imunodiagnóstico de doenças infecciosas
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Imunodiagnóstico de doenças infecciosas
Sandra do Lago MoraesPesquisadora Científica Instituto de Medicina Tropical Universidade de São Paulo
DIAGNÓSTICO DE CERTEZA DE UMA INFECÇÃO
demonstração direta do patógeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos
biológicos dos hospedeiros e/ou presença de sintomas clínicos definidos
MÉTODOS IMUNOLÓGICOS DIRETOS OU INDIRETOS
Amplamente usados na pesquisa de antígenos, anticorpos ou imunocomplexos
RapidezSimplicidadePossibilidade de automaçãoBaixo custo operacional
ANTICORPOS NO DIAGNÓSTICO INDIVIDUAL (#1)
Elucidar processos patológicos com sintomas e sinais
clínicos confundíveis diferenciar a fase da doença diagnosticar doença congênita selecionar doadores de sangue selecionar doadores e receptores de órgãos para
transplantes
ANTICORPOS NO DIAGNÓSTICO INDIVIDUAL (#2)
avaliar o prognóstico da doença avaliar a eficácia da terapêutica e suspensão
da terapêutica avaliar a imunidade específica naturalmente
adquirida ou artificialmente induzida verificar o agravamento da patologia
ANTICORPOS EM INQUÉRITOS SOROEPIDEMIOLÓGICOS
Estabelecer a prevalência da doençaVerificar a erradicação da doença Verificar a reintrodução de novos casos em
áreas consolidadas
PESQUISA DE ANTÍGENOS
Como critério de curaNa definição da etiologia da doençaNa seleção de doadores de sangueEm inquéritos epidemiólogicos
LIMITAÇÕES DOS TESTES SOROLÓGICOS #1
Dependem da capacidade de resposta imune
do hospedeiro Genética Estado de nutrição Integridade dos mecanismos de resposta
imunológica
Ubiqüidade dos determinantes antigênicos Reação cruzada (anticorpos heterófilos,
antígenos semelhantes, experiência
imunológica do hospedeiro com estímulos
antigênicos variados)
LIMITAÇÕES DOS TESTES SOROLÓGICOS #2
Interferentes não específicos Detergentes Solventes orgânicos pH Cromógenos endógenos Inibidores enzimáticos
LIMITAÇÕES DOS TESTES SOROLÓGICOS #3
FATORES DO ANTÍGENO ALVO QUE DEVEM SER CONSIDERADOS NA PESQUISA DE ANTÍGENOS
não persistência na circulação na ausência do parasita
ser abundante não apresentar grande diversidade genética ser estruturalmente diferente de antígenos
encontrados no sangue
MANIFESTAÇÕES DAS REAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO• Reação Primária ligação dos grupos reativos da molécula
antigênica com um de dois sítios de combinação da molécula de anticorpo
• Reação Secundária visibilização direta ou com auxílio de lupas da precipitação ou da aglutinação
• Reação terciária expressão biológica da interação Ag-Ac
TÉCNICAS SOROLÓGICAS
•Testes de complemento teste de hemólise fixação de complemento•Neutralização
Dependentes da reação terciária
TÉCNICAS SOROLÓGICAS
•Precipitação•Aglutinação
Dependentes da reação secundária
TÉCNICAS SOROLÓGICAS
•Imunofluorescência•Radioimunoensaio•Enzimaimunoensaios
Dependentes da reação primária (técnicas com reagentes marcados)
PRECIPITAÇÃO
•EM MEIO LÍQUIDO•EM MEIO SÓLIDO (ÁGAR)Imunodifusão simples - unidimensional (Oudin) - radial (Mancini)Imunodifusão dupla - unidimensional (Oakley) - radial (Ouchterlony)ImunoletroforeseImunoeletrodifusão - unidimensional simples - unidimensional dupla
AGLUTINAÇÃO
caracteriza-se pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e
partículas insolúveis que contêm determinantes antigênicos em sua
superfície
AGLUTINAÇÃO•1o estágio: ligação dos anticorpos aos
antígenos de superfície, por meio de ligações não-covalentes
