A Influência da Amostragem na Determinação de Foto-pigmentos em Espectrofotometria-UV e Comparação

dos Resultados à Fluorimetria

Juno MoraisMaíra CamposMarcela Ribeiro

Michelle Teodoro

Outubro/2006

Introdução

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A concentração de pigmentos fotossintetizantes é extensamente utilizada para estimar a biomassa do fitoplâncton.

No fitoplâncton, a Clorofila-a constitui de 1 a 2% do peso seco (Barroso;

Littlepage, 1998).

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A concentração de Clorofila-a também tem sido relacionada à produtividade primária (Wetzel, 1983), que por sua vez é importante para estimar a capacidade de suporte do sistema.

Objetivo

Verificar a influência do volume amostral para a determinação de Clorofila-a pelo método de Lorenzen e, comparar os resultados àqueles obtidos pela sonda SCUFA.

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O método de Lorenzen, descrito em 1967, é ainda hoje largamente utilizado. Foi primeiro oficialmente aceito para a determinação de Clorofila-a e feopigmentos; incorporou, a métodos já propostos, a acidificação durante a realização das leituras e definiu dois comprimentos de onda: 665 e 750 nm.

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A acidificação da amostra provoca o rompimento do

anel de porfirina.

A SCUFA(Self-contained Underwater Fluorescence Apparatus) é um fluorímetro submersível para medição in situ de clorofila; possui mecanismos que reduzem a influência da luz ambiente, turbidez e oscilação de temperatura.Detecta a clorofila através de um feixe de excitação azul (460 nm) e pela detecção da luz emitida pela amostra a 685 nm (vermelho).

http://www.ssco.com.tw/Turner_Designs/SCUFA/SCUFA_2.jpg

Metodologia

Ponto de coleta:

20º44’48,48’’S; 45º55’51,27’’W

Cidade: Guapé – MG

Em: 30/09/2006.

Análise: 03 e 04/10/2006Fonte: Google Earth

Metodologia

• Foram coletados, com garrafa de Van Dorn, três volume distintos (1, 2 e 3 litros), a 1,5 m de profundidade, em triplicata;

• Ao mesmo tempo coletamos aproximadamente 15 minutos de dados com a sonda SCUFA;

• As amostras, antes de serem filtradas, foram também analisadas pela SCUFA em um béquer de 2 litros (5 minutos de dados para cada amostra);

• A SCUFA foi conectada a um laptop para que os dados registrados fossem recuperados em Windows Excel;

• Em laboratório de campo filtramos as amostras em filtro de fibra de vidro conforme o método de Lorenzen;

• No laboratório de Ecofisiologia de Organismos Zooplanctônicosda UFMG procedemos com a análise espectrofotométrica.

• O tese-t foi utilizado para comparação dos volumes amostrados (Systat)

ResultadosComposição do fitoplâncton em função dos pigmentos

Clorofila-a, ß-caroteno e luteína (xantofila) como pigmentos principais; Clorofila-b como pigmento acessório e outros carotenos e xantofilas em pequenas quantidades.

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Clorofila-a e  ß-caroteno como pigmentos principais e outras clorofilas e xantofilas em pequenas quantidades.

Crisofíceas

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Clorofila-a e ß-caroteno como pigmentos principais; fucoxantina (xantofila) como pigmento acessório e outros carotenos, clorofilas e neofucoxantinas em pequenas quantidades.

Bacilariofíceas

Scan da amostra de Clorofila

Intervalo de leitura: 350.0 nm à 760.0 nm

Picos de absorção: 430 nm e 660 nm.

Clorofila µg/L em função do tempo de leitura (SCUFA)

0,002,004,006,008,00

10,0012,0014,0016,0018,00

16:16:19 16:19:12 16:22:05 16:24:58 16:27:50 16:30:43 16:33:36 16:36:29 16:39:22

Tempo de leitura

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Clorofila µg/L em função da amostra (Espectrofotômetro-UV)

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Volume filtrado (L)

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• Variáveis 1L e 2L

P valor: 0.145

• Variáveis 1L e 3L

P valor: 0.225

• Variáveis 2L e 3L

P valor: 0.369

Teste-t

Discussão

• Na varredura das amostras, obtida pelo scan, verifica-se um pico de absorbância em 660nm e não em 663nm, como observado na literatura. Deste modo, faz-se necessário o questionamento se o método mede mesmo clorofila-a, como descrito, ou se haveria a influência de outros foto-pigmentos. Sendo assim, que pigmentos seriam estes.

