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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

MANOEL ANDRÉ DE SOUZA NETO

Ziziphus joazeiro MARTIUS: ESTUDO FITOQUÍMICO DO EXTRATO

HIDROETANÓLICO DAS FOLHAS, FRACIONAMENTO BIOGUIADO ANTI-

Candida E AVALIAÇÃO DO EFEITO PROTETOR EM MODELO DE

DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL

NATAL-RN

2016

http://www.sigaa.ufrn.br/sigaa/public/programa/portal.jsf?lc=pt_BR&id=4847

MANOEL ANDRÉ DE SOUZA NETO

Ziziphus joazeiro MARTIUS: ESTUDO FITOQUÍMICO DO EXTRATO

HIDROETANÓLICO DAS FOLHAS, FRACIONAMENTO BIOGUIADO ANTI-

Candida E AVALIAÇÃO DO EFEITO PROTETOR EM MODELO DE

DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Orientador: Silvana Maria Zucolotto Langassner

Co-orientadores: Guilherme Maranhão Chaves

Gerlane Coelho Bernardo Guerra

NATAL-RN

2016

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS

Souza Neto, Manoel André de.

Ziziphus joazeiro Martius: estudo fitoquímico do extrato

hidroetanólico das folhas, fracionamento bioguiado anti-Candida

e avaliação do efeito protetor em modelo de doença inflamatória

intestinal / Manoel André de Souza Neto. - Natal, 2016.

262f.: il.

Orientador: Silvana Maria Zucolotto Langassner.

Coorientadores: Guilherme Maranhão Chaves, Gerlane Coelho Bernardo Guerra.

Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

1. Ziziphus joazeiro - Dissertação. 2. Fitoquímica -

Dissertação. 3. Flavonoides - Dissertação. 4. Candida -

Dissertação. I. Langassner, Silvana Maria Zucolotto. II. Chaves,

Guilherme Maranhão. III. Guerra, Gerlane Coelho Bernardo. IV.

Título.

RN/UF/BS-CCS CDU 634.662

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS

Souza Neto, Manoel André de.

Ziziphus joazeiro Martius: estudo fitoquímico do extrato

hidroetanólico das folhas, fracionamento bioguiado anti-Candida

e avaliação do efeito protetor em modelo de doença inflamatória

intestinal / Manoel André de Souza Neto. - Natal, 2016. 262f.: il.

Orientador: Silvana Maria Zucolotto Langassner.

Coorientadores: Guilherme Maranhão Chaves, Gerlane Coelho Bernardo Guerra.

Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

1. Ziziphus joazeiro - Dissertação. 2. Fitoquímica -

Dissertação. 3. Flavonoides - Dissertação. 4. Candida -

Dissertação. I. Langassner, Silvana Maria Zucolotto. II. Chaves,

Guilherme Maranhão. III. Guerra, Gerlane Coelho Bernardo. IV.

Título.

RN/UF/BS-CCS CDU 634.662

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, à minha família, especialmente aos meus pais, Margarida e Francisco,

e ao meu irmão, Francisco Júnior, por todo carinho, suporte e incentivo durante essa jornada

inicial na área acadêmica.

À Profa. Silvana Maria Zucolotto Langassner, pela orientação, paciência, confiança e

principalmente por apoiar as minhas ideias, por vezes mirabolantes, que surgiram durante a

realização deste trabalho. Muito obrigado pela oportunidade.

Ao meu co-orientador micologista, Prof. Guilherme Maranhão Chaves, por todo

auxílio, orientação e ensinamentos, fundamentais para a realização da etapa de atividade

antifúngica deste trabalho.

A todos do laboratório de Microbiologia Clínica e Micologia Médica e Molecular

(LMMM), principalmente ao doutorando Plínio Rocha, pelo auxílio na realização dos

experimentos de atividade antifúngica.

A minha co-orientadora, Profa. Gerlane Coelho Bernardo Guerra, pela orientação,

apoio e, por assim dizer, otimismo na realização dos experimentos in vivo de doença

inflamatório intestinal.

A todos do laboratório de Farmacologia do CB pela enorme ajuda prestada na

realização dos experimentos de doença inflamatório intestinal, incluindo os técnicos Flávio,

Carla, César e Dona Neida, além dos alunos de IC Valéria, Iuri e Cássio. Agradeço

especialmente a doutoranda Daline por todo o auxílio e aprendizado proporcionados.

Ao Prof. Freddy Alejandro Ramos e ao Geison Modesti Costa pela orientação,

essencial suporte e ensinamentos fornecidos durante a realização dos experimentos na

Universidade Nacional de Colombia (UNAL), Laboratório de Productos Naturales Marinos y

Frutas de Colombia.

A operadora do equipamento de RMN da UNAL, Katherine Jaramillo, por todo

cuidado e atenção na obtenção dos espectros. A todas as pessoas da UNAL e Bogotá que me

ajudaram e contribuíram, de alguma forma, para a realização deste trabalho.

Aos colegas do laboratório de Farmacognosia da UFRN/PNBio pela ajuda e amizade.

Em especial, ao meu “ex” IC Jordan, pelo auxílio na realização dos experimentos, e a Samara,

por ter me ensinado boa parte do que sei sobre fitoquímica, pelas dicas, trocas de ideias e

ajuda nos experimentos de isolamento.

Aos professores Josean Fechine Tavares e Norberto Peporine Lopes, assim como aos

técnicos Evandro Ferreira e José Carlos Tomaz, pela colaboração nas análises de RMN e

espectrometria de massas, respectivamente.

À UFRN, Faculdade de Farmácia e Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas pela oportunidade de formação.

À CAPES e ao CNPq pelo auxílio financeiro a essa pesquisa.

RESUMO

A espécie Ziziphus joazeiro é uma planta da Caatinga do Nordeste brasileiro, utilizada como antiséptico, dentifrício, anticaspa, anti-inflamatório e antimicrobiano. A maioria dos estudos químicos relatou a presença de triterpenos nas cascas da espécie. Quanto às folhas, os estudos fitoquímicos são escassos, envolvendo apenas a triagem fitoquímica. Até o momento não foram caracterizadas as substâncias responsáveis pela atividade antifúngica das folhas e não foi encontrado nenhum estudo que tenha avaliado o seu efeito anti-inflamatório em modelo de doença inflamatória intestinal. Portanto, o trabalho tem como objetivo isolar e caracterizar os marcadores químicos do extrato hidroetanólico das folhas (EHF) e desenvolver um método analítico por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para quantifica-los. Em paralelo a isso, objetiva-se avaliar a atividade anti-Candida do extrato, frações e substâncias isoladas de Z. joazeiro, por meio de um fracionamento bioguiado, além de avaliar o efeito protetor do EHF em modelo de doença inflamatória intestinal (colite) induzida por DNBS. O EHF foi preparado por meio de maceração, o qual foi posteriormente particionado com solventes de polaridade crescente. O extrato e as frações foram analisados por reações químicas clássicas, Cromatografia em Camada Delgada, CLAE e CLAE acoplada a espectrômetro de massas (CLAE-EM), sendo observada a presença de saponinas, ácidos fenólicos, cumarinas, e flavonoides glicosilados derivados de quercetina, canferol e isormanetina ou o seu isômero, tamarixetina. Por meio das análises por CLAE-EM foi possível identificar glicosídeos de quercetina (quercetina-3-O-rutinosídeo, quercetina-3-O-galatosídeo, quercetina-3-O-glicosídeo), canferol (canferol-3-O-rutinosídeo) e isoramnetina ou tamarixetina (isoramnetina ou tamarixetina-3-O-rutinosídeo, isoramnetina ou tamarixetina-3-O-galactosídeo, isoramnetina ou tamarixetina-3-O-glicosídeo). Para o isolamento dos flavonoides majoritários, a fração acetato de etila foi submetida à técnica de Cromatografia em Contra-Corrente de Alta Velocidade aliada ao refinamento por zona de pH, seguido de cromatografia em coluna de fase reversa e CLAE semipreparativa. Desse processo, foram isolados 3 flavonóis (ZJF1, ZJF2 e ZJF3), os quais foram identificados, pela análise conjunta de dados cromatográficos e RMN de 1H, como quercetina-3-O-rutinosídeo, canferol-3-O-rutinosídeo e isoramnetina ou tamarixetina-3-O-rutinosídeo, respectivamente. A partir da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) por microdiluição em caldo, aliada a bioautografia, observou-se que a fração butanólica apresentou maior atividade antifúngica frente à Candida glabrata ATCC2001 (CIM = 0,625 mg/mL), e que o processo de concentração das substâncias hipoteticamente bioativas permitiu obter frações com maior atividade anti-Candida in vitro frente a cepas de referência e clínicas. Foi observado que as principais substâncias responsáveis são as saponinas, e a partir de uma dessas frações isolou-se a saponina bacopasídeo X, presuntivamente identificada por análises mono e bidimensionais de RMN. A atividade anti-inflamatória do EHF foi avaliada em modelo de doença inflamatória intestinal nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg, não sendo observado efeito protetor do EHF em relação ao grupo controle positivo. Os resultados obtidos são inéditos para a espécie e o estudo abre perspectivas para a realização de novas investigações envolvendo o uso de flavonoides e saponinas no controle de qualidade e avaliação da sazonalidade, além do estudo do mecanismo de ação das saponinas das folhas sobre as leveduras do gênero Candida. Palavras-chave: Ziziphus joazeiro, flavonoides, saponinas Candida, colite

ABSTRACT

The species Ziziphus joazeiro is a Caatinga plant from Northeast Brazil, used as an antiseptic, dentifrice, anti-dandruff, anti-inflammatory, and antimicrobial. Most chemical studies reported the presence of triterpenes in the bark of the species. Regarding the leaves, the phytochemical studies are scarce, only involving phytochemical screening. The substances responsible for the antifungal activity of leaves have not yet been characterized and no study has evaluated its anti-inflammatory effect in inflammatory bowel disease model. Therefore, this study aims to isolate and characterize the chemical markers of hydroethanolic extract of the leaves (HEL), and develop an analytical method by high-performance liquid chromatography (HPLC) to quantify them. Parallel to this, the study aims to evaluate the anti-Candida activity of the extract, fractions and isolated substances from Z. joazeiro through a bioguided fractionation, and to evaluate the HEL protective effect in a DNBS induced model of inflammatory bowel disease (colitis). The HEL was prepared by maceration, which was further partitioned with increasingly polar solvents. The extract and the fractions were analyzed by classical chemical reactions, Thin Layer Chromatography, HPLC and HPLC coupled to mass spectrometry (HPLC-MS), being observed the presence of saponins, phenolic acids, coumarins and flavonoid glycosides derived from quercetin, kaempferol and isorhamnetin or its isomer, tamarixetin. Through HPLC-MS analysis it was identified quercetin glycosides (quercetin-3-O-rutinoside, quercetin-3-O-galatosídeo, quercetin-3-O-glycoside), kaempferol (kaempferol-3-O-rutinoside) and isorhamnetin or tamarixetin (tamarixetina-3-O-rutinoside, isorhamnetin or tamarixetin-3-O-galactoside, isorhamnetin or tamarixetin-3-O-glucoside). For the isolation of the major flavonoids, the ethyl acetate fraction was subjected to a pH-zone-refining high speed countercurrent chromatography, followed by reversed phase column chromatography and semi-preparative HPLC. In this process, 3 flavonols were isolated (ZJF1, and ZJF2 ZJF3), which were identified by the joint analysis of chromatographic data and 1H NMR as quercetin-3-O-rutinoside, kaempferol-3-O-rutinoside and isorhamnetin or tamarixetin-3-O-rutinoside, respectively. From the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) by broth microdilution, coupled with bioautography, it was observed that the butanol fraction had higher antifungal activity against Candida glabrata ATCC2001 (MIC = 0.625 mg / mL), and the process of concentration of the hypothetically bioactive substances afforded fractions which had more anti-Candida activity in vitro against clinical and reference strains. It was observed that the main substances involved are saponins, and through a saponin rich fraction it was isolated bacopaside X, presumptively identified by one and two-dimensional NMR analyzes. The anti-inflammatory activity of EHF was evaluated in a model of inflammatory bowel disease in doses of 50, 100 and 200 mg / kg and it was not observed protective effect of the HEL compared to the positive control group. The results are novel for the species and the study opens perspectives for new investigations involving the use of flavonoids and saponins in quality control and evaluation of seasonality, besides the study of the mechanism of action of leaves saponins on the Candida genus. Key-words: Ziziphus joazeiro, flavonoids, saponins Candida, colitis

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Indivíduo de Ziziphus joazeiro Martius. ........................................... 31

Figura 2 - Folhas e flores de Ziziphus joazeiro Martius. ................................... 32

Figura 3 - Representação do teste de microdiluição em caldo. ....................... 72

Figura 4 - Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com o eluente para

glicosídeos ...................................................................................... 83


agliconas. ........................................................................................ 85

Figura 6 - Análise por co-CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com os padrões

de quercetina e canferol .................................................................. 86

Figura 7 - Análise por co-CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com os padrões

de rutina e isoquercetina. ................................................................ 88

Figura 8 - Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. e das frações

obtidas da partição líquido-líquido. .................................................. 90

Figura 9 - Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. e das frações

obtidas da partição líquido-líquido ................................................... 90

Figura 10 - Espectros de UV (210-450 nm) dos 25 picos observados na

análise por CLAE-UV-DAD do EHF de Z. joazeiro Mart. ................. 94

Figura 11 - Cromatograma obtido por CLAE-UV-DAD para o EHF de Ziziphus

joazeiro Mart. e frações. .................................................................. 97

Figura 12 - Comparação entre os cromatogramas obtidos para a fração

AcOEt-PLL01 nos equipamentos de CLAE-UV-DAD e CLAE-EM-

TOF, sob o comprimento de onda de 340 nm. ................................ 105

Figura 13 - Análise por CCD das fases dos testes em tubos para os sistemas

contendo acetato de etila-butanol-água........................................... 108

Figura 14 - Análise por CCD das frações da separação CCCAV1..................... 110




Figura 18 - Análise por CCD das frações da separação CCCAV11. .................. 111

Figura 19 - Análise por CCD dos flavonoides ZJF1, ZJF2, ZJF3 e das

misturas ZJFM1 e ZJFM2................................................................ 112

Figura 20 – Cromatograma e espectro no UV do flavonoide ZJF1. .................... 114

Figura 21 - Representação estrutural do flavonol quercetina. ............................ 115

Figura 22 - Espectro ampliado de RMN 1H do flavonoide ZJF1 (400 MHz,

metanol-d4). .................................................................................... 118

Figura 23 - Cromatograma e espectro no UV do flavonoide ZJF2. .................... 120


metanol-d4). .................................................................................... 123

Figura 25 - Possibilidades estruturais para o flavonoide ZJF3. .......................... 126

Figura 26 - Cromatograma e espectro no UV do flavonoide ZJF3. .................... 128


metanol-d4) ..................................................................................... 129

Figura 28 - Ensaio de microdiluição em caldo para as frações da fração

BuOH-PLL01. .................................................................................. 135

Figura 29 - Bioautografia e análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. e da

fração BuOH-PLL01. ....................................................................... 137

Figura 30 - Bioautografia e análise por CCD das subfrações da fração BuOH-

PLL01. ............................................................................................ 138

Figura 31 - Ensaio de microdiluição em caldo para a fração 07-CCFR07. ......... 141

Figura 32 - Ensaio de concentração fungicida mínima realizado para a fração

07-CCFR07. .................................................................................... 142

Figura 33 - Microscopia de amostras dos poços contendo Candida albicans

ATCC90028. ................................................................................... 144

Figura 34 - Valores de CIM observados para a fração 07-CCFR07 frente a

cepas de referência e cepas clínicas. .............................................. 147

Figura 35 - Análise por CCD das frações da CFG03. ........................................ 151

Figura 36 - Análise por CCD das frações da CGF04. ........................................ 152

Figura 37 - Análise por CCD das frações da cromatografia em coluna de fase

reversa 12. ...................................................................................... 153

Figura 38 - Representação estrutural do núcleo damarano (A) e da saponina

bacopasídeo X (B). ......................................................................... 155

Figura 39 - Espectro ampliado de RMN 1H da saponina ZJS1(DMSO-d6; 500

MHz). .............................................................................................. 156


MHz). .............................................................................................. 157


MHz). .............................................................................................. 157

Figura 42 - Espectro ampliado de RMN 13C da saponina ZJS1(DMSO-d6;

125 MHz). ....................................................................................... 159

Figura 43 - Representação estrutural da aglicona jujubogenina. ....................... 160

Figura 44 - Espectro ampliado de HMBC da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500

MHz). .............................................................................................. 161

Figura 45 - Espectro ampliado de HMBC da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500

MHz). .............................................................................................. 162

Figura 46 - Espectro ampliado de HMQC da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500

MHz). .............................................................................................. 163

Figura 47 - Espectro ampliado de COSY da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500

MHz). .............................................................................................. 164

Figura 48 - Principais correlações de HMBC e COSY observadas para ZJS1... 168

Figura 49 - Monitorização do peso corporal das ratas durante o período

experimental.................................................................................... 171

Figura 50 - Índice de atividade da doença (IAD) relativo aos grupos tratatos e

controle durante o período de pós-indução da doença. ................... 172

Figura 51 - Efeito do EHF de Ziziphus joazeiro Mart., em comparação com os

grupos controle, sobre o escore de dano macroscópico do cólon. .. 173

Figura 52 - Cólons representativos dos tratamentos e grupos controle. ........... 173


grupos controle, sobre a relação peso/longitude (mg/cm) do cólon. 174

LISTA DE FLUXOGRAMAS

Fluxograma 1 - Fracionamento do EHF por partição líquido:líquido com

solventes de polaridade crescente. ........................................... 56

Fluxograma 2 - Isolamento dos flavonoides ZJF1, ZJF2 e ZJF3. ....................... 63

Fluxograma 3 - Esquema do fracionamento para a obtenção da fração 09-

CCFR05, utilizada no teste de atividade antifúngica. ................ 64


CCFR07, utilizada no teste de atividade antifúngica. ................ 65

Fluxograma 5 - Esquema do processo de fracionamento por partição líquido-

líquido das frações BuOH-PLL01 e 02-PLL02. .......................... 67

Fluxograma 6 - Esquema de isolamento da saponina ZJS1, a partir da fração

02-PLL03. ................................................................................. 69

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Redimento das frações obtidas após a partição líquido-líquido do

EHF de Ziziphus joazeiro Martius. ................................................... 55

Tabela 2 - Sistemas de solventes testados e proporção (v/v) dos seus

respectivos componentes. ............................................................... 58

Tabela 3 - Condições cromatográficas das separações realizadas por

Cromatografia em Contra-Corrente de Alta Velocidade. .................. 60

Tabela 4 - Gradiente utilizado na separação da fração 12-CCCAV11 por

coluna de C18 (CCFR02). ............................................................... 62

Tabela 5 - Rendimento das principais frações obtidas após o fracionamento

por partição líquido-líquido da fração BuOH-PLL01. ....................... 66

Tabela 6 - Gradiente utilizado na separação da fração por cromatografia em

coluna de fase reversa (CCFR12). .................................................. 68

Tabela 7 - Amostras testadas pelo método de microdiluição em caldo e suas

respectivas concentrações iniciais e faixa de concentração após a

diluição seriada. .............................................................................. 71

Tabela 8 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a revelação

das cromatoplacas que foram submetidas ao eluente para

glicosídeos. ..................................................................................... 82

Tabela 9 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a revelação

das cromatoplacas que foram submetidas ao eluente para

agliconas. ........................................................................................ 84

Tabela 10 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a análise por

co-CCD do EHF de Z. joazeiro Mart.utilizando os padrões de

quercetina e canferol. ...................................................................... 86

Tabela 11 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a análise por

co-CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. utilizando os padrões de

rutina e isoquercetina. ..................................................................... 87

Tabela 12 - Tempo de retenção (tR) e máximos de absorção (λmax) dos

espectros no UV observados para os picos obtidos após a análise

do EHF de Ziziphus joazeiro Mart.por CLAE-UV-DAD. ................... 93



da fração CH2Cl2-PLL01 por CLAE-UV-DAD. .................................. 98



da fração AcOEt-PLL01 por CLAE-UV-DAD. .................................. 100



da fração BuOH-PLL01 por CLAE-UV-DAD. ................................... 101

Tabela 16 - Dados cromatográficos, espectroscópicos (UV) e de

espectrometria de massas dos principais flavonoides encontrados

na fração AcOEt-PLL01. ................................................................. 104

Tabela 17 - Dados espectrais de RMN 1H (400 MHz, metanol-d4) do flavonoide

ZJF1. ............................................................................................... 117

Tabela 18 - Dados espectrais de RMN 1H (400 MHz, metanol-d4) do

flavonoide ZJF2. .............................................................................. 122

Tabela 19 - Dados espectrais de RMN 1H (400 MHz, metanol-d4) do

flavonoide ZJF3 e literatura. ............................................................ 127

Tabela 20 - Concentração inibitória mínima (CIM) do extrato das folhas de Z.

joazeiro Mart. frente a cepas de referência de leveduras de

importância clínica. ......................................................................... 130

Tabela 21 - CIM das frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01, BuOH-

PLL01 e RA-PLL01 frente a cepas de Candida. .............................. 132

Tabela 22 - CIM de frações da fração BuOH-PLL01 frente à levedura Candida

glabrata ATCC 2001........................................................................ 135

Tabela 23 - Estatística descritiva das áreas relativas aos halos de inibição

observados após o teste de bioautografia. ...................................... 138

Tabela 24 - CIM e CFM da fração 07-CCFR07 testada frente a cepas de

Candida. .......................................................................................... 140

Tabela 25 - Concentração inibitória mínima (CIM) da fração 07-CCFR07

testada frente a cepas clínicas. ....................................................... 146

Tabela 26 - Dados espectrais de RMN 1H (500 MHz) e RMN 13C (125 MHz) da

saponina ZJS1 (DMSO-d6) observados para a aglicona, em

comparação com a literatura. .......................................................... 165

Tabela 27 - Dados espectrais de RMN 1H (500 MHz) e RMN 13C (125 MHz) da

saponina ZJS1 (DMSO-d6) observados para a glicona, em

comparação com a literatura. .......................................................... 166

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Estudos etnobotânicos de Ziziphus joazeiro Mart. ........................... 34

Quadro 2 - Metabólitos isolados de diferentes espécies já estudadas no

gênero Ziziphus. .............................................................................. 36

Quadro 3 - Códigos dos processos de separação utilizados ............................. 55

Quadro 4 - Cepas clínicas utilizadas no teste de suscetibilidade....................... 73

Quadro 5 - Distribuição dos grupos de colite aguda para a avaliação da

atividade do EHF de Z. joazeiro Mart. ............................................. 77

Quadro 6 - Critérios utilizados para a monitorização clínica da doença

inflamatória intestinal. ...................................................................... 78

Quadro 7 - Critério para a avaliação da gravidade do dano macroscópico da

colite experimental de acordo com Bell, Gall e Wallace (1995). ...... 79

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AcOEt acetato de etila

ASD Ágar Sabourand Dextrose

ATCC American Type Culture Collection

BuOH n-butanol

CC Cromatografia em coluna de vidro

CCCAV Cromatografia em contra-corrente de alta velocidade

CCD Cromatografia em Camada delgada analítica

CCFR Cromatografia em coluna de fase reversa

CFM Concentração Fungicida Mínima

CGF Cromatografia em coluna de gel de filtração

CIM Concentração Inibitória Mínima

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência

CLAESP Cromatografia líquida de alta eficiência semipreparativa

CNCA Candida não-Candida albicans

COSY Correlation Spectroscopy

CVC Cateter venoso central

DAD Detector de arranjo de diodos

DMSO dimetilsulfóxido

DNBS ácido 2,4-dinitrobenzóico

EHF Extrato hidroetanólico das folhas

HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Correlation

HMQC Heteronuclear Multiple-Quantum Correlation

IAD Índice de Atividade da Doença

IDM Indice de Dano Macroscópico

MeOH metanol

MHC Caldo Mueller-Hinton

MMA Ministério do Meio Ambiente

RMN 13C Ressonância magnética nuclear de carbono 13

RMN 1H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio

SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

SISBIO Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade

UFC Unidades Formadoras de Colônia

UTI Unidade de Terapia Intensiva

UV Ultravioleta

YPD Yeast peptone dextrose

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................... 22

2 REFERENCIAL TEÓRICO .................................................................... 24

2.1 O gênero Candida e as espécies vegetais como fonte de agentes

antifúngicos ......................................................................................... 24

2.2 As plantas medicinais como alternativa no tratamento de

doenças inflamatórias intestinais ...................................................... 28

2.3 Ziziphus joazeiro Martius: informações gerais ................................... 30

2.4 Estudos etnobotânicos de Ziziphus joazeiro Martius ....................... 32

2.5 Constituintes químicos de Ziziphus joazeiro Martius ....................... 35

2.6 Atividades biológicas descritas para a espécie Ziziphus joazeiro

Martius ................................................................................................. 39

2.6.1 Atividade antifúngica ............................................................................. 39

2.6.2. Atividade antibacteriana ........................................................................ 39

2.6.3 Atividade larvicida ................................................................................. 41

2.6.4 Atividade antioxidante ........................................................................... 41

2.6.5 Avaliação toxicológica ........................................................................... 41

2.6.6 Avaliação do potencial genotóxico ......................................................... 42

2.6.7 Atividade anti-inflamatória do gênero Ziziphus e da espécie Ziziphus

joazeiro Mart. ......................................................................................... 42

2.7 Marcadores químicos e controle de qualidade de plantas

medicinais ............................................................................................ 43

3 OBJETIVOS .......................................................................................... 45

3.1 Objetivo geral ....................................................................................... 45

3.2 Objetivos específicos .......................................................................... 45

4 JUSTIFICATIVA .................................................................................... 46

5 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................... 48

5.1 Solventes e reagentes ......................................................................... 48

5.2 Equipamentos e sistemas cromatográficos utilizados no estudo

fitoquímico ........................................................................................... 48

5.3 Material vegetal: coleta, secagem e moagem .................................... 50

5.4 Preparação dos extratos ..................................................................... 50

5.5 Estudo fitoquímico .............................................................................. 51

5.5.1 Análise fitoquímica preliminar ................................................................ 51

5.5.1.1 Identificação das classes de metabólitos secundários por reações

químicas clássicas................................................................................. 51

5.5.1.1.1 Compostos fenólicos ............................................................................. 51

5.5.1.1.2 Taninos ................................................................................................. 51

5.5.1.1.3 Flavonoides ........................................................................................... 51

5.5.1.1.4 Alcaloides .............................................................................................. 52

5.5.1.1.5 Saponinas ............................................................................................. 52

5.5.1.2 Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. por Cromatografia em Camada

Delgada (CCD) ...................................................................................... 52

5.5.2 Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações da partição líquido-

líquido por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ................. 53

5.5.3 Análise da fração AcOEt-PLL01 por espectrometria de massas ............ 54

5.5.3.1 Partição líquido-líquido .......................................................................... 55

5.5.3.2 Análise por cromatografia em contracorrente de alta velocidade ........... 56

5.5.3.2.1 Fracionamento das frações BuOH-PLL01 e AcOEt-PLL01 por

cromatografia em contra-corrente de alta velocidade ............................ 57

5.5.3.3 Isolamento dos flavonoides por cromatografia em coluna e CLAE

semipreparativa ..................................................................................... 62

5.5.3.4 Obtenção das frações para o teste de atividade antifúngica .................. 64

5.7 Avaliação da atividade antifúngica do EHF e frações ...................... 70

5.7.1 Determinação da CIM do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações ................ 70

5.7.1.1 Reativação das leveduras e triagem fenotípica ..................................... 70

5.7.1.2 Preparo do inóculo ............................................................................... 70

5.7.1.3 Triagem com micro-organismos de referência ....................................... 71

5.7.1.4 Determinação da CIM conforme o método do CLSI (CLSI, 2008).......... 73

5.7.1.5 Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) ...................... 74

5.7.1.6 Ensaio de bioautografia ......................................................................... 74

5.8 Avaliação do efeito protetor do EHF de Z. joazeiro Mart. em

modelo de doença inflamatória intestinal ......................................... 76

5.8.1 Animais ................................................................................................. 76

5.8.2 Modelo de colite aguda ......................................................................... 76

5.8.3 Avaliação macroscópica do processo inflamatório intestinal .................. 78

5.8.3.1 Monitorização clínica da doença inflamatória intestinal ......................... 78

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................ 80

6.1 Análise fitoquímica preliminar............................................................ 80

6.1.1 Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. utilizando a fase móvel

para glicosídeos .................................................................................... 80

6.1.2 Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. utilizando a fase móvel

para agliconas ....................................................................................... 84

6.1.3 Análise por co-cromatografia ................................................................. 85

6.2 Análise por CCD das frações da partição líquido-líquido do EHF

de Z. joazeiro Mart. ............................................................................... 89

6.3 Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações da partição líquido-

líquido por CLAE-UV-DAD .................................................................. 91

6.3.1 Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações da partição líquido-

líquido.................................................................................................... 91

6.4 Análise da fração AcOEt-PLL01 por CLAE-IES-EM (TOF) ................ 102

6.5 Fracionamento das frações BuOH-PLL01 e AcOEt-PLL01 por

cromatografia em contra-corrente de alta velocidade e

isolamento de flavonoides .................................................................. 108

6.5.1 Análise estrutural do flavonoide ZJF1 .................................................... 113



6.6 Avaliação da atividade anti-Candida do EHF de Ziziphus joazeiro

Mart. e frações ..................................................................................... 130

6.6.2 Atividade das frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01,

BuOH-PLL01 e RA-PLL01 frente a cepas de referência ........................ 132

6.6.3 Prosseguimento do fracionamento bioguiado para a fração BuOH-

PLL01 .................................................................................................... 133

6.6.4 Ensaio de bioautografia para o EHF, fração BuOH-PLL01 e

respectivas subfrações ativas .......................................................... 136

6.6.5 Avaliação da atividade antifúngica das frações 07-CCFR07 e 10-

CCFR12 frente a cepas de referência segundo o método do CLSI ....... 139

6.6.6 Avaliação da atividade antifúngica da fração 07-CCFR07 frente a

isolados clínicos segundo o método do CLSI ........................................ 145

6.7 Isolamento da saponina ZJS1 ............................................................ 151

6.8 Análise estrutural por RMN da saponina ZJS1 ................................. 154

6.9 Avaliação do efeito protetor do extrato hidroetanólico das folhas

de Z. joazeiro Mart. em modelo de doença inflamatória intestinal ... 170

7 CONCLUSÕES ..................................................................................... 176

REFERÊNCIAS ..................................................................................... 177

APÊNCIDE A – MANUSCRITO PARA PUBLICAÇÃO ......................... 192

APÊNDICE B - ESTRUTURA QUÍMICA DAS SUBSTÂNCIAS

MENCIONADAS NA DISSERTAÇÃO................................................... 216

ANEXO A .............................................................................................. 262

22

1 INTRODUÇÃO

O uso de plantas medicinais acompanha a humanidade desde a pré-história,

as quais, ao longo dos anos, formaram a base de sistemas terapêuticos de várias

civilizações antigas, como os astecas, incas, chineses, egípcios e gregos.

Substâncias obtidas de plantas, como nicotina, muscarina e reserpina, além de

terem contribuído significativamente para o avanço da farmacologia e patofisiologia,

compõem parte do arsenal terapêutico atualmente utilizado na clínica (PASQUALE,

1984; GILANI; RAHMAN, 2005; FABRICANT; FARNSWORTH, 2001).

Apesar da atual predominância, na indústria farmacêutica, de técnicas de

química combinatória como estratégia para a descoberta de fármacos, o número de

fármacos produzidos e aprovados para uso clínico não aumentou proporcionalmente

ao número de compostos sintéticos gerados com base nessas técnicas. Assim,

observa-se ainda que as plantas e outros produtos naturais continuam a participar,

direta ou indiretamente, desse processo (NEWMAN, 2008; NEWMAN; CRAGG,

2012).

Um exemplo da atual utilidade dos vegetais e de outros produtos naturais na

obtenção de fármacos é que, em 2010, de todas as moléculas pequenas e

inovadoras reportadas (que contem grupos farmacofóricos inéditos), cerca da

metade consistia em produtos naturais ou compostos derivados desses (NEWMAN;

CRAGG, 2012). De acordo com trabalhos envolvendo compilação de dados, entre

2000 e 2013 foram aprovados 38 medicamentos cujos fármacos derivam de

substâncias de espécies vegetais (BUTLER; ROBERTSON; COOPER, 2014;

SAKLANI; KUTTY, 2008). Além disso, até dezembro de 2013, vinte e um fármacos

antineoplásicos derivados de plantas estavam sendo submetidos a ensaios clínicos

(BUTLER; ROBERTSON; COOPER, 2014).

O país que possui a maior variedade dessas fontes de compostos bioativos é

o Brasil, as quais estão distribuídas em 6 biomas continentais e um marinho,

encerrando cerca de 20% da biodiversidade mundial. Igualmente extensa é a flora

brasileira, estimada em cerca de 55.000 espécies vegetais (IBGE, 2004; DIAS,

1995). Diante disso, percebe-se o importante potencial do Brasil como terreno para a

bioprospecção sustentável e a consequente geração de emprego, renda e produtos

para a saúde, como os medicamentos fitoterápicos (VILLAS BÔAS; GADELHA,

2007).

23

Apesar da imensa biodiversidade do Brasil, esta foi pouco explorada, pois

estima-se que a busca por compostos bioatlivos foi realizada em apenas cerca de

8% da flora do país (GUERRA; NODARI, 2001). Portanto, considerando a relevância

das plantas na descobertcoa de fármacos e a grande diversidade vegetal no país, é

de suma importância que as suas espécies vegetais sejam caracterizadas quanto ao

seu perfil fitoquímico e atividade biológica.

Ziziphus joazeiro Mart. destaca-se como uma das plantas da região

semiárida, nativa e endêmica do Brasil e de grande importância para a população do

Nordeste (LIMA, 2013a; LORENZI; MATOS, 2008). A árvore, cuja folhagem mantem-

se verde durante a seca, é usada tanto como forragem quanto como planta

medicinal, sendo a casca e as folhas tradicionalmente empregadas na higiene bucal

e capilar, no alívio de problemas estomacais (LORENZI; MATOS, 2008), no

tratamento de infecções fúngicas (CRUZ et al., 2007) e como anti-inflamatório

(OLIVEIRA, 2005).

De acordo com a literatura, um extrato concentrado em saponinas extraídas

da casca de Z. joazeiro Mart. inibiu o crescimento fúngico de Candida albicans

(RIBEIRO et al., 2013), um importante patógeno oportunista de infecções fúngicas

invasivas (SARDI et al., 2013). Logo, o uso popular da casca e da folha em

infecções fúngicas possivelmente tem relação com a presença de saponinas nesses

farmacógenos.

A partir de análises iniciais realizadas no presente trabalho, observou-se que

as folhas possuem, além de saponinas, uma grande variedade de flavonoides

glicosilados. Os flavonoides tem apresentado atividade anti-inflamatória em

diferentes modelos de inflamação (CHIBLI et al., 2015) e os glicosídeos destacam-

se por sua atividade anti-inflamatória em modelos de doença inflamatória intestinal

(COMALADA et al., 2005; MASCARAQUE et al., 2014).

Portanto, baseando-se no contexto explicitado e considerando a sua

importância etnofamacológica, neste trabalho foi realizado um estudo fitoquímico de

Z. joazeiro Mart. com o objetivo de isolar e caracterizar marcadores químicos, bem

como a avaliação da atividade antifúngica in vitro e protetora em modelo in vivo de

colite experimental do extrato hidroetanólico das folhas e suas respectivas frações

24

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 O gênero Candida e as espécies vegetais como fonte de agentes

antifúngicos

As infecções fúngicas, apesar de serem frequentemente subestimadas e

negligenciadas por pesquisadores e entidades governamentais, têm acometido e

causado a morte de milhares de pessoas ao redor do mundo (BROWN et al., 2012).

Recentemente, foram realizados estudos epidemiológicos no Brasil, México,

Espanha, Bélgica e Rússia, acerca da prevalência de infecções fúngicas graves, e a

soma de todos os casos estimados nesses países totalizou 18 047 381 milhões

(CORZO-LEÓN; ARMSTRONG-JAMES; DENNING, 2015; GIACOMAZZI et al.,

2015; KLIMKO et al., 2015; LAGROU et al.; RODRIGUEZ-TUDELA et al., 2015). É

importante mencionar que 52% de todos esses casos foram originados por espécies

do gênero Candida e, no Brasil, para o ano de 2011, de todos os casos de infecções

fúngicas graves estimados, 74% foram igualmente ocasionados por espécies do

gênero Candida (GIACOMAZZI et al., 2015)

O gênero Candida é constituído por leveduras que habitam diferentes sítios

anatômicos da espécie humana, assim como de outros animais e o meio ambiente

(água, solo, plantas). Candida albicans é a única espécie que sobrevive unicamente

no organismo humano e de outros animais de sangue quente, sendo portanto

comensal, fazendo parte da microbiota humana normal da cavidade oral, trato

gastrintestinal e vagina de indivíduos saudáveis. Em decorrência deste fator, pode-

se explicar a sua alta prevalência em infecções dos mais variados sítios anatômicos

(REISS; SHADOMY; LYON, 2011).

As espécies do gênero são patógenos oportunistas e atingem principalmente

indivíduos debilitados por outras doenças ou imunocomprometidos. São

responsáveis por causar um amplo espectro de efermidades, como candidíase oral,

vulvovaginal, infecções de pele, mucosa, onicomicose, assim como infecções

invasivas, incluindo a candidemia, que está associada a uma elevada taxa de

mortalidade (REISS; SHADOMY; LYON, 2011).

A patogenicidade das espécies do gênero Candida é resultante dos seus

fatores de virulência, os quais estão relacionados à adesão a células epiteliais e

endoteliais do hospedeiro, formação de uma comunidade microbiana envolvida em

25

matriz exopolimérica, denominada de biofilme, produção de enzimas hidrolíticas,

fosfolipases e aspartil-proteases secretadas, além da filamentação, ou seja, a

transição de blastoconídio para hifa verdadeira, fenômeno este comum em Candida

albicans (O’DONNELL; ROBERTSON; RAMAGE, 2015) A espécie Candida glabrata

não é capaz de produzir hifas, porém é a segunda ou terceira mais reportada em

estudos da América do Norte e Norte da Europa, que envolvem o isolamento de

leveduras nos mais variados sítios. Este achado pode ser justificado devido aos

mecanismos de resistência aos antifúngicos que essa espécie apresenta

(LOCKHART, 2014; YAPAR, 2014).

Candida spp. têm emergido principalmente no ambiente hospitalar na forma

de candidíase invasiva, resultando sobretudo do aumento no número de pacientes

debilitados ou imunocomprometidos, como indivíduos com a Síndrome da

Imunodeficiência Adquirida (SIDA), aqueles submetidos a quimioterapia em

decorrência de neoplasias malígnas ou transplantes, indivíduos submetidos a

procedimentos invasivos ou que permanecem longos períodos de tempo em

unidades de terapia intensiva (UTI) (YAPAR, 2014). A candidíase invasiva

comumente está associada a um aumento da mortalidade e custos hospitalares e,

possivelmente, esse fator explica a maior atenção fornecida a essa doença no que

se refere a estudos epidemiológicos, aspecto que pode ser observado

principalmente nos Estados Unidos e países da Europa (MORGAN et al., 2005;

YAPAR, 2014).

Existem mais de 150 espécies de Candida conhecidas, porém cerca de 95%

da infecções invasivas são causadas por apenas 5 espécies: C. albicans, C.

glabrata, C. parapsilosis e C. krusei. A espécie C. albicans é frequentemente

reportada como a espécie mais prevalente nos estudos epidemiológicos acerca de

candidíase invasiva, sendo variável a sua proporção em relação às outras espécies

de acordo com a região (LOCKHART, 2014; YAPAR, 2014).

No entanto, ao longo dos últimos anos, tem-se observado uma tendência

caracterizada por uma redução gradativa na prevalência de C. albicans isoladas de

pacientes com candidíase invasiva. Apesar de C. albicans ainda ser a espécie mais

prevalente nos mais variados estudos, o número de casos de candidíase invasiva

por essa espécie tem diminuído, enquanto que a candidíase invasiva ocasionada por

espécies de Candida não-Candida albicans (CNCA) tem aumentado, a um ponto em

que, quando consideradas em conjunto, superam a prevalência de C. albicans em

26

muitos estudos mundiais. Atualmente não se sabe as causas dessa mudança,

porém supõem-se que os principais fatores que a impulsionaram foram o uso

excessivo do fluconazol como terapia empírica e a implementação de cateteres

venosos centrais (CVCs) em pacientes graves (LOCKHART, 2014; YAPAR, 2014).

Na América do Norte e em muitos países da Europa, o declínio de C. albicans

foi acompanhado por um aumento na prevalência de C. glabrata. Enquanto isso, na

América Latina, a segunda espécie mais prevalente pertence ao complexo C.

parapsilosis, que afetava principalmente neonatos e indivíduos portadores de CVCs

internados em UTIs, porém atualmente tem sido isolada de todas as faixas etárias.

A Espanha, assim como os países da América Latina, também possui como

segunda espécie mais prevalente C. parapsilosis em estudos de infecções fúngicas

invasivas (YAPAR, 2014).

No Brasil, C. glabrata tem emergido como a segunda espécie mais prevalente

em alguns hospitais públicos e principalmente em hospitais privados (COLOMBO et

al., 2013; MORETTI et al., 2013). Segundo Colombo et al. (2013), alguns hospitais

privados apresentam um perfil semelhante ao de países desenvolvidos devido ao

uso do fluconazol como agente profilático.

Outro importante gênero envolvido em infecções fúngicas é Trichosporon,

constituído por espécies causadoras principalmente de infecções superficiais de pele

e fâneros em pacientes imunocompetentes, destacando-se casos de piedra branca

e, em menor frequência, episódios de onicomicose (CHAGAS-NETO et al., 2009;

COLOMBO et al., 2011). O gênero Trichosporon é considerado o segundo ou

terceiro agente mais comumente isolado de infecções fúngicas invasivas por

leveduras não-Candida spp., em pacientes com câncer. Em um estudo realizado

durante 8 anos pala rede ARTEMIS, envolvendo 134 grupos de pesquisas de 40

países, incluindo o Brasil, Trichosporon spp. responderam por 10,7% das 8.821

cepas de leveduras não pertencentes ao gênero Candida (PFALLER E DIEKEMA,

2007)

No Brasil, em cerca de 68% dos casos de infecções sistêmicas, foram isoladas

cepas de T. asahii, seguida de T. asteroides (CHAGAS-NETO et al., 2009). O

prognóstico para os pacientes é relativamente pobre. As infecções invasivas tendem

a ser graves e apresentam elevada taxa de mortalidade, da ordem de 53%, podendo

chegar até 83% em pacientes com câncer (FLEMING et al., 2002; CHAGAS-NETO

et al., 2008).

