enzimas de restrição. tópicos a abordar diferentes tipos de enzimas de restrição (tipo i, ii,...

Enzimas deRestrição

Enzimas deRestrição

Tópicos a abordarTópicos a abordar

Diferentes tipos de enzimas de restrição (tipo I, II, III)

Enzimas do tipo II e sequências de reconhecimento (4, 6, 8 nts)

Izosquizômeros e enzimas compatíveis

Hidrólises múltiplas

Aplicações em engenharia genética

Mapas de Restrição

Nota HistóricaNota Histórica

1940

1950

~1940 – Experiências com bacteriófagos

~1950 – Diferentes eficácias de infecções por parte dos bacteriófagos. Variações entre estirpes bacterianas.

1953

1953 – Estrutura do DNA (Watson Crick)

1956

1956 – Isolamento da DNA polimerase (Kornberg)

1966

1966 – Isolamento da DNA ligase (Weiss & Richardson)

1970

1970 – Purifica-se a primeira enzima de restrição tipo II: o Hind II (Smith & Wilcox)

1972 2006

1972 – Primeiras experiências com DNA recombinante (Berg & Boyer)

1978

1978 – Isolamento e caracterização de mais de 200 enzimas de restrição

Prémio Nobel – W. Arber, H. Smith e D. Nathans

in educar.sc.usp.br

Enzimas de restriçãoEnzimas de restrição

Proteínas que reconhecem e clivam o DNA em pontos

específicos, geralmente em sequências de 4, 6 e 8

bases - palíndromas

in educar.sc.usp.br

Enzimas de restriçãoEnzimas de restrição

Enzimas produzidas por bactérias para restringir a proliferação de

vírus invasores

Diferentes tipos de enzimas clivam diferentes sequências de

bases de DNA

Ajuda a detectar a presença de diferentes formas de

determinados genes

in 1fiuA-1crf_-active

NomenclaturaNomenclatura

As enzimas de restrição são chamadas de acordo com a bactéria que a produziu

RY 13

Exemplo: EcoR I

Escherichia coli 1º enzima a ser descoberta nesta

bactéria

GéneroEstirpe Espécie

Ordem de descoberta

Sistemas de Restrição - Sistemas de Restrição - ModificaçãoModificação

Mecanismo de defesa presente quando da entrada de DNA fágico

na célula

Combinação de enzimas de restrição com metilases

hidrólise do DNA “estranho”

protecção do DNA celular relativamente as enzimas de restrição através da adição de grupos metil às bases A ou C

DNA metilase possui a mesma sequência de reconhecimento que

os enzimas de restrição

Existem raras exceções em que a metilação pode provocar a

activação do enzima de restrição

Sequências de reconhecimentoSequências de reconhecimento

Não ambíguas

Exemplo:

BamHI - só reconhece a sequência GGATCC

CCTAGG

Ambíguas

Exemplo:

HInf I - reconhece sequências de 5bp começadas

por GA e que terminem em TC

Tipos de enzimas de restriçãoTipos de enzimas de restrição

Classificação baseada em:

Composição da sequência nucleotídica

Posição de clivagem

Sequência de reconhecimento

Co-fatores envolvidos

Estrutura da enzima em causa

in Lenhinger Principles of Biochemistry

Tipos de enzimas de restriçãoTipos de enzimas de restrição

Tipo I

3 subunidades:

1 subunidade de restrição (“R”)

1 subunidade de metilação (“M”)

1 subunidade de reconhecimento (“S”)

Sequência de reconhecimento é assimétrica

Local de hidrólise não é específico e ocorre a mais de 1000 bp de distância

Hidrólise é sempre num local diferente e necessita de ATP

Impede o seu uso em engenheira genética

Tipo III

2 subunidades: 1 subunidade de restrição (“R”) 1 subunidade de metilação e reconhecimento (“MS”)

Sequência de reconhecimento é assimétrica (5-7 bp)

Dupla cadeia de DNA hemimetilada

Local de hidrólise a mais de 24-26 bp de distância

Hidrólise é sempre num local diferente e necessita de ATP

Impede o seu uso em engenheira genética

Tipo II Duas enzimas:

1 enzima de restrição (Endonuclease)

1 enzima de metilação (Metilase)

Estrutura com 4 folhas β e 1 hélice α

Sequência de reconhecimento é palindrómica 4-8nts

Hidrólise ocorre dentro ou nas extremidades da sequência

reconhecida

Não necessita de ATP, apenas Mg2+

Importantes na recombinação genética e na elaboração de mapas de restrição (especificidade de corte)

IzosquizômerosIzosquizômeros

Diferentes enzimas de restrição que possuem a

mesma sequência de reconhecimento

Diferem nas condições ótimas de reação, na

estabilidade

Enzimas de restrição

Sequência de reconhecimento

SacIGAGCTC

CTCGAG

SstIGAGCTCCTCGAG

Exemplo:

Enzimas compatíveisEnzimas compatíveis

Produzem extremidades protuberantes compatíveis

Sobreposição parcial de sequências de reconhecimento

DNA recombinado com sequência híbrida

Enzimas de restrição

Sequência de reconhecimento

BamHIGGATCC

CCTAGG

BglII AGATCTTCTAGA

Exemplo:

Factores que influenciam a Factores que influenciam a atividade das enzimas de atividade das enzimas de

restrição:restrição:Composição do tampão Diferem na força iónica (concentração de sal)

Diferem no catião principal (Na+ ou K+)

Solução: Manter o pH da reacção (geralmente em 8.0)

Digestão com múltiplas enzimas

Influência da metilação no DNA Existe algumas endonucleases de restrição que não clivam DNA metilado

Temperatura de incubação A maioria das enzimas cliva melhor a 37ºC Excepções: Bactérias termofílicas – clivam melhor entre 50 a 60ºC

Enzimas com tempo de meia vida pequeno a 37ºC, recomenda-se a incubação a 20ºC

Hidrólise EnzimáticaHidrólise Enzimática

As endonucleases de restrição do tipo II ligam-se ao sulco maior da forma b-DNA

A ligação não específica permite à enzima ‘deslizar’ pela cadeia ligada apenas ao ‘backbone’ da molécula de DNA

A ligação específica leva à alteração da dupla hélice de DNA, para aproximar melhor as bases dos centros catalíticos

A metilação de uma base impede a ligação específica e a formação do complexo

Dois tipos de ligação: não específica e específica

Hidrólise EnzimáticaHidrólise Enzimática

A hidrólise dá-se ao nível das ligações fosfodiéster

Mg2+ é um cofator essencial, mas pode ser substituído por certos cátions divalentes, como Mn2+

Produtos da hidrólise resultam em extremidades 3’-OH e

5’-P

5’

3’

5’

3’

Hidrólise EnzimáticaHidrólise Enzimática

A cadeia de DNA pode ser hidrolisada para dar origem a pontas cegas (“blunt ends”) ou pontas coesivas (“sticky ends”)

Duas cadeias com pontas cegas podem ser unidas por uma DNA-ligase, mesmo sendo de origens diferentes

Uma cadeia com pontas coesivas liga-se com maior facilidade a cadeias com sequências complementares

Extremidade cega (blunt ends)

Clivam as duas cadeias de DNA em

ligações fosfodiéster opostas

Extremidade coesiva (sticky ends)

Clivagem assimétrica nas cadeias de

DNA

Pequeno número de nucleotídeos em

cadeia simples, capazes de se associar

por ligações de hidrogénio, com outra

cadeia simples em que a sequência de

bases seja complementar desta

(annealing)

Hidrólise EnzimáticaHidrólise Enzimática

Hidrólise EnzimáticaHidrólise Enzimática

A hidrólise enzimática pode ser simples ou múltipla dependendo do número de enzimas utilizadas na obtenção de fragmentos de DNA

Hidrólise múltipla: DNA hidrolisado por mais que uma enzima de restrição Determinação das posições dos fragmentos no DNA, produzidos pelas enzimas, com a ajuda da eletroforese

Hidrólise simples: Digestão do DNA com uma única enzima de restrição Determinação relativa das orientações dos fragmentos no DNA linear

Aplicações em Engenharia Aplicações em Engenharia GenéticaGenética

O termo “engenharia genética” inclui: métodos para a formação de combinações novas do material genético introdução e replicação do DNA recombinante numa bactéria para amplificar o gene

Análise molecular da estrutura do cromossomo e do genoma (mapeamento, o grau de metilação)

Caracterização fenotípica (manifestos ou latentes) de defeitos genéticos hereditários ao nível do DNA (RFLPs)

Relacionamentos filogenéticos pela comparação de locais selecionados da restrição em genes essenciais.

Clonagem de Genes

Restriction Fragment Length Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)Polymorphism (RFLP)

Marcador de DNA

Mutações em 2 alelos específicos de cada individuo em locais

de restrição – polimorfismo: sequências diferentes de restrição

diferentes tamanhos de fragmentos

Muitas doenças humanas prejudiciais ou fatais caem nesta categoria

Restriction Fragment Length Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)Polymorphism (RFLP)

Banda igual

Banda igual

Banda comum em pessoas com doença

Banda comum em pessoas saudáveis

Testes padrões do DNA das pessoas com doença

Testes padrões do DNA de pessoas saudáveis (controlo)

A existência de RFLPs fornece a base para estabelecer relacionamentos inequívocos de paternidade

Mapas de RestriçãoMapas de Restrição

As unidades do mapa são expressadas em pares de bases ou para distâncias mais longas em pares de kilobases

É uma compilação do número, da ordem e da distância entre locais do corte do enzima de restrição ao longo de um segmento clonado do DNA

Normalmente, o mapeamento é a primeira etapa para caracterizar um DNA desconhecido e um pré-requisito a manipulá-lo para outras finalidades.

