U N I V E R S I D A D E D E S Ã O P A U L O I N S T I T U T O D E Q U Í M I C A D E S Ã O C A R L O S L A B O R A T Ó R I O D E C R O M A T O G R A F I A

“CLONAGEM, EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE XYLELLA FASTIDIOSA”

Célia Sulzbacher Caruso

Tese apresentada ao Instituto de Química de São Carlos, da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Ciências, área Química Analítica.

Orientador: Prof. Dr. Emanuel Carrilho

São Carlos 2007

ii

Quando a saudade bater

No quarto escuro do peito

Você não pode negar

O que ficou bem marcado

O que ficou definido, neste lugar.

Lugar que nunca se esquece

Lugar que nunca envelhece

Lugar que tem seu lugar

Quando a saudade vier

Diga que fui pra lá lhe ver

Diga que fui buscar

Um pedaço do tempo que ficou

Como se fosse dois meninos

Se lambuzando de mel

Correndo pra festejar o amor, o amor, o AMOR....

As únicas coisas que importam são

as feitas de verdade e alegria”

Célia Caruso

iii

Agradecimentos A Deus, pela presença constante em minha vida;

Ao Prof. Dr. Emanuel Carrilho, pela amizade, confiança, orientação e dedicação

de sempre. Agradeço de todo o coração!

À Prof. Dra. Ana Paula Ulian de Araújo, que muito fez por mim, meus sinceros

agradecimentos! Que eu possa retribuir incondicionalmente a confiança, o

respeito, a preocupação e ajuda de sempre.

Á Profa. Dra. Eliana G. M. Lemos e a todo seu grupo de pesquisa que muito

fizeram para o início deste trabalho, pelas horas de descontração, amizade,

respeito, confiança e, acima de tudo, incentivo.

Aos técnicos da Biofisica IFSC-USP: Bel, Andressa, e João, por toda a ajuda,

paciência e principalmente suporte durante todo o período de realização deste

trabalho.

Aos professores do grupo de Biofísica Molecular “Sergio Mascarenhas”: Jabáh,

Nelma, Leila e Otaciro por terem me recebido como membro do grupo.

Aos amigos da Biofisica: Cris, Leandro, Fernando, Ana Paula, Priscila, Ceará,

Fernanda, Wânius, Lia, Julio, Luis, Daniel e Militar, pela amizade!

Aos meus grandes amigos Sheila, Júlio, Assuero, Joci, Débora, Fernando,

Roberta e José Luiz.....meus amigos de todas as horas....tão especiais.... que só

tenho a agradecer a DEUS por ter convivido com vcs....tudo foi muito bom!!! Eu

amo vcs!!!

iv

Aos meus pais, José e Petronila, pelo amor de sempre, pela paciência e por serem

aqueles que me trouxeram até aqui. Aos meus irmãos, Jeremihas, Juliana e

Cecília, pela mais sincera amizade. Eu amo vcs!

A CAPES e a FAPESP pelo suporte financeiro para a realização deste trabalho.

v

SUMÁRIO Dedicatória

Agradecimentos

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

RESUMO

ABSTRACT

I – INTRODUÇÃO ....................................................................................................1 I.1 - Reação em Cadeia da Polimerase – PCR .................................................2 I.2 - Clonagem Molecular................................................................................ 4

I.2.1 - Conceito de Clonagem Molecular .............................................4 I.2.2 - Enzimas de Restrição ............................................................... 5 I.2.3 - Vetores de Clonagem ..............................................................10

I.2.4 - Construção do DNA Recombinante ........................................12 I.2.4.1 - Enzimas DNA Ligases ............................................. 13

I.2.5 - Transformação Bacteriana ......................................................15 I. 2.5.1 – Conceito de Transformação Induzida..................... 15 I. 2.5.2 – Mecanismos de Captação do DNA......................... 15

I. 2.6 – Detecção e análise dos Clones Recombinantes...................... 17 I. 2.6.1 – Seqüenciamento de DNA ....................................... 18

I. 2.6.1.1 – Seqüenciamento Manual.......................... 19 I. 2.6.1.2 – Seqüenciamento Automático ................... 21

I. 3 – Expressão de Proteínas Heterólogas................................... ................. 22 I. 4 – Bactéria Xylella fastidiosa................................................... .................25

I. 4.1 - Proteínas de Xylella fastidiosa................................ ............... 27 I. 4.1.1 - Hidroxinitrila Liase................................... ...............27

I. 4.1.1.1 - Enzimas dependentes de FAD.... ............. 29 I. 4.1.1.2 - Enzimas independentes de FAD ...............30

I. 4.1.2 – Corismato Sintase....................................................32 I. 4.1.2.1 – Biosíntese de Aminoácidos Aromáticos...35

I. 4.1.3 – Proteína D do Sistema de Transporte e Secreção Tat .......................................................................... 36

I. 5 – Objetivos e Perspectivas ...................................................................... 40

vi

II – MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................43

II.1 - MATERIAIS .…………………………….............……………................43

II.1.1 - Reagentes, Enzimas, Linhagens Bacterianas e Vetores ..............43

II.2 – MÉTODOS ……………………………………..............…..................... 44

II. 2.1 – Extração do DNA genômico ......................................................44 II. 2.2 – Construção dos Oligonucleotídeos e Amplificação dos Genes..46 II. 2.3 – Purificação dos Produtos Amplificados por PCR...................... 49 II. 2.4 – Preparação dos Produtos de PCR purificados – Reação de

Adenilação................................................................................... 49 II. 2.5 – Clonagem dos Produtos de PCR adenilados nos Vetores de

Clonagem pGEM-T easy - Reação de Ligação.......................... .50 II. 2.6 – Transformação da Bactéria Escherichia coli DH5α com os

Plasmídeos Recombinantes pGEM-T easy................................. 51 II. 2.7 – Extração, Análise de Restrição e Seqüenciamento dos Plasmídeos

Recombinantes pGEM-T easy de Escherichia coli DH5α.......... 52 II. 2.8 – Subclonagem dos Genes no Plamídeo de Expressão pET28a... 54 II. 2.9 – Transformação da Bactéria Escherichia coli DH5α com os

Plasmídeos Recombinantes pET28a ........................................... 55 II. 2.10 – Extração e Análise de Restrição dos Plasmídeos Recombinantes

pET28a de Escherichia coli DH5α ............................................. 55 II. 2.11 – Transformação da Bactéria Escherichia coli BL21(DE3) com os

Plasmídeos Recombinantes pET28a............................................ 56 II. 2.12 – Expressão Heteróloga das Proteínas Recombinantes de Xylella

fastidiosa (rXfHNL, rXftatD e rXfaroC) em E.coli..................... 56 II. 2.13 – Purificação das Proteínas Recombinates de Xylella fastidiosa

(rXfHNL, rXftatD e rXfaroC) ..................................................... 58 II. 2.13.1 – Cromatografia de Afinidade em Resina de

Níquel......................................................................... 59 II. 2.13.2 – Cromatografia de Exclusão por Tamanho em Colunas

Superdex.................................................................... 62 II. 2.14 - Análises Físico-química e Estrutural das Proteínas

Recombinantes de Xylella fastidiosa (rXfHNL, rXftatD e rXfaroC) ...................................................................................... 63 II. 2.14.1 – Determinação Quantitativa do Nível de Expressão

Protéica...................................................................... 63 II. 2.14.1.1 - Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-

PAGE).................................................................. 64 II. 2.14.1.2 - Eletroforese em Gel através de Microchip

(Método GelChip-CE)......................................... 65 II. 2.14.2 - Determinação do Ponto Isoelétrico............................ 66 II. 2.14.3 - Determinação da Seqüência por Espectrometria de

Massas....................................................................... 68 II. 2.14.4 – Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (SAXS) e

Análises dos Dados................................................... 70 II. 2.14.5 – Espectroscopia de Dicroísmo Circular (CD) e Cálculo

das Frações de Estrutura Secundária......................... 73

vii

II. 2.14.6 - Espectroscopia de Emissão de Fluorescência............ 76 II. 2.14.7 – Ensaios de Estabilidade Térmica e Química das

Proteínas Recombinantes........................................... 78 II. 2.14.7.1 – Ensaio de Estabilidade Térmica Frente a

Variações de pH................................................... 78 II. 2.14.7.2 - Ensaio de Estabilidade Química Frente a

Variações na Concentração de Uréia................... 79 II. 2.14.8 – Estudos de Atividade Enzimática das Proteínas

Recombinantes..................................................... 80 II. 2.14.8.1 – Hidroxinitrila Liase de Xylella fastiosa

(rXfHNL)............................................................. 80 II. 2.14.8.2 – Corismato Sintase de Xylella fastiosa

(rXfaroC) ............................................................. 81 III – RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 83

III. 1 – Hidroxinitrila Liase .............. .......................... ....................................... 83 III. 1.1 – Amplificação e Clonagem no Vetor pGEM-T easy.................. 83

III. 1.1.1 – Análise de Restrição e Seqüenciamento dos Plasmídeos Recombinantes........................................... 87

III. 1.2 – Subclonagem no Vetor de Expressão e Análise de Restrição dos Plasmídeos Recombinantes.............. ........................................... 90

III. 1.3 – Expressão Heteróloga da Proteína rXfHNL a partir dos Vetores de Expressão.................... .......................... ................................ 92

III. 1.4 – Purificação da Proteína rXfHNL por Cromatografia de Afinidade e Exclusão por Tamanho............................................ 93

III. 1.5 – Análises Físico-química e Estrutural da Proteína rXfHNL...... 98 III. 1.5.1 – Determinação Quantitativa do Nível de expressão

Protéica ................... ................................................. 98 III. 1.5.2 – Determinação do Ponto Isoelétrico ......................... 102 III. 1.5.3 – Determinação da Seqüência por Espectrometria de

Massas.................... ................................................. 103 III. 1.5.4 – Análise dos Dados de SAXS.................................... 105 III. 1.5.5 – Espectroscopia de Dicroísmo Circular..................... 108

III. 1.5.5.1 – Estudos de Estabilidade Térmica................................................ ................... 109

III. 1.5.5.2 – Estudos da Estabilidade Química................... ................................................ 113

III. 1.5.6 – Espectroscopia de Emissão de Fluorescência........................................................... 120

III. 1.5.6.1 – Estudos da Estabilidade Química.................................................................... 122

III. 1.5.7 – Ensaio de Atividade Enzimática ............................. 126 III. 1.5.8 – Conclusões Parciais ................................................ 128

III. 2 – Corismato Sintase ..................................................................................130

III. 2.1 – Amplificação e Clonagem no Vetor pGEM-T easy ...............130 III. 2.1.1 – Análise de Restrição e Seqüenciamento dos

Plasmídeos Recombinantes .................................... 132

viii

III. 2.2 – Subclonagem no Vetor de Expressão, Análise de Restrição e Seqüenciamento dos Plasmídeos Recombinantes .................. 134

III. 2.3 – Expressão Heteróloga da Proteína rXfaroC a partir dos Vetores de Expressão .......................................................................... 137

III. 2.4 – Purificação da Proteína rXfaroC por Cromatografia de Afinidade..................................................................................139

III. 2. 5 – Análises Estrutural da Proteína rXfaroC ............................... 141 III. 2.5.1 – Espectroscopia de Dicroísmo Circular .....................141 III. 2.5.2 – Espectroscopia de Emissão de Fluorescência ..........144 III. 2.5.3 – Ensaio de Atividade Enzimática...............................146

III. 2.6 – Conclusões Parciais ................................................................148

III. 3 – Proteína D do Sistema de Transporte e Secreção Tat ............................150 III. 3.1 – Amplificação e Clonagem no Vetor pGEM-T easy ................150 III. 3.2 – Análise de Restrição e Seqüenciamento dos Plasmídeos

Recombinantes ........................................................................152 III. 3.3 – Subclonagem no Vetor de Expressão e Análise de Restrição dos

Plasmídeos Recombinantes .................................................... 154 III. 3.4 – Expressão Heteróloga da Proteína rXftatD a partir dos Vetores

de Expressão .......................................................................... 156 II. 3.5 – Conclusões Parciais.................................................................. 158

IV – PERSPECTIVAS .......................................................................................... 159 V – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 160

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 O ciclo da reação em cadeia da polimerase ...................................... 3

Figura 2 Tipos de clivagem gerados por enzimas de restrição ....................... 7

Figura 3 Moléculas de DNA de tamanhos diferentes podem ser separadas por eletroforese .................................................................................

9

Figura 4 Estrutura molecular de um plasmídeo típico usado em clonagem molecular ..........................................................................................

11

Figura 5 Construção de um DNA recombinante ............................................ 13

Figura 6 Mecanismo molecular proposto para a transformação de E. coli com uma molécula de DNA exógeno...............................................

16

Figura 7 Seqüenciamento de DNA pelo método de Sanger ........................... 20

Figura 8 Expressão e purificação de uma proteína recombinante com tag de seis histidinas ....................................................................................

23

Figura 9 Mecanismo enzimático de glicosídeos cianogênicos ....................... 28

Figura 10 Via do chiquimato ............................................................................ 33

Figura 11 Destino do corismato a partir da via do ácido chiquímico e os produtos finais correspondentes .......................................................

34

Figura 12 Previsões topológicas derivadas das seqüências previstas para os genes do sistema Tat.........................................................................

39

Figura 13 Seqüência codificadora da ORF XfHNL (Xylella fastidiosa Genome Project – número de acesso XFa0032) ..............................

47

Figura 14 Interação entre resíduos vizinhos da cauda His-Tag e a matriz Ni-NTA .................................................................................................

60

Figura 15 Estrutura molecular do composto imidazol e do aminoácido histidina ...........................................................................................

60

x

Figura 16 Espectro de CD de vários tipos de estrutura secundária ................. 74

Figura 17 Diagrama de Jablonski .................................................................... 77

Figura 18 Amplificação da ORF codificadora da proteína hidroxinitrila liase...................................................................................................

85

Figura 19 Colônias Recombinantes e Não Recombinantes de Células E. coli DH5α ..............................................................................................

86

Figura 20 Separação dos plasmídeos digeridos pGEM-XfHNL ...................... 88

Figura 21 Bases seqüenciadas do plasmídeo pGEM-XfHNL extraído do clone 1 ..............................................................................................

89

Figura 22 Separação dos plasmídeos digeridos pET-XfHNL .......................... 91

Figura 23 Expressão da proteína rXfHNL a partir dos clones 1 e 2 ................. 92

Figura 24 Purificação da rXfHNL por cromatografia de afinidade .................. 94

Figura 25 Perfil cromatográfico da rXfHNL por cromatografia de exclusão por tamanho e SDS-PAGE das frações eluídas ................................

95

Figura 26 Determinação do grau de oligomerização aparente da rXfHNL por cromatografia de exclusão por tamanho ..........................................

97

Figura 27 Géis representativos das análises por (A) SDS-PAGE e (B) GelChip-CE .....................................................................................

99

Figura 28 Resultado da expressão da rXfHNL em função do tempo por GelChip-CE e SDS-PAGE ..............................................................

100

Figura 29 Ensaio de focalização isoelétrica da rXFHNL ................................. 102

Figura 30 Cobertura da seqüência de aminoácidos da proteína rXfHNL obtida pelas análises por LC-nanoESI-MS/MS ...............................

104

Figura 31 Curvas de espalhamento de raios-X a baixos ângulos e gráfico da função de variação de distância da rXfHNL ....................................

106

Figura 32 Modelo de SAXS para a rXfHNL .................................................... 107

xi

Figura 33 Espectro de dicroísmo circular da rXfHNL...................................... 109

Figura 34 Espectros de CD da rXfHNL em diferentes pH ............................... 110

Figura 35 Transição da desnaturação térmica da rXfHNL ............................... 112

Figura 36 Dependência do Tm de rXfHNL com o pH, monitorado por CD ....................................................................................................

113

Figura 37 Desnaturação da rXfHNL induzida por uréia .................................. 114

Figura 38 Desnaturação e renaturação da rXfHNL induzida por uréia ............ 118

Figura 39 Espectros de emissão de fluorescência da rXfHNL a vários pH .........

120

Figura 40 Efeitos da desnaturação induzida por uréia ...................................... 122

Figura 41 Desnaturação induzida por uréia da rXfHNL por Fluorescência ..... 124

Figura 42 Amplificação do gene codificador da proteína corismato sintase .... 131

Figura 43 Separação dos plasmídeos digeridos pGEM-aroC ........................... 133

Figura 44 Separação dos plasmídeos digeridos pET-XfaroC ........................... 135

Figura 45 Bases seqüenciadas do plasmídeo pET-XfaroC extraído do clone 3 ..............................................................................................

136

Figura 46 Expressão piloto da proteína rXfaroC a partir do clone 1 ................ 138

Figura 47 Purificação da rXfaroC por cromatografia de afinidade .................. 139

Figura 48 Purificação da rXfaroC por cromatografia de afinidade .................. 140

Figura 49 Espectro de dicroísmo circular da proteina recombinante rXfaroC ............................................................................................

142

Figura 50 Espectros de CD da rXfHNL em diferentes pHs ............................. 143

Figura 51 Espectros de emissão de fluorescência da rXfaroC a vários valores de pH ................................................................................................

145

xii

Figura 52 Análise de restrição dos plasmídeos pGEM-XftatD ........................ 152

Figura 53 Análise de restrição dos plasmídeos pET-XftatD ............................ 155

Figura 54 Expressão Piloto da proteína rXftatD a partir dos clones 1 e 2 ........ 156

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Endonucleases ou enzimas de restrição....................... 8

Tabela 2 Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na amplificação por PCR... 48

Tabela 3 Dados termodinâmicos para diferentes concentrações da rXfHNL

por CD ................................................................................................

119

Tabela 4 Dados termodinâmicos para diferentes concentrações da rXfHNL

por Fluorescência. ..............................................................................

125

xiv

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

Símbolo dos aminoácidos Código de 3 letras Código de 1 letra Nome do aminoácido

Ala A Alanina

Arg R Arginina

Asn N Asparagina

Asp D Aspartato

Cys C Cisteína

Gln Q Glutamina

Glu E Glutamato

Gly G Glicina

His H Histidina

Iso I Isoleucina

Leu L Leucina

Lys K Lisina

Met M Metionina

Phe F Fenilalanina

Pro P Prolina

Ser S Serina

Thr T Treonina

Trp W Triptofano

Tyr Y Tirosina

Val V Valina

Abreviaturas CA Anidrase carbônica

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

BSA Albumina sérica bovina

CD Circular Dichroism, dicroísmo circular

D.O. Densidade Óptica

EDTA Ácido etileno diamino tetracético

xv

LC-nanoESI-MS/MS

Liquid chromatography nano Electros Spray Ionization – Mass Spectrometry, Espectrometria de massa por ionização elétron-spray

IEF IsoEletric Focussing, Focalização Isoelétrica

ITS Inibidor de tripsina de soja

NCBI National Center for Biotechnology Information

OVA Ovalbumina

pI Ponto isoelétrico

SDS-PAGE Sodium DodecylSulphate – Polyacrilamide Gel Electrophpresis, eletroforese em gel de poliacrilamida- SDS

SELCON, Continll e CDSSTR

Programas de análise de espectros de CD que estimam o conteúdo de estrutura secundária de uma proteína

u.a. Unidade arbitrária

xvi

RESUMO

A bactéria Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) é um patógeno de planta que causa a

clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Xylella fastidiosa

é uma bactéria limitada ao xilema, sendo transmitida de planta a planta através de

insetos vetores. Através da determinação experimental da seqüência primária de

algumas proteínas marcadamente expressas pela X. fastidiosa e a comparação destas

com seqüências de ácidos nucléicos do genoma identificou entre elas três ORFs

codificadoras de proteínas que podem estar relacionadas à patogenicidade desta

bactéria no seu hospedeiro. No entanto, a função biológica destas proteínas ainda não

foi funcionalmente caracterizada. Para investigar o papel biológico e realizar estudos

de estrutura e função, as ORFs correspondentes as proteínas hidroxinitrila liase,

corismato sintase e proteína D do sistema de transporte e secreção Tat foram

clonadas, seqüenciadas e expressas em Escherichia coli. As proteínas recombinantes

expressas foram purificadas por cromatografia de afinidade e suas identidades

verificadas por seqüenciamento. As proteínas purificadas foram encontradas como

uma única banda em SDS-PAGE. As proteínas recombinantes, pela primeira vez

isoladas, foram caracterizadas em termos de estabilidade conformacional e

comportamento estrutural frente a mudanças de pH e temperatura utilizando-se as

espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência. O sucesso na construção do

gene sintético e na clonagem em vetores de expressão de E. coli resultou em

quantidade satisfatória de expressão das proteínas recombinantes. Duas delas

apresentaram-se na formas solúveis, facilmente purificadas e ativas e permitindo suas

caracterizações.

xvii

ABSTRACT

Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis, also known as

"amarelinho". Xylella fastidiosa inhabits exclusively the xylem vessels, and is

transmitted by sharpshooter vectors. The experimental determination of the primary

sequence of some markedly expressed proteins for X. fastidiosa and the comparison

with the nucleic acids sequence of its genome aided the identification of three of

them as being proteins involved in host pathogenicity. However, the biological role

of these proteins should be assigned experimentally. In order to investigate the

biological role, function and structure, ORFs corresponding to hydroxynitrile liase,

chorismate synthase and type V secretory pathway proteins were cloned, sequenced

and expressed in Escherichia coli. The expressed recombinant proteins were purified

by immobilized metal affinity chromatography (Ni-NTA resin) and their identities

were verified by protein sequencing. The purified proteins were found as a single

band on SDS-PAGE. The successful cloning and heterologous expression of

recombinant HNL in E. coli resulted in a satisfactory amount of expressed protein.

Two of the expressed recombinant proteins were soluble, easily purified, and isolated

in an active form. X. fastidiosa recombinant proteins, for the first time isolated, were

characterized according to enzyme conformational stability and structural behavior

as a function of pH and temperature using circular dichroism and fluorescence

spectroscopy.

Introdução

1

I - INTRODUÇÃO

Até meados da década de 70, o ácido desoxirribonucléico (DNA) foi o

componente celular mais difícil de ser analisado por procedimentos científicos que

levassem a sua caracterização químico-funcional dentro dos organismos vivos

(STRYER, 1988). A partir de 1970, novas tecnologias provenientes da Microbiologia,

Bioquímica, Imunologia e Genética Microbiana foram desenvolvidas, permitindo o

isolamento e a purificação de genes específicos num processo chamado clonagem

gênica (ZAHA et al., 1996; STRYER, 1988). A clonagem gênica permitiu que a

análise do DNA ganhasse um novo enfoque, fazendo com que a dificuldade

encontrada na análise desta molécula diminuísse muito, tornando-o, assim, umas das

moléculas mais fáceis de ser analisada. Muitas destas técnicas permitiram isolar

regiões específicas do DNA, obtê-las em grande quantidade e determinar a sua

seqüência numa velocidade de milhares de nucleotídeos por dia.

Como conseqüência do desenvolvimento destas tecnologias, a tecnologia do

DNA recombinante, como se convencionou denominar este conjunto de técnicas, teve

ampla aplicação tanto na área biológica como em diversas outras áreas, tais como:

médica, forense, agrícola e química. Atualmente é possível realizar investigações de

paternidade, diagnósticos de doenças genéticas e infecciosas, estudos dos mecanismos

de replicação e expressão, estudos do desenvolvimento de culturas microbianas

capazes de produzir substâncias úteis tais como a insulina humana, hormônio de

crescimento e vacinas, e ainda, produzir enzimas de interesse industrial aplicáveis no

processo de fabricação de pesticidas e fármacos, entre outros. Portanto, sua aplicação

comercial ou biotecnológica parece ter um potencial inesgotável.

Introdução

2

Diante da diversidade de aplicações, a tecnologia do DNA recombinante foi de

extrema importância neste estudo tanto na obtenção dos genes de interesse como na

confirmação de suas seqüências e, conseqüentemente, na obtenção das proteínas que

eles codificam. Nos próximos tópicos pretende-se descrever os passos básicos

envolvidos na construção de genes recombinantes, na expressão das respectivas

proteínas codificadas por eles e, finalmente, explanar sobre o organismo e as funções

das proteínas de interesse.

I. 1 – Reação em Cadeia da Polimerase - PCR

A tecnologia da reação em cadeia da polimerase (“Polymerase Chain Reaction”)

foi concebida por Kary Müllis da década de 80 (ZAHA et al., 1996; STRYER, 1988).

A maior aplicação desta metodologia é a possibilidade de se amplificar uma

determinada seqüência de DNA através da síntese enzimática in vitro de milhões de

cópias de um segmento específico na presença da enzima DNA polimerase.

Uma simples cópia de um gene dentro de um genoma pode ser amplificada a

alguns microgramas, partindo-se de quantidades mínimas como sub picogramas de

DNA total. A condição básica para a aplicação da técnica, depende da construção de

um par de oligonucleotídeos (“primers” ou iniciadores) os quais são complementares

as duas fitas opostas do DNA e que delimitam a seqüência alvo da amplificação.

A PCR envolve basicamente 3 etapas: desnaturação, hibridização e extensão, os

quais constituem um ciclo da reação de amplificação. A Figura 1 ilustra a

representação de um ciclo básico da PCR.

Introdução

3

Figura 1. O ciclo da reação em cadeia da polimerase. O processo envolvendo estas três etapas pode

ser repetido de 25 a 30 ciclos, sendo possível aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentração de

DNA pré-existente. Em teoria, se for possível levar a cabo 25 ciclos de amplificação seguidos, a

concentração de DNA aumentaria 225 vezes embora, na prática, devido a ineficiência no processo de

amplificação, esse aumento fique em alguns milhões de vezes.

Na primeira etapa, a fita dupla do DNA alvo sofre desnaturação a temperaturas

em torno de 94 °C durante 5 min. Nesta temperatura, as duas fitas do DNA alvo se

separam. Na etapa de anelamento, a temperatura é rapidamente reduzida para 35 a 60

oC permitindo que os oligonucleotídeos sejam hibridizados especificamente na região

do DNA molde em que há complementariedade das bases. Finalmente, a temperatura

é elevada para aproximadamente 72 °C para que a DNA polimerase realize a extensão

a partir das extremidades 3’ dos primers.

Inicialmente, a DNA polimerase da bactéria Escherichia coli (E. coli), cuja

temperatura ótima é de 37 oC foi muito empregada e adicionada manualmente a cada

ciclo na amplificação de DNA. Este processo manual era realizado a fim de preservá-

la durante a PCR já que ela era inativa a 94 oC. Um importante avanço técnico surgiu

com a descoberta da Taq DNA polimerase (ZAHA et al., 1996; STRYER, 1988),

oriunda da bactéria Thermus aquaticus, a qual vive em fontes de água a temperatura

de 75 oC. Com esta nova enzima foi possível programar, de forma contínua e

automatizada, vários ciclos de PCR em equipamentos denominados termocicladores.

Por apresentar temperatura ótima de ação a 72 oC e ser razoavelmente estável mesmo

Introdução

4

a 94 oC, esta descoberta permitiu que adição de enzima fosse realizada uma única vez

durante toda reação.

Além do processo de amplificação de seqüências específicas, principal uso da

PCR, rapidamente surgiram novas aplicações para esta poderosa metodologia, tais

como: utilização no seqüenciamento de nucleotídeos, análise do polimorfismo e várias

outras aplicações mais específicas atribuídas ao emprego da metodologia do DNA

recombinante.

A amplificação via PCR é a etapa primordial para a obtenção da quantidade de

DNA necessária a ser aplicada na etapa de clonagem molecular.

I. 2 - Clonagem Molecular

I. 2.1 – Conceito de Clonagem Molecular

A origem do termo clonagem vem da genética bacteriana que considera uma

colônia de bactérias como um clone, uma vez que todos os indivíduos são

geneticamente idênticos à bactéria inicial.

A técnica central da metodologia do DNA recombinante é a clonagem

molecular, a qual consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA

idênticas. Em geral, a clonagem molecular compreende dois estágios importantes:

i) a ligação de um fragmento de DNA de interesse, denominado inserto, a uma

outra molécula de DNA, denominada vetor, a fim de formar uma terceira molécula, o

DNA recombinante;

ii) a molécula do DNA recombinante é introduzida numa célula hospedeira

compatível, num processo chamado de transformação. A célula hospedeira que

Introdução

5

adquiriu a molécula do DNA recombinante é agora chamada de transformante ou

célula transformada. Um único transformante, em condições ideais, sofre muitos

ciclos de divisão celular, produzindo uma colônia que contém milhares de cópias do

DNA recombinante.

I. 2.2 – Enzimas de Restrição

A descoberta das enzimas de restrição revolucionou a biologia molecular, pois

possibilitou montar moléculas de DNA recombinante, tornando possível a

manipulação do DNA com extrema precisão.

Em 1953, um fenômeno de deficiência da replicação de um vírus de bactérias

(bacteriófagos ou simplesmente fagos) foi descrito dependente da célula hospedeira na

qual este vírus estava inserido. Com o avanço das pesquisas em torno deste fenômeno,

foi observado que a inabilidade de certos vírus crescerem em determinadas linhagens

bacterianas era devido à presença de enzimas denominadas nucleases altamente

específicas que clivavam o DNA viral, tornando-os inativos. Este processo foi

encarado como um sistema de defesa bacteriano que degrada o DNA que lhe é

estranho (DNA exógeno), e é denominado processo de restrição.

Neste processo, as bactérias protegem seu próprio DNA desta degradação

através da sua modificação química após a síntese. Esta modificação consiste na

metilação de nucleotídeos (bases) específicos ao longo da fita dupla de DNA. Sendo

assim, as enzimas de restrição são capazes de distinguir o DNA exógeno de seu

próprio DNA. A enzima responsável pelo processo de metilação, a metilase, também

pode, teoricamente, adicionar radicais metil no DNA do vírus por engano. No entanto,

a metilase é uma enzima de ação lenta, e antes que ela realize a metilação do DNA do

Introdução

6

vírus, a enzima de restrição já o eliminou. Na bactéria o processo de metilação ocorre

logo no início da formação de um novo indivíduo. Como conseqüência, este sistema é

frequentemente descrito como fenômeno da restrição/modificação e existe em um

grande número de bactérias.

Em 1973, o interesse por enzimas de restrição aumentou quando se percebeu que

elas poderiam ser usadas para fragmentar o DNA deixando em suas extremidades fitas

simples de DNA que permitiam a ligação dos fragmentos (ZAHA et al., 1996;

STRYER, 1988). Isto significava que a recombinação poderia ser efetuada in vitro.

Além disto, DNA bacteriano poderia recombinar com DNA humano ou de qualquer

outra espécie, abrindo a possibilidade de clonar genes ou isolar proteínas de culturas

bacterianas.

Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição são proteínas bacterianas que

reconhecem seqüências nucleotídicas específicas de 4 a 8 pares de base (pb) em uma

molécula de DNA, clivando a mesma em dois lugares da fita dupla que a constitui. A

seqüência de reconhecimento é chamada de sítio de restrição. Estas enzimas são

divididas em várias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos sítios de

reconhecimento e clivagem.

Na tecnologia do DNA recombinante, as enzimas do tipo II, que podem ser

proteínas monoméricas ou diméricas, são as mais importantes e cortam o DNA no

mesmo sítio do seu reconhecimento. O sítio de reconhecimento deste tipo de enzima é

normalmente uma seqüência denominada palindrômica, ou seja, ela tem um eixo de

simetria e a seqüência de bases de uma fita é a mesma da fita complementar, quando

lida na direção oposta. Há 2 tipos distintos de clivagens: a) os dois cortes ocorrem no

eixo de simetria da seqüência específica, gerando extremidades abruptas, ou b) os

cortes são feitos simetricamente, porém, fora do eixo de simetria, gerando

Introdução

7

extremidades coesivas. Estas extremidades apresentam regiões constituídas de fita

simples. Exemplos destes dois tipos de clivagens e seus produtos gerados foram

representados na Figura 2.

Figura 2. Tipos de clivagem gerados por enzimas de restrição. Os sítios de reconhecimento são

compostos por seqüências palindrômicas. As setas indicam os sítios de clivagem. As linhas tracejadas

representam o centro de simetria das seqüências.

As extremidades coesivas produzidas por várias enzimas de restrição permitem

que dois fragmentos de DNA liguem-se mais facilmente do que fragmentos que

contenham extremidades abruptas devido serem estruturalmente mais adequadas para

a complementaridade das bases. Assim, fragmentos com extremidades abruptas são

ligados com muito menos eficiência. Uma concentração muito maior de DNA ligase e

dos DNAs envolvidos ou até uma modificação destas extremidades a fim de torná-las

coesivas são necessários para que ocorra a reação de ligação.

Atualmente, mais de 1000 enzimas de restrição já foram identificadas (LEWIN,

1997; LEWIN, 1994). A nomenclatura desenvolvida para elas foi baseada na

abreviação do nome do microrganismo do qual a enzima foi isolada. A primeira letra

Introdução

8

representa o gênero e as outras duas à espécie, seguido de um algarismo romano ou

outra letra que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por

exemplo, a enzima de restrição denominada de EcoRI é purificada da bactéria E. coli

que carrega um fator de transferência de resistência RY, enquanto que a HindIII é

isolada da Haemophilus influenzae, linhagem Rd III.