27

O atual arsenal terapêutico para o tratamento de infecções fúngicas é

limitado, se restringido a poucas classes. Dentre elas, destacam-se os azólicos,

poliênicos, equinocandinas e análogos de nucleosídeos. Os azólicos, incluindo

miconazol, fluconazol, voriconozol e posaconasol, atuam causando danos à

membrana celular fúngica ao inibir uma enzima envolvida na biossíntese do

ergosterol (14-α-demetilase). Os poliênicos, como a nistatina e a anfotericina B,

também atuam no ergosterol, porém ligam-se diretamente a esse componente e

causam a formação de poros na membrana. As equinocandinas, incluindo a

caspofungina e a micafungina, impedem a formação da parede celular fúngica por

meio da inibição de uma enzima envolvida na síntese de glucana (β-1-3-D-glucano-

sintase). Por último, os análogos de nucleosídeos, como flucistosina e pirimidina,

impedem a síntese do DNA ao inibir uma enzima envolvida na sua biossíntese, a

timidilato sintase (SPAMPINATO; LEONARD, 2013).

O surgimento de cepas resistentes aos antifúngicos sintéticos disponíveis

comercialmente torna ainda mais limitado o arsenal terapêutico disponível. Embora a

prevalência de resistência em C. albicans seja baixa e permaneça relativamente

constante, em espécies de CNCA ela tem emergido, sendo C. glabrata uma espécie

em destaque por apresentar menor susceptibilidade intrínseca aos azólicos, além ter

sido reportado um aumento no número de cepas resistentes às equinocandinas

(ALEXANDER et al., 2013; LOCKHART, 2014). Portanto, considerando a já

mencionada substituição gradativa de C. albicans por espécies de CNCA, a situação

passa a ser ainda mais preocupante.

A resistência aos antifúngicos envolve basicamente os mecanismos de

bomba de efluxo, perda de afinidade ao receptor e compensação do efeito do

fármaco (SPAMPINATO; LEONARD, 2013).

O mecanismo de bomba de efluxo consiste na expulsão do agente antifúngico

do meio intracelular para o extracelular. Em Candida, existem bombas de efluxo do

tipo ABC (ATP-binding cassette), responsáveis por expulsar todos os antifúngicos

azólicos do meio intracelular, assim como bombas específicas para o fluconazol, que

utilizam um gradiente de prótons como energia propulsora. No primeiro tipo de

bomba, os genes codificantes são o CDR1 e o CDR2, e no último o gene MDR1 é o

responsável (SPAMPINATO; LEONARD, 2013).

A diminuição da afinidade do antifúngico ao alvo resulta de mutações pontuais

no gene ou genes que o codificam. Para os azólicos, podem ocorrer mutações no

28

gene ERG11 que codifica a enzima 14-α-demetilase. Por outro lado, para as

equinocandinas, o mecanismo de resistência envolve mutações nos genes FKS1 e/

ou FKS2, os quais codificam o complexo enzimático β-1-3-D-glucano-sintase

(SPAMPINATO; LEONARD, 2013).

O mecanismo compensatório envolve o aumento na quantidade do alvo, por

consequência do aumento na sua expressão gênica ou ausência do alvo devido a

mutações. Para os antifúngicos azólicos, pode ocorrer uma superexpressão do gene

ERG11, levando a um aumento na proteína alvo. No caso dos antifúngicos

poliênicos, ocorre uma diminuição no conteúdo de ergosterol da membrana em

virtude de mutações nos genes ERG3 ou ERG6 que codificam enzimas envolvidas

na biossíntese do ergosterol (SPAMPINATO; LEONARD, 2013).

Portanto, conforme o contexto anteriormente apresentado, são necessárias

novas alternativas que venham a complementar os agentes antifúngicos disponíveis,

e as plantas medicinais, por apresentarem a capacidade de produzir metabólitos

diversos, constituem uma dessas alternativas.

2.2 As plantas medicinais como alternativa no tratamento de doenças

inflamatórias intestinais

A inflamação consiste numa cascata de eventos, envolvendo uma variedade

de mediadores e tipos celulares, quel é eliciada em resposta a um estímulo nocivo.

Essa resposta é pré-programada e inespecífica quanto ao tipo tecidual e seu

objetivo final é a remoção do agente agressor e reparo do local afetado. No entanto,

o alcance desse objetivo requer uma drástica alteração da homeostase tecidual, que

envolve a dilatação dos vasos e consequente aumento do fluxo sanguíneo, aumento

da permeabilidade capilar, formação de exsudato, infiltração leucocitária e lesão

tecidual (SCHMID-SCHÖNBEIN, 2006; OKIN e MEDZHITOV, 2012).

Em consequência disso, pode-se inferir que a resposta inflamatória é

essencial para a sobrevivência da espécie humana, por ser capaz de tratar

condições severas, causadas por diferentes estímulos, porém, ao mesmo tempo é

potencialmente danosa. O custo sobrepõe o benefício quando a resposta

inflamatória não atinge o seu objetivo final e torna-se exacerbada e persistente. Em

consequência disso, a inflamação atua como elemento-chave na patofisiologia de

diversas doenças, como artrite reumatóide, diabetes, hipertensão e distúrbios

29

intestinais (SCHMID-SCHÖNBEIN, 2006; OKIN e MEDZHITOV, 2012). De particular

interesse para esta pesquisa são as doenças inflamatórias intestinais, que possuem

etiologia pouco conhecida e cuja patogênese envolve uma complexa interação entre

fatores relacionados ao ambiente, componentes genéticos, microbiota intestinal e

sistema imune.

Neste contexto, as duas principais doenças inflamatórias intestinais são a

colite ulcerativa e a doença de Crohn (ZHANG e LI, 2014). Especificamente, a colite

ulcerativa é uma doença inflamatória recidivante e restrita à mucosa do colon. As

pessoas acometidas por essa doença apresentam dores abdominais, evacuação de

pus, muco e diarreias sanguinolentas. Essas podem ocorrer em torno de quatro

vezes ao dia, nos casos clinicamente classificados como leves, até mais de 10

vezes ao dia, nos casos considerados fulminantes (BAUMGART; SANDBORN,

2007).

O tratamento medicamentoso das doenças inflamatórias intestinais objetiva

amenizar o processo inflamatório e promover a remissão da doença. A terapia

envolve o uso de aminosalicilatos, corticosteróides, agentes imunossupressivos e

antimicrobianos. No entanto, o uso crônico desses medicamentos é frequentemente

limitado devido a eventos adversos a medicamentos, incluindo náusea, vômito,

cefaleia, dislipidemia, osteoporose, hiperglicemia, hipertensão e nefrotoxicidade

(HEMSTREET, 2014).

Diante desse contexto, é de fundamental importância buscar alternativas

eficazes, seguras e que possam ser usadas cronicamente. Uma dessas alternativas

são as plantas medicinais.

Na literatura há muitos trabalhos que têm como objetivo avaliar o potencial de

extratos vegetais como agente anti-inflamatório e protetor em modelos de colite

experimental, os quais geralmente apresentam compostos fenólicos, principalmente

os flavonoides, como os metabólitos secundários majoritários. Por exemplo, foi

reportado que os extratos de Bryophyllum pinnatum e Jasminum sambac, os quais

possuem polifenóis como componentes majoritários, apresentaram atividade anti-

inflamatória em modelos de edema de pata e de orelha, enquanto que o extrato de

Prunus dulcis apresentou atividade em um modelo de colite induzida por ácido

trinitrobenzenosulfônico (CHIBLI et al., 2014; SENGAR et al., 2015; ZORILLA et al.,

2014). Os flavonoides, na forma isolada, também tem apresentado considerável

potencial na modulação da inflamação, apresentando atividade em modelos in vivo

30

de edema de pata e de orelha (CHIBLI et al., 2015) e in vitro frente à produção de

óxido nítrico por macrógagos (CUONG et al., 2015). Com relação à atividade de

flavonoides em modelos de colite, foi reportado que a miricitrina apresentou

atividade anti-inflamatoria sobre a colite experimental induzida em ratos por sulfato

sódico de dextrana (SCHWANKE et al., 2013), enquanto que o flavonoide rutina

apresentou atividade em modelos de colite induzida por sulfato sódico de dextrana e

de indução por transferência de células T (COMALADA et al., 2005; MASCARAQUE

et al., 2014).

Uma constatação relevante que alguns estudos têm enfatizado é a de que os

glicosídeos de quercetina, como rutina e quercitrina, apresentam atividade anti-

inflamatória em modelos de inflamação intestinal, enquanto que a aglicona

apresenta-se inativa. Essa informação é aparentemente contraditória, pois a forma

livre possui o maior efeito anti-inflamatório in vitro. A hipótese mais reforçada é a de

que a aglicona é absorvida no intestino delgado e, em contrapartida, a forma

glicosilada funciona como um pró-fármaco, carreando a aglicona até intestino

grosso, onde é liberada na forma livre por glicosidases bacterinanas (COMALADA et

al., 2005; KIM et al., 2005; KWON et al., 2005, MASCARAQUE et al., 2014). Essa

informação é de extrema relevância para o presente trabalho, pois, de acordo com

os resultados observados neste estudo, as folhas de Ziziphus joazeiro possuem uma

grande variedade de flavonoides glicosilados.

2.3 Ziziphus joazeiro Martius: informações gerais

O gênero Ziziphus pertence à família Rhamnacea, encontrada nas regiões

temperadas, tropicais e subtropicais de todo o mundo e possui aproximadamente

900 espécies distribuídas em 58 gêneros (BARROSO, 2002).

Os representantes desta família, no Brasil, podem ser encontrados em todas

as cinco regiões do país e, consequentemente, em todos os domínios

fitogeográficos (Amazônico, Caatinga, Cerrado, Mata Atlântica, Pampa e Pantanal).

No país, a família compreende 14 gêneros, sendo três endêmicos. Os gêneros

possuem 47 espécies representativas, das quais 16 são endêmicas. Na região

Nordeste, 20 das 47 espécies podem ser encontradas (LIMA, 2013b).

No Nordeste, as espécies da família são utilizadas na ornamentação, na

medicina popular, na fabricação de cosméticos, cremes dentais antissépticos e

31

doces, na alimentação de animais e no trabalho artesanal. As espécies do gênero

Ziziphus estão entre as mais conhecidas pelos habitantes da região, destacando-se,

como comentado anteriormente, Z. joazeiro, cuja as raspas da casca são

comercializadas para o uso na higiene capilar (QUEIROZ, 2006).

Entre as nove espécies do gênero que ocorrem no país, seis são encontradas

na região Nordeste:

Ziziphus cinnamomum Triana & Planch; Ziziphus cotinifolia Reissek; Ziziphus

guaranítica Malme; Ziziphus platyphylla Reissek; Ziziphus undulata Reissek;

Ziziphus joazeiro Mart (LIMA, 2013c).

A espécie Z. joazeiro possui vários nomes populares, sendo os mais comuns

juá e juazeiro. A planta (Figura 1) é típica da Caatinga e ocorre em oito dos nove

estados do Nordeste e também em Minas Gerais, sendo encontrada no ambiente de

forma isolada, longe das matas secas (CARVALHO, 2007).

Figura 1 - Indivíduo de Ziziphus joazeiro Martius.

É uma espécie que, ao contrário de outras plantas da Caatinga, consegue

manter-se perenifolia durante o ano todo. Isto porque a planta possui raízes amplas

e profundas, capazes de captar a pouca umidade presente na terra semi-árida,

Fonte: autor

32

podendo perder por completo a sua folhagem apenas quando a água do solo torna-

se quase inexistente (OLIVEIRA, 1976).

As árvores do juazeiro podem atingir até 16 metros de altura quando adultas e

formam uma copa ampla e densa. O tronco pode ser reto ou tortuoso, sendo bem

ramificado a partir da base e com galhos dotados de espinhos. A casca externa é

rígida e de cor cinza escuro a levemente castanha; a casca interna é amarelada, a

qual libera um exsudato transparente e amargo após uma incisão (CARVALHO,

2007).

As folhas medem de 2 a 6 cm de largura por 5 a 10 cm de comprimento.

São lustrosas, de consistência membranácea a coriácea, com disposição alternada

nos ramos. Possuem formato oval ou elíptico, ápice acuminado e 3 a 5 nervuras que

emergem da base e se reúnem no ápice. As flores são pequenas, de coloração

amarelo-esverdeada. Os frutos são uma drupa amarela de formato esférico,

medindo de 1,5 a 2 cm de diâmetro (CARVALHO, 2007).

Figura 2 - Folhas e flores de Ziziphus joazeiro Martius.

2.4 Estudos etnobotânicos de Ziziphus joazeiro Martius

Ao longo dos anos, as civilizações e tribos humanas construíram um extenso

conhecimento acerca de plantas medicinais, as quais foram selecionadas de forma

Fonte: autor

33

empírica com base nos seus efeitos. Como exemplo do acúmulo dessa sabedoria,

tem-se a medicina tradicional Chinesa e a Ayurveda. É este tipo de conhecimento

que constitui o alvo da pesquisa etnofarmacológica, que visa validá-lo

cientificamente através de estudos fitoquímicos e farmacológicos não-clínicos e

clínicos (FABRICANT; FARNSWORTH, 2001; ELISABETSKY, 2001).

Pode-se dizer que a pesquisa etnodirigida apresenta vantagens em relação à

pesquisa randômica de plantas e às técnicas de química combinatória. Isto porque

as espécies que foram utilizadas pelo homem por um longo período provavelmente

passaram por uma triagem inicial e, consequentemente, possuem maior

probabilidade de conter compostos eficazes tanto farmacologicamente quanto

biofarmaceuticamente (ELISABETSKY, 2001).

Baseando-se nessa ideia, foi realizado, na década de 1980, um levantamento

de todos os fármacos derivados de plantas utilizados na clínica e observou-se que a

maioria foi descoberta com base em dados etnobotânicos (FARNSWORTH et al.

1985). Além disso, outros estudos forneceram evidências da maior eficácia da

abordagem etnofarmacológica em relação à abordagem aleatória na seleção de

plantas promissoras (SLISH et al., 1999; KHAFAGI; DEWEDAR, 2000). Portanto, a

tradição popular mostra-se muito útil para nortear pesquisas que envolvam a

descoberta de fármacos, o desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos ou

apenas a validação do uso popular.

Diante deste contexto, é de grande importância que os estudos científicos da

espécie Z. joazeiro Mart. também sejam direcionados pelo conhecimento popular,

sobretudo porque, de acordo com a literatura, esta é uma das plantas do Nordeste

brasileiro mais utilizadas na região da Caatinga (ALBUQUERQUE et al., 2007) e

uma das 100 plantas com maior diversidade de usos medicinais do Brasil

(MEDEIROS; LADIO; ALBUQUERQUE, 2013). Desta forma, foi realizado um

levantamento bibliográfico da etnobotânica da espécie Z. joazeiro Mart. (Quadro 1).

34

Quadro 1 - Estudos etnobotânicos de Ziziphus joazeiro Mart.

Partes Usadas Modo de preparo Uso popular/indicação Referências

Entrecasca do fruto In natura Sabão e dentifrício BRAGA, 1960 apud

OLIVEIRA, 1978 Entrecasca do fruto Infusão ou maceração Tônico capilar

Casca

ND

Xampu, anticaspa e tônico capilar

LIMA, 1985 apud CARVALHO, 2007

Casca e folha Detergente

Folha e casca Extrato aquoso

Alívio de problemas gástricos, clareamento da pele do rosto, tônico capilar, dentifrício, doenças de pele.

BRAGA, 1960; SOUSA et al., 1991; MATOS, 2002 apud LORENZI; MATOS,

2008 Entrecasca(pó) Pó Dentifrício

Casca

Raspas da casca deixadas em água

Cicatrizante ALBUQUERQUE; ANDRADE, 2002

Xarope Tosse

Casca/folhas ND Anti-inflamatório, antitussígeno, higiene bucal

OLIVEIRA, 2005

ND ND Gripe PINTO et al., 2006

Casca Banho Reações alérgicas TEIXEIRA; MELO, 2006

Casca do caule

Adição de raspas da casca na água Cicatrização ALBUQUERQUE, 2006

Xarope

ND ND Tosse ALBUQUERQUE, OLIVEIRA, 2007

Casca (pó) ND Dentifrício, anticaspa AGRA et al., 2007

Folhas Decocção Micoses superficiais

CRUZ et al., 2007

Casca Infusão Candidíase

Madeira In natura Fitocombustível RAMOS, 2007

Fruto In natura Alimento

ROQUE, 2009 Folha In natura Forrageira (dieta de bovinos, caprinos e ovinos).

Casca (raspa) Maceração, banho e xarope

Queimaduras, verminose, higiene bucal, gripe, caspa, cicatrizante em geral.

ND ND Dentifrício SANTOS et al., 2009

ND ND Mau hálito, doenças bucais CAVALCANTE, 2010

35

Folhas, frutos, casca Decocção, infusão, maceração, suco

Gripe, febre, azia, problemas estomacais, indigestão, reumatismo, antiséptico, caspa, dentifrício, tônico capilar

CARTAXO; SOUZA; ALBUQUERQUE, 2010

Casca Uso tópico Caspa

OLIVEIRA; BARROS; MOITA NETO, 2010

Casca Emplastro Queimadura

Folha Infusão Problemas gástricos

Casca Maceração Gripe, caspa, dor dentária SILVA; FREIRE, 2010

Folha Infusão

Tosse, gripe, indigestão, bronquite

MARINHO; SILVA; ANDRADE, 2011

Casca do caule Maceração

Entrecasca da raíz Decocção

Folhas Decocção Problemas da dentição, diarréia

SILVA et al., 2012

ND ND

Antisséptico, antisséptico oral, azia, caspa, constipação, dor de estômago, diarreia, expectorante, febre, ferida, fortificante capilar, gripe, inflamação, insônia, dentifrício, indigestão, problemas estomacais, reumatismo, tosse, tuberculose, helmintíase

MEDEIROS; LADIO; ALBUQUERQUE, 2013

ND: Não descrito.

2.5 Constituintes químicos de Ziziphus joazeiro Martius

O conhecimento dos metabólitos secundários, presentes no gênero

Ziziphus, é de fundamental importância, pois permite prever os metabolitos

secundários que podem ser encontrados na espécie Z. joazeiro Mart. Dentre as

várias espécies pertencentes a este gênero, destacam-se Ziziphus mucronata Willd.,

Ziziphus mauritiana Lam. e Ziziphus jujuba Mill., por serem as mais estudadas

quanto a sua fitoquímica (Quadro 2).

36

Quadro 2 - Metabólitos isolados de diferentes espécies já estudadas no gênero

Ziziphus.

Espécie Parte usada

Extração Isolado(s) Referência

Z. mucronata

Raíz (casca)

Percolação em diclorometano

Mucronina A, D e J (alcalóides ciclopeptídicos).

AUVIN et al., 1996

Z mauritiana

Raiz

Extração em metanol

Àcido ceanotico, ácido ceanotano, ácido zizimauritico, ácido betulínico.

JI et. al., 2012

Z. oxyphylla

Raiz

Extração em metanol

Alcalóides ciclopeptídicos: Oxifilina-B 1, Oxifilina C 2, Oxifilina -D 3, Nummularina-C 4, Nummularina-R 5

KALEEM et al., 2013

Z. jujuba e Z. jujuba var. Spinosa

Folhas Extração em metanol 80%

Três flavonóides: Quercetina-3-O-rutinosídeo; quercetina-3-O-α-L-arabinosil-(1 → 2)-α-L-rhamnosídeo; 3, quercetina-3-O-β-d-xilosil-(1 → 2)-α-L-ramnosídeo; Duas saponinas: Ziziphus saponina I; Ziziphus saponina

II Nove ácidos triterpênicos: ácido ceanótico; ácido alfitólico; ácido maslínico; ácido 2-α-hidroxiursolico; ácido ziziberanálico; ácido epiceanótico; ácido ceanotênico; ácido betulínico; ácido oleanólico.

GUO et al., 2011

Z. jujuba

Fruto sem semente

1 - extração em n-hexano clorofórmio; etanol 80%+ agua + acetato de etila. 2 - extração em n-hexano com posterior maceração com metanol.

Isômeros do ácido palmitoléico e ácidos triterpénicos, tais como: ácido betulínico, ácido ursólico, ácido alfitólico, ácido oleanóico

PLASTINA et. al., 2012

Os trabalhos acerca dos constituintes químicos da espécie Z. joazeiro Mart.

são esporádicos e tem como foco a investigação dos metabólitos secundários da

casca, principalmente substâncias triterpenóides.

Um dos primeiros estudos acerca dos fitoconstituintes da espécie foi

publicado em 1984 por Higuchi et al.. Nesse trabalho, a partir da casca, foram

isoladas e caracterizadas três saponinas triterpênicas inéditas que diferem quanto à

porção glicídica e, portanto, possuem a mesma aglicona, a jujubogenina,

previamente isolada das sementes de Ziziphus jujuba. A primeira saponina

(bacocasídeo X) é uma jujubogenina ligada a uma molécula de glicose (β-D-

glicopiranose) e duas moléculas de arabinose (α-L-arabinofuranose e α-L-

37

arabinopiranose). A segunda e terceira saponinas correspondem a jujubogenina

ligada à mesma porção glicídica, porém a glicona encontra-se monosulfatada (4’’’-O-

sulfato) para a segunda saponina, e disulfatada (3’’, 4’’’-di-O-sulfato) para a terceira

saponina.

Posteriormente, foi realizado um estudo no qual a casca do caule foi extraída

com clorofórmio, seguido de extração com metanol, sendo a fração clorofórmica

submetida à cromatografia líquida em coluna e a fração metanólica submetida a uma

cromatografia de gel de filtração. Ao final do estudo, foram isolados da casca do

caule ácido betulínico, ácido oleanóico e uma saponina que forneceu lactona ebilin

quando submetida à hidrólise ácida (BARBOSA-FILHO; TRIGUEIRO;

BHATTACHARYYA, 1985). A lactona ebilin, segundo os autores, provavelmente é

um artefato derivado da hidrólise de um glicosídeo de jujubogenina, sendo o mesmo

evento detectado anteriormente por Higuchi et al. (1984).

Kato et al. (1997) isolaram e identificaram da casca do caule de Z. joazeiro

Mart. lupeol, ácido betúlinico, cafeína e estearato de glicerila. Dois anos após, em

um estudo feito na Suiça, foram isolados do extrato diclorometano da casca os

ácidos triterpênicos betulínico, ursólico e alfitólico, também presentes em Z. jujuba

(GUO ET al., 2011; PLASTINA et. al., 2012) assim como três novos ácidos

triterpênicos derivados do ácido betulínico: [ácido betulínico 7-β-O-(4-

hidroxibenzoiloxi); ácido betulínico 7-β-O-(4-hidroxi-3'-metoxibenzoiloxi) e ácido

betulínico 27-O-(4-hidroxi-3'-metoxibenzoiloxi) (SCHÜHLY et al., 1999). Em seguida,

os mesmos autores isolaram da casca 4 saponinas triterpênicas, sendo três nunca

antes reportadas na literatura (SCHÜHLY et al., 2000).

A primeira saponina, um jujubosídeo, já havia sido isolada por Higuchi et al.

(1984) e, dentre as isoladas, foi considerada a majoritária. Outra saponina isolada foi

denominada lotosideo A, a qual compartilha a mesma aglicona presente nas

saponinas lotosídeo I e II, isoladas da casca da raíz de Z. lotus (RENAULT et al.,

1997). As últimas saponinas possuem uma aglicona inédita e estruturalmente similar

a lotogenina, a qual foi intitulada joazeirogenina. Assim, essas novas saponinas

foram nomeadas joazeirosídeo A e joazeirosídeo B, diferindo apenas quanto ao

número e natureza dos açúcares ligados ao carbono 3.

Em 2010, Leal et al. realizaram um fracionamento do extrato etanólico da

casca do Z. joazeiro Mart. baseado na atividade antibacteriana,. Após a extração

com etanol, foram realizadas partições com solventes de polaridade crescente

38

(diclorometano, acetato de etila e butanol) gerando, respectivamente, 3 frações.

Dentre essas, apenas a fração diclorometano foi escolhida para análises posteriores

por apresentar a maior atividade antibacteriana. Após ser submetida a sucessivos

fracionamentos, foram isolados e identificados 5 compostos triterpênicos

provenientes da casca: metilbetulinato, ácido betulínico, ácido alfitólico, ácido

epigouanico A e metilceanotato, este último sendo o composto majoritário da fração

mais ativa (LEAL et al., 2010).

Os estudos anteriormente citados tinham como foco o isolamento,

identificação e/ou caracterização dos metabólitos da casca, no entanto, foram

publicados estudos fitoquímicos, neste caso de caráter preliminar, acerca de outras

partes da planta, como folhas e frutos. Foram realizadas análises em extratos

metanólicos obtidos a partir de amostras de caule e folha de plantas jovens e

adultas. Os extratos foram analisados por Cromatografia em Camada Delgada com

o emprego de diversas fases móveis e reveladores específicos. Como resultado, foi

observada a presença de saponinas, mono, sesquiterpenos e esteróides em todas

as partes vegetais. Apenas nas folhas foram detectados flavonoides, enquanto que

apenas no caule de plantas adultas foram detectados derivados do ácido cinâmico e

cumarinas (SILVA, 2008). Outra análise fitoquímica preliminar avaliou a composição

de extratos etanólicos da casca do caule, folhas e frutos. A casca do caule

apresentou saponinas, triterpenos, esteróides; as folhas apresentaram alcalóides,

saponinas, triterpenos, esteróides e taninos (MELO et al., 2012).

Em 2015, foi publicado um trabalho que envolveu a análise fitoquímica

preliminar do extrato hidroetanólico, assim como a avaliação da presença de

compostos fenólicos por CLAE. Na prospecção fitoquímica, foi detectada a presença

de ácidos fenólicos, flavonoides, taninos e saponinas. Através da análise por CLAE,

foram identificados 11 compostos fenólicos no extrato hidroalcoólico das folhas,

constituindo um relato inédito para as folhas da espécie. Desses 11 compostos, 4

são ácidos fenólicos (ácido gálico, ácido clorogênico, ácido cafeico, ácido elágico) e

7 são flavonoides (catequina, epicatequina, quercetina, isoquercitrina, quercitrina,

rutina e canferol). Os polifenóis presentes no extrato foram identificados ao se

comparar o seu tempo de retenção e espectro no UV com os de padrões comerciais.

No entanto, não foi realizada uma co-eluição dos padrões com o extrato nem uma

análise posterior por técnicas espectroscópicas. Logo, a presença desses

39

compostos fenólicos nas folhas é de caráter sugestivo, não confirmatório (BRITO et

al., 2015).

Com base no que foi exposto acerca dos constituintes químicos, pode-se

concluir, no geral, que a casca possui triterpenoides e heterosídeos triterpênicos, as

saponinas. As folhas possuem triterpenos, saponinas, alcaloides, taninos e

compostos fenólicos, principalmente os flavonoides.

2.6 Atividades biológicas descritas para a espécie Ziziphus joazeiro Martius

2.6.1 Atividade antifúngica

Cruz et al. (2007) observaram que o infuso (1mg/mL) da entrecasca de Z.

joazeiro apresentou atividade antifúngica contra Candida albicans, C. guilliermondii,

Cryptococcus neoformans, Trichophyton rubrume Fonsecaea pedrosoi. Foram

observados valores de CIM entre 6,25 µg/mL e 400 µg/mL. Em outro estudo, as

saponinas extraídas da casca apresentaram atividade contra C. albicans (156

µg/mL) e Aspergillus niger (312.5 µg/mL) pelo método de microdiluição em caldo

(RIBEIRO et al., 2013). O extrato etanólico (SILVA et al, 2011) e o extrato

hidroalcoólico da casca (MELO et al., 2012) também apresentaram atividade frente

a C. albicans pelo método de difusão em ágar.

As folhas foram avaliadas num estudo recente acerca da sua atividade

antifúngica. A CIM do extrato hidroetanólico das folhas foi determinada pelo método

de microdiluição em caldo, frente a cepas clínicas de Candida krusei, Candida

tropicalis e Candida albicans, além de cepas multirrestitentes de C. krusei, C.

tropicalis e C. albicans. Nesse estudo, a CIM foi ≥ 1024 µg/mL, indicando, segundo

os autores, ausência de atividade antifúngica para as folhas (BRITO et al., 2015).

2.6.2. Atividade antibacteriana

Em estudos que realizaram uma triagem da atividade antibacteriana, extratos

etanólicos, hidroalcoólicos e hexânicos de diferentes partes do joazeiro (folhas,

casca, frutos) apresentaram variada atividade frente a isolados clínicos e cepas de

referência de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Em geral, os extratos

40

etanólicos foram os mais ativos, assim como os da casca. (LIMA, 2008; SILVA et al.,

2011; MELO et al., 2012).

Contrariamente aos estudos mencionados, um extrato da casca da planta,

rico em saponinas, não apresentou efeito inibitório, em concentração igual ou inferior

a 12,5 mg/mL, frente às seguintes cepas: Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027,

Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538 e Bacillus

subtilis ATCC 6633 (RIBEIRO et al., 2013).

Por outro lado, em estudos fitoquímicos biomonitorados, compostos

triterpênicos isolados de extratos metanólicos da casca apresentaram atividade

frente a bactérias Gram-positivas, com CIM entre 8 e 128 µg/mL (SCHÜHLY et al.,

1999, LEAL et al., 2009).

Foi realizado um estudo sobre a atividade antibacteriana de dentifrícios pelo

método de difusão em ágar. O dentifrício da empresa Unilever (Gessy Cristal®),

contendo extrato da casca do joazeiro em sua composição, apresentou atividade

frente a bactérias causadores de cárie (BARRETO et al., 2005).

Em um estudo etnobotânico sobre plantas utilizadas em doenças bucais, a

atividade antibacteriana do extrato etanólico (maceração) e do extrato aquoso

(decocção) da casca do juá foi avalidada frente a bactérias associadas a doenças

bucais. O extrato etanólico foi ativo contra todas as cepas enquanto que o decocto

não apresentou efeito inibitório contra a maioria (CAVALCANTE, 2010). Um extrato

aquoso (infuso) da casca interna de Z. joazeiro Mart. também apresentou atividade

antimicrobiana contra bactérias relacionadas à doenças bucais, com valores de CIM

variando de 1mg/mL a 16 mg/mL (ALVIANO et al., 2007).

Recentemente, o EHF das folhas foi avaliado pelo método de microdiluição

em caldo para a determinação da CIM. O extrato foi testado frente às cepas de

Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 e Enterobacter

aerogenes, assim como frente a cepas multirresistentes de S. aureus, E. coli e E.

aerogenes. Além da CIM, foi avaliado o sinergismo do extrato quando associado a

diferentes antimicrobianos, como amoxicilina, penicilina G, gentamicina, amicacina e

vancomicina. Nesse estudo, a CIM foi ≥ 1024 µg/mL, indicando, segundo os autores,

ausência de atividade antibacteriana para as folhas. Porém, foi observada uma

redução da CIM dos antimicrobianos amicacina e gentamicina, quando associados

ao extrato hidroetanólico das folhas (BRITO et al., 2015).

41

2.6.3 Atividade larvicida

Ao analisar as atividades dos extratos aquoso (15%, p/v) hidroalcoólico (50%,

p/v) e etanólico das folhas de Z. joazeiro Mart. contra a larva do Culex

quinquefasciatus, verificou-se que os extratos hidroalcoólico e etanólico

apresentaram resultados significativos contra o estágio larval L3 (26% e 28% de

mortalidade, respectivamente), ao contrário do extrato aquoso que não apresentou

resultados satisfatórios (LIMA, 2008).

2.6.4 Atividade antioxidante

Em um estudo, avaliou-se a atividade antioxidante da fração butanol, obtida

do extrato metanólico da casca, e de uma fração enriquecida em saponinas, obtida a

partir da lavagem da fração butanol com NaOH 1%. A atividade antioxidante foi

avaliada pela capacidade dos extratos em capturar o radical livre DPPH (2,2-difenil-

2-picrilhidrazila). A fração enriquecida em saponinas apresentou CE50 (quantidade

de amostra necessária para diminuir em 50% a absorbância do DPPH) maior que

10.000 µg/mL. A fração butanol, composta de saponinas e compostos fenólicos,

apresentou CE50 de 668 µg/mL (RIBEIRO et al., 2013). Alviano et al. (2007)

avaliaram o potencial do extrato aquoso da entrecasca do Z. joazeiro Mart. para

capturar radicais livres pelo método do DPPH. O extrato apresentou CE50 de 821,4

± 35,3 µg/mL. Em outro estudo, que empregou o mesmo método do DPPH, o extrato

etanólico das folhas e cascas de Z. joazeiro Mart. apresentaram valores de CE50

iguais a 461,88 e 1743,05 µg/mL, respectivamente (SILVA et al, 2011).

2.6.5 Avaliação toxicológica

Alviano et al. (2007) avaliaram a toxicidade aguda, por meio de doses

crescentes em camundongos (via oral), do extrato aquoso da parte interna da casca

de Z. joazeiro Mart.. Os resultados não demonstraram qualquer alteração

comportamental e nenhum efeito letal sobre os camundongos com as doses

testadas (1-5 g/Kg). Desta forma, o referido estudo indicou que o extrato apresentou

baixa toxicidade.

42

Por outro lado, em outro estudo toxicológico não-clínico da casca do juazeiro

feito em camundongos, observou-se que estes apresentaram alterações

metabólicas, bioquímicas, hematológicas e histopatológicas após ensaios de

toxicidade aguda e crônica. No ensaio toxicológico agudo, foi administrada, por via

oral, uma dose de 2000 mg/Kg do extrato etanólico da casca. Após 14 dias, foi

observado que as fêmeas passaram a ingerir mais ração e que apresentaram

leucopenia e neutropenia. Os machos apresentaram redução na ingestão de água,

níveis séricos de uréia diminuídos e os de creatinina aumentados. No estudo

crônico, administrou-se as doses de 7 mg/Kg , 35 mg/Kg e 175 mg/Kg aos

camundongos por 90 dias. Ao final do teste e alguns dias após, pôde-se observar

que ocorreram alterações hematológicas em ambos os sexos (leucopenia,

neutropenia, monocitose), mudanças na ingestão de água e ração, elevação da

creatinina sérica em machos e fêmeas, diminuição da uréia em machos, além de

alterações renais, hepáticas e pulmonares após a análise histopatológica. Dessa

forma, são necessários mais estudos clínicos acerca da toxicidade da espécie Z.

joazeiro Mart., a fim de esclarecer a segurança de preparações desta planta

(ESTEVAM, 2008). É importante destacar que para as folhas não há até o momento

estudos que avaliem a sua toxicidade em modelos animais.

2.6.6 Avaliação do potencial genotóxico

Resende et al. (2008) avaliaram a mutagenicidade de extratos hidroalcoólico

(tratamentos de 500, 1000, 1500 e 2000 mg/Kg) das cascas e folhas da espécie Z.

joazeiro Mart., por meio do teste do micronúcleo em medula óssea in vivo. Controles

negativo (NaCl 0,9%) e positivo (50 mg/Kg de N-Nitroso-N-etilureia) foram utilizados.

O resultado deste ensaio sugeriu ausência de potencial clastogênico e/ou

aneugênico do extrato de Z. joazeiro Mart. testado.

2.6.7 Atividade anti-inflamatória do gênero Ziziphus e da espécie Ziziphus joazeiro

Mart.

Até o momento, foi reportado apenas um estudo acerca da avaliação da

atividade anti-inflamatória de Ziziphus joazeiro Mart., porém o foco desse trabalho foi

a casca. Nesse estudo, o extrato etanólico da casca apresentou atividade anti-

43

inflamatória nos modelos de edema de pata e peritonite induzidos por carragenina

(ESTEVAM, 2012).

Para uma espécie do mesmo gênero, Zizyphus lotus, foi relatado que as

frações ricas em flavonoides, provenientes das folhas, e ricas em saponinas,

provenientes das folhas e casca, apresentaram atividade anti-inflamatória

significativa no modelo de edema de pata e inibição da produção de óxido nítrico em

macrófagos (BORGI; et al., 2008). Em outro estudo, os extratos de diclorometano e

acetato de etila das folhas e casca de Ziziphus spina Cristi foram capazes de inibir a

atividade enzimática das enzimas COX-1 e COX-2 (ELDEEN; STADEN, 2008).

2.7 Marcadores químicos e controle de qualidade de plantas medicinais

O uso de plantas medicinais, ao contrário da opinião popular, pode causar

danos à saúde, principalmente quando exercido de forma irracional. No Brasil, as

plantas comumente são utilizadas sem que existam evidências científicas da sua

eficácia e segurança, o que pode comprometer o tratamento ou causar reações

adversas (LANINI et al., 2009).

Outro problema é a qualidade da droga vegetal e de seus derivados

comercializados, que podem estar contaminados, adulterados, apresentarem falsa

autenticidade ou conter quantidade insuficiente de substâncias ativas para promover

um efeito terapêutico (ZHANG et al., 2012). Portanto, além de testes farmacológicos

e toxicológicos não-clinicos e clinicos, devem ser realizados ensaios de controle de

qualidade para garantir a constância da segurança e eficácia do produto.

Uma das estratégias utilizadas no controle de qualidade de plantas medicinais

e fitoterápicos é o emprego de marcadores químicos, que podem ser substâncias

relacionadas diretamente ou não ao efeito terapêutico. Por exemplo, um marcador

pode ser uma molécula com atividade farmacológica ou uma substância majoritária

da planta. A sua quantificação apresenta várias aplicações, tanto para fins de

fiscalização quanto para a padronização e monitoramento da qualidade de

fitoterápicos durante a sua produção (LI et al., 2008).

A qualidade dos produtos à base de plantas medicinais comercializadas no

Brasil é cada vez mais preocupante. Pesquisas realizadas em diferentes regiões do

país constataram diversas irregularidades, que podem comprometer a eficácia do

produto e pôr em risco a saúde do consumidor. Estas irregularidades envolvem a

44

presença de resíduos de pesticidas, elevado teor de impurezas e de umidade,

ausência ou baixa concentração dos constituintes ativos, adulterações, além de

informações inadequadas na embalagem do produto (ZUIN; YARIWAKE; BICCHI,

2004; BARA et al., 2006; MELO et al., 2007; DIAS et al., 2013).

Em resposta a esse problema, existe a resolução RDC 26/2014, de 13 de

maio de 2014, que dispõe sobre os requisitos mínimos para o registro de

medicamentos fitoterápicos e de produtos tradicionais fitoterápicos, além da

resolução RDC 17/2010, que trata das Boas Práticas de Fabricação de

Medicamentos. Segundo estas resoluções, os medicamentos fitoterápicos são

caracterizados pelo conhecimento da sua eficácia e segurança, assim como pela

constância da sua qualidade.

A determinação do perfil cromatográfico, prospecção fitoquímica e análise

quantitativa do(s) marcador(es) estão entre os testes exigidos pela RDC 26/2014

para o registro de fitoterápicos, os quais devem ser apresentados em laudos de

análises da matéria-prima vegetal e do produto acabado. Estes testes também são

necessários ao cumprimento das boas práticas de fabricação de medicamentos

fitoterápicos, como consta na RDC 17/2010 (BRASIL, 2010).

Segundo a RDC 26/2014, marcador é um composto ou classe de compostos

químicos presentes na matéria-prima vegetal que é utilizado como referência no

controle da qualidade da matéria-prima vegetal e do medicamento fitoterápico,

possuindo preferencialmente relação com o efeito terapêutico (BRASIL, 2014).

Durante o processo de fabricação, os marcadores químicos podem ser utilizados

como padrões de referência no controle de qualidade da matéria-prima vegetal e do

produto acabado, podendo ser escolhidos com base em estudos que o tenham

caracterizado, nos casos de ausência na Farmacopeia Brasileira, ou em outro

código reconhecido pela Anvisa (BRASIL, 2010). Baseado nisso, a escolha e

determinação de marcadores químicos para a espécie Ziziphus joazeiro Mart.

mostra-se muito importante para auxiliar no controle de qualidade da droga vegetal e

de seus derivados.

45

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Caracterização dos marcadores químicos e a avaliação das atividades anti-

Candida in vitro e protetora em modelo de colite experimental in vivo a partir do

extrato hidroetanólico das folhas de Ziziphus joazeiro Martius.

3.2 Objetivos específicos

• Identificar as principais classes de metabólitos secundários presentes no

extrato das folhas de Z. joazeiro Mart. e candidatos a marcadores químicos,

utilizando reações químicas clássicas, cromatografia em camada delgada e

cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de

fotodiodos;

• Isolar e caracterizar por técnicas espectroscópicas possíveis marcadores

químicos da espécie Z. joazeiro Mart.;

• Avaliar a atividade antifúngica do extrato, frações, e/ou substâncias isoladas

mais ativas por meio do ensaio de bioautografia e da determinação da

concentração inibitória mínima e fungicida mínima em microdiluição em caldo,

frente a cepas de Candida;

• Isolar e caracterizar os compostos responsáveis pela atividade antifúngica;

• Avaliar o potencial protetor do extrato das folhas de Z. joazeiro Mart. sobre a

colite experimental utilizando parâmetros clínicos murinométricos;

• Determinar o efeito do extrato das folhas de Z. joazeiro Mart. sobre a

concentração de marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo em tecido

colônico.

46

4 JUSTIFICATIVA

Embora a espécie Z. joazeiro Mart. seja amplamente utilizada pela população

da região Nordeste do país, pode-se observar que há uma escassez de estudos

químicos com a espécie. Com base nos estudos relatados na literatura, sabe-se que

as saponinas e triterpenos têm atividades interessantes e que apresentam um altor

teor nas cascas de Z. joazeiro Mart., amplamente utilizadas para o preparo de

produtos de higiene como shampoo e pasta dental (BARRETO et al., 2005).

Entretanto, visto que as folhas da espécie também são utilizadas medicinalmente,

não foram encontrados estudos na literatura que envolvam o isolamento e

caracterização de substâncias que venham a ser marcadores químicos, o que

justifica a proposta deste estudo.

Ainda, pode-se destacar que a utilização das folhas como matéria-prima é

mais interessante do ponto de vista ecológico, tendo em vista que dependendo da

forma como é retirada a casca de algumas plantas, pode ocasionar a morte do

vegetal. Ademais, as folhas geralmente são consideradas um subproduto das

indústrias.

A presente proposta vai ao encontro da RDC nº 26, de 13 de maio de 2014,

que dispõe sobre os requisitos mínimos para o registro de medicamentos

fitoterápicos e de produtos tradicionais fitoterápicos, em que faz-se necessário

caracterizar um marcador, que pode ser ou não a substância ativa, para que em

todas as fases da produção e desenvolvimento de um medicamento fitoterápico

mantenha-se constante o teor desse metabólito.

Com relação ao potencial antifúngico, alguns estudos foram relatados para a

espécie (BRITO et al., 2014; CRUZ et al., 2007; MELO et al., 2012; RIBEIRO et al.,

2013), mas nenhum desses apresentou uma investigação mais aprofundada da

atividade antifúngica, tampouco a caracterização dos componentes responsáveis por

essa atividade.

