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Análise de Proteínas e Azoto não proteico

nos alimentos proteínas podem estar combinadas com lípidos e hidratos de carbono

na maioria dos alimentos conteúdo de proteína dado por N x 6.25%

procedimento mais comum para determinar proteínas:

determinação de um elemento ou grupo pertencente à proteína

elementos – C ou N

grupos – aminoácidos e ligações peptídicas


análise pode ser dificultada pela presença de N não proteico:

aminoácidos livres

pequenos peptídeos

ácidos nucleicos

fosfolídos

açúcares aminados

porfirinas

algumas vitaminas

alcalóides

ácido úrico

ureia

NHŸ

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análise de proteínas importante para:

rotulagem

investigação de propriedades funcionais

determinação de actividade biológica

conteúdo proteico total

teor de uma dada proteína

teor proteico durante isolamento e purificação de proteínas

determinação de azoto não proteico

composição em aminoácidos

valor nutricional de uma proteína


Análise de carbono

digestão mais fácil que para N

menores erros no resultado

maior quantidade relativamente a N

factor de correcção mais constante que para N

maior dificuldade em separar os C proteicos dos restantes

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Análise de azoto

mais utilizada

proteínas têm em média 16% N

transformação de azoto para proteína – 6.25

16 g N ––––– 100 g proteínas

n g N ––––– x g proteínas

erros quando teor em N ʌ 16%

tabelas com factores de conversão específicos

n x 100x = = n x 6.25

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Análise de azoto

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Método de Kjeldahl – determinação através do N total

mais utilizado na determinação de proteína

diversas modificações ao longo do tempo

método determina N orgânico total

proteico e não proteico

na maioria dos alimentos, N não proteico em muito pequena quantidade


procedimentoamostra triturada e homogeneizadaaquecimento da amostra com H2SO4

digestão converte N (excepto o que está em forma de NO3 ou NO2) em amónia

amónia está na forma de NHŸ ligado a SO‚permanece em solução

restantes compostos orgânicos convertidos em CO2 e H2O

Amostra (N orgânico) + H2SO4 ↓ (NH4)2SO4

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procedimentoadiciona-se NaOH conc.

converte sulfato de amónio em amónia gasosaaquece-se para libertar amónia num volume conhecido

de ácido bóricoforma borato de amónio

(NH4)2SO4 + NaOH ↓ NH3

NH3 + H3BO3 ↓ (NH4)3BO3

(NH4)3BO3 doseado com HClindicador usado para determinar ponto de

viragem

(NH4)3BO3 + HCl ↓ NH4Cl + H3BO3


procedimentoconcentração de H+ necessária para alcançar ponto de

viragem é equivalente à concentração de N no alimento

usa-se um brancosubtrair N do reagente do N da amostracálculo:

s bv - vx

%N = x x 14 x 1001000 m

m – peso da amostra (g)x – HCl (mol)vs – vol. titulação da amostra (cm3)vb – vol. titulação branco (cm3)14 – PM azoto (g/mol)

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Método de Kjeldahl

vantagens:

universal

muito preciso

boa reprodutibilidade

barato

micro Kjeldahl para determinar g

desvantagens:

não mede apenas proteína

diferentes factores de conversão

risco de utilização de H2SO4 conc. a temperatura elevada

risco de utilização de catalisadores

demorado (pelo menos 2 h)

menos preciso que método do biureto


modificações do métodoadição de óxidos de metais para acelerar a digestão da

misturamistura de Hg, Cu, Se

Hg mais eficazadição de sulfato de potássio

aumenta ponto de ebulição da mistura na digestãoacelera o processo

adição de sulfito ou tiossulfato de sódio ao hidrolisado diluídoajuda a libertar azoto do Hg

adição de ácido bóricorecolha da amónia libertada em excesso de ácido bóricoborato de amónio formado titulado com um ácido

padronizado

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modificações do métodomicro Kjeldahl

permite determinar g de N


Método de Kjeldahl

reagentes

carbonato de sódio

alaranjado de metilo 0.1%

HCl 0.1 N

NaOH 0.02 N

NaOH conc.

ác. bórico 2%

fenolftaleína

verde de bromocresol 0.1% em álcool

HCl conc.

mistura de catalisadores

96% K2SO4, 4% CuSO4.5H2O

H2SO4 conc.

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procedimento:

digestão da amostra

juntar num balão de microkjeldahl de 100 mL

200 mg amostra

1.5 g mistura de catalisadores

3 mL H2SO4 conc.

colocar balão no digestor

digerir 20 min

tirar balão e arrefecer até temperatura ambiente

juntar 5 mL H2O2


digestão da amostra

repor balão no digestor

aquecer devagar até se tornar translúcido e não haver resíduos carbonizados

arrefecer 15-20 min à temperatura ambiente

arrefecer em água da torneira

juntar devagar, com agitação, 40 mL H2O

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procedimento:

destilação da amostra

amostra transferida para destilador

adicionar excesso NaOH

NH4HSO4 passa a NH3 (volátil)

colocar ~7 g NaOH num Erlenmeyer de 50 mL

juntar 11 mL H2O

agitar até dissolver NaOH

arrefecer sob água corrente

colocar ~10 mL ác. bórico num erlenmeyer

adicionar 4 gotas vermelho de metilo e 6 gotas verde de bromocresol


destilação da amostra

erlenmeyer com ác. bórico e indicadores colocado à saída do destilador

recolher ~⅔ do destilado no erlenmeyer

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procedimento:

titulação da amostra

titular o destilado com solução padronizada de HCl 0.1 N

nº equivalentes de ácido consumido igual a nº equivalentes de amónia


Método de Dumas

determinação de N total, após combustão da amostra

700 – 800 ºC

medida volumétrica do N gasoso

GC com detector de condutividade térmica (TCD)