A Tabela 1 mostra o organismo de origem, a seqüência palindrômica e o sítio de

clivagem de algumas enzimas de restrição. Note que há enzimas que originam

terminações coesivas enquanto que uma gera cortes abruptos.

Tabela 1. Endonucleases ou enzimas de restrição. As setas verdes dentro das seqüências de

reconhecimento indicam o local de clivagem em uma fita dupla de DNA.

Organismo Denominação da Enzima Seqüência de Reconhecimento

Escherichia coli RY 13 EcoRI 5’ G↓AATTC 3’ 3’ CTTAA↑G 5’

Haemophilus influenzae Rd HindIII 5’ A↓AGCTT 3’ 3’ TTCGA↑A 5’

Haemophilus aegyptius HaeIII 5’ AG↓GCCT 3’ 3’ TC↑CGGA 5’

Xantomonas hilicola XhoI 5’ C↓TCGAG 3’ 3’ GAGCT↑C 5’

Neisseria denitrificans NdeI 5’ CA↓TATG 3’ 3’ GTAT↑AC 5’

Termus aquaticus TaqI 5’ A↓AGCTT 3’ 3’ TTCGA↑A 5’

A digestão de DNA por enzimas de restrição é um processo bastante simples.

Basta colocar o DNA em contato com a enzima a uma temperatura ideal, geralmente

37 0C, e a enzima inicia imediatamente o processo de digestão, cortando o DNA em

diversos fragmentos. O número de fragmentos produzido é estabelecido pelo número

de sítios de restrição reconhecidos pela enzima utilizada. Uma importante

conseqüência desta especificidade é que o número de clivagens feito por cada uma

Introdução

9

delas no DNA de qualquer organismo é definido e permite o isolamento de

fragmentos deste DNA. Portanto, cada enzima de restrição gera um conjunto único de

fragmentos quando cliva uma molécula de DNA específica.

O conjunto de fragmentos gerados por digestão com enzimas de restrição é

geralmente detectado pela separação destes fragmentos por eletroforese em gel de

agarose. A Figura 3 mostra uma separação de DNAs digeridos e visualizados em gel

de agarose.

Figura 3. Moléculas de DNA de tamanhos diferentes podem ser separadas por eletroforese.

Moléculas menores migram mais rapidamente que moléculas maiores, tornando-se, portanto separadas

em bandas. O DNA é corado com brometo de etídeo, que fluoresce quando iluminado com luz

ultravioleta.

A eletroforese é a técnica pela qual fragmentos de DNA de diferentes tamanhos

são separados. O DNA é colocado em um poço do gel (que tem aspecto de gelatina) e

este é submetido a um campo elétrico. O DNA irá se mover na direção do pólo

positivo, uma vez que a molécula de DNA é negativa devido à presença de

grupamentos fosfato. A separação dos fragmentos ocorre em função dos seus pesos

Introdução

10

moleculares que determina o quão rápido o campo elétrico será capaz de mover o

fragmento de DNA ao longo do gel. Quanto maior o fragmento, mais lenta será sua

migração, deste modo, fragmentos menores chegam primeiro ao final do gel.

As enzimas de restrição constituem a principal ferramenta da tecnologia do

DNA recombinante. Sua aplicação permite cortar genes específicos de interesse e

colocá-los dentro de outros organismos, tornando possível recombinar ou criar

organismos transgênicos, tão conhecidos popularmente.

I. 2.3 – Vetores de Clonagem

Após o isolamento de uma informação genética, os fragmentos de DNA obtidos

pela clivagem com enzimas de restrição devem ser inseridos numa outra molécula de

DNA, capaz de amplificar esta informação genética em centenas de cópias. Este

processo de amplificação é obtido através do uso de moléculas de DNA que são os

chamados de vetores de clonagem molecular.

Atualmente, os tipos básicos de vetores usados na metodologia do DNA

recombinante apresentam características especiais que os tornam excelentes veículos

de clonagem em diferentes situações. Os vetores de clonagem mais utilizados

normalmente são os plasmídeos de bactérias - moléculas de DNA circular existentes

nesses microorganismos, fora dos seus cromossomos e capazes de se replicar de modo

independente. A técnica de DNA recombinante tem um interesse especial se uma das

fontes de DNA clivado for um plasmídeo, justamente pelo seu potencial de replicação

independente.

Vetores de clonagem são pequenas moléculas de DNA dupla fita, contendo os

elementos necessários para a sua replicação e pelo menos um gene que confere

Introdução

11

resistência a antibiótico. Estas moléculas variam de 5 a 400 quilobases e comumente

estão presentes em duas ou mais cópias por célula. Os plasmídeos presentes num

grande número de cópias são usados como veículos de clonagem desde que capacitem

à amplificação do segmento do DNA neles clonado.

Um plasmídeo é considerado um bom vetor de clonagem se: possui uma origem

de replicação (O), ou seja, uma seqüência de DNA que permita que o vetor seja

replicado na célula hospedeira; apresenta dois ou mais sítios únicos de clivagem para

endonucleases de restrição onde o inserto é incorporado e possui um gene que codifica

um produto que distingue a célula transformada da célula não transformada. A Figura

4 ilustra as principais características estruturais de um vetor de clonagem.

Figura 4. Estrutura molecular de um plasmídeo típico usado em clonagem molecular. O é a

origem de replicação, AmpR é o gene que confere resistência ao antibiótico ampicilina e MSC é ó sítio

de múltipla clonagem.

O conjunto dos sítios de clivagem é denominado de múltiplos sítios de clonagem

(MSC) que permite sua abertura por várias enzimas, a escolha depende do DNA

exógeno. Muitos vetores de clonagem carregam genes que conferem resistência a

diversos antibióticos tais como ampicilina (AmpR), tetraciclina e canamicina. As

células transformadas com tais vetores são capazes de crescer num meio contendo o

Introdução

12

antibiótico, enquanto que as células não tranformadas acabam morrendo. Porém,

existem ainda outras marcas de seleção úteis, as marcas auxotróficas. São

representadas por genes que codificam proteínas cuja síntese é deficiente na célula

hospedeira e que estão envolvidas na síntese de um composto essencial para a seleção

dos clones positivos.

I. 2.4 – Construção do DNA Recombinante

O início do processo de clonagem envolve a construção de vetores contendo os

genes de interesse, denominado construção do DNA recombinante. As construções

gênicas, feitas através de reações enzimáticas que cortam e ligam o DNA em

fragmentos específicos, são geralmente compostas de três partes principais dos genes:

a região promotora, a região codificadora e a região terminal. Cada uma dessas

regiões, no fragmento a ser transplantado, pode ter como origem um organismo

diferente.

Na construção do DNA recombinante a primeira etapa envolve, como descrita

anteriormente, a produção de fragmentos de DNA de origens diferentes com o mesmo

conjunto de extremidades fitas simples, ou seja, a digestão das moléculas de DNA

com a mesma enzima de restrição. Numa segunda etapa, estes dois fragmentos (por

exemplo, provenientes de uma bactéria e de um vegetal) são ligados por renaturação

das regiões de fita simples. Se a ligação for feita com uma enzima, a DNA ligase, após

o pareamento das bases estes fragmentos serão ligados permanentemente.

A Figura 5 mostra uma representação da construção de um DNA Recombinante

com somente um sítio de clivagem para uma determinada enzima de restrição.

Introdução

13

Figura 5. Construção de um DNA recombinante. Uma molécula de DNA híbrida é formada a partir

de fragmentos de diferentes organismos obtidos com o uso de uma mesma enzima de restrição.

Se os fragmentos de DNA vegetal são misturados com os DNAs bacterianos

linearizados previamente, permitindo a ligação entre eles, uma nova molécula de

DNA plasmidial contendo DNA vegetal pode ser gerada. Este é denominado

plasmídeo híbrido e pode ser inserido numa bactéria por transformação. Sendo assim,

o inserto será replicado como se fosse parte integrante do plasmídeo.

I. 2.4.1 – Enzimas DNA Ligases

Algumas bactérias e vírus, como a E. coli e o fago T4, codificam enzimas DNA

ligase capazes de unir fragmentos de DNA contendo extremidades abruptas ou

coesivas. A maior diferença entre elas é que as DNA ligases isoladas de bactérias

requerem moléculas de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) como cofator

Introdução

14

para exercerem suas atividades, enquanto que a isolada do bacteriófago T4 requer

adenosina tri-fosfato (ATP).

Após preparação das duas moléculas de DNA que se pretendem recombinar in

vitro, segue-se o processo de ligação. Sendo o vetor de clonagem e o fragmento de

DNA a clonar tratados com a mesma enzima de restrição, suas extremidades serão

compatíveis e a reação de ligação poderá ocorrer na presença de uma DNA ligase.

Consequentemente, o emparelhamento entre bases complementares por ligações de

hidrogênio também ocorrerá na seqüência.

A ligação é promovida pela ligação covalente (uma ligação fosfodiéster) entre os

dois nucleotídeos das extremidades das duas moléculas. A enzima DNA ligase

catalisa a ligação entre o grupo fosfato ligado ao carbono 5’ e o grupo hidroxila, OH

livre, ligado ao carbono 3’ das moléculas de desoxirribose presentes nos nucleotídeos

que constituem estas moléculas.

Neste passo, pode acontecer que os vetores de clonagem recircularizem,

promovendo uma ligação intramolecular, em vez de haver integração do outro

fragmento de DNA a clonar, resultando no retorno ao processo inicial. Além disso,

pode ainda haver formação de dímeros do vetor sem ligação do fragmento de DNA.

Embora seja relativamente fácil selecionar as colônias que abrigam os vetores de

clonagem utilizando os marcadores de resistência a antibióticos, é muito mais difícil

selecionar o clone que contenha o gene de interesse. Mas existe, no entanto,

estratégias complementares de seleção a fim de minimizar estes problemas

de recircularização do vetor.

A etapa seguinte consiste na transformação das células hospedeiras adequadas

com as moléculas de DNA recombinante (rDNA ou vetor com o DNA exógeno

clonado).

Introdução

15

I. 2.5 – Transformação Bacteriana

I. 2.5.1 – Conceito de Transformação Induzida

O processo de transformação constitui um evento de alta importância na técnica

de manipulação gênica. A transformação natural, descrita por Griffith e Avery, é um

evento raro verificado apenas em determinadas espécies e em condições fisiológicas

específicas. No entanto, em 1970, Mandel e Higa encontraram que a E. coli tornou-se

marcadamente competente para transformação com DNA exógeno, quando a bactéria

foi suspensa em cloreto de cálcio gelado e submetida a um curto choque térmico a 42

ºC (LEWIN, 1997; ZAHA et al., 1996, LEWIN, 1994). Estes mesmos autores também

verificaram que as bactérias crescidas até a fase de crescimento exponencial (fase log)

eram mais competentes do que aquelas isoladas de outros estágios do crescimento.

A eficiência de transformação é geralmente expressa como o número de células

transformadas (geralmente de 105 a 107) obtido a partir de um micrograma de DNA

plasmidial intacto (LEWIN, 1997; LEWIN, 1994). O tamanho e a conformação da

molécula de DNA afetam o processo de transformação. Plasmídeos pequenos são

mais facilmente incorporados pela célula bacteriana competente. DNA linear é

pobremente incorporado pelo fato de talvez sofrer degradação pelas exonucleases

presentes no espaço periplasmático.

I. 2.5.2 – Mecanismos de Captação do DNA

O mecanismo de captação da molécula de DNA pela bactéria competente ainda

é desconhecido. Uma hipótese é que as moléculas do DNA passam através de canais

Introdução

16

situados nas chamadas zonas de adesão, que são locais onde as membranas interna e

externa da célula bacteriana se unem formando poros. Estes poros só estão presentes

durante o crescimento bacteriano na fase log. Em condições naturais, a captação do

DNA torna-se difícil, devido à repulsão eletrostática existente entre as cargas

negativas da camada de fosfolipídeos da membrana bacteriana com a carga negativa

dos grupos fosfato da molécula de DNA. A Figura 6 ilustra esta hipótese para o

mecanismo de captação do DNA por íons Ca2+.

Figura 6. Mecanismo molecular proposto para a transformação de E. coli com uma molécula de

DNA exógeno. Os círculos em vermelho representam os íons Ca2+. Os sinais negativos em rosa são

representações da carga elétrica negativa proveniente de grupos fosfatos carregados presentes nas

membranas celulares das bactérias.

Introdução

17

Quando soluções geladas de cloreto de cálcio são empregadas para incubar as

células bacterianas, a fluidez da membrana celular é cristalizada, estabilizando a

distribuição dos fosfatos carregados. Os íons Ca+2

formam um complexo com os

fosfatos carregados, cobrindo as cargas negativas, facilitando agora a atração

eletrostática com as moléculas do DNA na zona de adesão. O choque térmico

complementa este processo de captação, provavelmente criando um desequilíbrio

térmico entre o interior e o exterior da célula bacteriana, auxiliando o bombeamento

do DNA através da zona de adesão.

I. 2.6 – Detecção e análise dos Clones Recombinantes

Um passo crucial na tecnologia do DNA recombinante é encontrar o clone

correto na mistura de clones que foi criado durante os procedimentos de construção.

Note que, no caso do vetor ser um plasmídeo, milhões de colônias de bactérias

crescidas em placas de Petri contendo ágar deverão ser examinados para a detecção

daquelas colônias que possuam o gene de interesse.

Dentre as marcas de seleção, a presença de genes repórteres é um dos artifícios

mais importantes e frequentemente empregado na escolha de um vetor de clonagem.

Genes repórteres funcionam como marcadores porque fornecem informações quanto

ao sucesso ou não dos experimentos com DNA recombinante.

O gene lacZ é muito utilizado como gene repórter no qual produz uma enzima

chamada β-galactosidase. A presença desta enzima faz com que a colônia da bactéria

que tem em seu interior o plasmídeo contendo este gene seja azul quando colocada na

presença dos compostos químicos isopropil-3-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) e 5-

bromo-4-cloro-3-indoil-b-D-galactosidae (X-Gal). O IPTG induz a produção da

Introdução

18

enzima β-galactosidase que degrada o substrato X-Gal formando um produto colorido,

de cor azul.

Os sítios de restrição das enzimas utilizadas para cortar este tipo de plasmídeo se

localizam exatamente na região onde está o gene que codifica a enzima β-

galactosidase. Quando adicionamos um fragmento exógeno de DNA dentro deste

plasmídeo, introduzindo-o nesta região, o gene que produz a enzima β-galactosidase é

destruído. Sendo assim, as colônias de bactérias que possuírem o plasmídeo com a

essa enzima intacta em seu interior irão produzir colônias azuis, enquanto a colônia de

bactéria que possuir o plasmídeo que teve a β-galactosidase destruída irá produzir

colônias brancas.

Assim, os genes repórteres em adição aos antibióticos também permitem

selecionar as colônias, porém selecionam somente aquelas constituídas por células que

possuam o vetor ligado com o fragmento de interesse inserido, em detrimento das

colônias que possuam o vetor de clonagem tal como ele se apresentava antes do início

da manipulação.

I. 2.6.1 – Seqüenciamento de DNA

O seqüenciamento de DNA é um método de análise dos clones positivos que se

faz necessário para se obter a seqüência completa, ou pelo menos, uma porção do

gene alvo. Sua estratégia envolve a PCR consistindo na capacidade da DNA

polimerase em adicionar um nucleotídeo na extremidade de alongamento de um

oligonucleotídeo copiando uma fita de DNA molde.

Desde a década de 70, o método descrito por Sanger é o mais utilizado para

análise de seqüências de DNA e é conhecido também como método da terminação da

Introdução

19

cadeia (LEWIN, 1997; ZAHA et al., 1996, LEWIN, 1994; STRYER, 1988). No início

dos anos 70, o processo era manual e eram necessários dois anos para seqüenciar 20

pares de bases de DNA. Atualmente, com o desenvolvimento das técnicas de

seqüenciamento automático, um aparelho de seqüenciamento é capaz de seqüenciar

meio milhão de pares de bases por dia (LEWIN, 1997; ZAHA et al., 1996, LEWIN,

1994; STRYER, 1988).

Estas duas versões da técnica diferem entre si basicamente pelos tipos de

dideoxinucleotídeos (ddNTPs) empregados. No seqüenciamento manual, os ddNTPs

são marcados com radiação; já no seqüenciamento automático são marcados com

compostos fluorescentes. Na técnica manual se faz necessário uma autoradiografia

para a leitura da seqüência do DNA e na técnica automática um equipamento provido

de um laser é necessário para detectar os ddNTPs fluorescentes e permitir a leitura

direta da seqüência.

I. 2.6.1.1 – Seqüenciamento Manual

O seqüenciamento de DNA descreve a clonagem dos fragmentos de DNA de

interesse em vetores apropriados como os da série M13mp os quais têm sido

largamente utilizados para esta finalidade. A reação de seqüenciamento pelo método

de Sanger consiste na hibridização de um oligonucleotídeo sintético com uma região

conhecida do vetor M13mp, imediatamente adjacente ao inserto a ser seqüenciado. A

seguir, a síntese da fita complementar, pela enzima DNA polimerase, é promovida na

presença de uma mistura de dideoxinucleotídeos (ddNTPs) marcados com 32P ou 35S e

desoxirribonucleotídeos (dNTPs).

Introdução

20

A Figura 7 ilustra uma representação do método manual de seqüenciamento de

DNA.

Figura 7. Seqüenciamento de DNA pelo método de Sanger. Os dideoxinucleotídeos representados

como ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP são os compostos 5’-desoxiadenosina trifosfato, 5’-

desoxicitosina trifosfato, 5’-desoxiguanina trifosfato e 5' -desoxitimina trifosfato, respectivamente.

Neste processo são realizadas quatro reações independentes, sendo que em cada

uma delas é adicionado um tipo de ddNTP. Em cada reação, um número muito grande

de moléculas de fita complementar é produzido simultaneamente. A hidroxila 3’ (3'

OH) do oligonucleotídeo reage com um dNTP formando uma nova ligação

fosfosdiéster. No entanto, em um dado momento da extensão, uma pequena

porcentagem de moléculas irá incorporar um ddNTP e neste caso a reação de

alongamento da cadeia será automaticamente interrompida naquele sítio, devido à

ausência do grupamento 3' OH do ddNTP. Por outro lado, em outras moléculas a

Introdução

21

reação de extensão continua a ocorrer até que um ddNTP seja incorporado. Sendo

assim, em cada uma das quatro reações, haverá fragmentos de todos os tamanhos

sendo que todos eles têm início comum, ou seja, adjacente ao iniciador.

Uma vez terminadas as reações de extensão, os fragmentos recém sintetizados

são separados em gel desnaturante de poliacrilamida e em seguida

autoradiografados.Como este tipo de gel apresenta alto poder de resolução é possível

através da sua auto-radiografia, visualizar cada um dos fragmentos sintetizados como

uma banda específica.

I. 2.6.1.2 – Seqüenciamento Automático

O desenvolvimento e a utilização de seqüenciadores automáticos tornaram mais

rápido e eficiente o seqüenciamento de DNA na medida em que as etapas de leitura do

gel e o processamento de sequências são realizados através de computadores. Assim,

o surgimento e a utilização de seqüenciadores automáticos foi o maior benefício

alcançado com o desenvolvimento da técnica.

Em concordância com as técnicas manuais, a reação de seqüenciamento é

também realizada através do método de Sanger. Entretanto, devido aos ddNTPs serem

marcados com fluoróforos ao invés de isótopos radioativos, os fragmentos de DNA

são detectados através de fluorescência induzida a laser. Quatro diferentes fluoróforos

são empregados e uma vez excitados por um feixe de laser emitem luz em diferentes

comprimentos de onda. É possível marcar com estes fluoróforos o primer universal

M13mp ou então, cada um dos ddNTPs. Assim, uma vez que em cada uma das

reações foi empregado um fluoróforo diferente é possível juntar estes produtos numa

só reação e realizar a corrida em uma única raia do gel de seqüenciamento. Os

Introdução

22

produtos da reação de seqüenciamento, marcados com os fluorocromos, ao serem

submetidos à eletroforese passam pelo feixe de laser, que promove a excitação dos

fluorocromos. A luz emitida pelos fluoróforos é detectada por um fotomultiplicador e

a informação é processada através de um computador.

I. 3 – Expressão de Proteínas Heterólogas

Grande parte dos esforços despendidos na expressão de proteínas heterólogas,

visando obtê-las em quantidade adequada para estudos funcionais e estruturais

posteriores, se concentra na experimentação de sistemas de expressão alternativos,

incluindo bactérias, leveduras, células de insetos e mamíferos; e no uso de proteínas

de fusão como facilitadoras do enovelamento e purificação de proteínas

recombinantes. A expressão destas proteínas permitiu uma abordagem poderosíssima

que vem revolucionando os estudos de estrutura, função, purificação e identificação

de novas proteínas.

O sistema mais comumente utilizado para expressão de proteínas heterólogas é o

que utiliza E. coli como célula hospedeira (LEWIN, 1997; ZAHA et al., 1996,

LEWIN, 1994; STRYER, 1988). Este sistema é amplamente difundido devido à

facilidade e baixo custo de se cultivar esta bactéria e pela reprodutibilidade e

abundância de proteínas que a mesma produz. Além disso, modificações nos vetores e

linhagens de E. coli são freqüentemente feitas no sentido de aumentar a eficiência e

versatilidade do sistema original.

De maneira ideal, quando se pensa em expressão heteróloga, espera-se que a

proteína de interesse seja estável, não tóxica para a bactéria, solúvel, expressa em

grande quantidade e possa ser facilmente purificada. Um procedimento muito

Introdução

23

utilizado é o de expressar a proteína de interesse em fusão com uma pequena

seqüência de aminoácidos específicos (“tag”) que permita sua fácil purificação através

de cromatografia por afinidade em resinas às quais se encontram acoplada moléculas

ligantes, permitindo que a tag possa se ligar especificamente. A coluna reterá a

proteína de fusão até que os sítios ligantes sejam liberados pela mesma frente à

passagem de compostos cujos grupamentos apresentem maior afinidade por estes

sítios. Um exemplo do procedimento para a obtenção da proteína híbrida através da

clonagem em vetores é dado na Figura 8.

(b)

Figura 8. Expressão e purificação de uma proteína recombinante com tag de seis histidinas. a)

Esquema ilustrando os passos da expressão em vetor pET28a e purificação da proteína recombinante;

b) Gel de poliacrilamida de frações da expressão e purificação. (1) extratos de células não induzidas,

(2) extratos de células induzidas e (3) fração eluída contendo a proteína recombinante purificada.

A produção de proteínas híbridas é geralmente muito simples, bem como,

eficiente e de baixo custo financeiro podendo suprir imediatas necessidades da

Introdução

24

pesquisa básica, tais como, produção de anticorpos, sondas em experimentos variados

e para estudos funcionais e estruturais da proteína expressa. Permite, também, a

expressão em grande escala, para fins industriais ou clínicos de enzimas, hormônios e

anticorpos quando a atividade da proteína é preservada.

É importante mencionar que a situação ideal exposta acima nem sempre é

atingida. Algumas proteínas produzidas em bactérias têm a sua atividade biológica

plenamente recuperada, porém outras são inativas. Assim como, podem ser insolúveis,

tóxicas para a célula hospedeira, expressas em baixos níveis, formar agregados

extremamente insolúveis mesmo na presença de agentes desnaturantes, ou até mesmo

interagir com a sua fusão inibindo-as de se ligar à resina de afinidade e tornando a

purificação menos eficiente. Nestes casos, procedimentos para atenuar estes

problemas devem ser bem estudados a fim de empregá-los convenientemente e não

comprometer a pesquisa científica das proteínas de interesse.

Uma vez que a expressão de proteínas heterólogas provenientes da manipulação

de genes específicos representa a última etapa da relevante tecnologia do DNA

recombinante, o subseqüente estudo bioquímico destas proteínas pode elucidar as

diversas interações entre organismos vivos e patógenos. Visando enfocar isto e

sabendo das possíveis similaridades entre enzimas de diferentes organismos em

termos de função biológica, a literatura descrita a seguir servirá como base para o

conhecimento do fitopatógeno Xylella fastidiosa e de algumas de suas proteínas

metabólicas depositadas em seu respectivo banco de dados. A análise de enzimas de

uma bactéria de crescimento lento como a Xylella fastididosa representa não só um

desafio, mas também uma contribuição dos estudos monitorados por conceituados

pesquisadores envolvidos no Projeto Genoma/Onsa da FAPESP de 1998.

Introdução

25

I. 4 – Bactéria Xylella fastidiosa

A bactéria Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) (PURCELL, et al.; 1996) pertence

ao grupo das bactérias gram-negativas, restrita aos vasos xilemáticos das plantas. Sua

colonização provoca o bloqueio dos vasos obstruindo a passagem de água e nutrientes

das raízes para a copa das plantas, gerando estresse híbrido e impedindo o

desenvolvimento vegetal. É transmitida e disseminada para as plantas hospedeiras

através de insetos vetores como a cigarrinha das famílias Cicadellidae e Cercopidae,

que se alimentam da seiva bruta das plantas (MEIDANIS, 2002; HARTUNG, 1994).

São estritamente aeróbicas e não fermentativas, não halofíticas, apigmentadas, com

temperatura ótima de desenvolvimento de 26 a 28 oC e pH ótimo de 6,5 a 7,0.

Possuem dimensões de 0,25 a 0,35 µm de largura por 0,9 a 5,0 µm de comprimento e

apresentam ondulações na parede celular que podem estar envolvidas no

reconhecimento do hospedeiro pelo patógeno (PURCELL, et al.; 1996)

A X. fastidiosa foi primeiramente relatada em 1987 nos Estados de São Paulo e

Minas Gerais, afetando pomares com variedades de laranja doce. A clorose variegada

dos citros (CVC), conhecida como amarelinho, é uma doença causada por esta

bactéria e atinge todas as variedades de citros comerciais. A doença é amplamente

distribuída em todas as regiões de produção de citros no Brasil, principalmente no

estado de São Paulo, onde sua difusão ocorreu de forma extremamente rápida. As

plantas cítricas afetadas pela CVC mostram inicialmente, na parte mediana e superior

da copa, folhas amareladas com sintomas de deficiências nutricionais e frutos

reduzidos, endurecidos, persistentes, com amarelecimento precoce e lesões pardas na

casca, imprestáveis para o comércio. Além disso, danosas conseqüências aos

Introdução

26

equipamentos de extração do suco são provocadas por estes frutos (PURCELL, et al.;

1996).

Numerosas espécies de plantas são colonizadas pela X. fastidiosa sem provocar

sintomas. Freitag (PURCELL et al., 1996) demonstrou que mais de 100 espécies de

plantas arbóreas apresentam esta bactéria. Estas plantas não apenas suportam vastas

populações de vetores, mas também foram excelentes fontes da bactéria, o que explica

porque a remoção de videiras afetadas foi de limitado valor na prevenção da

propagação da doença nos vinhedos da Califórnia e Flórida (PURCELL, et al.; 1996).

Além dos citros, X. fastidiosa causa doenças em diversas plantas de importância

econômica como cafeeiro (Coffea arabica L., PURCELL et al., 1996; HARTUNG et

al., 1994), ameixeira (Prunus salicina Lindl. PURCELL et al., 1996; HARTUNG et

al., 1994), videira (Vitis vinifera L.), hibisco (Hibiscus schizopetalus, PURCELL et

al., 1996; HARTUNG et al., 1994), seringueira (Hevea brasiliensis, PURCELL et al.,

1996; HARTUNG et al., 1994) e em várias espécies florestais (AZEVEDO et al.,

2000). Fica evidente que a gama de hospedeiros deste fitopatógeno é grande e diversa.

A interação patógeno-hospedeiro pode ser analisada sob aspectos morfológicos,

genéticos, bioquímicos ou moleculares, isoladamente ou em conjunto. Independente

da abordagem é clara a importância dos fatores que delimitam a colonização do tecido

hospedeiro por estas bactérias e como eles vivem neste ambiente. Uma grande parcela

destes fatores é formada pelas proteínas produzidas por elas onde, as enzimas exercem

funções cruciais, dependente de cada interação no desenvolvimento do patógeno e,

conseqüentemente, no surgimento dos sintomas no hospedeiro. Desta forma, a

descrição de alguns aspectos interessantes sobre função, classificação e uso destes

tipos de enzimas se faz necessário para caracterizá-las adequadamente.

Introdução

27

I. 4.1 - Proteínas de Xylella fastidiosa

A determinação experimental das seqüências primárias seguidas de suas

subseqüentes comparações com seqüências protéicas depositadas no banco de dados

público SWISSPROT (Lausanne, Suíça), permitiram durante o projeto genoma

caracterizar diversas proteínas como sendo de prováveis funções conhecidas. Dentre

elas, três proteínas apresentando homologias com a de outros organismos foram

denominadas prováveis enzimas hidroxinitrila liase (HNL), corismato sintase (CS) e

proteínas D da via de transporte e secreção Tat (TatD), potencialmente envolvidas na

interação planta-patógeno.

I. 4.1.1 - Hidroxinitrila Liase

A habilidade de organismos vivos em produzir ácido cianídrico (HCN) é

denominada cianogênese. Apesar de muito estudada em plantas, pode ser encontrada

também em bactérias, fungos e insetos.

Fontes de HCN foram identificadas em aproximadamente 300 espécies de

plantas como sendo glicosídeos cianogênicos e cianolipídeos denominados

precursores cianogênicos e que, em sua maioria, são derivados de cinco aminoácidos:

a L-fenilalanina, L-tirosina, L-valina, L-isoleucina e L-leucina. Os precursores mais

comuns são as cianohidrinas (definidas quimicamente como glicosídeos de α -

hidroxinitrilas). O HCN não é produzido livremente na maioria das plantas, porém é

liberado por precursores cianogênicos como resultado de uma ação enzimática. A

Figura 9 ilustra o mecanismo enzimático de precursores cianogênicos até a liberação

de ácido cianídrico.

Introdução

28

OH

OO

OOH

OHOH

OH

OHOH

CNO CNOH O H

+ CH N

Glicosídeo Cianogênico Amigdalina

Mandelonitrila Benzaldeído

Hidroxinitrila Liaseβ - glicosidase

açúcar1 __ açúcar2

Figura 9. Mecanismo enzimático de glicosídeos cianogênicos. O grupo açúcar em um glicosídeo

cianogênico é normalmente uma D-glucose.

Quando a integridade celular dos tecidos de plantas é afetada por ataque de

fungos, herbívoros ou ainda mecânico, os chamados precursores cianogênicos

(glicosídeos e cianolipídeos) entram em contato com enzimas β - glicosidases e são

hidrolisados e dissociados a cianohidrinas. As cianohidrinas, por sua vez, são clivadas

a HCN e ao correspondente aldeído ou cetona, sob ação de outra enzima catabólica

chamada α - hidroxinitrila liase (HNL).

As HNLs estão naturalmente envolvidas no passo final da biodegradação de

glicosídeos cianogênicos nas células de diversas espécies de plantas de diferentes

origens filogenéticas. Como todas as reações enzimáticas envolvidas na cianogênese

são reversíveis, as HNLs podem ser utilizadas também na formação de cianohidrinas.

As HNLs de diferentes famílias de plantas representam uma nova classe de

enzimas que originam da evolução independente de diferentes precursores de

proteínas. De fato, a falta de identidade seqüencial associada à seqüência de

aminoácidos de recentes HNLs clonadas enfatiza esta idéia, embora algumas

Introdução

29

apresentem nenhuma ou limitada identidade seqüencial a outras proteínas conhecidas.

Um exemplo disto é a HNL de Sorghum bicolor que possui identidade seqüencial

surpreendente com uma enzima serina carboxipeptidase, especialmente com aquelas

de trigo. Alguns sítios de importância funcional nas carboxipeptidases são

conservados, como exemplo, motivos de N-glicosilação, resíduos da tríade catalítica

(sítio ativo) e de cisteína.

As HNLs podem ser classificadas de acordo com diferentes propriedades

enzimáticas tais como especificidade a substratos (R) ou (S) e independência ou não

de coenzimas (FAD - flavina-adenina dinucleotídeo), representando a classificação

bioquímica dessas enzimas.

I. 4.1.1.1 - Enzimas dependentes de FAD

Enzimas HNLs que possuem grupos prostéticos FAD (moléculas não protéicas)

ligados próximo ao seu sítio catalítico são denominados hidroxinitrila liases

dependentes de FAD. Estas enzimas foram isoladas de monocotiledôneas da espécie

Rosaceae nas subfamílias Prunoideae e Maloideae.

Elas são glicoproteínas de cadeia longa com massa molecular variando de 50 a

80 kDa, contendo mais de 30% de carboidratos ligados à mesma por ligação N-

glicosídica. Hidroxinitrila liases dependentes de FAD encontradas no gênero Prunus

amygdalus são formadas por uma única subunidade e existem em pequenas isoformas

diferentes, originadas de variações na sua estrutura primária e/ou do seu conteúdo

carboidrato heterogêneo.