No que se refere à atividade anti-inflamatória, até o momento não há na

literatura estudos que tenham avaliado o potencial anti-inflamatório da espécie em

modelos de doença inflamatória intestinal.

Dentro deste contexto, a proposta principal deste trabalho é isolar e

caracterizar marcadores químicos do extrato de Z. joazeiro Martius, além da avaliar

a atividade antifúngica por meio de um fracionamento biomonitorado, em

47

colaboração com o Prof. Dr. Guilherme Maranhão Chaves (UFRN), e a atividade

protetora em modelo de colite experimental, em colaboração com a Profa. Dra.

Gerlane Coelho Bernado Guerra (UFRN).

48

5 MATERIAL E MÉTODOS

5.1 Solventes e reagentes

Os solventes e reagentes utilizados para a realização da análise fitoquímica e

avaliação da atividade antifúngica foram de origem diversa, incluindo Merk®, Vetec®,

Chemis®, Neon®, Synth®, Dinâmica®, Alphatec® e Panreac®. Foram utilizados os

solventes acetato de etila, acetona, acetonitrila, água destilada, água ultrapura,

clorofórmio, diclorometano, dimetilsulfóxido, etanol, éter de petróleo, hexano,

metanol, n-butanol e tolueno; os ácidos e bases incluíram ácido sulfúrico, ácido

acético, ácido fórmico, hidróxido de amônio e amônia. Os solventes utilizados foram

de grau analítico, exceto os usados para as análises por cromatografia líquida de

alta eficiência (CLAE), os quais foram de grau espectroscópico.

A água utilizada nos experimentos, incluindo o preparo dos extratos, foi

destilada e o etanol foi de procedência variada.

Os reagentes utilizados para a detecção de classes de metabólitos

secundários foram: Bertrand (ácido sílico-túngstico), Dragendorff

(tetraiodobismutato de potássio) e Mayer (tetraiodomercurato de potássio) para

alcaloides; cloreto férrico para compostos fenólicos; difenilboriloxietilamina e

magnésio em pó para flavonoides, KOH 5% (p/v) para a detecção de cumarinas e

antraquinonas; vanilina sulfúrica para a detecção universal.

5.2 Equipamentos e sistemas cromatográficos utilizados no estudo fitoquímico

Os procedimentos cromatográficos envolveram cromatografia em camada

delgada analítica (CCD), em coluna de vidro (CC), líquida de alta eficiência analítica

(CLAE), líquida de alta eficiência semipreparativa (CLAESP) e em contra-corrente de

alta velocidade (CCCAV).

As cromatografias em camada delgada analítica foram realizadas em

cromatoplacas de alumínio (20x20 cm) cobertas com gel de sílica 60 F254, com

tamanho de partícula de 5-17 µm (Macherey-Nagel). A detecção foi realizada

mediante visualização sob luz visível e lâmpada de luz ultravioleta com

comprimentos de onda de 254 nm e 365 nm, seguida de visualização sob luz visível

após reação química com os agentes cromogênicos vanilina sulfúrica, Reagente

49

Natural A (1% p/v), Reagente de Bornträger (KOH 5%, p/v) e Dragendorff. As

cromatoplacas reveladas com Reagente Natural A e Reagente de Bornträger foram

novamente visualizadas sob luz ultravioleta a 365 nm para a detecção de

fluorescência originada por compostos fenólicos.

As cromatografias em coluna de vidro foram realizadas em sílica de fase

reversa – C18 - com tamanho de partícula de 40-63 µm (Merck Lichroprep®, Merck)

e 100 µm (Chromabond®, Macherey Nagel).

A cromatografia líquida de alta eficiência analítica foi realizada em dois

equipamentos. O primeiro, um aparelho Agilent® 1260 Infinity Quaternary LC

System, equipado com uma coluna Luna Phenomenex® (250 x 4,0 mm, 5 µm),

detector de arranjo de diodos (DAD) bomba quaternária, auto-injetor e

desgaseificador. O segundo aparelho, utilizado para a análise das substâncias

isoladas, era um cromatógrafo Merck-Hitach® equipado com um detector de DAD,

bomba quaternária e autoinjetor.

As análises por CLAE semipraparativa foram realizadas numa coluna

Thermo® Hypersil GOLD Cyano (250x10 mm, 5 μm), utilizando um equipamento

Merck-Hitach® equipado com um detector DAD, bomba quaternária e autoinjetor.

Para o fracionamento por CCCAV, foi utilizado um Cromatógrafo em

Contracorrente de Alta Velocidade da P.C.Inc.®, equipado com uma coluna em

espiral multicamada de 110 mL e equilibrada com contrapeso, loop de 7 mL, bomba

de alta pressão Merck-Hitachi® modelo L-6000 e um coletor de frações automático

Eldex®.

A análise por CLAE acoplado a espectrômetro de massa foi realizada na USP

de Ribeirão Preto, num aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada

a um espectrômetro de massas micro-TOF da Bruker® com interface por

eletronspray (IES) e analisador de massas do tipo Time-of-Flight (CLAE-IES-EM

{TOF}). O aparelho é de alta resolução, necessitando de calibração interna antes da

realização das análises, sendo efetuada com uma solução de NA-TFA a 10 mg/mL.

Uma parte das análises de RMN foram realizadas no Laboratorio de

Ressonancia Magnética Nuclear da Universidad Nacional de Colombia, em um

equipamento Bruker Avance 400, equipado com um espectrômetro, imã

supercondutor de 9,4 tesla, sonda BBI de banda larga 5 mm e unidade de controle

de temperatura BVT3200. As amostras foram dissolvidas em metanol-d4

previamente à realização das análises. As outras análises foram realizadas no

50

Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear da Universidade Federal da Paraíba,

num equipamento de 500 MHz da marca Varian, modelo NMR systems, operando a

500 MHz para análises de 1H e 125 MHz para análises de 13C.

5.3 Material vegetal: coleta, secagem e moagem

As folhas da espécie Ziziphus joazeiro Mart. foram coletadas no município

de Maxaranguape, estado do Rio Grande do Norte, nas coordenadas

latitude/longitude -5.484221 -35.311565 e altura de 22 metros em relação ao nível

do mar. A coleta foi realizada no período da tarde, nos meses de novembro de 2011

e maio de 2012. Uma amostra do material vegetal foi utilizada para fazer uma

exsicata, a qual foi depositada no herbário da UFRN sob o número 12253. A

autorização da coleta foi obtida no Sistema de Autorização e informação em

Biodiversidade (SISBIO), sob o número 35017. A autorização para acesso ao

patrimônio genético, via Plataforma Carlos Chagas/CNPq, foi concedida pelo

Conselho de Gestão do Patrimônio Genético (CGEN), do Ministério do Meio

Ambiente (MMA), sob o número 010142/2012-6.

Após a coleta, as folhas foram secas em estufa de ar circulante a uma

temperatura de 60 ºC, durante 72 horas. Em seguida, o material vegetal seco foi

moído em um aparelho liquidificador, originando 3,136 kg de folhas trituradas.

5.4 Preparação dos extratos

O extrato hidroetanólico das folhas (EHF) foi preparado utilizando o método

maceração, na qual o material vegetal, na proporção 1:15 p/v (droga

vegetal:solvente), foi mantido em contato com etanol: H2O (70: 30, v/v) durante sete

dias. Após esse período, o extrato foi filtrado à vácuo e seu volume reduzido em

evaporador rotatório Buchi® R-3, a uma temperatura de 40 ºC, até a remoção total

do etanol, restando apenas uma suspensão do extrato em água. Para os

experimentos com Cromatografia em Contra-Corrente de Alta Valocidade, o extrato

proveniente da maceração de 950 g de folhas, após a remoção do etanol, foi

utilizado diretamente numa partição líquido-líquido com solventes orgânicos de

polaridade crescente. Para os ensaios biológicos e análises por CCD, CLAE-UV-

DAD e CLAE acoplado a espectrômetro de massas, o extrato reduzido à forma

51

aquosa, proveniente da maceração de 150 g de material vegetal, teve seu volume

reduzido em evaporador rotatório, a 40 ºC, até tornar-se completamente seco

(23,5556 g). Uma porção desse extrato, na forma aquosa, foi reservada para a

realização da triagem fitoquímica clássica.

5.5 Estudo fitoquímico

5.5.1 Análise fitoquímica preliminar

5.5.1.1 Identificação das classes de metabólitos secundários por reações químicas

clássicas

5.5.1.1.1 Compostos fenólicos

A presença de compostos fenólicos foi avaliada por meio da reação com

cloreto férrico. Foram transferidos 2 mL do EHF para um tubo de ensaio, ao qual

foram adicionadas 2 gotas de solução etanólica de cloreto férrico a 2,5%. O

surgimento de coloração verde-escuro, violeta ou azul indica positividade da reação.

5.5.1.1.2 Taninos

Foram transferidos 2 mL do EHF das folhas de Z. joazeiro Mart. para um

tubo de ensaio, em seguida, foram adicionadas algumas gotas de solução

aquosa de gelatina a 2,5 %. O desenvolvimento de precipitado indica positividade

da reação.

5.5.1.1.3 Flavonoides

Foram transferidos 2 mL do EHF das folhas de Z. joazeiro Mart. para

uma cápsula de porcelana, levando-a ao aquecimento em banho-maria (50 °C)

até a obtenção da amostra seca. Aguardou-se o resfriamento da cápsula e, em

seguida, foi adicionado à amostra 0,2 mL de clorofórmio para a remoção da clorofila.

O resíduo contendo clorofila foi desprezado. O resíduo restante na cápsula foi

dissolvido com 1 mL de etanol 70 % v/v e, posteriormente, transferido para um tubo

52

de ensaio. Verteu-se pelas paredes do tubo de ensaio 1 mL de HCl concentrado,

adicionando-se uma pequena quantidade de magnésio em pó. O

desenvolvimento de coloração amarelo-avermelhada indica a positividade da

reação.

5.5.1.1.4 Alcaloides

Em uma placa de vidro foram adicionados, separadamente, do lado esquerdo,

duas gostas dos seguintes reagentes: Dragendorff, Mayer, Wagner e Bertrand. Do

lado direito da placa, ao lado de cada reagente, foram adicionadas 2 gotas do EHF

das folhas de Z. joazeiro Mart.. Em seguida, com auxilio de um capilar, fez-se a

mistura de cada reagente com o seu extrato correspondente. A formação de

precipitado indica a positividade da reação.

5.5.1.1.5 Saponinas

Para um tubo de ensaio grande, foram transferidos 2 mL do EHF e,

posteriormente, foram adicionados 4 mL de água destilada. Logo após, o tubo foi

agitado vigorosamente por 1 minuto. O tubo foi deixado em repouso e observou-se a

presença ou não de espuma abundante e persistente, que indica positividade da

reação.

5.5.1.2 Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. por Cromatografia em Camada Delgada

(CCD)

O EHF foi analisado por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

utilizando cromatoplacas de alumínio com gel de sílica F254 (Macherey-Nagel®). A

fase móvel utilizada foi acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água

(100:14:6:10,v/v/v/v), para a observação de moléculas glicosiladas, e tolueno:acetato

de etila:ácido fórmico (50:50:5, v/v/v) para a obsevação de agliconas. Após a eluição

em cuba cromatográfica, as placas foram secadas e visualizadas sob luz visível e

sob luz UV a 365 nm para uma inspeção inicial. Posteriormente, foram reveladas

com os agentes cromogênicos vanilina sulfúrica, Reagente Natural A

(difenilborietoxietilamina 2 % p/v em metanol), Reagente de Bornträger (KOH 5% p/v

53

em etanol) e Dragendorff, sendo reservada uma placa para cada reagente. As

cromatoplacas reveladas com Reagente Natural A e Reagente de Bornträger foram

novamente visualizadas sob luz ultravioleta a 365 nm para a observação de

fluorescência.

Foram utilizados os padrões de ácido elágico, ácido gálico, ácido tânico,

apigenina, canferol, crisina, diosmina, isoorientina, isoquercetina, isovitexina,

luteonina, morina, narigenina, quercetina, rutina, vicenina-2 e vitexina (Sigma-

Aldrich®, pureza ≥ 95%).

Com o objetivo de obter uma maior evidência acerca da presença dos

flavonoides suspeitos de ocorrerem no EHF das folhas de Z. joazeiro Mart., após a

análise inicial por CCD, foi realizada a análise por co-CCD do extrato com os

padrões de quercetina, canferol, isoquercetina e rutina (Sigma-Aldrich®, pureza ≥

95%) em cromatoplacas com sílica gel F254. Para a observação das agliconas

flavonoídicas, utilizou-se a fase móvel tolueno:acetato de etila:ácido fórmico (50:50:5

v/v/v/v). A fase móvel acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:16:6:15,

v/v/v/v) foi utilizada para a observação dos flavonoides glicosilados.

5.5.2 Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações da partição líquido-líquido por

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

Para as análises por CLAE-UV-DAD, o extrato hidroetanólico seco das folhas,

assim como as frações da partição líquido-líquido, foram dissolvidos em

metanol:água (1:1 v/v) numa concentração de 5 mg/mL e filtrados em membrana

PVDF de 0,45 µm. Todos os solventes utilizados na análise por CLAE foram

previamente filtrados em membrana de 0,45 µm e desgaseificados.

O perfil cromatográfico foi determinado em um aparelho Agilent® 1260 Infinity

Quaternary LC System, equipado com uma coluna Luna Phenomenex® (250 x 4,0

mm, 5 µm), detector de arranjo de diodos (DAD) bomba quaternária, auto-injetor e

desgaseificador. Para a análise, foi desenvolvido um método que consistiu num

gradiente de fase móvel composta por ácido acético 0,3% (solvente A) e acetonitrila

(solvente B), iniciando-se numa proporção de 90:10 (v/v) e variando até 68:32 (v/v)

em 55 minutos, com um fluxo de 1 mL/min, volume de injeção de 10 µl,

monitorização nos comprimentos de onda de 210, 254, 280 e 345 nm e aquisição

espectral na faixa de 210 a 450 nm.

54

5.5.3 Análise da fração AcOEt-PLL01 por espectrometria de massas

A análise foi realizada no aparelho de CLAE-IES-EM {TOF}, em colaboração

com o professor Norberto Peporine Lopes, da USP de Ribeirão Preto. As condições

utilizadas foram as seguintes:

Prato final: 500 Volts;

Voltagem do capilar: 3500 Volts;

Voltagem da saída do capilar: 120 Volts;

Skimmer 1: 40 Volts;

Skimmer 2: 22 Volts;

Transferência: 59µs;

Tipo de gás utilizado: gás nitrogênio;

Temperatura do gás seco: 220 Cº;

Fluxo do gás seco:10 l/min;

Pressão do gás de nebulização: 5,5 Bar;

Faixa de escaneamento: 0-1000 m/z

O método desenvolvido para a análise do extrato e frações foi utilizado para a

análise por CLAE-IES-EM (TOF). A identificação das substâncias foi realizada por

meio da comparação dos dados obtidos com os presentes na base de dados

MassBank, bem como com base no espectro no ultravioleta e tempo de retenção

obtidos para os picos observados.

5.5.3 Fracionamento do EHF de Z. joazeiro Mart.

O fracionamento foi inicialmente realizado por uma partição líquido-líquido

com solventes imiscíveis e de polaridade crescente, seguida de separação por

técnicas cromatográficas envolvendo diferentes suportes, fases estacionárias e

fases móveis. No quadro a seguir, seguem os códigos dos processos de separação,

numerados conforme a ordem de realização, pois foram executados repetidamente.

55

Quadro 3 - Códigos dos processos de separação utilizados

Processo Código

Partição líquido-líquido PLL

Cromatografia em contra corrente de alta velocidade CCCAV

Cromatografia em coluna de fase reversa CCFR

Cromatografia em coluna de gel de filtração CGF

CLAE semipreparativa CLAESP

5.5.3.1 Partição líquido-líquido

Após ser submetido à redução de volume em evaporador rotatório, o extrato

foi particionado com solventes imiscíveis e de polaridade crescente (éter de petróleo,

diclorometano, acetato de etila e n-butanol). O extrato (4000 mL) foi adicionado num

funil de separação e logo em seguida o solvente, na proporção 5:3 (extrato:solvente,

v/v). Foram realizadas 8 partições, cada uma partindo de 500 mL de extrato para

300 mL de solvente orgânico (3x 300 mL). Ao final, resultaram as frações éter de

petróleo (EP-PLL01), diclorometano (CH2Cl2-PLL01), acetato de etila (AcOEt-

PLL01), n-butanol (BuOH-PLL01) e residual aquosa (RA-PLL01). O rendimento das

frações encontra-se na Tabela 1, e o processo está esquematizado no Fluxograma

1.

Tabela 1 - Redimento das frações obtidas após a partição líquido-líquido do EHF de

Ziziphus joazeiro Martius.

Frações Rendimento (g) Rendimento (%)*

EP-PLL01 0,0979 0,01

CHCl2-PLL01 1,9239 0,20

AcOEt-PLL01 3,3658 0,35

BuOH-PLL01 40,0265 4,21 * Valor relativo a 950 g de folhas

56

Fluxograma 1 - Fracionamento do EHF por partição líquido:líquido com solventes de

polaridade crescente.

5.5.3.2 Análise por cromatografia em contracorrente de alta velocidade

Em virtude da dificuldade em se obter compostos isolados e em quantidade

suficiente para a realização de testes biológicos, desenvolvimento e validação de um

método analítico por CLAE, iniciou-se um estágio no laboratório de Productos

Naturales Marinos e Frutos de Colombia, no Departamento de Química da

Universidad Nacional de Colombia (Bogotá, Colômbia), sob orientação do professor

Extrato reduzido

Resíduo

EP-PLL01

CH2Cl2-PLL01

Resíduo

AcOEt-PLL01

Resíduo

BuOH-PLL01

Resíduo Aquoso

(RA-PLL01)

Extração com

éter de petróleo

Extração com

diclorometano

Extração com

acetato de etila

Extração com

n-butanol

PLL: partição líquido-líquido

Proporção 5:3 (v/v) extrato:solvente

57

Freddy Alejandro Ramos. As seções a seguir referem-se aos experimentos

realizados nesse laboratório, que envolveram o fracionamento e isolamento de

substâncias da fração BuOH-PLL01 e AcOEt-PLL01 por Cromatografia em Contra-

Corrente de Alta Velocidade (CCCAV), colunas cromatográficas em fase reversa e

CLAE em modo semipreparativo.

5.5.3.2.1 Fracionamento das frações BuOH-PLL01 e AcOEt-PLL01 por

cromatografia em contra-corrente de alta velocidade

Primeiramente, os sistemas de solventes utilizados para o fracionamento por

CCCAV foram selecionados através de testes de partição líquido-líquido em tubos

de ensaio, seguido de análise por CCD. Posteriormente, os sistemas aparentemente

mais promissores foram selecionados mediante teste empírico direto no

equipamento de CCCAV.

Para cada teste em tubo de ensaio, o sistema de duas fases foi preparado

pela adição direta dos seus componentes, seguido da agitação vigorosa do tubo por

30 segundos. Após o equilíbrio das fases, foram adicionados cerca de 5 mg da

fração BuOH-PLL01, e posteriormente o tubo foi novamente agitado por 10

segundos. Após o alcance do equilíbrio, as fases foram coletadas separadamente e

analisadas por CCD, sendo aplicadas num mesmo número de vezes para evitar uma

interpretação errônea do resultado. Abaixo segue uma tabela descrevendo os

diversos sistemas de solventes testados (Tabela 2).

58

Tabela 2 - Sistemas de solventes testados e proporção (v/v) dos seus respectivos

componentes.

Sistema Solventes

AcOEt BuOH H2O

1 1 0,05 1 2 1 0,1 1 3 1 0,2 1 4 1 0,4 1 5 1 0,6 1 6 1 0,8 1 7 1 1 1

Hex AcOEt MeOH BuOH H2O

8 1 1 1

1

9 1 2 1

2

10 0,5 2 0,5

2

11 0,5 3 0,5

3

12 0,5 2

0,1 2


13 0,2 3 0,5

3

14 0,5 3 0,5

3

15 0,8 3 0,5

3

16 1 3 0,5

3

17 1,2 3 0,5

3

18 1,4 3 0,5

3

19 0,5 2

0,1 2

Hex AcOEt BuOH H2O

20 0,2 3 0,3 3 21 0,5 3 0,3 3 22 0,8 3 0,3 3 23 1 3 0,3 3 24 1,2 3 0,3 3

CHCl3 EtOH H2O

25 2 1 2 26 2 1,5 2

BuOH Hex H2O

27 2 2 4

CHCl3 MeOH H2O

28 4 4 2 29 4 2 2

Hex AcOEt MeOH H2O

30 0,5 3 0,5 2,5 31 0,5 3 1 2,5 32 0,5 3 1,5 2,5


33 0,5 3 1 0,5 2,5

34 0,5 3 1,5 0,5 2,5

AcOEt ACN H2O

35 1,5 0,5 2 36 1,5 1 2 37 1,5 1,5 2

Hex AcOEt BuOH H2O

38 0,1 3 0,6 3 39 0,2 3 0,6 3 40 0,4 3 0,6 3 41 0,6 3 0,6 3 42 0,8 3 0,6 3 *ACN: acetonitrila; AcOEt: acetato de etila; BuOH: butanol; CHCl3: clorofórmio; Hex:

hexano; H2O: água; MeOH: metanol.

59

Para a realização da separação por CCCAV, inicialmente o sistema de

solventes a ser utilizado foi preparado em um funil de separação, em que a fase

aquosa e a fase orgânica foram adicionadas e agitadas vigorosamente. Após

alcançarem o equilíbrio, foram coletadas em frascos separados para a utilização na

separação. Subsequentemente, a amostra foi pesada em balança analítica e

dissolvida em um determinado volume das fases aquosa e orgânica.

Após o preparo do sistema de solventes e da amostra, iniciou-se o

bombeamento da fase estacionária para o interior da coluna sob um fluxo de 9

mL/min, durante 20 minutos. Nas análises em que a fase estacionária era a

orgânica, o sentido de bombeamento na coluna foi centro-periferia; quando a fase

estacionária era a aquosa, o sentido de bombeamento na coluna foi periferia-centro.

Após a coluna estar totalmente preenchida com fase estacionária, iniciou-se a

rotação do sistema até 40% de sua capacidade, o que corresponde a cerca de 530

rpm. Com o sistema em rotação, a fase móvel foi bombeada para o interior da

coluna num fluxo de 1mL/min, e a amostra injetada apenas quando observava-se

que um equilíbrio de fases havia se estabelecido no interior da coluna, caracterizado

pela saída apenas da fase móvel. A retenção da fase estacionária foi estimada neste

momento, em que se subtraia o volume da coluna pelo volume de fase estacionária

estruída.

Os modos de separação utilizados consistiram em fase normal (fase

estacionária aquosa e fase móvel orgânica) e fase reversa (fase estacionária

orgânica e fase móvel aquosa). Além disso, a fase móvel foi eluída em 3

modalidades: isocrática (fase móvel constante), gradiente (mudança gradativa de

um dos componentes da fase móvel) e separação por refinamento por zona de pH

(gradiente de pH) contendo ácido fórmico e amônia, os quais foram adicionados as

respectivas fases antes do seu bombeamento para o interior da coluna.

Foram realizadas 11 separações por CCCAV, empregando diferentes modos

de eluição, com o objetivo de selecionar empiricamente as melhores condições

cromatográficas. A separação baseada em cromatografia de fase reversa associada

a refinamento por zona de pH (do inglês pH-zone refining) foi eleita a melhor

condição a ser utilizada. Os parâmetros da CCCAV utilizados em cada separação,

incluindo o pH da fase móvel, no caso de uma separação com refinamento por zona

de pH, estão descritos na tabela a seguir (Tabela 3).

60 Tabela 3 - Condições cromatográficas das separações realizadas por Cromatografia em Contra-Corrente de Alta Velocidade.

CCCAVNº

Sistema Modo Sentido Retenção

da FE Fluxo

Volume da fração

Amostra Quantidade

1 AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1 v/v/v Isocrático Centro-periferia 64 % 1

mL/min 3 mL

BuOH-PLL01

1 g dissolvidos em 5 mL de FA e 1 mL de FO

2 1. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0,8:3:0,1:3 v/v/v/v 2. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0,25:3:0,1:3 v/v/v/v 3. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0,025:3:0,3:3 v/v/v/v 4. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0:3:1,2:3 v/v/v/v

Gradiente Periferia-centro 81,82 % 1

mL/min 3 mL

BuOH-PLL01


3 1. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 1:3:0,1:3 v/v/v/v 2. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0,6:3:0,1:3 v/v/v/v 3. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0,3:3:0,1:3 v/v/v/v 4. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0,05:3:0,1:3 v/v/v/v 5. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0,025:3:0,2:3 v/v/v/v 6. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0:3:0,4:3 v/v/v/v 7. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0:3:0,8:3 v/v/v/v 8. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0:3:1,2:3 v/v/v/v 9. Hex:AcOEt:BuOH:H2O 0:3:1,8:3 v/v/v/v

Gradiente Periferia-centro 77,2 % 1,2

mL/min 3 mL

BuOH-PLL01


4 AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1 v/v/v Isocrático Centro-periferia 65 % 1,5

mL/min 4-9 mL

BuOH-PLL01

3 injeções: 0,6 g, 1 g e 1 g dissolvidos em 5 mL de FA e 1 mL de FO

5 AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1 v/v/v Isocrático Centro-periferia 65 % 1,5

mL/min 4-9 mL

BuOH-PLL01

2 injeções: 1 g e 1 g, dissolvidos em 5 mL de FE e 1 mL de FM

6 AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1 v/v/v

1. 280 mL de FE + 0,2 mL de ácido fórmico e FM ajustada ao pH 8 com amônia

2. FM ajustada ao pH 10 com amônia

Gradiente de pH

Centro-periferia 81 % 1,2

mL/min 2-9 mL

BuOH-PLL01

1 g em 6 mL de FA e 1 mL de FO


1. 280 mL FE + 17 mL de ácido fórmico e

Gradiente de pH

Centro-periferia 63,6 % 1,2

mL/min 2-9 mL

BuOH-PLL01


61

FA = fase aquosa; FO = fase orgânica; FE = fase estacionária; FM = fase móvel

FM ajustada ao pH 7 com amônia 2. FM ajustada ao pH 8 com amônia 3. FM ajustada ao pH 10 com amônia


1. 280 mL FE + 17 mL de ácido fórmico e

FM ajustada ao pH 3 com ácido fórmico 2. FM ajustada ao pH 8 com amônia 3. FM ajustada ao pH 10 com amônia

Gradiente de pH


mL/min 2-9 mL

BuOH-PLL01





Gradiente de pH


mL/min 2-9 mL

BuOH-PLL01





Gradiente de pH

Centro-periferia 54 % 1,2

mL/min 2-5 mL

39-48 CCC5

470 mg em 5 mL de FA e 2 mL de FO




Gradiente de pH


mL/min 3-7 mL

AcOEt-PLL01

1,5 g em 6 mL de FO e 1 mL de FA

62

5.5.3.3 Isolamento dos flavonoides por cromatografia em coluna e CLAE

semipreparativa

Com base em seu perfil por CCD, as frações obtidas a partir do

fracionamento por CCCAV11 foram reunidas e secas em evaporador rotatório

numa temperatura entre 30-40 ºC. As frações aparentemente mais purificadas

por CCD e de rendimento satisfatório foram submetidas à cromatografia em

coluna de fase reversa (CCFR) para posterior isolamento por CLAE

semipreparativa. Para fins didáticos, as frações obtidas por esses

procedimentos cromatográficos foram rotuladas com números após a sua

reunião.

A fração 12-CCCAV11 (127,1 mg) foi submetida a uma coluna

cromatográfica de fase reversa (Merck Lichroprep®, 40-63 µm) e eluída a um

fluxo de 1 mL/min com um gradiente de metanol e água, conforme descrito na

tabela abaixo:

Tabela 4 - Gradiente utilizado na separação da fração 12-CCCAV11 por coluna

de C18 (CCFR02).

Nº % H2O % MeOH Volume (mL)

1 80 20 80

2 50 50 50

3 30 70 80

4 0 100 50

A partir da fração 08-CCFR02 (29,1 mg) realizou-se um fracionamento

por CLAE semipreparativa no equipamento Merck-Hitachi®, equipado com

detector de UV-VIS, bomba manual e injetor manual com loop de 150 μl. A

coluna utilizada para a separação foi uma ciano Hypersil Gold Cyano (250x10

mm, 5 μm, ThermoScientific®) e a fase móvel composta por H2O:ACN (85:15,

v/v), eluída em modo isocrático a um fluxo de 1,8 mL/min. A amostra foi

dissolvida em 0,58 mL de H2O:MeOH (1:1, v/v), de modo a produzir uma

solução a 50 mg/mL, sendo injetada 5 vezes num volume correspondente a

100 μl. Ao final desse processo, foram obtidos um isolado (ZJF1) e 3 misturas

de flavonoides (frações 02, 03, e 04-CLAESP01)

63

A fração 02-CLAESP01 foi submetida ao mesmo processo com o

objetivo de obter mais 2 substâncias isoladas (ZJF2 e ZJF3). As condições

cromatográficas empregadas foram as mesmas, sendo utilizados 5,9 mg dessa

fração, que foi dissolvida em 0,3 mL de H2O:MeOH (1:1, v/v) e, em seguida,

injetada 3 vezes num volume correspondente a 100 μl.

Fluxograma 2 - Isolamento dos flavonoides ZJF1, ZJF2 e ZJF3.

Fração AcOEt-

PLL01 (1,5 g)

12-CCCAV11

(127,1 mg)

08-CCFR02

(29,1 mg)

01-CLAESP01

(ZJF1, 3,3 mg)

02-CLAESP01

5,9 mg

03-CLAESP01

(ZJFM1, 4,7 mg)

04-CLAESP01

(ZJFM2, 0,9 mg)

01-CLAESP02

(ZJF2, 1,5 mg)02-CLAESP02

(ZJF3, 1,4 mg)

CCCAV11Sistema solvente:

AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1 v/v/v

Fluxo: 1,2 ml/min

CCFR02FE: C18 (40-63 µm)

AC: 40 cm ; AFE: 21,5 cm ; D: 2,5 cm

FM: gradiente de MeOH:H O

Fluxo: 1 ml/min

CLAESP01FE: ciano (250x10 mm, 5 μm)

FM: H2O:ACN (85:15, v/v)

Fluxo: 1,8 ml/min;

Detecção: 280 nm

CLAESP02FE: ciano (250x10 mm, 5 μm)

FM: H2O:ACN (85:15, v/v)

Fluxo: 1,8 ml/min;

Detecção: 280 nm

Isolado

análises de RMN de 1H 1D e 2D


CCCAV: cromatografia em contra-corrente de alta velocidade

CCFR: cromatografia em coluna de fase reversa

CLAESP: cromatografia líquida de alta eficiência semipreparativa

Isolados

análises de RMN de 1H 1D e 2D

FE: fase estacionária

FM: fase móvel

AC: altura da coluna (cm)

AFE: altura da fase estacionária (cm)

D: diâmetro da coluna (cm)

64

5.5.3.4 Obtenção das frações para o teste de atividade antifúngica

Com base nos resultados da análise por CCD e bioautografia, objetivou-

se obter frações concentradas nas substâncias antifúngicas por meio de

técnicas cromatográficas. A fração 02-CCCAV07 (127,5 mg) foi dissolvida em

1,7 mL de metanol:água (23:77, v/v) e submetida a uma cromatografia de fase

reversa (CCFR05, Merck Lichroprep ®, 40-63 µm) com um fluxo de 0,8 mL/min

e um gradiente de metanol e água (20% - 100 % de MeOH). Foram obtidas 9

frações, sendo a fração 09-CCFR05 (13 mg) utilizada no ensaio de atividade

antifúngica. O processo de fracionamento está esquematizado no Fluxograma

3.


CCFR05, utilizada no teste de atividade antifúngica.

Fração BuOH-

PLL01 (1 g)

02-CCCAV07

(127,5 mg)

09-CCFR05

(13 mg)



Gradiente de pH

Fluxo: 1,2 ml/min

CCFR05FE: C18 (40-63 µm)

AC: 40 cm ; AFE: 21,5 cm ; D: 2,5 cm


Fluxo: 0,8 ml/min





FM: fase móvel




65

As frações 02,03 e 05-CCCAV09 foram reunidas (290,3 mg + 43,4 mg +

42,2 mg) e também utilizadas num fracionamento por cromatografia em coluna

de fase reversa, conforme exemplificado no Fluxograma 4 (CCFR07, Merck

Lichroprep ®, 40-63 µm). As frações foram primeiramente reunidas (375,9 mg)

e dissolvidas em 3 mL de metanol:água (23:77, v/v). Posteriormente, a amostra

foi aplicada na coluna e eluída a um fluxo de 0,8 mL/min com um gradiente de

metanol e água (20% - 100 % de MeOH). Foram obtidas 9 frações, sendo

utilizada a fração 07-CCFR07 (93,5 mg) no teste biológico.


CCFR07, utilizada no teste de atividade antifúngica.

Fração BuOH-

PLL01 (1 g)

03-CCCAV09

(43,4 mg)

07-CCFR07

(93,5 mg)



Gradiente de pH

Fluxo: 1,2 ml/min

CCFR07FE: C18 (40-63 µm)

AC: 40 cm ; AFE: 21,5 cm ; D: 2,5 cm


Fluxo: 0,8 ml/min

02-CCCAV09

(290,3 mg)

05-CCCAV09

(42,2 mg)+ +





FM: fase móvel




66

Após os experimentos com Cromatografia em Contra Corrente de Alta

Velocidade, o restante da fração BuOH-PLL01 (25,0495 g) foi utilizado num

fracionamento por partição líquido-líquido, que objetivou obter amostras

concentradas nas substâncias suspeitas de apresentarem atividade

antifúngica. A fração foi primeiramente suspensa em 300 mL de metanol:água

25:75 (v/v) e adicionada a um funil de separação de 500 mL. Posteriormente,

realizou-se a partição líquido-líquido com solventes imiscíveis em água e de

polaridade crescente, obedecendo a uma proporção de amostra/solvente

equivalente a 5:3 v/v. Foi utilizado o éter etílico, para a extração da clorofila

ainda presente (540 mL, fração Et-PLL02); acetato de etila 6 vezes (1080 mL,

fração 01-PLL02) para a extração dos flavonoides (agliconas, mono e

diglicosídeos), seguido de uma mistura composta por acetato de etila e butanol

(60:40, v/v,) a qual foi adicionada 4 vezes (720 mL, fração 02-PLL02) para a

extração das saponinas e simultaneamente evitar a extração de açúcares,

devido à presença do acetato de etila na mistura. Por último, realizou-se a

partição com o butanol (3 vezes, 540 mL, fração 03-PLL02)

A fração 02-PLL02 foi ressuspensa em 100 mL de metanol:água (20:80,

v/v) e submetida a uma partição líquido-líquido na proporção 5:4

(amostra/solvente). Primeiramente realizou-se a partição com acetato de etila,

o qual foi adicionado 10 vezes (800 mL, fração 01-PLL03) para extrair mais

flavonoides (agliconas, mono e diglicosídeos) e por último com n-butanol,

adicionado 3 vezes (240 mL, fração 02-PLL03), para a extração das saponinas.

Na Tabela 5, a seguir, estão os códigos das principais frações obtidas e seus

respectivos rendimentos. O esquema do processo de fracionamento encontra-

se no Fluxograma 5.

Tabela 5 - Rendimento das principais frações obtidas após o fracionamento por

partição líquido-líquido da fração BuOH-PLL01.

Solvente utilizado na extração Código Rendimento (g)

acetato de etila 01-PLL02 1,944

n-butanol 03-PLL02 2,0756

acetato de etila 01-PLL03 1,0127

n-butanol 02-PLL03 5,676

67

Fluxograma 5 - Esquema do processo de fracionamento por partição líquido-

líquido das frações BuOH-PLL01 e 02-PLL02.

BuOH-PLL01 (25 g) em 300

ml de MeOH:H2O (25:75 v/v)

ResíduoEt-PLL02

01-PLL02

Resíduo

02-PLL02

Resíduo

03-PLL02

Resíduo Aquoso

Extração com

éter etílico

Extração com

acetato de etila

Extração com

n-butanol

Extração com acetato de

etila:butanol (40:60 v/v)

02-PLL02 em 100 ml de

MeOH:H2O (20:80 v/v)

01-PLL03

Resíduo

02-PLL03

Resíduo

Aquoso

Extração com

acetato de etila

Extração com

n-butanol

3x 180 ml

6x 180 ml

4x 180 ml

3x 180 ml

10x 80 ml

3x 80 ml

68

A fração 02-PLL03 (5,6 g) que, de acordo com o seu perfil por CCD,

estava mais concentrada nas substâncias de interesse, foi submetida a uma

cromatografia em coluna de gel de filtração (CGF) utilizando a fase estacionária

Sephadex ® LH-20. Foram realizadas duas separações por esse método

(CGF01 e CGF02), utilizando 2 g de amostra, que foi dissolvida em 8 mL de

MeOH:H2O (6:2, v/v).

Posteriormente, a fração 02-CGF01 (643 mg) e 02-CGF02 (550 mg),

foram submetidas, separadamente, ao processo mencionado, com a exceção

de que as amostras foram dissolvidas em 1,5 mL de MeOH:H2O (1:2, v/v) e

eluídas sob um fluxo de 1 mL/min.

As frações 05-CGF03 e 04-CGF04 foram reunidas (177,1 mg) e

submetidas a uma cromatografia em coluna de fase reversa (CCFR12, , 100 µl,

Chromabond®, Macherey Nagel). A amostra foi dissolvida em 0,7 mL de

MeOH:H2O (5:2, v/v) e eluída com um gradiente de MeOH: H2O sob um fluxo

de 0,7 mL/min. O gradiente utilizado está descrito na tabela a seguir (Tabela 6):

Tabela 6 - Gradiente utilizado na separação da fração por cromatografia em

coluna de fase reversa (CCFR12).

Nº % H2O % MeOH Volume (mL)

1 60 40 40

2 40 60 160

3 20 80 40

4 0 100 40

A partir desse procedimento, foram obtidas 10 frações, sendo a fração

05-CCFR12 (5 mg) analisada em espectrômetro de ressonância magnética

nuclear, por denotar estar semipurificada após avaliação por CCD. Dessa

fração, obtiveram-se os espectros monodimensinais e bidimensionais de

ressonância magnética nuclear de 1H e 13C, em colaboração com o professor

Josean Fechine Tavares, da Universidade Federal da Paraíba. Por meio

dessas análises, foi possível constatar que a fração consistia numa saponina

isolada, sendo nomeada ZJS1.

69

Fluxograma 6 - Esquema de isolamento da saponina ZJS1, a partir da fração

02-PLL03.

02-PLL03 (2 g)

02-CGF01

(643 mg)

04-CCFR04

CGF01FE: Sephadex ® LH-20

AC: 35,5 cm; AFE: 16 cm

D: 3,3 cm

FM: MeOH

Fluxo: 2 ml/min


CGF: cromatografia em coluna de gel de filtração



FM: fase móvel




02-PLL03 (2 g)

02-CGF02

(550 mg)

05-CCFR03


AC: 35,5 cm; AFE: 16 cm

D: 3,3 cm

FM: MeOH

Fluxo: 2 ml/min


AC: 35,5 cm; AFE: 16 cm

D: 3,3 cm

FM: MeOH

Fluxo: 2 ml/min


AC: 35,5 cm; AFE: 16 cm

D: 3,3 cm

FM: MeOH

Fluxo: 2 ml/min

177,1 mg

05-CCFR12

ZJS1

CCFR12FE: C18

AC: 36,6 cm; AFE: 18 cm

D: 2 cm


Fluxo: 0,7 ml/minisolado

análises de RMN de 1H e 13C 1D e 2D

70

5.7 Avaliação da atividade antifúngica do EHF e frações

5.7.1 Determinação da CIM do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações

5.7.1.1 Reativação das leveduras e triagem fenotípica

As leveduras pertencentes à coleção de culturas do Laboratório de

Micologia Médica e Molecular, armazenadas em YPD caldo (“Yeast peptone

dextrose”; extrato de levedura 10 g/L; dextrose 20g/L; peptona 20 g/L)

adicionado de 20% de glicerol a -80 °C (Termo Scientific), foram reativadas

após 3 repiques sucessivos para placas de Petri de 90 mm de diâmetro

contendo meio de cultura, sendo semeadas por esgotamento e incubadas a 37

ºC por 48 horas. O primeiro repique foi realizado em Ágar Sabouraud Dextrose

(ASD, Difco), com posterior repique em meio cromogênico CHROMagar

Candida®(Difco), para a purificação dos isolados. O último repique foi realizado

no meio ASD. Paralelamente a isso, a partir desse último repique, foi realizado

o microcultivo de cada colônia. Cada amostra foi semeada com o auxílio de

alça em anel de níquel-cromo em três estrias paralelas sobre a placa de Petri

de 90 mm de diâmetro contendo ágar fubá com Tween-80 (fubá 40 g/L; ágar

bacteriológico 20 g/L; tween-80 12 mL/L). As estrias realizadas sobre o ágar

foram cobertas com lamínulas estéreis e a placa incubada a 30 °C, durante

48h. As leituras foram realizadas em microscopia de luz com 400x de

magnificação (Olympus, CX21).

5.7.1.2 Preparo do inóculo

Tratando com as leveduras puras, foi preparada uma suspensão em

solução salina estéril 0,85% (v/v), agitando-a em vórtex e ajustada visualmente

com base no tubo 0,5 da escala de McFarland, que equivale à concentração de

1 a 5x108 UFC/mL. Foram realizadas duas diluições da suspensão: 1:50 em

solução salina estéril e uma nova diluição de 1:20 em meio de cultura.

71

5.7.1.3 Triagem com micro-organismos de referência

Amostras do EHF, frações obtidas da partição líquido-líquido e sub-

frações da fração BuOH-PLL01 (Tabela 7) foram testadas pelo ensaio de

microdilução em caldo frente às seguintes cepas de referência:

Candida albicans ATCC90028

Candida tropicalis ATCC13803

Candida dubliniensis CBS7987

Candida parapsilosis ATCC22019

Candida glabrata ATCC2001

Candida krusei ATCC6258

Candida rugosa ATCC10571

Tabela 7 - Amostras testadas pelo método de microdiluição em caldo e suas

respectivas concentrações iniciais e faixa de concentração após a diluição

seriada.