•2o estágio: resulta das colisões que ocorrem entre as partículas, de modo que os anticorpos ligados a uma partícula se ligam a determinantes antigênicos de outra formam pontes entre partículas
agregados visíveis a olho nu
FATORES QUE INTERFEREM NA FORMAÇÃO DE AGREGADOS:
tipo do anticorpo (IgM é 750x mais eficiente que IgG)
eletrólitospH (ideal entre 6,0 e 8,0)macromoléculas hidrofílicas (em baixas
concentrações impedem a autoaglutinação)enzimas (afastam reações inespecíficas)tempotemperatura
AGLUTINAÇÃO
FENÔMENO DE PROZONA
falsos resultados negativos em soros com elevado título de anticorpos aglutinantes
esse efeito é eliminado empregando-se diluições seriadas do soro
AGLUTINAÇÃO
AGLUTINAÇÃO DIRETA
ocorre com partículas que apresentam determinantes antigênicos naturais em sua superfície (Ex: hemácias, bactérias,
protozoários, fungos)
AGLUTINAÇÃO DIRETAhemácias como antígeno:
tipagem de grupos sangüíneos do sistema ABO e Rh (antígenos específicos) reação de Paul-Bunnel-Davidson (antígenos heterófilos)
antígenos íntegros ou fragmentados de bactérias, espiroquetas, protozoários:
teste de Widal (salmoneloses)teste de Wright (brucelose)
teste de Weil-Felix (rickettsiose)teste de aglutinação para leptospirose, toxoplasmose e tripanossomíase
INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO DIRETA
baseia-se na capacidade que certos antígenos virais têm de, espontaneamente, aglutinarem certos
tipos de hemácias. Os anticorpos, se presentes na amostra, revestem as partículas virais, resultando
na inibição da aglutinação, indicando um teste positivo para a presença de anticorpos
Exemplos: anticorpos contra os vírus da rubéola, sarampo, influenza e certos enterovírus
AGLUTINAÇÃO PASSIVA OU INDIRETA
Aglutinação de partículas inertes (látex, poliestireno, bentonita, sepharose, colódio, charcoal, etc.) ou células antigenicamente
não relacionadas (hemácias, bactérias, leveduras) sensibilizadas com antígenos
solúveis
HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVAHemácias possuem uma superfície complexa, o que
facilita a ligação de muitos antígenosmais usadas: hemácias de carneiro ou humanas do grupo O, fixadas com formaldeído ou glutaraldeído(resolve o problema da fragilidade e permite que sejam estocadas por longos períodos de tempo)
Ags polissacarídicos aderem prontamente a hemáciasantígenos protéicos requerem pré-tratamento com ácido tânico ou cloreto de cromo
INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA
baseia-se na competição, pelos sítios de combinação do anticorpo, entre o antígeno fixado à hemácia e o antígeno solúvel ou o hapteno. O grau de inibição relaciona-se com a quantidade do antígeno presente na amostra e, também, com a afinidade pelos sítios de combinação do anticorpo
AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX
Partículas de látex são esferas de poliestireno que podem ser utilizadas como suportes na adsorção de proteína solúvel e
antígenos polissacarídicos, funcionando como sistema indicador da reação antígeno-
anticorpo
AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX
fator reumatóide antígenos polissacarídicos bacterianos (Haemaphilus influenzae, Rickettsia sp, estreptococos do grupo B, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, etc., no soro, urina ou líquor)drogas e hormônios (-HCG)anticorpos na rubéolaproteína C reativa
útil na pesquisa de:
AGLUTINAÇÃO DE CRISTAIS DE COLESTEROL
O teste de VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) emprega cristais de colesterol
que são sensibilizados com lecitina e cardiolipina, para a pesquisa de anticorpos
antilipídios na sífilis
formação de flóculos ( aglutinação??)