Apresentam pontos isoelétricos variando de 4,2 a 4,8 e possuem como substrato

natural a (R)-(+)-mandelonitrila que é derivada dos glicosídeos cianogênicos (R)-

Introdução

30

prunasina ou amigdalina. Sua forma ativa contém FAD ligado não covalentemente

próximo ao seu sítio ativo, apresentando um espectro de absorção típico com máximos

na região 380-390 e 460-480 nm. Estas enzimas estão presentes em concentração

relativamente alta nos tecidos de grãos e sementes, necessitando de 5 a 10

purificações para alcançar alto grau de homogeneidade. A região codificadora de

proteínas (ORF – “open reading frame”) em Prunus amygdalus codifica polipeptídeos

de 61 kDa (563 aa) que é preservada pela remoção de uma seqüência sinal N-terminal

de 27 aminoácidos (aa), levando a uma hidroxinitrila liase madura de 58 kDa (sem

carboidrato) (ASANO et al., 2005).

I. 4.1.1.2 - Enzimas independentes de FAD

As hidroxinitrila liases independente de FAD são mais heterogêneas e foram

isoladas de diferentes famílias de grupos taxonômicos de monocotiledôneas e

dicotiledôneas de Poaceae, Euphorbiaceae, Linaceae, Filitaceae e Olacaceae. Elas

diferem entre si no conteúdo de carboidratos, em massa molecular, na estrutura

primária, bem como em suas subunidades de polimerização. Além disso, elas não

estão relacionadas às HNLs dependentes de FAD a nível de seqüência de aminoácidos

e de sua superfície estrutural antigênica. Em geral, as HNLs deste grupo possuem

caráter mais ácido com pontos isoelétricos variando de 3,9 a 4,6 e necessitam de 100 a

1500 purificações para se tornar homogênea (ASANO et al., 2005; FECHTER et al.,

2004; HICKEL et al., 1996; WAJANT et al., 1996).

Dentre as HNLs pertencentes a este grupo as mais estudadas são de Sorghum

bicolor, Manihot esculenta e Hevea brasiliensis. HNLs da família Poaceae, isolada da

espécie Sorghum bicolor apresentam massa molecular de 105 kDa, do qual, 7% é

Introdução

31

carboidrato N-ligado. São dímeros que apresentam conformação heterotetramérica

essencial para sua atividade enzimática. In vivo, apresentam conformações homo ou

heterodíméricas. Possuem como substrato natural a p-hidroxi-(S)-mandelonitrila que é

derivada do glicosídeo cianogênico (S)-dhurrin. Já as HNLs da família

Euphorbiaceae, isoladas das espécies Manihot esculenta e Hevea brasiliensis são

proteínas não glicosiladas com uma subunidade de massa molecular 30 kDa e

conformação natural homoligomérica; apresentando identidade de 75% da sua

estrutura primária com outras proteínas já identificadas da mesma família. Seus

substratos naturais são acetato de cianohidrina e cianohidrina 2-butanona (descrita

somente para a HNLs isolada de Manihot esculenta) derivadas dos glicosídeos

cianogênicos linamarina e (R)-lotaustralina, respectivamente.

Baseado nas características bioquímicas das diferentes hidroxinitrila liases já

isoladas por diversos pesquisadores, observou-se ainda que, para garantir o

mecanismo enzimático ou a atividade enzimática das HNLs dependentes de FAD, se

faz necessário a presença de uma serina, uma cisteína e um cofator FAD no meio

reacional; já para HNLs independentes de FAD, estruturas α,β-hidrolases com tríades

catalíticas (formada por três aminoácidos Ser/Asp/His sendo a serina nucleofílica) são

enzimaticamente essenciais. A função dos grupos prostéticos FAD não foi ainda bem

esclarecida, porém, alguns estudos sugerem que eles são essenciais para manter a

estrutura conformacional total da molécula ativa.

A mais relevante aplicação das enzimas HNL está na síntese orgânica

enantioseletiva de compostos ativos utilizados extensivamente nas indústrias

farmacêutica, química e de cosmético. As HNLs são utilizadas como biocatalisadores

industriais para a síntese de cianohidrinas quirais através da reação enzimática reversa

que elas catalizam a partir de HCN e aldeídos ou cetonas. As cianohidrinas quirais são

Introdução

32

compostos essenciais necessários na obtenção dos ativos empregados na fabricação de

antibióticos, broncodilatadores, inseticidas, germicidas e cosméticos em geral

(SHARMA et al., 2005; ASANO et al., 2005; FECHTER et al., 2004; HICKEL et al.,

1996; WAJANT et al., 1996).

I. 4.1.2 – Corismato Sintase

Em plantas e microrganismos, todos os compostos aromáticos chaves envolvidos

no mecanismo primário, incluindo os três aminoácidos aromáticos encontrados em

proteínas, são produzidos pela via do chiquimato ou do ácido chiquímico. A via do

chiquimato é essencial em algas, plantas superiores, bactérias e fungos, porém ausente

em mamíferos, porque estes últimos dependem destes compostos para sua dieta.

A bactéria X. fastidiosa é capaz de sintetizar uma ampla variedade de cofatores

enzimáticos e grupos prostéticos, alguns deles necessários e essenciais à via do

chiquimato, incluindo biotina, ácido fólico, pantotenato e coenzima A, ubiquinona,

glutationa, tireodoxina, glutaredoxina, riboflavina, mononucleotídeo flavina (FMN),

dinucleotídeo flavina-adenina (FAD), nucleotídeos pirimidínicos, porfirina, tiamina,

5-fosfato piridoxal (PLP) e lipoato.

A via metabólica do chiquimato consiste de sete enzimas que catalisam a

conversão seqüencial de eritrose-4-fosfato e fosfoenolpiruvato à corismato(KITZING

et al., 2005; HERRMANN et al., 1999; MACHEROUX et al.; SPRINSON et al.,

1964). A Figura 10 ilustra a via do chiquimato completa.

Introdução

33

Figura 10. Via do chiquimato. As enzimas descritas tratam-se das enzimas 2-ceto-3-desoxi D-

arabinoeptulosonato-7-fosfato sintase (DAHP sintase), desidroquinato sintase (DHQ sintase), 3-

desidroquinato desidratase (DHS desidratase), chiquimato desidrogenase (SHK desidrogenase),

chiquimato sintase (S3P quinase), 5-enolpiruvil chiquimato-3-fosfato sintase (EPSP sintase) e

corismato sintase (CS sintase).

Todos os intermediários da via podem ser considerados compostos importantes

porque podem servir como substratos para outros caminhos metabólicos. A

organização molecular e estrutural das enzimas da via do chiquimato varia

consideravelmente entre grupos de microorganismos. As bactérias possuem sete

polipeptídeos individuais, cada um possuindo uma única atividade enzimática, nos

quais são codificados por genes separados. Plantas têm um arranjo molecular similar

ao de bactéria, isto é, as enzimas são codificadas por genes separados, com exceção da

DHQ e a DHS, que são domínios separados de um polipeptídeo bifuncional. Grande

parte das enzimas de plantas, embora codificadas no núcleo, é ativa no cloroplasto e

possuem uma seqüência N-terminal transitória. Em contraste, todos os fungos

possuem corismato sintases monofuncionais e um polipeptídeo pentafuncional

chamado AROM. O polipeptídeo AROM tem domínios análogos às enzimas

bacteriais: DHQ, EPSP, S3P, DHQ e SHK.

Introdução

34

O corismato é convertido, por cinco enzimas distintas, aos metabólitos

intermediários prefenato, antranilato, aminodeoxicorismato, isocorismato e p-

hidroxibenzoato (KITZING et al., 2005; HERRMANN et al., 1999; MACHEROUX

et al.; SPRINSON et al., 1964). A Figura 11 apresenta a rota para obtenção destes

metabólitos intermediários e consequentemente os aminoácidos, ácidos e vitaminas.

Figura 11. Destino do corismato a partir da via do ácido chiquímico e os produtos finais

correspondentes. Os metabólitos intermediários são essenciais para a viabilidade do organismo.

Estes metabólitos compreendem os primeiros intermediários na biosíntese da

fenilalanina (Phe), Tirosina (Tyr), triptofano (Trp), folato, menaquinona e os

sideróforos enterobactina e ubiquinona, respectivamente. A síntese destes precursores

é em muitos casos altamente regulada. Entre os muito metabólitos aromáticos

Introdução

35

secundários estão os flavonóides, muitas fitoalexinas, indol acetato, alcalóides (como

morfina), protetores de luz UV e o mais importante, lignina.

I. 4.1.2.1 – Biosíntese de Aminoácidos Aromáticos

Na bíossíntese dos aminoácidos aromáticos, Phe, Tyr e Trp, os precursores

essênciais iniciais são o fosfoenolpiruvato e a eritrose-4-fosfato. Sua condensação

forma o 2-ceto-3-desoxi-D-arabinoheptulosonato-7-fosfato, um composto de sete

carbonos que se torna cíclico e é convertido a chiquimato que dará origem ao

corismato, o precursor comum dos aminoácidos aromáticos. O corismato é

transformado em prefenato por meio de uma mutase. O prefenato sofre uma

desidratação e depois é descarboxilado originando o fenilpiruvato que é transaminado

formando a fenilalanina. O prefenato pode, ainda, sofrer uma descarboxilação

oxidativa formando p-hidroxi fenilpiruvato. O p-hidroxi fenilpiruvato é então

transaminado formando a tirosina.

Os mamíferos sintetizam a tirosina através da hidroxilação da fenilalanina. A

glutamina cede uma amina de sua cadeia lateral para o corismato, esta reação libera

piruvato e forma o antranilato. O antranilato se condensa com o PRPP (fosforribosil

pirofosfato) formando o N-5-fosforribosil antranilato. Este composto sofre então um

rearranjo, uma desidratação e uma descarboxilação gerando o indol 3-glicerol fosfato.

O indol 3-glicerol fosfato reage com a serina formando o triptofano e liberando

gliceraldeído 3-fosfato. A triptofano sintase é a enzima que catalisa as duas reações

finais da biossíntese do triptofano. Sua estrutura é um tetrâmero α2β2. A subunidade

α cliva o indol-3-glicerol fosfato em indol e gliceraldeído-3-fosfato. A subunidade β

une o indol com a serina para formar o triptofano. O indol é uma molécula hidrófoba

Introdução

36

que pode atravessar a membrana e ser perdido da célula. A triptofano sintase possui

um canal que liga suas subunidades catalíticas permitindo que o indol seja difundido

através da enzima, ou seja, o indol formado não sai da enzima quando a serina está

presente e as duas reações parciais são coordenadas. Este processo é chamado de

canalização do substrato e é extremamente vantajoso, pois assim, além de aumentar

mais de 10 vezes a taxa catalítica global, ele previne a perda de um intermediário da

síntese do triptofano.

Enzimas da via do chiquimato são alvos atrativos para o desenvolvimento de

drogas como as contra a tuberculose, no entanto, alguns novos inibidores para as

enzimas da via do chiquimato têm alta especificidade para enzimas de X. fastidiosa,

uma vez que elas também estão presentes em plantas.

I. 4.1.3 – Proteína D do Sistema de Transporte e Secreção Tat

Os sistemas de transporte e secreção são encontrados em várias bactérias,

fitopatógenos, patógenos humanos e microrganismos simbiontes. Como o próprio

nome diz, sistemas de transporte e secreção exercem a função de transportar para fora

da célula (meio extracelular) através das membranas, diversas proteínas sintetizadas

em seu interior cujas funções são extremamente específicas.

Fisiologicamente, algumas bactérias classificadas como gram-positivas possuem

apenas um espaço intracelular denominado citoplasma sendo limitado por uma única

membrana. Já outras, as gram-negativas, possuem o periplasma além do citoplasma,

localizado entre duas membranas, uma interna e outra externa. Aqui residem as

diferenças na exportação de proteínas através de membranas. Algumas proteínas

exportadas das bactérias gram-negativas permanecem no periplasma, mas outras

Introdução

37

atravessam as duas membranas, sendo secretadas para fora das células. A bactéria

gram-negativa E. coli, em particular, não faz bem a secreção para fora da célula, e

muitas proteínas que são exportadas em outras espécies gram-negativas, quando tem o

gene inserido em E. coli, são transportadas no máximo até o espaço periplasmático,

mas não além dessa região.

O mecanismo de transporte e secreção de proteínas em bactérias gram-negativas

é nas últimas duas décadas, um campo de grande pesquisa com o intuito de verificar a

virulência destes organismos e a produção de enzimas de interesse (FILLOUX et al.,

1998; SARGENT et al., 1998). Estas bactérias são capazes de secretar enzimas

degradativas e toxinas diretamente envolvidas nos processos infecciosos para o meio

ambiente ou diretamente para o citoplasma da célula hospedeira/alvo. A produção

destas enzimas está envolvida na aquisição de substratos, degradação da parede

celular das plantas ou tecido animal e no efeito tóxico de alguns compostos

ocasionando a morte de células alvos.

A maioria das bactérias gram-negativas apresenta um mecanismo comum de

secreção via periplasma (FILLOUX et al.; 1998; SARGENT et al., 1998). Esse

mecanismo envolve um processo com dois passos: primeiro, as proteínas são

transferidas através da membrana citoplasmática, via um mecanismo dependente de

uma seqüência sinal. O segundo passo é a transferência através da membrana externa,

um processo que envolve funções que podem ser específicas para proteínas

individuais ou em grupos (FILLOUX et al.; 1998; SARGENT et al., 1998).

Um total de 140 genes que codificam proteínas relacionadas com o transporte foi

identificado no genoma de X. fastidiosa, representando 4,8 % de todos os genes

codificando para proteínas e estão incluídos em dois sistemas de transporte: sistemas

gerais de secreção ou Sec dependente e sistema Tat (FILLOUX et al.; 1998;

Introdução

38

SARGENT et al., 1998). Estes genes referem-se a transportes de ânions, cátions,

carboidratos, peptídeos, proteínas e de substâncias relacionadas com as vias de

secreção.

A maquinaria de sistemas gerais de secreção envolve a translocação de proteínas

em conformação estendida nas quais são freqüentemente ligadas a outras proteínas

que previnem seu enovelamento antes de serem exportadas. Proteínas como

fotossintéticas e de cadeias respiratórias alternativas (anaeróbicas, por ex.) produzidas

dentro das células e que estão envolvidas no metabolismo energético, necessitam de

ser translocadas associadas à cofatores. Essas proteínas já adquirem uma configuração

terciária ao se ligarem aos cofatores no citoplasma, e conseqüentemente necessitam de

um canal especial na célula, que é designado por sistema Tat (“Twin Arginine

translocation”). Dentre os cofatores possíveis, incluem-se íons cobre, enxofre, ferro,

níquel e nicotinamida adenina dinucleotídeo-fosfato (NADP). A maioria das bactérias

possui esta via de secreção e é totalmente distinta das outras vias de secreção

(WEINER et al., 1998; SARGENT et al., 1998).

Proteínas da via Tat recebem este nome devido seus precursores serem lançados

para a via através de um peptídeo sinal localizado na zona N-terminal da proteína

reconhecível por uma seqüência conservada (S/T)RRxFLK que inclui dois resíduos

consecutivos de arginina (R). Os resíduos de arginina são invariantes em proteínas

desta via sendo que os outros resíduos ocorrem com freqüência de 50% nas proteínas

já descritas. O que mais distingue estes peptídeos sinal dos convencionais é que estes

possuem muitas vezes cargas positivas nas regiões hidrofóbicas e regiões N-terminais

mais compridas do que o normal. Mas, a característica mais pronunciada da via Tat é

que ela funciona para transportar proteínas enoveladas de dimensões variadas através

da membrana citoplasmática.

Introdução

39

A Figura 12 mostra dois arranjos propostos para proteínas pertencentes ao

sistema Tat.

A)

B)

Figura 12. Previsões topológicas derivadas das seqüências previstas para os genes do sistema Tat.

A) Imagem da microscopia eletrônica e modelo do complexo TatABC purificados da bactéria

Streptomyces coelicolor (Sargent et. al., 1998). B) Modelo para as proteínas de translocação Tat de E.

coli. Em ambos os organismos, somente as proteínas Tat C apresentam suas extremidades N- e C-

terminais localizados no citoplasma.

Introdução

40

As proteínas destes sistemas são classificadas como proteínas transportadoras do

tipo ABCDE. São comumente denominadas TatA, TatB, TatC, TatD e TatE. O canal

de passagem das proteínas a serem excretadas é majoritariamente composto por TatA.

Transportadores do tipo ABE (“ATP-binding cassete”), em sua maioria, estão

geralmente reunidos na formação de um único canal e envolvidos no transporte

transmembranar de substratos com consumo de ATP. Os transportadores do tipo C

estão envolvidos no transporte de proteínas dependentes do pH. Já transportadores do

tipo D existem, mas não se sabe qual ou quais são suas funções até o momento.

Somente sabe-se que eles são proteínas citoplasmáticas e não estão fazem o papel de

interação direta com a membrana.

Conceitualmente, o transporte dependente de sistemas Sec é mais rápido ou de

menor custo energeticamente para a célula do que sistemas Tat. Porém, a preferência

da bactéria por um sistema ou outro depende das velocidades relativas e da

conformação das proteínas que necessitam ser secretadas.

I. 5 – Objetivos e Perspectivas

Através da análise por microarranjos de DNA foram observados 23 genes

diferencialmente expressos da X. fastidiosa quando presente em plantas de citros com

sintomas de CVC comparado com plantas de citros sadias. Desses, três genes estão

envolvidos na patogenicidade e distribuídos segundo as diferentes categorias

funcionais especificadas durante a anotação do Projeto Genoma da X. fastidiosa

(http://unicamp.lbi.ic.unicamp.br/xf). É importante mencionar que as funções

atribuídas as estes genes foram baseadas apenas por identidade seqüencial com

proteínas de funções conhecidas de outros organismos.

Introdução

41

Com base no projeto genoma e na literatura (SIMPSON et al., 2000), os genes

AroC e HNL depositados no banco de dados desta bactéria apresentam fortes indícios

de que são importantes sustentadores da sua colonização, adaptação e patogenicidade

no hospedeiro. Além disso, por terem sido expressos em grande quantidade pela

bactéria em diversas condições são também possíveis grandes alvos biotecnológicos

podendo ser aplicados na produção de pesticidas, cosméticos e fármacos.

Entre as proteínas hipotéticas conservadas, a HNL especificamente identificada

como potencialmente envolvida num processo de detoxicação contra o HCN liberado

pela planta será especialmente caracterizada e priorizada em termos estruturais a fim

de permitir sua manipulação futura no desenvolvimento de possíveis moléculas

inibidoras ou silenciadores do gene que a codifica.

Com as HNLs envolvidas em processos de liberação de toxinas e sendo

possíveis alvos diretos de enzimas das vias de secreção e transporte, a similaridade de

uma terceira proteína, também expressa diferencialmente com enzimas do tipo D da

via Tat, fomentou a investigação desta, principalmente por não haver na literatura

trabalhos que estudem a função deste tipo de proteína.

Acreditamos que a presença de genes com alta similaridade às enzimas liases,

corismato e de transporte e secreção conhecidas de outros organismos, fornecem

material enzimático adequado que contribui muito para seu metabolismo,

permanência e conseqüente degradação dos componentes celulares na planta

hospedeira. O conjunto das potencialidades enzimáticas previstas para estas proteínas

estimulou, em nosso grupo, a pesquisa com a X. fastidiosa, principalmente porque

poderá contribuir na aplicabilidade individual de cada uma na área biotecnológica

Assim, os objetivos gerais do presente trabalho foram: clonar, expressar, purificar e

Introdução

42

elucidar as propriedades físico-químicas e estruturais das enzimas de X. fastidiosa

obtidas através da propagação em E. coli.

Neste intuito, as seguintes etapas foram desenvolvidas no referente trabalho:

1- Expressão e purificação das proteínas de interesse. Obtenção das proteínas

de interesse a partir das principais ferramentas da biologia molecular (extração,

quantificação e reações de amplificação do DNA genômico, purificação dos

fragmentos, clonagem em vetores de expressão, seleção dos clones, expressão do

produto de PCR, verificação da expressão), bem como da bioinformática (construção

de primers, alinhamento e caracterização da seqüência protéica obtida frente a

proteínas já descritas na literatura/banco de dados), que servirão como ferramenta

essencial no esclarecimento das etapas envolvidas na identificação das proteínas e na

elucidação do funcionamento e da interligação das diversas vias metabólicas.

2- Caracterização das proteínas de interesse. Esta etapa envolve: separação,

purificação, e determinação do peso molecular das proteínas por cromatografia de

exclusão por tamanho, cromatografia de afinidade e SDS-PAGE; determinação do pI

por focalização isoelétrica; medida de concentração através da espectrofotometria por

absorção UV-VIS; caracterização das diferenças estruturais e identificação de

alterações conformacionais por fluorescência, dicroísmo circular e SAXS; análise das

seqüências através espectrometria de massas e, finalmente, ensaios enzimáticos a fim

de determinar a atividade enzimática das proteínas em estudo.

A biocaracterização, ou caracterização bioanalítica destas proteínas

recombinantes, nunca antes isolada em Xylella fastidiosa, poderá ser útil para a

compreensão dos mecanismos de ação destas proteínas quando a bactéria está presente

em plantas hospedeiras.

Materiais e Métodos

43

II – MATERIAIS E MÉTODOS

II. 1 – MATERIAIS

II. 1.1 – Reagentes, Enzimas, Linhagens Bacterianas e Vetores

Os reagentes químicos utilizados tais como Tris-HCl, β-mercaptoetanol, SDS,

NaCl, MgCl2, acrilamida, Na2HPO4, NaOH, HCl, EDTA, brometo de N-cetil-N,N,N-

trimetil amônio (CTAB), ditiotreitrol (DTT), iodoacetamida, acetonitrila, ácido

fórmico, ácido trifluoracético (TFA), glicerol, uréia, ácido acético glacial,

clorofórmio, álcool isoamílico, isopropanol, fenol, ácido bórico, acetato de sódio,

borato de sódio, etanol, bicarbonato de amônio, Comassie Brilliant Blue G-250 e R-

250, albumina sérica bovina (BSA – 66 kDa), ovalbumina (OVA – 45 kDa), anidrase

carbônica (CA – 30 kDa), inibidor de tripsina de soja (ITS - 20,1 kDa), citocromo C

(cit C - 12,4 kDa), α-lactoalbumina (a-Lacto), extrato de levedura, bacto-triptona,

ágar e mandelonitrila foram de grau P.A. ou equivalentes e comprados da Sigma–

Aldrich Chemical (St. Louis, MO, EUA). O reagente químico 5-bromo-4-chloro-3-

indolyl-beta-D-galactopiranosideo (X-Gal) foi obtido da GIBCO BRL (Rockville,

MD, EUA).

Os reagentes para PCR e a polimerase Taq Platinum High Fidelity foram

obtidas da Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, EUA). As enzimas

Thermophilic DNA polymerase, T4 DNA ligase, XhoI e NdeI, seus respectivos

tampões e tripsina modificada grau seqüenciamento foram obtidas da Promega

(Madison, WI, EUA). Os oligonucleotídeos específicos (iniciadores ou primers)

foram obtidos da Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, EUA).

Materiais e Métodos

44

As linhagens de Escherichia coli (E. coli) utilizadas nos experimentos de

clonagem e expressão foram DH5α e BL21(DE3) obtidos da Promega e Novagen

(San Diego, CA, EUA), respectivamente. Os vetores de propagação e expressão

utilizados foram pGEM®-T easy e pET28a obtidos da Promega e Novagen,

respectivamente. Os kits Wizard® Plus SV Miniprep DNA Purification Systems e

Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System foram obtidos da Promega. A Resina

Ni–NTA superflow foi obtida da Qiagen (Hilden, Alemanha). Os antibióticos

ampicilina, canamicina e o indutor isopropil-β-D-tiogalactosidase (IPTG) foram

comprados da Calbiochem (La Jolla, CA, EUA).

A coluna cromatográfica de exclusão por tamanho, Superdex 75-HR 10/30 foi

comprada da GE Healthcare (Uppsala, Suécia).

II. 2 – MÉTODOS

Na descrição deste trabalho, as seqüências nucleotídicas provenientes de X.

fastidiosa serão referidas como ORFs (open reading frame). As proteínas resultantes

da tradução das ORFs de X. fastidiosa e expressas de forma heteróloga são tratadas

como proteínas recombinantes e são designadas com a sigla r antes do nome.

II. 2.1 – Extração do DNA genômico

O método utilizado para a extração do DNA genômico foi o método descrito

por Ausubel e colaboradores em 1987 (AUSUBEL et al., 1995), com algumas

modificações.

Materiais e Métodos

45

As suspensões bacterianas de X. fastidiosa foram transferidas para tubos de

microcentrífuga estéreis (eppendorfs) de 2 mL contendo 100 µL de água purificada

e estéril (Milli-Q, Millipore, Bedford, MA, EUA) e centrifugadas em uma

microcentrífuga Eppendorf (modelo 5415 D, Cologne, Alemanha) por 20 min a

14000 rpm. Os sobrenadantes foram descartados e os precipitados (pellets)

ressuspendidos em uma solução contendo 400 µL tampão TE 10 mM (10 mM de

Tris e 1 mM EDTA, ajustado com HCl concentrado a pH 8,0), 70 µL de SDS a 10%

e 10 µL proteinase K a 20 mg mL-1. As soluções foram incubadas a 37 oC por uma

hora. Em seguida, 10 µL de RNAse a 200 µg mL-1 foram adicionados aos

eppendorfs, incubando-se novamente à 37 oC por mais uma hora e meia. Volumes de

100 µL de uma solução de NaCl a 5 mM e CTAB a 2% foram adicionados a mistura

reacional, que em seguida foi submetida à incubação final a 65 oC sob agitação por

10 min.

Após o período de incubação, volumes de 750 µL de uma mistura composta de

fenol, clorofórmio e álcool isoamílico (25:24:1) foram adicionados, homogeneizados

cuidadosamente e em seguida foram submetidos a centrifugação por 10 min a 14000

rpm em microcentrífuga. Os sobrenadantes foram transferidos para novos microtubos

estéreis.

Aos sobrenadantes foram adicionados 450 µL de isopropanol e estes foram

agitados algumas vezes por inversão. Após centrifugação por 10 min a 14000 rpm e

descarte dos sobrenadantes, os DNAs foram lavados com 1 mL de etanol 70%,

centrifugados e secos a temperatura ambiente por aproximadamente 30 min.

Os DNAs foram ressuspendidos em 30 µL de tampão TE 10 mM pH 7,5 e

posteriormente armazenados em freezer a -20 ºC. Para estimar a quantidade do DNA

Materiais e Métodos

46

extraído foi medida a absorbância a 260 e 280 nm contra o tampão TE, utilizando-se

o espectrofotômetro UV–Vis Hitachi, modelo U-2800 (Hitachi High-Technologies,

Tóquio, Japão). A relação padrão de que uma unidade de densidade óptica (DO)

equivale a aproximadamente 50 µg de DNA dupla fita por mL de solução foi

considerada (SAMBROOK et al., 1989).

II. 2.2 – Construção dos Oligonucleotídeos e Amplificação dos Genes

As seqüências nucleotídicas das ORFs que codificam as proteínas putativas

hidroxinitrila liase (XfHNL), corismato sintase (XfaroC) e proteína D do sistema de

transporte e secreção Tat (XftatD) de X. fastidiosa foram amplificadas através da

reação em cadeia da polimerase (PCR). A Figura 13 demonstra a seqüência

codificadora da proteína XfHNL como um exemplo da estratégia de amplificação

utilizada para obtenção dos genes de interesse deste estudo.

Materiais e Métodos

47

Figura 13. Seqüência codificadora da ORF XfHNL (Xylella fastidiosa Genome Project – número

de acesso XFa0032). A seqüência possui 773 nucleotídeos sendo que 756 nucleotídeos codificam

para a proteína putativa hidroxinitrila liase XfHNL. Os nucleotídeos em negrito vermelho e azul

correspondem aos códons de início e de parada tradução, respectivamente. As seqüências em negrito

representam os oligonucleotídeos foward e reverse (5’ e 3’) utilizados como iniciadores (primers). Os

nucleotídeos sublinhados representam os sítios de clivagem para as enzimas de restrição NdeI e XhoI.

A estratégia resumiu-se em utilizar dois primers (oligonucleotídeos iniciadores)

complementares às extremidades 3’ e 5’ do gene de interesse as quais hibridizavam

com esta região e serviram como ponto de partida para a polimerização pela Taq

DNA polimerase.

O DNA genômico, isolado de acordo com Ausubel (AUSUBEL et al., 1995) e

tratado com RNAse, foi utilizado como molde para a amplificação das ORFs (full-

length) anotadas no banco de dados genômico da X. fastidiosa (códigos de acesso

XFa0032, XF1369 e XF 1913). Os oligonucleotídeos forward e reverse com sítios de

restrição para as enzimas NdeI e XhoI, respectivamente, foram sintetizados e

AATTCCATATGAACGCATACCGTCCTATCGCTTTTGCCTCATCCGCAGCATCTGATAAGCCAA

CCGTTTTACTGAAACCGACAATTGTGCTCGTACACGGTGCTTTTGCTGATGGTTCTACATGGA

ACAAAGTAATCCATCAGCTCCAGGCAAAAGGGCTGAATGCTGTGTCCGTTCAAAATCCGCTGA

CGTCTTTCGAAGATGATGTAGCAGCAACACGCCGTGTGCTTGCTCTGCAAACGGGACCTGTAG

TGCTCGTTGGCCACTCTTATGGGGGAGCAGTGATTACTGAAGCTGGACAAGATGAACGAGTTA

AAGCCCTAGTTTATATTGCCGCATTTGCTCCATCCGAGGGAGAGTCGGTTGCTGATCTGAATA

AAAAATATCCATTACCTTCTGGATATAATCATCTCAGCAGTGACAAAGAAGGGTTCCTGATGC

TAACGCCAGAAGGTGTGGAAAAATACTTGGCTCAGGATATCCCCCTTGAGCAAACTCGCCTGA

TCATCGCCACTCAGCACCCTATACGCGGCGCCAATTTTGAAAAAAAGGTTTCAGCTGCCGCTT

GGGAAACTAAACCATCATGGTATTTGGTGAGTGAGAATGATCTTATGCTTCAGCCAGCGCTGC

AAAAAGAGATGGCTCAAAAAATAGGTGCTCATATCGTCAATGTGGCAGCCAGCCATGTGCCAC

ATCTTTCACATGCTGCGGAAGTAGAAAAAATCATCATGAGTGCAGTCAACGATGTTGAAGTAT

TAGAATAACTCGAGCGG

Materiais e Métodos

48

utilizados na amplificação a fim de facilitar a clonagem dentro dos vetores de

expressão escolhidos. Estes oligonucleotídeos iniciadores estão listados na Tabela 2.

Tabela 2. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na amplificação por PCR. Os nucleotídeos em

azul representam as trincas dos códons de iniciação (start codon) e terminação (stop codon) presentes

na seqüência das ORFs de interesse nas quais codificam para a metionina inicial e o término do

processo de tradução, respectivamente.

PROTEÍNA CLONES OLIGOS SEQÜÊNCIA

XFa0032F 5’-AATTCCATATGAACGCATACCGTCC-3’ Hidroxinitrila

Liase XfHNL

XFa0032R 5’-CCGCTCGAGTTATTCTAATACTTCAACATC-3’

XF1369F 5’-GGAATTCCATATGGGGGCGAACACGTTTGG-3’ Corismato

Sintase XfaroC

XF1369R 5’-CCGCTCGAGTCAATCATCGGCATTCCTG-3’

XF1913F 5'-GGAATTCCATATGCAATTGATCGACATCGG-3’ Proteína D

do Sistema

Tat

XftatD

XF1913R 5'-CCGCTCGAGTCATGAACCGGAACCGG-3’

A amplificação via PCR foi realizada em um termociclador PTC-100TM

Programabe Thermal Controller (MJ-Research Inc., Watertown, MA, EUA)

empregando-se um volume final de 50 µL constituído de 100 pmol de cada primer,

133 ng de DNA genômico, 10 mM de dNTPs, 1 U de polimerase Taq Platinum High

Fidelity e 2 mM de MgSO4.

As condições de amplificação compreenderam uma desnaturação inicial a 94

oC for 120 s, seguida de 39 ciclos constituídos de desnaturação a 94 oC por 60 s,

hibridização (annealing) variando de 52 e 58 oC (de acordo com o gene empregado)

por 60 s e extensão dos primers a 72 oC por 90 s; com extensão final a 72 oC por 10

min. Ao final da reação a mesma foi interrompida por resfriamento a 4 oC.

Materiais e Métodos

49

Os produtos das amplificações foram analisados aplicando-se 2 µL das

misturas de reação em gel de agarose preparativo a 0,8% contendo 0,5 µg mL-1 de

brometo de etídeo, em tampão 1X TAE (80 mM Tris; 40 mM ácido acético glacial;

2,5 mM EDTA, pH 8,3) e em seguida foi submetido a uma tensão de 100 V por 30

min. Em seguida, foram visualizados sob luz UV após migração.

II. 2.3 – Purificação dos Produtos Amplificados por PCR.

Uma vez confirmado o tamanho correto dos fragmentos de DNA obtidos, os

produtos de PCR restantes (cada 48 µL) foram separados novamente por eletroforese

em gel de agarose preparativo, conforme descrito anteriormente.

Os produtos de PCR foram excisados do gel e purificados utilizando-se o Kit

Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), de acordo com as instruções

do fabricante. O resultado da extração foi analisado por eletroforese em gel de

agarose 1% e quantificado por espectrofotometria no UV-visível empregando-se o

método de Sambrook e colaboradores (SAMBROOK et al., 1989).