Amostra Concentração inicial Faixa de concentração

EHF 10 mg/mL 5 - 0,039 mg/mL

Fração EP-PLL01 10 mg/mL 5 - 0,039 mg/mL

Fração CH2Cl2-PLL01 10 mg/mL 5 - 0,039 mg/mL

Fração AcOEt-PLL01 10 mg/mL 5 - 0,039 mg/mL

Fração BuOH-PLL01 10 mg/mL 5 - 0,039 mg/mL

Fração RA-PLL01 10 mg/mL 5 - 0,039 mg/mL

Fraçao 09-CCFR05 2,5 mg/mL 1,25 - 0,010 mg/mL

Fração 07-CCFR07 2,5 mg/mL 1,25 - 0,010 mg/mL

Fração 01-PLL02 5 mg/mL 2,5 - 0,020 mg/mL




Antes da realização do ensaio, foram preparadas as soluções do EHF e

frações, sendo inicialmente dissolvidos em DMSO e posteriormente o volume

completado com caldo Mueler-Hinton (MHC) estéril, de forma a produzir uma

solução contendo DMSO a 5% v/v. Por apresentar elevada solubilidade em

água, apenas a fração residual aquosa foi dissolvida diretamente em MHC

estéril puro. Após o preparo das soluções, essas foram filtradas em filtro de

72

seringa com membrana de 0,22 µm (KASVI). Posteriormente, iniciou-se o teste

de microdiluição em microplacas estéreis de 96 poços. Primeiramente, foram

adicionados 100 μl da amostra nos poços das colunas 1, 2 e 11. Em seguida,

foram transferidos 100 μl de MHC para os poços das colunas de 2 a 8 e 200 μL

para os poços da coluna 12. Posteriormente, com o auxílio de uma micropipeta

multicanal, foi realizada uma diluição seriada partindo da coluna 2,

homogeneizando-se e retirando-se 100 μL da mistura (meio + amostra) e

adicionando-se ao poço da coluna seguinte. Este procedimento foi repetido até

a coluna 9, desprezando-se os 100 μL restantes. Após a diluição seriada, foram

adicionados, em cada poço, 100 μL da suspensão de leveduras, exceto nas

colunas 1 (controle de esterilidade da amostra) e 12 (controle de esterilidade do

meio de cultura). Os poços das colunas 10 e 11 foram reservados,

respectivamente, para o controle de viabilidade da levedura na ausência e

presença do solvente DMSO (Figura 3). Subsequentemente, as placas foram

incubadas sob 35 ± 2 °C por 48 horas. As leituras foram realizadas após o

período de incubação, observando-se a ausência ou não de crescimento

fúngico nas respectivas diluições através de comparação visual. A CIM foi

considerada como a menor concentração de extrato ou fração capaz de inibir

visualmente o crescimento de cada cepa, tomando como referência o

respectivo controle de viabilidade (OLIVEIRA et al., 2006). Os ensaios foram

realizados uma única vez para a triagem (teste do EHF e frações da PLL01) e

em duplicata para as frações da fração BuOH-PLL01.

Figura 3 - Representação do teste de microdiluição em caldo.

Coluna 1 = controle de esterilidade do extrato. Coluna 2 – 9 = poços-teste. Coluna 10 = controle de viabilidade do inoculo. Coluna 11 = controle do solvente. Poço 12 = controle de esterilidade do meio de

cultura. Fonte: autor.

73

5.7.1.4 Determinação da CIM conforme o método do CLSI (CLSI, 2008).

A CIM das frações 07-CCFR07, 28-36 CCFR04 e 46-51 CCFR04 foi

determinada pelo método preconizado pelo CLSI frente às cepas de referência

de Candida. A execução foi quase idêntica a do método de triagem, com a

exceção de que o meio de cultura utilizado foi o caldo RPMI-1640, e o tempo

de incubação das leveduras, previamente à realização do experimento, foi de

24 horas.

A CIM da fração 07-CCFR07 também foi determinada frente a isolados

clínicos de Candida obtidos a partir do banco de microorganismos do

Laboratório de Micologia Média e Molecular. Os isolados clínicos foram

previamente identificados por metodologia clássica de identificação. As cepas

utilizadas encontram-se descritas no Quadro 4. O ensaio foi realizado em

duplicata.

Quadro 4 - Cepas clínicas utilizadas no teste de suscetibilidade.

Isolados clínicos

Candida albicans LMMM 116 (U)

Candida albicans LMMM 78 (S)

Candida albicans LMMM 233 (S)

Candida glabrata LMMM 48 (CO)

Candida glabrata LMMM 79 (S)



Candida tropicalis LMMM 190 (Ur)

Candida tropicalis LMMM 21 (Ur)

Candida tropicalis LMMM 35 (O)

Candida parapsilosis LMMM 81 (S)

Candida parapsilosis LMMM 104 (U)

Candida parapsilosis LMMM 84 (CO)

Candida dubliniensis LMMM (CO)

Trichosporon asahiiLMMM 451 (S)

S = sangue. Ur = urina. CO = cavidade oral. U = unha.

74

5.7.1.5 Determinação da concentração fungicida mínima (CFM)

Após a leitura do resultado do teste que utilizou o meio RPMI-1640, foi

realizada a determinação da CFM. A partir dos poços com ausência de

crescimento visível, 10 µl do seu conteúdo foram retirados e transferidos para

placas contendo ASD, sendo incubadas a 37 ºC por 48 horas. A menor

concentração de amostra que apresentou subcultura negativa foi considerada a

concentração fungicida mínima. Como controles, foram utilizados alíquotas de

10 µl do controle de crescimento da levedura e do controle de esterilidade do

meio de cultura.

5.7.1.6 Ensaio de bioautografia

O ensaio de bioautografia foi realizado frente à cepa de referência de

Candida glabrata (ATCC2001), segundo Rahalinson et al. (1991), com algumas

modificações. As amostras utilizadas foram o EHF e as frações BuOH-PLL01,

01-PLL02, 03-PLL02, 01-PLL03, 02-PLL03, 09-CCFR05 e 07-CCFR07.

Primeiramente, as amostras foram dissolvidas em metanol:agua (75:25,

v/v) de modo a formar uma solução a 20 mg/mL (p/v). Em seguida, com o

auxílio de um capilar, 5 a 10 µl das amostras foram aplicadas em 3 placas de

CCD, sendo a quantidade por aplicação correspondente a 100 µg ou 200 µg.

Foram preparadas duas placas para o ensaio de bioautografia,

constituindo assim uma duplicata, e duas placas para comparação, as quais

foram utilizadas para a revelação com os agentes cromogênicos vanilina

sulfúrica e Reagente Natural A. Para o ensaio de bioautografia, também foram

reservadas duas placas de CCD para a realização de uma duplicata dos

controles de viabilidade do inóculo (placa de CCD desenvolvida sem amostra)

e viabilidade do inóculo na presença do solvente (placa de CCD desenvolvida

com aplicação do solvente utilizado para a dissolução da amostra).

Antes de desenvolver cada CCD, a cuba contendo a fase móvel acetato

de etila:ácidofórmico:metanol:água (100:15:6:15, v/v/v/v) foi deixada saturando

75

com o vapor do solvente por 10 minutos, de forma a diminuir o erro associado a

uma saturação incompleta e a garantir a reprodução da separação nas

duplicatas.

Posteriormente, as placas de CCD contendo as amostras foram

colocadas na cuba cromatográfica, eluídas e secas em capela (Quimis®), com

o auxílio de um secador portátil, para a remoção do solvente.

Subsequentemente, as placas de CCD foram transferidas para uma cabine de

fluxo laminar (BSTEC®) e submetidas à ação de lâmpada germicida (UV 254

nm) por 20 minutos para efeitos de esterilização. Em seguida, as placas de

CCD foram depositadas em placas de Petri de 140 mm por 15 mm.

Após a etapa de desenvolvimento e acondicionamento das placas de

CCD, 3 mL de uma suspensão da cepa de referência de C. glabrata (ATCC

2001) a aproximadamente 1x108 UFC/mL, preparada conforme o item 5.7.1.2 ,

foram transferidos para um tubo contendo 30 mL de ASD fundido e mantido em

banho-maria (Quimis®) a 50°C. O inóculo diluído no ágar foi então aplicado

sobre as placas de CCD com o auxílio de uma pipeta de vidro estéril. Ao final,

as placas de Petri foram incubadas em estufa a 37 °C por 48 horas e, logo

após a incubação, visualizadas para a detecção de halos de inibição.

Após a incubação, foram obtidas imagens da bioautografia, sendo

processadas por softwares para a medição da área dos halos de inibição. As

imagens foram obtidas com uma câmera de 21 megapixels, abertura f/2, modo

flash e ISO 64. Posteriormente, foram processadas pelo software livre GIMP,

versão 2.8.14, utilizando inicialmente a ferramenta “Perspectiva”, para tornar a

imagem plana, e em seguida o filtro de imagem Máscara de Desaguçar (raio:

200; quantidade: 2,0 ou 4,0; limiar: 0) para realçar as bordas do halo de

inibição. Logo após, a imagem processada foi transferida para o software livre

ImageJ 1.48 v (National Institute of Health, USA, Bethesda) para medir a área

dos halos de inibição, utilizando-se inicialmente a ferramenta de seleção oval,

seguida da função MEASURE. Os resultados foram expressos como média,

desvio padrão e coeficiente de variação da área medida em pixel².

76

5.8 Avaliação do efeito protetor do EHF de Z. joazeiro Mart. em modelo de

doença inflamatória intestinal

5.8.1 Animais

Ratas (180-250g), da espécie Rattus norvegicus albinus foram obtidas

do biotério da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Os animais foram

mantidos em uma sala com temperatura controlada de 25 ± 2°C, ciclo claro-

escuro, com acesso à comida e água ad libitum, sendo submetidos a jejum

somente 12 horas antes do experimento. Todos os procedimentos visaram

minimizar o número de animais empregados nos testes e qualquer desconforto

que possa a provir desses. O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no

Uso de Animais da UFRN sob o número de protocolo 067/2015.

5.8.2 Modelo de colite aguda

As ratas (n = 7/ grupo) foram distribuídas aleatoriamente em grupos de

indução da doença inflamatória intestinal (DII) com tratamento por

administração do extrato hidroetanólico das folhas de Ziziphus joazeiro Mart. ou

sulfassalazina, e grupos controles. A DII foi induzida pelo ácido 2,4

dinitrobenzóico (DNBS), com duração de 4 dias.

A indução da colite aguda foi realizada pelo método descrito por Morris

et al., (1989) e Gálvez et al. (2000) com pequenas modificações. Os animais

foram submetidos a um período de jejum de 24 horas e, posteriormente,

anestesiados com 10% de ketamina (70 mg/Kg, Quetamina, Sintec, São Paulo)

e 2% de xilazina (10 mg/Kg, Sintec, São Paulo). O DNBS foi preparado numa

concentração de 120 mg/mL, dissolvidos em uma solução a 50 % de etanol v/v.

A solução hidroetanólica de DNBS foi administrada por via retal, num volume

de 0,25 mL, com o auxílio de um catéter de teflón (diâmetro de 2 mm) acoplado

a uma seringa de 1 mL. O catéter foi introduzido no ânus das ratas até uma

distância de 8 cm. Os animais do grupo controle negativo foram submetidos ao

mesmo procedimento, porém com a administração de solução salina em

substituição ao DNBS. Após a administração do hapteno, os animais foram

77

mantidos em posição vertical, com a cabeça voltada para baixo, por 15 minutos

de modo a evitar o extravasamento do agente indutor.

Os tratamentos receberam, por gavagem, 1 mL de uma suspensão do

extrato em solução salina (0,9 %, v/v), uma vez ao dia em três doses: 50 mg/kg

(dose baixa), 100 mg/Kg (dose média) e 200 mg/kg (dose alta). Outro grupo

recebeu 1 mL de sulfassalazina a 250 mg/Kg por via oral. Os tratamentos

foram realizados às 72, 48, 24 e 2 horas antes da indução de colite, assim

como 4 dias após. Como padrão de comparação, foi utilizado o grupo controle,

ao qual foi induzida a colite, mas sem tratamento farmacológico (controle

positivo) e um grupo saudável (controle negativo), ao qual não foi induzido o

processo inflamatório colônico. Os animais dos grupos controle positivo e

negativo receberam 1 mL de solução salina, por via oral. Todos os animais

foram eutanasiados 4 dias após a indução da colite por overdose de tiopental

associado a lidocaína. (Quadro 5)

Quadro 5 - Distribuição dos grupos de colite aguda para a avaliação da

atividade do EHF de Z. joazeiro Mart.

Grupos Tratamento via oral

Grupo 1 (7 animais) Salina 0,9% v/v

Grupo 2 (7 animais) Salina 0,9 % v/v

Grupo 3 (7 animais) EHF 50 mg/kg



Grupo 6 (7 animais) sulfassalazina 250 mg/kg - oral

Grupo 1: controle negativo; Grupo 2: controle positivo

78

5.8.3 Avaliação macroscópica do processo inflamatório intestinal

5.8.3.1 Monitorização clínica da doença inflamatória intestinal

A severidade clínica do modelo murino de inflamação intestinal foi

avaliada com base no exame diário da perda de peso, consistência fecal e

presença macroscópica de sangue nas fezes. O peso e o aspecto das fezes

dos animais foram determinados no primeiro dia do experimento, antes da

administração dos tratamentos, até o último dia, antes da eutanásia dos

animais. A perda de peso foi calculada como a diferença entre o peso corporal

no dia anterior ao da indução e qualquer dia após a indução. Para cada

parâmetro (perda peso, consistência fecal, presença de sangue) foi atribuído

um escore, cujo valor baseou-se nos critérios apresentados no Quadro 6. O

Índice de Atividade da Doença (IAD) foi calculado para cada animal por meio

da média dos três parâmetros já mencionados. Quanto maior o valor do IAD,

mais severa é a condição clínica apresentada pelo animal ou grupo de animais.

Quadro 6 - Critérios utilizados para a monitorização clínica da doença

inflamatória intestinal.

Pontuação Critérios

Perda de Peso Consistencia das fezes Sangramento

0 0 Normal Normal

1 1--10 Pouco branda -

2 11--15 Fezes brandas Sangue oculto

3 15 - 20 Pastosa -

4 >20 Diarreia Sangue

5.9.3.2 Determinação do dano macroscópico

Para a determinação do dano macróscopico, os animais foram

primeiramente eutanasiados através da injeção de uma overdose de tiopental

sódico (90 mg/kg) por via intraperitoneal, associado com lidocaína (10 mg/mL).

Subsequentemente, o seguimento colônico foi extraído na sua totalidade,

lavado com solução fisiológica e, em seguida, colocado sobre uma placa de

Petri com gelo para a remoção das aderências mesentéricas.

79

Posteriormente, foi verificado o seu peso, em balança eletrônica digital, e

medido o seu comprimento total para determinação da relação peso/longitude

(P/L). O cólon foi então aberto longitudinalmente para que fosse avaliada a

extensão da área inflamada e o Índice de Dano Macroscópico (IDM). O IDM de

cada animal foi determinado com base na presença de parâmetros de

inflamação, na quantidade de úlceras e na extensão do dano tissular, medida

com o auxílio de uma régua (BELL; GALL; WALLACE, 1995) (Quadro 7)

Quadro 7 - Critério para a avaliação da gravidade do dano macroscópico da

colite experimental de acordo com Bell, Gall e Wallace (1995).

Pontuação Critério

0 Cólon normal (sem dano)

2 Ulceração sem hiperemia nem engrossamento da parede

3 Ulceração com ponto de inflamação

4 Dois ou mais sítios de ulceração e/ou inflamação

5 Zonas grandes de inflamação e ulceração com uma

extensão maior que 1 cm

6-10 Zonas grandes de dano tissular com uma extensão maior

que 2 cm, adicionando-se 1 (até 10) ponto a cada 1 cm

adicional de extensão.

Em seguida, o colón foi cuidadosamente seccionado em cortes

longitudinais, os quais foram armazenados a -20 °C para uma posterior

avaliação histopatológica e para a determinação de marcadores do processo

inflamatório e estresse oxidativo tecidual.

80

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1 Análise fitoquímica preliminar

Após a análise fitoquímica clássica, foi detectada a presença de

compostos fenólicos, flavonoides e saponinas no extrato hidroetanólico das

folhas (EHF) de Z. joazeiro Mart. Em seguida, foi realizada uma análise por

CCD do extrato, utilizando três reveladores específicos (Reagente Natural A,

Reagente de Borntrager, Dragendorff) e um universal (vanilina sulfúrica), além

de 2 fases móveis. Para um melhor entendimento, serão discutidos

primeiramente os resultados obtidos com a fase móvel de maior polaridade e

posteriormente os obtidos com a fase móvel utilizada para a visualização de

agliconas.

6.1.1 Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. utilizando a fase móvel para

glicosídeos

Antes da revelação, a CCD foi visualizada sob luz UV (ultravioleta) a 365

nm para a observação de compostos que emitem fluorescência sem a

necessidade de agentes cromogênicos, como flavonoides, cumarinas e ácidos

fenólicos (Figura 4-1). Foram observadas manchas com extinção de

fluorescência (negro), indicativo de flavonoides, e manchas de fluorescência

azul brilhante, sugestivo de flavonoides, ácidos fenólicos ou cumarinas

(MABRY; MARKHAM; THOMAS; 1970; WAGNER e BLADT, 2001). Em

seguida, a cromatoplaca foi revelada com KOH a 5% p/v para a detecção de

cumarinas e antraquinonas (Figura 4-2 e 3). Ao realizar a visualização sob luz

visível, observou-se manchas amarelas por toda a extensão da placa,

enquanto que, sob luz UV a 365 nm, foi possível observar manchas de

fluorescência azul-verde, indicativo de ácidos fenólicos e cumarinas. É

importante destacar que as manchas entre os valores de Rf 0,08 e 0,33

(Tabela 8) apresentaram uma fluorescência mais intensa em relação à placa

sem revelação, sobretudo a mancha com intensa fluorescência azul-verde de

valor de Rf 0,15, comportamento esse característico de cumarinas, que têm a

sua fluorescência intensificada em meio alcalino (WAGNER e BLADT, 2001).

81

A placa revelada com Reagente Natural A apresentou, sob luz UV a 365

nm, manchas de fluorescência amarela, laranja e verde por toda a sua

extensão, indicativo da presença de flavonoides com diferentes núcleos e

níveis de glicosilação. De acordo com a literatura, as manchas de cor laranja e

amarela são características de flavonoides cujo anel B possui 2 hidroxilas

adjacentes, como quercetina, luteolina, miricetina e seus derivados glicosilados

(Figura 4-4). Por sua vez, as manchas de cor verde são características de

flavonoides que apresentam apenas uma hidroxila no anel B, como canferol,

isoramnetina, apigenina e seus glicosídeos (WAGNER e BLANDT, 2001).

Após a revelação com vanilina sulfúrica (Figura 4-5), o extrato

apresentou manchas amarelas, de disposição semelhante às manchas

observadas na placa revelada com Reagente Natural A, as quais

provavelmente correspondem aos flavonoides observados anteriormente. Além

disso, pôde-se observar manchas azuis de valor de Rf 0,20 e 0,33

respectivamente, indicativo de saponinas devido à sua elevada polaridade e

cor característica. O reagente de Dragendorff, utilizado para detecção de

alcaloides, também foi empregado. Após a revelação com esse reagente

(Figura 4-6), não foi observado o desenvolvimento de manchas de coloração

alaranjada, característico da presença de alcaloides, assim como não foi

observado na reação clássica de precipitação (WAGNER e BLADT, 2001).

82

Tabela 8 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a revelação das

cromatoplacas que foram submetidas ao eluente para glicosídeos.

Mancha Rf Cor

Luz UV 365 nm KOH 5%/luz

visível KOH 5%/luz UV 365 nm

Reagente Natural A/ UV

365 nm

Vanilina Sulfúrica/ luz visível

1 0,08 Azul brilhante Laranja Azul-verde Laranja -

2 0,15 Azul brilhante Laranja Azul-verde Amarelo Azul

3 0,20 Azul- brilhante Laranja Azul-verde Laranja -

4 0,26 Azul brilhante Laranja Azul-verde Laranja Azul

5 0,33 Negro Laranja Azul-verde Laranja Laranja

6 0,40 Negro Laranja Laranja Amarelo-verde Laranja

7 0,47 Azul brilhante Laranja-amarelo Azul-verde Laranja Amarelo

8 0,51 Azul brilhante Laranja-amarelo Azul-verde Laranja -

9 0,55 Negro Laranja Azul-verde Laranja Amarelo

10 0,63 Negro Laranja-amarelo Laranja Verde Amarelo

11 0,69 Azul brilhante - Azul-verde - -

12 0,74 Azul brilhante Laranja Azul-verde Laranja Amarelo

13 0,79 Negro Laranja-amarelo Azul-verde Laranja Amarelo

14 0,84 - - Azul-verde Verde -

15 0,90 - - Azul-verde - -

83

Figura 4 - Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com o eluente para glicosídeos

Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:14:6:10,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: 1 – UV 365 nm; 2 – KOH 5 %/luz

visível; 3 – KOH 5%/ UV 365 nm; 4 – Reagente Natural A/UV 365 nm; 5 - vanilina sulfúrica/aquecimento; 6 - Dragendorff. Fonte: autor

84

6.1.2 Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. utilizando a fase móvel para

agliconas

A observação inicial da placa em luz UV a 365 nm permitiu verificar a

presença de 6 manchas vermelhas com valores de Rf entre 0,5 e 0,84, as quais

possivelmente correspondem a pigmentos vegetais, como clorofila (Figura 5-1).

Posteriormente, a placa foi revelada com KOH 5% (p/v), preservando a cor das

manchas vermelhas, exceto a de Rf 0,75, que passou a apresentar uma

coloração azul. Logo, é possível que esteja coeluindo uma cumarina juntamente

com o pigmento vegetal (Figura 5-2; Tabela 9).

Após a revelação com Reagente Natural A, surgiram manchas de

fluorescência verde e laranja (Figura 5-3). Como comentado anteriormente, a

mancha laranja é característica de flavonoides cujo anel B possui duas hidroxilas

adjacentes, enquanto que a coloração verde é característica de flavonoides com

apenas uma hidroxila no anel B (WAGNER e BLADT, 2001). Portanto, há pelo

menos dois tipos de agliconas flavonoídicas no EHF de Z. joazeiro Mart., cujo os

derivados glicosilados possivelmente originam as manchas observadas após o

uso da fase móvel apropriada para glicosídeos.

O uso do revelador universal vanilina sulfúrica permitiu observar, sob luz

visível, manchas de cor violeta com valores de Rf de 0,75 e 0,85, as quais co-

eluem com as manchas vermelhas (Figura 5-4). A cor violeta é característica de

substâncias da classe dos terpenoides (WAGNER e BLADT, 2001).

Tabela 9 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a revelação das

cromatoplacas que foram submetidas ao eluente para agliconas.

Mancha Rf

Cor

Luz UV 365 nm

KOH 5%/luz UV 365 nm

Reagente Natural A/ UV 365 nm

Vanilina Sulfúrica/ luz

visível

1 0,5 Vermelho Vermelho - -

2 0,55 Vermelho Vermelho - Verde

3 0,58 - - Laranja -

4 0,61 Vermelho Vermelho Vermelho Verde

5 0,66 - - Verde -

6 0,75 Vermelho Azul Vermelho Violeta

7 0,84 Vermelho Vermelho Vermelho Violeta

85


agliconas.

Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:14:6:10,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: 1 – UV 365 nm; 2 – KOH 5%/ UV 365 nm; 3 – Reagente Natural A/UV

365 nm; 4 - vanilina sulfúrica/aquecimento. Fonte: autor

6.1.3 Análise por co-cromatografia

Adicionalmente, foi realizada uma análise por co-CCD com os padrões

comerciais das agliconas flavonoídicas quercetina e canferol, além dos

flavonoides glicosilados rutina e isoquercetina, de modo a verificar a sua presença

no extrato. Os padrões foram eluídos em paralelo com o EHF, bem como

juntamente com esse (co-eluição). Após a eluição com a fase móvel para

agliconas e revelação com Reagente Natural A/UV 365 nm, foi possível observar

que as manchas dos padrões, tanto em paralelo quanto após a co-eluição,

apresentaram Rf e coloração semelhante às manchas verde e laranja observadas

no EHF. A mancha verde (Rf = 0,72) apresentou comportamento cromatográfico

similar ao da amostra autêntica de canferol (Figura 6-1; 6-2; 6-3; Tabela 10),

enquanto que a mancha amarelo-laranja (Rf = 0,65) apresentou comportamento

86

cromatográfico similar à amostra autêntica de quercetina (Figura 6-4; 6-5; 6-6;

Tabela 10).

Tabela 10 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a análise por co-

CCD do EHF de Z. joazeiro Mart.utilizando os padrões de quercetina e canferol.

Mancha Rf Cor

EHF

Padrão quercetina

Padrão canferol

EHF + padrão

1 0,65 Laranja-Amarelo Amarelo - Amarelo

2 0,68 Vermelho - - Vermelho

3 0,72 Verde - Verde Verde



Figura 6 - Análise por co-CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com os padrões de

quercetina e canferol

Eluente: tolueno:acetato de etila:ácido fórmico (50:50:5,v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: Reagente Natural A/UV 365 nm. Amostras: 1 – EHF; 2 – padrão de canferol; 3 – co-

eluição do EHF com o padrão de canferol; 4 – EHF; 5 – padrão quercetina; 6 – co-eluição do EHF com o padrão quercetina. Fonte: autor.

A análise utilizando a fase móvel adequada para glicosídeos permitiu

observar, após revelação com Reagente Natural A/UV 365 nm, que as manchas

87

dos padrões de rutina (Rf = 0,55, Figura 7-2, Tabela 11) e isoquercetina (Rf =

0,80, Figura 7-5, Tabela 11) apresentaram coloração similar, porém um valor de

Rf relativamente discrepante ao das manchas de fluorescência laranja presentes

no EHF (Rf = 0,50 e 0,75; Figuras 7-1 e 7-4). Embora na eluição em paralelo, as

referidas manchas não tenham apresentado valor de Rf próximo ou igual ao das

amostras autênticas, possivelmente devido ao efeito da complexidade da matriz,

após a co-eluição foi possível observar um aumento da fluorescência dessas

(Figuras 7-3 e 7-6), o que permite sugerir a presença desses flavonoides no EHF

de Z. joazeiro Mart.

Tabela 11 - Valores de Rf e cor das manchas observadas após a análise por co-

CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. utilizando os padrões de rutina e isoquercetina.

Mancha Rf Cor

EHF Padrão rutina

Padrão isoquercetina

EHF + padrão

1 0,50 Laranja - - Laranja

2 0,55 - Laranja - -

3 0,56 Verde - - Verde

4 0,60 Amarelo - - Amarelo

5 0,66 Amarelo - - Amarelo


7 0,80 - - Laranja -

8 0,83 Verde - - Verde


88

Figura 7 - Análise por co-CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. com os padrões de

rutina e isoquercetina.

Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:16:6:15,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: Reagente Natural A/UV 365 nm. Amostras: 1 – EHF; 2 – padrão de

rutina; 3 – co-eluição do EHF com o padrão rutina; 4 – EHF; 5 – padrão de isoquercetina; 6 – co-eluição do EHF com o padrão isoquercetina. Fonte: autor

Com base nos resultados dessa análise fitoquímica preliminar, foi possível

constatar a presença de saponinas, flavonoides e possivelmente ácidos fenólicos,

cumarinas e terpenoides no EHF de Ziziphus joazeiro Mart.. Ainda, foi possível

observar a presença de agliconas flavonoidicas e seus respectivos glicosídeos,

bem como sugerir a presença dos flavonóis quercetina, canferol, rutina e

isoquercetina por meio de uma análise por co-CCD.

Estudos anteriores já haviam reportado a presença de saponinas,

flavonoides e terpenoides nas folhas de Ziziphus joazeiro Mart.. No entanto,

também foi reportada a presença de taninos e alcaloides por meio de reações

clássicas (SILVA el al., 2008; MELO et al., 2012). Essa discrepância pode

decorrer de variações no perfil metabólico em função do local e época da coleta

ou devido a resultados falso-positivos que podem ocorrer nas técnicas clássicas

de identificação. Em um estudo recentemente publicado, foram identificados, por

CLAE-DAD, ácidos fenólicos e flavonoides no extrato hidroetanólico das folhas,

incluindo os flavonoides quercetina, canferol, rutina e isoquercetina, o que

corrobora para a presença desses constituintes nas folhas da espécie (BRITO et

al., 2015).

89

6.2 Análise por CCD das frações da partição líquido-líquido do EHF de Z.

joazeiro Mart.

O EHF foi particionado com solventes de polaridade crescente, obtendo-se

as frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01, BuOH-PLL01 e RA-PLL01.

Essas frações foram analisadas por CCD a fim conhecer o seu perfil

cromatográfico.

Foram utilizadas duas fases móveis de forma a permitir a visualização de

moléculas polares e menos polares. Pôde-se observar que nas placas reveladas

com Reagente Natural A, específico para flavonoides, o EHF e a fração BuOH-

PLL01 apresentaram um perfil semelhante, enquanto que a fração AcOEt-PLL01

apresentou uma maior diversidade de flavonoides com diferentes polaridades,

que nitidamente se distribuíram em 3 regiões (Figura 8). Observa-se na placa da

Figura 9, revelada com vanilina sulfúrica, a presença de manchas azuis no EHF e

na fração BuOH-PLL01. Devido à sua cor e maior polaridade, sugere-se que

sejam saponinas, como observado anteriormente na análise por CCD do EHF.

Não foi possível observar manchas nas frações EP-PLL01e CH2Cl2-PLL01. A

fração RA-PLL01 se apresentou como um arraste disperso, característico de

açúcares.

90

Figura 8 - Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. e das frações obtidas da

partição líquido-líquido.

Eluente A: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:16:6:15,v/v/v/v). Eluente B: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:15:6:2,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254;

Detecção: Reagente Natural A/UV 365 nm. Amostras: EHF; EP-PLL01; CH2Cl2-PLL01; AcOEt-PLL01; BuOH-PLL01; RA-PLL01. Fonte: autor.

Figura 9 - Análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. e das frações obtidas da

partição líquido-líquido

Eluente A: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:16:6:15,v/v/v/v). Eluente B: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:15:6:2,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254;

Detecção: Reagente Natural A/UV 365 nm. Amostras: EHF; EP-PLL01; CH2Cl2-PLL01; AcOEt-PLL01; BuOH-PLL01; RA-PLL01. Fonte: autor.

EH

F

EH

F

91

6.3 Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações da partição líquido-líquido

por CLAE-UV-DAD

O extrato hidroetanólico das folhas (EHF) de Z. joazeiro Mart. e suas

respectivas frações da partição líquido-líquido foram analisados por CLAE-UV-

DAD para caracterizar as classes de metabólitos secundários presentes,

utilizando como detector um arranjo de fotodiodos, que realizou a varredura do

espectro na região entre 210-450 nm. Devido à presença de ácido acético na fase

móvel, não foi possível realizar a identificação de saponinas, pois o grupo

carboxila do ácido acético absorve em torno de 200-210 nm, o que dificulta a

observação de moléculas com poucos grupos cromóforos (SNYDER; KIRKLAND;

GLAJCH, 1997). Portanto, a análise foi útil para a identificação de classes e

subclasses de compostos fenólicos.

6.3.1 Análise do EHF de Z. joazeiro Mart. e frações da partição líquido-líquido

A análise do EHF por CLAE-UV-DAD demonstrou a presença de 25 picos

com resolução satisfatória (Figura 10), sendo possível adquirir seus espectros no

UV com pureza maior que 80%. Foram observados espectros com bandas de

absorção indicativas de ácidos fenólicos, cumarinas, flavonóis com substituição

em C-3 e flavonas (Tabela 12).

Os picos 1, 3 e 4 (Tabela 12), com menor tempo de retenção, podem

corresponder a ácidos fenólicos derivados do ácido benzóico, pois apresentam

um único máximo de absorção em torno de 200-290 nm (WAKSMUNDZKA-

HAJNOS; SHERMA, 2010)

Os picos 5, 8 e 19 (Tabela 12) podem derivar de cumarinas. O pico 5

apresenta bandas de absorção sugestivas de uma cumarina com oxigenação em

C-7 (HARBORNE , 1989). Enquanto isso, o pico 6 apresenta espectro sugestivo

de uma 4-fenilcumarina devido a presença de 3 bandas de absorção em torno de

230, 280-295 e 340-370 nm (DANG et al., 2015). Por último, o pico 19 pode

corresponder a uma furanocumarina linear por possuir 4 bandas de absorção em

torno de 205 e 316 nm (HARBORNE , 1989).

92

A partir do tempo de retenção (tR) de 16 min, surgem picos com espectro

no UV característico de flavonoides, mais especificamente flavonas ou flavonóis

com substituição em C-3, por apresentarem dois máximos de absorção

correspondentes a banda I (sistema cinamoila do anel B) e banda II, (sistema

benzoila do anel A) entre 300-380 nm e 240-280 nm, respectivamente (MABRY;

MARKHAM; THOMAS, 1970).

Pode-se observar picos (9, 10, 14, 15 e 16; Tabela 12) com espectro no UV

sugestivo de flavonóis com o núcleo quercetina, possivelmente apresentando

glicosilação em C-3 devido ao seu tempo de retenção. Sustentam essa hipótese a

presença de duas bandas principais em torno de 255 e 354 nm, estando a banda I

fora da região de sobreposição entre flavonas e flavonois substituídos em C3

(328-350 nm), um deslocamento hipsocrômico da banda I em torno de 15 nm em

relação a aglicona quercetina, que corrobora para a substituição em C-3 por um

açúcar, e uma banda II duplicada, indicativo de hidroxilação nas posições 3' e 4'

do anel B (CAMPOS; MARKHAM, 2007; MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970).

Ainda, na região de tempo de retenção entre 16 e 30 minutos, verifica-se

que os picos 11, 13 e 17 (Tabela 12) possuem a dupla banda II em torno de 255

nm e a banda I em torno de 345-350 nm, comportamento esse sugestivo de uma

flavona com oxigenação em 3' e 4' e ausência de substituição em 3, ou seja,

sugestivo de luteolina. Considerando o tempo de retenção dos picos,

possivelmente a flavona está glicosilada.

A partir do tR de 26 min, surgem picos com espectro característico de

flavona ou flavonol (20, 22, 23, 24, 25; Tabela 12) apresentando uma banda I em

torno de 325-335, o que representa um intenso deslocamento hipsocrômico em

relação aos flavonoides anteriores. Esse comportamento é sugestivo de

flavonoide com metilação ou glicosilação em 3, 4' e 5' ou ausência de oxigenação

nessas posições (MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970).

93

Tabela 12 - Tempo de retenção (tR) e máximos de absorção (λmax) dos espectros

no UV observados para os picos obtidos após a análise do EHF de Ziziphus

joazeiro Mart.por CLAE-UV-DAD.

Pico tR (min) λmax(nm)

1 2,53 253

2 2,93 212, 244sh, 255sh

3 4,21 270

4 4,53 270

5 7,84 234, 313

6 8,55 215, 240sh, 324

7 8,91 241, 327

8 9,60 230, 292, 337sh

9 16,54 256, 262sh, 298sh, 354

10 18,26 256, 263, 296, 354sh

11 18,90 255, 263sh, 295sh, 346

12 19,58 266, 296, 340

13 20,94 255, 263sh, 298sh, 346

14 21,83 255, 262sh, 298sh, 354

15 22,60 254, 262sh, 354

16 24,10 255, 262sh, 354

17 25,21 254, 262sh, 349

18 26,97 230, 266sh, 294, 326sh

19 29,85 245, 262sh, 332

20 31,76 253, 265sh, 296sh, 329

21 32,64 265, 317

22 36,34 243, 266, 295sh, 328

23 38,04 242, 265, 297sh, 335

24 38,67 267, 295sh, 328

25 39,43 246sh, 267, 325 sh = shoulder ou ombro

94

Figura 10 - Espectros de UV (210-450 nm) dos 25 picos observados na análise

por CLAE-UV-DAD do EHF de Z. joazeiro Mart.

1

2

3

4

6

7

8

5

95

12

13

11

10

9

16

17

14

15

18

96

Fonte: autor

21

22

20

19 23

24

25

97

Figura 11 - Cromatograma obtido por CLAE-UV-DAD para o EHF de Ziziphus joazeiro Mart. e frações.

A

A

A

A

B

B

B

B

EHF

CH2Cl2-PLL01

AcOEt-PLL01

BuOH-PLL01

A = cromatograma obtido a 254 nm (280 nm para a fração BuOH-PLL01). B = espectro no UV em função do tempo de retenção. Fonte: autor

98

A fração CH2Cl2-PLL01, após análise por CLAE-UV-DAD, apresentou

picos com perfil espectral predominante em ácidos fenólicos, possivelmente

derivados do ácido benzoico e ácido cinâmico, além de cumarinas. Os picos 2, 4,

7, 8, 9, 10, 16, e 21 podem ser derivados do ácido benzóico por apresentarem

máximo de absorção entre 200-290 nm (Tabela 13). Por sua vez, os picos 5, 11,

12, 13, 14, 15, 1 e 20 podem corresponder a ácidos fenólicos derivados do ácido

cinâmico ou cumarinas, em decorrência de possuírem máximos de absorção

entre 218 e 330 nm (Tabela 13). Portanto, o perfil químico da fração CH2Cl2-

PLL01 difere bastante do EHF.


no UV observados para os picos obtidos após a análise da fração CH2Cl2-PLL01

por CLAE-UV-DAD.

Pico tR(min) λmax(nm)

1 5,49 265, 274

2 7,89 284

3 8,54 252

4 10,12 280

5 11,20 228, 276, 306

6 11,89 218, 265sh, 292

7 12,15 217, 281

8 12,66 229, 278

9 14,35 223, 284

10 15,25 244

11 15,63 220, 258, 302sh

12 16,50 230, 280, 310

13 17,41 218, 229sh, 308

14 18,68 242, 326

15 19,01 219sh, 239, 294sh, 323

16 20,35 241

17 24,20 246sh, 259, 298, 358

18 25,23 234, 345

19 41,56 228

20 44,52 238, 330

21 45,45 276

22 47,13 238, 329 sh = shoulder ou ombr

99

A fração AcOEt-PLL01 apresentou um perfil abundante em flavonoides,

assim como observado na análise por CCD. Dos 30 picos analisados, 20

apresentaram espectro no UV característico de flavonoides (Tabela 14). Além dos

flavonoides observados no extrato entre tR de 16 - 30 min, surgiram mais picos na

região entre tR 30 - 55 min, possivelmente devido à capacidade do acetato de etila

de extrair agliconas flavonoídicas da fase aquosa, além de flavonoides mono e

diglicosilados. Logo, surgiram mais picos com tempo de retenção elevado,

comportamento esse associado a moléculas de menor polaridade, considerando a

cromatografia de fase reversa.

Em consonância com o observado no EHF, os picos 8(a),9, 12, 13, 15 e 16

(Tabela 14) apresentaram espectro característico de quercetina-3-O-glicosídeo,

com máximos de absorção em torno de 255 e 355 nm, além da presença de

banda IIb ao redor de 266 nm. Os picos 10, 15(b) e 19, por sua vez,

possivelmente correspondem a derivados glicosilados de canferol, em

decorrência do deslocamento hipsocrômico da banda I em relação aos

glicosídeos de quercetina e ausência de uma banda II duplicada, indicativo de um

anel B hidroxilado apenas na posição 3' (CAMPOS; MARKHAM, 2007).

Os picos 18, 22, 23, 24, 25, 27, 29 e 30 (Tabela 14) podem derivar de

flavonoides com ausência de substituintes oxigenados nas posições 3, 4' e 5,

devido ao intenso descolamento hipsocrômico observado para as bandas I ou II

ou ambas. Além disso, destaca-se o pico 26, que possui espectro no UV

indicativo de uma flavona com ausência de oxigenação no anel B, como a crisina

(MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970).

Foi observado para os picos 17(a) e 25 (Tabela 14) um espectro

característico de flavonoide, no entanto com anomalia. Esses apresentam banda

IIa e IIb, indicativo de oxigenação em 3' e 4', porém a banda I possui um intenso

deslocamento hipsocrômico, sendo incoerente com o restante do espectro, uma

vez que esse deslocamento hipsocrômico é característico de um núcleo do tipo

apigenina. Assim, propõe-se que essas substâncias devem apresentar algum

substituinte com efeito imprevisível sobre o espectro no UV, sendo portanto de

interesse para o isolamento.

100

Sugere-se também a presença de derivados do ácido benzoico e ácido

cinâmico (picos 1, 2, 3, 4, 5, e 28; Tabela 14) devido à presença de bandas de

absorção entre 216 e 334 nm.


no UV observados para os picos obtidos após a análise da fração AcOEt-PLL01

por CLAE-UV-DAD.


1 2,89 258, 268sh

2 3,61 259, 266sh

3 7,34 218, 260, 295

4 10,63 256

5 11,90 218, 261, 295, 334sh

6 12,15 216, 273

7 14,36 227, 279

8(a) 16,34 257, 266sh, 358

8(b) 16,34 223sh, 271sh, 312

9 18,33 256, 266, 294, 354

10 18,98 256, 261sh, 292sh, 347

11 19,67 264, 291, 344

12 21,03 256, 264sh, 292sh, 346

13 21,92 255, 266sh, 295sh, 354

14 22,69 256, 266sh, 292sh, 354

15 24,19 255, 267sh, 278sh, 353

16 25,31 254, 266sh, 297sh, 353

17 (a) 27,11 229, 266, 295sh, 321

17 (b) 27,11 264, 350

18 29,91 245, 267sh, 332

19 31,83 252sh, 268, 298sh, 329

20 32,74 236sh, 256, 267sh, 294sh, 316

21 34,40 264, 298, 340

22 36,40 219sh, 244sh, 266, 296sh, 328

23 38,08 245, 268sh, 295sh 332

24 38,72 245sh, 268, 296sh, 328

25 39,45 245, 268sh, 330

26 40,50 257, 267sh, 292sh, 314

27 41,55 252, 267sh, 296sh, 333

28 43,55 227, 293, 317sh

29 46,12 230, 268, 280sh, 328

30 47,55 269, 292sh, 328 sh = shoulder ou ombro

101

A fração BuOH-PLL01 apresentou um perfil quase idêntico ao do EHF,

porém com menos picos entre os tempos de retenção de 0-10 min. Novamente,

observa-se o pico 6 (Tabela 15) com um espectro sugestivo de uma 4-

fenilcumarina. (DANG et al., 2015). Assim como observado para o extrato, a

partir do tR = 16 min surgem picos com espectro no UV característico de

flavonoides do tipo quercetina-3-O-glicosídeo (picos 9, 13, 13, 15; Tabela 15),

mesclados com flavonoides que apresentam uma banda I indicativa de uma

flavona do tipo luteolina (picos 11 e 16). Além disso, também nota-se a

presença de picos (19, 20) com espectro sugestivo de flavonoides que

apresentam metilação ou glicosilação em 3, 4' e 5' ou ausência de oxigenação

nessas posições.


espectros no UV observados para os picos obtidos após a análise da fração

BuOH-PLL01 por CLAE-UV-DAD.