• A análise do fitoplâncton revelou a dominância das espécies Chlorella sp., Melosira sp. e Dynobryum sp., dos grupos Clorofíceas, Bacilariofíceas e Crisofíceas respectivamente. Os pigmentos encontrados nestes organismos são predominantemente, clorofila-a, β-carotenos, que absorve em 466 nm e 496 nm, e xantofilas , o que não explica o pico de absorção em 660nm.

.• Na comparação dos dois métodos, espectrofotométrico e

fluorimétrico, os gráficos mostraram uma grande discrepância, sendo os valores da fluorimetria sempre mais elevados. Estes resultados são indicativos da própria qualidade das medidas que ambos métodos possuem. A fluorimetria é um tipo de medida mais sensível e o espectrofotômetro mais específico (Dos Santos et al, 2003), assim, é de se esperar que as medidas da primeira fossem maiores.

• Os valores de clorofila-a nos três diferentes volumes amostrados não apresentaram diferenças significativas, verificadas pelo valor de p. No entanto, o baixo número amostral (3 pontos, com três réplicas cada) pode ser um empecilho para a aplicação eficaz de um teste estatístico.

• O estudo confirmou que o volume amostrado não influencia no resultado do método de Lorenzen, refutando a hipótese de que um maior volume filtrado aproximaria o resultado dos dois métodos.

• Sugere-se uma varredura prévia das amostras para estudos de localização no scan de picos de absorção;

• Baseado na tendência dos gráficos parece não existir correlação entre os dois métodos: espectrofotométrico e fluorimétrico;

• A fluorimetria é um tipo de medida mais sensível e o espectrofotômetro mais específico (Dos Santos et al, 2003).

DiscussãoConclusão

Referências• Barroso, G.F; Littlepage, J. 1998. Protocolo para análise de clorofila a e feopigmentos pelo método

fluorimétrico. BMLP – Vitória – ES.

• Chlorophyll and phaeophytin determination (Spectrophotometric Method). Disponível em: <http://waterontheweb.org/curricula/ws/unit_01/Mod_4_5/ChlorSpec5-2003.pdf> Acesso em: 05 de outubro de 2006.

• Dere, S; Günes, T; Sivaci, R. 1998. Espectrophotometric determination of chlorofyll – A, B and total carotenoid contents of some algae species using diffrent solvents. Tr. J. of botany, f.13-17.

• Dos Santos, A.C.A., Calijuri, M.C., Moraes, E.M., Adorno, M.A.T., Falco, P.B., Carvalho, D.P., Deberdt, G.L.B. & Benassi, S.F. Comparison of three methods for Chlorophyll determination. Disponível em: <http://www.sblimno.org.br/acta/my_web_sites/acta_limnologica_contents1503E_files/art2_15(3).pdf> Acesso em: 23 de setembro de 2006.

• Lorenzen, C.J. 1967. Determination of chlorophyll and pheo-pigments: espectrophotometric equations. Limnol. Oceanogr., 12:343-346.

• Performance verification statement for the turner designer SCUFA fluorometer. Disponível em: <http://www.act-us.info/Download/Fluorometer/ACT_TV06-06_Turner_Scufa_Fluoro.pdf> Acesso em : 10 de outubro de 2006.

• SCUFA - Self-Contained Underwater Fluorescence Apparatus. Disponível em: <http://www.turnerdesigns.com/t2/instruments/scufa.html> Acesso em: 10 de outubro de 2006.

• Software Estatístico: Systat Version 5.0. Copyright, 1990-1994. Systat, Inc.

• The Great North American Secchi Dip-In (Chlorophyll Analysis). Disponível em: <http://dipin.kent.edu/chlorophyll.htm> Acesso em 05 de outubro de 2006.

• Wetzel, R.G. 1983. Limnology. 2nd edition. Saunders College Publishing, Philadelphia, PA.