IMUNOFLUORESCÊNCIABaseia-se na capacidade de anticorpos/antígenos se ligarem covalentemente a fluorocromos, sem perder sua reatividade específica com o antígeno
antígeno/anticorpo
Fluorocromos- substâncias que absorvem luz em comprimento de onda menor e quando excitadas com luz UV emitem luz em comprimento maior
mais comuns: isotiocianato de fluoresceína, lisamina-rodamina b
IMUNOFLUORESCÊNCIADIRETA
empregada na pesquisa e localização de antígenos em células ou tecidos através de um anticorpo específico marcado com fluorocromoEx.: Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Legionella sp, Escherichia coli
Luz de excitação
Luz emitida
IMUNOFLUORESCÊNCIAINDIRETA
Empregada na pesquisa de anticorpos/antígenos. O antígeno fixado em lâmina reage com um anticorpo específico e o complexo Ag/Ac é revelado com conjugado
fluorescente (anti-Ig marcado)Exemplos:•pesquisa de antígenos: Plasmodium sp•pesquisa de anticorpos: T. pallidum, T.cruzi, CMV, Plasmodium sp, autoanticorpos
RADIOIMUNOENSAIO
anticorpo antígeno marcado+ não marcado (amostra)
medir radioatividade
Método de competição com antígeno marcado
antígeno fase sólida
anticorpo marcado+antígeno (amostra) medir
radioatividade
Método de competição com anticorpo marcado
RADIOIMUNOENSAIO
anticorpo antígeno (amostra) anti-antígenomarcado
medir radioatividade
Método de captura
RADIOIMUNOENSAIO
TÉCNICAS IMUNOENZIMÁTICAS
Baseadas na utilização de antígenos ou anticorpos marcados com enzimas e permitem a detecção,
titulação e quantificação de substâncias de interesse biológico
IMUNOPEROXIDASE
Enzima converte o componente cromógeno (substrato + doador de hidrogênio) em produto
insolúvel, que precipita no sítio da reação
precipitado visível ao microscópio óptico comum e eletrônico
(por ser eletrodenso)
ENZIMAIMUNOENSAIO
Método quantitativo em que a reação Ag-Ac é monitorada pela medida da atividade enzimática
Homogêneo: não é necessária a separação entre os complexos Ag-Ac e o Ag e/ou Acs, pois a atividade da enzima não é alterada pela reação Ag-AcHeterogêneo: a atividade da enzima é alterada pela reação Ag-Ac e a separação se faz necessária
Ensaios heterogêneosperoxidase glicose oxidasefosfatase alcalina anidrase carbônica-galactosidase acetilcolinesteraseEnsaios homogêneoslisozima ribonuclease Amalato desidrogenase -galactosidaseglicose-6-desidrogenase
ENZIMAS MAIS UTILIZADAS EM ENZIMAIMUNOENSAIOS:
EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay(ELISA)
Princípio básico:imobilização de um dos reagentes numa fase
sólida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservação tanto da atividade enzimática como da atividade
imunológica do Ac
ELISA para pesquisa de anticorpos
antígeno
lava
gem
anticorpo(amostra)
E E
anti-imunoglobulinamarcada
lava
gem
lava
gem E E
substrato cromogênico
Método indireto
Método de Captura de IgM
lava
gem
lava
gem
lava
gem
lava
gem
anti-IgM IgM (amostra) antígeno anti-antígenomarcado
E E
Substratocromogênico
E E
ELISA para pesquisa de anticorpos
ELISA para pesquisa de antígenos
Método de captura
anticorpo antígeno (amostra)
E E
anti-antígeno marcado
E E
substrato cromogênico
lava
gem
lava
gem
lava
gem
ELISA para pesquisa de antígenos
Método de competição com anticorpo marcado
antígeno
E
E
E
antígeno (amostra) +anticorpo marcado
E
substrato cromogênico
lava
gem
lava
gem
ELISA para pesquisa de antígenos
Método de competição com antígeno marcado
anticorpo
E
E
E
E
E
antígeno marcadoe não marcado (amostra)
E E
substrato cromogênico
lava
gem
lava
gem
Immunodot(ou dot-ELISA, dot-immunobinding assay, dot-blotting assay, dot-blot ELISA)
pequenas quantidades do imuno-reagente são aplicadas como gotas em membrana de nitrocelulose (fase sólida)membranas de nitrocelulose adsorvem proteínas com grande eficiência (praticamente 100%) (volumes de 0,1 a 1 ml, contendo de 100 a 400 pg de imuno-reagente, são suficientes)simplicidaderapidezsensibilidade
Immunodotenzimas mais utilizadas:
º peroxidase º fosfatase alcalinaº glicose oxidase
substratos devem sob ação da enzima, originar um precipitado colorido
para peroxidase: diaminobenzidina/H2O2 e 4-cloro-1-naftol/H2O2)
outros sistemas de detecção: substratos fluorescentes ou luminescentes, radioisótopos
Western blotting (Immunoblotting)1a etapa: proteínas são separadas, de acordo com seu
tamanho, por eletroforese em gel de poliacrilamida, contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
2a etapa: as proteínas separadas são transferidas eletroforeticamente, do gel para uma membrana de nitrocelulose, onde ficam imobilizadas, como uma réplica do padrão de bandas do gel
3a etapa: a reação imunoenzimática é então processada na membrana para identificação das proteínas separadas e transferidas
Western blottingpode ser empregado para:
determinar se há antígeno ou anticorpo em uma amostra e qual é a sua especificidade
determinar se o preparado é puro ou nãodeterminar quais proteínas estão sendo reconhecidas
por um anticorpodistinguir diferentes perfis de anticorpos, de acordo
com a fase da doença ou infecção, ou de acordo com a presença ou não da infecção
diferenciar entre cepas patogênicas e não-patogênicas, etc.
