPIOO acido úrico é o produto final do metabolismo das purinas no homem. A presente metodologia

destina-se ao doseamento do ácido úrico em fluidos biológicos (soro ou rina) através de uma técnicaenzimática e colorimétrica.

IMPORTANCIA CLÍNICAA principal utilidade clinica da determinação da uricemia está no diagnóstico e controle da gota,

doença que é caracterizada pela hiperuricemia. Putras doenças como anemia perniciosa, insuficiênciarenal, insuficiência cardíaca, mieloma múltiplo e policitemia podem apresentar uma hiperuricemia.

REAGENTESRGT - Reagente de corPAD - Padrão de Ácido úrico com 6mg/dL em solução tamponada

AMOSTRA

Soro, plasma e urina.

MATERIAL E EQUIPAMENTOSEspectrofotômetro calibrado em 520 nm Banho-mariaPipetas automáticas de 1000µL e 40µLLaboratório: BioquidCor: Rosa


Branco Padrão TesteReagente (RGT) 2000µL 2000µL 2000µLAmostra -- -- 40µLPadrão -- 40µL --

Agitar e colocar em banho-maria 37ºC por 5 min. Ler as absorbâncias em 520 nm.

CÁLCULO:Ácido Úrico (mg/dL/ = Absorbância do Teste X 6


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VALORES DE REFERÊNCIAS3,6 – 7,0 mg/dL

INTERPRETAÇÃOA gota é uma patologia caracterizada pela inflamação das articulações devido a fixação de cristais

do ácido úrico nas articulações. Para ser diagnosticado o valor do ácido úrico deverá estar acima de

10mg/dL.A técnica de dosagem do ácido úrico é utilizado como indicador da função renal;O ácido tem origem nas bases nitrogenadas;É encontrado nas vísceras, carnes e proteínas.Geralmente cria feridas entre os dedos dos pés.



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Prática

Dosagem de colesterol HDL

FINALIDADESistema para determinação do Colesterol HDL através da precipitação seletiva das lipoproteínas de

baixa e muito baixa densidade (LDL e VLDL), por reação de ponto final.

PRINCIPIOLipoproteínas e baixa densidade (LDL) e de muito baixa densidade (VLDL) são precipitadas

seletivamente por polietilenoglicol tamponado. No sobrenadante, resta apenas a fração de alta densidade(HDL). O teor de colesterol da fração HDL é determinada pelo sistema enzimático – colesterol 250.

As técnicas para dosagens do colesterol HDL baseiam-se na precipitação seletiva das frações LDLe VLDL.

METODOLOGIAPEG: 6.000 modificado

REAGENTESPrecipitante;PAD – Padrão

AMOSTRA

Soro, plasma heparinizado ou EDTA

EQUIPAMENTOSCentrifuga de bancadaAgitador para tubos tipo “Vortex” Banho-Maria a 37ºCEspectrofotômetro (calibrado em 500nm)

MATERIAL

Tubo de ensaioPipetas automáticas de 200µL e 1000µL

PROCEDIMENTO1º ESTAPA: EXTRAÇÃO DO COLESTEROL HDL (Precipitado)Adicionar 500µL de soro e 500µL de reagente precipitante.Homogeneizar e repousar por 10 min à temperatura ambiente.Centrifugar durante 15 min a 3500 rpm.Pipetar o sobrenadante límpido imediatamente após a centrifugação, tomando cuidado para não

suspender o precipitado, a fim de evitar resultados falsamente elevados.

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2º ETAPA: COLORIMETRIAUtilizar com o reagente 1- Colesterol LiquiformIdentificar os tubos de ensaio com B (branco) , P (padrão) e T (teste)


Sobrenadante-- -- 200µL

Padrão -- 200µL --RGT 1 2000µL 2000µL 2000µL

Misturar e incubar em banho-maria 37ºC por 10min. Ler as absorbâncias do teste e padrão em 500 nm acertando o zero com o branco.

CÁLCULO:HDL (mg/dL) = Absorbância do Teste x 40


VALOR DE REFERÊNCIA< 40 (Baixo)≥ 60 (Elevado – desejável)

INTERPRETAÇÃOHDL Baixo: Risco de incidência de coronariopatias. A lipoproteína HDL mobiliza o colesterol

depositado ao nível da íntima das artérias, transportando-o para o fígado, onde será metabolizado.