II. 2.4 – Preparação dos Produtos de PCR purificados – Reação de

Adenilação

Para uma correta e eficiente ligação dos produtos de PCR no vetor de clonagem

pGEM-T easy fez-se necessária a modificação prévia destes através da introdução in

vitro de uma adenina (A) em suas extremidades 3’ terminais mediante uma reação

denominada A-tailing procedure. Nesta reação, os substratos são o produto da PCR e

Materiais e Métodos

50

uma deoxiadenosina tri-fosfato (dATP) e a enzima é uma Taq DNA polimerase sem

atividade corretiva (exonucleásica).

As reações de adenilação foram executadas em um termociclador PTC-100TM

empregando-se volumes finais de 10 µL constituídos de 6 µL do produto de PCR

purificado, 1 µL de tampão Thermophilic DNA poly 10x Buffer contendo MgCl2, 2

µL de dATP a 1 mM e 1 µL de enzima Thermophilic DNA polymerase (5U). Uma

vez preparadas, as reações foram incubadas por 30 minutos a 72 oC no termociclador.

II. 2.5 – Clonagem dos Produtos de PCR adenilados nos Vetores de

Clonagem pGEM-T easy - Reação de Ligação

O sistema pGEM-T easy (Promega) é um kit que contém um plasmídeo linear

que possui uma deoxitimidina (T) em cada uma de suas extremidades 3’ e que

permite a inserção direta de produtos de PCR adenilados, pela enzima T4 DNA

ligase. A circularização do DNA pela inserção do produto de PCR adenilado nada

mais é que a formação do plasmídeo recombinante a ser introduzido posteriormente

dentro da bactéria E. coli visando à propagação plasmidial.

As seqüências codificantes dos genes de interesse, amplificadas e adeniladas,

foram inseridas no vetor pGEM-T easy através de uma reação de ligação. Cada

mistura de ligação foi preparada empregando-se um volume final de 10 µL

constituídos de 2 µL produto de PCR adenilado a 100 ng µL-1, 1 µL da enzima T4

DNA ligase (6U), 5 µL do tampão de ligação para a enzima T4 DNA ligase (2X) e 1

µL da solução contendo o vetor pGEM-T easy a 50 ng µL-1. Água Milli-Q foi

utilizada para completar o volume total. Esta reação foi mantida a 20 ºC por 24

Materiais e Métodos

51

horas. As misturas de ligação foram utilizadas na transformação por choque térmico

de células competentes de E. coli DH5α (Promega), competentes por tratamento com

CaCl2.

Os plasmídeos recombinantes obtidos foram denominados de pGEM-XfHNL,

pGEM-XfaroC e pGEM-XftatD correspondentes aos insertos codificando as

proteínas putativas hidroxinitrila liase, corismato sintase e proteína D do sistema de

transporte e secreção Tat, respectivamente.

II. 2.6 – Transformação da Bactéria Escherichia coli DH5α com os

Plasmídeos Recombinantes pGEM-T easy

As suspensões de células competentes DH5α, produzidas no momento de uso

ou estocadas a -80 oC, foram mantidas durante pelo menos 10 min em banho de

gelo. A cada 50 µL de células DH5α foram adicionados 2 µL das reações de ligação.

As misturas resultantes foram homogeneizadas gentilmente e mantidas em gelo por

30 min. Em seguida, estas misturas foram submetidas à incubação em banho de água

a 42 oC por 2 min e subseqüente banho de gelo por mais 2 min (choque térmico).

Após este período, 250 µL de meio LB foram adicionados a cada um dos tubos

contendo as células transformadas com as reações de ligação. As novas misturas

foram mantidas a 37 oC por 1 hora e meia sob agitação de 150 rpm. Estas foram

plaqueadas em placas de Petri contendo 20 mL de meio seletivo Luria-Bertani sólido

(LB; 15 g extrato de levedura, 10 g de bacto-triptona, 10 g de NaCl e 15 g de ágar

por litro de solução a pH 7,5) suplementado com 10 µL do antibiótico de seleção

Materiais e Métodos

52

ampicilina a 100 mg mL-1, 40 µL de X-Gal a 50 mg mL-1 e 30 µL de IPTG a 0,5 M;

e incubadas overnight a 37 oC em estufa.

II. 2.7 – Extração, Análise de Restrição e Seqüenciamento dos

Plasmídeos Recombinantes pGEM-T easy de Escherichia coli DH5α

Após o período de incubação, algumas colônias brancas resistentes (possíveis

recombinantes ou clones positivos) foram selecionadas a fim de realizar a extração

dos seus DNAs plasmidiais. A seleção definitiva dos recombinantes foi realizada

através da análise de restrição e confirmada pelo do seqüenciamento de DNA.

As colônias previamente selecionadas foram repicadas, individualmente, em

tubos estéreis para cultivo de bactérias contendo 5 mL de meio LB líquido (sem

ágar) contendo 3 µL de ampicilina a 100 mg mL-1 (pré-inóculo). Os tubos foram

incubados a 37 oC por 16 horas, sob agitação de 250 rpm. A seguir, as células

tiveram seus DNAs plasmidiais extraídos seguindo dois métodos:

i) por meio de lise alcalina (AUSUBEL et al., 1995) para uma análise prévia de

restrição enzimática a fim de verificar a presença dos produtos de PCR ligados aos

vetores e confirmar os clones positivos;

ii) através do kit Wizard® Plus SV Miniprep DNA Purification Systems

(Promega) para análise destes DNAs por seqüenciamento e obtenção dos genes a

serem posteriormente subclonados nos vetores de expressão.

Ambos os métodos proporcionaram materiais adequados para os procedimentos

seguintes, porém a extração por kit proporcionou materiais livres de contaminantes

como DNA genômico, RNA, proteínas e macromoléculas; mais adequados aos

procedimentos de seqüenciamento e subclonagem em plasmídeos de expressão. A

Materiais e Métodos

53

quantificação dos DNAs plasmidial foi realizada empregando-se o método de

Sambrook e colaboradores (SAMBROOK et al., 1989).

A primeira análise de restrição foi realizada empregando-se um volume final de

10 µL constituídos de 0,8 µL dos DNAs plasmidiais a 100 ng µL-1, 1 µL da enzima

NdeI (10 U), 1 µL da enzima XhoI (10 U) e 1 µL do tampão de enzima D (10X),

estes últimos fornecidos pelo fabricante. Água Milli-Q foi utilizada para completar o

volume total. Esta reação foi mantida a 37 C em estufa por 4 horas. Os produtos de

digestão foram analisados em gel de agarose preparativo 0,8% e visualizados sob luz

UV.

Dos clones positivos identificados, dois clones contendo cada ORF de interesse

foram selecionados e tiveram seu DNA plasmidial purificado por kit, quantificado e

submetido ao seqüenciamento automático.

Uma segunda digestão também foi realizada com tais plasmídeos, porém

empregando-se um volume de 50 µL. Este último procedimento foi necessário para a

obtenção de quantidade suficiente dos insertos de interesse com extremidades

coesivas adequadas para serem subclonados nos vetores de expressão, previamente

digeridos com as mesmas endonucleases de restrição.

O seqüenciamento de DNA foi realizado utilizando-se o método do

didesoxinucleotídeo marcado (dideoxy chain termination method) com auxílio de um

seqüenciador automático ABI Prism 377-96 Collection da Applied Biosystem

(Sarasota, FL, EUA), seguindo o protocolo do fabricante. Após o seqüenciamento,

para verificar a integridade da seqüência obtida, esta foi submetida a uma busca em

bancos de dados públicos como NCBI através da ferramenta BLAST

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Materiais e Métodos

54

II. 2.8 – Subclonagem dos Genes no Plamídeo de Expressão pET28a

Plasmídeos do sistema pET utilizados possuem um gene que confere resistência

a canamicina e podem apresentar uma seqüência nucleotídica na região N- ou C-

terminal do sítio de múltipla clonagem que codifica seis histidinas denominada His-

tag. Assim, as ORFs de interesse foram subclonados em fusão com esta seqüência

facilitando a purificação das proteínas recombinantes através de cromatografia de

afinidade em metal imobilizado. Os plasmídeos de expressão construídos foram

denominados pET-XfHNL, pET-XfaroC e pET-XftatD, os quais codificam as

proteínas putativas hidroxinitrila liase, corismato sintase e proteína D do sistema de

transporte e secreção Tat, respectivamente.

As seqüências codificantes de interesse foram inseridas no vetor pET28a

através de uma nova reação de ligação. Cada mistura de ligação foi preparada

empregando-se um volume final de 10 µL constituídos de 1,5 µL do inserto a 100 ng

µL-1, 1,7 µL do vetor pET28a a 90 ng µL-1, 5 µL do tampão de ligação para a enzima

T4 DNA ligase (2X) e 1 µL da enzima T4 DNA ligase (6U). Água Milli-Q foi

utilizada para completar o volume total. Esta reação foi mantida a 20 C por 24 horas.

As novas misturas de ligação foram utilizadas na transformação por choque

térmico de células competentes de E. coli DH5α para nova propagação plasmidial.

Materiais e Métodos

55

II. 2.9 – Transformação da Bactéria Escherichia coli DH5α com os

Plasmídeos Recombinantes pET28a

O procedimento empregado na transformação de células competentes de E.coli

DH5α foi o mesmo descrito na seção II. 2.6, porém, com algumas modificações

necessárias. Foram utilizados para transformar as células competentes por choque

térmico os volumes totais das novas misturas de ligação. As células transformadas

foram plaqueadas em placas de Petri contendo 20 mL de meio seletivo LB

suplementado apenas com 12 µL do antibiótico de seleção canamicina 50 mg mL-1 e

incubadas overnight a 37 0C em estufa.

II. 2.10 – Extração e Análise de Restrição dos Plasmídeos

Recombinantes pET28a de Escherichia coli DH5α

Após o período de incubação, algumas colônias resistentes foram selecionadas

para realizar a extração dos seus DNAs plasmidiais. A seleção dos recombinantes foi

realizada através da análise de restrição a fim de verificar a eficiência na

transformação e propagação e obter quantidade suficiente dos plasmídeos para

posterior transformação em linhagens de expressão.

As colônias selecionadas foram repicadas, individualmente, em 5 mL de meio

LB líquido contendo 3 µL de canamicina a 50 mg mL-1. Os tubos foram incubados

overnight a 37 oC em estufa sob agitação de 250 rpm até uma DO600 nm entre 1 e 2.

As células tiveram seus DNAs plasmidiais extraídos através do kit Wizard®

Plus SV Miniprep DNA Purification Systems e quantificados empregando-se o

método de Sambrook e colaboradores (SAMBROOK et al., 1989).

Materiais e Métodos

56

A análise de restrição foi realizada empregando-se um volume final de 10 µL

de acordo ao procedimento descrito na seção II. 2.7. Uma vez confirmada a presença

dos DNAS plasmidiais nestas células, os mesmos foram utilizados na transformação

por choque térmico de células competentes de E. coli BL21(DE3) para expressão

heteróloga.

II. 2.11 – Transformação da Bactéria Escherichia coli BL21(DE3)

com os Plasmídeos Recombinantes pET28a

O procedimento empregado na transformação de células competentes de E.coli

BL21(DE3) foi o mesmo descrito na transformação de células DH5α (seção II. 2.9).

Porém, 10 µL de cada solução de DNA plasmidial foram utilizados para transformar

por choque térmico células competentes de E.coli BL21(DE3). A linhagem

empregada nesta etapa do trabalho também passou pelo tratamento com cloreto de

cálcio (AUSUBEL et al., 1995).

II. 2.12 – Expressão Heteróloga das Proteínas Recombinantes de

Xylella fastidiosa (rXfHNL, rXftatD e rXfaroC) em E.coli

Para realizar os testes de expressão foram feitos pré-inóculos das colônias

resultantes da transformação de células BL21(DE3) com os plasmídeos pET-XfHNL,

pET-XftatD e pET-XfaroC, selecionadas em meio sólido com antibiótico. Colônias

isoladas contendo cada uma destas construções foram escolhidas aleatoriamente.

Estas colônias foram inoculadas, individualmente, em 5 mL de meio LB líquido

Materiais e Métodos

57

contendo canamicina (3 µL a 50 mg mL-1) e crescidas overnight a 37 oC sob 250 rpm

de agitação.

As culturas foram então diluídas na proporção 1:100 com LB líquido contendo

canamicina e crescidas, novamente, a 37 oC até alcançar a OD600 de

aproximadamente 0.6. Depois de atingido este crescimento celular, alíquotas de 100

µL de cada cultura foram armazenadas a -80 oC em soluções estéreis de 100 µL de

glicerol a 65 % e sulfato de magnésio a 100 mM na proporção 1:1. Antes da adição

de IPTG no restante da cultura, alíquotas de 250 µL de cada fracso, representando os

controles não induzidos foram centrifugadas a 10000 rpm por 2 min em

microcentrífuga, ressuspendidas em 20 µL de água Milli-Q e congeladas a - 20 oC.

O restante das culturas de células foi induzido com IPTG a 0,5 M e o

crescimento foi mantido por um período inicial de 4 horas a 37 oC. Alíquotas de 250

µL da cultura induzida foram retiradas de hora em hora para avaliação do nível de

expressão das proteínas recombinantes. Todos os precipitados (pellets) provenientes

das alíquotas retiradas durante a etapa de expressão protéica foram adequadamente

ressuspendidos e preparados de acordo com as subseqüentes análises em gel descritas

na secção de caracterização físico-química.

As culturas induzidas restantes foram centrifugadas a 12000 rpm por 10 min a

4 oC em centrífuga Sorvall modelo RC-5C Plus (Kendro, CA, EUA). Os pellets

bacterianos obtidos de cada 250 mL de cultura induzida foram congelados a 20 oC e

descongelados antes do uso.

Materiais e Métodos

58

II. 2.13 – Purificação das Proteínas Recombinates de Xylella

fastidiosa (rXfHNL, rXftatD e rXfaroC)

Métodos cromatográficos são rotineiramente utilizados para identificar e isolar

proteínas de interesse através de sucessivos fracionamentos de acordo com suas

propriedades físico-químicas como solubilidade, carga iônica, massa molecular,

ponto isoelétrico, propriedades de adsorção e ligação a outras moléculas biológicas.

As técnicas cromatográficas mais comuns empregam colunas verticais onde as

amostras são colocadas e as moléculas protéicas que as constituem se distribuem

entre uma fase estacionária e outra móvel. A fase móvel corresponde ao solvente

cujo fluxo arrasta a maioria das moléculas presentes nas amostras. No entanto, a fase

estacionária é constituída de um material imóvel acondicionado (como resinas

carregadas, camadas porosas, papel de filtro, entre outros) de modo a interagir com a

mistura de proteínas e outras moléculas (ZAHA et al., 1996, STRYER et al, 1988).

Os métodos cromatográficos mais utilizados para isolamentos de proteínas são

cromatografias de exclusão por tamanho, troca iônica e afinidade. Neste trabalho, os

métodos aplicados para isolar as proteínas recombinantes foram cromatografias de

afinidade em resina de níquel e exclusão por tamanho em coluna Superdex 75-HR

10/30.

A solução tampão utilizada na purificação das proteínas recombinantes foi

tampão de lise Tris-HCl constituído de 20 mM de Tris base, 150 mM de NaCl e 5 %

de glicerol, pH 8,0 ajustado com HCl concentrado.

Os pellets bacterianos descongelados obtidos a partir de 250 mL de cultura

induzida foram ressuspendidos em 12,5 mL de tampão de lise Tris-HCl e mantidos

em gelo por 30 min.

Materiais e Métodos

59

As suspensões celulares mantidas em gelo foram submetidas à lise celular

utilizando-se o sonicador 550 Sonic Dismembrator (Fisher Scientific International

Inc., Hampton, NH, EUA) acoplado a uma sonda microtip e uma fonte de alta

voltagem. O processo de sonicação foi realizado empregando-se 10 ciclos de 30

segundos com intervalos de 30 segundos. Os extratos protéicos brutos provenientes

das células lisadas foram clarificados por centrifugação a 10000 rpm por 30 min a 4

oC. Os sobrenadantes foram empregados na purificação por cromatografias de

afinidade e exclusão molecular.

II. 2.13.1 – Cromatografia de Afinidade em Resina de Níquel

A estratégia empregada para a purificação das proteínas recombinantes

contendo cauda de hexahistidinas utiliza as vantagens da cromatografia de afinidade

em metal. Os íons metálicos são imobilizados pelo uso de um agente quelante capaz

de disponibilizar o metal para ligação à proteína. Certos aminoácidos, principalmente

histidina, apresentam alta especificidade de ligação pelo metal imobilizado. Assim,

proteínas ricas em histidinas ou com um grupo destes aminoácidos podem ser

seletivamente eluídas da resina carregada com íons metálicos e, consequentemente,

isoladas por este método. Uma representação da interação dos resíduos de histidinas

com a matriz Ni-NTA é apresentada na Figura 14.

Materiais e Métodos

60

Figura 14. Interação entre resíduos vizinhos da cauda His-Tag e a matriz Ni-NTA. O quelante em

vermelho, o ácido nitrilotriacético, coordena-se com quatro dos seis sítios ligantes do Ni (II). Os dois

sítios livres da esfera de coordenação interagem com os anéis imidazol da cauda de 6X histidinas das

proteínas recombinantes (em azul) (Qiagen).

A eluição das proteínas de interesse é realizada utilizando-se uma solução

contendo o composto imidazol, que também possui o anel imidazólico, mas tem

maior afinidade ao Ni (II) do que a histidina. A Figura 15 apresenta a estrutura

molecular do imidazol e da histidina que se ligam aos íons níquel que estão

imobilizados pelos grupos NTA na matriz.

Figura 15. Estrutura molecular do composto imidazol e do aminoácido (Qiagen).

Materiais e Métodos

61

Os sobrenadantes foram inseridos em colunas contendo 3 a 5 mL de resina de

níquel Ni–NTA superflow (QIAGEN) pré-equilibrada com tampão de lise. Após 30

min de repouso a 20 oC, os materiais não ligados de 12,5 mL de volume foram

eluídos da coluna. As colunas foram então lavadas com um gradiente inicial de

imidazol variando de 0 a 100 mM em tampão de lise Tris-HCl. As etapas de lavagem

consistiram de 18 a 30 mL de tampão de lise sem imidazol, seguido de 18 a 50 mL

de tampão de lise contendo 5 mM de imidazol, 24 a 50 mL de tampão contendo 40

mM de imidazol e 6 a 10 mL de tampão contendo 100 mM de imidazol. Todas as

proteínas recombinantes foram eluídas com aproximadamente 10 mL de tampão

contendo 250 mM de imidazol. Cada proteína recombinante deste estudo possuía

uma coluna de afinidade individual para evitar eventuais contaminações.

Alíquotas de 20 µL de todas as frações de lavagem e eluição foram avaliadas e

o grau de pureza das proteínas recombinantes avaliado por eletroforese em gel de

poliacrilamida 15%, de acordo com as subseqüentes análises em gel descritas na

secção de caracterização físico-química.

As frações provenientes das eluições com 250 mmol L-1 de imidazol contendo

as proteínas recombinantes purificadas foram reunidas e dialisadas contra o próprio

tampão de lise (sem imidazol). Em seguida foram concentradas através de

concentradores Centripep Ultra 10 da Amicon (Millipore Corporation, Bedford, MA,

EUA) contendo membranas de tamanho adequadas às suas massas moleculares. Cada

proteína recombinante possuía também um concentrador individual para evitar

eventuais contaminações.

As concentrações das proteínas recombinantes purificadas foram determinadas

medindo-se suas absorbâncias em espectrofotômetro UV-Vís a 280 nm. As

absorbâncias foram relacionadas aos seus respectivos coeficientes de extinção molar

Materiais e Métodos

62

btidos através do cálculo do conteúdo teórico de resíduos de triptofanos, tirosinas e

fenilalaninas (GASTEIGER et al., 2005). Este método proporcionou os coeficientes

de extinção molar para rXfHNL, rXfaroC e rXftatD de 26030, 28930 e 21980 L mol -

1 cm-1, respectivamente. Todos os estudos subseqüentes foram realizados com as

proteínas recombinantes contendo a cauda de 6× histidinas.

II. 2.13.2 – Cromatografia de Exclusão por Tamanho em Colunas

Superdex

Está técnica de separação utiliza colunas empacotadas com polímeros contendo

esferas de tamanho específico nas quais formam uma rede tridimensional de poros

proporcionando a separação das moléculas em solução de acordo com seus

tamanhos. Dentre as colunas empacotadas utilizadas na cromatografia de exclusão

por tamanho estão as colunas Superdex que são empregadas na separação de

proteínas e outras biomoléculas. Por serem de tamanho selecionado, as matrizes

destas colunas permitem que proteínas que apresentam maiores massas moleculares

migrem mais rapidamente do que proteínas com menores massas moleculares.

Devido a não interação com seus poros, estas são eluídas mais precocemente.

Como alternativa para a retirada do imidazol das frações protéicas provenientes

da purificação em coluna de níquel e para prever o grau de oligomerização das

proteínas recombinantes, a cromatografia de exclusão por tamanho foi realizada a

temperatura ambiente empregando-se a coluna Superdex 75-HR 10/30, acoplada a

um sistema HPLC preparativo (ÄKTA™-purifier 10, GE Healthcare BioSciences,

Uppsala, Sweden). As colunas foram previamente lavadas com água Milli-Q e pré-

equilibradas com tampão de lise Tris-HCl. Os eluatos foram monitorados por

Materiais e Métodos

63

absorbância no UV a 280 nm e coletados em frações de 1 mL empregando-se uma

velocidade de fluxo de 0,5 mL min-1. As frações contendo as proteínas

recombinantes purificadas foram reunidas e concentradas através dos concentradores

Centripep Ultra 10.

Os padrões de massa molecular utilizados na calibração foram soro albumina

bovina (BSA – 66 kDa), ovalbumina (OVA – 45 kDa), anidrase carbônica (CA –30

kDa), inibidor de tripsina de soja (ITS - 20,1 kDa) e α-lactoalbumina (a-Lacto - 14.4

kDa), separados individualmente.

As concentrações das proteínas recombinantes purificadas foram determinadas

medindo-se suas absorbâncias por espectrofotômetro UV-vís a 280 nm. Todos os

estudos subseqüentes foram realizados com as proteínas recombinantes contendo a

cauda de 6X histidinas.

II. 2.14 - Análises Físico-química e Estrutural das Proteínas

Recombinantes de Xylella fastidiosa (rXfHNL, rXftatD e rXfaroC)

II. 2.14.1 – Determinação Quantitativa do Nível de Expressão

Protéica

As alíquotas derivadas da expressão heteróloga foram então avaliadas quanto à

homogeneidade e tiveram suas massas moleculares e quantificações estimadas

através de dois métodos eletroforéticos de análise: gel de poliacrilamida e microchip.

Uma vez estabelecida às condições de expressão mais favoráveis, as proteínas

recombinantes foram expressas em larga escala.

Materiais e Métodos

64

II. 2.14.1.1 - Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-

PAGE)

A separação, detecção e quantificação das amostras rXfHNL XfaroC e XftatD

contidas nas alíquotas de cultura induzida foram realizadas segundo o método de

Laemmli (LAEMMLI et al., 1970). No sistema eletroforético foi utilizado gel de

empilhamento de concentração igual a 5 % contendo bis-acrilamida:acrilamida: na

proporção 0,8:30 (m/v) em Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 e SDS 0,1 % e gel de separação a

15% contendo bis-acrilamida:acrilamida na proporção 0,8:30 (m/v) em Tris-HCl 2,0

M, pH 8,8 e SDS 0,1 %. Os géis foram polimerizados em placas de vidro adaptáveis

a sistemas verticais, as quais foram acopladas a seus respectivos reservatórios

contendo tampão Tris-HCl a 25 mM contendo SDS a 0,1 % (m/v) utilizado como

tampão de corrida.

Um volume de 10 µL de tampão Tris-HCl a 0,0625 M, pH 6,8 contendo

glicerol 10 %, β-mercaptoetanol 5 % (v/v), SDS 2% e azul de bromofenol a 0,001 %

(tampão de amostra) foi adicionado a 20 µL de todas as amostras submetidas a

eletroforese. As soluções foram aquecidas a 100 oC por 5 min e aplicadas nos poços,

num volume final de 20 µL. As proteínas utilizadas como padrões de massa

molecular foram albumina sérica bovina (BSA: 66 kDa), ovalbumina (Ova: 45 kDa),

anidrase carbônica (CA: 30 kDa), inibidor de tripsina de soja (ITS: 20,1 kDa),

citocromo C (cit C: 12,4 kDa) e α-lactoalbumina (a-Lacto: 14,4 KDa).

A eletroforese foi efetuada sob uma tensão de 120 V para a separação das

amostras durante a migração no gel de empilhamento e de resolução. Após 2 horas

de separação eletroforética, a presença das bandas protéicas foi detectada com a

Materiais e Métodos

65

imersão dos géis numa solução de corante Comassie Brilliant Blue 250 R, por 15 min

sob agitação branda. Em seguida, os géis foram descorados com ácido acético 7 %.

A quantificação das proteínas recombinantes foi feita por densitometria do gel

corado com Coomassie utilizando-se o software Kodak 1D image analysis

(Rochester, New York, EUA) e anidrase carbônica (CA, 30 kDa) como padrão.

II. 2.14.1.2 - Eletroforese em Gel através de Microchip (Método

GelChip-CE)

A separação, detecção e quantificação das amostras contidas nas alíquotas de

cultura induzida também foram realizadas no instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer -

método GelChip-CE (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) em combinação

com o kit Protein 200 plus LabChip e o software Protein 200 Plus (version A.02.12).

A preparação (priming) e o preenchimento dos microchips com as amostras

foram realizados de acordo com o protocolo do kit Protein 200 Plus LabChip, como

recomendado pelo fabricante. Cada microchip de vidro continha 16 reservatórios

interconectados via rede de microcanais, que foram preenchidos com uma mistura de

corante e gel. Dez dos 16 reservatórios foram preenchidos com as amostras

experimentais, quatro reservatórios com a mistura gel-corante, um com a solução

descorante (destaining solution) e um com o padrão de tamanho molecular (ladder).

Brevemente, os microcanais foram preenchidos pipetando-se 12 µL da mistura

gel-corante dentro dos reservatórios apropriados. A mistura foi inserida dentro dos

microcanais aplicando-se uma pressão ao reservatório adequado via seringa de 1mL.

Os microchips recentemente preparados (priming) foram utilizados imediatamente.

Três reservatórios adicionais para tampão foram preenchidos com 12 µL da mistura

Materiais e Métodos

66

gel-corante. As amostras foram desnaturadas misturando-se estas com tampão de

amostra (buffer proporcionado pelo kit) na proporção 2:1 e aquecidas em banho de

água fervente por 3 min. O tampão de amostra fornecido com o kit Agilent Protein

200 plus Assay continha 4 % SDS, um corante fluorescente apropriado, e duas

proteínas controle de tamanho conhecido servindo como marcadores internos de

tamanho. Após a etapa de desnaturação, as amostra foram diluídas em água

desionizada na proporção 1:15 e inseridas no microchip. Os reservatórios das

amostras e do padrão foram preenchidos com as soluções apropriadas. O microchip

foi agitado em um agitador tipo vortex e inserido dentro do instrumento Bioanalyzer

para análise.

As amostras foram eletroforéticamente separadas nos microcanais preenchidos

com solução polimérica. A detecção foi baseada na fluorescência induzida a laser de

um corante fluorescente que foi adicionado à solução polimérica e ligado não

covalentemente às micelas proteína-SDS. O software Bioanalyzer automaticamente

calcula o tamanho e a concentração de cada pico separado e expõe os resultados em

tempo real. A quantidade de proteína recombinate nas amostras expressa como

porcentagem de proteína total pode ser determinada diretamente da tabela dos

resultados fornecida pelo software. Os resultados obtidos por GelChip-CE foram

comparados com aqueles obtidos por gel de eletroforese convencional (15 % SDS-

PAGE) (LAEMMLI et al., 1970).

II. 2.14.2 - Determinação do Ponto Isoelétrico

As proteínas são macromoléculas anfóteras, ou seja, possuem cargas positivas

ou negativas dependendo do pH. A rede de cargas nas proteínas é uma soma

Materiais e Métodos

67

algébrica de todas as cargas das cadeias laterais dos aminoácidos que as compõe.

Cada proteína possui um pH específico na qual a somatória das cargas é nula ou zero

e cujo valor é denominado ponto isoelétrico (pI) (STRYER, 1988).

A focalização isoelétrica (IEF, isoelectric focusing) é uma técnica eletroforética

de alta resolução que separa proteínas em uma mistura de acordo com seus pontos

isoelétricos. Ela é realizada em condições não desnaturantes e têm como princípio a

movimentação destas macromoléculas carregadas em um gradiente de pH quando

um campo elétrico é aplicado. Nesse gradiente, as proteínas se movimentam até a

atingirem seus pIs. Em valores de pH acima do pI da proteína estas são

negativamente carregadas e em valores abaixo do seu pI são positivamente

carregadas.

A eletroforese de focalização isoelétrica com as amostras protéicas

provenientes das cromatografias de exclusão por tamanho foi realizada através do

sistema PhastSystem da GE Healthcare (Uppsala, Suécia). Como meio de separação

foi utilizado o gel do kit PhastGel IEF com um gradiente de pH variando de 3 a 9. O

padrão de pI empregado foi o kit Broad pI variando de 3 a 10. O gel foi corado com

Coomasie Blue G – 250 a 0,1% em solução aquosa de metanol a 25 % e ácido

acético a 5 % . As amostras foram previamente dessalinizadas através das mini

colunas de dessalinização Centrisep spin columns (Princeton Separations, Aldelphia,

NJ, EUA), de acordo com o protocolo do fornecedor.

Materiais e Métodos

68

II. 2.14.3 - Determinação da Seqüência por Espectrometria de

Massas

A espectrometria de massas é atualmente a técnica analítica mais utilizada para

identificar compostos, elucidar algumas propriedades estruturais e químicas de

moléculas e, muitas vezes, determinar as seqüências aminoacídicas de peptídeos que

serão comparadas com massas e seqüências depositadas em bancos de dados

mundiais. Esta técnica permite a determinação de moléculas com altas massas

moleculares, uma vez que é capaz de produzir abundantemente íons multiplamente

carregados.

Os espectrômetros de massas contam com três componentes básicos a fim de

converter moléculas individuais em íons, separá-los e detectá-los: uma fonte de

ionização, um analisador de massas e um detector. Uma das técnicas de ionização

mais empregadas na determinação de massas moleculares é a de electrospray, na

qual baseia-se na ionização de moléculas peptídicas, levando os íons a fase gasosa,

sem degradação ou fragmentação das mesmas. No processo de ionização, a solução

de interesse é bombeada num capilar metálico mantido a um potencial onde um

campo elétrico é formado conduzindo a um acúmulo de carga na ponta do capilar.

Este acúmulo de cargas leva à emissão de gotículas com altas densidades de carga

que passam por um processo de evaporação do solvente e fissão eletrostática e,

finalmente provocam a expulsão dos íons para a fase gasosa. Os íons são produzidos

de forma contínua e acelerados.

Dentre os analisadores de massas, o quadrupolo tem sido o mais comumente

empregado em equipamentos comerciais de uso geral. Neste tipo de filtro, os íons

são injetados paralelamente a quatro barras metálicas, às quais são aplicadas

Materiais e Métodos

69

combinações de potenciais elétricos de corrente contínua (DC) e alternada (AC). A

variação dos potenciais DC aplicados às barras metálicas faz com que somente íons

com uma determinada relação massa/carga (m/z) tenham trajetórias estáveis e

cheguem até o final do percurso (percurso).

Em seguida, os íons são direcionados para um detector que avalia seus tempos

de vôo após sua produção e aceleração no processo de ionização.

A análise por espectrometria de massas foi utilizada para confirmar a expressão

das proteínas recombinantes. A confirmação foi realizada através da seqüência de

aminoácidos dos peptídeos gerados pela digestão tríptica das amostras e de seus

respectivos valores de massas. Esta análise foi feita junto ao Laboratório Nacional de

Luz Síncroton (LNLS, Campinas, São Paulo, Brazil) com auxílio do doutorando

Rogério de Campus Bicudo, usuário cadastrado nesta instituição.

Os digeridos trípticos foram analisados diretamente por cromatografia líquida

acoplado em tandem a um espectrômetro de massas com ionização por electrospray

no modo íon positivo (LC-nanoESI-MS/MS). A separação por LC-MS/MS foi

realizada em um sistema Micromass (Waters Ltda, Manchester, UK) equipado com

pré-coluna de desalinização e coluna analítica C18 Waters Symmetry 300 (com

comprimentos de 5 mm e 150 mm, diâmetros internos de 350 µm e 75 µm e

tamanhos de partículas de 5 e 3 µm, respectivamente) e diretamente acoplado ao

espectrômetro ESI-Q/Tof Ultima API. As soluções empregadas como fases móveis

foram acetonitrila e ácido fórmico a 0,1 %, água e ácido fórmico a 0,1 % e água

Milli-Q. Um padrão de íon interno foi empregado a fim de proporcionar alta exatidão

nas medidas de massas em ambos os modos de aquisição MS e MS/MS.