anodo
mistura deantígenos protéicos
catodo
migraçãoeletroforética
Western blotting
catodoanodo
papel de filtro
membrana
gel
tampão de transferência
Western blotting
reação antígeno-anticorpo
Y Y
YY
Y
Y
Y
YY
Y
A B
reação com conjugadorevelação com substrato cromogênico
Substratocromogênico
Y Y
YY
Y
Y
Y
YY
YY
E
Y E
YE
Y E
YE
Y E
YE
YE
YE
YE
A Bconjugado
A B
visualização dos complexosantígeno-anticorpo formados
ENSAIOS QUIMIOLUMINESCENTESQuimioluminescência: fenômeno em que se obtém
energia luminosa a partir de uma reação química gerada como resultado da dissociação de ligações fracas (são produzidos compostos intermediários em um estado eletronicamente excitado que, quando retornam ao
estado de energia inicial, emitem luz
ImunofluorescênciaA fonte de energia que
promove a excitação das moléculas é uma
radiação incidente
BioluminescênciaA energia provém de uma reação biológica, sendo a emissão de luz
facilitada por uma enzima (luciferase) ou uma fotoproteína
VANTAGENS DA QUIMIOLUMINESCÊNCIA
•Elevada sensibilidade de detecção: de atomol até zeptomol (10-18 até 10-21 M)
• Linearidade da curva dose-resposta•Rapidez (sinal é gerado em segundos)•Custo (uso de pequenas quantidades de reagentes)•Reagentes não perigosos e procedimentos simples•Possibilidade de aumento da sensibilidade
(amplificadores)•Possibilidade de aplicação em sistema automatizados
ENZIMAIMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE
•Consiste na detecção da reação antígeno-anticorpo utilizando uma enzima e uma molécula sintetizada ou uma mistura de moléculas que atuará como substrato para a enzima e como emissor de luz
•Substratos quimioluminescentes da peroxidase: luminol, isoluminol, polifenóis, ácido gálico, umbiliferone
ENZIMAIMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE COM NANOPARTÍCULAS
•Nanopartículas são mais estáveis, mais baratas e de mais fácil purificação
•Ex. de ouro coloidal, que podem ser facilmente preparadas em uma gama de tamanhos, de 2 a 100 nm
WESTERN BLOTTING ENZIMAIMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE
•A emissão de luz é detectada com um filme fotográfico ou de raios X
IMMUNODOT QUIMIOLUMINESCENTE
ENSAIOS IMUNOCROMATOGRÁFICOS
Podem ser encontrados em quatro formatos
B. “dipstick” C.cartão
D.híbrido
A1 A2
C2C1
S ST
A.cassete
TÉCNICAS EMPREGADA NA AUTOMAÇÃO
•Nefelometria•Turbidimetria•Enzimaimunoensaio• Imunoensaio quimioluminescente• Imunoensaio fluorescente (heterogêneo/
homogêneo)• Imunoensaio de polarização de fluorescência• Imunoensaio fluorescente de tempo controlado•Enzimaimunoensaio fluorescente
ENSAIOS MULTIPARAMÉTRICOS
•Possibilitam a realização de múltiplos ensaios em um único tubo, com a mesma amostra e ao mesmo tempo
•Duas plataformas principais•Microarranjos com proteínas ligadas
(chips)•Microarranjos com micropartículas
(suspensão)
SINALExpressão de um teste sorológico que resulta
da integração de um número variável de impulsos elementares, cada um destes
correspondendo à reação de uma molécula de anticorpos com o determinante antigênico para
o qual mostra afinidade
RUÍDOimpulsos resultantes de reatividade
inespecífica e que interferem na capacidade discriminativa do teste
Ideal: SINAL>>>> RUÍDO
LIMIAR DE DETECÇÃO
número de impulsos necessários para
desencadear o sinal. Varia entre as
diferentes técnicas imunológicas
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