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Colesterol esterase

Colesterol oxidase

Prática

Dosagem de colesterol livre e esterificado (total)

FINALIDADE

Reagentes para a determinação quantitativa do colesterol presente no soro e plasma humano.

PRINCIPIOO colesterol no soro é quantificado através das seguintes reações enzimáticas. A cor resultante é

medida fotometricamente.

1. Ésteres de colesterol ------------------- > colesterol livre + ácidos graxos

2. Colesterol livre + O2 ---------------------- > colesterona + H2O2

3.

2H2O2 + 4 – AAP + p-Hidroxibenzoato --------------------- > 4 – Antipirilquinomina + 4 H20

METODOLOGIAEnzimáticaCor: Rosa

MATERIALTubos de ensaioPipeta automática de 1000µL e 20µL

EQUIPAMENTOSBanho-Maria a 37 ºCEspectrofotômetro calibrado em 500 nm

REAGENTESRGT – Reagente enzimáticoSTD – Padrão

AMOSTRASoro, plasma heparinizado ou EDTA.


Branco Padrão TesteRGT 2000µL 2000µL 2000µLAmostra -- -- 20µLPadrão -- 20µL --

Homogeneizar e incubar por 5 min em banho-maria a 37ºC.Medir as absorbâncias de T e P em 500 nm, acertando o zero com o branco.

CÁLCULO:

Colesterol mg/dL = Absorbância do Teste x 200Absorbância do Padrão

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Peroxidase



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VALORES DE REFERÊNCIA< 200 mg/dL Ótimo200 – 239 mg/dL Limítrofe≥ 240 Alto

INTERPRETAÇÃOO risco cardiovascular é uma função contínua da concentração de colesterol, mais precisamente do

colesterol HDL e LDL, pois ele é um dos fatores que contribuem para a formação de ateromas (placasde gorduras).

HIPERCOLESTEROLEMIA: Diabetes MellitusSíndrome NefróticaIcteríciaAteroscleroseAcidente Vascular (quando acompanhado de hiperlipidemia)Hipertensos e fumantes

HIPOCOLESTEROLEMIA: Hipertireoidismo

Crise tireóideaAnemia perniciosa e hemolíticaDoenças infecciosas agudas (pneumonia, febre tifóide)Doença de AddisonTuberculose pulmonar graveObstrução Intestinal e prostática



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Glicerol-fosfato-oxidase

peroxidase

Prática

Dosagem de TRIGLICERÍDEOS

FINALIDADE

Método enzimático para a determinação de triglicérides no soro e plasma.

PRINCÍPIOOs triglicérides são determinados após hidrolise enzimática com lípases. O indicador é a

quinoneimina formada a partir do peróxido de hidrogênio, 4-aminoantipirina e a 4-clorofenol sobinfluencia catalítica da peroxidase.

1. Triglicérides --------------------- > Glicerol + ácidos graxos

2. Glicerol + ATP ------------------ > glicerol – 3 fosfato + ADP

3. Glicerol- 3- fosfato -------------------- > dihidroxiacetona + H2O2

4. H2O2 + 4-clorofenol + 4 – aminoantipirina ---------------- > 4-antipiriquinomina + 4H2O

METODOLOGIAEnzimáticaLaboratório: LabtestCor: Rosa

REAGENTES

Reagente de corSolução padrão 200 mg/dL

AMOSTRASoro ou plasma (paciente em jejum completo por 12 horas, abstenção de álcool por 12 horas e

qualquer medicamento, principalmente anticoncepcionais usados por via oral).

EQUIPAMENTOSVórtexBanho-MariaEspectrofotômetro (calibrado em 505 nm)

MATERIALTubos de ensaioGaleria para tubosPipetas automáticas de 1000µl e 20µL


Branco Padrão TesteRGT 2000µL 2000µL 2000µL

Amostra -- -- 20µLPadrão -- 20µL --

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Lipase

Glicerol uinase



Homogeneizar e incubar por 5min a 37ºC;Determinar a absorbância de T e P a 505nm, zerando o aparelho com o branco

CÁLCULO:Triglicerídeos (mg/dL) = Absorbância do Teste x 200


VALORES DE REFERÊNCIA< 150 mg/dL

INTERPRETAÇÃOTaxa elevada de triglicerídeos: Diabetes

AterosclerosePancreatiteDoenças coronarianaSíndrome nefrótica

apostila de bioquímica finalizada

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