O preparo das proteínas recombinantes provenientes das cromatografias de

exclusão por tamanho foi feito utilizando o protocolo padrão de digestão tríptica com

Materiais e Métodos

70

pequenas modificações quando necessário. Proteínas rXfHNL foram preparadas sem

a etapa de redução e alquilação por não apresentarem resíduos de cisteínas. Todos os

reagentes foram preparados imediatamente antes do uso. As soluções protéicas a 532

µg mL-1 foram previamente dessalinizadas, liofilizadas em Speed-vac e

ressuspendidas em 1,5 mL de bicarbonato de amônio 0,05 mM a pH 8,0.

Quando necessário, a etapa de redução e alquilação se deu após a adição de

apenas 100 µL de bicarbonato de amônio e pela adição de 5 µL de DTT a 45 mM e

iodoacetamida a 100 mM. Em seguida, a mistura foi incubada por 1 hora a 56 ºC em

atmosfera de N2. Passado este período, iodoacetamida foi adicionada mantendo-se as

amostras sob incubação a temperatura ambiente por mais 2 horas no escuro. Antes do

início da digestão com tripsina, o restante do volume de bicarbonato de amônio foi

adicionado às misturas.

Finalmente, a digestão das amostras foi realizada adicionando-se 399 µL de

solução de tripsina a 20 µg mL-1, contendo 7,98 µg de tripsina modificada a uma

proporção enzima:substrato de 1:50 (w/w). A digestão ocorreu a 37 °C overnight. As

reações enzimáticas foram interrompidas adicionando-se 20 µL de TFA a 5%.

A seqüência de resíduos obtidos foi submetida ao sistema de busca NCBI-

BLAST a fim de encontrar proteínas que apresentassem identidade seqüencial com

as proteínas recombinantes.

II. 2.14.4 – Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (SAXS) e

Análises dos Dados

A técnica de análise SAXS (small-angle X-ray scattering) fornece informações

globais matemáticas quanto à forma, tamanho e estado de oligomerização de

Materiais e Métodos

71

macromoléculas em solução. Nesta técnica, um feixe de raios-X é incidido na

amostra fazendo com que cada um de seus elétrons se torne uma fonte de onda

espalhada, de modo que um padrão de espalhamento é observado. Este padrão

contém informações sobre a estrutura espacial das partículas na amostra nas quais

definem sua estrutura quaternária através de simulações com modelos.

O uso dos raios-X na caracterização estrutural de macromoléculas depende

essencialmente de sua interação com a matéria através dos elétrons que constituem

seus átomos e moléculas. Como o comprimento de onda de raios-X por radiação

síncroton é próximo a 1 Å, que é correspondente a magnitude das ligações químicas,

é possível detectar a configuração espacial dos átomos e moléculas que a compõe.

As análises de SAXS foram realizadas junto ao LNLS com auxílio do Dr

Wânius Garcia e do Ms. Mario Oliveira Neto, usuário cadastrado nesta instituição.

Os dados de SAXS foram feitos empregando-se feixes a baixos ângulos e detectores

unidimensionais (KELLERMANN et al., 1997). As curvas de espalhamento das

soluções protéicas e dos correspondentes tampões foram monitoradas a

comprimentos de onda de 0,148 nm com a distância amostra-detector de 732,1 mm,

intervalos de medida (momentum transfer range) de 0.15 < q < 2 nm-1 (q = 4πsinθ/λ,

onde 2θ é o ângulo de espalhamento) e coletados em intervalos (frames) de 100

segundos a fim de monitorar danos na radiação e na estabilidade do feixe. Os dados

obtidos foram normalizados à intensidade do feixe incidente e a resposta do detector

corrigida. O espalhamento do tampão foi subtraído e as diferentes curvas foram re-

escalonadas para concentração.

Soluções de proteínas recombinantes provenientes da cromatografia de

afinidade foram preparadas a concentrações de 3 e 12 mg mL-1 em tampão de lise

Tris-HCl.

Materiais e Métodos

72

A determinação dos parâmetros necessários para o refinamento dos dados

experimentais foi realizada empregando-se diversas ferramentas computacionais. Os

cálculos da inclinação molecular da proteína a baixas resoluções foram recuperadas

dos dados experimentais de SAXS utilizando-se o procedimento ab initio

implementado no programa GASBOR (PETOUKHOV et al., 2003; DAMMIN et al.,

1998; SVERGUN et al., 1992; SVERGUN et al., 1988). Este programa gera modelos

ab initio de baixa resolução com seqüências ao acaso Cα denominadas curvas

Dummy Atom Model (DAM). A idéia principal é enovelar este modelo a fim de

reduzir a discrepância (χ) entre as curvas DAM e as experimentais. O programa

simula a estrutura interna das proteínas e não é necessário subtrair as constantes de

intensidade de Porod (PETOUKHOV et al., 2003; DAMMIN et al., 1998;

SVERGUN et al., 1992; SVERGUN et al., 1988). Os raios de giro (Rg) foram

avaliados segundo o método Guinier (ln I(q) x q2) (SVERGUN et al., 1992;

SVERGUN et al., 1988) e pelo programa de transformada de Fourier indireta

GNOM (SVERGUN et al., 1992; SVERGUN et al., 1988). As funções de

distribuição de distâncias p(r) também foram avaliadas pelo mesmo programa.

O banco de dados de estrutura de proteínas PDB (Protein Data Bank,

Piscataway, NJ, EUA) foi utilizado a fim de encontrar proteínas de outros

organismos com identidade de seqüência e função. Seus dados estruturais foram

empregados como modelos comparativos para determinação das estruturas

quaternárias das proteínas recombinantes deste estudo. O programa CRYSOL

(PETOUKHOV et al., 2003; DAMMIN et al., 1998; SVERGUN et al., 1992;

SVERGUN et al., 1988) gerou o espalhamento teórico das proteínas utilizadas como

modelos, proporcionando parâmetros como raio de giro, distância máxima das

partículas e o volume do envelope de partículas. Foi também possível comparar as

Materiais e Métodos

73

curvas experimentais com estes espalhamentos teóricos e calcular o fator de

discrepância entre elas provando suas similaridades.

II. 2.14.5 – Espectroscopia de Dicroísmo Circular (CD) e Cálculo

das Frações de Estrutura Secundária

A espectroscopia de dicroísmo circular (Circular Dichroism, CD) é a

propriedade que uma molécula quiral tem de absorver diferentemente a luz

circularmente polarizada à direita e à esquerda. (CAMPBEL et al., 1984; CANTOR

et al., 1980).

Peptídeos e proteínas são amplamente estudados por CD, pois estão repletos de

centros quirais (carbonos α, Cα) distribuídos ao longo da cadeia principal em hélices

alfa, folhas beta, estruturas desordenadas e voltas denominadas estruturas

secundárias. Portanto, é possível caracterizar a estrutura secundária dessas

macromoléculas e quantificá-las por seus espectros de CD. A região do UV-distante

nos espectros de CD, entre 180 e 260 nm, fornece informações capazes de

caracterizar e discriminar as estruturas presentes nestas moléculas (SREERAMA et

al., 2000). A Figura 16 mostra os espectros de CD de proteínas compostas por

diferentes tipos de estrutura secundária.

Materiais e Métodos

74

Figura 16. Espectro de CD de vários tipos de estrutura secundária. Os espectros representam α-

hélice (____), folha-β (- - - -), voltas-β (. . . .) e estrutura irregular (. . - -). Modificada a partir de Kelly &

Price, 1997.

A espectroscopia de CD em proteínas e peptídeos é uma ferramenta muito

utilizada no estudo de mudanças conformacionais induzidas por interações da

proteína com ligantes específicos e solventes, assim como verificar alterações

ocorridas em função da temperatura, do pH, da força iônica e monitorar fenômenos

de desnaturação e renaturação na interação com ligantes (CANTOR et al., 1980).

A estimativa do conteúdo de estrutura secundária de uma proteína é feita com

base num grupo de proteínas de referência que possuem estrutura secundária e

espectros de CD conhecidos. Com o auxílio de programas computacionais, que

utilizam diferentes métodos de desconvolução, são extraídas as componentes comuns

dos espectros de CD da proteína analisada e a porcentagem que as mesmas

representam no espectro (SREERAMA et al., 2000).

Materiais e Métodos

75

As medidas de CD foram realizadas a temperatura controlada de 25 oC

utilizando o espectropolarímetro JASCO J-720 (JASCO Corporation, Tóquio, Japão),

na faixa de 198 a 250 nm em cubetas cilíndricas de quartzo de caminho óptico de 1

mm. Os espectros de CD foram tipicamente recuperados empregando-se médias de

16 varreduras. As contribuições dos tampões obtidos sob condições idênticas foram

subtraídas e todos espectros de CD foram corrigidos a fim de eliminar quaisquer

efeitos de ruído. Os espectros originais foram ainda filtrados com Transformadas de

Fourier, preservando as bandas típicas de cada espectro. Em todos os casos, eles

foram obtidos em elipticidade (θ) e, convenientemente transformados em elipticidade

molar ([θ]).

As soluções protéicas provenientes da purificação em coluna de afinidade,

devidamente dialisadas, foram utilizadas para analisar a integridade das estruturas

secundárias nas condições de extração e monitorar as possíveis mudanças

conformacionais induzidas por influência do pH através das medidas de CD. A

concentração das amostras foi de 10 µM em tampão acetato-borato-fosfato de sódio

20 mM contendo NaCl 150 mM. As amostras foram incubadas em soluções

tamponadas a pH variando de 3 a 10.

As contribuições de estrutura secundária pelo espectro de CD das proteínas

recombinantes foram calculadas utilizando o pacote de desconvolução CDPro

software package, que inclui três programas SELCON3, CONTINLL e CDSSTR,

providos de um grupo de proteínas de referência contendo 43 espectros de CD

(SREERAMA et al., 2000; SREERAMA et al., 1999; SREERAMA et al., 1993). A

partir dos resultados fornecidos pelos três programas, uma média destes resultados

foi realizada para encontrar as frações de estruturas secundárias dos espectros de CD.

Materiais e Métodos

76

II. 2.14.6 - Espectroscopia de Emissão de Fluorescência

A absorção da radiação eletromagnética de um determinado comprimento de

onda por um cromóforo, pode fazer com que seus elétrons passem do estado

eletrônico fundamental para um estado eletrônico excitado. Muitas vezes, esta

energia de excitação é perdida para o meio sob a forma de calor, promovendo o

retorno do elétron para o estado fundamental. Quando este elétron retorna para o

estado fundamental através do seu decaimento do menor nível de energia vibracional

do estado eletrônico excitado (S1) para o estado eletrônico fundamental (S0) pela da

emissão de um fóton, a fluorescência ocorre refletido por um comprimento de onda

maior que o da excitação (CAMPBELL et al., 1984; CANTOR et al., 1980). A

Figura 17 mostra o diagrama de Jablonski que representa este processo.

Materiais e Métodos

77

Figura 17. Diagrama de Jablonski. A absorção de determinada quantidade de energia faz com que

um elétron passe do menor estado vibracional do estado fundamental (S0) para um estado vibracional

superior do estado excitado S1 ou S2 (setas vermelhas). Após passar por processos não radiativos

(setas azuis), que conduzem o elétron ao menor nível vibracional do primeiro estado excitado, pode

ocorrer emissão de fluorescência (seta verde), que é a emissão de um fóton devido ao decaimento do

estado S1 para o estado fundamental S0. A relaxação do elétron também pode ocorrer pela emissão de

um fóton devido ao decaimento de um estado tripleto (T1) para o estado eletrônico fundamental (S0),

processo chamado de fosforescência (seta laranja).

A espectroscopia de emissão de fluorescência estática também é largamente

utilizada para caracterizar macromoléculas biológicas e verificar mudanças

conformacionais discretas no microambiente dos grupos fluorescentes naturais

(fluorórofos) como triptofano (Trp), tirosina (Tyr) e fenilalanina (Phe). A

fluorescência destes resíduos é altamente sensível ao ambiente em que se encontram,

portanto, é possível monitorar suas alterações por parâmetros como posição do

máximo de emissão (λmax) e rendimento quântico (φF) devido à ação de solventes,

ligantes, supressores, íons ou agentes solubilizantes (LAKOWICZ et al., 1999).

As medidas de emissão de fluorescência das proteínas recombinantes foram

realizadas no modo estático utilizando-se o espectrofluorímetro K2 (ISS Inc.,

S0

S1

S2

Absorção Fluorescência Fosforecência

Cruzamento Intersistemas

Conversão Interna

T1

Materiais e Métodos

78

Champaign, IL, EUA) acoplado a um sistema de banho refrigerador modelo RTE-

111 (Neslab, Willow Brook Road, Freehold, NJ). Os espectros de fluorescência

foram obtidos a temperatura controlada de 25 oC. Amostras foram excitadas a 295

nm e a emissão de fluorescência foi monitorada no intervalo de 300 a 450 nm.

Cubetas retangulares de quartzo de 1 cm de caminho ótico foram utilizadas nas

medidas. A fim de minimizar o efeito do espalhamento de luz, os espectros de

emissão de fluorescência dos tampões foram subtraídos dos espectros das

correspondentes amostras.

As proteínas recombinantes provenientes da purificação em coluna de afinidade

também foram utilizadas nas medidas de fluorescência para analisar o microambiente

dos resíduos de triptofano nas condições de extração. As possíveis mudanças

conformacionais induzidas por influência do pH através das medidas de

fluorescência também foram investigadas. A concentração das amostras foi de 37

µM em tampão de lise Tris-HCl.

II. 2.14.7 – Ensaios de Estabilidade Térmica e Química das

Proteínas Recombinantes

II. 2.14.7.1 – Ensaio de Estabilidade Térmica Frente a

Variações de pH

Os estudos de desnaturação térmica das proteínas recombinantes foram

caracterizados por CD nos diferentes pHs medindo-se as mudanças de elipticidade a

222 nm induzidas pelo aumento de temperatura de 20 a 80 oC com taxa de

aquecimento de 10 oC por hora.

Materiais e Métodos

79

Novos espectros de CD das amostras protéicas incubadas em soluções

tamponadas a pH variando de 3 a 10 foram tomados após 12 horas de incubação à

temperatura ambiente em cada um dos pHs escolhidos. A concentração das amostras

protéicas para as medidas de CD foi mantida a 17 µM.

O equipamento e a metodologia empregada nas análises de estabilidade térmica

frente a variações nos pHs foram os mesmos descritos anteriormente.

II. 2.14.7.2 - Ensaio de Estabilidade Química Frente a

Variações na Concentração de Uréia

O estudo da desnaturação química das proteínas recombinantes frente a

diversas concentrações de um agente desnaturante também foram realizadas por

ambas as técnicas espectroscópicas, CD e fluorescência. A desnaturação química foi

monitorada empregando-se soluções protéicas a 5, 10 e 20 µM de concentração em

tampão de lise Tris-HCl contendo diferentes concentrações de uréia (0 a 6 M). Os

estudos de desnaturação química, caracterizados por CD, foram medidos através das

mudanças de elipticidade a 222 nm induzidas pelo aumento da concentração de uréia.

Todos os experimentos foram levados a temperatura controlada de 25 oC. As

contribuições dos tampões foram subtraídas de todos os experimentos.

Os equipamentos e as metodologias empregadas nas análises de estabilidade

química frente à uréia foram os mesmos descritos anteriormente em cada técnica

espectroscópica.

Materiais e Métodos

80

II. 2.14.8 – Estudos de Atividade Enzimática das Proteínas

Recombinantes

O conhecimento teórico sobre cinética enzimática permitiu o desenvolvimento

de ensaios quantitativos de atividade enzimática. Utilizando métodos analíticos

relativamente simples como a espectrofotometria foi possível analisar a quantidade

dos produtos formados ou consumidos pela adição das enzimas a uma solução

tamponada com concentração conhecida de substrato. As reações ocorreram em

tempos fixos, em condições determinadas de temperaturas e pHs. O uso de cofatores

foi empregado quando necessário.

II. 2.14.8.1 – Hidroxinitrila Liase de Xylella fastiosa (rXfHNL)

A atividade enzimática da rXfHNL foi determinada seguindo a clivagem do

substrato, mandelonitrila racêmica, em benzaldeído e ácido cianídrico (HCN) a 25

oC. A formação do benzaldeído foi monitorada espectrofotometricamente a 280 nm,

comprimento de onda na qual a absorção da mandelonitrila pode ser negligenciada,

já que não é o comprimento do máximo de absorção da mesma.

As medidas de atividade foram realizadas utilizando-se o espectrofotômetro

UV–Vis Hitachi, modelo U-2800, acoplado a um computador para aquisição e

tratamento dos dados. As cubetas utilizadas para monitorar a reação eram

retangulares, providas de tampa, de quartzo, com 1 cm de caminho ótico e

capacidade de 1,5 mL. Todas as soluções foram mantidas a 25 °C durante a dosagem

e as amostras foram analisadas em triplicata.

Materiais e Métodos

81

A mistura reacional foi preparada utilizando o tampão fosfato de sódio a 50

mmol L-1 contendo NaCl a 150 mM nos pHs 5 e 7. As concentrações finais de

mandelonitrila e rXfHNL na mistura reacional foi de 0,5 mM e 0,05 µM,

respectivamente. A velocidade da reação ou de formação dos produtos foi

acompanhada por um intervalo de 8 min. Tampão fosfato de sódio contendo

mandelonitrila racêmica foi utilizado como branco das amostras para zerar o

espectrofotômetro. A atividade da enzima rXfHNL foi monitorada na ausência e na

presença do cofator FAD.

II. 2.14.8.2 – Corismato Sintase de Xylella fastiosa (rXfaroC)

A atividade enzimática da rXfaroC foi determinada seguindo a formação do

corismato a partir da do ácido corísmico em presença de NADH e FMN a 25 oC. A

formação do corismato foi monitorada espectrofotometricamente a 340 nm.

As medidas de atividade foram realizadas utilizando-se o espectrofotômetro

UV–Vis Hitachi, modelo U-2800, acoplado a um computador para aquisição e

tratamento dos dados. As cubetas utilizadas para monitorar a reação eram

retangulares, providas de tampa, de quartzo, com 1 cm de caminho ótico e

capacidade de 1,5 mL. Todas as soluções foram mantidas a 25 °C durante a dosagem

e as amostras foram analisadas em triplicata.

A mistura reacional foi preparada utilizando o tampão fosfato de potássio a 50

mM contendo NaCl a 150 mM no pH 7,8. As concentrações finais de ácido

corísmico e rXfaroC na mistura reacional foi de 0,4 mM e 0,1 µM, respectivamente.

A velocidade da reação ou de formação dos produtos foi acompanhada por um

intervalo de 8 min. O Tampão fosfato de potássio contendo NADH e FMN foi

Materiais e Métodos

82

utilizado como branco das amostras para zerar o espectrofotômetro. A atividade da

enzima rXfaroC foi monitorada na ausência e na presença do cofator NADH.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

83

III – RESULTADOS E DISCUSSÃO

III. 1 – Hidroxinitrila Liase

III. 1.1 – Amplificação e Clonagem no Vetor pGEM-T easy

As suspensões bacterianas utilizadas na extração do DNA genômico foram

do isolado 9a5c da bactéria X. fastidiosa. Inicialmente, a qualidade e a

concentração do DNA genômico obtido foi visualmente medida através da

eletroforese em gel de agarose 0,8 % e, subseqüentemente, confirmada através de

leituras em espectrofotômetro (A260/A280), como descrito em materiais e métodos.

A metodologia empregada segundo Ausubel et al .(AUSUBEL et al., 1995),

permitiu a obtenção de um DNA puro e de boa qualidade com rendimentos totais

de 100 a 500 ng µL-1 suficiente para os experimentos seguintes.

Como mencionado anteriormente, os oligonucleotídeos utilizados na

amplificação foram desenhados com base na seqüência da ORF SCJ21.16 e

tiveram sítios de restrição para as enzimas NdeI e XhoI incorporados preservando

seus códons originais de iniciação e terminação. Estes sítios de restrição nos

iniciadores empregados para a amplificação foram inseridos de forma a permitir

sua subclonagem nos vetores de expressão. Adicionalmente, a temperatura de

anelamento do par de iniciadores (F e R) desenhado foi calculada teoricamente

através do software Gene Runner 3.05 (Hastings Software Inc., EUA) a fim

garantirmos que estes apresentassem temperaturas próximas e evitassem assim a

formação de estruturas indesejáveis como dímeros e grampos que podem não só

acarretar em suas auto-complementariedade, resultando na obtenção de

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

84

subprodutos, como também provocar perda de eficiência da reação de

amplificação do DNA de interesse. A temperatura ótima encontrada ficou em

torno dos 54 oC.

Com base na temperatura de hibridização calculada para o par de

oligonucleotídeos desenhado foi possível a amplificação do fragmento

correspondente à proteína hidroxinitrila liase, porém com baixa concentração

Nesta temperatura bandas inespecíficas estiveram presentes em ambas as

extremidades do gel utilizado para avaliar as amostras amplificadas. Estas foram

atribuídas a prováveis excessos de dNTPs, DNA genômicos e eventuais

subprodutos na reação de amplificação. Diante deste primeiro resultado, fez-se

necessário um processo de otimização da PCR a fim de garantir o máximo de

eficiência na obtenção dos produtos desejados. Assim, somente quando foi

empregada a temperatura de hibridização dos primers de 52 oC foi possível a

amplificação desejada.

A Figura 18 ilustra o resultado desta amplificação a qual gerou o produto de

850 pares de bases. O produto de amplificação obtido pela PCR teve o seu

tamanho concordante com o previsto, não apresentou nenhuma banda inespecífica,

indicando o sucesso da otimização e resultou em quantidades suficientes para

procedermos a posterior clonagem.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

85

pb 1 212000

5000

2000 1650

1000 850 650 500 400 300 200 100

Figura 18. Amplificação da ORF codificadora da proteína hidroxinitrila liase. A coluna 1 é o

padrão de massa molecular 1 kb Plus DNA Ladder da Gibco BRL. A coluna 2 é a ORF SCJ21.16

amplificada. O meio de separação foi gel de agarose 0,8 % em tampão 1X TAE, pH 8,3. A

voltagem aplicada na separação foi 100 V por 30 min. Os fragmentos de DNA no gel foram

visualizados em transiluminador UV a 365 nm.

Os produtos da amplificação por PCR foram devidamente purificados pelo

kit Wizard PCR Clean-up da Promega, quantificados em espectrofotômetro e

adenilados para inseri-los no vetor de clonagem pGEM-T easy. A concentração

obtida para estes produtos variou de 500 até 700 ng µL-1. A construção nos vetores

de clonagem foi denominada de pGEM-XfHNL. A escolha deste sistema foi

empregada para propagação baseada no fato deste vetor ser muito conveniente

para clonar produtos de PCR facilitar a seleção dos clones positivos. Este vetor

apresenta 3018 pb e contém duas marcas de seleção ao longo de sua seqüência, um

gene que confere resistência ao antibiótico ampicilina e outro gene que codifica

para a proteína β-galactosidase localizado no sítio de múltipla clonagem.

Os plasmídeos recombinantes pGEM-XfHNL recém construídos foram

inseridos por choque térmico em bactérias de E. coli DH5α competentes. As

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

86

bactérias transformadas foram semeadas em placas de Petri contendo meio LB,

ágar, ampicilina, X-gal e IPTG e crescidas overnight em estufa por incubação a 37

oC. A Figura 19 mostra um exemplo dos resultados obtidos com a transformação

das bactérias DH5α.

Figura 19. Colônias Recombinantes e Não Recombinantes de Células E. coli DH5α. Células

competentes DH5α foram transformadas com os construídos recombinantes pGEM-XfHNL,

plaqueadas em meio LB contendo ágar, ampicilina, X-gal e IPTG e incubadas overnight a 37 oC.

As colônias que tiveram o gene da β-galactosidase interrompido apresentaram coloração branca e

as colônias que tiveram o gene intacto apresentaram coloração azul. As colônias brancas são os

prováveis clones positivos.

Diversas colônias brancas e azuis cresceram na placa contendo o meio

selecionado descrito acima. A seleção dos transformantes foi realizada então pela

capacidade de crescer em presença do antibiótico ampicilina e através da coloração

branca de algumas colônias transformantes indicativa da presença do inserto

dentro da região codificadora da enzima β-galactosidase. Dentre as colônias

brancas resistentes, cinco foram escolhidas aleatoriamente, inoculadas em tubos

estéreis contendo meio LB líquido com ampicilina e submetidas à incubação

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

87

overnight a 37 oC sob agitação. Após o crescimento individual destas colônias seus

DNAs plasmidiais foram extraídos, quantificados, clivados por enzimas de

restrição para checar a presença do inserto e, finalmente, seqüenciados.

III. 1.1.1 – Análise de Restrição e Seqüenciamento dos

Plasmídeos Recombinantes

Os DNAs plasmidiais dos 5 prováveis clones positivos, extraídos através dos

métodos de lise alcalina e pelo kit Wizard Miniprep® (descritos em II.2.7), foram

inicialmente considerados de boa qualidade e adequados para as análises de

restrição e seqüenciamento. É importante ressaltar que em algumas das análises de

restrição ocorreu baixa eficiência da clivagem pela enzima NdeI, a qual requer

geralmente DNAs livre de impurezas para que ocorra uma boa digestão

enzimática. Sendo assim, sempre que necessário foi empregado para estas análises

DNA obtido pelo protocolo de extração através kit. As amostras de DNA

plasmidial extraídos pelo kit e pelo método de lise alcalina apresentaram em geral

concentrações de 200 e 150 ng µL-1, respectivamente.

A análise de restrição empregando as enzimas NdeI e XhoI foi realizada a

fim de confirmar a presença do inserto nos clones selecionados. Nesta análise, o

tamanho do inserto foi avaliado pela clivagem do plasmídeo em sítios de restrição

adjacentes ao sítio de clonagem, com posterior eletroforese em gel de agarose. A

Figura 20 apresenta o perfil de restrição destes cinco clones selecionados.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

88

1 2 3 4 5 6 pb 3000 850

Figura 20. Separação dos plasmídeos digeridos pGEM-XfHNL. A coluna 1 é o padrão de massa

molecular 1 kb Plus DNA Ladder da Gibco BRL. As colunas 2 a 6 são os clones positivos

selecionados a serem utilizados na etapa de subclonagem nos vetores de expressão. O meio de

separação foi gel de agarose 1 % em tampão 1X TAE, pH 8,3. A voltagem aplicada na separação

foi 100 V por 30 min. Os fragmentos de DNA no gel foram visualizados em transiluminador UV a

365 nm. As bandas específicas dos genes XfHNL e dos plasmídeos digeridos estão representados

por setas cujos tamanhos são aproximadamente 3000 e 850 pb, respectivamente.

A presença e o tamanho dos insertos confirmaram o sucesso das etapas de

clonagem e transformação das bactérias. Os produtos da digestão de 850 pb

correspondente a ORF XfHNL foram retirados do gel, purificados utilizando-se

novamente o kit Wizard PCR Clean-up, quantificados e utilizados na etapa de

subclonagem nos vetores de expressão. Estas amostras de DNA apresentaram em

geral concentrações variando de 100 a 150 ng µL-1.

As seqüências resultantes do gel de seqüenciamento foram analisadas através

do programa Sequencing Analysis V 3.4 que capturou automaticamente os dados

coletados de cada amostra analisada no seqüenciador e extraiu as bases de cada

seqüência arquivando-as em arquivos textos e em forma de eletroferogramas.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

89

A Figura 21 ilustra a seqüência resultante de um dos clones submetidos ao

seqüenciamento.

TCNATNNNTT GCGTCATATG CTCCNNGCCG CNTGGNNGCC GCGGGAANNC AATTCCATAT GAACGCATAC

CGTCCTATCG CTTTTGCCTC ATCCGCAGCA TCTGATAAGC CAACCGTTTT ACTGAAACCG ACAATTGTGC

TCGTACACGG TGCTTTTGCT GATGGTTCTA CATGGAACAA AGTAATCCAT CAGCTCCAGG CAAAAGGGCT

GAATGCTGTG TCCGNTCAAA ATCCGCTGAC GTCTTTCGAA GATGATGTAG CAGCAACACG CCGTGTGCTT

GCTCTGCAAA CGGGACCTGT AGTGCTCGTT GGCCACTCTT ATGGGGGAGC AGTGATTACT GAAGCTGGAC

AAGATGAACG AGTTAAAGCC CTAC-TTATA TTGCCGCATT TGCTCCATCC GAGGGAGAG TCGGTTGCTG

ATCTGAATAA AAAATATCCA TTACCTTCTG GATATAATCA TCTCAGCAGT GACAAAGAAG GGTTCCTGAT

GCTAACGCCA GAAGGTGTGG AAAAATACTT GGCGCAGGAT ATCCCCCTTG AGCAAACTCG CCTGATCATC

GCCACTCAGC ACCCTATACG CGGCGCCAAT TTTGAAAAAA AGGTTTCAGC TGCCGCTTGG GAAACTAAAC

CATCATGGTA TTTGNTGAGT GAGAATGATC TTATNCTTCA GCCAGCGCTG CAAAAAGAGA TGGCTCAAAA

AATAGGTGCT CATATCGTCA ATGTGGCAGC CAGCCATGTG CCACATCTTT CACATGCTGC GGAAGTAGAA

AAAATCATCA GAGTGCAGT CAACGATGTT GAAGTATTAG AATAACTCGA GCGGAATCAC TAGTGATATC

GCGGACACCT GCAGCTCTAG CATATGGAGA GCTCCCATNG NGTTNGNN

Figura 21. Bases seqüenciadas do plasmídeo pGEM-XfHNL extraído do clone 1. As bases em

vermelho correspondem a ORF SCJ21.16 que codifica para proteína hidroxinitrila liase. As bases

em negrito e sublinhado são correspondentes às seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores. Os

nucleotídeos em negrito preto foram são os não identificados pelo seqüenciador.

As seqüências resultantes foram submetidas a um processo de busca por

similaridade em diversos bancos de dados internacionais, através de servidores de

busca disponíveis na rede. O principal programa utilizado foi o software público

BLAST, cujos resultados mostraram similaridade de seqüência variando de 90 a

95% de identidade frente à cadeia nucleotídica correspondente a ORF deste

estudo, confirmando a presença da região alvo desejada.

De modo geral os clones seqüenciados apresentaram pequenas variações

entre si, que podem ser atribuídos a erros de leitura ou mesmo a erros gerados

durante a marcação para o seqüenciamento ou na amplificação. No entanto, os

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

90

plasmídeos pGEM-XfHNL destes cinco clones apresentaram os genes de interesse

inseridos na orientação e com fase de leitura corretas dentro dos vetores pGEM-T

easy garantindo assim a integridade destes clones e a posterior leitura eficiente de

todas as bases dos fragmentos na etapa de expressão protéica.

III. 1.2 – Subclonagem no Vetor de Expressão e Análise de

Restrição dos Plasmídeos Recombinantes

Os fragmentos de DNA de 850 pb que codificam para a proteína rXfHNL

foram subclonados nos vetores pET28a. Esta nova construção denominada pET-

XfHNL foi escolhida para expressar a proteína de interesse fusionada com uma

cauda de seis histidinas. Novamente, os plasmídeos recombinantes recém

construídos foram inseridos por choque térmico em bactérias de E. coli DH5α

competentes, semeadas em placas semelhantes ao processo anterior, porém

somente com adição de canamicina, o novo antibiótico de seleção, e finalmente

incubadas para o crescimento. A seleção das colônias neste caso foi realizada

unicamente pela análise de restrição, já que o vetor pET28a não apresenta genes

que as tornem de coloração diferenciada.

Após o período de crescimento celular, novamente cinco colônias foram

selecionadas aleatoriamente dentre as muitas colônias presentes na placa de Petri,

e inoculadas seguindo o mesmo processo descrito anteriormente. Após o

crescimento individual destas células, seus DNAs foram extraídos, quantificados e

uma alíquota destes DNAs foi clivada por enzimas de restrição. Estas amostras de

DNA também apresentaram concentrações variando de 100 a 150 ng µL-1. A

Figura 22 ilustra o novo perfil de restrição destes cinco clones selecionados.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

91

1 2 3 4 5 6 pb 5000 850

Figura 22. Separação dos plasmídeos digeridos pET-XfHNL. A coluna 1 é o padrão de massa

molecular 1 kb Plus DNA Ladder da Gibco BRL. As colunas 2 a 6 são os clones positivos. O meio

de separação foi gel de agarose 1 % em tampão 1X TAE, pH 8,3. A voltagem aplicada na

separação foi 100 V por 30 min. Os fragmentos de DNA no gel foram visualizados em

transiluminador UV a 365 nm. As bandas específicas dos genes XfHNL e dos plasmídeos digeridos

estão representados por setas.

