Controle Microbiológico Controle Microbiológico de Produtos não de Produtos não

estéreisestéreis

“Produtos não estéreis são aqueles nos quais se admite conceitualmente a presença de carga microbiana, embora limitada, tendo em vista as características de sua utilização”.

Cosméticos, produtos farmacêuticos tópicos e orais

Contato com áreas portadoras de flora microbiana natural!!!

Atenção no CQ destes produtos deve assegurar que a carga microbiana presente (quali e quantitativo) não comprometa a sua qualidade final ou mesmo a segurança do paciente.

Altas cargas microbianas presentes no produto farmacêutico não estéril podem comprometer:

A segurança do paciente e/ou usuário que não esteja saudável, dependendo ainda das características de utilização de cada produto.

A estabilidade do mesmo, interferindo diretamente na sua qualidade intrínseca.

A qualidade microbiológica de um produto não estéril é proporcionada pela adoção e respeito às Boas Práticas de Fabricação, sendo necessário e complementar às BPF a adição de conservantes.

CQ tem como objetivo imediato – comprovar a ausência de microorganismos patogênicos e determinar o número de microorganismos viáveis, em função dos tipos de utilização do produto.

Risco ao consumidor: Risco ao consumidor:

Saprófitas – agentes infectantes oportunistas (deterioração de produtos) – TOLERA-SE CARGA MICROBIANA!!! Patogênicos (Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus) – risco de quadro clínico infeccioso – PROIBITIVO A PRESENÇA!!!

Ex. consumidor ser debilitado ou imunodeprimido; Cosméticos em pele sensível – bebê.

Cuidados quanto ao limite microbiano!!!

Estabilidade do produto: Estabilidade do produto:

Perda da eficácia terapêutica Perda da eficácia terapêutica – por degradação do PA:ou por alteração de parâmetro físico fundamental para sua atividade – ex. pH, ou alteração de propriedades físico-químicas – entre elas: produção de gases – odor desagradável, ação enzimática levando a degradação de tensoativos – quebra da emulsão ou alteração na viscosidade.

PREOCUPAÇÃO COM AS POSSÍVEIS FONTES DE CONTAMINAÇÃOPREOCUPAÇÃO COM AS POSSÍVEIS FONTES DE CONTAMINAÇÃO:

- DIRETAS: Fluidos gasosos, água e demais matérias-primas (principalmente origem natural).

- INDIRETAS: procedimentos de limpezas, instalações inadequadas, pessoal não paramentado, processos não validados...

Lembrar que a carga microbiana (CM) pode ser alterada durante o processo de fabricação ou mesmo durante o tempo de prateleira do produto, por diversos fatores:

Fórmula:Fórmula: presença de proteínas e carboidratos (cosméticos) se a concentração não for hiperosmótica – favorece a elevação de CM. em contrapartida, presença de etanol, sorbitol, sacarose, propilenoglicol tendem a favorecer CM mais baixas, nas concentrações normalmente utilizadas em líquidos. Conservantes: usados com critério – podem interagir com componentes da fórmula e ter sua atividade reduzida.

pH: pH: microorganismos crescem em pH neutro, com efeitos inibitórios em faixas extremas (ácidas ou alcalinas).

Atividade da água: Atividade da água: fundamental para sobrevivência de microorganismos. Portanto os produtos em água dependem de incorporação de conservantes. Recorrer quando possível às fórmulas extemporâneas!!!

Processo:Processo: altas temperaturas reduzem CM, já temperaturas próximas a 40ºC tem efeito oposto. Água de condensação nas paredes de reatores, ou mesmo vapor de água na tampa de frascos durante o resfriamento podem ocasionar a proliferação de microorganismos

Padrões Microbianos

As primeiras inclusões de limites microbianos aplicados a produtos farmacêuticos e seus insumos ocorreram de forma vaga, como a recomendação de “ausência de emboloramento”;

11ª e 12ª edições da USP:1936 e 1942, respectivamente;

No formulário Nacional de 1970 e na 18ª Edição da Farmacopéia, do mesmo ano, a expressão foi modificada para:

Padrões Microbianos

“Drogas vegetais e animais deverão estar, o máximo possível, isentas de microrganismos, sendo que os patogênicos não deverão estar presentes”;

Padrões Microbianos

Apesar do reconhecimento, há muitos anos, da importância do controle microbiano de produtos não estéreis, a implantação e aceitação dos padrões sanitários tem ocorrido lentamente;

Produtos cosméticos

Métodos de análises:Métodos de análises:

- Amostragem (coleta, transporte e preparação da amostra).