1 2,52 265

2 2,88 257, 268sh

3 3,6 257

4 7,74 243, 311

5 7,92 232, 287

6 9,58 229, 290, 343sh

7 16,55 256, 264sh, 292sh, 355

8 18,27 256, 266sh, 286sh, 354

9 18,9 256sh, 265, 352

10 19,59 266, 293, 336

11 20,97 256, 264sh, 292sh, 346

12 21,82 255, 266sh, 292sh, 354

13 22,61 254, 267sh, 355

14 23,41 232, 290, 330

15 24,11 256, 266sh, 354

16 25,18 254, 266sh, 294, 343

17 27,03 227, 266, 293, 324

18 28,37 233, 290

19 29,84 245, 268sh, 332

20 31,78 252, 266sh, 332

21 32,68 232, 257, 264, 317, 362 sh

22 36,33 243, 328

23 43,5 295, 318sh sh = shoulder ou ombro

102

6.4 Análise da fração AcOEt-PLL01 por CLAE-IES-EM (TOF)

Os cromatogramas obtidos em 340 nm nos equipamentos de CLAE-DAD

e CLAE-IES-EM (TOF) apresentaram um perfil semelhante. Por conseguinte,

os espectros de UV dos picos obtidos na análise por CLAE-UV-DAD foram

utilizados para nortear a busca de picos revelantes no cromatograma de pico

base, obtido na análise por CLAE-IES-EM (TOF), além de complementar os

dados de espectrometria de massas (Figura 12). Conforme mencionado

anteriormente, na análise por CLAE-UV-DAD a fração AcOEt-PLL01

apresentou um perfil químico complexo em flavonoides, sendo observados

picos com espectros no UV característicos de O-glicosídeos de quercetina e

canferol. Os picos equivalentes, observados no cromatograma em 340 nm

obtido com o equipamento de CLAE-IES-EM (TOF) em modo positivo, tiveram

os seus espectros de massas analisados em busca de fragmentos com relação

massa/carga (m/z) característicos dessas agliconas e de outras

estruturalmente semelhantes. Os picos foram identificados por meio da

comparação com os dados presentes na base de dados MassBank.

De acordo com as massas exatas das agliconas, obtidas na base de

dados MassBank (Tabela 16), os picos 8, 9 e 10 apresentaram fragmentos com

m/z condizentes com a aglicona quercetina, enquanto que o pico 11

apresentou um fragmento com m/z em concordância com a aglicona canferol.

Por outro lado, os picos 13, 15 e 16 apresentaram fragmentos característicos

das agliconas metoxiladas isoramnetina ou tamarixetina, isômeros de posição.

Por meio da análise das diferenças de m/z dos espectros, constatou-se

que todos apresentavam picos com uma diferença de 162 e/ou 142 unidades,

correspondendo a perdas de unidades de hexose e deoxihexose,

respectivamente. Em relação ao pico 8 do cromatograma, esse apresentou um

espectro de massas com fragmentos em 465,1046 ([M+H]+ - 146); 303,0510

([M+H]+ - 162), indicativos da perda de uma deoxihexose seguido de uma

hexose, o que permitiu identifica-lo como quercetina-3-O-rutinosídeo. Esse

composto foi posteriormente isolado e identificado por ressonância magnética

nuclear (RMN) de hidrogênio, confirmando a identidade do flavonoide. Os picos

9 e 10 apresentaram fragmentos e moléculas protonadas com massa quase

idêntica, sendo identificados inicialmente como os isômeros quercetina-3-O-

103

galactosídeo ou quercetina-3-O-glicosídeo. Porém, com base num estudo

acerca de flavonoides de espécies do gênero Ziziphus (PALOWSKA et al.,

2009) quercetina-3-O-galactosídeo apresenta um tR menor em relação ao seu

isômero quercetina-3-O-glicosídeo. Assim, sugere-se que os picos 9 e 10

sejam, respectivamente, quercetina-3-O-galactosídeo e quercetina-3-O-

glicosídeo. O pico 11 do cromatograma, que havia apresentado um espectro no

UV característico de um derivado glicosilado de canferol (IWASHINA;

MATSUMOTO, 2013), exibiu um espectro de massas com fragmentos em

449,1080 ([M+H]+ - 146); 287,0555 ([M+H]+ - 162), indicativos da perda de uma

deoxihexose seguido de uma hexose. Assim, foi identificado como canferol-3-

O-rutinosídeo. Outra possibilidade, de acordo com os dados do MassBank,

seria o canferol-3-O-neohesperidosídeo, porém, de acordo com os dados de

RMN 1H que serão apresentados posteriormente, o deslocamento químico e a

constante de acoplamento do dubleto referente ao hidrogênio de carbono

anomérico da ramnose corroboram para uma ligação glicosídica entre esse

com o carbono 6' da glicose (KAZUMA; NODA; SUZUKI, 2003). O pico 13

também apresentou fragmentos sugestivos da perda de uma unidade de

deoxihexose e hexose, sendo identificado como isoramnetina-3-O-rutinosídeo,

podendo também corresponder a seu isômero tamarixetina-3-O-rutinosídeo. Os

picos 15 e 16, por sua vez, são derivados monoglicosilados da isoramnetina ou

tamarixetina, e ambos foram identificados como isoramnetina-3-O-glicosideo ou

tamarixetina-3-O-glicosideo, com base nos dados do MassBank. Porém, por

possuírem tempos de retenção distintos e de acordo com a ordem de eluição

reportada na literatura (SCHIEBER et al., 2002), pode-se sugerir que o pico

15 seja isoramnetina/tamarixetina-3-O-galactosideo, e o pico 16

isoramnetina/tamarixetina-3-O-glicosídeo.

104

Tabela 16 - Dados cromatográficos, espectroscópicos (UV) e de espectrometria de massas dos principais flavonoides encontrados

na fração AcOEt-PLL01.

Identificação Pico tR(min) λmax(nm)* [M+H]+ (m/z) Fragmentos [M+H]+ (m/z) MassBank

Registro no MassBank

Quercetina-3-O-rutinosídeo 8 18,0 257, 266sh, 358 611,1620 465,1046 ([M+H]+ - 146); 303,0510 ([M+H]+ - 162); 147,0446 ([M+H]+ - 156)

611,1593 FIO00588

Quercetina 3-O-galactosídeo 9 20,0 256, 266, 294, 354 465,1039 303,0506 ([M+H]+ - 162) 465,1033 FIO00150

Quercetina 3-O-glicosídeo 10 20,6 256, 261sh, 292sh, 347 465,1042 303,0508 ([M+H]+ - 162); 177,0559 ([M+H]+ - 126 )

465,1073 TY000218

Canferol-3-O-rutinosídeo 11 21,4 264, 291, 344 595,1663 449,1080 ([M+H]+ - 146); 287,0555 ([M+H]+ - 162);

595,1658 FIO00728

Isoramnetina-3-O-rutinosídeo ou tamarixetina-3-O-rutinosídeo

13 23,8 255, 266sh, 295sh, 354 625,1764 479,1179 ([M+H]+ - 146); 317,0666 ([M+H]+ - 162); 245,1393 ([M+H]+ - 72)

625,1838 PR020050

Isoramnetina-3-O-galactosídeo ou tamarixetina-3-O-galactosídeo

15 26,3 255, 267sh, 278sh, 353 479,1182 317,0657 ([M+H]+ - 162) - -

Isoramnetina-3-O-glicosideo ou tamarixetina3-O-glicosideo

16 27,5 254, 266sh, 297sh, 353 479,1184 317,0658 ([M+H]+ - 162) 479,1349 PR020049

*Dados obtidos na análise por CLAE-UV-DA

105

Figura 12 - Comparação entre os cromatogramas obtidos para a fração AcOEt-

PLL01 nos equipamentos de CLAE-UV-DAD e CLAE-EM-TOF, sob o

comprimento de onda de 340 nm.

A = cromatograma obtido por CLAE-UV-DAD. B = cromatograma obtido por CLAE-EM-TOF, com os picos de interesse numerados conforme o cromatograma anterior. Fonte: autor

A

8

9

10

11

13

15

16 B

106

Na análise por CLAE-UV-DAD do EHF, fração AcOEt-PLL01 e a fração

BuOH-PLL01, observou-se que os picos com tempo de retenção entre 16 e 25

minutos constituem os flavonoides com maior intensidade de absorção no

espectro de UV, ou seja, os flavonoides majoritários. Portanto, esses são

possíveis candidatos a marcadores químicos (Li et al., 2008) das folhas da

espécie Ziziphus joazeiro Mart.. Conforme será discutido adiante, objetivou-se

isola-los e, por técnicas espectroscópicas, caracteriza-los.

Em resumo, o EHF de Ziziphus joazeiro Mart., de acordo com as análises

por reações clássicas, CCD, CLAE-UV-DAD e CLAE-IES-EM (TOF), possui

ácidos fenólicos, cumarinas, saponinas e flavonoides, principalmente derivados

de quercetina e canferol, tanto na forma livre quanto na forma glicosilada.

Conforme mencionado anteriormente, foi reportado um estudo em que

identificou-se flavonoides e ácidos fenólicos por CLAE-UV-DAD no extrato das

folhas da espécie Ziziphus joazeiro Mart., incluindo rutina, isoquercetina,

quercetina, canferol, ácido cafeíco, ácido clorogênico e ácido elágico (BRITO et

al., 2015). No presente estudo, além de se identificar rutina e isoquercetina por

CLAE-IES-EM (TOF), foram identificados canferol-3-O-rutinosideo (nicotiflorina) e

glicosídeos de isoramnetina ou tamarixetina.

Com relação a outras espécies do gênero Ziziphus, foi reportada a

presença de flavonoides em diferentes partes, incluindo folhas, sementes e frutos.

Os flavonoides pertenciam a diferentes classes, principalmente flavonóis livres e

O-glicosideos de quercetina, mas também flavonas livres, metoxiladas e C-

glicosiladas, além de chalconas (CHENG et al., 2000; GUO et al., 2011;; LI et al.,

2013; MACIUK et al., 2003; NAWWAR et al., 1984; PELOTTO e MARTINEZ,

1993; PAWLOWSKA et al., 2009; ZHANG et al., 2014). Nos estudos que

utilizaram as folhas como material vegetal, os flavonóis predominam, sendo

relatada a presença principalmente de derivados glicosilados de quercetina e, em

menor proporção, de canferol (GUO et al., 2011; MACIUK et al., 2003; NAWWAR

et al., 1984; PELOTTO e MARTINEZ, 1993; ZHANG et al., 2014). Cabe destacar

que, especificamente com EHF de Z. joazeiro Mart., a presença de canferol-3-O-

rutinosideo (nicotiflorina) e dos derivados glicosilados de isoramnetina ou

tamarixetina é descrita pela primeira vez para a espécie neste trabalho.

107

Logo, os flavonóis, principalmente derivados de quercetina, possuem

hegemonia em diferentes partes das espécies de Ziziphus, incluindo as folhas,

sendo o mesmo observado por CCD e CLAE-UV-DAD para o EHF de Ziziphus

joazeiro Mart..

As saponinas igualmente constituem uma classe de metabólitos

predominante nas espécies do gênero Ziziphus, em que Ziziphus jujuba Mill e sua

variedade, denominada spinosa, se destacam entre os trabalhos publicados sobre

o tema. As primeiras saponinas do gênero, jujubosídeo A e B, dois heterosídeos

triterpênicos com núcleo damarano denominado jujubogenina, foram isoladas das

sementes de Ziziphus jujuba (OTSUKA et al., 1978). Posteriormente, foram

isoladas das sementes dessa espécie novas saponinas derivadas da

jujubogenina, denominadas jujubosídeos D e E, as quais contem uma cadeia

glicídica, ligada ao carbono 3, com 5 e 6 unidades osídicas, respectivamente (YU;

WANG; HU, 2014).

As cumarinas não constituem uma classe amplamente distribuída em

Ziziphus, sendo reportada apenas em Ziziphus rugosa (raízes) a presença de

uma cumarina, a escopoletina (KAENNAKAM et al., 2013). Consequentemente,

as substâncias observadas por CLAE-UV-DAD, com espectro no UV

característico de cumarinas, podem ser úteis como marcadores

quimiotaxonômicos da espécie.

108

6.5 Fracionamento das frações BuOH-PLL01 e AcOEt-PLL01 por

cromatografia em contra-corrente de alta velocidade e isolamento de

flavonoides

Previamente ao uso do equipamento de CCCAV, foram realizados testes

em tubos de ensaio a fim de selecionar sistemas de solventes para serem

utilizados na separação. Primeiramente, de acordo com a literatura, foram

testados sistemas de solventes pertencentes à família acetato de etila-butanol-

água, passando para sistemas contendo hexano-acetato de etila-metanol-água,

hexano-acetato de etila-butanol-água, a sistemas contendo clorofórmio e

acetonitrila. Basicamente, foram realizadas modificações nos denominados

modificadores orgânicos e aquosos desses sistemas, sendo o hexano e butanol

modificadores orgânicos, e o metanol um modificador aquoso. Logo, a função do

hexano seria a de tornar a fase orgânica mais apolar, a do butanol seria a de

torna-la mais polar, enquanto que a do metanol, tornar a fase aquosa mais apolar

(COSTA; LEITÃO, 2010). Foram testados e analisados por CCD 42 sistemas de

solventes, sendo os mais promissores os sistemas contendo acetato de etila-

butanol-água.

Figura 13 - Análise por CCD das fases dos testes em tubos para os sistemas

contendo acetato de etila-butanol-água.

Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:ácido metanol:água (100:15:6:15,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F25. Detecção: Reagente Natural A/UV 365 nm. S = fase superior; I = fase inferior.

Fonte: autor

109

A partir da figura 13, pode-se observar que o aumento gradativo na

quantidade de butanol promoveu, na fase orgânica (superior), um aumento na

intensidade e quantidade de manchas com Rf < 0,5, ou seja, ocorreu uma maior

distribuição da amostra para a fase orgânica, ao passo em que o contrário

ocorreu para a fase aquosa (inferior). Dentre os sistemas testados, foi escolhido o

sistema 4, contendo AcOEt:BuOH:H2O 1:0,4:1, para a realização das separações

1, 4 e 5 por CCCAV em fase reversa (Figuras 14, 15 e 16), pois, aparentemente,

apresentou-se como um sistema com intermediária retenção da amostra. Assim,

foi proposto que o sistema 4 poderia permitir a distribuição gradativa dos

compostos mais polares para a fase aquosa, pois além dos flavonoides

majoritários era de interesse o isolamento de saponinas, que podem estar

relacionadas à atividade antifúngica observada para a fração BuOH-PLL01.

Posteriormente, com base numa consulta na literatura, foi realizado um

fracionamento por CCCAV envolvendo uma mudança de pH no sistema (Figura

15). Na fase orgânica, utilizada como estacionária, foi adicionado ácido fórmico,

enquanto que na fase aquosa, utilizada como fase móvel, foi adicionado amônia.

A função do ácido foi a de promover a retenção dos compostos com base em seu

pKa, e a da base a de promover a eluição desses a medida em que a sua

concentração aumentava na fase móvel (XU; LUO;KONG, 2013). De acordo com

o resultado por CCD, observou-se que o uso da técnica de refinamento por zona

de pH tornou a separação 6 (Figura 17) mais diferenciada e eficiente em relação

às separações 1, 4 e 5 (Figuras 14, 15 e 16), apesar de todas possuírem a fase

aquosa como fase móvel.

Embora tenha ocorrido uma melhora na separação dos compostos, o

rendimento dos flavonoides de interesse foi insatisfatório para a fração BuOH-

PLL01, em torno de 50 mg a cada procedimento. Assim, foi realizada uma nova

separação por CCCAV a partir de 1,5 g da fração AcOEt-PLL01, também

concentrada em flavonoides. Essa nova separação foi denominada CCCAV11

(Figura 18).

110

Figura 14 - Análise por CCD das frações da separação CCCAV1.

Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:água (100:12:12, v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: A - vanilina sulfúrica/aquecimento; B – Reagente Natural A/UV 365 nm.

Numeração: refere-se às frações reunidas Fonte: autor


Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:água (100:12:12, v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: A - vanilina sulfúrica/aquecimento; B – UV 254 nm; C – Reagente Natural A/UV

365 nm. Numeração: refere-se às frações reunidas. Fonte: autor




111







112

A fração 12-CCCAV11, por apresentar um rendimento satisfatório e conter

os flavonoides majoritários observados por CLAE, foi escolhida para dar

continuidade ao processo de isolamento. Assim, essa fração foi submetida a uma

coluna de fase reversa, resultando em 10 frações após a reunião. A fração 08-

CCFR2 foi submetida a uma separação por CLAE semipreparativa, resultando em

4 frações, as quais foram analisadas por CLAE analítica. A fração 02-CLAESP

apresentou dois picos no cromatograma, sendo submetida a um novo processo

de CLAE semipreparativa, utilizando as mesmas condições cromatográficas da

separação anterior. A análise dos espectros de RMN de 1H obtidos, juntamente

com os dados de CLAE e CCD analítica, permitiu concluir a presença de 3

flavonoides semi purificados, nomeados de ZJF1 (3,3 mg), ZJF2 (1,5 mg) e ZJF3

(1,4 mg), além de 2 misturas de flavonoides, nomeadas de ZJFM1 (4,7 mg) e

ZJFM2 (0,9 mg). A mistura ZJFM1 consiste em dois flavonoides, um não

identificado e o outro predominantemente ZJF3, segundo dados de RMN de 1H e

CCD. Enquanto isso, a mistura ZJFM2 consiste em uma combinação dos mesmos

flavonoides, porém com predominância do não identificado, de acordo com a

análise por CCD (Figura 19).

Figura 19 - Análise por CCD dos flavonoides ZJF1, ZJF2, ZJF3 e das misturas

ZJFM1 e ZJFM2.

Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:ácido acético:água (100:10:10:26,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: Reagente Natural A/UV 365 nm. Amostras: EHF; flavonoides ZJF1

ZJF2 e ZJF3; misturas ZJFM1 e ZJFM2.

113

6.5.1 Análise estrutural do flavonoide ZJF1

O isolado ZJF1, após análise por CCD e revelação com o Reagente

Natural A/UV 365 nm, apresentou uma mancha laranja de valor de Rf 0,55 (figura

19), sugestivo de um flavonoide glicosilado contendo duas hidroxilas adjacentes

no anel B (WAGNER e BLADT, 2001).

Após a análise por CLAE, a substância apresentou um espectro de UV

característico de flavonoide (Figura 20), com 2 máximos de absorção (UV max:

257, 354; figura 23) referentes às bandas I (anel A) e II (anel B), a presença de

bandas IIa e IIb, característica de oxigenação em 3’ e 4’ e um tempo de retenção

de 22,79 min. Assim, sugere-se que a substância seja a princípio um flavonol

3’,4’-dioxigenado com glicosilação em C-3 (MABRY; MARKHAM, THOMAS;

1970). Somando os dados da análise por CCD e UV, essa substância

possivelmente corresponde a um flavonol 3’,4’ dihidroxilado com a posição 3

glicosilada. Além disso, de acordo com a literatura, ZJF1 apresenta um espectro

no UV característico do flavonol quercetina-3-O-rutinosídeo (rutina) (MABRY;

MARKHAM; THOMAS; 1970; MOURA; VILEGA, SANTOS, 2011).

114

Figura 20 – Cromatograma e espectro no UV do flavonoide ZJF1.

Ab

so

rbân

cia

(A

U)

Comprimento de onda (nm)

(nm)

Coluna: C8 Waters, 4,6 x 150 mm, 5 µm. Eluente: gradiente de acetonitrila:água (8:92-34:66, v/v). Fluxo: 0,8

mL/min. Tempo: 55 min. Detecção: UV 340 nm. Fonte: autor

115

Para concluir a caracterização, a substância ZJF1 foi analisada por RMN

de 1H (400 MHz, metanol-d4; Figura 22; Tabela 17). Por meio da análise dos

sinais na região dos prótons aromáticos (6-8 ppm) é possível observar, em um

campo mais alto (δH 6-6,5) a presença de dois singletos com deslocamentos

químicos de 6,24 e 6,44 ppm respectivamente, indicativos de hidrogênios nas

posições 6 e 8 do anel A e característico de um padrão de substituição 5,7

dihidroxilado (MABRY, MARKHAM, THOMAS, 1970). Além disso, há a ausência

de um singleto na faixa de δH 6,30 - 6,60, característico de H-3 do anel C, o que

permite inferir que essa posição está substituída. Na região mais desblindada,

devido ao efeito mesomérico retirador de elétrons da carbonila em C4, observa-se

os sinais característicos de hidrogênios do anel B. Inicialmente, observa-se um

dubleto em δH 6,89, indicativo de H5', apresentando acoplamento em orto (J =

8,39 Hz) com o H-6'. Em campo mais baixo, observa-se um duplo dubleto em δH

7,62 e um dubleto em δH 7,89. O duplo dubleto (δH 7,62; J = 1,2; 8,39 Hz) é

indicativo de H-6' devido à presença de acoplamento orto e meta com os

hidrogênios H-5' (orto) e H-2' (meta). O dubleto pode ser atribuído ao H-2' por

apresentar acoplamento meta (J = 1,2 Hz) com o H-6'. Portanto, os sinais

observados na região dos prótons aromáticos corroboram com a possibilidade de

um núcleo flavônico do tipo 5,7,3,4',3' pentasubstituído. Por meio de comparação

com dados da literatura (KAZUMA; NODA; SUZUKI, 2003) sugere-se que a

substância ZJF1 seja um flavonol do tipo quercetina (Figura 21).

Figura 21 - Representação estrutural do flavonol quercetina.

OH

OOH

OH O

OH

OH

1'

2'3'

4'

5'

6'

34

1056

8

7

9

2

116

Na análise do espectro em campo mais alto, pode-se observar,

respectivamente, um dubleto e um singleto numa região característica de

hidrogênios de carbono anomérico (MABRY, MARKHAM, THOMAS, 1970). Com

base na literatura, o dubleto apresenta deslocamento químico e constante de

acoplamento característicos de hidrogênio de carbono anomérico de glicose (δH

5,10; J = 7,7 Hz). Enquanto isso, o singleto em δH 4,51 pode ser atribuído ao

hidrogênio de carbono anomérico de ramnose. A presença de um dubleto em

região mais protegida (δH 1,11; J = 6,1 Hz), característico de sinal de metila de

ramnose, corrobora para a presença desse tipo de hexose. Na região entre δH

3,37 - 3,9 também é possível observar sinais sobrepostos referentes a

hidrogênios de açucares. Portanto, com base nos dados espectrais de RMN,

dados espectrais de UV, comparação com dados da literatura e análise por CCD

envolvendo comparação com o padrão comercial de rutina, pode-se concluir que

a substância ZJF1 corresponde a quercetina-3-O-rutinosídeo (rutina). Além disso,

foi observado na analise por espectrometria de massas um pico com fragmentos

característicos desse flavonoide, corroborando para esse achado.

O flavonol rutina é amplamente distribuído entre as espécies de Ziziphus,

incluindo Ziziphus mauritiana (frutos), Ziziphus spina-christi (folhas e frutos),

Ziziphus jujuba Mill. e Ziziphus jujuba variedade spinosa (folhas e frutos), Ziziphus

lotus (folhas) e Ziziphus mistol (folhas). Embora rutina aparentemente não possua

valor como marcador quimiotaxonômico, esse ainda pode ser utilizado como

marcador analítico para a quantificação de flavonoides totais e no

desenvolvimento e monitorização da eficiência de técnicas extração de

flavonoides, conforme exemplificado no trabalho de Zhang et al. (2014).

117

Tabela 17 - Dados espectrais de RMN 1H (400 MHz, metanol-d4) do flavonoide

ZJF1.

Atribuição δH (ppm); multiplicidade; J (Hz)

ZJF1

rutina (KAZUMA; NODA; SUZUKI, 2003)

Aglicona

H-6 6,24 (s) 6,21 (d; 2,0)

H-8 6,44 (s) 6,40 (d; 2,0)

H-5' 6,89 (d; 8,4) 6,87 (d; 8,5)

H-6' 7,62 (dd; 1,2; 8,4) 7,62 (dd; 2,1; 8,5)

H-2' 7,89 (d; 1,2) 7,66 (d; 2,1)

3-glicosil H-1'' 5,09 (d; 7,8) 5,10 (d; 7,7)

6'-ramnosil H-1'' 4,55 (s) 4,51 (d; 1,5)

H-6'' (-CH3) 1,21 (d; 6,2) 1,11 (d; 6,1) s = singleto, d = dubleto, dd = duplo dubleto.

118

H-2’

H-6’H-5’

H-8

H-6

H-1’’

H-1’’’

H-6’’’

O

O

O

O

OOH

OH O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

1'

2'3'

4'

5'

6'

34

1056

8

7

9

1''

2''

3''4''

5''

6''1'''

2'''3'''

4'''

5'''

6'''

2

Figura 22 - Espectro ampliado de RMN 1H do flavonoide ZJF1 (400 MHz, metanol-d4).

Fonte: autor

119


A análise por CCD desse flavonoide evidenciou uma mancha de valor de

Rf 0,62, indicativo da presença de açúcar conjugado à molécula, conforme a

polaridade da fase móvel utilizada. Após a revelação com o Reagente Natural A e

visualização sob luz UV a 365 nm, a mancha apresentou coloração verde (Figura

19), que sugere tratar-se de um flavonoide com núcleo 4’ hidroxilado (WAGNER e

BLADT, 2001).

Na análise por CLAE, foi observado um tempo de retenção de 28,1 min e

um espectro no UV com máximos de absorção característicos (UV max: 266, 345)

de uma flavona ou flavonol substituido em C-3 (Figura 23). A presença de uma

única banda II e de um ombro entre 280 e 310 nm é indicativo de um núcleo com

hidroxilação em C-4’ e C-7, porém não em C-3’, possibilidade essa corroborada

pelo aspecto da mancha na CCD e devido ao deslocamento hipsocrômico da

banda I em relação à substância ZJF1. Uma vez que flavonas com hidroxilação

em C-4’, como apigenina, apresentam um máximo de absorção da banda II menor

que 340 nm, sugere-se que ZJF2 possua oxigenação em C-3 (MABRY;

MARKHAM, THOMAS; 1970). Associando os dados de UV com o comportamento

cromatográfico da amostra, essa substância possivelmente corresponde a um

flavonol com ausência de hidroxilação em C-3’ e com glicosilação em C-3. A

comparação dos dados espectrais no UV desse flavonoide com a literatura

(IWASHINA; MATSUMOTO, 2013) sugere tratar-se do canferol-3-O-rutinosídeo.

120

Figura 23 - Cromatograma e espectro no UV do flavonoide ZJF


Coluna: C8 Waters, 4,6 x 150 mm, 5 µm. Eluente: gradiente de acetonitrila:água (8:92-34:66, v/v). Fluxo: 0,8

mL/min. Tempo: 55 min. Detecção: UV 340 nm.. Fonte: autor. A

bs

orb

ân

cia

(A

U)

121

O espectro de RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) apresentou sinais

característicos de núcleo flavonoídico na região dos hidrogênios aromáticos

(Tabela 18 e Figura 24). Pode-se observar sinais correspondentes aos

hidrogênios 6 (δH 6,23; d, J = 1,6 Hz) e 8 (δH 6,43; s) do anel A e sugestivos de

um padrão de substituição 5,7 dihidroxilado. A ausência de sinal referente ao H-3

permite sugerir substituição em C-3. Em campo mais baixo, na região dos

hidrogênios do anel B (δH 6,5 – 8), é evidente a presença de um par de dubletos

em δH 6,11 e δH 8,11, ambos com acoplamento em orto (J = 8,7 Hz),

característico de um anel aromático para-disubstituído. No caso de flavonoides,

esse comportamento é típico de um anel B oxigenado em C-4’, em que o dubleto

na região mais blindada corresponde aos hidrogênios H-3 e H-5’, devido ao efeito

mesomérico protetor da hidroxila livre em C4’, enquanto que o dubleto em campo

mais baixo corresponde aos hidrogênios H-2’ e H-6’, estando mais desprotegidos

devido ao efeito mesomérico da carbonila em C4 (MABRY; MARKHAM,

THOMAS; 1970).

Em campo mais alto, é evidente a presença de dois sinais de hidrogênio de

carbono anomérico, o primeiro sendo um dubleto (δH 5,05; J = 7,8 Hz), que pode

ser atribuído ao hidrogênio H-1’’ de uma molécula de glicose e o segundo um

singleto em δH 4,54, que se pode atribuir ao hidrogênio H-1’’’ de uma molécula de

ramnose Também foi observado um intenso dubleto em região mais protegida (δH

1,20; J = 6,2 Hz), que corresponde ao radical metila da ramnose.

Baseado nos dados espectrais de UV e RMN de 1H do presente estudo e

da literatura, além do resultado observado na análise da fração AcOEt-PLL01 por

espectrometria de massas, sugere-se que ZJF2 seja canferol-3-O-rutinosídeo,

denominado nicotiflorina, o qual foi previamente identificado nos frutos de Z.

jujuba e Z. spina-christi (PAWLOWSKA et al., 2009) porém nunca foi antes

reportado na literatura para a espécie Z. joazeiro Mart..

O flavonoide nicotiflorina foi identificado em Z. jujuba Mill. var. spinosa. De

acordo com pesquisa na base de dados Scifinder, há 12 registros da presença

desse flavonoide em espécies do gênero. Logo, observa-se que a sua distribuição

entre as espécies é mais limitada em relação ao flavonol rutina, sendo portanto

um possível candidato a marcador quimiotaxonômico.

122

Tabela 18 - Dados espectrais de RMN 1H (400 MHz, metanol-d4) do flavonoide ZJF2.

Atribuição δH (ppm); multiplicidade; J (Hz)

ZJF2

Nicotiflorina (KAZUMA; NODA; SUZUKI, 2003)1

Aglicona

H-6 6,23 (d; 1,6) 6,21 (d; 1,8)

H-8 6,43 (s) 6,40 (d; 1,8)

H-5' 6,91 (d; 8,7) 6,89 (d; 9,0)

H-3' 6,91 (d; 8,7) 6,89 (d; 9,0)

H-6' 8,11 (d; 8,7) 8,05 (d; 9,0)

H-2' 8,11 (d; 8,7) 8,05 (d; 9,0)

3-glicosil H-1'' 5,05 (d; 7,8) 5,12 (d; 7,3)

6''-ramnosil

H-1'' 4,54 (s) 4,51 (d; 1,5)

H-6'' (-CH3) 1,20 (d; 6,2) 1,11 (d; 6,2) 1 400 MHz, CD3OD

123

H-2’/H-6’ H-3’/5’

H-8

H-6

H-1’’

H-1’’’

H-6’’’

O

O

O

O

OOH

OH O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

1'

2'3'

4'

5'

6'

34

1056

8

7

9

1''

2''

3''4''

5''

6''1'''

2'''3'''

4'''

5'''

6'''

2

Figura 24 - Espectro ampliado de RMN 1H do flavonoide ZJF2 (400 MHz, metanol-d4).

Fonte: autor

124


Após a análise por CCD e detecção com o Reagente Natural A/UV 365 nm,

a substância ZJF3 apresentou uma mancha verde e de mesmo valor de Rf 0,62

(Figura 19) que o flavonoide ZJF2. Logo, ZJF3 possivelmente apresenta um

núcleo com hidroxilação em C-3’ ou C-4’ (WAGNER e BLADT, 2001).

A análise por CLAE revelou um pico com tempo de retenção de 29,99 min

e máximos de absorção no espectro de UV (UV max : 255 e 354) característicos

de um flavonol substituído em C-3 (Figura 26). A presença de uma banda II

duplicada indica uma maior oxigenação no anel B, sendo seu espectro compatível

com o do flavonoide rutina (MABRY; MARKHAM; THOMAS; 1970; MOURA;

VILEGA, SANTOS, 2011). Porém, com base no resultado da CCD, esse

flavonoide apresenta um anel B monohidroxilado e não dihidroxilado como o do

flavonol rutina. Uma hipótese seria a de que haveria outro substituinte oxigenado,

que não uma hidroxila, ligado nas posições C-3’ ou C-4’. Segundo Wagner e Bladt

(2001), um possível núcleo flavonoídico que apresenta fluorescência verde após

detecção com Reagente Natural A/UV 365 nm, além de um anel B dissubstituído

e monohidroxilado, seria quercetina-3’-metil éter ou isoramnetina. Seu

diglicosídeo, isoramentina-3-O-rutinosídeo, apresenta fluorescência verde e valor

de Rf próximo ao do flavonoide rutina.

O espectro de RMN de 1H de ZJF3 (400 MHz, metanol-d4) apresentou

semelhança com o espectro do flavonoide ZJF1 (Figura 27 e Tabela 19). É

possível observar dois dubletos com acoplamento meta, relativos aos hidrogênios

6 (δH 6,23; J = 1,8 Hz) e 8 (δH 6,44; J = 1,4 Hz) do anel A e a ausência de sinal

referente ao hidrogênio 3 do anel C. Em campo mais baixo, observa-se os sinais

relativos aos hidrogênios do anel B, com um dubleto com acoplamento orto em δH

6,93 (J = 8,4 Hz), característico de H-5’, um duplo dubleto (acoplamento orto e

meta) característico de H-6’ em δH 7,62 (J = 1,7; 8,4 Hz) e em δH 8,05 um dubleto

com acoplamento meta (J = 1,8 Hz) o qual pode ser atribuído ao H-2’.

Em campo mais alto, observa-se a presença de dois sinais de hidrogênio

de carbono anomérico. O primeiro é um dubleto (δH 5,25; J = 7,8 Hz), indicativo

de H-1’’ de uma molécula de glicose e o segundo um dubleto em δH 4,55 (J = 1,0

Hz), indicativo de H-1’’’ de uma molécula de ramnose. A presença de um intenso

125

dubleto em região mais protegida (δH 1,19; J = 6,2 Hz) e com integração para 3

hidrogênios corrobora para a presença desse açúcar.

Com base nos dados espectrais de UV e de RMN de 1H, é possível sugerir

que ZJF3 possua um núcleo do tipo quercetina, com substituição em C-3 por uma

rutinose. Porém, no espectro de RMN de 1H, ainda há a presença de um singleto

intenso em δH 3,99 com integração para 3 hidrogênios, sugestivo de um radical

metoxila, o qual pode estar substituindo um hidrogênio nas posições 5, 7, 3’ ou 4’.

Uma vez que o flavonoide, após análise por CCD, apresentou fluorescência

verde, característico de um anel B monohidroxilado, um espectro de UV sugestivo

de um padrão de oxigenação em C-3’ e C-4’ e devido à ausência de sinais

referentes aos hidrogênios 3’ e 4’, é reforçada a hipótese de que há outro

substituinte oxigenado em algumas dessas posições. Neste caso, baseado nos

dados de RMN de 1H, esse substituinte seria uma metoxila, a qual estaria ligada

aos carbonos 3’ ou 4’ do anel B, de modo a preservar uma hidroxila livre em uma

dessas posições e a consequentemente permitir o surgimento de fluorescência

verde após detecção com Reagente Natural A/UV 365 nm. Portanto, com base

nos dados do presente estudo e em comparação com os da literatura, sugere-se

que ZJF3 corresponda ao flavonoide isoramnetina-3-O-rutinosídeo ou a seu

isômero de posição, tamarixetina-3-O-rutinosídeo, ambos inéditos para a espécie

(Figura 25). A confirmação da posição da metoxila poderia ser realizada com base

em um espectro bidimensional de HMBC, porém, devido a pouca quantidade de

amostra, foi possível apenas a realização de um espectro monodimensional de

1H.

Em pesquisa realizada na base de dados SciFinder® há apenas um estudo

que relata a presença de isoramnetina-3-O-rutinosídeo no gênero Ziziphus, ainda

que por meio de técnicas com menor poder preditivo, como cromatografia em

papel e espectroscopia no UV (PELOTTO e MARTINEZ, 1993). Em contrapartida,

para o isômero tamarixetina-3-O-rutinosídeo, não há qualquer relato para o

gênero. Portanto, ambas as possibilidades estruturais são candidatas a

marcadores quimiotaxônomicos da espécie Ziziphus joazeiro Mart..

126

Figura 25 - Possibilidades estruturais para o flavonoide ZJF3.

isoramnetina-3-O-rutinosídeo tamarixetina-3-O-rutinosídeo

127

Tabela 19 - Dados espectrais de RMN 1H (400 MHz, metanol-d4) do flavonoide ZJF3 e literatura

1BENAHMED et al., 2014; 300 MHz, DMSO-d6

2HARPUT; SARACOĞLU; OGIHARA, 2004; 500 MHz, CD3OD

3XU et al., 2011; 400 MHz, DMSO-d6

Atribuição Atribuição

δH (ppm); multiplicidade; J (Hz)

ZJF3 isoramnetina-3-O-

rutinosídeo1 isoramnetina -3-O-

rutinosídeo2 tamarixetina-3-O-

rutinosídeo3

Aglicona H-6 6,23 (d; 1,8) 6,20 (d; 1,7) 6,11 (d) 6,22 (d; 1,5)

H-8 6,44 (d; 1,4) 6,43 (d; 1,7) 6,28 6,43 (d; 1,5)

H-5' 6,93 (d; 8,7) 6,5 (d; 8,5) 6,89 (d; 8,5) 7,03 (d; 8,5)

H-6' 7,62 (dd; 1,7; 8,4) 7,53 (dd; 1,7; 8,5) 7,63 (dd; 1,8; 8,5) 7,71 (dd; 1,8; 8,5)

H-2' 8,05 (d; 1,8) 7,86 (d; 1,7) 7,94 (d; 1,8) 7,50 (d; 1,8)

3' ou 4 ' -OCH3 3,99 (s) 3,83 (s) 3,94 (s) 3,85 (s)

3-glicosil H-1'' 5,25 (d; 7,8) 5,45 (d; 7,2) 5,14 (d; 7,3) 5,37 (d; 7,0)

6''-ramnosil H-1''' 4,54 (d; 1,0) 4,41 (s) 4,52 (d; 1,8) 4,40 (s)

H-6''' (-CH3) 1,19 (d; 6,2) 0,98 (d; 6,0) 1,12 (d; 6,1) 0,98 (d; 6,0)

128

Figura 26 - Cromatograma e espectro no UV do flavonoide ZJF3.


Ab

so

rbân

cia

(A

U)

Coluna: C8 Waters, 4,6 x 150 mm, 5 µm. Eluente: gradiente de acetonitrila:água (8:92-34:66, v/v). Fluxo: 0,8 mL/min. Tempo: 55 min. Detecção: UV 340 nm. Fonte: autor

129

H-2’

H-6’H-5’

H-8

H-6

H-1’’

H-1’’’

H-6’’’3’ ou 4’ O-CH3

Figura 27 - Espectro ampliado de RMN 1H do flavonoide ZJF3 (400 MHz, metanol-d4)

Fonte: autor

130

6.6 Avaliação da atividade anti-Candida do EHF de Ziziphus joazeiro Mart. e

frações

6.6.1 Atividade do EHF de Ziziphus joazeiro Mart. frente a cepas de referência

Inicialmente, foi realizada uma triagem da atividade anti-Candida do EHF de

Ziziphus joazeiro Mart. por meio da determinação da concentração inibitória mínima

(CIM). O ensaio foi executado frente a 7 cepas de referência do gênero Candida e

uma de Trichosporon asahii. Após o ensaio, observou-se que o EHF, na

concentração de 5 mg/mL, foi capaz de inibir o crescimento de quatro leveduras: C.

albicans, C. dubliniensis, C. glabrata e C. rugosa (Tabela 20).

Tabela 20 - Concentração inibitória mínima (CIM) do extrato das folhas de Z. joazeiro

Mart. frente a cepas de referência de leveduras de importância clínica.

Cepas de referência CIM

(mg/mL)

Candida albicans ATCC90028 5

Candida tropicalis ATCC13803 +*

Candida dubliniensis CBS7987 5

Candida parapsilosis ATCC22019 +

Candida glabrata ATCC2001 5

Candida krusei ATCC6258 +

Candida rugosa ATCC10571 5

Trichosporon asahii CBS 2630 + * Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada; (n = 1)

Em estudos anteriores, o infuso e uma fração butanólica concentrada em

saponinas, obtidos da casca do caule de Ziziphus joazeiro Mart., apresentaram

atividade frente a uma gama de espécies fúngicas, incluindo C. albicans, C.

guilliermondii, Cryptococcus neoformans, Trichophyton rubrum, Fonsecaea pedrosoi

e Aspergillus niger (CRUZ et al., 2007; RIBEIRO et al., 2013). Foi reportada uma

CIM de 25 µg/mL para o infuso da casca frente a C. albicans ATCC18804 (CRUZ et

al., 2007) e uma CIM de 156 µg/mL para a fração butanólica frente a C. albicans

ATCC10231.

Entretanto, o extrato aquoso das folhas, assim como o seu extrato

hidroetanólico, não apresentaram atividade em ensaios de difusão em ágar e

microdiluição frente a C. albicans, C. guilliermondii, C. krusei, C. tropicalis, C.

131

neoformans, T. rubrum e F. pedrosoi (BRITO et al., 2014; CRUZ et al., 2007; MELO

et al., 2012).

De acordo com a literatura etnobotânica, as cascas de Ziziphus joazeiro Mart.

são amplamente utilizadas pela população do Nordeste na limpeza dos dentes e

cabelos, fato que está associado à presença de saponinas, as quais possuem

caráter tensoativo. Para as folhas, também há dados acerca do seu uso

etnobotânico para as mesmas finalidades, assim como relatos da presença de

saponinas (CARTAXO; SOUZA; ALBUQUERQUE, 2010; LORENZI; MATOS, 2008;

OLIVEIRA et al., 2005).

As saponinas são substâncias anfifílicas, amplamente conhecidas por sua

ação desestabilizante sobre membranas biológicas, além de apresentarem atividade

antifúngica in vitro frente a diferentes cepas, incluindo espécies do gênero Candida

(AUGUSTIN et al., 2011; SPARG, S. G.; LIGHT, M. E.; STADEN, 2004). A exemplo

disso, saponinas esteroidais apresentaram atividade frente a C. albicans, C.

glabrata, C. krusei, Cryptococcus neoformans e Apergillus fumigatus, com CIM de 2

µg/mL frente a C. albicans e 0,4 µg/mL frente a C. neoformans (YANG et al., 2006)

Portanto, é provável que a atividade antifúngica observada para os extratos da

casca, nos estudos de CRUZ et al. (2007) e RIBEIRO et al. (2013) seja decorrente

da presença de saponinas. Por sua vez, para as folhas, que também apresentam

saponinas, não foi observada atividade segundo os critérios estabelecidos nos

estudos citados. Logo, uma hipótese que poderia explicar esse resultado é de que

as folhas apresentam saponinas, porém em um baixo teor quando comparado às

cascas.