A presença dos insertos em todos os clones selecionados confirmou o

sucesso das etapas de subclonagem e transformação das bactérias. Uma vez

confirmada a presença do inserto, apenas os clones 1 e 2 (equivalentes as 2 o e 3o

canaletas do gel) os quais apresentaram maior intensidade de banda, foram

utilizados para transformar as células competentes de expressão de E. coli

BL21(DE3). A seleção de dois novos clones contendo as ORFs subclonadas nos

vetores de expressão foi realizada após o plaqueamento das células em meio

adequado,e estes clones foram empregados na produção da proteína expressa de

forma heteróloga.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

92

III. 1.3 – Expressão Heteróloga da Proteína rXfHNL a partir dos

Vetores de Expressão

A produção da proteína recombinante foi realizada inicialmente por meio da

indução da expressão por IPTG a 37 oC. Visando otimizar o período de expressão

protéica, alíquotas foram retiradas de hora em hora para a quantificação da

expressão de modo a obter quantidades adequadas da proteína recombinante a

serem empregadas nas etapas de caracterização. Passado o período de indução de 4

horas, as células bacterianas resultantes foram recuperadas por centrifugação e

lisadas na presença de tampão de lise tris-HCl. Os extratos protéicos foram

avaliados quanto a sua solubilidade em SDS-PAGE, em tampão com condições

próximas à fisiológica.

A Figura 23 mostra um gel de SDS-PAGE a 15% obtido após submeter às

amostras a condições desnaturantes.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

kDa

66

45

29

20,1

12,4

Figura 23. Expressão da proteína rXfHNL a partir dos clones 1 e 2. A análise foi realizada em

SDS-PAGE a 15%. As colunas 1 a 4 e 6 a 9 representam as proteínas das expressões dos clones 1 e

2 em BL21(DE3) pET-rXfHNL, respectivamente. As colunas 1 e 6 são os extratos protéicos totais

não induzido dos sistemas de expressão. As colunas 2 e 7 são os extratos protéicos totais induzidos.

As colunas 3 e 8 são as frações insolúveis pós lise celular. E as colunas 4 e 9 são as frações

solúveis pós lise celular. A coluna 5 é o marcador de massa molecular. A seta indica a expressão

diferenciada esperada na região de 29 kDa.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

93

A presença de banda diferenciada nas frações induzidas 2 e 7 tem o

tamanho esperado para a proteína rXfHNL, aproximadamente 30 kDa, revelando

sucesso na metodologia de expressão adotada.

Além disso, após a lise celular foi constatado que a proteína se apresentou

em grande quantidade nas frações solúveis com o emprego do tampão tris-HCl,

apesar de ter sido também observada a permanência da proteína na fração

insolúvel do sistema de expressão, indicativo de que um processo de otimização da

lise celular poderia ser empregado durante os experimentos.

Porém, com o rendimento aparentemente satisfatório da forma solúvel,

apenas uma adaptação do procedimento de lise celular foi empregado para

aumentar a quantidade da proteína recombinante na fração solúvel. Esta adaptação

envolveu o aumento dos ciclos de sonicação e consequentemente de descanso do

procedimento de lise celular. As frações solúveis foram, então, empregadas na

etapa de purificação da proteína rXfHNL.

A produção em maior escala da proteína em E.coli foi realizada depois de

otimizado o processo de indução, cuja quantidade foi suficiente tanto para as

etapas de purificação quanto para os subseqüentes estudos estruturais e funcionais.

III. 1.4 – Purificação da Proteína rXfHNL por Cromatografia de

Afinidade e Exclusão por Tamanho

As frações solúveis das culturas induzidas provenientes da lise celular foram

submetidas à cromatografia de afinidade utilizando uma resina contendo níquel

imobilizado. As frações eluídas durante o processo cromatográfico foram

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

94

analisadas por SDS-PAGE. A Figura 24 mostra a separação eletroforética em gel

de poliacrilamida SDS-PAGE a 15% dos eluídos da coluna de Ni-NTA.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 kDa

66 45 30 20,1

12,4

Figura 24. Purificação da rXfHNL por cromatografia de afinidade. A análise das frações

eluídas da coluna Ni-NTA foi realizada em SDS-PAGE a 15%. A coluna 1 é o marcador de massa

molecular. A coluna 2 representa a fração não ligada na coluna de afinidade. As colunas 3 e 4

representam as frações de lavagem com 5 mM de imidazol. As colunas 5 e 6, as frações de lavagem

com 40 mM de imidazol. As colunas 7, 8 e 9, as frações de eluição com 100, 250 e 500 mM de

imidazol, respectivamente. As frações eluídas representam a proteína rXfHNL purificada e estão

indicadas pela seta.

A purificação da proteína recombinante rXfHNL foi alcançada em um único

passo cromatográfico. A pureza foi confirmada pelas frações eluídas com tampão

de lise trisHCl contendo 100, 250 e 500 mM de imidazol nas quais apresentaram

uma única banda de aproximadamente 30 kDa, sob condições desnaturantes.

Em algumas das purificações realizadas neste estudo eventuais proteínas

contaminantes foram observadas nas frações de eluição. Para tentar contornar a

presença de contaminantes após a purificação em resina de afinidade, a estratégia

de re-cromatografia de afinidade e cromatografia por exclusão molecular foram

empregadas quando necessário.

30

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

95

Em algumas ocasiões a simples re-cromatografia por afinidade não foi

suficiente para se obter a proteína pura o suficiente (resultados não mostrados).

Desta forma, a cromatografia de exclusão por tamanho foi empregada não só a fim

de permitir a obtenção de amostras mais puras como também prever o provável

grau de oligomerização da proteína rXfHNL frente a calibração da coluna com três

padrões de massa molecular.

O perfil de eluição da proteína rXfHNL comparado com os perfis dos

padrões é mostrado na Figura 25: Os padrões empregados foram soro albumina

bovina (66 kDa), ovalbumina (45 kDa), anidrase carbônica (30 kDa), α-

lactoalbumina (20,1 kDa) e inibidor de tripsina (14,4 kDa).

5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,50

100

200

300

400

500

600

ITS

a-Lacto

BSA

CA

Abs

orbâ

ncia

( m

AU

)

Volume de Eluição ( mL )

Ova

rXfHNL

Figura 25. Perfil cromatográfico da rXfHNL por cromatografia de exclusão por tamanho e

SDS-PAGE das frações eluídas. A separação de todas as amostras foi realizada individualmente

em coluna Superdex 75 HR 10/30 a 25 oC empregando o tampão de lise tris-HCl a pH 8,0. As

frações eluídas da cromatografia por exclusão molecular foram recolhidas e aplicadas em SDS-

PAGE a 15% corado com azul de Comassie. A coluna 1 é o marcador de massa molecular. As

colunas 2 a 5 são os volumes recolhidos de eluição de 10 a 13 mL. A seta aponta para a banda

correspondente à forma monomérica de aproximadamente 30 kDa da proteína de fusão.

1 2 3 4 5kDa

66

45

30

20,1 12,4

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

96

A proteína rXfHNL submetida da cromatografia de exclusão por tamanho foi

eluída como um único pico representado pelo volume de eluição próximo a 12 mL.

O emprego desta técnica mostrou-se capaz de separar a fração correspondente à

proteína rXfHNL em fração distinta daquelas dos contaminantes e do imidazol,

eluídos entre os volume de 6 a 8 mL e 16 a 25 mL, respectivamente. A eliminação

do excesso de imidazol comumente presente após cromatografia de afinidade

permitiu que a proteína de interesse fosse utilizada diretamente nas etapas de

caracterização sem a necessidade de empregarmos a diálise para sua remoção, o

que foi muito benéfico em termos de estabilidade protéica.

Além disso, a análise do perfil cromatográfico sugeriu inicialmente que o

grau de oligomerização da proteína rXfHNL é aparentemente monomérico devido

a presença de apenas um pico próximo a região de eluição do padrão anidrase

carbônica (CA) de 30 kDa de massa molecular. Era esperado que a presença de

prováveis formas diméricas da proteína em estudo apresentasse um pico nas

regiões correspondente ao dobro desta massa, ou seja, próximo ao padrão soro

albumina bovina de 60 kDa.

A eluição de uma macromolécula em experimentos de exclusão por tamanho

é usualmente dado pelo coeficiente de partição ou de distribuição (Kd) da proteína

entre as fases, móvel e estacionária. Na prática, Kd é difícil de determinar e é

substituída pelo Kav uma vez que há uma relação constante entre Kav e Kd. Kav

representa os volumes de eluição relativos e é um parâmetro calculado como

0

0

VVVV

KT

eav −

−= ( 1 )

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

97

onde Ve é o volume de eluição da proteína, V0 é o volume morto da coluna e

VT é volume total do gel na coluna (OHNO et al., 1968; ACKERS et al., 1967;

LAURENT et al., 1964). O V0 foi determinado utilizando Dextran Blue 2000.

Então, a massa molecular da proteína rXfHNL foi determinada pela interpolação

na regressão linear da curva padrão através dos valores de Kav. A Figura 26 mostra

o gráfico do coeficiente de partição Kav plotado como uma função da massa

molecular dos padrões de proteínas.

10 20 30 40 50 60 70

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35 a-Lacto

ITSCA

Ova

BSA

Kav

Massa Molecular

rXfHNL

Figura 26. Determinação do grau de oligomerização aparente da rXfHNL por cromatografia

de exclusão por tamanho. O peso molecular da rXfHNL foi determinado por regressão linear da

curva de calibração dos padrões pelos valores dos seus respectivos Kav. Os volumes de eluição

foram expressos em termos de Kav que foi determinado para cada proteína padrão utilizando a

expressão (Ve - Vo)/(Vt - Vo). A separação de todas as amostras foi realizada individualmente em

coluna Superdex 75 HR 10/30 a 25 oC empregando o tampão de lise tris-HCl a pH 8,0.

A curva de calibração resultante revelou uma relação linear (y = 0,74921 –

0,34994X; R = 0,984) entre o coeficiente de partição e a massa molecular de cada

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

98

proteína padrão representado na Figura 25, como era esperado para um mecanismo

de separação puramente baseado no tamanho. Em adição, o alto coeficiente de

correlação sugere o potencial para se estimar a massa molecular baseada na curva

de calibração. Estes resultados também sugerem que a proteína nativa existe como

monômero. A estrutura monomérica está em acordo com o observado pra os

membros da família das HNLs independentes de cofator. Durante a cromatografia

de exclusão nenhum outro pico foi observado sugerindo a homogeneidade da

proteína purificada.

Sendo assim, a purificação por cromatografia de exclusão por tamanho foi

considerada um procedimento adotado sempre que necessário.

III. 1.5 – Análises Físico-química e Estrutural da Proteína

rXfHNL

III. 1.5.1 – Determinação Quantitativa do Nível de expressão

Protéica

Para testar o nível de expressão da rXfHNL, as alíquotas retiradas da cultura

induzida em intervalos fixos de tempo foram analisadas por SDS-PAGE e

GelChip-CE. A Figura 27 mostra os resultados analíticos desta expressão gerados

por SDS-PAGE e pelo equipamento Bioanalyzer 2100 da Agilent. Os resultados

fornecidos por este último foram também dispostos como eletroferogramas, porém

não foram mostrados devido ao melhor efeito de comparação proporcionado entre

pela imagem na forma de gel virtual.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

99

Figura 27. Géis representativos das análises por (A) SDS-PAGE e (B) GelChip-CE. A

detecção em (B) foi baseada na fluorescência induzida a laser de um corante fluorescente, no qual

foi adicionado na matriz de separação. As amostras foram separadas individualmente em uma

solução polimérica apropriada fornecida pelo kit Protein 200 plus LabChip, como recomendado

pelo fabricante. MM é o padrão de massa molecular. As colunas 6 (em A) e 1 (em B), representam

os extratos protéicos totais não induzidos dos sistemas de expressão. As colunas 7 a 10 (em A) e 2

a 5 (em B) são as alíquotas dos extratos protéicos totais após 1, 2, 3 e 4 h de indução,

respectivamente. As colunas 1 a 5 são as diversas concentrações do padrão anidrase carbônica. As

bandas a 6 e 210 kDa no gel B são os marcadores que delimitam as separações das amostras por

Gel-ChipCE. As setas indicam as bandas específicas da proteína rXfHNL.

Quando analisado qualitativamente o gel SDS-PAGE, o maior nível de

expressão da rXfHNL aparentemente foi detectado após 2 horas do início do

processo de indução. Já na análise por microchip uma observação visual não

mostrou grandes diferenças com relação ao resultado prévio. Com a intenção de

realizar uma comparação mais minuciosa entre estes dois resultados, a

quantificação dos níveis de expressão da rXfHNL em SDS-PAGE foi analisada

por densitometria ótica já que as análises por microchip forneceram a

quantificação em tempo real de cada separação. A Figura 28 mostra o perfil da

quantificação da expressão da proteína rXfHNL pelas duas técnicas eletroforéticas.

A B

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10kDa

30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10kDa

30

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

100

1 2 3 4

30

45

60

75

90

Con

cent

raçã

o (n

g.µL

-1)

Tempo da Expressão (horas)

Figura 28. Resultado da expressão da rXfHNL em função do tempo por GelChip-CE e SDS-

PAGE. As amostras analisadas por Gel Chip-CE foram separadamente eletroforesadas e a

concentração e tamanho de cada banda separada foi automaticamente calculada pelo software. Os

resultados foram fornecidos em tempo real. As intensidades das bandas apresentadas por SDS-

PAGE foram quantificadas por densitometria empregando-se o software Kodak 1D image analysis

e anidrase carbônica como padrão quantitativo. Os quadrados em branco representam os dados da

SDS-PAGE, enquanto os quadrados em preto representam os resultados do Gelchip-CE.

A concentração protéica relativa de cada banda do GelChip-CE foi obtida

baseado na medida da área de cada pico dos eletroferogramas simultaneamente

gerados com o gel e comparadas a área de pico do marcador superior. O marcador

superior, uma proteína de concentração conhecida, serviu como padrão interno.

Para as análises do gel SDS-PAGE, a concentração protéica relativa foi baseada na

curva de calibração obtida utilizando diferentes quantidades do padrão anidrase

carbônica (CA).

Como pode ser visto na Figura 28, diferenças significativas nos níveis de

expressão da rXfHNL foram observadas nestes métodos de quantificação. O gel de

SDS-PAGE proporcionou resultados consistentes com as análises qualitativas

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

101

descritas anteriormente. O maior nível de expressão da rXfHNL

(aproximadamente 84 ng µL-1) foi alcançado duas horas após a indução para o gel

SDS-PAGE. No entanto, as análises por GelChip-CE demonstraram que a

expressão mais pronunciada foi após três horas de expressão protéica.

Esta diferença pode ser explicada pelo fato do gel SDS-PAGE ser um

método semiquantitativo. Além disso, sob as condições deste método, a

concentração de rXfHNL (principal banda) se apresenta fora da faixa dinâmica

linear do ensaio. Quando a concentração dos contaminantes estava ainda em uma

variação linear, a saturação na coloração da banda principal foi alcançada muito

antes da saturação das outras bandas correspondentes aos contaminantes. Portanto,

a porcentagem de rXfHNL encontrada pode ser considerada superestimada. O

método Gel-Chip-CE permite uma quantificação mais exata através de parâmetros

calculados automaticamente e proporcionados pelo software.

Assim, os tempos de indução para a produção em larga escala da rXfHNL

foram limitados a três horas. A massa molecular aparente da banda correspondente

a rXfHNL é de aproximadamente 30,4 kDa. Levando-se em conta a inclusão da

cauda adicional de 6 histidinas, esta massa molecular foi considerada mais

próxima daquela obtida por SDS-PAGE e coerente com a massa teórica de 29,1

kDa proporcionada pelo software Protein Parameters Tools

(www.bo.expasy.org/tools/protparam.html) obtida através da seqüência dos

aminoácidos.

Nenhum aumento no nível de expressão protéica foi observado quando

diferentes temperaturas de indução foram testadas. A proteína recombinante

rXfHNL foi sempre expressa na forma solúvel e a expressão como corpos de

inclusão não foi observada.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

102

III. 1.5.2 – Determinação do Ponto Isoelétrico

Inicialmente, o pI teórico para a proteína rXfHNL foi previsto pelo software

ProtParam disponível online (http://ca.expasy.org/tools/protparam.html). Este

software é uma ferramenta que permite calcular teoricamente vários parâmetros

químicos e físicos através da seqüência das proteínas. O valor teórico encontrado

para a rXfHNL foi de 5,85. A partir desta estimativa, o ensaio de focalização

isoelétrica foi realizado com a proteína rXfHNL para confirmar seu pI

experimental. A Figura 29 mostra o resultado experimental deste ensaio.

Figura 29 - Ensaio de focalização isoelétrica da rXFHNL. O ensaio foi realizado no

PhastSystem gel numa faixa de pH de 9,0 a 3,0. A coluna 1 representa o padrão de pI e a 2 a

amostra rXfHNL.

Como esperado, a presença da proteína foi observada na região próxima do

pI teórico. No entanto, o ensaio realizado indicou que o pI experimental da

pI 8,65 8,45 8,15 7,35 6,85

6,55 5,85 5,2 4,45 3,5

1 2

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

103

proteína rXfHNL é 4,6. Esta característica ácida no valor do pI desta proteína é

uma característica apresentada para ambas as classes de hidroxinitrila descritas na

literatura. Através deste resultado pode-se apenas prever que a rXfHNL apresenta

uma das características inerentes a esta família de proteínas e pode estar incluída

em qualquer umas das duas classes de proteínas.

III. 1.5.3 – Determinação da Seqüência por Espectrometria de

Massas

A fim de verificar a identidade seqüencial da proteína recombinante, a

rXfHNL foi analisada por espectrometria de massas. A metodologia para

determinar a seqüência aminoacídica envolveu a digestão inicial da proteína com

tripsina gerando peptídeos de várias massas diferentes nos quais foram fracionados

da mistura através da cromatografia líquida. Após o fracionamento, os peptídeos

gerados na digestão foram devidamente identificados pela espectrometria de

massas.

As seqüências peptídicas resultantes foram utilizadas nas buscas frente ao

banco de dados de proteínas não redundantes do Centro Nacional de Informações

Biotecnológicas (NCBI) como expressão de busca. A Figura 30 mostra a

representação gráfica da seqüência da rXfHNL e a localização dos peptídeos

identificados.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

104

1 MNAYRPIAFA SSAASDKPTV LLKPTIVLVH GAFADGSTWN KVIHQLQAK

51 GLNAVSVQNPL TSFEDDVAAT RRVLALQTGP VVLVGHSYGG AVITEAG

101 QDERVKALVYIAA FAPSEGESVA DLNKKYPLPS GYNHLSSDKE GFLMLT

151 PEGVEKYLAQDIPL EQTRLIIATQ HPIRGANFEK KVSAAAWETK PSWYL

201 VSENDLMLQPALQKE MAQKIGAHIV NVAASHVPHL SHAAEVEKII MSAV

251 NDVEVLE

Figura 30. Cobertura da seqüência de aminoácidos da proteína rXfHNL obtida pelas análises

por LC-nanoESI-MS/MS. Os aminoácidos em negrito azul foram identificados através dos

peptídeos gerados na digestão com trpsina. 78% dos aminoácidos que compõe a seqüência primária

de foram identificados.

Através das seqüências peptídicas reconhecidas, somente uma única proteína

apresentou identidade de seqüência com os peptídeos identificados pelo

seqüenciamento do digerido tríptico. Este resultados identificaram a proteína

rXfHNL como sendo a proteína hipotética conservada de X. fastidiosa sob o

código de acesso XFa0032 cujo código de acesso no NCBI, massa molecular

nominal e pI estão de acordo com a proteína HNL deste estudo. Além disso, o

perfil peptídico comparado ao banco de dados proporcionou uma porcentagem de

cobertura de 78%, considerada satisfatória.

A alta identidade de seqüência encontrada na seqüência primária permitiu

que fosse inferido o sucesso na expressão da proteína heteróloga, da clonagem em

vetor pGEM-T easy e da subclonagem no vetor de expressão bacteriano pET28a.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

105

III. 1.5.4 – Análise dos Dados de SAXS

Medidas de SAXS (LNLS/Brasil) foram realizadas para averiguar o estado

de oligomerização da proteína rXfHNL em solução. As curvas de espalhamento da

rXfHNL em solução foram obtidas a partir de duas concentrações distintas: 3 e 12

mg mL-1. Curvas de espalhamento a altas concentrações protéicas podem mostrar

um efeito de concentração não desprezível. Assim, foram combinadas a parte de

baixa resolução da curva de espalhamento a 3 mg mL-1 (< 0,5 nm-1) com a parte de

alta resolução da curva de espalhamento a 12 mg mL-1. A curva de espalhamento

resultante desta combinação foi utilizada para a obtenção do modelo ab initio. O

programa CRYSOL foi utilizado para gerar a curva de espalhamento teórica do

modelo DAM ajustada aos dados experimentais obtidos com a proteína rXfHNL.

Curvas de espalhamento teóricas também foram obtidas com os modelos

cristalográficos de alta resolução de HNLs monomérica e dimérica. As curvas

obtidas para as três proteínas foram então comparadas. As duas proteínas HNL

obtidas no PDB são de Hevea brasiliensis cujos códigos de acesso são 1QJ4 e

1YAS.

A curva de espalhamento experimental obtida na análise da proteína

rXfHNL, o ajuste dos dados experimentais (curva teórica gerada) e as curvas

teóricas obtidas com o programa CRYSOL para as HNLs monomérica e dimérica

são mostradas na Figura 31 (A). Os valores encontrados para o raio do envelope

destas estruturas são mostrados na Figura 31 (B). A função de variação de

distância p(r) e a dimensão máxima (Dmax = 8,40 ± 0,50 nm) para a proteína

rXfHNL foi determinada utilizando o programa GNOM.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

106

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,00,1

1

10

100

rXfHNL 1QJ4 1YAS Modelo Teórico

0.1 0.2

Inte

nsity

(a.u

.)

q2 (nm-2)

Inte

nsid

ade

q(nm-1)

(A)

log

Inte

nsid

ade

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 (B)

p (r

)

r (nm)

Figura 31. (A) Curvas de espalhamento de raios-X a baixos ângulos. O gráfico interno é a

representação do gráfico de Guinier (log I versus q2). A curva de espalhamento contendo as barras

de erro em preto representam os dados experimentais da rXfHNL. A curva em azul representa o

modelo teórico DAM produzido pelo programa GASBOR. As curvas em vermelho e azul

representam o espalhamento das proteínas HNLs monomérica e dimérica depositadas no PDB sob

os códigos 1QJ4 e 1YAS. (B) Gráfico da função de variação de distância da rXfHNL. Os

valores p(r) da rXfHNL foram calculados das curvas de espalhamento através do programa

GNOM. O parâmetro de dimensão máxima (Dmax) encontrado é 8,40 ± 0,50 nm. A curva em azul

corresponde ao p(r) do modelo DAM. As curvas em vermelho e verde correspondem ao p(r) das

HNLs dimérica (PDB code: 1QJ4) e monoméricas (PDB code: 1YAS), respectivamente.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

107

Um conjunto de parâmetros estruturais foi extraído desta curvas

experimentais. A linearidade observada no gráfico de Guiner se mostrou

característico de proteínas monodispersas em solução e constituídas

principalmente por espécies oligoméricas únicas. Além disso, o raio de giro de

2,53 nm foi encontrado para rXfHNL através da região de Guinier da curva de

SAXS no qual mostrou-se consistente com uma partícula dimérica.

A curva de espalhamento experimental da rXfHNL proporcionou ainda a

construção do seu envelope molecular, utilizando o programa GASBOR, e com ele

foi possível averiguar sua consistência com a estrutura cristalográfica resolvida da

proteína HNL dimérica 1QJ4. A Figura 32 ilustra a sobreposição da estrutura 1QJ4

com o envelope molecular determinado da rXfHNL (sobreposição obtida com a

utilização do programa SUBCOMP). Os dados do envelope molecular foram

obtidos empregando-se uma resolução de espalhamento de raios-X de 2,4 nm.

Figura 32. Modelo de SAXS para a rXfHNL. Os círculos em cinza representam o envelope

molecular gerado das curvas de espalhamento da proteína rXfHNL. A estrutura cristalográfica

sobreposta ao envelope é da HNL dimérica depositada no PDB sob os códigos 1QJ4. Estes

modelos representam a visão superior e lateral das moléculas sobrepostas.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

108

A superposição da estrutura cristalográfica da HNL dimérica com o

envelope molecular obtido para rXfHNL mostra boa concordância entre as formas,

independente da disposição espacial.

Por meio deste estudo, ao contrário do que foi previsto pela cromatografia

de exclusão molecular, foi possível concluir que a proteína rXfHNL apresenta-se

como um homo-dímero em solução e similar a HNL de Hevea brasiliensis (código

de acesso 1QJ4) classificada na classe das HNLs independente de cofator.

Apesar dos resultados de SAXS serem bastante evidentes, apenas com

dados cristalográficos seria possível obter um melhor esclarecimento das

características estruturais da proteína em estudo, porém até o presente momento

não há estrutura tridimensional resolvida para α–hydroxinitrila liase de Xylella

fastidiosa, estudos estes que serão a continuidade deste trabalho.

III. 1.5.5 – Espectroscopia de Dicroísmo Circular

Com a definição da condição oligomérica da rXfHNL partiu-se para a

investigação da estrutura secundária por espectroscopia de dicroísmo circular (CD)

no UV-distante.

A Figura 33 mostra o espectro de CD da rXfHNL em tris-HCl (pH 8,0)

contendo NaCl 150 mM e glicerol 5%, condição cuja estabilidade da proteína foi

preservada.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

109

200 210 220 230 240 250-12-10

-8-6-4-202468

10-3[θ

] (de

g.cm

2 /dm

ol)

Comprimento de Onda (nm)

Figura 33. Espectro de dicroísmo circular da rXfHNL. O espectro de CD indica que a rXfHNL

é constituída de estruturas α-hélices e folhas β. A rXfHNL foi incubada em tampão tris-HCl

20mM, NaCl 150 mM e glicerol 5%, pH 8,0. As medidas de CD foram realizadas a 25 oC. A

concentração da proteína rXfHNL é 10 µM.

A rXfHNL apresentou um espectro de CD caracterizado por dois mínimos

pronunciados em torno de 222 e 207 nm, e um máximo positivo em torno de 196

nm. Estas bandas são características de proteínas contendo estruturas em α-hélice

(ref). A desconvolução do espectro em pH 8,0 estimou 35,3 % de elementos

helicoidais, 10,9 % de estruturas beta e 53,3 % de outras estruturas. A estabilidade

estrutural de rXfHNL foi então avaliada frente a variação de pH, temperatura e na

presença de um agente desnaturante.

III. 1.5.5.1 – Estudos de Estabilidade Térmica

Os estudos de estabilidade térmica da rXfHNL foram realizados para

averiguar a natureza das transições de desenovelamento e renovelamento térmico,

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

110

monitoradas pela espectroscopia de dicroísmo circular. A Figura 34 mostra os

espectros de dicroísmo circular da rXfHNL em diferentes pHs a 25 ºC.

200 210 220 230 240 250

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

pH 3,0 pH 4,9 pH 7,0 pH 7,8 pH 10,1

θ ( d

eg.c

m2 .d

Mol

-1 )

103

Comprimento de Onda ( nm )

Figura 34. Espectros de CD da rXfHNL em diferentes pH. A concentração da proteína foi de 10

µM em tampão acetate-borato-fosfato 20 mM, de pH 3,0 a 10,0; contendo NaCl 150 mM.

O espectro de CD da rXfHNL nativa, característico de proteína contento

elementos em α-hélice, foi preservado no intervalo de pH entre 4,9 e 10,1. Apenas

pequenas variações foram observadas no valor da elipticidade molar dos mínimos

negativos em 222 e 207 nm. Essas diferenças nos conteúdos de estruturas

secundárias foram estimadas pela desconvolução dos espectros de CD. A

desconvolução do espectro em pH 7,8 estimou 35,5 % de elementos helicoidais,

11,1 % de estruturas beta e 53,4 % de outras estruturas. Diminuindo o pH para 7,0

e 4,0, por exemplo, a desconvolução resultou em 29,1 e 23,6 % de elementos

helicoidais, 15,2 e 17,5 % de estruturas beta, e 55,7 e 58,9 % de outras estruturas.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

111

A redução da elipticidade molar provavelmente representa a diminuição de

estruturas helicoidais.

No entanto, em pHs extremamente ácidos como o pH 3,0, foram observados

um forte decréscimo na elipticidade molar e um pequeno deslocamento do mínimo

em 207 para 206 nm, e a perda do mínimo em 222 nm do espectro nativo da

rXfHNL. Neste pH, um notável rearranjo e/ou perda de estruturas helicoidais pode

ter ocorrido, pois a proteína passou a apresentar um espectro de CD típico de

proteínas com estruturas não-ordenadas; provavelmente perdendo parte da sua

estrutura secundaria ordenada. Neste caso, não foi possível calcular o conteúdo de

estrutura secundária.

Conforme descrito na literatura (CANTOR et al., 1980; HAVEL et al., 1996;

VENYAMINOV, et al., 1996) estas observações podem ser explicadas através do

comportamento protéico no processo básico de enovelamento. Cerca de 80 % das

cadeias laterais apolares dos resíduos de aminoácidos hidrofóbicos Ala (13,1 %),

Val (10 %), Leu (9,0 %), Ile (5,2 %), Phe (2,4 %), Met (2,0 %), Trp (1,2 %) que

constituem a seqüência primária da rXfHNL, estão localizados no interior da

molécula, fora do contato com água (meio hidrofílico), e esta é assumida a

conformação mais estável, geralmente, o estado nativo (enovelado).

A Figura 35 mostra a isoterma de desnaturação da proteína rXfHNL em

tampão acetato-borato-fosfato (pH 8,0) em diversas temperaturas. O processo de

desnaturacão da rXfHNL foi monitorado pela mudança na elipticidade em 222 nm,

que é a banda dominante característica de estruturas helicoidais e está dentro da

região do espectro onde a razão sinal/ruído é de alta qualidade.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

112

20 30 40 50 60 70 80-27

-24

-21

-18

-15

-12

θ ( d

eg.c

m2 .d

Mol

-1 )

103

Temperatura ( oC )

Tm

Figura 35. Transição da desnaturação térmica da rXfHNL. A concentração da proteína foi de

20 µM em tampão acetato-borato-fosfato de sódio 20 mM contendo NaCl 150 mM. A curva de

desnaturação térmica foi construída a partir dos espectros de CD monitorados a 222 nm. A Tm,

temperatura de transição, foi de 52,6 oC, obtida através da regressão sigmoidal.

A desnaturação térmica de rXfHNL mostrou-se um processo irreversível,

uma vez que as amostras aquecidas até 80 ºC não voltaram a apresentar espectro

de CD semelhante ao seu estado nativo, mesmo após rápido ou lento resfriamento

para 20 ºC. A curva sigmoidal indica que este processo envolve aparentemente

uma transição de dois estados. A temperatura de transição do estado enovelado

para o desenovelado da proteína, Tm, foi de 52,6 oC.

A curvas de desnaturação da rXfHNL em função da temperatura foi realizada

em vários pHs. A Figura 36 mostra a dependência da temperatura de transição da

enzima rXfHNL com a variação do pH.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

113

5 6 7 8 9 10

30

35

40

45

50

55

T m (o C

)

pH

Figura 36. Dependência do Tm de rXfHNL com o pH, monitorado por CD. O tampão utilizado

foi acetato-borato-fosfato de sódio 20 mM contendo NaCl 150 mM, variando em pH de 5,0 a 10,0.

A concentração da proteína foi de 20 µM. A temperatura de transição (Tm) de 52,6 oC para o pH de

maior estabilidade (pH 8,0) foi obtida através da regressão representada pela curva polinomial.

Os resultados mostram que a proteína rXfHNL é relativamente sensível a

alteração de sua estrutura secundária em pHs ácidos ou básicos, em função do

aumento da temperatura. A temperatura de transição apresentou pequena variação

para os valores de pHs entre 6,0 e 8,0. Contudo, um maior decaimento nos valores

de Tm é observado em pH abaixo de 6,0 e acima de 8,0.

III. 1.5.5.2 –Estudos da Estabilidade Química

A estabilidade da estrutura secundária de rXfHNL, na presença de um agente

químico, também foi estudada por CD. As medidas de CD foram realizadas a 25ºC

empregando concentrações de 0 a 6 M do agente caotrópico uréia adicionado em

tampão de lise tris-HCl a pH 8,0. Três concentrações distintas da proteína rXfHNL

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

114

foram empregadas neste estudo (5, 10 e 20 µM). A Figura 37 mostra os espectros

de CD da rXfHNL (20 µM) em diferentes concentrações de uréia.

200 205 210 215 220 225 230 235 240-25

-20

-15

-10

-5

0

5

θ ( d

eg.c

m2 .d

Mol

-1 )

103

Comprimento de Onda (nm)

0 M 1,75 M 2,25 M 5 M

Figura 37. Desnaturação da rXfHNL induzida por uréia. A concentração da proteína foi de 20

µM em tampão tris-HCl contendo NaCl 150 mM, glicerol 5% e concentrações crescentes de uréia.

Os espectros de CD foram obtidos individualmente.

O espectro de CD da rXfHNL em uréia a 0 M manteve os dois mínimos

negativos a 207 e 222 nm. Com o aumento da concentração de uréia na solução

protéica pode ser observado um concomitante decréscimo na elipticidade a 222

nm, sugerindo uma perda cooperativa no conteúdo de α-hélice da estrutura

secundária. A completa desnaturação da enzima ocorreu em 5,0 M de uréia, uma

vez que o espectro de CD da rXfHNL nesta condição corresponde ao espectro de

uma proteína sem estrutura secundária ordenada.