- Determinação numérica ou contagem de formas viáveis.

- Isolamento e identificação dos microorganismos indesejáveis para serem pesquisados.

Medicamentos não estéreis e cosméticos!!!

AmostragemAmostragem

A amostragem a ser efetuada para investigação quanto aos atendimentos aos padrões microbianos deve ser representativa.

-Barricas ou sacos de matéria-prima (pó) não estéril: coletar amostras na região inferior, mediana e superior na quantidade de √n + 1. Efetuar assepsia na área próxima à coleta de amostras, vedar em recipiente hermético a amostra.

- Em processos contínuos, a segmentação do processo deve estar contemplada na amostragem.

- Produto acabado – duplicata de amostra representando início, meio e fim do processo de enchimento e que após fechado a embalagem não existirá a introdução de contaminantes.

Coleta e Transporte das amostrasColeta e Transporte das amostras

- Fazer as amostragens em local limpo;

- Operador treinado;

- Recipientes, dispositivos auxiliares (espátulas, pipetas) estéreis;

- Temperatura adequada para trasnporte.

Preparação da amostraPreparação da amostra

- Verificar a presença de conservantes na fórmula.

- Os conservantes devem ser inativados – substâncias adequadas de acordo com natureza química.Ex. Sais de amônio quaternário 3% de polissorbato + 0,3% de lecitina.

-Ajuste do pH do produto diluído para a faixa de neutralidade.

- Homogeneização.

- Tratamento da amostra para permitir contato íntimo daamostra com o meio diluente.

- Produtos oleosos – adição de agente tensoativo.

Durante o preparo de amostras de produtos não estéreis para a contagem de microrganismos viáveis não patogênicos, é necessário o contato dessas amostras com diluentes biocompatíveis com as células microbianas.

Alguns possíveis diluentes:

- solução de NaCl à 0,9% estéril.- solução de NaCl à 0,9% e peptonada a 0,1% estéril.- solução tampão pH 7,0 estéril.- caldo lactosado estéril.

Exemplo de preparo de amostra para análise microbiológico de um cosmético em diluição decimal seriada:

A diluição 1:10 de uma amostra de cosmético pode ser obtida homogeneizando:

1 g de cosmético + 9 mL de diluente, ou10 g de cosmético + 90 mL de diluente, ou20 g de cosmético + 180 mL de diluente, ou25 g de cosmético + 225 mL de diluente, e assim por diante.

Em todos os exemplos acima, a amostra resultante é diluída a 1:10 (10-1), e consequentemente, em cada mL da diluição teremos uma quantidade de amostra correspondente a um décimo de mL (0,1 mL) e 0,9 mL de diluente.

Métodos de Contagem de MicrorganismosMétodos de Contagem de Microrganismos

Semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate)Semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate)

- Análise quantitativa.

- Alíquota de 1 a 2 mL da diluição da amostra para réplicas (triplicata) de placas de Petri estéreis.

- Meio de cultura não seletivo líquido, estéril, fundido e resfriado a temperatura (45-48°C), cerca de 20 mL é vertido sobre a placa contendo a amostra e homogeneização com movimento em 8 ou S.

- Incubação na posição invertida após solidificação.

8

Semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate)Semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate)

Pour Plate:

Segue-se incubação das placas, em estufa, na posição invertida;

Após 2 a 5 dias de incubação a 30 – 35°C, para bactérias e 5 a 7 dias para bolores e leveduras, a 20 – 25°C, as colônias são contadas;

Pour Plate:

Para contagem total de bactérias os meios oficialmente recomendados são principalmente ágar caseína-soja e ágar nutriente;

Para fungos, ágar Sabouraud-dextrose e ágar batata;

- Análise quantitativa.

- Meio de cultura não seletivo ou seletivo sólido, líquido ou semi-sólido preparado e distribuído previamente em placas de Petri ou tubos.

- As diluições são distribuídas por pipetas estéreis, com volumes de 0,1 a 0,5 mL na superfície do gel já solidificado, e espalha com movimentos cuidadosos com bastão de vidro em L ou alça de Drigalski.

-Incubar as placas invertidas.

- Esta metodologia não se aplica a amostras com cargamicrobiana inferior a 2 UFC/g (mL).