Segundo Ríos e Recio (2005), durante a busca por extratos com atividade

antimicrobiana, deve-se evitar experimentos nos quais sejam utilizadas

concentrações maiores que 1 mg/mL. O estudo de BRITO et al. (2015), adotou o

mesmo critério para desconsiderar a atividade antifúngica do extrato hidroetanólico

das folhas de Z. joazeiro Mart. No presente estudo, essa concentração foi

extrapolada 5 vezes em relação ao recomendado por publicações anteriores. No

entanto, se o objetivo da investigação for o isolamento ou obtenção de frações

enriquecidas, deve-se atentar para a possibilidade de que as substâncias com

potencial antimicrobiano podem estar em baixa concentração no extrato, numa

quantidade insuficiente para ser detectada pelos ensaios, ou que há efeito

antagônico entre elas. Outra hipótese a ser considerada é a de que as substâncias

132

atuam sinergicamente e estão em quantidade insuficiente para eliciar um efeito

antimicrobiano. Porém, caso seja verdadeira, é possível que a atividade

antimicrobiana continue a não ser detectada após a realização de um fracionamento.

6.6.2 Atividade das frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01, BuOH-PLL01

e RA-PLL01 frente a cepas de referência

Em vista disso, prosseguiu-se o fracionamento do extrato por meio de uma

partição líquido-líquido com solventes de polaridade crescente, obtendo-se as

frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01, BuOH-PLL01 e RA-PLL01. A

partir da determinação da CIM (Tabela 21), observou-se que as cepas inibidas por

um maior número de frações foram Candida albicans, C. glabrata e C. rugosa. Com

relação à atividade das frações, a fração CH2Cl2-PLL01 foi a que inibiu o maior

número de leveduras, sendo ativa contra cepas de referência de 5 espécies. Porém,

a fração BuOH-PLL01 destacou-se por apresentar a menor CIM, frente à cepa de C.

glabrata ATCC2001, numa concentração de 0,625 mg/mL (Tabela 16). Para verificar

a reprodutibilidade desse resultado, o teste da fração butanólica frente a C. glabrata

ATCC2001 foi novamente realizado, em duplicata, sendo observado o mesmo valor

de CIM.

Tabela 21 - CIM das frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01, BuOH-PLL01

e RA-PLL01 frente a cepas de Candida.

Cepas de referência CIM (mg/mL)

EP-

PLL01 CH2Cl2-PLL01

AcOEt-PLL01

BuOH-PLL01

RA-PLL01

Candida albicans ATCC90028 +* 5 5 5 +

Candida tropicalis ATCC13803 + + + + +

Candida dubliniensis CBS7987 + + + + +

Candida parapsilosis ATCC22019 + + + + +

Candida glabrata ATCC2001 5 5 5 0,625 +

Candida krusei ATCC6258 + 5 + + +

Candida rugosa ATCC10571 + 5 5 5 +

Trichosporon asahii CBS 2630 + 5 + + + * Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada; (n = 1)

A partir desses resultados, é possível propor que a quantidade de substâncias

antifúngicas no EHF esteja numa concentração insuficiente para causar um efeito

133

semelhante ao observado para os extratos da casca. É plausível considerar que,

para a cepa de C. glabrata, o processo de partição líquido-líquido permitiu obter uma

fração (BuOH-PLL01) mais concentrada nas substâncias antifúngicas. Porém, dado

que não foi realizado a quantificação desses componentes, nem a comparação da

atividade entre cascas e folhas, não há evidências para, neste momento, comprovar

essa hipótese. Ainda assim, supondo que a hipótese da baixa concentração é

verdadeira, a fração BuOH-PLL01 foi selecionada para dar continuidade ao

fracionamento, a fim de isolar as substâncias com atividade anti-Candida.

É importante mencionar que se a cepa de C. glabrata não fosse inibida pela

fração BuOH-PLL01 e caso fosse levado em consideração os critérios de Ríos e

Recio (2005), o fracionamento não teria prosseguido. Portanto, é de fundamental

importância que, para uma triagem de atividade antimicrobiana, sejam incluídas uma

grande variedade de cepas. Além disso, conforme será evidenciado nos próximos

parágrafos, é importante aliar a esses resultados dados de análise fitoquímica das

amostras, de modo que permita a criação de hipóteses que possam direcionar o

estudo.

6.6.3 Prosseguimento do fracionamento bioguiado para a fração BuOH-PLL01

Conforme mencionado anteriormente, é de amplo conhecimento que as

saponinas apresentam atividade antimicrobiana por possuírem a habilidade de

desestabilizar a membrana plasmática de células (SPARG, S. G.; LIGHT, M. E.;

STADEN, 2004). Além disso, são frequentemente concentradas na fração butanólica

após um procedimento de partição líquido-líquido, a exemplo do estudo de Ribeiro et

al. (2013). Uma vez que foi detectada a presença de saponinas na fração BuOH-

PLL01, após o teste de formação de espuma em tubo de ensaio, e com base nas

propriedades das saponinas expostas anteriormente, hipotetizou-se que essas

seriam as substâncias responsáveis pela atividade da fração frente à levedura C.

glabrata. Além disso, foi hipotetizado que essas corresponderiam às manchas azuis

de elevada polaridade observadas na placa de CCD após revelação com vanilina

sulfúrica. É importante destacar que essas mesmas manchas apresentaram

fluorescência azul quando visualizadas, previamente à revelação, sob luz UV a 365

nm, comportamento característico de cumarinas. Assim, é possível que as manchas

azuis estejam coeluindo com esses compostos fenólicos, os quais também podem

134

apresentar atividade antifúngica (KUMAR; SAHA; SAHA, 2012; MARCONDES et al.,

2015).

Com base nessas hipóteses, objetivou-se obter frações concentradas nessas

manchas por meio de técnicas cromatográficas, para posteriormente serem testadas

biologicamente. Durante o estágio na Universidade Nacional de Colombia, foram

obtidas, a partir da fração BuOH-PLL01, frações concentradas nessas manchas, por

meio da técnica de cromatografia em contra-corrente de alta velocidade aliada ao

refinamento por zona de pH (CCCAV-pH). Essas frações foram posteriormente

purificadas em cromatografia de fase reversa do tipo C18.

O restante da fração BuOH-PLL01 (25 g), não utilizado em sua totalidade no

estágio no exterior, também foi submetido a um fracionamento a fim de isolar as

substâncias bioativas em quantidade suficiente para os ensaios biológicos. A partir

de dois processos de partição líquido-líquido foram obtidas as seguintes frações:

Fração 01-PLL02

Fração 03-PLL02

Fração 01-PLL03

Fração 02-PLL03

As frações oriundas das separações 7 e 9 por CCCAV, além das frações da

partição líquido da fração BuOH-PLL01, mencionadas anteriormente, foram testadas

frente à cepa ATCC2001 de C. glabrata pelo método de microdiluição em caldo

aliado ao método de bioautografia por revestimento de ágar, ou em inglês, agar-

overlay bioautography.

Após a realização do teste de microdiluição em caldo, observou-se que as

frações mais ativas foram aquelas que passaram por um processo de concentração

das substâncias que se apresentam como manchas azuis na CCD, após revelação

com vanilina sulfúrica. Assim, as amostras mais ativas foram as frações 09-CCFR05

e 07-CCFR07, oriundas inicialmente de frações da CCCAV-pH, além da fração

Fração 02-PLL03, a qual foi purificada por meio de partições líquido-líquido da

fração BuOH-PLL01. O teste foi realizado em duplicata e os resultados, expressos

como média e desvio padrão das réplicas, encontram-se na Tabela 22.

135

Tabela 22 - CIM de frações da fração BuOH-PLL01 frente à levedura Candida

glabrata ATCC 2001.

Amostras CIM (mg/mL)*

Fração 01-PLL02 +**

Fração 01-PLL03 +

Fração 03-PLL02 0,313 ± 0

Fração 02-PLL03 0,156 ± 0

Fração 07-CCFR07 0,117 ± 0,055

Fração 09-CCFR05 0,078 ± 0 * Média amostral ± desvio padrão amostral (n = 2) ** Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada

Figura 28 - Ensaio de microdiluição em caldo para as frações da fração BuOH-

PLL01.

A = Fração 01-PLL02. B = Fração 01-PLL03. C = Fração 03-PLL02. D = Fração 02-PLL03. F = Fração 07-CCFR07. G = Fração 09-CCFR05. Coluna 1 = Controle de esterilidade da amostra.

Coluna 2 – 9 = diluição seriada. Coluna 10, 11 e 12 = controle de viabilidade do inóculo, controle de viabilidade na presença de DMSO, controle de esterilidade do meio. Fonte: autor.

136

6.6.4 Ensaio de bioautografia para o EHF, fração BuOH-PLL01 e respectivas

subfrações ativas

Com o objetivo de corroborar os resultados observados no ensaio de

microdiluição em caldo e verificar a hipótese de que as manchas azuis tem relação

com a atividade anti-Candida, realizou-se o teste de bioautografia por revestimento

de ágar em duplicata, testando o EHF, fração BuOH-PLL01 e suas respectivas

subfrações.

A técnica de bioautografia é de grande utilidade no processo de

fracionamento biomonitorado, pois apresenta as vantagens da cromatografia em

camada delgada convencional, como baixo custo, capacidade de analisar várias

amostras simultaneamente, além de pouca quantidade de amostra necessária, ao

mesmo tempo em que se observa a atividade biológica em função da separação

promovida pela cromatografia (DEWANJEE et al., 2015).

Após a realização da bioautografia, observou-se a formação de halos de

inibição em torno da região correspondente às manchas azuis presentes, após

revelação com vanilina sulfúrica, no EHF, fração BuOH-PLL01 e frações

provenientes dessa. Observa-se que o EHF, na duplicata 1, apresentou um halo de

inibição discreto na região onde essas manchas surgem. Pode-se observar,

visualmente (Figura 29 e 30) e com base nos resultados quantitativos (Tabela 23),

que as sub-frações 09-CCFR07 e 07-CCFR07, mais concentradas nas substâncias

hipoteticamente bioativas, apresentaram um maior halo de inibição em relação às

frações menos purificadas provenientes da partição da fração BuOH-PLL01. Além

disso, a fração BuOH-PLL01 apresentou um maior halo de inibição em relação ao

EHF de Z. joazeiro Mart. Assim, conclui-se que à medida que a amostra torna-se

mais concentrada nessas substâncias, ocorre um aumento do halo de inibição,

resultado em concordância com o observado no ensaio de microdiluição em caldo.

Outro resultado relevante é a seletividade observada para a fração BuOH-

PLL01 frente a C. glabrata, uma importante espécie de Candida não-Candida

albicans, a qual é a segunda mais reportada nos estudos de infecções invasivas em

países da América do Norte e Europa (LOCKHART, 2014; YAPAR, 2014), além de

apresentar menor suscetibilidade intrínseca ao azólicos e isolados clínicos

resistentes a caspofungina, micafungina e anfotericina B já reportados

(ALEXANDER et al., 2013; CHO et al., 2014). Uma característica que difere C.

137

glabrata das demais espécies é a sua incapacidade de formar hifas (SUDBERY,

2011). Consequentemente, a ausência de algum componente, expresso apenas nas

espécies portadoras de genes associados ao estágio de hifa, pode ser a causa da

sua maior susceptibilidade a fração BuOH-PLL01 em relação às demais cepas

testadas.

Figura 29 - Bioautografia e análise por CCD do EHF de Z. joazeiro Mart. e da fração

BuOH-PLL01.

Eluente: acetato de etila:ácidofórmico:metanol:água (100:15:6:15,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Amostras: E - EHF, 200 µg; BuOH – fração BuOH-PLL01, 200 µg. A: réplica 1 da

bioautografia. B: réplica 2 da bioautografia. C: vanilina sulfúrica/aquecimento. D: UV 365 nm. E: Reagente Natural A/UV 365 nm. Fonte: autor.

138

Figura 30 - Bioautografia e análise por CCD das subfrações da fração BuOH-PLL01.

Eluente: acetato de etila:ácidofórmico:metanol:água (100:15:6:15,v/v/v/v). Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Amostras: 1 – fração 03-PLL02, 100 µg; 2 – fração 02-PLL03, 100 µg; 3 – fração 09-

CCFR05, 100 µg; 4 – fração 07-CCFR07, 100 µg; 5 – fração 01-PLL02, 100 µg; 6 – 01-PLL03, 100 µg. A: réplica 1 da bioautografia. B: réplica 2 da bioautografia. C: vanilina sulfúrica/ aquecimento. D:

UV 365 nm. E: Reagente Natural A/UV 365 nm. Fonte: autor.

Tabela 23 - Estatística descritiva das áreas relativas aos halos de inibição

observados após o teste de bioautografia.

Amostras Média (pixel2) DPa CVb

EHF* 2024,00 2862,37 141,42

Fração BuOH-PLL01 26624,50 289,21 1,09

Fração 03-PLL02 ** 2704,00 3824,03 141,42

Fração 02-PLL03 10978,00 248,90 2,27

Fração 09-CCFR05 32890,00 9927,78 30,18

Fração 07-CCFR07 32345,00 4569,32 14,13 a: desvio padrão da duplicata b: coeficiente de variação da duplicata * 200 µg de amostra para extrato e fração butanólica ** 100 µg de amostra para as frações da fração butanólica

1 – fração 03-PLL02, 100 µg;

2 – fração 02-PLL03, 100 µg;

3 – fração 09-CCFR05, 100 µg;

4 – fração 07-CCFR07, 100 µg;

5 – fração 01-PLL02, 100 µg;

6 – fração 01-PLL03, 100 µg.

139

6.6.5 Avaliação da atividade antifúngica das frações 07-CCFR07 e 10-CCFR12

frente a cepas de referência segundo o método do CLSI

Após obter evidências de que as referidas manchas azuis, observadas na

CCD, causam a inibição do crescimento de C. glabrata ATCC2001, foi realizado um

fracionamento da fração 02-PLL03, por diferentes processos cromatográficos, a fim

de isolar essas substâncias bioativas. Desse processo, não foi possível obter

substâncias isoladas em quantidade suficiente para a realização de testes

biológicos, porém foi possível obter uma fração, que se apresentou como uma única

mancha azul após análise por CCD e revelação com vanilina sulfúrica, com pureza e

quantidade suficiente para análises estruturais por ressonância magnética nuclear

(RMN). Conforme será descrito na seção posterior, foram realizadas análises por

RMN monodimensional e bidimensional, que possibilitaram a identificação de uma

saponina com núcleo damarano, equivalente ao da jujubogenina. Detalhes da

elucidação estrutural são apresentados no item 6.7. Assim, esse resultado corrobora

com a hipótese de que as manchas azuis são saponinas.

Além disso, a partir desse fracionamento, foram obtidas frações concentradas

em manchas que apresentam cor amarela na CCD, após revelação com vanilina

sulfúrica, e fluorescência azul sob visualização com luz UV a 365 nm, característico

de cumarinas.

A partir da fração 07-CCFR07, enriquecida em saponinas e de rendimento

satisfatório, e da fração 10-CCFR12, concentrada nas hipotéticas cumarinas, foi

realizado um novo teste de microdiluição em caldo RPMI-1640, utilizando um leque

maior de microorganismos. As amostras foram testadas frente às 8 cepas de

referência de Candida spp e T. asahii., com o objetivo de averiguar se a atividade da

fração 07-CCFR07 se estenderia para as outras cepas, ao mesmo tempo em que se

avaliaria a possibilidade de as hipotéticas cumarinas também contribuírem para o

efeito antifúngico.

A fração 10-CCFR12, dentro do intervalo de concentração e do critério para a

determinação da CIM utilizados, não foi capaz de inibir qualquer uma das 8 cepas de

referência. Por outro lado, a fração 07-CCFR07, além de inibir o crescimento de C.

glabrata, foi capaz de inibir o crescimento de C. albicans, C. dubliniensis, C.

parapsilosis, C. rugosa e T. asahii com baixas CIMs. A média da CIM para C.

albicans e C. glabrata foi equivalente (94 µg/mL), assim como entre C. dubliniensis e

140

C. parapsilosis (CIM = 188 µg/mL), e entre C. rugosa e T. asahii (CIM = 125 µg/mL)

(Tabela 24; Figura 31)

Após a observação da CIM, a concentração fungicida mínima (CFM) foi

determinada por meio do repique em ASD do conteúdo dos poços que não

apresentaram crescimento visível. As cepas de Candida rugosa ATCC10571 e

Trichosporon asahii CBS2630 apresentaram CFM correspondente a CIM, o que

significa dizer que a concentração de 125 µg/mL apresentou efeito fungicida frente a

essas duas cepas. Em contrapartida, para C. albicans ATCC90028, C. dubliniensis

CBS7987, C. parapsilosis ATCC22019 e C. glabrata ATCC2001, a CIM apenas foi

capaz de apresentar efeito fungistático, porém em concentrações superiores

apresentou efeito fungicida.

Tabela 24 - CIM e CFM da fração 07-CCFR07 testada frente a cepas de Candida.

Cepas de referência CIM (mg/mL)* CFM (mg/mL)*

Candida albicans ATCC90028 0,094±0,044 0,3125±0,265

Candida tropicalis ATCC13803 +** +

Candida dubliniensis CBS7987 0,188±0,088 0,5±0

Candida parapsilosis ATCC22019 0,188±0,088 +

Candida glabrata ATCC2001 0,094±0,044 0,125±0

Candida krusei ATCC6258 + +

Candida rugosa ATCC0571 0,125±0 0,125±0

Trichosporon asahii CBS2630 0,125±0 0,125±0 * Média amostral ± desvio padrão amostral (n = 2) **Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada

141

Figura 31 - Ensaio de microdiluição em caldo para a fração 07-CCFR07.

A =. Candida albicans. B = C. tropicalis. C = C. dubliniensis. D = C. parapsilosis . E = C. glabrata. F = C. krusei. G = C. rugosa. H = Trichosporon asahii. Coluna 1 = Controle de esterilidade da amostra.

Coluna 2 – 9 = diluição da amostra. Coluna 10, 11 e 12 = controle de viabilidade do inóculo, controle de viabilidade na presença de DMSO, controle de esterilidade do meio. Fonte: autor.

Duplicata 1

Duplicata 2

142

Figura 32 - Ensaio de concentração fungicida mínima realizado para a fração 07-

CCFR07.

1 = duplicata 1. 2 = duplicata 2. A = Candida albicans. C = C. dubliniensis. D = C. parapsilosis . E = C. glabrata. G = C. rugosa. H = Trichosporon asahii. Numeração de 2 a 6 indica os possos que não

apresentaram creacimento visível. Número 10 = controle de viabilidade do inoculo. CN = controle negativo. Fonte: autor.

143

Na literatura, há estudos que demonstram a capacidade de extratos vegetais

e substâncias isoladas, como saponinas, em inibir a transição morfológica de

Candida albicans de blastoconídio para hifa verdadeira, um importante fator de

virulência desta espécie (CHEVALIER.; MEDIONI; PRÊCHEUR, 2012;

LAURENÇON et al., 2013; SILVA-ROCHA et al., 2015). Baseado nisso, foi realizada

uma análise por microscopia óptica do conteúdo dos poços da microplaca (réplica 1)

após a incubação. Retirou-se uma amostra do poço A6 (CIM da réplica 1) e do poço

A10 (controle de viabilidade do inóculo da réplica 1), os quais continham a levedura

Candida albicans ATCC90028. Como resultado, foi observada a presença de

blastoconídios, hifas verdadeiras e pseudo-hifas bem desenvolvidas no poço A10

(figura 33A); por outro lado, para o poço A6, no qual havia ocorrido efeito

fungistático, foi observada a presença de alguns blatoconídios e a ausência de hifas

(figura 33B). A partir desses indícios, é possível sugerir que essas saponinas

tenham a capacidade de inibir a filamentação de Candida albicans, um importante

fator de virulência envolvido na invasão tecidual durante o processo infeccioso

(SUDBERY, 2011). Assim, são necessários mais estudos para avaliar se essa

inibição se estende para outras cepas de Candida e como ela ocorre.

144

Figura 33 - Microscopia de amostras dos poços contendo Candida albicans

ATCC90028.

Visualização em objetiva de 100x. A = poço A10, controle de viabilidade. B = poço A6, 62,5 µg/mL da fração 07-CCFR.07. Fonte: autor.

145

Todos os resultados apresentados até o momento corroboram para as

hipóteses de que as saponinas são as principais substâncias responsáveis pela

atividade anti-Candida e de que, previamente ao fracionamento, estavam em baixa

concentração no EHF. Além disso, é importante mencionar o potencial antifúngico,

ao menos in vitro, que essas substâncias apresentam, pois uma fração foi capaz de

inibir diferentes cepas de Candida, além de Trichosporon asahii CBS2630, numa

concentração média abaixo de 190 µg/mL. Por conseguinte, as saponinas isoladas

podem apresentar CIMs ainda menores e potencial para inibir um maior número de

cepas.

6.6.6 Avaliação da atividade antifúngica da fração 07-CCFR07 frente a isolados

clínicos segundo o método do CLSI

A fim de complementar os resultados anteriores, a fração 07-CCFR07,

concentrada em saponinas, foi testada frente a 15 isolados clínicos do banco de

cepas do Laboratório de Micologia Médica e Molecular (LMMM) obtidos a partir do

Hospital Universitário Onofre Lopes. Foram utilizadas 9 cepas de infecção sistêmica

e 6 cepas de infecção superficial, coletadas de diferentes fontes, incluindo sangue,

urina, cavidade oral e unha.

Após a determinação da CIM, foi observado que todas as cepas foram

inibidas, exceto Candida parapsilosis LMMM 104 e C. parapsilosis LMMM 84 (CO)

(Tabela 25). A susceptibilidade por cepa de uma mesma espécie e entre espécies foi

variável, porém foi observada uma tendência de menor susceptibilidade para C.

parapsilosis.

146

Tabela 25 - Concentração inibitória mínima (CIM) da fração 07-CCFR07 testada

frente a cepas clínicas.

Isolados clínicos CIM (mg/mL)*

Candida albicans LMMM 116 (U) 0,375±0,177

Candida albicans LMMM 78 (S) 0,25±0


Candida glabrata LMMM 48 (CO) 0,188±0,088

Candida glabrata LMMM 79 (S) 0,25±0

Candida glabrata LMMM 249 (S) 0,188±0,088


Candida tropicalis LMMM 190 (Ur) 0,188±0,088


Candida tropicalis LMMM 35 (O) 0,188±0,088

Candida parapsilosis LMMM 81 (S) 0,750±0,354

Candida parapsilosis LMMM 104 (U) +**

Candida parapsilosis LMMM 84 (CO) +

Candida dubliniensis LMMM 19 (CO) 0,188±0,088

Trichosporon asahii LMMM 451 (S) 0,188±0,088 * média amostral ± desvio padrão amostral (n = 2); **Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada S = sangue. Ur = urina. CO = cavidade oral. U = unha;

O gráfico a seguir (Figura 34) sintetiza todos os resultados de CIM obtidos

para a fração 07-CCFR07 frente a cepas de referência e isolados clínicos. Pode-se

observar que 15 (68 %) das 22 cepas foram inibidas numa CIM média menor ou

igual a 250 µg/mL. As únicas espécies que apresentaram exemplares com menor

susceptibilidade (CIM > 0,5 mg/mL e < 1 mg/mL) ou ausência de inibição (CIM > 1

mg/mL) foram C. tropicalis, C. parapsilosis e C. krusei.

147

Figura 34 - Valores de CIM observados para a fração 07-CCFR07 frente a cepas de referência e cepas clínicas.

CA = Candida albicans. CG = C. glabrata. CT = C. tropicalis. CP = C. parapsilosis. CD = C. dubliniensis. CK = C. krusei. TA = Trichosporon asahii.

Fonte: autor.

0,094

0,375

0,25 0,25

0,094

0,188

0,25

0,188

0,25

>1

0,188

0,625

0,188 0,188

0,75

>1 >1

0,188 0,188

>1

1

0,125

0,188

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

CIM

(m

g/m

l)

Cepa de referência

Cepa clínica

148

Posto que neste trabalho não foi realizada uma análise fenotípica

detalhada das cepas, nem se conhece o mecanismo de ação dessa fração, não

é possível afirmar a razão de C. tropicalis, C. parapsilosis e C. krusei

apresentarem menor susceptibilidade. Acrescenta que, em estudos

epidemiológicos, a susceptibilidade de espécies do gênero Candida varia de

acordo com a região geográfica, sítio de coleta e tamanho da amostra de cepas

coletadas. Por exemplo, no estudo de Neves-Junio et al. (2015), realizado num

hospital terciário de Minas Gerais, Candida tropicalis foi a espécie com maior

prevalência de resistência ao fluconazol (45 %); por outro lado, num estudo

realizado na Itália entre 2006 e 2008, envolvendo 38 UTIs de 27 hospitais,

Candida parapsilosis foi a que apresentou a maior prevalência (25,8%) de

resistência ao fluconazol (TORTORANO et al., 2012). Apesar disso, é possível

sugerir hipóteses levando em consideração um dos principais efeitos biológicos

das saponinas: a perturbação de membranas.

A discussão quanto o mecanismo de ação das saponinas sobre

membranas biológicas ocorre desde 1962, em que cientistas, em seu artigo

publicado no periódico Nature, investigaram o efeito dessas substâncias sobre

membranas de vírus, células de fígado de galinha e eritrócitos de humanos e

de cobaias (DOURMASHKIN; DOUGHERTY; HARRIS, 1962). Desde então,

foram realizados vários estudos para obter evidências de como as saponinas

interagem a nível molecular com os componentes da membrana. Apesar disso,

até o momento, não há uma explicação única e definitiva de como as

saponinas atuam em membranas em virtude da variação observada nos

resultados, que dependem da natureza química da saponina estudada, como

tipo de aglicona e glicosilação (AUGUSTIN et al., 2011HU; KONOKI;

TACHIBANA, 1996; KORCHOWIEC et al., 2015; SUDJI et al., 2015;

WOJCIECHOWSK et al., 2016). No entanto, a maioria dos trabalhos apontam

para um elemento em comum, sobre o qual as saponinas atuam para que

ocorra a perturbação da membrana: o colesterol.

Em estudos que utilizaram monocamadas de fosfolipídeos e colesterol,

foi medida a influência das saponinas sobre os parâmetros físicos-químicos

dessas membranas artificiais, sendo observado que algumas as saponinas

interagem fortemente com o colesterol presente nessas membranas

(KORCHOWIEC et al., 2015.; WOJCIECHOWSKI et al., 2016).

149

Em outro estudo, foram utilizadas células de carcinoma de bexiga

contendo colesterol marcado radioativamente, para avaliar a influência de

diferentes saponinas triterpênicas sobre o teor de colesterol, além de avaliar a

toxicidade sobre a membrana plasmática. Foi constatado que as saponinas

com maior toxicidade a membrana também foram as que mais diminuíram o

teor de colesterol nela, bem como foram capazes de impedir a incorporação do

colesterol (BÖTTGER; MELZIG, 2013).

Adicionalmente a esses trabalhos, Agustin et al. (2011), a partir de uma

revisão na literatura, propuseram 3 modelos de como as saponinas causam a

perturbação da membrana a nível molecular. Nesses modelos, os esteroides,

como o colesterol, são necessários para que saponinas causem a

desestabilização da membrana. Portanto, as saponinas tratadas neste

trabalham possivelmente inibem o crescimento de Candida e Trichosporon

asahii por esse mecanismo membranolítico.

Posto que o ergosterol é o principal esteroide que compõe a membrana

de células fúngicas, a menor susceptibilidade observada para C. tropicalis, C.

parapsilosis e C. krusei poderia ser explicada com base numa alteração do teor

de ergosterol da membrana, caso o mecanismo das saponinas estudadas

fosse a complexação com o ergosterol e outros esteroides.

Candida krusei ATCC6258 é a única cepa deste estudo da qual se

conhece previamente sua susceptilibidade aos antifúngicos azólicos, que

inibem a síntese do ergosterol. Segundo OROZCO et al. (1998), essa cepa de

referência apresenta resistência aos azólicos, possivelmente devido a uma

menor afinidade da enzima 14-α-demetilase a esses antifúngicos. Não se sabe

o que esse mecanismo de resistência poderia influenciar na menor

susceptibilidade às saponinas, considerando a hipótese de se complexarem

com os esteroides da membrana para danifica-la. Porém, isso abre

perspectivas para estudos mais detalhados acerca dos mecanismos envolvidos

na menor susceptibilidade dessa espécie. Ademais, outra perspectiva para

futuros trabalhos é avaliar se a atividade dessa fração enriquecida em

saponinas é dependente da presença de ergosterol e outros esteroides na

membrana da célula fúngica. Isso poderia ser realizado por meio da

determinação do teor de ergosterol nas leveduras e se a presença do

ergosterol ou outro esteróide no meio extracelular aumentaria a CIM da fração

150

enriquecida em saponinas. Caso essa hipótese não se concretize, poderiam

ser realizados estudos mais detalhados por técnicas ômicas, como

metabolômica, proteômica e transcriptômica.

Em suma, foi demonstrado que as substâncias antifúngicas do EHF de

Ziziphus joazeiro Mart. são as saponinas, as quais possivelmente estavam em

menor concentração no extrato antes do fracionamento. A fração 07-CCFR07

apresentou atividade frente a uma variedade de cepas de Candida,

abrangendo cepas das principais espécies observadas em estudos de

prevalência de infecções invasivas (YAPAR, 2014). A técnica de bioautografia

mostrou-se uma importante ferramenta para o fracionamento bioguiado ao aliar

informações de atividade biológica com informações fitoquímicas. Novamente,

é importante ressaltar a cautela que se deve tomar na realização desse tipo de

estudo, evitando basear-se em poucos resultados e critérios para descartar

uma amostra. Não foi encontrado na literatura, até o momento, trabalhos com

abordagem e finalidades semelhantes para a espécie, assim como para o

gênero. Assim, este estudo tem caráter inédito e abre novas oportunidades de

investigação científica.

151

6.7 Isolamento da saponina ZJS1

A fração 02-PLL03, conforme discutido na seção anterior, apresentou

atividade frente à Candida glabrata ATCC2001 pelo método de microduição em

caldo e bioautografia, em que se evidenciou a atividade anti-Candida das

manchas azuis observadas após a revelação com vanilina sulfúrica. Por

conseguinte, a fim de isolar essas substâncias, essa fração foi submetida a

dois processos de cromatografia em coluna de gel de filtração (CGF), obtendo-

se 4 e 5 frações respectivamente. As frações 2 de ambos os processos foram

submetidas a uma nova separação por CGF, obtendo-se, após a reunião, 6

frações para a CFG03 (Figura 35) e 5 frações para a CGF04 (Figura 36).

Figura 35 - Análise por CCD das frações da CFG03.

Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:15:6:15 v/v/v/v. Adsorvente: gel de

sílica 60 F254. Detecção: A – UV 365 nm; B – Reagente Natural A/UV 365 nm; C - vanilina sulfúrica/aquecimento. Numeração: refere-se às frações reunidas. Fonte: autor.

152

Figura 36 - Análise por CCD das frações da CGF04.

Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:15:6:15 v/v/v/v. Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: A – UV 365 nm; B – Reagente Natural A/UV 365 nm; C - vanilina

sulfúrica/aquecimento. Numeração: refere-se às frações reunidas. Fonte: autor

As frações 05-CGF03 e 04-CGF4 foram reunidas e submetidas a uma

separação por cromatografia em coluna de fase reversa (CCFR12), obtendo-se

11 frações após a reunião (Figura 37).

153

Figura 37 - Análise por CCD das frações da cromatografia em coluna de fase

reversa 12.

Eluente: acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água (100:15:6:15 v/v/v/v. Adsorvente: gel de sílica 60 F254. Detecção: A – UV 365 nm; B – Reagente Natural A/UV 365 nm; C - vanilina

sulfúrica/aquecimento. Numeração: refere-se às frações reunidas. Fonte: autor

A fração 5 (5 mg), com aspecto semipurificado após a análise por CCD,

foi enviada para a obtenção de espectros de ressonância magnética nuclear. A

inspeção inicial dos espectros de 1H (Figura 38) e 13C (Figura 39) permitiu

sugerir que essa fração contém majoritariamente uma saponina, devido à

presença de muitos sinais em região mais protegida, indicativo de hidrogênios

de metilas, além da presença de sinais característicos de açúcar em campo

mais desprotegido. A análise estrutural dessa fração por RMN encontra-se na

seção a seguir.

154

6.8 Análise estrutural por RMN da saponina ZJS1

A fração em questão, obtida de uma cromatografia em coluna de vidro

empacotada com fase reversa C18, apresentou, segundo os dados de RMN,

pureza suficiente para se considerar que continha majoriariamente uma

substância isolada. Assim, a fração a partir deste momento será chamada de

ZJS1.

Inicialmente, foram analisados os espectros monodimensionais de 1H e

13C, aliado a análise por HMQC, para identificar sinais característicos das

saponinas isoladas das cascas de Ziziphus joazeiro Mart. por Higuchi et al.

(1984) e Schühly et al. (2000). No espectro de RMN 1H, foi possível observar 7

singletos de alta intensidade em δH 0,73, 0,77, 0,94, 1,00, 1,02, 1,58 e 1,64,

sugestivos de hidrogênios de metila (Figura 39), os quais, por HMQC, foram

atribuídos a seus respectivos carbonos (δH 0,73↔16,4; δH 0,77↔16,5; δH

0,94↔δC 27,6; δH 1,00↔δC 18,8; δH 1,02↔δC 29,7; δH 1,6↔δC 18,5; δH1,64↔δC

25,7), vários sinais sobrepostos entre δH 3,2 e 3,9, indicativo de hidrogênios de

açúcar (Figura 40), além de dubletos entre δH 4,2 e 5,5, sugestivos de

hidrogênios de carbonos anoméricos (Figura 41). Após a análise do espectro

de 13C (Figura 42), contatou-se a presença de 23 sinais sugestivos de carbonos

saturados, 17 sinais de metinas ou metilenos oxigenados e 3 sinais

característicos de carbonos anoméricos (δC 103,15↔ δH4,40 [d, J = 8,0 Hz];

104,79↔ δH [4,25, d, J = 6,8 Hz]; 108,73↔ δH 5,13 [d, J = 2,3 Hz]) o que

permite sugerir a presença de 3 açúcares ligados a aglicona. Ainda,

destacaram-se 2 sinais em campo mais desprotegido, em δC 126,27 e 133,92,

sugestivos de carbono olefínico.

Apesar de os espectros terem sido obtidos em DMSO, observou-se uma

semelhança e corência desses deslocamentos químicos com os da saponina

bacopasídeo X, obtidos em metanol e piridina (LI et al., 1999; SCHÜHLY et al,

2000). Essa substância é um derivado da jujubogenina, uma saponina de

núcleo damarano (Figura 38), isolada das cascas de Ziziphus joazeiro Mart.

pelos cientistas supracitados. Portanto, a partir dos dados obtidos na análise

preliminar, foi realizada uma estratégia de atribuição sequencial dos sinais da

aglicona e glicosídeos, através das correlações homo e heteronucleares de

HMBC (Figura 44 e 45), HMQC (Figura 46) e COSY (Figura 47) assim como

155

comparado com a literatura citada. Primeiramente, foi realizada uma análise

dos sinais da aglicona seguido dos sinais da porção glicídica.

Figura 38 - Representação estrutural do núcleo damarano (A) e da saponina

bacopasídeo X (B).

10

5

1

4

2

3

9

8

6

7

11

12

14

13

CH330

CH3

18

CH328

CH329

15

17

16

CH3

19

H

H

H

20

22CH3

21

23

24

25

CH3

26

CH327

H

O

O

OH

O

O O

OH OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OHO

OH2

1

34

56

7

89

10

29(28)

28(29)

30

13

12

1118

14

1716

20

22

23

24

26(27)

27(26)

25

1915

1'2'

3'

4'5'

2''

5''

3''

4''1''

1'''2'''

3'''

4'''5'''

6'''

21

A

B

156

O

O

OH

O

O O

OH OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OHO

OH2

1

34

56

7

89

10

29(28)

28(29)

30

13

12

1118

14

1716

20

22

23

24

26(27)

27(26)

25

1915

1'2'

3'

4'5'

2''

5''

3''

4''1''

1'''2'''

3'''

4'''5'''

6'''

21

Figura 39 - Espectro ampliado de RMN 1H da saponina ZJS1(DMSO-d6; 500 MHz).

H-29

H-19 H-28

H-18 H-21

H-27

H-5 H-15

H-19

H-17

H-26

157

O

O

OH

O

O O

OH OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OHO

OH2

1

34

56

7

89

10

29(28)

28(29)

30

13

12

1118

14

1716

20

22

23

24

26(27)

27(26)

25

1915

1'2'

3'

4'5'

2''

5''

3''

4''1''

1'''2'''

3'''

4'''5'''

6'''

21


H-2’’’

H-4’ H-2’

H-3’

H-2’’

H-3

158

O

O

OH

O

O O

OH OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OHO

OH2

1

34

56

7

89

10

29(28)

28(29)

30

13

12

1118

14

1716

20

22

23

24

26(27)

27(26)

25

1915

1'2'

3'

4'5'

2''

5''

3''

4''1''

1'''2'''

3'''

4'''5'''

6'''

21


H-24 H-23

H-1’’’

H-1’

H-1’’’

159

O

O

OH

O

O O

OH OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OHO

OH2

1

34

56

7

89

10

29(28)

28(29)

30

13

12

1118

14

1716

20

22

23

24

26(27)

27(26)

25

1915

1'2'

3'

4'5'

2''

5''

3''

4''1''

1'''2'''

3'''

4'''5'''

6'''

21

Figura 42 - Espectro ampliado de RMN 13C da saponina ZJS1(DMSO-d6; 125 MHz).

160

Para a atribuição dos sinais da aglicona, foram observadas as

correlações de HMBC das metilas identificadas na análise preliminar dos

espectros monodimensionais de H1 e C13. Inicialmente buscaram-se

correlações de sinais diagnósticos da aglicona jujubogenina (Figura 41),

principalmente entre os carbonos e hidrogênios das posições 28/29 e 26/27

Foram observadas correlações de HMBC características de carbonos vicinais,

(δH 1,64 ↔ δC 18,5 e δH 1,58 ↔ δC 25,7; δH 0,73↔δC 27,6 e δH 0,94 ↔ δC 16,4),

indicativas das metilas 26/27 e 28/29.

A confirmação das posições 26/27 foi possível após observar a presença

de correlações entre os hidrogênios dessas metilas com sinais de carbono

característico de ligação dupla (δC 126,27 e δC 133,92), sendo também possível

atribuir os sinais destes últimos e de outros a partir das correlações de HMQC

e COSY. O sinal em δC 133,92 apresentou-se quaternário no HMQC enquanto

que o sinal em δC 126,27 apresentou ligação com apenas um hidrogênio (δH

5,08, dt, J = 8,0 Hz) e foram atribuídos as posições 25 e 24, respectivamente.

O sinal em δH 5,08, por sua vez, indicou no espectro de COSY uma correlação

com o sinal em δH 4,48, o qual foi atribuído ao carbono em δC 67,9, com

deslocamento característico de metina oxigenada. Logo, esse foi atribuído a

posição 23 da molécula de jujubogenina.

Os sinais sugestivos das metilas 28/29 foram confirmados após se

observar a presença de correlação no espectro de HMBC entre os hidrogênios

dessas com um sinal em δC 88,3, característico do carbono 3 ligado a uma

unidade osídica.

Figura 43 - Representação estrutural da aglicona jujubogenina.

21

34

56

7

89

10

29(28)

28(29)

30

13

12

1118

14

1716

20

22

23

24

26(27)

27(26)

25

1915

21

O

O

OH

OH

161

Figura 44 - Espectro ampliado de HMBC da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500 MHz).

162

H-15/C-30

H-26/C-27

H-27/C-26

H-27/C-24

H-27/C-25H-26/C-25

H-26/C-24

H-15/C-16 H-17/C-16

H-28/C-3 H-29/C-3

H-28/C-5

H-29/C-28

H-28/C-29

H-28/C-4

H-19/C-1H-18/C-7

Figura 45 - Espectro ampliado de HMBC da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500 MHz).

163

Figura 46 - Espectro ampliado de HMQC da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500 MHz).

164

Figura 47 - Espectro ampliado de COSY da saponina ZJS1 (DMSO-d6; 500

MHz).

165

ZJS1 Bacopasídeo X*

Posição δ C (ppm) δ H (ppm), multiplicidade, J (Hz) HMBC Posição δ C (ppm) δ H (ppm), multiplicidade, J (Hz)

1 38,6 1,55 (m); 0,84 (m) H-19 1 39,8 1,67 (m); 0,92 (m) 2 26,3 1,52 (m), 1,65 (m) - 2 27,3 1,85 (m); 1,70 (m) 3 88,3 2,96 (dd, J = 11,6; 4,0) H-28, H-29, H-1' 3 90,3 3,11 (dd, J = 12,3; 4,3) 4 39,4 - H-28, H-29 4 40,6 - 5 55,8 0,66 (d, J = 11,6 Hz) H-28, H-29 5 57,4 0,74 (d, J = 9,1) 6 18,0 1,47 (m); 1,35 (m) - 6 19,1 1,59 (m); 1,52 (m) 7 35,7 1,45 (m); 1,32 (m) H-18 7 36,9 1,56 (m); 1,49 (m) 8 37,2 - - 8 38,5 - 9 52,4 0,78 (m) H-19 9 54,1 0,88 (m)

10 37,1 - H-19 10 38,3 - 11 21,5 1,48 (m) - 11 22,5 1,64 (m), 1,50 (m) 12 28,1 1,69 (m); 1,73 (m) - 12 29,2 1,86 (m); 1,67 (m) 13 37,1 - H-18 13 38 2,48 (ddd, J = 12,5; 6,7; 6,4) 14 53,1 - H-18 14 54,6 - 15 36,2 1,89 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 0,98 (s) H-30b 15 36,7 2,06; 1,18 (2d, J = 8,7) 16 109,9 - H-21, H-17 16 111,4 - 17 53,3 0,82 (d, J = 6,4 Hz, 1H) - 17 54,4 1,00 (d, J =6,7) 18 18,8 1,00 (s) - 18 19,2 1,14 (s) 19 16,5 0,77 (s) - 19 16,8 0,88 (s) 20 67,9 - H-22 20 69,4 - 21 29,7 1,02 (s) - 21 29,6 1,14 (s) 22 44,6 1,23 (m); 1,36 (m) H-21 22 45,5 1,47 (m); 1,38 (m) 23 67,9 4,48 (m) H-21 23 69,7 4,68 (ddd, J = 11,3; 8,1; 1,3) 24 126,3 5,08 (dt, J = 8,0 Hz) H26, H-27 24 126,3 5,15 (m) 25 134,0 - H-26, H-28 25 136,7 - 26 25,7 1,64 (s) H-27, H-24 26 25,8 1,72 (s) 27 18,5 1,58 (s) H-26, H-24 27 18,4 1,70 (s) 28 27,6 0,94 (s) H-29 28 28,3 1,05 (s) 29 16,4 0,73 (s) H-28 29 16,8 0,85 (s) 30 65,4 3,64; 3,82 H-15 30 66,9 4,03; 3,94 (2d, J = 12,6)

Tabela 26 - Dados espectrais de RMN 1H (500 MHz) e RMN 13C (125 MHz) da saponina ZJS1 (DMSO-d6) observados para a

aglicona, em comparação com a literatura.