A partir dos resultados de desnaturação química obtidos por CD foram

construídas as isotermas de desnaturação, onde a elipticidade, expressa em termos

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

115

da fração de proteína desnaturada, Df , foi colocada no eixo das ordenadas e a

variação da concentração do agente desnaturante no eixo das abscissas. A fração

de proteína desnaturada foi calculada pela relação:

dn

obsnDf

θθθθ−−

= e 1=+ dn ff (2)

onde θobs é a e elipticidade ou centro de massa da área do pico (no caso de

espectroscopia de fluorescência) da amostra em uma determinada condição, θd e θn

são os valores de elipticidade para os estados desnaturado e nativo.

A análise das isotermas foi feita assumindo que a proteína é um homodímero

e que a desnaturação ocorre como um processo reversível de dois estágios, sem a

formação de intermediários passíveis de serem detectados. Assim, o ajuste das

curvas foi realizado como descrito por Mallam, e colaboradores (MALLAM et al.,

2005; HUANG et al., 2005), aplicando o modelo homodimérico de dois estados,

em que duas populações de proteína existem em equilíbrio, denominadas

homodímeros enovelados (D) e monômeros desenovelados (M). Esse modelo é

descrito pelas equações 3 e 4.

MDDK

2↔ (3)

[ ][ ]DMKD

2

= (4)

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

116

A concentração de proteínas monomérica, Pt, para qualquer concentração de

uréia pode ser descrito em termos da fração de proteína desnaturada como descrito

pela equação 5.

( ) tDtDt PfPfMDP +−=+= 12 (5)

A partir das equações 4 e 5, KU pode ser expresso em termos de Pt and fD.

( )( )D

DtD f

fPK−

=1

2 2

(6)

Partindo das equações anteriores, a energia livre de desnaturação ( UG∆ ) para

o modelo de dois estágios pode ser expressa como uma função linear da

concentração de uréia, onde OHUG 2∆ é:

[ ] ( )DOH

UU KRTUmGG ln2 −=+∆=∆ (7)

extrapolando a energia livre do desnovelamento na ausência de uréia, m é a

inclinação do gráfico UG∆ versus a concentração de uréia [U], e R e T são a

constante dos gases e a temperatura absoluta, respectivamente. Combinando as

equações 6 e 7 e rearranjando os valores de OHUG 2∆ em termos da fração de

proteínas desenoveladas, a concentração de uréia pode ser obtida diretamente das

curvas de desnaturação ajustando-as com a equação 8:

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

117

t

DtDDD P

KPKKf

482 −+

= (8)

[ ]( )RT

denaturantmG

D

OHU

eK+∆−

=2

(9)

A equação 10 pode ser rearranjada e resolvida para determinar U1/2.

( )[ ]m

GPRTUOH

Ut2ln

2/1∆+−

= (10)

onde U1/2 é a fração da concentração de uréia em que 50% da proteína está na

forma desenovelada (fU = 0,5)

Assim, os dados de CD foram tratados seguindo este modelo e as curvas para

cada concentração de proteína foram ajustados individualmente com a equação 8,

utilizando para isso o programa Origin 7.0.

Realizando os cálculos termodinâmicos descritos anteriormente, o processo

de desnaturação da rXfHNL foi avaliado pela construção das isotermas de

desnaturação (unfolding). Adicionalmente, o processo inverso de reenovelamento

(refolding) também foi acompanhado, utilizando como ponto de partida, a proteína

rXfHNL desnaturada a 8 M de uréia. O processo de reenovelamento foi realizado

através da adição da proteína totalmente desnaturada em soluções contendo

concentrações decrescentes do agente caotrópico. A Figura 38 mostram os ajustes

com os parâmetros termodinâmicos associados aos processos termodinâmicos de

desnaturação e renaturação protéica.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

118

0 1 2 3 4 5-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

f D

[Uréia] (M)

Unfolding Refolding

A

0 1 2 3 4 50,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

f D

B

[Uréia] (M)

05 µM 10 µM 20 µM

Figura 38. Desnaturação e renaturação da rXfHNL induzida por uréia. Cada curva foi

monitorada a 222 nm e expressas em termos da fração de proteínas desnaturada em função da

concentração de agente desnaturante. A concentração da proteína empregada em (A) foi de 20 µM

em tampão de lise tris-HCl. As isotermas em (B) são representativas do processo de desnaturação

química da rXfHNL a diferentes concentrações.

As isotermas construídas indicaram que não há formação de intermediários

detectáveis durante a transição do desenovelamento, independente das

concentrações protéicas empregadas (5, 10 e 20 µM). A desnaturação ocorreu

como um processo reversível, no qual cerca de 90% do sinal da elipticidade inicial

foi restaurada.

Através dos espectros de CD da rXfHNL, analisados de acordo com o

modelo de dois estágios, foi possível calcular os valores termodinâmicos descritos

acima a fim de verificar a independência destes mediante diferentes valores de

concentração protéica. A Tabela 3 apresenta alguns destes valores como DNm 22↔ e

DNOHG 22

2

↔∆ . DNOHG 22

2

↔∆ é a diferença da energia livre entre 1 mol de dímero e 2 mols

de monômero desenovelado na ausência do desnaturante.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

119

Tabela 3. Dados termodinâmicos para diferentes concentrações da rXfHNL por CD.

Pt (µM) [U]1/2 (M) DNOHG 22

2

↔∆ (kJ/mol) DNm 22↔ (kJ/mol.K)

5 2,25± 0,03 71,9± 1,9 10,9± 0,8 10 2,32± 0,06 71,4± 2,1 11,1± 0,9 20 2,27± 0,02 70,3± 2,1 11,6± 0,9

A dependência da concentração protéica para o equilíbrio das curvas de

desenovelamento em um sistema homodimérico pôde ser explicada em termos da

constante de equilíbrio KD, definida como [ ] [ ]DMKD2= . Assim, para uma dada

concentração de agente desnaturante, KD e ∆G permaneceram constantes para

todas as concentrações protéicas e somente a fração de cada espécie presente no

equilíbrio mudou com Pt. Um sistema homodimérico, [ ]2

1U é definido como a

concentração de desnaturante onde a fração de monômeros desnovelados é igual à

fração de monômeros presentes como dímeros. Isto é tD PK = , em que a

concentração de [ ]2

1U ocorrerá dependente de Pt, assim uma mudança na

concentração de agente desnaturante com a concentração total de proteína pôde ser

esperada, mas a variação de energia livre, DNOHG 22

2

↔∆ , permaneceu praticamente

constante independentemente da mudança no valor de Pt e [ ]2

1U . Como o valor de

m é uma constante para cada proteína este não foi afetado pela concentração

protéica.

Deste modo, o modelo de dois estágios homodimérico descreve

adequadamente os resultados experimentais. Entretanto, existe a possibilidade que

a forma dimérica da rXfHNL possa dissociar-se produzindo monômeros antes de

atingir a transição. Contudo, deve-se destacar que estas possíveis formas não

puderam ser detectadas pelo método de análise empregado.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

120

III. 1.5.6 – Espectroscopia de Emissão de Fluorescência

O ambiente dos três resíduos de triptofano presentes na seqüência primária

da rXfHNL foi monitorado pela espectroscopia de emissão de fluorescência

visando complementar e confirmar os experimentos de CD quanto a integridade

estrutural e a estabilidade da proteína em diferentes pHs. Mudanças na emissão de

fluorescência fornecem informações sobre a acessibilidade do solvente e sobre a

hidrofobicidade do meio ao redor destes resíduos. O resíduo de triptofano atua

como uma sonda para a estrutura terciária da proteína (LAKOWICZ et al., 1983).

Na seqüência primária da rXfHNL, dois resíduos de triptofano estão presentes

perto da porção C-terminal da proteína, e o terceiro resíduo está perto da região N-

terminal. O espectro de emissão de fluorescência intrínseca de rXfHNL em

diferentes pH está mostrado na Figura 39.

325 350 375 400 425 4500

10

20

30

40

50 pH 3,0 pH 4,9 pH 7,0 pH 7,8 pH10,1

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia

( u.

a.)

Comprimento de Onda ( nm )

Figura 39. Espectros de emissão de fluorescência da rXfHNL a vários pH. A solução tampão

empregada foi acetate-borato-fosfato de sódio 20 mM contendo NaCl 150 mM. As medidas foram

realizadas com excitação em 295 nm. A concentração utilizada para as amostras foi 10 µM.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

121

O máximo de emissão de fluorescência da rXfHNL foi em 327 nm (λem) no

pH 8,0, indicativo de resíduos de triptofano internalizados na proteína. No entanto,

o pico de emissão foi assimétrico, sugerindo que o ambiente dos três resíduos de

Trp pode não ser idêntico, isto é, um ou mais resíduos provavelmente podem estar

expostos a um ambiente mais polar (mais hidrofílico) da estrutura da molécula.

Porém, isto poderá ser confirmado apenas pela estrutura cristalográfica da

proteína, um ensaio que ainda está em progresso.

Conforme esperado, foi observado que a emissão de fluorescência de

rXfHNL foi uma boa estratégia para monitorar mudanças estruturais induzidas

pela concentração hidrogeniônica. Nos pH 4,9, 7,0 e 7,8, a rXfHNL mostrou um

pico de emissão de fluorescência em 327 nm, para uma excitação em 295 nm. Este

resultado indicou que os resíduos de triptofano estão mais protegidos do meio

polar e, provavelmente, a enzima se mantém estruturada. Em pHs mais extremos

(3,0 e 11,0) ocorreu um deslocamento para o vermelho no pico de emissão (333 e

331, respectivamente), indicando que o ambiente dos resíduos de triptofano

tornou-se mais hidrofílico. Como os resíduos de triptofano estão mais expostos à

água, a enzima provavelmente começou a se desenovelar (desenovelamento

parcial).

Além disso, foi possível observar que a intensidade de fluorescência sofreu

mudanças com a variação do pH do meio. Uma supressão de fluorescência

intrínseca pôde ser atribuída onde a redução do rendimento de fluorescência foi

resultante da distribuição de cargas e da mudança da carga líquida da proteína

rXfHNL. Por exemplo, em proteínas monoméricas, a protonação progressiva dos

resíduos de aminoácidos pelo decréscimo do pH dá origem a interações repulsivas

que conduzem à perda das estruturas secundária e terciária. A estabilização das

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

122

pontes salinas é removida e as cadeias laterais internalizadas na estrutura tornam-

se expostas. Proteínas que não foram desenoveladas completamente, portanto,

podem adotar estados conformacionais relativamente compactos, que diferem da

estrutura nativa, conforme indicado por suas propriedades espectroscópicas

(LAKOWICZ et al., 1983).

III. 1.5.6.1 – Estudos da Estabilidade Química

A estabilidade química da rXfHNL empregando uréia como desnaturante

também foi estudada pela espectroscopia de emissão de fluorescência intrínseca a

25 ºC. A Figura 40, mostra o espectro de emissão de fluorescência da rXfHNL em

diferentes concentrações de uréia (0; 2,75 e 5 M).

300 320 340 360 380 400 420 4400

200

400

600

800

1000

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia

( u

. a. )

Comprimento de onda ( nm )

0 M 2,75 M 5 M

Figura 40. Efeitos da desnaturação induzida por uréia. As amostras da rxfHnl foram expostas a

concentrações de uréia variando de 0 a 6 M. As medidas de emissão de fluorescência foram

monitoradas de 300 a 450 nm com comprimento de excitação em 295 nm a 25 ºC. Os dados foram

analisados através do centro de massa de cada espectro.

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

123

Com excitação em 295 nm, a rXfHNL em 0 M de uréia também exibiu um

máximo de emissão em torno de 327 nm, típico de triptofano internalizado no

interior da proteína. Adicionalmente, a incubação da rXfHNL com concentrações

crescentes de uréia resultou numa grande supressão da intensidade de

fluorescência e num deslocamento significante do máximo de emissão

fluorescência. O comportamento observado à 5 M de uréia pôde, então, ser

atribuído a maior exposição dos três triptofanos ao solvente indicado pelo

deslocamento para o vermelho (~350 nm). Isto permitiu que a proteína fosse

considerada como completamente desenovelada. Com 5 M de uréia, o espectro de

fluorescência da rXfHnl é característico de proteínas que apresentam maior

porcentagem de estruturas não ordenadas.

Assim, como para as medidas de CD, a presença de dois extremos

característicos foi observada, colaborando para sua caracterização como um

processo de desnaturação constituído de, pelo menos, dois estados. Desta forma, as

isotermas de desnaturação e renaturação puderam ser calculadas.

Para a construção destas isotermas, o centro de massa (λcm) de cada espectro

teve que ser calculado a partir dos espectros de fluorescência. Os centros de massa

representam um índice do valor de energia médio do espectro. Os centros de massa

dos espectros de fluorescência também denominada comprimento de onda de

emissão médio foram calculados de acordo com a equação 10.

∑∑=

)()(

λλλ

λII

cm (10)

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

124

onde λ é o comprimento de emissão, and I(λ) representa a intensidade de

fluorescência no comprimento de onda λ.

A Figura 41 mostra a fração desnaturada da rXfHNL, calculada através do

centro de massa λcm em função da concentração de uréia.

0 1 2 3 4 5 6

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

f U

[ Urea ] ( M )

5 µM 10 µM 20 µM

Figura 41. Desnaturação induzida por uréia da rXfHNL por Fluorescência. Cada curva foi

calculada através do centro de massa λcm e expressas em termos da fração de proteínas desnaturada

em função da concentração de agente desnaturante. As concentrações de proteína empregadas neste

estudo foram de 5, 10 e 20 µM em tampão de lise tris-HCl. As isotermas são representativas do

processo de desnaturação química da rXfHNL.

As curvas obtidas por fluorescência também sugerem que o desenovelamento

da rXfHNL comporta-se como um processo de dois estados. O reenovelamento da

rXfHNL confirmou que a desnaturação química com uréia é um processo

reversível. Como observado anteriormente, mudanças no centro de massa do

espectro de emissão refletem as mudanças conformacionais induzidas na estrutura

da proteína influenciadas pelos resíduos aromáticos, como triptofano e a tirosina,

sensíveis à polaridade de seus micro-ambientes. Esta curva sugere que não há

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

125

estados intermediários presentes em quantidades detectáveis durante a

desnaturação química.

Como a emissão de fluorescência intrínseca fornece uma medida da mudança

na estrutura terciária, um teste bem conhecido da transição de dois estados consiste

em examinar se as mudanças na estrutura secundária ocorrem paralelamente com

as modificações na fluorescência. Quando examinamos a estrutura secundária da

rXfHNL pela espectroscopia de fluorescência intrínseca em função da

concentração de uréia, as mudanças foram coincidentes com a espectroscopia de

CD (Figura 38). Analisando a estrutura de α-hélice em 222 nm, observa-se uma

transição sigmoidal semelhante. Neste caso, o ajuste dos dados de acordo com o

modelo de Mallam et al., também sugeriu ausência aparente de intermediários.

Adicionalmente, o reenovelamento da rxfHnl revelou que a desnaturação química

medida por fluorescência também foi um processo reversível (resultados não

mostrados).

Alguns resultados do ajuste dos dados da desnaturação com uréia pela

equação 8 e 10 estão resumidos na Tabela 4.

Tabela 4. Dados termodinâmicos para diferentes concentrações da rXfHNL por

Fluorescência.

Pt (µM) [U]1/2 (M) DNOHG 22

2

↔∆ (kJ/mol) DNm 22↔ (kJ/mol.K)

5 2,20± 0,07 70,6± 1,2 10,9± 0,5 10 2,21± 0,06 67,3± 0,5 9,8± 0,3 20 2,27± 0,05 68,7± 1,2 10,9± 0,5

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

126

Os valores de OHG2

∆ foram determinados calculando os valores médios de

OHG2

∆ calculados em cada concentração de proteína. Os valores de OHG2

∆ entre

as concentrações da proteína ficaram dentro do erro experimental (~5%). Isto

indica que os valores foram efetivamente invariantes sobre uma escala de

concentrações da proteína, como se esperaria para o modelo de desnaturação de

dois estados.

Portanto, o modelo de dois estados para a desnaturação de uma proteína

homodimérica apenas o dímero nativo e o monômero desnaturado estão

significantemente populados no equilíbrio, é consistente com os dados de

desnaturação por uréia, descritos neste estudo. Duas condições deste modelo são

que o desenovelamento do dimero é reversível e que as curvas do

desenovelamento demonstraram dependência com a concentração da proteína. Foi

estabelecido, portanto, a total reversibilidade da desnaturação da rxfHnl. Pela lei

de ação das massas, o aumento da concentração da proteína aumentará a proporção

da molécula nativa homodimérica em cada concentração do desnaturante, e o

ponto médio da curva sigmoidal de desnaturação aumentará com o a aumento da

concentração da proteína.

III. 1.5.7 – Ensaio de Atividade Enzimática

Os estudos estruturais descritos anteriormente permitiram avaliar a atividade

específica da rXfHNL nos pH 4,9 e 7,0. A atividade da hidroxinitrila liase foi

determinada estimando a produção do benzaldeído durante a decomposição do

substrato em 280 nm. Todas as atividades enzimáticas foram medidas a 25 ºC. A

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

127

reação enzimática no pH 7,8, condição em que a rXfHNL é mais estável, não foi

avaliada devido a significativa degradação da mandelonitrila. O substrato se

decompõe espontaneamente neste pH. Reações de controle, sem rXfHNL, para as

condições do ensaio permitiram uma estimativa da quebra não-enzimática do

substrato e os valores da atividade foram ajustados de maneira adequada.

As atividades enzimáticas específicas observadas em pH 4,9 e 7,0 foram de

6,8 e 33,8 U mg-1, respectivamente. A proteína recombinante produziu uma

quantidade mais elevada de benzaldeído por minuto em pH 7,0 do que em pH 4,9.

A atividade da liase aqui representada foi definida como a quantidade de enzima

(em uma concentração 113 µg mL-1) que catalisa a produção de 76 and 380 nmol

de benzaldeído por minuto em pH 4,9 e 7,0, respectivamente. A atividade da

enzima mostrou ser independente do cofactor FAD, já que as atividades

específicas encontradas na presença de FAD foram praticamente iguais (6,6 e 33,2

U mg-1.

Estes resultados demonstram claramente que a proteína recombinante foi

obtida na forma ativa. Uma vez que a reação de cianogênese é descrita como um

processo reversível, estes resultados podem ser correlacionado com a hipótese que

a rXfHNL está envolvida em uma via bioquímica para a detoxicação ao cianeto

secretado pela planta como um mecanismo de defesa contra a X. fastidiosa.

O desenovelamento parcial da rXfHNL nos pHs mais ácidos, anteriormente

proposto pelos resultados de CD e de fluorescência, foi acompanhado por uma

perda da atividade enzimática.

A caracterização cinética e a determinação da estrutura tridimensional da

rXfHNL foram iniciadas recentemente a fim alcançar a completa caracterização da

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

128

proteína e conseqüentemente proporcionar maiores contribuições no conhecimento

de seu papel biológico.

III. 1.5.8 – Conclusões Parciais

As etapas de clonagem e a expressão de heteróloga em E. coli BL21(DE3)

resultaram em quantidades satisfatórias de rXfHNL na forma solúvel e facilmente

purificáveis.

As técnicas de SDS-PAGE, Gelchip-CE e cromatografia de exclusão

molecular mostraram que a proteína recombinante apresentou massas moleculares

próximas a esperada.

A proteína recombinante de X. fastidiosa demonstrou ser uma molécula

estável, homodimérica e de forma alongada em solução, como demonstrada pelos

resultados de espalhamento de raios-X a baixo ângulo.

Baseado nos experimentos de CD e fluorescência, os resultados sugerem que

rXfHNL é possuem uma estrutura secundária que é mais estável entre pHs 4,9 a

7,8. A ausência do mínimo observado em 220 nm no espectro de CD em pH 3,0 e

a mudança para comprimentos de onda mais elevados (~350 nm) dos máximos de

emissão dos espectros de fluorescência em pH mais extremos (3,0 e 10,1), indicam

que a estabilidade estrutural da enzima foi afetada. Porém, a máxima estabilidade

de rxfHnl foi observada entre os pH 6,0 e 7,8.

O processo de desnaturação química induzido pela uréia se dá através de um

processo reversível clássico, de dois estados, onde somente os estados nativo e

desnaturado estão significativamente presentes em quantidades detectáveis, sem

intermediários. Este processo é descrito adequadamente por um modelo

Resultados e Discussão – Hidroxinitrila Liase

129

homodimérico. Entretanto, o desenovelamento térmico foi um processo

irreversível nas circunstâncias aqui descritas. Contudo, a forma dimérica,

provavelmente antes de alcançar o estado desnaturado, é esperada dissociar para

produzir monômeros e é interessante que estas possíveis formas não foram

detectadas para a rXfHNL nos dois métodos usados no presente estudo.

Durante a anotação do gene Xfa0032 do projeto genoma, foi levantada a

hipótese de que a rXfHNL estivesse envolvida no processo de detoxicação da

bactéria. Este estudo reforça esta hipótese, uma vez que a proteína rXfHNL é ativa

e apresenta dependência com o pH, podendo perfeitamente estar envolvida na

reação inversa do processo de cianogenêse. De alguma maneira, a liberação do

cianeto pela planta pode servir como substrato para a produção de glicosídeos

cianogênicos, atóxicos, comumente encontrados no metabolismo de bactérias. Isto

explicaria a sobrevivência desta bactéria no hospedeiro.

Uma vez que HNLs de outros organismos são, atualmente, enzimas muito

empregadas industrialmente na síntese orgânica estereoespecífica de compostos

ativos, estes resultados podem ser muito úteis como uma fonte de referência na

manipulação futura da enzima rXfHNL em aplicações biotecnológicas. Assim

como, poderá servir como guia no desenho de moléculas inibidoras alvo contra a

colonização da Xylella fastidiosa em citros.

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

130

III. 2 – Corismato Sintase

III. 2.1 – Amplificação e Clonagem no Vetor pGEM-T easy

As suspensões bacterianas utilizadas na extração do DNA genômico também

foram do isolado 9a5c da bactéria X. fastidiosa. A metodologia empregada para

avaliar a qualidade e a concentração do DNA genômico obtido foi descrita na

seção III. 1.1.

Como descrito anteriormente, os oligonucleotídeos utilizados na

amplificação foram desenhados com base na seqüência da ORF aroC e foram

incorporados com sítios de reconhecimento das enzimas de restrição NdeI e XhoI

preservando seus códons originais de iniciação e terminação. Estes sítios de

restrição nos iniciadores a fim de permitir sua subclonagem nos vetores de

expressão.

Como para o estudo anterior, a temperatura de hibridização do par de

iniciadores (F e R) desenhado foi calculada teoricamente através do software Gene

Runner 3.05, buscando garantir a eficiência da reação de amplificação do DNA de

interesse. A temperatura ótima encontrada neste caso ficou em torno dos 69 oC.

Com base na temperatura calculada para o par de oligonucleotídeos

desenhado foi possível a amplificação do fragmento correspondente ORF que

codifica a proteína corismato sintase, porém com baixa concentração e na presença

de algumas bandas inespecíficas. Diante deste resultado, se fez necessária a

otimização da PCR a fim de garantir o máximo de eficiência na obtenção dos

produtos desejados. Assim, somente quando foi empregada a temperatura de

hibridização dos primers de 58 oC ,foi possível a amplificação desejada.

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

131

A Figura 42 ilustra o resultado desta amplificação a qual gerou um produto

de aproximadamente 1125 pb. Resultados excelentes foram obtidos na

amplificação do gene de interesse. O produto de amplificação obtido pela PCR

teve o seu tamanho concordante com o previsto, não apresentou nenhuma banda

inespecífica, indicando o sucesso da otimização e resultou em quantidades

suficientes para proceder à clonagem posterior.

1 2 p b

5 0 0 0

2 0 0 0 1 6 5 0

1 0 0 0 8 5 0

6 5 0

5 0 0 4 0 0 3 0 0 2 0 0 1 0 0

Figura 42. Amplificação do fragmento de DNA que codifica a proteína corismato sintase. A

coluna 1 é o padrão de massa molecular 1 kb Plus DNA Ladder da Gibco BRL. A coluna 2 é a

ORF aroC amplificada. O meio de separação foi gel de agarose 0,8 % em tampão 1x TAE, pH 8,3.

A voltagem aplicada na separação foi 100 V por 30 min. Os fragmentos de DNA no gel foram

corados com brometo de etídeo e visualizados em transiluminador UV a 365 nm.

Os produtos da amplificação por PCR foram devidamente purificados pelo

kit Wizard PCR Clean-up da Promega, quantificados em espectrofotômetro e

adenilados a fim de inseri-los no vetor de clonagem pGEM-T easy. A

concentração obtida para estes produtos variou de 300 até 500 ng µL-1. A

construção nos vetores de clonagem foi denominada de pGEM-XfaroC.

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

132

Os plasmídeos recombinantes pGEM-XfaroC recém construídos foram

inseridos por choque térmico em bactérias de E. coli DH5α competentes. As

bactérias transformadas foram semeadas em placas de Petri contendo meio LB

sólido, ampicilina, X-gal e IPTG e crescidas overnight a 37 oC.

Como para a HNL, diversas colônias brancas e azuis cresceram na placa

contendo o meio selecionado descrito acima. A seleção dos transformantes foi

realizada então pela capacidade de crescer em presença do antibiótico ampicilina e

através da coloração branca de alguns transformantes indicativa da presença do

inserto dentro da região codificadora da enzima β-galactosidase. Dentre as

colônias brancas resistentes, novamente quatro colônias foram escolhidas

aleatoriamente, inoculadas em tubos estéreis contendo meio LB líquido com

ampicilina e submetidas à incubação overnight a 37 oC sob agitação. Após o

crescimento individual destas colônias, seus DNAs plasmidiais foram extraídos,

quantificados, clivados por enzimas de restrição e finalmente seqüenciados.

III. 2.1.1 – Análise de Restrição e Seqüenciamento dos

Plasmídeos Recombinantes

O DNA plasmidial dos 4 prováveis clones positivos extraídos através dos

métodos descritos pelo kit Wizard Miniprep® e de lise alcalina empregados de

acordo com o descrito em II.2.7, foram inicialmente considerados de boa

qualidade e adequados para as análises de restrição e seqüenciamento. As amostras

de DNA plasmidial extraídos pelo kit e pelo método de lise alcalina apresentaram

neste caso concentrações de 150 e 80 ng µL-1, respectivamente.

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

133

A análise de restrição empregando as enzimas NdeI e XhoI foi realizada a

fim de confirmar a presença do inserto nos clones selecionados. A Figura 43

apresenta o perfil de restrição destes nove clones selecionados.

Figura 43. Análise de restrição dos plasmídeos pGEM-aroC. A coluna 1 é o padrão de massa

molecular 1 Kb Plus DNA Ladder da Gibco BRL. As colunas 2 a 5 são os clones selecionados. O

meio de separação foi gel de agarose 1 % em tampão 1x TAE, pH 8,3. A voltagem aplicada na

separação foi 100 V por 30 min. Os fragmentos de DNA no gel foram corados com brometo de

etídeo e visualizados em transiluminador UV a 365 nm. As bandas específicas dos genes XfaroC e

dos plasmídeos digeridos estão representados por setas cujos tamanhos são aproximadamente 3000

e 1125 pb, respectivamente.

A presença e o tamanho do inserto correto foram confirmados apenas em

dois dos 4 clones selecionados. Assim, os clones 2 e 4 localizados na 3ª e 5ª

canaleta do gel puderam confirmar o sucesso das etapas de clonagem e

transformação das bactérias. Os produtos da digestão de aproximadamente 1000

pb correspondente a ORF aroC foram retirados do gel, purificados utilizando-se

novamente o kit Wizard PCR Clean-up, quantificados e utilizados na etapa de

subclonagem nos vetores de expressão. Estas amostras de DNA apresentaram em

geral concentrações variando de 150 a 200 ng µL-1.

1 2 3 4 5 pb

3000

1000

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

134

Os DNAs plasmidias selecionados para o seqüenciamento também foram os

clones 2 e 4. Os resultados do gel de seqüenciamento para estes clones foram de

baixa qualidade apresentando pouca eficiência na leitura das bases. Assim, não

permitiram a certificação de que o gene correspondia exatamente a ORF de

interesse. Em vista disso, o seqüenciamento dos plasmídeos contendo o gene

ligado no vetor de expressão pET28a foi posteriormente realizado a fim de garantir

sua identidade.

III. 2.2 – Subclonagem no Vetor de Expressão, Análise de

Restrição e Seqüenciamento dos Plasmídeos Recombinantes

Os fragmentos de DNA de 1125 pb que codificam para a proteína rXfaroC

foram subclonados nos vetores pET28a. Esta nova construção denominada pET-

XfaroC também foi escolhida devido a expressar a proteína de interesse fusionada

com uma cauda de seis histidinas na região N-terminal. Novamente, os plasmídeos

recombinantes recém construídos foram inseridos por choque térmico em bactérias

de E. coli DH5α competentes, semeadas em placas semelhantes ao processo

anterior, porém somente com adição de canamicina como agente seletivo, e

finalmente incubadas para o crescimento. A seleção das colônias neste caso foi

realizada pela análise de restrição.

Após o período de crescimento celular, quatro colônias foram selecionadas

aleatoriamente dentre as inúmeras colônias presentes na placa de Petri, e

inoculadas seguindo o mesmo processo descrito anteriormente. Após o

crescimento individual destas células seus DNAs foram extraídos, quantificados e

alíquotas destes DNAs foram clivados pelas enzimas de restrição e submetidas

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

135

pb

5000

1000

1 2 3 4 5

novamente ao sequenciamento. Estas amostras de DNA também apresentaram

concentrações variando de 120 a 150 ng µL-1. A Figura 44 ilustra o novo perfil de

restrição destes quatro clones selecionados.

Figura 44. Análise de restrição dos plasmídeos pET-XfaroC. A coluna 1 é o padrão de massa

molecular 1 Kb Plus DNA Ladder da Gibco BRL. As colunas 2 a 5 são os clones selecionados. O

meio de separação foi gel de agarose 1 % em tampão 1x TAE, pH 8,3. A voltagem aplicada na

separação foi 100 V por 30 min. Os fragmentos de DNA no gel foram corados com Brometo de

etídeo e visualizados em transiluminador UV a 365 nm. As bandas específicas da XfaroC e dos

plasmídeos digeridos estão representados por setas.

Uma vez confirmada a presença do inserto nos quatro clones selecionados, as

etapas de subclonagem e transformação das bactérias foram consideradas bem

sucedidas. Apenas os os clones 1 e 2 (equivalentes as 2 a e 3 a canaleta do gel) que

apresentaram maior intensidade de banda, foram utilizados para transformar as

células competentes de expressão de E. coli BL21(DE3). A seleção de dois novos

clones contendo as ORFs subclonadas nos vetores de expressão foi realizada após

o plaqueamento das células em meio adequado. Finalmente, um inóculo destes

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

136

clones foi empregado na produção da proteína recombinante em células de E. coli

BL21(DE3).

As seqüências obtidas a partir do seqüenciamento foram analisadas através

do programa Sequencing Analysis V 3.4. A Figura 45 ilustra a seqüência resultante

de um dos clones submetidos ao seqüenciamento.

1 TCAATGCNTT GCGTCGCATG CTCCCGGCCG CNTGGCGGCC GCGGGAATTC GATTGGAATT CCATATGGGG

2 GCGAACACGT TTGGAAAGTT ACTGGCGGTC ACGACCTTCG GTGAATCACA TGGCCCTGCC ATTGGCTGTG

3 TGATTGATGG CTGTCCTCCC GGATTGGAAC TCGCTGCTGA GGAGTTTGCC CACGACTTGC AGCGTCGCGC

4 TACCGGTAGG AGCCGTCATA CCTCGGCGCG GCGTGAGGCC GATGAAGTCG AGATTCTCTC CGGCGTCTAC

5 GAAGGCCGTA CCACGGGCAC TCCTATTGCA CTGTTGATCC GCAATACCGA CCAGCGTAGT AAGGATTATG

6 CGACGATTGC CCGGCAGTTC CGTCCGGGCC ATGCCGATTA CACCTATTGG CAGAAATATG GTATCCGTGA

7 TCCTCGTGGT GGTGGGCGTT CTTCGGCCCG TGAGACAACA ATGCGTGTGG CTGCTGGGGT GGTTGCTAAA

8 AAGTGGCTGA AGCAGCGTTA TGGTGTGATT GTGCGCGGTT TTTTATCCCA GCTTGGTGAG ATCCGCCCGG

9 AAGGCTTTGC TTGGGATGCG GTCGAAGATA ATCCTTTTTT CTGGCCGCAG GCGGCTCAGG TGCCAGAGCT

10 GGAAGCCTAC ATGGATGCAT TGCGCAAATC TGGAAATTCN GTCGGTGCAC GCTGGATGTG GTTGCCGAAG

11 GCGTGCCGCC AGGGTGGGGT GAGCCGATTT ACGGCAAGCT TGATGGTGAA CTTGCTGCTG CGTTGATGAG

12 TATCAACGCA GTAAAAGGTG TGGAGATCGG CGCTGGTTTC GGCAGCACTG TACAAAAAGG AACCGAGCAC

13 CGTGATTTGA TGACACCGTT AGGTTTTCTC AGTAACCATG CTGGCGGCAT CATCGGTGGG ATCACCACTG

14 GTCAGCCGAT TATTGTTTCG ATTGCTCTGA AACCAACATC TAGCCTACGT TTGCCTGGCG AGACGGTGGA

15 TGTGGATGGC CACCCTGTCC AAGTGATCAC CAAGGGACGT CATGATCCTT GTGTGGGGAT TCGTGCCCCT

16 CCGATTGCTG AAGCCATGGT CGCGTTAGTA CTGATGGACC AGGCGCTGCG CCACCGTGCC CAGTGTGGCG

17 ATGTCGGTGA GATGTCTCCG TGCATCCTTG AGAATGTGGG TTTCAGGAAT GCCGATGATT GACTCGAGCG

18 GAATCACTAG TGAATTCGCG GCCGCCTGCA GGTCGACCAT ATGGAGAGCT CCCAANGCGT TNGAT

Figura 45. Seqüencia obtida do plasmídeo pET-XfaroC extraído do clone 3. As bases em

vermelho correspondem a ORF aroC que codifica para proteína corismato sintase. As bases em

negrito e sublinhado são correspondentes às seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores. Os

nucleotídeos em negrito preto foram são os não identificados pelo seqüenciador.