O DNA encontra-se, geralmente, dentro de um vector bem caracterizado do plasmídeo ou do bacteriófago, onde a sequência é conhecida

Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de Restrição

Existem dois métodos para elaborar um mapa de restrição: mapeamento utilizando digestões múltiplas mapeamento utilizando digestões parciais

Construção de mapas de restrição com hidrólises múltiplas: Hidrólise do DNA:

separadamente com hidrólises simples e com pares de enzima

Aplicar uma electroforese em gel para os fragmentos obtidos

(Permite a separação dos fragmentos gerados de diferentes tamanhos!!!)

Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de RestriçãoM

arca

dore

s

0.51.0

2.5

5.0

8.0

10.0

DNA não

dige

rido

HindIII

SalI

HindI

II +

SalI

7.06.2

5.8 5.8

0.81.2

0.8

0.4

0.8

0.8

1.2

5.8

7.0

7.0

0.8 0.4 5.8

0.8 5.0 1.2

Modelo I

Modelo II

HindIII SalI

HindIII SalI

Mapas de RestriçãoMapas de Restrição

Digestão Parcial com marcação radioativa (32P) dos extremos do DNA

Digestão parcial surge em condições não ótimas para que ocorram

um número limitado de hidrólises:

período de incubação pequeno

incubação a baixas temperaturas

Fragmento de DNA marcado num dos extremos com um radioisótopo

Pode ser parcialmente digerido com enzimas de restrição produzindo

fragmentos marcados de tamanhos diferentes mas que revelam

directamente onde são os locais de clivagem

Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de Restrição

Enzimas Nº de fragmentos Tamanho / kd

XbaI 2 24.0, 24.5

XhoI 2 15.0, 33.5

KpnI 3 1.5, 17.0, 30.0

XbaI + XhoI 3 9.0, 15.0, 24.5

XbaI + KpnI 4 1.5, 6.0, 17.0, 24.0

É linear

Tamanho do fragmento: 48.5 kd

Nº de sítios restrições de:

XbaI – 1

KpnI – 2

XhoI – 1

Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de Restrição

XbaI 24.0, 24.5

XhoI 15.0, 33.5

XbaI + XhoI 9.0, 15.0, 24.5

48.524.0 24.5

XbaI

9.0 15.09.015.0

Todos os locais de restrição do KpnI caem no fragmento da XbaI 24.5 kb, uma vez que o fragmento 24.0 kb continua intacto após a digestão dupla do XbaI-KpnI

A ordem dos fragmentos do KpnI só pode ser determinado pela digestão parcial

XhoI XhoI

Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de Restrição

Os fragmentos 1.5, 17.0 e 30.0kd são produtos da digestão completa

Os fragmentos 18.5 e 31.5kd são produtos da digestão parcial

48.524.5

XbaI

9.015.0

XhoI

6.0

KpnI

18.517.0 1.517.01.5

KpnI’s

Enzima Tamanho / kd

KpnI – digestão parcial 1.5, 17.0, 18.5, 30.0, 31.5, 48.5

XbaI + KpnI 1.5, 6.0, 17.0, 24.0

Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de Restrição

EcoRI BamHI HindIII HaeIIEcoRI

+ HaeII

BamHI +

HaeII

HindIII +

HaeII

EcoRI +

HindIII

EcoRI +

BamHI

BamHI +

HindIII

12.0 12.0 12.0 6.0

4.0

2.0

5.0

4.0

2.0

1.0

6.0

4.0

1.5

0.5

6.0

2.5

2.0

1.5

6.5

5.5

10.5

1.5

8.0

4.0

12.0kd

HaeII (6.0)

HaeII(10.0)

HaeII (0/12.0)

EcoRI (1.0)

BamHI (11.5)

HindIII (7.5)

É circular

Tamanho: 12.0kd

Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de Restrição

Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de Restrição

Elaboração de Mapas de RestriçãoElaboração de Mapas de Restrição

RAPD: randomly amplified polymorphic DNA

Size sorted

RAPD: randomly amplified polymorphic DNA

B

AFLP: amplified fragment length polymorphism

Digestão do DNA com 2 enzimas

Ligação de adaptadores nos finais dos fragmentos

PCR com primers adaptadores dos fragmentos

AFLP

VNTR: variable number tandem repeats

• Regiões não codificadoras

• Muitas cópias de uma mesma sequência no genoma

• Alta taxa de variação entre indivíduos no número de cópias

Microssatélites

• VNTRs mais utilizados

• Repetições de 2, 3, ou 4 pares de bases

• Próximo de 100 cópias aleatórias de cada

• Altamente variável

• Muitos loci diferentes de microssatélites (1000s) em diferentes espécies

Microssatélites

Microssatélites

BibliografiaBibliografia

Brown, T.A. (1998) Gene Cloning an introduction 3rd ed., Santley Thorner (Publishers) ltd,

Manchester, UK

Kulg; Cunnings (1997) Concepts of Genetics 5th ed., Internacional edition, Prentice Hall,

USA

Watson, James D. (1992) Molecular Biology of the Gene 3rd ed., Benjamin/Lumming,

Harvard University and Cold spring Haba laboratory

Lewin, Benjamin (1997) Genes VI Oxford University Press, Oxford, New York

Gerhartz Wolfgang (1990) Enzymes in Industry – Production and Applications VCH, New

York