* SCHÜHLY et al. (2000); 400 MHz, CD3OD

166


glicona, em comparação com a literatura.

ZJS1

Bacopasídeo X*

Posição δ C (ppm) δ H (ppm); multiplicidade; J (Hz) HMBC COSY Posição δ C

(ppm) δ H (ppm); multiplicidade; J

(Hz)

3-arabnopiranosil

3-arabnopiranosil

1' 104,8 4,25 (d, J= 6,8 Hz) H-3, H-2' H-3, H-2', H-4' 1' 106 4,39 (d,J=6.4)

2' 75,3 3,57 (m)

H-1' 2' 77,2 3,75 (dd)

3' 81,7 3,63 (m) H-2', H-

1''' H-1''' 3' 83,7 4,05 (dd, J=5,1, 2,6)

4' 67,5 3,82 (m) - H-1' 4' 69,2 4,03 (ddd)

5' 65,4 3,66 (m); 3,36 (m) H-1' - 5' 65,9 3,85 (dd), 3.54 (dd)

2'-arabnofuranosil

2'-arabnofuranosil

1'' 108,8 5,13 (d, J = 2,3 Hz) H-2' H-2'' 1'' 110,3 5,30 (d, J= 2,6)

2'' 82,7 3,87 (td, J = 2,4 Hz) - H-1''' 2'' 83,7 4,09 (dd, J = 5,0; 2,6)

3'' - - - - 3'' 77,9 3.93 (dd)

4'' - - - - 4'' 84,6 3.97 (ddd)

5'' - - - - 5'' 62,1 3,71, 3,60 (2dd, J= 12,3, 2,9)

3'-glicopiranosil

3'-glicopiranosil

1''' 103,2 4,40 (d, J = 8,0 Hz) H-2''' H-3', H-2''' 1''' 104,9 4,51 (d, J = 7,6)

2''' 74,1 3,12 (m) - H-1''' 2''' 75,2 3,28 (dd)

3''' - - - - 3''' 77,7 3,92 (dd, J = 7,6; 4,9)

4''' - - - - 4''' 71,1 3,33 (dd)

5''' - - - - 5''' 77,8 3,35 (ddd)

6''' - - - - 6''' 62,3 3,83; 3,67 (2dd, J = 8,2; 5,2)

* SCHÜHLY et al (2000); 400 MHz, CD3OD

167

Com relação à porção glicídica da molécula, no espectro de 13C foi

observado que o sinal em δC 88,3 apresentou um deslocamento químico que

corrobora para a presença de uma ligação osídica. No espectro de HMQC,

observou-se uma correlação desse sinal com o dubleto em δH 2,96. Enquanto

isso, os sinais em δH 0,94 e δH 0,73, atribuídos às metilas nas posições 28 e

29, respectivamente, apresentaram correlação no espectro de HMBC com o

sinal em δC 88,3, permitindo confirmar a atribuição desse a C-3. Ainda, no

espectro de HMBC, foi possível observar uma correlação entre o sinal do C-3 e

um dubleto em δH 4,25. Este, por sua vez, apresentou correlação no HMQC

com um sinal de carbono em δC 104,79, sugestivo de carbono anomérico.

Portanto, confirmou-se a inserção da unidade osídica no carbono 3.

O sinal em δC 104,79, atribuído ao C-1’, apresentou correlação por

HMBC com um hidrogênio em δH 3,57, que por HMQC foi atribuído ao carbono

em δC 75,29. Igualmente, o sinal de hidrogênio do C-1’ apresentou correlação

no espectro de COSY com o hidrogênio em δH 3,57. Assim, os sinais em δC

75,29 e δH 3,57 foram atribuídos ao H-2’. Continuando a sequência das

correlações, o sinal em δH 3,57 apresentou correlação no HMBC com o sinal

em δC 108,8, indicativo de outro carbono anomérico e evidenciando que a

primeira unidade osídica está ligada a uma segunda por intermédio de uma

ligação com o C-2’. O sinal em δC 108,8 exibiu correlação no HMQC com um

dubleto em 5,13 (J = 2,3 Hz). Adicionalmente, o sinal em 4,40 (d, J = 8,0 Hz),

atribuído ao δC 103,1 e característico de outro carbono anomérico, apresentou

correlação no espectro de HMBC com um sinal de carbono em δC 81,7. Esse

sinal foi atribuído ao C-3’ por correlacionar no HMBC com o hidrogênio

atribuído ao H-2’, o que confirma a ligação da terceira unidade osídica a

primeira por intermédio de uma ligação com o C-3’. As análises dos

espectros ainda estão em andamento para a confirmação da porção glicídica,

sendo ainda necessárias outras análises, como espectrometria de massas,

para confirmar a identidade da molécula. Com base na análise realizada até o

momento, a substância ZJS1 foi presuntivamente identificada como

bacopasídeo X ou 3-O-[α-L-arabinofuranosil-(1 → 2)-{β-D-glicopiranosil-

(1 → 3)-}-α-L-arabinopiranosil] jujubogenina.

168

Figura 48 - Principais correlações de HMBC e COSY observadas para ZJS1

Flecha azul = correlação de HMBC. Flecha vermelha = correlação de COSY.

Uma característica em comum entre as saponinas de Ziziphus spp

isoladas até o momento é que todas compartilham da mesma aglicona, a

jujubogenina, ou apresentam uma aglicona com poucas diferenças estruturais

em relação a essa. A partir da casca das raízes de Ziziphus lotus, foram

isoladas 4 saponinas de núcleo damarano, incluindo jujubosídeo B, e 3

saponinas com uma aglicona inédita, estruturalmente similar a jujubogenina,

denominada lotogenina (RENAULT et al., 1997) Ainda com relação a Ziziphus

lotus, foram isoladas das suas folhas, jujubosídeo B e 4 novas saponinas cuja

sapogenina deriva da jujubogenina (MACIUK et al., 2004). Zizynummin, uma

saponina isolada das folhas de Ziziphus numularia, também apresenta a

jujubogenina como aglicona. Para a espécie do presente estudo, Ziziphus

joazeiro Mart., foram isoladas da casca saponinas de núcleo damarano

derivadas da jujubogenina (bacopasídeo X), bem como da lotogenina

(lotosídeo A), além de 2 saponinas (joazeirosídeos A e B) com uma aglicona

inédita e estruturalmente semelhante a lotogenina e jujubogenina, denominada

joazeirogenina (SCHÜHLY et al., 2000). Portanto, uma hipótese considerada foi

a de que as saponinas observadas no teste de formação de espuma e na

análise por CCD possuíam um núcleo do tipo damarano e eram derivadas das

sapogeninas jujugogenina ou lotogenina. Segundo os resultados apresentados,

O

O

OH

O

O O

OH OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OHO

OH2

1

3

45

67

89

10

29(28)

28(29)

30

13

12

1118

14

1716

20

22

23

24

26(27)

27(26)25

19

15

1'2'

3'

4'5'

2''

5''

3''

4''1''

1'''2'''

3'''

4'''5'''

6'''

21

169

uma dessas saponinas foi isolada e presuntivamente identificada como

bacopasídeo X, confirmando-se a hipótese proposta.

A saponina bacopasídeo X foi isolada da casca de Ziziphus joazeiro

Mart. primeiramente por Higuchi et al. (1984), seguido de Schühly et al (2000),

em que estes últimos observaram que essa saponina era majoritária na casca.

Apesar de não ter sido realizada a sua quantificação nas folhas, possivelmente

essa saponina também é majoritária nessa parte da planta, pois na análise por

CCD com o revelador vanilina sulfúrica, realizada para o EHF, observou-se

uma intensa mancha azul de Rf equivalente ao observado para a saponina

ZJS1.

Em pesquisa na base de dados SciFinder, não foram encontrados

estudos que mostrem a presença de bacopasídeo X em outras espécies do

gênero, somente em Colubrina retusa (LI et al., 1999) e Bacopa monnieri

(SIVARAMAKRISHNA et al., 2005)

Assim, essa saponina tem distribuição restrita em relação ao gênero e

outras famílias, tendo, consequentemente, utilidade como marcador

quimiotaxonômico para a identificação da espécie e no controle de qualidade

de produtos oriundos das cascas e folhas. Conforme foi abordado na seção

acerca dos resultados da atividade anti-Candida, essa saponina estava

presente numa fração que apresentou atividade frente a uma variedade de

espécies de Candida, além de ter sido reportada sua atividade inibitória contra

Candida albicans, Cryptococcus neoformans e Aspergillus fumigatus, assim

como frente a diferentes linhagens de células humanas tumorais, nos estudos

da espécie Colubrina retusa (LI et al., 1999) e Bacopa monniera (PENG et al.,

2010). Portanto, além de marcador quimiotaxonômico, essa saponina é

também um candidato a marcador bioativo da espécie, e estudos posteriores

devem ser realizados para avaliar o seu potencial biológico.

170

6.9 Avaliação do efeito protetor do extrato hidroetanólico das folhas de Z.

joazeiro Mart. em modelo de doença inflamatória intestinal

A doença inflamatória intestinal é caracterizada por uma resposta imune

intestinal exacerbada e desregulada, envolvendo células da imunidade inata

(neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, células natural killer) e adaptativa

(células T e B). A ativação dessas células é acompanhada pela liberação de

citocinas e quimiocinas, expressão de moléculas de adesão e o consequente

recrutamento de mais células mononucleares e polimorfonucleares para a

mucosa intestinal, estabelecendo-se assim um perpétuo ciclo de ativação,

infiltração leucocitária e dano celular por radicais livres e proteases

(ABRAHAM; CHO, 2009; BAUMGART et al., 2007).

O modelo experimental, em ratos, de doença inflamatória intestinal

induzido pelo hapteno ácido 2,4,6 trinitrobenzóico (TNBS) apresenta vários

aspectos presentes na doença inflamatória intestinal em humanos. Sua

resposta é caracterizada por uma inflamação transmural da mucosa colônica

do animal, associada a formação de úlceras. O seu análogo estrutural, o

DNBS, causa uma resposta inflamatória similar ao TNBS, sendo portanto

utilizado neste estudo como agente indutor do modelo experimental para a

avaliação do efeito do EHF de Ziziphus joazeiro Mart. (WALLACE et al., 1995).

O protocolo experimental consistiu em 6 grupos, sendo 3 relativos às

doses com concentração crescente do EHF de Ziziphus joazeiro Mart., além

de grupos com administração oral de salina sem a indução da doença (controle

negativo) e com a indução da doença (controle positivo), bem como um grupo

com a administração oral do fármaco sulfassalazina. A administração de

salina, do extrato e do fármaco foi realizada 72, 48, 24 e 2 horas antes da

indução da doença, assim como em todos os dias subsequentes, até a

eutanásia.

Durante todo o período experimental, os animais foram monitorados

quanto à alteração do peso corporal, consistência fecal e presença de sangue

nas fezes, em que a pontuação atribuída para cada um desses parâmetros foi

utilizada no cálculo do Índice de Atividade da Doença (IAD). O IAD é uma

ferramenta útil na monitorização clínica do processo inflamatório intestinal, pois

é indicativo da gravidade da injúria no dia após à indução da doença e também

171

sugestivo da recuperação dos animais, momento no qual deve-se realizar a

eutanásia.

Pode-se observar na figura 49 que ocorreu uma perda de peso gradativa

ao longo dos dias para todos os grupos, exceto o controle negativo, atingido o

seu ápice no sétimo dia de experimento. Isso resulta da diarreia e consequente

diminuta ingestão de ração observada nos grupos tratados e controle positivo,

após a indução por DNBS. Por sua vez, na Figura 50, observa-se que o escore

IAD foi menor para o grupo que recebeu sulfassalazina, em relação aos

tratamentos com EHF e controle positivo, durante os três dias subsequentes à

indução. De fato, apesar da redução diária de peso, observou-se que menos

animais do grupo sulfassalazina apresentavam diarreia e sangue

macroscopicamente visível nas fezes, o que contribuiu para a redução do IAD

Figura 49 - Monitorização do peso corporal das ratas durante o período

experimental.

1 2 3 4 5 6 7

1 5 0

2 0 0

2 5 0

D ia s d e E x p e r im e n ta ç ã o

Mé

dia

do

pe

so

± d

es

vio

pa

drã

o

(g)

C o n tro le P o s it iv o

Z J 5 0 m g /k g

C o n tro le N e g a tivo

Z J 1 0 0 m g /k g

Z J 2 0 0 m g /k g

S u lfa s s a la z in a 2 5 0 m g /k g

In d u ç ã o c o lite

Valores expressos como média ± desvio padrão (n = 7).

172

Figura 50 - Índice de atividade da doença (IAD) relativo aos grupos tratatos e

controle durante o período de pós-indução da doença.

1 2 3

0

1

2

3

4

D ia s a p ó s a in d u ç ã o d a c o lite

Es

co

re

IA

D

C o n tro le N e g a tivo

C o n tro le P o s it iv o

Z J 5 0 m g /k g

Z J 1 0 0 m g /k g

Z J 2 0 0 m g /k g

S u lfa s s a la z in a 2 5 0 m g /k g

Resultados expressos como média ± desvio padrão (n = 7).

Além da monitorização dos parâmetros clínicos, após a eutanásia dos

animais, foi avaliado o índice de dano macroscópico, o qual se baseia em

critérios estabelecidos por Bell, Gall e Wallace (1995) assim como foi avaliada

a relação peso/longitude dos cólons removidos, parâmetro esse utilizado para

verificar a presença de encurtamento e engrossamento das suas paredes.

A análise do gráfico acerca do escore macroscópico (Figura 51) permite

constatar que os grupos tratados com o EHF de Z. joazeiro Mart., nas doses de

50, 100 e 200 mg/kg, não apresentaram diferença estatisticamente significante

(p>0,05) em relação ao grupo controle positivo. Assim o EHF,

independentemente da dose utilizada no estudo, não foi capaz de diminuir o

dano tecidual causado pelo hapteno DNBS, apresentando em média um escore

próximo a 8, caracterizado pela presença de grandes zonas de injúria tissular

(Figura 52). Em contrapartida, como esperado, o fármaco padrão

sulfassalazina foi capaz de diminuir o dano provocado pelo DNBS.

173


grupos controle, sobre o escore de dano macroscópico do cólon.

Co

ntr

ole

Neg

at i

vo

Co

ntr

ole

Po

sit

ivo

ZJ 5

0 m

g/k

g

ZJ 1

00 m

g/k

g

ZJ 2

00m

g/k

g

Su

lfassala

zin

a 2

50m

g/k

g

0

2

4

6

8

1 0

Es

co

re

ma

cro

sc

óp

ico A

A

A

A

A B C

Dados expressos como média ± desvio padrão (n = 7). ANOVA/Teste de Mann-Whitney. Diferença estatisticamente significativa quando p <0,05. A = p <0,05 contra o controle negativo.

B = p<0,05 contra o controle positivo. C = p<0,05 contra os tratamentos com o EHF.

Figura 52 - Cólons representativos dos tratamentos e grupos controle.

174

No gráfico da figura 53, observa-se que a administração de

sulfassalazina foi capaz de prevenir o encurtamento e edemaciamento do cólon

a ponto de tornar o grupo estatisticamente equivalente ao controle negativo.

Além disso, para o tratamento com o EHF nas doses de 50 e 200 mg/kg, não

houve diferença estatisticamente significativa (p < 0,05) em relação ao controle

positivo. No entanto, observa-se uma diferença estatisticamente significativa

entre o grupo que recebeu a dose de 100 mg/kg e o grupo controle positivo.

A princípio, propõe-se a seguinte hipótese para o resultado anômalo

observado com o extrato: as variáveis aleatórias e desconhecidas do

experimento, não passíveis de serem controladas, aliado ao efeito imprevisível

decorrente da complexidade química do extrato, contribuíram para que a dose

de 100 mg/kg ocasionalmente melhorasse o parâmetro peso/longitude do

cólon, considerando um nível de significância de 5%.


grupos controle, sobre a relação peso/longitude (mg/cm) do cólon.

Co

ntr

ole

Neg

at i

vo

Co

ntr

ole

Po

sit

ivo

ZJ 5

0 m

g/k

g

ZJ 1

00 m

g/k

g

ZJ 2

00m

g/k

g

Su

lfassala

zin

a 2

50m

g/k

g

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

mg

/ c

m

AA B

AA

B C

Dados expressos como média ± desvio padrão (n = 7). One-way ANOVA seguido de teste de Tukey de comparações múltiplas. Diferença estatisticamente significativa quando p <0,05. A = p <0,05 contra o controle negativo. B = p<0,05 contra o controle positivo. C = p<0,05 contra os

tratamentos com o EHF.

175

Com o intuito de explicar a ineficácia observada para o extrato como

agente anti-inflamatório na doença inflamatória intestinal, foram sugeridas

hipóteses que se baseiam nas seguintes informações:

O EHF, conforme verificado nas análises por reações clássicas de

identificação, CCD e CLAE, apresenta flavonoides glicosilados, saponinas e

cumarinas. De acordo com a literatura, sabe-se que as saponinas e cumarinas

apresentam atividade citotóxica frente a células humanas neoplásicas e, em

alguns casos, frente à células humanas normais (CANNING et al., 2013, WU et

al., 2015). Os flavonoides glicosilados, em contrapartida, possuem atividade

protetora em modelos animais de colite experimental (COMALADA et al., 2005;

KIM et al., 2005; KWON et al., 2005, MASCARAQUE et al., 2014). Com base

nisso, duas hipóteses foram propostas:

Os flavonoides glicosilados, responsáveis pela atividade anti-

inflamatória, estão em concentração insuficiente para eliciar um efeito

protetor.

O EHF possui saponinas e cumarinas citotóxicas que intensificam o

dano causado pelo DNBS e sobrepõem o efeito benéfico dos

flavonoides glicosilados.

É importante destacar que se a segunda hipótese sugerida for

verdadeira, as substâncias com atividade antifúngica, suspeitas de

corresponderem a saponinas e cumarinas, possivelmente não poderão ser

utilizadas para o tratamento de infecções fúngicas sistêmicas, restando a via

tópica como alternativa.

176

7 CONCLUSÕES

Foi observado que as folhas da espécie Ziziphus joazeiro Mart. possuem

ácidos fenólicos, cumarinas, saponinas e flavonoides, sendo os flavonóis a

classe majoritária. Por meio de análises por co-CCD CLAE, CLAE-IES-

EM(TOF) e RMN, foi possível identificar no EHF glicosídeos dos flavonoides

quercetina, canferol e isormanetina ou tamarixetina, muitos inéditos para a

espécie, e alguns de distribuição restrita para o gênero ou ainda inéditos para o

gênero. Portanto, os flavonoides, principalmente os glicosilados, constituem um

alvo para a seleção de marcadores químicos.

No ensaio de colite experimental, não foi observado efeito protetor para

o extrato hidroetanólico das folhas. Uma hipótese sugerida foi a de que os

flavonoides não estão em concentração suficiente no extrato para promover

efeito anti-inflamatório.

A partir da avaliação da atividade anti-Candida aliada a bioautografia, foi

demonstrado que as saponinas são as principais substâncias responsáveis por

essa atividade, sendo ainda possível isolar e presuntivamente identificar uma

das saponinas, bacopasídeo X, presente nas frações testadas.

Assim, este estudo traz resultados inéditos para a espécie e para o

gênero, abrindo perspectivas para a realização de novas investigações

envolvendo o uso de flavonoides e saponinas como marcadores químicos no

controle de qualidade e avaliação do perfil sazonal, o estudo aprofundado do

mecanismo de ação das saponinas das folhas sobre as leveduras do gênero

Candida, bem como o uso dessas saponinas para outros fins, como avaliação

de outras atividades biológicas, estudos de semissíntese e desenvolvimento de

formulações.

177

REFERÊNCIAS

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192

APÊNCIDE A – MANUSCRITO PARA PUBLICAÇÃO

Journal of Ethnopharmacology

- Manuscrito em preparação -

Fracionamento bioguiado e atividade anti-Candida de uma fração

enriquecida em saponinas, obtida do extrato das folhas de Ziziphus

joazeiro Martius

Manoel André de Souza Neto; Jordan Silva de Medeiros; Jovelina Samara

Ferreira Alves; Walicyranison Plinio da Silva da Silva Rocha; Guilherme

Maranhão Chaves; Freddy Alejandro Ramos; Josean Fechine Tavares,

Silvana Maria Zucolotto

Resumo

Relevância etnofarmacológica: as cascas e as folhas de Ziziphus joazeiro Mart.

tem sido tradicionalmente empregadas na higiene bucal e capilar, no alívio de

problemas estomacais, no tratamento de infecções fúngicas e como anti-

inflamatório.

Objetivo do estudo: realizar um fracionamento bioguiado a partir da atividade

anti-Candida das folhas.

Materiais e métodos: as folhas foram submetidas à maceração com

etanol:água (70:30, v/v) por 7 dias e, a partir do extrato hidroetanólico, realizou-

se uma partição líquido-líquido com solventes de polaridade crescente. A

fração butanol foi submetida a um fracionamento por cromatografia em contra-

corrente de alta velocidade com refinamento (CCCAV) por zona de pH, seguido

de cromatografia em coluna de fase reversa. Paralelamente ao fracionamento,

a atividade antifúngica do extrato e frações frente a cepas de Candida foi

avaliada pelo método de microdiluição em caldo aliado a bioautografia.

Resultados: Na avaliação da atividade antifúngica, o EHF apresentou

concentração inibitória mínima (CIM) de 5 mg/mL frente a Candida albicans,

Candida dubliniensis, Candida glabrata e Candida rugosa, enquanto que a

fração butanol destacou-se frente a C. glabrata, com uma CIM de 0,625

mg/mL. Após o ensaio de bioautografia para a fração butanol e suas

respectivas sub-frações, observou-se que as manchas azuis, originadas após o

193

uso do revelador vanilina sulfúrica, possuíam atividade frente a C. glabrata. A

fração 07-CCFR07, obtida após concentração das substâncias antifúngicas por

CCCAV e cromatografia em coluna de fase reversa, foi capaz de inibir

diferentes cepas de referência de Candida e isolados clínicos, no teste de

microdiluição em caldo. Com o objetivo de descobrir a identidade das

substâncais antifúngicas, foi realizado um novo fracionamento a partir da fração

butanol. Ao final, foi possível obter uma saponina isolada, presuntivamente

identificada como bacopasídeo X, anteriormente isolada das cascas de

Ziziphus joazeiro

Conclusões: os resultados fornecem evidências que justificam o uso

etnofarmacológico das folhas como antifúngico. Este estudo tem caráter inédito

para a espécie e abre novas oportunidades de investigação científica quanto a

atividade antifúngica das saponinas presentes nas folhas de Ziziphus joazeiro.

1. Introdução

A incidência e prevalência de infecções fungicas invasivas têm

aumentado ao longo dos anos, principalmente em decorrência do aumento no

número de pessoas imunocomprometidas, incluindo transplantados e pessoas

com SIDA (Pappas et al., 2010; Tang et al., 2015). As espécies do gênero

Candida constituem relevante grupo de patógenos oportunistas, os quais são

uma das principais causas de infecção de corrente sanguínea nos Estados

Unidos e Europa (Lockhart, 2014). A espécie Candida albicans é uma das mais

prevalentes, seguido de Candida glabrata na América do Norte e Europa e o

complexo Candida parapsilosis na America Latina (Yapar, 2014).

Apesar dos avanços, o arsenal terapêutico para o tratamento de

infecções fúngicas ainda apresenta limitações. Por exemplo, o uso da

anfotericina B, considerado um padrão ouro na terapia antifúngica, é limitado

devido à possibilidade de reações adversas, como nefrotoxicidade (Laniado-

Laborín and Cabrales-Vargas, 2009). Além disso, há um aumento na

prevalência de espécies com resistência aos azólicos (Orasch et al., 2014).

Portanto, é necessária a busca por novos agentes antifúngicos eficazes e

seguros, e as espécies vegetais são uma fonte para a descoberta de novos

antimicrobianos promissores (Perumal Samy and Gopalakrishnakone, 2010).

194

A espécie Ziziphus joazeiro, popularmente conhecida por juá ou juazeiro,

é uma importante planta medicinal do bioma Caatinga e do Nordeste (Carvalho,

2007). As folhas e a casca, devido a sua propriedade espumógena, são

utilizadas na higiene bucal, capilar e da pele (Lorenzi and Matos, 2008). Além

disso, também são utilizadas no tratamento de infecções fúngicas (Cruz et al.,

2007). As folhas apresentam uma vantagem em relação à casca no que se

refere ao seu uso como matéria-prima na obtenção de fitocomponentes, pois a

árvore mantem-se perenifólia durante todo o ano, até mesmo em períodos de

seca, e a sua remoção acarreta menor dano à planta. Apesar disso, para as

folhas são escassos os estudos tanto para a investigação fitoquímica quanto

para a determinação da sua atividade antimicrobiana. Assim, este trabalho tem

como objetivo preencher a lacuna existente quanto a fitoquímica e atividade

antifúngica da espécie, ao mesmo tempo em que se realiza um estudo

etnofarmacologicamente dirigido, visando também fornecer evidências que

justifiquem o uso das folhas no tratamento de infecções fúngicas superficiais.

2. Materiais e métodos

2.1. Material vegetal

As folhas da espécie Ziziphus joazeiro foram coletadas no município de

Maxaranguape, estado do Rio Grande do Norte, nas coordenadas

latitude/longitude -5.484221 -35.311565 e altura de 22 metros em relação ao

nível do mar. A coleta foi realizada no período da tarde, nos meses de

novembro de 2011 e maio de 2012. Uma exsicata do material vegetal foi

depositada no herbário da UFRN sob o número 12253.

2.2 Extração

O extrato hidroetanólico das folhas foi preparado utilizando o método de

maceração, em que o material vegetal, na proporção 1:15 p/v (droga

vegetal:solvente), foi mantido em contato com etanol: H2O (70: 30, v/v) durante

sete dias. Após esse período, o extrato foi filtrado à vácuo e seu volume

reduzido em rotaevaporador a uma temperatura de 40 ºC.

195

2.3 Avaliação da atividade anti-Candida

A atividade do extrato e frações foi determinada pelo ensaio de microdiuição

em caldo, aliado a bioautografia, de modo a permitir a identificação das

substâncias responsáveis pela atividade antifúngica.

2.3.1. Leveduras e meio de cultura

Para a avaliação da atividade antifúngica, foram utilizadas cepas de

referência do gênero Candida, pertencendo às espécies Candida albicans

ATCC90028, Candida tropicalis ATCC13803, Candida dubliniensis CBS7987,

Candida parapsilosis ATCC22019, Candida glabrata ATCC2001, Candida

krusei ATCC6258, Candida rugosa ATCC10571. As leveduras armazenadas a -

20 °C foram reativadas após 3 repiques sucessivos, primeiramente em Agar

Sabouraud Dextrose – SDA (Himedia®) e posteriormente em CHROMagar

Candida®(Difco), sob incubação por 48 horas a 37 ºC. O último repique foi

realizado em meio ASD, com incubação a 37 °C por 48h para o método de

triagem e 24 horas para o método do CLSI utilizando caldo RPMI-1640.

Previamente a realização dos ensaios, foram preparadas suspensões das

leveduras em solução salina estéril 0,85%, as quais foram ajustadas

visualmente com base no tubo 0,5 da escala de McFarland.

2.3.2 Determinação da concentração inibitória mínima

Inicialmente, o extrato hidroetanólico e as frações da partição líquido-

líquido foram dissolvidos em DMSO e o volume completado com caldo Mueler-

Hinton (MHC) estéril ou caldo RPMI-1640, de forma a produzir uma solução

contendo DMSO a 5% v/v. Por apresentar elevada solubilidade em água,

apenas a fração residual aquosa foi dissolvida em MHC estéril puro. Após o

preparo das soluções, essas foram filtradas em filtro de seringa com membrana

de 0,22 µm.

Para o ensaio de microdiluição, primeiramente foram adicionados 100 μL

da amostra nos poços das colunas 1, 2 e 11. Em seguida, foram transferidos

196

100 μL de MHC para os poços das colunas de 2 a 8 e 200 μL para os poços da

coluna 12. Posteriormente, com o auxílio de uma micropipeta multicanal, foi

realizada uma diluição seriada partindo da coluna 2, homogeneizando-se e

retirando-se 100 μL da mistura (meio + amostra) e adicionando-se ao poço da

coluna seguinte. Este procedimento foi repetido até a coluna 9, desprezando-se

os 100 μL restantes. Após a diluição seriada, foram adicionados 100 μL da

solução contendo o inoculo das células de leveduras em cada poço, exceto nas

colunas 1 e 12 (controle de esterilidade da amostra e do meio de cultura,

respectivamente). Os poços das colunas 10 e 11 foram reservados para o

controle de viabilidade do inóculo na ausência e presença do solvente de

DMSO, respectivamente. Subsequentemente, as placas foram incubadas sob

35 ± 2 °C por 48 horas .

As leituras foram realizadas após o período de incubação (48 horas),

observando-se o crescimento nas respectivas diluições através de comparação

visual. A CIM foi considerada como a menor concentração de extrato ou fração

capaz de inibir visualmente o crescimento de cada cepa, tomando como

referência o respectivo controle de viabilidade (Oliveira et al., 2006).

2.3.3 Ensaio de bioautografia

O ensaio de bioautografia foi realizado segundo Rahalison et al.

(Rahalison et al., 1991) com algumas modificações. As placas de CCD

utilizadas foram cromatoplacas de alumínio revestidas com gel de sílica F254

(Macherey-Nagel®)

Primeiramente, as amostras foram dissolvidas em metanol:agua (75:25,

v/v) de modo a formar uma solução a 20 mg/mL (p/v). Em seguida, com o

auxílio de um capilar, 5 a 10 µl das amostras foram aplicadas em 3 placas de

CCD, sendo a quantidade por aplicação correspondente a 100 µg ou 200 µg.

Foram preparadas duas placas para o ensaio de bioautografia,

constituindo assim uma duplicata, e duas placas para comparação, as quais

foram utilizadas para a revelação com os agentes cromogênicos vanilina

sulfúrica e Reagente Natural A. Para o ensaio de bioautografia, também foram

reservadas duas placas de CCD para a realização de uma duplicata dos

controles de viabilidade do inóculo (placa de CCD desenvolvida sem amostra)

197

e viabilidade do inóculo na presença do solvente (placa de CCD desenvolvida

com aplicação do solvente utilizado para a dissolução da amostra).

A CCD foi desenvolvida em uma cuba saturada (10 minutos de

saturação) com a fase móvel acetato de etila:ácido fórmico:metanol:água

(100:15:6:15, v/v/v/v). Os cromatogramas foram secos em capela, com o

auxílio de um secador portátil, para a remoção do solvente.

Subsequentemente, as placas de CCD foram transferidas para uma cabine de

fluxo laminar e submetidas à ação de lâmpada germicida (UV 254 nm) por 20

minutos para efeitos de esterilização. Posteriormente, foram depositadas em

placas de Petri de 150 mm por 15 mm.

Após a etapa de desenvolvimento e acondicionamento das placas de

CCD, 3 mL de uma suspensão de uma cepa de referência de C. glabrata

(ATCC 2001) a aproximadamente 1x108 UFC/mL, foram transferidos para 30

mL de ASD, fundido e mantido em banho-maria a 50°C. O inóculo diluído no

ágar foi então aplicado sobre as placas de CCD com o auxílio de uma pipeta de

vidro estéril. Ao final, as placas de Petri foram incubadas em estufa a 37 °C por

48 horas e, logo após a incubação, visualizadas para a detecção de halos de

inibição.

2.4 Purificação da fração mais ativa

O extrato hidroetanólico das folhas foi submetido a diferentes tipos de

fracionamento, orientados com base nos resultados observados nos testes de

concentração inibitória mínima e bioautografia.

2.4.1. Partição líquido-líquido do extrato

O extrato foi particionado com solventes imiscíveis de polaridade

crescente (éter de petróleo, diclorometano, acetato de etila e n-butanol) na

proporção 5:3 (extrato:solvente, v/v), obtendo-se as frações éter de petróleo

(EP-PLL01), diclorometano (CH2Cl2-PLL01), acetato de etila (AcOEt-PLL01), n-

butanol (BuOH-PLL01) e residual aquosa (RA-PLL01).

198

2.4.2. Cromatografia em contra corrente de alta velocidade

A partir da fração BuOH-PLL01, foram realizadas separações por

cromatografia em contra-corrente de alta velocidade.

2.4.2.1. Equipamento

Para o fracionamento por CCCAV, foi utilizado um Cromatógrafo em

Contracorrente de Alta Velocidade da P.C.Inc.®, equipado com uma coluna em

espiral multicamada de 110 mL e equilibrada com contrapeso, loop de 7 mL,

bomba de alta pressão Merk-Hitachi® modelo L-6000 e um coletor de frações

automático Eldex®.

2.4.2.2 Seleção dos sistemas de solvente

Os sistemas de solventes utilizados nas separações por CCCAV foram

escolhidos com base em testes de tubo de ensaio e teste empírico diretamente

no equipamento de CCCAV.

Os testes em tubo de ensaio consistiram em se adicionar cerca de 5 mg

da fração BuOH-PLL01 num tubo de ensaio contendo o sistema de solventes

previamente equilibrado. O tubo foi agitado vigorosamente para particionar a

amostra entre as duas fases e posteriormente mantido em repouso para o

alcance do equilíbrio. Amostras das duas fases equilibradas foram coletadas e

analisadas por CCD utilizando a fase móvel acetato de etila:ácido

fórmico:metanol:água (100:15:6:15,v/v/v/v) e visualização sob luz UV a 254 nm,

seguido de detecção com Reagente Natural A/UV 365 nm

(difenilborietoxietilamina 3% em MeOH).

199

2.4.2.3. Preparo da amostra e do sistema de solvente

A amostra foi preparada dissolvendo-se 1 g em 6 mL de fase aquosa e 1

mL de fase orgânica. O sistema de solventes utilizado era composto por

acetato de etila:butanol:água (10:4:10/ v/v/v), com adição prévia de 0,2 mL

ácido fórmico na fase orgânica e a adição de amônia na fase aquosa, cuja

quantidade utilizada foi suficiente para tornar o pH em torno de 8.

2.4.2.4. Procedimento da separação por CCCAV

A coluna, enquanto estava estática, foi primeiramente preenchida com

fase estacionária (fase orgânica acidificada) sob um fluxo de 9 mL/min durante

20 minutos. Posteriormente, iniciou-se a rotação do equipamento a 530 rpm e,

enquanto isso, a fase móvel (fase aquosa) foi bombeada para o interior da

coluna no sentido centro-periferia sob um fluxo de 1,2 mL/min. Após o alcance

do equilíbrio hidrodinâmico, caracterizado pela saída de uma única fase, a

amostra foi injetada e as frações coletadas num volume entre 2 e 9 mL.

2.4.3 Obtenção da fração enriquecida em saponinas

As frações 02, 03 e 05-CCCAV foram reunidas (290,3 mg + 43,4 mg +

42,2 mg) e utilizadas num fracionamento por cromatografia em coluna de fase

reversa. As frações reunidas (375,9 mg) foram dissolvidas em 3 mL de

metanol:água (23:77, v/v). Posteriormente, a amostra foi aplicada na coluna

empacotada com fase reversa (Merck Lichroprep ®, 40-63 µm; 21,5 x 2,5 cm de

fase estacionária) e eluida a um fluxo de 0,8 mL/min com um gradiente de

metanol e água. Foram obtidas 9 frações, sendo utilizada a fração 07-CCFR07

no teste biológico.

2.4.4 Isolamento da saponina ZJS1

Após os experimentos com cromatografia em Contra Corrente de Alta

Velocidade, o que restou da fração butanol (25,0495 g) foi utilizado num

fracionamento por partição líquido-líquido. A fração foi suspensa em 300 mL de

200

metanol:água 25:75 (v/v) e submetida a partição líquido-líquido com solventes

de polaridade crescente em funil de separação, numa proporção de 5:3 v/v

amostra/solvente. Foram utilizados, em sequencia, os seguintes solventes: éter

etílico,.acetato de etila, uma mistura composta por acetato de etila e butanol

(60:40, v/v,) e por último o butanol. A partir desse primeiro procedimento, foram

obtidas as frações 01-PLL02, 02-PLL02 e 03-PLL02.

A fração 03-PLL02 (fração acetato de etila:butanol {40:60, v/v}) foi

ressuspensa em 100 mL de metanol:água (20:80, v/v) e submetida a uma

partição líquido-líquido na proporção 5:4 (amostra/solvente), primeiramente

com acetato de etila, seguido do butanol. As frações obtidas com esse

procedimento foram 01-PLL03 e 02-PLL03.

A fração 02-PLL03 (5,6 g) que, de acordo com o seu perfil por CCD,

estava mais concentrada nas substâncias de interesse, foi submetida a uma

cromatografia em coluna de gel de filtração (CGF) utilizando a fase estacionária

Sephadex ® LH-20. Foram realizadas duas separações por esse método

(CGF01 e CGF02), utilizando 2 g de amostra, que foi dissolvida em 8 mL de

MeOH:H2O (6:2, v/v).

Posteriormente, a fração 02-CGF01 (643 mg) e 02-CGF02 (550 mg),

foram submetidas, separadamente, ao mesmo processo, com a exceção de

que as amostras foram dissolvidas em 1,5 mL de MeOH:H2O (1:2, v/v) e

eluídas sob um fluxo de 1 mL/min.

As frações 05-CGF03 e 04-CGF04 foram reunidas (177,1 mg) e

submetidas a uma cromatografia em coluna de fase reversa (CCFR12, 36x2

cm, 100 µl, Chromabond®, Macherey Nagel). A amostra foi dissolvida em 0,7

mL de MeOH:H2O (5:2, v/v) e eluída com um gradiente de MeOH: H2O sob um

fluxo de 0,7 mL/min.

A partir desse procedimento, foram obtidas 10 frações, sendo a fração 5

(5 mg) analisada em equipamento de ressonância magnética nuclear.

201

3. Resultados e discussão

3.1 Atividade do extrato hidroetanólico das folhas (EHF) de Ziziphus joazeiro

frente a cepas de referência

Inicialmente, foi realizada uma triagem da atividade anti-Candida do

EHF de Ziziphus joazeiro Mart. por meio da determinação da concentração

inibitória mínima (CIM). O ensaio foi executado frente a 7 cepas de referência

do gênero Candida e uma de Trichosporon asahii. Após o ensaio, observou-se

que o EHF, na concentração de 5 mg/mL, foi capaz de inibir o crescimento de

quatro leveduras: C. albicans, C. dubliniensis, C. glabrata e C. rugosa (Tabela

1)

Tabela 1 - Concentração inibitória mínima (CIM) do extrato das folhas de Z.

joazeiro Mart.frente a cepas de referência de leveduras de importância clínica.

Cepas de referência CIM

(mg/mL)

Extrato

Candida albicans ATCC90028 5

Candida tropicalis ATCC13803 +*

Candida dubliniensis CBS7987 5

Candida parapsilosis ATCC22019 +

Candida glabrata ATCC2001 5

Candida krusei ATCC6258 +

Candida rugosa ATCC10571 5

Trichosporon asahii CBS 2630 + * Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada; (n = 1)

Em estudos anteriores, o infuso e uma fração butanol concentrada em

saponinas, obtidos da casca do caule de Ziziphus joazeiro, apresentaram

atividade frente a uma gama de espécies fúngicas, incluindo C. albicans, C.

guilliermondii, Cryptococcus neoformans, Trichophyton rubrum, Fonsecaea

pedrosoi e Aspergillus niger. Foi reportada uma CIM de 25 µg/mL para o infuso

da casca frente a C. albicans ATCC18804 (Cruz et al., 2007; Ribeiro et al.,

2013) e uma CIM de 156 µg/mL para a fração butanol frente a C. albicans

ATCC10231.

202

Entretanto, o extrato aquoso das folhas, assim como o seu extrato

hidroetanólico, não apresentaram atividade em ensaios de difusão em ágar e

microdiluição frente a C. albicans, C. guilliermondii, C. krusei ,C. tropicalis, C,

neoformans, T. rubrum e F. pedrosoi (Brito et al., 2015; Cruz et al., 2007; Melo

et al., 2012).

De acordo com a literatura etnobotânica, as cascas são amplamente

utilizadas pela população do Nordeste na limpeza dos dentes e cabelos, devido

à presença de saponinas neste farmacógeno. Para as folhas, também há

dados acerca do seu uso etnobotânico para as mesmas finalidades, assim

como relatos da presença de saponinas (Cartaxo et al., 2010; Leonardo and

Oliveira, 2005; Lorenzi and Matos, 2008) As saponinas são substâncias

anfifílicas, amplamente conhecidas por sua ação desestabilizante sobre

membranas biológicas, além de apresentarem atividade antifúngica in vitro

frente a diferentes cepas, incluindo espécies do gênero Candida (Augustin et

al., 2011; Sparg et al., 2004). Baseado nisso, é evidente que a atividade

antifúngica observada para os extratos da casca, nos estudos de CRUZ et al

(2007) e Ribeiro et al (2013), é decorrente da presença de saponinas. Assim,

uma hipótese que poderia explicar a inatividade das folhas seria a de que

essas apresentam saponinas, porém numa concentração inferior ao teor

presente na casca, a ponto de ser insuficiente para ter atividade biológica

dentro dos limites estabelecidos no estudo. Por consequência, a realização de

um fracionamento poderia tornar essa atividade melhor detectável.

4.3.2 Atividade das frações da partição líquido-líquido do (EHF) de Ziziphus

joazeiro frente a cepas de referência

Considerando essa hipótese, prosseguiu-se o fracionamento do extrato

por meio de uma partição líquido-líquido com solventes de polaridade

crescente, resultando nas frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01,

BuOH-PLL01 e residual RA-PLL01. A partir da determinação da CIM (Tabela

2), observou-se que as cepas inibidas por um maior número de frações foram

Candida albicans, C. glabrata e C. rugosa. Com relação à atividade das

frações, a fração diclorometano foi a que inibiu o maior número de leveduras,

sendo ativa contra 5 espécies. Porém, a fração butanol destacou-se por

203

apresentar a menor CIM, frente à cepa de C. glabrata ATCC2001, numa

concentração de 0,625 mg/mL (Tabela 2). Para verificar a reprodutibilidade

desse resultado, o teste da fração butanol frente a C. glabrata ATCC2001 foi

realizado novamente, desta vez em duplicata, sendo observado o mesmo valor

de CIM.

3.3 Atividade das frações da partição líquido-líquido do (EHF) de Ziziphus

joazeiro frente a cepas de referência

Tabela 2. CIM de frações EP-PLL01, CH2Cl2-PLL01, AcOEt-PLL01, BuOH-

PLL01 e RA-PLL01 frente a cepas de Candida.