As seqüências resultantes foram submetidas a um processo de busca por

similaridade em diversos bancos de dados internacionais, através de servidores de

busca disponíveis na rede. O principal programa utilizado foi o software público

BLAST onde os resultados mostraram similaridade de seqüência variando de 99%

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

137

de identidade frente à cadeia nucleotídica correspondente a ORF deste estudo,

confirmando a presença da região alvo desejada.

De modo geral os clones seqüenciados apresentaram pequenas variações

entre si, que podem ser atribuídos a erros de leitura ou mesmo a erros gerados

durante a marcação para o seqüenciamento. No entanto, os plasmídeos pET28a-

XfaroC sequenciados apresentaram os genes de interesse inseridos na orientação e

com fase de leitura corretas dentro dos vetores pET28a garantindo assim a

integridade destes clones e a leitura eficiente de todas as bases dos fragmentos na

etapa de expressão protéica.

III. 2.3 – Expressão Heteróloga da Proteína rXfaroC a partir dos

Vetores de Expressão

Como no estudo de expressão heteróloga anterior, a produção da proteína

rXfaroC foi realizada inicialmente por meio do teste de expressão na presença de

IPTG a 37 oC. Porém, após o período de indução de 4 horas e a subseqüente lise

celular na presença de tampão tris-HCl, nenhuma expressão diferenciada na região

de aproximadamente 45 kDa foi observada a partir dos clones selecionados.

Diante da expressão negativa da proteína de interesse, uma etapa de

otimização do processo de indução foi necessária neste estudo. A mudança da

temperatura de expressão para 20 oC foi inicialmente avaliada. Conseqüentemente,

um período de indução de 12 horas se fez necessário para alcançar quantidade

suficiente de proteína para sua visualização por SDS-PAGE.

A Figura 46 mostra um gel de SDS-PAGE a 15% obtido após submeter às

amostras resultantes da expressão a condições desnaturantes.

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

138

Figura 46. Expressão piloto da proteína rXfaroC a partir do clone 1. A análise foi realizada em

SDS-PAGE a 15%. A coluna 1 é o marcador de massa molecular. A coluna 2 é o extrato protéico

total não induzido do sistema de expressão. A coluna 3 é o extrato protéico total induzido. As

colunas 4 e 5 são as frações insolúvel e solúvel pós lise celular. A seta indica a expressão

diferenciada esperada na região de 45 kDa.

Apesar da expressão diferenciada na região esperada não ter sido

claramente visualisada no extrato protéico induzido, sua presença foi confirmada

pela banda diferenciada na fração solúvel (coluna 5) a qual concorda com o

tamanho esperado para a proteína rXfaroC de aproximadamente 45 kDa, revelando

a eficiência da metodologia de clonagem e expressão da proteína recombinante.

Além disso, após a lise celular foi constatado que a proteína se apresentou

em grande quantidade nas frações solúveis com o emprego do tampão tris-HCl,

apesar de ter sido também observada a permanência de quantidade redundante da

proteína na fração insolúvel do sistema de expressão.

As frações solúveis foram, então, empregadas na etapa de purificação da

proteína rXfaroC.

1 2 3 4 5

kDa

66

45

29 20,1

12,4

30

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

139

Neste caso, a produção em maior escala da proteína em E.coli foi realizada

depois de avaliado o processo de purificação uma vez que a quantidade analítica

foi considerada satisfatória para os subseqüentes estudos estruturais e funcionais.

III. 2.4 – Purificação da Proteína rXfaroC por Cromatografia de

Afinidade.

As frações solúveis provenientes da lise celular das culturas induzidas foram

submetidas à cromatografia de afinidade utilizando uma resina com níquel

imobilizado. As frações eluídas durante a etapa de purificação foram analisadas

por SDS-PAGE. A Figura 47 mostra a separação eletroforética em gel de

poliacrilamida SDS-PAGE a 15% dos eluatos da coluna de Ni-NTA.

Figura 47. Purificação da rXfaroC por cromatografia de afinidade. A análise das frações

eluídas da coluna Ni-NTA foi realizada em SDS-PAGE a 15%. Colunas: 1) marcador de massa

molecular; 2) fração insolúvel após a lise celular; 3) fração solúvel após a lise celular; 4) fração

não ligada na coluna de afinidade; 5) lavagem com 5 mM de imidazol; 6) lavagem com 40 mM de

imidazol; 7, 8 e 9) eluição com 100, 250 e 500 mM de imidazol, respectivamente. A banda

correspondente a proteína rXfaroC está indicada pela seta.

kDa

66

45

30

20,1

12,4

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

140

A purificação da proteína recombinante rXfaroC não foi alcançada em um

único passo cromatográfico como para a HNL. Proteínas contaminantes em maior

quantidade foram observadas nas frações de eluição.

O processo de otimização da purificação envolveu o aumento dos volumes

de tampão contendo 5 e 40 mM de imidazol empregados no processo de lavagem.

Assim, o dobro de seus volumes iniciais foi empregado na purificação por

afinidade. A Figura 48 mostra a separação eletroforética em gel de poliacrilamida

SDS-PAGE a 15% dos novos eluídos da coluna de Ni-NTA.

Figura 48. Otimização da purificação da rXfaroC por cromatografia de afinidade. A análise

das frações eluídas da coluna Ni-NTA foi realizada em SDS-PAGE a 15%. Colunas: 1) marcador

de massa molecular; 2) fração não ligada na coluna de afinidade; 3 e 4) representam as frações de

lavagem com 5 mM de imidazol; 5 e 6) frações de lavagem com 40 mM de imidazol; 7 e 8) frações

de 100 e 250 mM de imidazol, respectivamente. A proteína rXfaroC purificada está indicada pela

seta.

Como mostra Figura 48, a purificação da proteína rXfaroC foi alcançada

após a otimização do processo. Em algumas ocasiões, quando as frações eluídas a

kDa

66

45 30

20,1

12,4

1 2 3 4 5 6 7 8

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

141

250 mM de imidazol se apresentavam ainda com alguns contaminantes, a simples

re-cromatografia por afinidade foi suficiente para se obter a proteína na forma

mais adequada. É importante ressaltar que para as eventuais etapas de re-

cromatografia foi necessário retirar o excesso de imidazol presente nas frações

recém eluídas da coluna através da diálise.

A pureza foi confirmada pela análise das frações eluídas com tampão de lise

tris-HCl contendo 100 e 250 mM de imidazol, as quais apresentaram uma única

banda de aproximadamente 45 kDa, sob condições desnaturantes.

Numa tentativa de prever o grau de oligomerização da proteína rXfaroC

através de cromatografia de exclusão molecular foi realizada, porém sua

instabilidade não permitiu que tais experimentos fossem conclusivos.

III. 2. 5 – Análises Estrutural da Proteína rXfaroC

III. 2.5.1 – Espectroscopia de Dicroísmo Circular

A fim de investigar a estrutura secundária e estimar seu pH ótimo de

estabilidade, a rXfaroC purificada foi estudada por espectroscopia de dicroísmo

circular (CD).

A Figura 49 ilustra o espectro de CD observado para a rXfaroC em tampão

de lise tris-HCl a pH 8,0 contendo NaCl e glicerol, condição cuja estabilidade da

proteína foi preservada.

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

142

200 210 220 230 240 250-12-10

-8-6-4-202468

10-3[θ

] (de

g.cm

2 /dm

ol)

Comprimento de Onda (nm)

Figura 49. Espectro de dicroísmo circular da proteína recombinante rXfaroC. O espectro de

CD mostra que provavelmente a rXfaroC é também constituída predominantemente de estruturas

α-hélices e folhas β. A rXfaroC foi preparada em tampão tris-HCl a 20mM, NaCl a 150 mM e

glicerol a 5%, pH 8,0. As medidas de CD foram realizadas a temperatura de 25 oC.

A rXfaroC também apresentou um espectro de CD caracterizado por dois

mínimos pronunciados em torno de 220 e 207 nm, e um máximo positivo em torno

de 196 nm. Estas bandas são características de proteínas contendo estruturas em α-

hélice. A estabilidade estrutural de rXfaroC foi então avaliada frente a variação da

concentração hidrogeniônica (Figura 50).

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

143

200 210 220 230 240 250

-10-8-6-4-202468

Comprimento de Onda ( nm )

θ ( d

eg.c

m2 .d

Mol

-1 )

103

pH 3,0 pH 4,9 pH 6,0 pH 7,0 pH 7,8 pH 8,9

Figura 50. Espectros de CD da rXfHNL em diferentes pHs. A concentração da proteína foi de

10 µM em tampão acetate-borato-fosfato a 20 mM contendo NaCl a 150 mM.

Os espectros de CD, característicos de estruturas contendo elementos do tipo

em α-hélice, foram relativamente preservados nos pHs 3,0; 7,8 e 8,9. As presenças

dos mínimos negativos em torno de 220 e 207 nm foram observadas com pequenas

variações no valor da elipticidade molar. Além disso, análises de desconvolução

dos espectros de CD mostraram diferenças nos conteúdos de estruturas

secundárias. A desconvolução do espectro em pH 8,9 estimou 33,4 % de

elementos helicoidais, 14,1 % de estruturas beta e 52,5 % de outras estruturas.

Diminuindo o pH para 7,8 e 3,0 por exemplo, a desconvolução do espectro

resultou em 28,1 e 21,5 % de elementos helicoidais, 16,8 e 17,9 % de estruturas

beta, e 55,1 e 58,6 % de outras estruturas. A redução da elipticidade molar

provavelmente representa a diminuição de estruturas helicoidais.

No entanto, em pHs intermediários como o pH 4,9 e 6,0, um forte

decréscimo na elipticidade molar e notáveis deslocamentos dos mínimo em 207 e

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

144

220 nm foram observados. Nestes pHs, um notável rearranjo e/ou perda de

estruturas helicoidais pode ter ocorrido. A proteína provavelmente se tornou

desnaturada ou desenovelada, caracterizada pelo espectro típico de proteínas com

estruturas não-ordenadas. É importante mencionar que o pI teórico calculado para

a rXfaroC é de 6,33. Esta desestabilidade estrutural em pHs intermediários pode

ser devido ao seu pI. Neste caso, não foi possível calcular o conteúdo de estrutura

secundária.

O estudo de estabilidade química e térmica por CD frente à variação do pH e

da temperatura e também sob diversas concentrações de uréia foi realizado

recentemente e, porém não foram incluídos, pois ainda necessitam de tratamento

mais refinado.

III. 2.5.2 – Espectroscopia de Emissão de Fluorescência

O ambiente dos cinco resíduos de triptofano presentes na seqüência primária

da rXfaroC foram monitorados pela espectroscopia de emissão de fluorescência a

fim de complementar e confirmar os experimentos de CD quanto a integridade

estrutural e a estabilidade em diferentes pH. Como mencinado anteriormente,

mudanças na emissão de fluorescência revelam informações sobre a acessibilidade

do solvente e sobre a hidrofobicidade do meio ao redor destes resíduos. O resíduo

de triptofano atua como uma sonda espectral para a estrutura terciária da proteína

(LAKOWICZ, 1983). Na seqüência primária da rXfaroC, os cinco resíduos de

triptofano se localizam na parte central da seqüência proteína. O espectro de

emissão de fluorescência intrínseca de rXfaroC em diferentes pH é mostrado na

Figura 51.

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

145

300 325 350 375 400 425 450

0

200

400

600

800

1000

Comprimento de Onda ( nm )

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia

( u.

a.)

pH 3,0 pH 4,9 pH 6,0 pH 7,0 pH 7,8 pH 8,9

Figura 51. Espectros de emissão de fluorescência da rXfaroC a vários valores de pH. A

solução tampão empregada foi acetato-borato-fosfato de sódio a 20 mM contendo NaCl a 150 mM.

As medidas foram realizadas com excitação a 295 nm. A concentração utilizada para as amostras

foi 10 µM.

O máximo de emissão de fluorescência da rXfaroC foi em 332 nm (λem) no

pH 7,8, indicativo de resíduos de triptofano internalizados na proteína. No entanto,

o pico de emissão foi assimétrico, sugerindo que o ambiente dos cinco resíduos de

Trp pode não ser idêntico, isto é, um ou mais resíduos provavelmente podem estar

expostos a um ambiente mais polar (mais hidrofílico) na estrutura da molécula.

Porém, isto pode ser confirmado apenas pela estrutura cristalográfica da proteína,

um ensaio que ainda será objeto de estudo.

Conforme esperado, foi observado que a emissão de fluorescência de

rXfaroC foi capaz de monitorar mudanças estruturais induzidas por pH. Em todos

os pHs, a rXfaroC mostrou picos de emissão de fluorescência em torno de 330 nm,

para uma excitação em 295 nm. Estes resultados indicaram que os resíduos de

triptofano devem estar mais protegidos do meio polar e provavelmente a enzima se

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

146

mantém estruturada. Ao contrário das medidas de CD, as pequenas diferenças

observadas na fluorescência em pHs intermediários (4,9 e 6,0), indicam que os

resíduos de triptofano tendem a estar protegidos na estrutura interna da proteína

mesmo sofrendo mudança conformacional de sua estrutura secundária,

evidenciadas pelos espectros de dicroísmo circular.

Além disso, foi possível observar que mudanças na intensidade de

fluorescência aconteceram com mudanças no pH do meio. Uma supressão de

fluorescência intrínseca pôde ser atribuída onde a redução do rendimento de

fluorescência foi resultante da distribuição de cargas e da mudança da carga

líquida da proteína rXfaroC. Por exemplo, em proteínas monoméricas, a

protonação progressiva dos resíduos de aminoácidos pelo decréscimo do pH dá

origem a interações repulsivas que conduzem à perda das estruturas secundária e

terciária. A estabilização das pontes salinas é removida e as cadeias laterais

internalizadas no interior da estrutura tornam-se expostas. Proteínas que não foram

desenoveladas completamente, no entanto, podem adotar estados conformacionais

relativamente compactos, que diferem da estrutura nativa, conforme indicado por

suas propriedades espectroscópicas (LAKOWICZ, 1983).

O estudo de estabilidade química por fluorescência frente a diversas

concentrações de uréia foi realizado recentemente e ainda está em processo de

análise.

III. 2.5.3 – Ensaio de Atividade Enzimática

A atividade da corismato sintase foi determinada estimando a produção do

corismato em 340 nm pela via do ácido chiquímico a 25 ºC. Esta foi uma via

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

147

alternativa para a medida da atividade da proteína rXfaroC devido a não

disponibilidade comercial do principal substrato natural desta proteína, o 5-

enolpiruvil chiquimato-3-fosfato (EPSP). O ácido corísmico proveniente da junção

do ácido chiquímico e uma molécula de fosfoenolpiruvato gera o corismato que é

utilizado na síntese de aminoácidos aromáticos (triptofano, fenilalanina e tirosina)

(HERRMANN et al., 1983).

Assim, a reação enzimática foi monitorada no pH 7,8, condição em que a

rXfaroC se apresentou mais estável nos estudos estruturais, porém os demais pHs

não foram avaliados. O interesse deste ensaio foi verificar se a rXfaroC

apresentava atividade enzimática, o que é o aspecto mais interessante da

tecnologia do DNA recombinante.

A atividade enzimática específica observada para rXfaroC foi 10,3 U mg-1. A

atividade aqui representada foi definida como a quantidade de enzima (em uma

concentração 53,3 µg mL-1) que catalisa a produção de 37 nmol de corismato por

minuto. A atividade da enzima mostrou ser dependente dos cofactores NADH e

FMN, já que não ocorreu nenhuma reação na ausência destes cofatores.

Estes resultados demonstram claramente que a proteína recombinante foi

obtida na forma ativa. No entanto, o estudo enzimático nos demais pHs bem como

a caracterização cinética e a determinação da estrutura tridimensional da rXfaroC

serão concluídas brevemente a fim alcançar a completa caracterização da proteína

e conseqüentemente proporcionar maiores contribuições no conhecimento de seu

papel biológico.

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

148

III. 2.6 – Conclusões

As etapas de clonagem e a expressão heteróloga em E. coli BL21(DE3)

resultaram em quantidades satisfatória de rXfaroC na forma solúvel e facilmente

purificáveis.

A massa molecular para a proteína recombinante medida por SDS-PAGE foi

de aproximadamente 45 kDa o que está de acordo com a massa molecular

esperada.

A proteína recombinante de X. fastidiosa demonstrou ser uma molécula

aparentemente estável através das medidas espectroscópica, evidenciando uma

estrutura secundária contendo elementos em α·-hélice e estruturalmente mais

estável nos pHs extremos. A mudança de conformação com aparentes ausências

dos mínimos no espectro de CD e a mudança nos máximos de emissão dos

espectros de fluorescência, indica provavelmente que a estabilidade estrutural da

enzima foi afetada.

O estudo da enzima corismato sintase visou sua contribuição como uma

possível aplicação alternativa na área biotecnológica, uma vez que outras enzimas

desta via são muito empregadas industrialmente na obtenção de compostos como o

glifosato, muito utilizado na fabricação de importantes herbicidas agrícolas. O

glifosato é um conhecido inibidor da via do chiquimato presente em plantas,

fungos e bactérias que inibe a formação de aminoácidos como o triptofano e

fenilalanina considerados essenciais no metabolismo destes organismos.

A possível inativação desta via pela inibição da corismato sintase deste

estudo pode ser muito útil como uma fonte de referência na sua manipulação

Resultados e Discussão – Corismato Sintase

149

futura como defensivos agrícolas. Assim como, poderá servir como um guia no

desenho de moléculas alvo contra a colonização da Xylella fastidiosa em citrus.

Resultados e Discussão – Proteína D do Sistema de Trannsporte e Secreção Tat

150

III. 3 – Proteína D do Sistema de Transporte e Secreção Tat

III. 3.1 – Amplificação e Clonagem no Vetor pGEM-T easy

Como para as duas proteínas descritas nos capítulos anteriores, as suspensões

bacterianas utilizadas na extração do DNA genômico também foram do isolado

9a5c da bactéria X. fastidiosa. A metodologia empregada para avaliar a qualidade

e a concentração do DNA genômico obtido foi descrita na seção III. 1.1.

Como descrito anteriormente, os oligonucleotídeos utilizados na

amplificação foram desenhados com base na seqüência da ORF mttC e

incorporados com os mesmos sítios de restrição das demais proteínas, NdeI e XhoI,

preservando também seus códons originais de iniciação e terminação e permitindo

posteriormente sua subclonagem nos vetores de expressão.

Como para os estudos anteriores, a temperatura de hibridização do par de

iniciadores (F e R) desenhado foi calculada teoricamente através do software Gene

Runner 3.05, buscando garantir a eficiência da reação de amplificação do DNA de

interesse. A temperatura ótima encontrada neste caso ficou em torno dos 60 oC.

Com base na temperatura calculada para o par desenhado de

oligonucleotídeos iniciadores foi possível a amplificação da ORF correspondente à

proteína D do sistema de transporte e secreção Tat, porém com baixa concentração

e presença de algumas bandas inespecíficas. Diante deste resultado, também se fez

necessário o processo de otimização da PCR a fim de garantir o máximo de

eficiência na obtenção dos produtos desejados. Assim, somente quando foi

empregada a temperatura de hibridização dos primers de 58 oC foi possível a

amplificação desejada (resultados não mostrados).

Resultados e Discussão – Proteína D do Sistema de Trannsporte e Secreção Tat

151

Resultados excelentes foram obtidos na amplificação da ORF de 807 pb. O

produto de amplificação obtido pela PCR teve o seu tamanho concordante com o

previsto, não apresentou nenhuma banda inespecífica, indicando o sucesso da

otimização e resultou em quantidades suficientes para proceder à clonagem

posterior.

Os produtos da amplificação por PCR foram devidamente purificados pelo

kit Wizard PCR Clean-up da Promega, quantificados em espectrofotômetro e

adenilados a fim de inseri-los no vetor de clonagem pGEM-T easy. A

concentração obtida para estes produtos variou de 100 até 200 ng µL-1. A

construção nos vetores de clonagem foi denominada de pGEM-XftatD.

Os plasmídeos recombinantes pGEM-XftatD recém construídos foram

inseridos por choque térmico em bactérias de E. coli DH5α competentes. As

bactérias transformadas foram semeadas em placas de Petri contendo meio LB

com ágar, ampicilina, X-gal e IPTG e crescidas overnight em estufa a 37 oC.

Diversas colônias brancas e azuis cresceram na placa contendo o meio

selecionado descrito acima. A seleção dos transformantes foi realizada então pela

capacidade de crescer em presença do antibiótico ampicilina e através da coloração

branca de alguns transformantes indicativa da presença do inserto dentro da região

codificadora da enzima β-galactosidase. Dentre as colônias brancas resistentes,

cinco colônias foram escolhidas aleatoriamente, inoculadas em tubos estéreis

contendo meio LB líquido com ampicilina e submetidas à incubação overnight a

37 oC sob agitação. Após o crescimento individual destas colônias seus DNAs

foram extraídos, quantificados, clivados por enzimas de restrição e finalmente

seqüenciados.

Resultados e Discussão – Proteína D do Sistema de Trannsporte e Secreção Tat

152

III. 3.2 – Análise de Restrição e Seqüenciamento dos Plasmídeos

Recombinantes

O DNA plasmidial dos cinco prováveis clones positivos extraídos através dos

métodos descritos pelo kit Wizard Miniprep® e de lise alcalina empregados de

acordo com o descrito em II.2.7, foram inicialmente considerados de boa

qualidade e adequados para as análises de restrição e seqüenciamento. As amostras

de DNA plasmidial extraídos pelo kit e pelo método de lise alcalina apresentaram

em geral concentrações de 200 e 150 ng µL-1, respectivamente.

A análise de restrição empregando as enzimas NdeI e XhoI foi então

realizada a fim de confirmar a presença do inserto nos clones selecionados. A

Figura 52 apresenta o perfil de restrição destes cinco clones selecionados.

1 2 3 4 5 6

bp

3000

850

1 2 3 4 5 6

bp

3000

850

Figura 52. Análise de restrição dos plasmídeos pGEM-XftatD. A coluna 1 é o padrão de massa

molecular 1 Kb Plus DNA Ladder da Gibco BRL. As colunas 2 a 6 são os clones positivos

selecionados a serem utilizados na etapa de subclonagem nos vetores de expressão. O meio de

separação foi gel de agarose 1 % em tampão 1x TAE, pH 8,3. A voltagem aplicada na separação foi

100 V por 30 min. Os fragmentos de DNA no gel foram visualizados em transiluminador UV a 365

nm. As bandas específicas da ORF XftatD e dos plasmídeos digeridos estão representados por setas

cujos tamanhos são aproximadamente 3000 e 850 pb, respectivamente.

Resultados e Discussão – Proteína D do Sistema de Trannsporte e Secreção Tat

153

A presença e o tamanho dos insertos confirmaram o sucesso das etapas de

clonagem e transformação das bactérias. Os produtos da digestão de 850 pb

correspondente a ORF XftatD foram retirados do gel, purificados utilizando-se

novamente o kit Wizard PCR Clean-up, quantificados e utilizados na etapa de

subclonagem nos vetores de expressão. Estas amostras de DNA apresentaram em

geral concentrações variando de 150 a 200 ng µL-1.

Os DNAs plasmidiais de cinco clones foram selecionados para o

seqüenciamento. As seqüências resultantes do gel de seqüenciamento destes clones

também foram analisadas através do programa Sequencing Analysis V 3.

As seqüências resultantes foram submetidas a um processo de busca por

similaridade em diversos bancos de dados internacionais, através de servidores de

busca disponíveis na rede. O principal programa utilizado foi o software público

BLAST cujos resultados mostraram similaridade de seqüência variando de 97 %

de identidade frente à cadeia nucleotídica correspondente a ORF deste estudo,

confirmando a presença da região alvo desejada.

De modo geral os clones seqüenciados apresentaram pequenas variações

entre si, que podem ser atribuídos a erros de leitura ou mesmo a erros gerados

durante a marcação para o seqüenciamento. No entanto, os plasmídeos pGEM-

XftatD destes cinco clones apresentaram os genes de interesse inseridos na

orientação e com fase de leitura corretas dentro dos vetores PGEM-T easy

garantindo assim a integridade destes clones e a posterior leitura eficiente de todas

as bases dos fragmentos na etapa de expressão protéica.

Resultados e Discussão – Proteína D do Sistema de Trannsporte e Secreção Tat

154

III. 3.3 – Subclonagem no Vetor de Expressão e Análise de

Restrição dos Plasmídeos Recombinantes

Os fragmentos de DNA de 850 pb que codificam para a proteína rXftatD

foram subclonados nos vetores pET28a. Esta nova construção denominada pET-

XftatD também foi escolhida devido a expressar a proteína de interesse fusionada

com uma cauda de seis histidinas. Novamente, os plasmídeos recombinantes

recém construídos foram inseridos por choque térmico em bactérias de E. coli

DH5α competentes, semeadas em placas semelhantes ao processo anterior, porém

somente com adição de canamicina, o novo antibiótico de seleção; e finalmente

incubadas para o crescimento. A seleção das colônias neste caso foi realizada

unicamente pela análise de restrição, já que o vetor pET28a não apresenta genes

que as tornem de coloração diferenciada.

Após o período de crescimento celular, novamente cinco colônias foram

selecionadas aleatoriamente dentre as inúmeras colônias presentes na placa de

Petri, e inoculadas seguindo o mesmo processo descrito anteriormente. Após o

crescimento individual destas células seus DNAs foram extraídos, quantificados e

uma alíquota destes DNAs foram clivados por enzimas de restrição. Estas

amostras de DNA também apresentaram concentrações variando de 100 a 150 ng

µL-1. Os DNAs extraídos restantes foram armazenados a -20 oC para eventuais

necessidades.

A Figura 53 ilustra o novo perfil de restrição destes cinco clones

selecionados.

Resultados e Discussão – Proteína D do Sistema de Trannsporte e Secreção Tat

155

bp

5000

850

1 2 3 4 5 6

bp

5000

850

1 2 3 4 5 6

Figure 53. Análise de restrição dos plasmídeos pET-XftatD. A coluna 1 é o padrão de massa

molecular 1 Kb Plus DNA Ladder da Gibco BRL. As colunas 2 a 6 são os clones positivos. O meio

de separação foi gel de agarose 1 % em tampão 1x TAE, pH 8,3. A voltagem aplicada na separação

foi 100 V por 30 min. Os fragmentos de DNA no gel foram visualizados em transiluminador UV a

365 nm. As bandas específicas das ORFs XftatD e dos plasmídeos digeridos estão representados

por setas.

A presença dos insertos em todos os clones selecionados confirmou o

sucesso das etapas de subclonagem e transformação das bactérias. Uma vez

confirmada a presença do inserto, apenas os clones 1 e 2 (equivalentes as 2 o e 3o

canaletas do gel), os quais apresentaram maior intensidade de banda, foram

utilizados para transformar as células competentes de expressão de E. coli

BL21(DE3). A seleção de dois novos clones contendo as ORFs subclonadas nos

vetores de expressão foi realizada após o plaqueamento das células em meio

adequado. Finalmente, os inóculos destes clones foram empregados na produção

da proteína recombinante em células adequadas à expressão.

Resultados e Discussão – Proteína D do Sistema de Trannsporte e Secreção Tat

156

III. 3.4 – Expressão Heteróloga da Proteína rXftatD a partir dos

Vetores de Expressão

A produção da proteína recombinante foi realizada inicialmente por meio da

induzição da expressão por IPTG, a 37 oC. Passado o período de indução de 4

horas, as células bacterianas resultantes foram coletadas por centrifugação e

lisadas na presença de tampão de lise tris-HCl. Os extratos protéicos resultantes

foram avaliados quanto a sua solubilidade por SDS-PAGE.

A Figura 54 mostra o SDS-PAGE 15% no qual foram aplicads as amostras

para análise.

6645

30

20,1

12,4

1 2 3 4 5 6 7 8 9kDa

6645

30

20,1

12,4

1 2 3 4 5 6 7 8 9kDa

Figura 54. Expressão Piloto da proteína rXftatD a partir dos clones 1 e 2. A análise foi

realizada em SDS-PAGE a 15%. Colunas 2 a 5 e 6 a 9 representam as expressões dos clones 1 e 2

contendo os construídos pET-rXftatD, respectivamente. As colunas 2 e 6 são os extratos protéicos

totais não induzido dos sistemas de expressão. As colunas 3 e 7 são os extratos protéicos totais

induzidos. As colunas 4 e 8 são as frações insolúveis após a lise celular. E as colunas 5 e 9 são as

frações solúveis após a lise celular. A coluna 1 é o marcador de massa molecular. A seta indica a

banda de expressão diferenciada na região de 30 kDa.

A presença de bandas adicionais nas frações induzidas 3 e 7 concordam

com o tamanho esperado de 30 kDa para a proteína rXftatD, revelando a eficiência

Resultados e Discussão – Proteína D do Sistema de Trannsporte e Secreção Tat

157

da metodologia de expressão adotada. Porém, a rXftatD não foi observada na

fração solúvel.

Como a cinética de produção das proteínas heterólogas está sujeita a

variados fatores, incluindo tamanho e estrutura da proteína, sua solubilidade,

transporte e tamanho, a expressão heteróloga da rXftatD foi realizada overnight a

temperatura de 20 oC para averiguar se a proteína recombinante era expressa na

forma solúvel.

Além disso, novas células de expressão como a Rosetta (DE3) pLys

também foram transformadas com o plasmídeo pEt-XftatD a 20 0C. Estas células

permitem a captação do indutor de forma lenta, permitindo que a expressão da

proteína de interesse seja expressa lentamente favorecendo assim seu

enovelamento correto.

A mudança de temperatura, do tempo de indução e da célula de expressão

não foram suficientes para expressar a proteína rXftatD na forma solúvel.

Assim, como uma segunda alternativa de solubilização da rXftatD, a

subclonagem da ORF mttC no vetor de expressão pET 32a foi realizada na

tentativa de possibilitar sua expressão solúvel. Este vetor permite a expressão da

proteína alvo em fusão com a proteína tireorredoxina na com a região N-terminal,

uma proteína altamente solúvel, que catalisa a formação de pontes de dissulfeto.

Porém, esta nova construção expressou a proteína novamente na forma insolúvel.

Certas proteínas alvo podem se acumular em agregados insolúveis na forma

de corpos de inclusão. A formação de corpos de inclusão bacterianos são

formalmente considerados ocorrer via associação não específica das superfícies

hidrofóbicas promovida pela interação intermolecular específica sendo um fator

muitas vezes dependente da seqüência (CLARK, 2001). Isto nem sempre é um

Resultados e Discussão – Proteína D do Sistema de Trannsporte e Secreção Tat

158

problema, pois a formação de corpos de inclusão pode proteger a proteína contra a

degradação bacteriana e também facilitar a purificação, uma vez que são corpos

densos, precipitados à baixa velocidade de centrifugação, enquanto a maior parte

das proteínas bacterianas permanece no sobrenadante.

Diante destes resultados, estudos aplicados para solubilizar e renaturar a

proteína rXftatD insolúvel se faziam necessários e foram inicialmente alvos deste

trabalho. Porém, dada a incerteza do resultado e por requererem longos períodos

de tempo para alcançar a renaturação adequada da proteína, de forma a mantê-la

solúvel e funcional, estes estudos foram considerados inviáveis.

II. 3.5 – Conclusões

As etapas gerais de clonagem e a expressão heteróloga em E. coli foram bem

sucedidas, porém a rXftatD somente foi obtida na forma insolúvel.

Perspectivas

159

V – PERSPECTIVAS

O prosseguimento do trabalho com as proteínas de Xylella fastidosa pode objetivar

as seguintes tarefas:

Realização de ensaios de cristalização, e uma vez obtidos cristais, utilizar-se

da difração de raios-X para resolver suas estruturas tridimensionais.

Ensaios de cinética enzimática com o intuito de se calcular os parâmetros

cinéticos envolvidos para cada uma dessas enzimas;

Determinação dos parâmetros termodinâmicos (∆H, ∆G, ∆S, ∆Cp)

envolvidos na interação destas mesmas enzimas, por ensaios de calorimetria, num

microcalorímetro VP-ITC Microcal e VP-DSC.

V - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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