Semeadura da amostra em superfícieSemeadura da amostra em superfície

Semeadura da amostra em superfícieSemeadura da amostra em superfície

Meio líquido

Meio semi-sólido

Meio sólido inclinado

Meio sólido placa de Petri

Membrana FiltranteMembrana Filtrante

- Análise quantitativa.

- Alíquotas do produto ou suas diluições – filtradas em membranas apropriadas. - Membranas de 0,45μm ou 0,20 μm de poro e 47 mm de diâmetro.

- Coloca-se a membrana sobre placa contendo meio de cultura solidificado.

- Permite amostragem de volumes elevados.

Membrana FiltranteMembrana Filtrante

Stericup Unidade filtrante STERICUP com membrana express 0,22mm e PVDF 0,45 um, funil e frasco coletor.

Sterifil aseptic Suporte de

filtração a vácuo Sterifil em

polissulfona, composto de funil,

base e copo coletor.

Trasnferir a membrana para placa de Petri e incubar

INCUBAÇÃO DAS AMOSTRASINCUBAÇÃO DAS AMOSTRAS

- Colocar placas em estufa a 30-35° C por 2 a 5 dias na posição invertida, ou estante com tubos, paraverificar a presença de bactérias.

- Colocar placas em estufa a 20-25° C por 5 a 7 dias na posição invertida, ou estante com tubos, paraverificar a presença de fungos e leveduras.

- Contagem: à vista desarmada ou com auxílio de contadores.Transcorrido o tempo de incubação, considerar a contagem, somente das placas da mesma diluição que apresentarem de 30-300 colônias. Multiplica-se a média das mesmas pelorespectivo fator de diluição e se expressa o resultado em UFC/g de amostra.

Número Mais Provável (NMP)Número Mais Provável (NMP)

- Análise estimativa fundamentada em probabilidade.

- Indica o valor dentro de uma faixa que reflete o número de organismos presentes.

- Embora apresentando imprecisão maior – é oficilamente recomendado.

- Melhor revitalização de microrganismos estressados –perfeito contato com o meio de cultura.

-Recomendado para amostras pouco solúveis e translúcidas.

- Permite amostras com níveis elevados de concentração, mas éindicado para quando se espera valores baixos de contagem- caldo de dupla concentração

Número Mais Provável (NMP)Número Mais Provável (NMP)

- Emprega meios líquidos – diluições seriadas das amostras inoculadas nos mesmos.

- Uso de tabelas estatísticas.

- Número de réplicas de cada diluição pode variar - o mais comum : 3 ou 5 réplicas.

-As tabelas oferecem o número mais provável de microrganismos por mL ou g e os limites inferior e superior (limite de confiança de 95%)

- Leitura e obtenção dos resultados se dá por comparação com padrão de turvação de meios de cultura não seletivos.

Para a escolha da tabela na qual se verificará o NMP correspondente à combinação de tubos positivos, atentar para a quantidade (g ou mL) de amostra que foi realmente inoculada em cada tubo das diferentes séries e não o volume inoculado.

Inoculação de

1,0 mL da diluição 10-1 na 1ª série 0,1 g ou mL1,0 mL da diluição 10-2 na 2ª série 0,01 g ou mL1,0 mL da diluição 10-3 na 3ª série 0,001 g ou mL

Quantidade de amostra inoculada em cada série

Quando inoculamos mais de 3 diluições seriadas, selecionar a maior diluição na qual todos os tubos inoculados são positivos e considerar as 2 diluições seguintes maiores que a selecionada.

Exemplo 1: Amostra de medicamento líquido que foi inoculada nas diluições abaixo e apresentaram os seguintes resultados:

10-2 3 tubos positivos10-3 2 tubos positivos10-4 0 tubos positivos

O valor de NMP a ser lido na tabela correspondente seria 3/2/0, que corresponde ao valor 93 NMP/g ou mL. Como, neste caso a amostra estava diluída a 10-2, o resultado obtido na tabela deve ser multiplicado por 100 para a obtenção do valor do NMP real por grama ou mL do alimento em análise. Assim, o resultado final será: 9300 NMP/g ou mL.

Pesquisa de patogênicos específicos

Os microrganismos a serem pesquisados devido à sua presença indesejável nas formulações são:

Pseudomonas aeruginosa: formulações tópicas (próximas aos olhos)

Staphylococcus aureus: formulações tópicas em geral.

Escherichia coli: preparações orais.

Salmonela sp.: preparações orais.