Cepas de referência CIM (mg/mL)

EP-

PLL01 CHCl2-PLL01

AcOEt-PLL01

BuOH-PLL01

RA-PLL01

Candida albicans ATCC90028 +* 5 5 5 +

Candida tropicalis ATCC13803 + + + + +

Candida dubliniensis CBS7987 + + + + +

Candida parapsilosis ATCC22019 + + + + +

Candida glabrata ATCC2001 5 5 5 0,625 +

Candida krusei ATCC6258 + 5 + + +

Candida rugosa ATCC10571 + 5 5 5 +

Trichosporon asahii CBS 2630 + 5 + + + * Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada; (n = 1)

A exemplo do estudo de Ribeiro et al (2013), as saponinas são

frequentemente concentradas na fração butanol após um procedimento de

partição líquido-líquido. Uma vez que foi detectada a presença de saponinas na

fração butanol, após o teste de formação de espuma em tubo de ensaio e com

base nas propriedades das saponinas expostas anteriormente, hipotetizou-se

que essas seriam as substâncias responsáveis pela atividade da fração butanol

frente à levedura C. glabrata.

3.4 Prosseguimento do fracionamento bioguiado para a fração BuOH-PLL01

Com base nisso, objetivou-se obter frações concentradas nessas

manchas por meio de técnicas cromatográficas, para posteriormente serem

204

testadas biologicamente. Assim, a fração BuOH-PLL01 foi submetida a uma

separação por CCCAV de refinamento por zona de pH, e a fração 2

cromatografada em coluna de fase reversa. A partir dessa coluna, a fração 7

(07-CCFR07) foi testada pelo ensaio de microdiluição em caldo frente à C.

glabrata, apresentando uma CIM de 0,117 ± 0,055 mg/mL (média ± desvio

padrão).

Com o objetivo de corroborar esses resultados, realizou-se o teste de

bioautografia por revestimento de ágar em duplicata, novamente frente a cepa

ATCC 2001 de C. glabrata. Após a realização da bioautografia, observou-se a

formação de halos de inibição em torno da região correspondente às manchas

azuis presentes no extrato bruto, fração butanol e a fração 07-CCFR07,

observadas na placa controle que foi revelada com vanilina sulfúrica.

Considerando a sua polaridade, essas manchas podem corresponder a

saponinas. A partir da casca de Ziziphus joazeiro, foram isoladas saponinas

derivadas de jujubogenina, bem como de lotogenina, presente em Ziziphus

lotus, sendo todas as saponinas com núcleo damarano (Higuchi et al., 1984;

Schühly et al., 2000). Portanto, é possível que as saponinas detectadas sejam

derivadas das sapogeninas jujugogenina ou lotogenina. Outro resultado

relevante é a seletividade observada para a fração BuOH-PLL01 frente a C.

glabrata, uma importante espécie de Candida não-Candida albicans que

apresenta susceptibilidade intrínseca ao azólicos, além de isolados resistentes

a caspofungina já descritos (Alexander et al., 2013).

3.5. Teste da fração 07-CCFR07 frente a cepas de referência segundo o

método do CLSI

A partir da fração 07-CCFR07, enriquecida em saponinas e de

rendimento satisfatório, foi realizado um novo teste de microdiluição, em caldo

RPMI-1640, utilizando um leque maior de microorganismos. As amostras foram

testadas frente às 8 cepas de referência, com o objetivo de averiguar se a

atividade da fração 07-CCFR07 se estenderia para outras leveduras. Após a

realização do teste, a fração 07-CCFR07, além de inibir o crescimento de C.

glabrata, foi capaz de inibir o crescimento de C. albicans, C. dubliniensis, C.

parapsilosis, C. rugosa e T. asahii. A média da CIM para C. albicans e C.

205

glabrata foi equivalente (94 µg/mL), assim como entre C. dubliniensis e C.

parapsilosis (CIM = 188 µg/mL), e entre C. rugosa e T. asahii (CIM = 125

µg/mL). A concentração fungicida mínima também foi determinada, sendo

observado que Candida rugosa ATCC10571 e Trichosporon asahii CBS2630

apresentaram CFM correspondente a CIM, o que significa dizer que a

concentração de 125 µg/mL apresentou efeito fungicida frente a essas duas

cepas. Por outro lado, para C. albicans ATCC90028, C. dubliniensis CBS7987,

C. parapsilosis ATCC22019 e C. glabrata ATCC2001, a CIM apenas foi capaz

de apresentar efeito fungistático, porém em concentrações maiores foi

observado efeito fungicida (Tabela 3)

Tabela 3. CIM e CFM da fração 07-CCFR07 testada frente a cepas de

Candida.

Cepas de referência CIM (mg/mL)* CFM (mg/mL)*

Candida albicans ATCC90028 0,094±0,044 0,3125±0,265

Candid atropicalis ATCC13803 +** +

Candida dubliniensis CBS7987 0,188±0,088 0,5±0

Candida parapsilosis ATCC22019 0,188±0,088 +

Canida glabrata ATCC2001 0,094±0,044 0,125±0

Candida krusei ATCC6258 + +

Candida rugosa ATCC0571 0,125±0 0,125±0

Trichosporon asahii CBS2630 0,125±0 0,125±0 * Média amostral ± desvio padrão amostral (n = 2) **Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada

A fim de complementar os resultados anteriores, essa mesma fração foi

testada frente a 15 isolados clínicos do banco de cepas do Laboratório de

Micologia Médica e Molecular (LMMM) obtidos a partir do Hospital Universitário

Onofre Lopes. Foram utilizadas 9 cepas de infecção sistêmica e 6 cepas de

infecção superficial coletadas de diferentes fontes, incluindo sangue, urina,

cavidade oral e unha.

Após a determinação da CIM, foi observado que todas as cepas foram

inibidas, exceto Candida parapsilosis LMMM 104 e C. parapsilosis LMMM 84

(CO). A susceptibilidade por cepa de uma mesma espécie e entre espécies foi

variável, porém foi observada uma tendência de menor susceptibilidade para C.

parapsilosis (Tabela 4).

206

Tabela 4. Concentração inibitória mínima (CIM) da fração 07-CCFR07 testada

frente a cepas clínicas.

Isolados clínicos CIM (mg/mL)*

Candida albicans LMMM 116 (U) 0,375±0,177



Candida glabrata LMMM 48 (CO) 0,188±0,088

Candidaglabrata LMMM 79 (S) 0,25±0

Candida glabrata LMMM 249 (S) 0,188±0,088



Candidatropicalis LMMM 21 (Ur) 0,625±0,530

Candida tropicalis LMMM 35 (O) 0,188±0,088

Candida parapsilosis LMMM 81 (S) 0,750±0,354

Candida parapsilosis LMMM 104 (U) +**

Candida parapsilosis LMMM 84 (CO) +

Candida dubliniensis LMMM (CO) 0,188±0,088

Trichosporon asahii LMMM 451 (S) 0,188±0,088 * média amostral ± desvio padrão amostral (n = 2); **Crescimento do micro-organismo na concentração limite de amostra testada S = sangue. Ur = urina. CO = cavidade oral. U = unha;

Uma vez que neste trabalho não foi realizada uma análise fenotípica

detalhada das cepas, nem se conhece o mecanismo de ação dessa fração, não

é possível afirmar a razão de C. tropicalis, C. parapsilosis e C. krusei

apresentarem menor susceptibilidade. Acrescenta que, em estudos

epidemiológicos, a susceptibilidade de espécies do gênero Candida varia de

acordo com a região geográfica, sítio de coleta e tamanho da amostra de cepas

coletadas. Apesar disso, é possível sugerir hipóteses levando em consideração

um dos principais efeitos biológicos das saponinas: a perturbação de

membranas.

Apesar de até o momento não haver uma explicação única e definitiva

de como as saponinas atuam em membranas, em virtude da variação

observada nos resultados, que dependem da natureza química da saponina

estudada, como tipo de aglicona e glicosilação, a maioria dos trabalhos

apontam para um elemento em comum, sobre o qual as saponinas atuam para

que ocorra a perturbação da membrana: o colesterol (Augustin et al., 2011; Hu

207

et al., 1996; Korchowiec et al., 2015; Sudji et al., 2015; Wojciechowski et al.,

2016).

Posto que o ergosterol é o principal esteroide que compõe a membrana

de células fúngicas, a menor susceptibilidade observada para C. tropicalis, C.

parapsilosis e C. krusei poderia ser explicada com base numa alteração do teor

de ergosterol da membrana, caso o mecanismo antifúngico das saponinas

estudadas fosse a complexação com o ergosterol e outros esteroides.

Candida krusei ATCC6258 é a única cepa deste estudo da qual se

conhece previamente sua susceptilibidade aos antifúngicos azólicos, que

inibem a síntese do ergosterol. Segundo OROZCO et al. (Orozco et al., 1998) ,

essa cepa de referência apresenta resistência aos azólicos, possivelmente

devido a uma menor afinidade da enzima 14-α-demetilase a esses antifúngicos.

Não se sabe o que esse mecanismo de resistência poderia influenciar na

menor susceptibilidade às saponinas, considerando a hipótese de se

complexarem com os esteroides da membrana para danifica-la. Porém, isso

abre perspectivas para estudos mais detalhados acerca dos mecanismos

envolvidos na menor susceptibilidade dessa espécie. Ademais, outra

perspectiva para futuros trabalhos é avaliar se a atividade dessa fração

enriquecida em saponinas é dependente da presença de ergosterol e outros

esteroides na membrana da célula fúngica

3.6 Identificação presuntiva da saponina ZJS1

Inicialmente, foram analisados os espectros monodimensionais de 1H e

13C, aliado a análise por HMQC, para identificar sinais característicos das

saponinas isoladas das cascas de Ziziphus joazeiro Mart. por Higuchi et al.

(1984) e Schühly et al. (2000). No espectro de RMN 1H, foi possível observar 7

singletos de alta intensidade em δH 0,73, 0,77, 0,94, 1,00, 1,02, 1,58 e 1,64,

sugestivos de hidrogênios de metila (Figura 39), os quais, por HMQC, foram

atribuídos a seus respectivos carbonos (δH 0,73↔16,4; δH 0,77↔16,5; δH

0,94↔δC 27,6; δH 1,00↔δC 18,8; δH 1,02↔δC 29,7; δH 1,6↔δC 18,5; δH1,64↔δC

25,7), vários sinais sobrepostos entre δH 3,2 e 3,9, indicativo de hidrogênios de

açúcar (Figura 40), além de dubletos entre δH 4,2 e 5,5, sugestivos de

hidrogênios de carbonos anoméricos. Após a análise do espectro de 13C

208

(Figura 42), contatou-se a presença de 23 sinais sugestivos de carbonos

saturados, 17 sinais de metinas ou metilenos oxigenados e 3 sinais

característicos de carbonos anoméricos (δC 103,15↔ δH4,40 [d, J = 8,0 Hz];

104,79↔ δH [4,25, d, J = 6,8 Hz]; 108,73↔ δH 5,13 [d, J = 2,3 Hz]) o que

permite sugerir a presença de 3 açúcares ligados a aglicona. Ainda,

destacaram-se 2 sinais em campo mais desprotegido, em δC 126,27 e 133,92,

sugestivos de carbono olefínico.

Apesar de os espectros terem sido obtidos em DMSO, observou-se uma

semelhança e corência desses deslocamentos químicos com os da saponina

bacosídeo X, obtidos em metanol e piridina.. Portanto, a partir dos dados

obtidos na análise preliminar, foi realizada uma estratégia de atribuição

sequencial dos sinais da aglicona através das correlações homo e

heteronucleares de HMQC, HMBC, COSY e NOESY, assim como em

comparação com a literatura citada. Por conseguinte, foi possível atribuir todos

os sinais de hidrogênios e carbonos observados para a aglicona e uma parte

dos sinais referentes à porção glicídica (Tabela 5 e 6).

Figura 2. Principais correlações de HMBC e COSY observadas.

Flecha azul = correlação de HMBC. Flecha vermelha = correlação de COSY.

O

O

OH

O

O O

OH OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OHO

OH2

1

3

45

67

89

10

29(28)

28(29)

30

13

12

1118

14

1716

20

22

23

24

26(27)

27(26)25

19

15

1'2'

3'

4'5'

2''

5''

3''

4''1''

1'''2'''

3'''

4'''5'''

6'''

21

209

ZJS1 Bacopasídeo X*

Posição δ C (ppm) δ H (ppm), multiplicidade, J (Hz) HMBC Posição δ C (ppm) δ H (ppm), multiplicidade, J (Hz)

1 38,6 1,55 (m); 0,84 (m) H-19 1 39,8 1,67 (m); 0,92 (m) 2 26,3 1,52 (m), 1,65 (m) - 2 27,3 1,85 (m); 1,70 (m) 3 88,3 2,96 (dd, J = 11,6; 4,0) H-28, H-29, H-1' 3 90,3 3,11 (dd, J = 12,3; 4,3) 4 39,4 - H-28, H-29 4 40,6 - 5 55,8 0,66 (d, J = 11,6 Hz) H-28, H-29 5 57,4 0,74 (d, J = 9,1) 6 18,0 1,47 (m); 1,35 (m) - 6 19,1 1,59 (m); 1,52 (m) 7 35,7 1,45 (m); 1,32 (m) H-18 7 36,9 1,56 (m); 1,49 (m) 8 37,2 - - 8 38,5 - 9 52,4 0,78 (m) H-19 9 54,1 0,88 (m)

10 37,1 - H-19 10 38,3 - 11 21,5 1,48 (m) - 11 22,5 1,64 (m), 1,50 (m) 12 28,1 1,69 (m); 1,73 (m) - 12 29,2 1,86 (m); 1,67 (m) 13 37,1 - H-18 13 38 2,48 (ddd, J = 12,5; 6,7; 6,4) 14 53,1 - H-18 14 54,6 - 15 36,2 1,89 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 0,98 (s) H-30b 15 36,7 2,06; 1,18 (2d, J = 8,7) 16 109,9 - H-21, H-17 16 111,4 - 17 53,3 0,82 (d, J = 6,4 Hz, 1H) - 17 54,4 1,00 (d, J =6,7) 18 18,8 1,00 (s) - 18 19,2 1,14 (s) 19 16,5 0,77 (s) - 19 16,8 0,88 (s) 20 67,9 - H-22 20 69,4 - 21 29,7 1,02 (s) - 21 29,6 1,14 (s) 22 44,6 1,23 (m); 1,36 (m) H-21 22 45,5 1,47 (m); 1,38 (m) 23 67,9 4,48 (m) H-21 23 69,7 4,68 (ddd, J = 11,3; 8,1; 1,3) 24 126,3 5,08 (dt, J = 8,0 Hz) H26, H-27 24 126,3 5,15 (m) 25 134,0 - H-26, H-28 25 136,7 - 26 25,7 1,64 (s) H-27, H-24 26 25,8 1,72 (s) 27 18,5 1,58 (s) H-26, H-24 27 18,4 1,70 (s) 28 27,6 0,94 (s) H-29 28 28,3 1,05 (s) 29 16,4 0,73 (s) H-28 29 16,8 0,85 (s) 30 65,4 3,64; 3,82 H-15 30 66,9 4,03; 3,94 (2d, J = 12,6)

Tabela 5. Dados espectrais de RMN 1H (500 MHz) e RMN 13C (125 MHz) da saponina ZJS1 (DMSO-d6) observados para a

aglicona, em comparação com a literatura.

* SCHÜHLY et al (2000); 400 MHz, CD3OD

210


glicona, em comparação com a literatura.

ZJS1

Bacopasídeo X*

Posição δ C (ppm) δ H (ppm); multiplicidade; J (Hz) HMBC COSY Posição δ C

(ppm) δ H (ppm); multiplicidade; J

(Hz)

3-arabnopiranosil

3-arabnopiranosil

1' 104,8 4,25 (d, J= 6,8 Hz) H-3, H-2' H-3, H-2', H-4' 1' 106 4,39 (d,J=6.4)

2' 75,3 3,57 (m)

H-1' 2' 77,2 3,75 (dd)

3' 81,7 3,63 (m) H-2', H-

1''' H-1''' 3' 83,7 4,05 (dd, J=5,1, 2,6)

4' 67,5 3,82 (m) - H-1' 4' 69,2 4,03 (ddd)

5' 65,4 3,66 (m); 3,36 (m) H-1' - 5' 65,9 3,85 (dd), 3.54 (dd)

2'-arabnofuranosil

2'-arabnofuranosil

1'' 108,8 5,13 (d, J = 2,3 Hz) H-2' H-2'' 1'' 110,3 5,30 (d, J= 2,6)

2'' 82,7 3,87 (td, J = 2,4 Hz) - H-1''' 2'' 83,7 4,09 (dd, J = 5,0; 2,6)

3'' - - - - 3'' 77,9 3.93 (dd)

4'' - - - - 4'' 84,6 3.97 (ddd)

5'' - - - - 5'' 62,1 3,71, 3,60 (2dd, J= 12,3, 2,9)

3'-glicopiranosil

3'-glicopiranosil

1''' 103,2 4,40 (d, J = 8,0 Hz) H-2''' H-3', H-2''' 1''' 104,9 4,51 (d, J = 7,6)

2''' 74,1 3,12 (m) - H-1''' 2''' 75,2 3,28 (dd)

3''' - - - - 3''' 77,7 3,92 (dd, J = 7,6; 4,9)

4''' - - - - 4''' 71,1 3,33 (dd)

5''' - - - - 5''' 77,8 3,35 (ddd)

6''' - - - - 6''' 62,3 3,83; 3,67 (2dd, J = 8,2; 5,2) * SCHÜHLY et al (2000); 400 MHz, CD3OD

211

As análises dos espectros ainda estão em andamento para a confirmação

da porção glicídica, sendo ainda necessárias outras análises, como espectrometria

de massas, para confirmar a identidade da molécula. Com base na análise

realizada até o momento, a substância ZJS1 foi presuntivamente identificada como

bacopasídeo X ou 3-O-[α-L-arabinofuranosil-(1 → 2)-{β-D-glicopiranosil-(1 → 3)-}-α-

L-arabinopiranosil] jujubogenina.

Para essa saponina, foi repordata sua atividade inibitória contra Candida

albicans, Cryptococcus neoformans e Aspergillus fumigatus, assim como frente a

diferentes linhagens de células humanas tumorais, nos estudos da espécie

Colubrina retusa (LI et al., 1999) e Bacopa monnieri (PENG et al., 2010).

A saponina bacopasídeo X foi isolada da casca de Ziziphus joazeiro

primeiramente por HIGUCHI et al (1984), seguido de SCHÜHLY et al (2000), em que

estes últimos observaram que essa saponina era majoritária na casca. Apesar de

não ter sio realizada a sua quantificação nas folhas, possivelmente essa saponina

também é majoritária nessa parte, pois na análise por CCD com o revelador vanilina

sulfúrica, realizada para o extrato hidroetanólico, observou-se uma intensa mancha

azul de Rf equivalente ao observado para essa saponina.

4. Conclusão

Em suma, foi demonstrado que as principais substâncias antifúngicas do

extrato hidroetanólico das folhas de Ziziphus joazeiro Mart. são as saponinas, as

quais possivelmente estavam em menor concentração no extrato antes do

fracionamento, fornecendo evidências para justificar o uso etnobotânico das folhas

da espécie no tratamento de micoses superficiais. A fração 05-CCFR12 apresentou

atividade frente a uma variedade de cepas de Candida, abrangendo a totalidade de

cepas observadas em estudos de prevalência de infecções invasivas (YAPAR,

2014). A técnica de bioautografia mostrou-se uma importante ferramenta para o

fracionamento bioguiado ao aliar informações de atividade biológica com

informações fitoquímicas. É importante ressaltar a cautela que se deve tomar na

realização desse tipo de estudo, evitando basear-se em poucos resultados e

critérios para descartar uma amostra. O relato da presença de bacopasídeo X nas

folhas de Ziziphus joazeiro é inédido, não sendo encontrado na literatura, até o

momento, trabalhos com abordagem e finalidades semelhantes para a espécie,

212

assim como para o gênero. Assim, este estudo tem caráter inédito e abre novas

oportunidades de investigação científica quanto à atividade antifúngica das

saponinas presentes nas folhas de Ziziphus joazeiro.

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216

APÊNDICE B - ESTRUTURA QUÍMICA DAS SUBSTÂNCIAS MENCIONADAS NA

DISSERTAÇÃO

Lista das substâncias por ordem de citação

N º Nome citado CAS Classe

1 nicotina 54-11-5 alcaloide

2 reserpina 50-55-5 alcaloide indólico

3 muscarina 300-54-9 alcaloide

4 miconazol 22916-47-8 antifúngico azólico

5 fluconazol 86386-73-4 antifúngico azólico

6 voriconazol 137234-62-9 antifúngico azólico

7 posaconazol 171228-49-2 antifúngico azólico

8 ergosterol 57-87-4 esterol

9 nistatina 1400-61-9 antifúngico macrolídeo

10 anfotericina B 1397-89-3 antifúngico macrolídeo

11 caspofungina 179463-17-3 antifúngico

equinocandina

12 micafungina 235114-32-6 antifúngico

equinocandina

13 flucistosina 2022-85-7 diazina

14 pirimidina 289-95-2 diazina

15 óxido nítrico 10102-43-9 óxido de nitrogênio

16 miricitrina 17912-87-7 flavonoide (flavonol)

17 rutina 153-18-4 flavonoide (flavonol)

18 quercitrina 522-12-3 flavonoide (flavonol)

19 quercetina 117-39-5 flavonoide (flavonol)

20 diclorometano 75-09-2 organoclorado

21 metanol 67-56-1 alcoól

22 hexano 110-54-3 alcano

23 clorofórmio 67-66-3 organoclorado

217

24 etanol 64-17-5 alcóol

25 acetato de etila 141-78-6 éster carboxílico

26 mucronina A 38840-25-4 alcaloide cliclopeptídico

27 mucronina D 38496-00-3 alcaloide cliclopeptídico

28 mucronina J 177714-94-2 alcaloide cliclopeptídico

29 ácido ceanótico 21302-79-4 ácido triterpênico

30 ácido ceanotênico 5948-16-3 ácido triterpênico

31 ácido zizimaurítico A 1403460-06-9 ácido triterpênico

32 ácido zizimaurítico B 1403460-07-0 ácido triterpênico

33 ácido zizimaurítico C 1403460-08-1 ácido triterpênico

34 ácido betulínico 472-15-1 ácido triterpênico

35 oxifilina B 1453167-58-2 alcaloide ciclopeptídico

36 oxifilina C 1453167-59-3 alcaloide ciclopeptídico

37 oxifilina D 1244672-17-0 alcaloide ciclopeptídico

38 nummularina C 53947-97-0 alcaloide ciclopeptídico

39 nummularina R 113836-69-4 alcaloide ciclopeptídico

40 quercetina-3-O-α-L-arabinosil-(1 → 2)-α-

L-rhamnosídeo 104683-55-8 flavonoide (flavonol)

41 quercetina-3-O-β-d-xilosil-(1 → 2)-α-L-

ramnosídeo 1327275-49-9 flavonoide (flavonol)

42 ziziphus saponina 1 77943-56-7 saponina (damarano)


44 ácido alfitólico 19533-92-7 ácido triterpênico

45 ácido maslínico 4373-41-5 ácido triterpênico

46 ácido 2-α-hidroxiursólico 4547-24-4 ácido triterpênico

47 ácido ziziberanálico 67594-73-4 ácido triterpênico

48 ácido epiceanótico 912676-19-8 ácido triterpênico

49 ácido oleanólico 508-02-1 ácido triterpênico

50 jujubogenina 54815-36-0 triterpeno

51 bacopasídeo X 94443-88-6 saponina (damarano)

218

52 β-D-glicopiranose 492-61-5 carboidrato

53 α-L-arabinofuranose 38029-69-5 carboidrato

54 α-L-arabinopiranose 7296-55-1 carboidrato

55 bacopasídeo X 4’’’-O-sulfato 94414-14-9 saponina (damarano)

56 bacopasídeo X 3’’, 4’’’-di-O-sulfato 94414-15-0 saponina (damarano)

57 lactona ebelin 3649-76-1 triterpeno

58 cafeína 58-08-2 metilxantina

59 ácido ursólico 77-52-1 ácido triterpênico

60 ácido betulínico 7-β-O-(4-

hidroxibenzoiloxi) 256932-93-1 ácido triterpênico

61 ácido betulínico 7-β-O-(4-hidroxi-3'-

metoxibenzoiloxi) 256932-94-2 ácido triterpênico

62 ácido betulínico 27-O-(4-hidroxi-3'-


63 jujubosídeo A 55466-04-1 saponina (damarano)

64 lotosídeo A 292044-97-4 saponina (damarano)

65 lotosídeo I 189136-86-5 saponina (damarano)

66 lotosídeo II 189163-11-9 saponina (damarano)

67 joazeirogenina 292044-99-6 triterpeno

68 joazeirosídeo A 292044-89-4 saponina (damarano)

69 joazeirosídeo B 292044-93-0 saponina (damarano)

70 ácido gálico 149-91-7 ácido fenólico

71 ácido clorogênico 327-97-9 ácido fenólico

72 ácido cafêico 331-39-5 ácido fenólico

73 ácido elágico 476-66-4 ácido fenólico

74 catequina 154-23-4 flavonoide (flavano-3-ol)

75 epicatequina 490-46-0 flavonoide (flavano-3-ol)

76 isoquercitrina 482-35-9 flavonoide (flavonol)

77 canferol 520-18-3 flavonoide (flavonol)

78 amoxicilina 26787-78-0 β-lactâmico

79 penicilina G 61-33-6 β-lactâmico

219

80 gentamicina 1403-66-3 aminoglicosídeo

81 amicacina 37517-28-5 aminoglicosídeo

82 vancomicina 1404-90-6 glicopeptídeo

83 2,2-difenil-2-picrilhidrazila 1898-66-4 nitrofenol (picrato)

84 N-Nitroso-N-etilureia 684-93-5 nitrosoureia

85 acetona 67-64-1 cetona

86 acetonitrila 75-05-8 alcanonitrila

87 dimetilsulfóxido 67-68-5 organosulfóxido

88 n-butanol 71-36-3 álcool

89 tolueno 108-88-3 hidrocarboneto

aromático

90 ácido sulfúrico 7664-93-9 ácido inorgânico

91 ácido acético 64-19-7 ácido carboxílico

92 ácido fórmico 64-18-6 ácido carboxílico

93 hidróxido de amônio 1336-21-6 base inorgânica

94 cloreto férrico 7705-08-0 cloreto

95 difenilborietoxietilamina 524-95-8 organoborano

96 vanilina 121-33-5 benzaldeído

97 ácido tânico 1401-55-4 tanino (galotanino)

98 apigenina 520-36-5 flavonoide (flavona)

99 crisina 480-40-0 flavonoide (flavona)

100 diosmina 520-27-4 flavonoide (flavona)

101 isoorientina 4261-42-1 flavonoide (flavona)

102 isovitexina 38953-85-4 flavonoide (flavona)

103 luteolina 491-70-3 flavonoide (flavona)

104 morina 654055-01-3 flavonoide (flavonol)

105 narigenina 480-41-1 flavonoide (flavanona)

106 vicenina-2 23666-13-9 flavonoide (flavonol)

107 vitexina 3681-93-4 flavonoide (flavonol)

108 ácido 2,4 dinitrobenzóico 610-30-0 nitrobenzoato

220

109 sulfassalazina 599-79-1 sulfonamida

110 tiopental 76-75-5 barbiturato

111 licodaína 137-58-6 acetanilida

112 isoramnetina 480-19-3 flavonoide (flavonol)

113 quercetina 3-O-galactosídeo 482-36-0 flavonoide (flavonol)

114 canferol-3-O-rutinosídeo 17650-84-9 flavonoide (flavonol)

115 isoramnetina-3-O-rutinosídeo 604-80-8 flavonoide (flavonol)

116 isoramnetina-3-O-galactosídeo 6743-92-6 flavonoide (flavonol)

117 isoramnetina-3-O-glicosideo 5041-82-7 flavonoide (flavonol)

118 jujubosídeo B 55466-05-2 saponina (damarano)

119 jujubosídeo D 194851-84-8 saponina (damarano)

120 jujubosídeo E 855184-67-7 saponina (damarano)

121 escopoletina 92-61-5 cumarina

122 colesterol 57-88-5 esterol

221

Nº Nome citado CAS Classe

1 nicotina 54-11-5 alcaloide

N

N


2 reserpina 50-55-5 alcaloide indólico

O

O

O

O

O

O

O

O

ON

NH H

H

H


3 muscarina 300-54-9 alcaloide

O

N+

OH

222


4 miconazol 22916-47-8 antifúngico azólico

Cl

Cl

O

Cl

Cl

N

N


5 fluconazol 86386-73-4 antifúngico azólico

F

F

N

N

N

NN

NOH


6 voriconazol 137234-62-9 antifúngico azólico

H

N

NF

OH

NN

N

F F

223


7 posaconazol 171228-49-2 Antifúngico azólico

FF

OO

O

OH

N NN

N

N

NN

N


8 ergosterol 57-87-4 esterol

OH

HH

H


9 nistatina 1400-61-9 antifúngico macrolídeo

O

O

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH OH

OH

OH

OH

O

O

OH

O

NH2

224


10 anfotericina B 1397-89-3 antifúngico macrolídeo

O

OHOH

O

O

OH

O

OH

OHOH

OH

OH

O

OHOH OHO

NH2

H


11 caspofungina 179463-17-3 antifúngico equinocandina

O

OH

OO

O O

OH

OH

OH

OH

OHO

OH

OH

O

N

N

NH

NH

NH

NH

NH

NH

NH2

NH2


12 micafungina 235114-32-6 antifúngico equinocandina

S

OH

OO O

O

OH

O

OH

OH

OH

OH

O

OH

OHO

O

OH

O

OO

O

OHO

N

N

NH

NH

NH

NH

NH

N

NH2

225


13 flucistosina 2022-85-7 diazina

OH

N

N

NH2

F


14 pirimidina 289-95-2 diazina

N N


15 óxido nítrico 10102-43-9 óxido de nitrogênio

O NH

226


16 miricitrina 17912-87-7 flavonoide (flavonol)

O

O

OH

OH

OH

O

OOH

OH

OH

OH

OH


17 rutina 153-18-4 flavonoide (flavonol)

O

O

O

O

OOH

OH O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH


18 quercitrina 522-12-3 flavonoide (flavonol)

O

O

OOH

OHOH

OH

OH

OH

O

OH

227


19 quercetina 117-39-5 flavonoide (flavonol)

O

OH

OH O

OH

OH

OH


20 diclorometano 75-09-2 organoclorado

Cl

Cl


21 metanol 67-56-1 alcoól

OH

228


22 hexano 110-54-3 alcano


23 clorofórmio 67-66-3 organoclorado

Cl

Cl

Cl


24 etanol 64-17-5 alcóol

OH

229


25 acetato de etila 141-78-6 éster carboxílico

O

O


26 mucronina A 38840-25-4 alcaloide cliclopeptídico

O

NH

ONH

OH

NH

O

N

H


27 mucronina D 38496-00-3 alcaloide cliclopeptídico

NH

N

OO

N

O

O

NH

NH O

O

230


28 mucronina J 177714-94-2 alcaloide cliclopeptídico

O N

ONH

NH OH

O

H

H

N


29 ácido ceanótico 21302-79-4 ácido triterpênico

OH O

H

H

OH

O

OH

HH


30 ácido ceanotênico 5948-16-3 ácido triterpênico

OHO

OH O

H

HH

H

231


31 ácido zizimaurítico A 1403460-06-9 ácido triterpênico

OH O

O

O

O

H

H

H


32 ácido zizimaurítico B 1403460-07-0 ácido triterpênico

OH O

O

O

O

H

H

H


33 ácido zizimaurítico C 1403460-08-1 ácido triterpênico

OH O

H

O

O

OH

H

H

232


34 ácido betulínico 472-15-1 ácido triterpênico

OH O

OH

HH

H

H


35 oxifilina B 1453167-58-2 alcaloide cliclopeptídico

O N

ONH

NH OH

O

H

H

NH

O


36 oxifilina C 1453167-59-3 alcaloide cliclopeptídico

NHNH

OO

O

NH

N

O

H

O

H

233


37 oxifilina D 1244672-17-0 alcaloide cliclopeptídico

O N

O

ONH

N

O

HO

HH

N


38 numularina C 53947-97-0 alcaloide cliclopeptídico

N

O

N

O

O

NH

NH O

OH

H


39 numularina R 113836-69-4 alcaloide cliclopeptídico

NH

N

O

N

O

O

NH

NH O

OH

H

234


40 quercetina-3-O-α-L-arabinosil-(1 → 2)-α-L-

rhamnosídeo 104683-55-8 flavonoide (flavonol)

O

O

OOH

OH

OH

OH

O

OH

OH

OOH

H

OH

OOH


41 quercetina-3-O-β-d-xilosil-(1→ 2)-α-L-ramnosídeo 1327275-49-9 flavonoide (flavonol)

O

O

OOH

OH

OH

OH

O

OH

OH

OOH

H

OH

OOH



O

O

OH

H

O

O

OH

OH

OOH

H

O

O

OH

OH

OH

OH

H

OOH

H

H

H

H

235



O

O

OH

H

O

O

OH

OH

OOH

H

O

O

OH

OH

OH

OH

H

OOH

H

H

H

H


44 ácido alfitólico 19533-92-7 ácido triterpênico

OH O

OH

OH

HH

H

H


45 ácido maslínico 4373-41-5 ácido triterpênico

OH

O

HOH

OH

H

H

236


46 ácido 2-α-hidroxiursólico 4547-24-4 ácido triterpênico

OH

O

HOH

OH

H

H


47 ácido ziziberanálico 67594-73-4 ácido triterpênico

OH

O

HOH

OH

H

H


48 ácido epiceanótico 912676-19-8 ácido triterpênico

OH

O

HOH

OH

H

H

237


49 ácido oleanólico 508-02-1 ácido triterpênico

OH

O

H

OH

H

H


50 jujubogenina 54815-36-0 triterpeno

O

O

OH

H

OH

H

H

H


51 bacopasídeo X 94443-88-6 saponina (damarano)

O

O

OH

H

O

O O

OH OH

OHH

O

O

OH

OH

OH

OH

H

OOH

H

H

H

H

238


52 β-D-glicopiranose 492-61-5 carboidrato

OH

OH

OH

O

OH

OH


53 α-L-arabinofuranose 38029-69-5 carboidrato

OH

OH

OOH

OH


54 α-L-arabinopiranose 7296-55-1 carboidrato

OH

OH

OH

O

OH

239


55 bacopasídeo X 4’’’-O-sulfato 94414-14-9 saponina (damarano)

O

O

OH

H

O

O

OH

OOH

OH

H

O

O

OH

OH

OH

OS

O O

OH

H

OOH

H

H

H

H


56 bacopasídeo X 3’’, 4’’’-di-O-sulfato 94414-15-0 saponina (damarano)

O

O

OH

H

O

O

OH

OOH

O

SO

O

OH

H

O

O

OH

OH

OH

OS

O O

OH

H

OOH

H

H

H

H


57 lactona ebelin 3649-76-1 triterpeno

OH

H

HO

O

240


58 cafeína 58-08-2 metilxantina

O

N

N

ON

N


59 ácido ursólico 77-52-1 ácido triterpênico

OH

O

OH

H

H

H


60 ácido betulínico 7-β-O(4-hidroxibenzoiloxi) 256932-93-1 ácido triterpênico

OH O

H

O

O

OH

OH

HH

H

241


61 ácido betulínico 7-β-O-(4-hidroxi-3'-


OH O

H

O

O

O

OH

OH

HH

H


62 ácido betulínico 27-O-(4-hidroxi-3'-


O

O

O

OH

OH O

H

OH

HH

H


63 jujubosídeo A 55466-04-1 saponina (damarano)

O

O

OH

H

O

O

OH

OH

OOH

H

O

O

OH

OH

OOH

H

OH

O

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

H

OOH

H

H

H

H

242


64 lotosídeo A 292044-97-4 saponina (damarano)

OH

OHO

OH

H

O

O

O

O

OH

OH

OH

OH

H

O

OH

O

OH

OH

H O

OH

OH

H

OH

OOH

H

H

H

H


65 lotosídeo I 189136-86-5 saponina (damarano)

OH

OHO

OH

H

O

O

OH

OH

OOH

H

O

O

OH

OH

OH

OH

H

O

OH

OH

H

H

H

H


66 lotosídeo II 189163-11-9 saponina (damarano)

OH

OHO

OH

H

O

O

OH

OH

OOH

H

O

O

OH

OH

OH

OH

H

O

OH

OH

H

H

H

H

243


67 joazeirogenina 292044-99-6 triterpeno

OH

OHO

OH

H

OH

H

H

H


68 joazeirosídeo A 292044-89-4 saponina (damarano)

OH

OHO

OH

H

O

O

OH

OH

OH

OH

H

H

H

H


69 joazeirosídeo B 292044-93-0 saponina (damarano)

OH

OHO

OH

H

O

O

O

O

OH

OH

OH

OH

H

O

OH

O

OH

OH

H O

OH

OH

H

OH

OOH

H

H

H

H

244


70 ácido gálico 149-91-7 ácido fenólico

OH

O

OH

OH

OH


71 ácido clorogênico 327-97-9 ácido fenólico

O

OH

OH

O

OHO

OH

OH

OH


72 ácido cafêico 331-39-5 ácido fenólico

OH

O

OH

OH

245


73 ácido elágico 476-66-4 ácido fenólico

OH

OOH

O

OH

O

O

OH


74 catequina 154-23-4 flavonoide (flavano-3-ol)

OH

O

OH

OH

OH

OH


75 epicatequina 490-46-0 flavonoide (flavano-3-ol)

OH

O

OH

OH

OH

OH

246


76 isoquercitrina 482-35-9 flavonoide (flavonol)

O

O

OOH

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH


77 canferol 520-18-3 flavonoide (flavonol)

O

O

OH

OH

OH

OH


78 amoxicilina 26787-78-0 β-lactâmico

S

O

O

OH

OOH

N

NH

NH2H

247


79 penicilina G 61-33-6 β-lactâmico

S

O

O

OH

O N

NHH


80 gentamicina 1403-66-3 aminoglicosídeo

O

NH2

NHOH

O

NH2

NH2

O

O

OH

NH

OH

H


81 amicacina 37517-28-5 aminoglicosídeo

O

O

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

OHO

OHOH

NH

NH2

NH2

NH2

NH2

248


82 vancomicina 1404-90-6 glicopeptídeo

OO

Cl

OHCl

OH

O

O

O

NH2

OH

OH

OH

OOH

NH

NH

OO

O

NH2

O

NH

O

NH

NH

ONH

O

O

OHNH

OHOH OH


83 2,2-difenil-2-picrilhidrazila 1898-66-4 nitrofenol (picrato)

O-

O-

O

O

O-

O

N

NH

N+

N+

N+


84 N-Nitroso-N-etilureia 684-93-5 nitrosoureia

N

N O

NH2

O

249


85 acetona 67-64-1 cetona

O


86 acetonitrila 75-05-8 alcanonitrila

N


87 dimetilsulfóxido 67-68-5 organosulfóxido

S

O

250


88 n-butanol 71-36-3 álcool

OH


89 tolueno 108-88-3 hidrocarboneto aromático


90 ácido sulfúrico 7664-93-9 ácido inorgânico

S

O

O

OH OH

251


91 ácido acético 64-19-7 ácido carboxílico

O

OH


92 ácido fórmico 64-18-6 ácido carboxílico

O

OH


93 hidróxido de amônio 1336-21-6 base inorgânica

OH-

NH4

+

252


94 cloreto férrico 7705-08-0 cloreto

Cl

FeClCl


95 difenilborietoxietilamina 524-95-8 organoborano

NH2

O

B


96 vanilina 121-33-5 benzaldeído

O

O

OH

253


97 ácido tânico 1401-55-4 tanino (galotanino)

O

O

OO

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

OH

OH

OH

OHOH

OH

OOH

OHO

O

O

O

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OH

OHOH OH

OH

OH

OH OH

OH

OH

OH

OH


98 apigenina 520-36-5 flavonoide (flavona)

O

O

OH

OH

OH


99 crisina 480-40-0 flavonoide (flavona)

OH

OH O

O

254


100 diosmina 520-27-4 flavonoide (flavona)

O

O

OH

O

OH

O

O

O

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH


101 isoorientina 4261-42-1 flavonoide (flavona)

OH

OH

O

O

OH

O

OH

OH

OH

OH

OH


102 isovitexina 38953-85-4 flavonoide (flavona)

OH

OH

O

O

OH

O

OH

OH

OH

OH

255


103 luteolina 491-70-3 flavonoide (flavona)

O

O

OH

OH

OH

OH


104 morina 654055-01-3 flavonoide (flavonol)

O

O

OHOH

OH

OH

OH


105 narigenina 480-41-1 flavonoide (flavanona)

O

O

OH

OH

OH

256


106 vicenina-2 23666-13-9 flavonoide (flavona)

OH

O

OH

OH

OH

OHOH O

O

OHO

OH

OH

OH

OH


106 vitexina 3681-93-4 flavonoide (flavona)

OH

OH O

O

OHO

OH

OH

OH

OH


108 ácido 2,4 dinitrobenzóico 610-30-0 nitrobenzoato

OH

ON+

O-

O

N+O

-

O

257


109 sulfassalazina 599-79-1 sulfonamida

SNH

NOO

NN

OHO

OH


110 tiopental 76-75-5 barbiturato

O NH

NH

O

S


111 lidocaína 137-58-6 acetanilida

NHN

O

258


112 isoramnetina 480-19-3 flavonoide (flavonol)

O

O

OH

O

OH

OH

OH


113 quercetina 3-O-galactosídeo 482-36-0 flavonoide (flavonol)

O

O

OOH

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH


114 canferol-3-O-rutinosídeo 17650-84-9 flavonoide (flavonol)

O

O

OOH

OH

OH

O

O

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH

259


115 isoramnetina-3-O-rutinosídeo 604-80-8 flavonoide (flavonol)

O

O

OOH

OH

O

OH

O

O

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH


115 isoramnetina-3-O-galactosídeo 6743-92-6 flavonoide (flavonol)

O

O

OOH

OH

O

OH

OH

OH

OH

O

OH


117 isoramnetina-3-O-glicosídeo 5041-82-7 flavonoide (flavonol)

O

O

OOH

OH

O

OH

OH

OH

OH

O

OH

260


118 jujubosídeo B 55466-05-2 saponina (damarano)

O

O

OH

H

O

O

OH

OH

OOH

H

O

O

OH

OH

OOH

H

OH

O

OH

OH

H

OOH

H

H

H

H


119 jujubosídeo D 194851-84-8 saponina (damarano)

O

O

OH

H

O

O

OH

OH

OOH

H

O

O

OH

OH

OOH

H

OH

O

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

H

OOH

H

H

H

H


120 jujubosídeo E 855184-67-7 saponina (damarano)

O

H

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OOH

H

H

H

H

OH2

261


121 escopoletina 92-61-5 cumarina

O

OH O O


122 colesterol 57-88-5 esterol

OH

H

H

H

H

262

ANEXO A

ministÉrio da educaÇÃo universidade federal do … · ácidos fenólicos, cumarinas, ... clae-em...

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