N determinado convertido em teor de proteína

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Método de Dumas

procedimento:

amostra de massa conhecida (100-500 mg) levada a combustão na presença de O2

libertação de CO2, H2O e N2

CO2 e H2O removidos por absorção em colunas

teor de N medido após passagem dos gases restantes por outra coluna

equipada com detector de condutividade térmica

detector calibrado com EDTA ou outro composto puro com concentração de N conhecida

necessário converter concentração de N em teor proteico

factores de conversão variam com composição da proteína


Método de Dumas

vantagens:

mais rápido que Kjeldahl

< 4 min por medida; Kjeldahl 1-2 h

não requer compostos tóxicos nem catalisadores

permite automatização (até 150 amostras)

aplicável a todos os tipos de alimentos

desvantagens:

custo inicial elevado

mede N proteico e não proteico

requer amostras pequenas

difícil obter amostras representativas

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Métodos que utilizam espectroscopia de absorção electrónica

exigem curvas de calibração com diversas proteínas

mede-se absorção ou turbidez

amostra medida ao mesmo comprimento de onda

obtém-se concentração proteica da amostra

diferentes métodos divergem nos grupos químicos responsáveis pela absorção ou turbidez

ligações peptídicas

grupos aromáticos

grupos alcalinos

agregados proteicos


Método do biureto

substâncias com 2 ou mais ligações peptídicas formam um complexo roxo com sais de cobre (Cu2+) em soluções alcalinas

proteína misturada com reagente do biureto

reagente contém sulfato de cobre, NaOH e tartarato de sódio e potássio

após 15-30 min, mede-se absorvância a 540 nm

intensidade da cor proporcional à quantidade de proteína

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Biuret_Komplex.png

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Método do biureto


Método do biureto

procedimento:

5 mL reagente biureto misturado com 1 mL solução de proteína

1-10 mg proteína/mL

mistura estabiliza à temperatura ambiente 15-30 min

se não estiver transparente requer filtração ou centrifugação

absorvância lida a 540 nm contra branco do reagente

fazer curva de calibração com albumina de soro bovino (BSA)

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Método do biureto

vantagens:

bastante específico

não tem problemas de interferentes

simples, rápido (< 30 min) e mais barato que Kjeldahl

determina proteína

desvantagens:

requer curva de calibração

cor não é idêntica para todas as proteínas

desvios causados menores que noutros métodos colorimétricos

menos sensível que outros métodos espectrofotométricos


Método de Lowry (fenol)combina reagente do biureto com reagente de Folin-Ciocalteauinteracção das proteínas com fenol e cobre em condições

alcalinasreacção colorimétrica

oxidação (catalisada por cobre) de aminoácidos aromáticos por um reagente heteropolifosfatocor azul, medida entre 500-750 nm e comparada

com curva padrãopequeno pico a ~500 nm

determinação de concentrações proteicas elevadas

pico maior a ~750 nmdeterminação de menores concentrações

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Método de Lowryprocedimento:

amostra diluídaadição de tartarato de sódio e potássio/Na2CO3

incubar à temperatura ambiente 10 minadição de CuSO4/tartarato Na K/NaOH

incubr 10 min à temperatura ambienteadicionar reagente de Folin

misturar e incubar a 50 ºC, 10 minler absorvância

curva de calibração com BSA para calcular teor proteico


Método de Lowryvantagens:

10-20 vezes mais sensível que determinação por UV100 vezes mais sensível que método do biuretorelativamente rápido (1-1.5 h)bastante específico

poucos interferentessacarose, em elevada concentração, lípidos, tampão

fosfato, ...

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Método de Lowrydesvantagens:

intensidade da cor pode variar com composição em aminoácidos e com condições analíticas

não é completamente proporcional à concentração proteica

destrói a amostramúltiplas operaçõesnecessita período de incubação entre adição de reagentesrequer curva padrão


Método espectrofotométrico directomaioria das proteínas absorve a 280 nm

presença de tirosina, triptofano e fenilalaninaaminoácidos aromáticosteor nos alimentos é relativamente constante

absorvância permite calcular a concentração proteicaproteínas solubilizadas num tampão ou base

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Método espectrofotométrico directovantagens:

rápido e simplesrelativamente sensível

mais que método do biuretonão destrutivopoucas interferências


Método espectrofotométrico directodesvantagens:

resultados com imprecisãodependem da concentração dos 3 a. a. na composição da

proteínasais de amónio não interferemácidos nucleicos podem interferir

problema reduzido por medição da absorvância a 2 280 nm, 260 nm

preparação da amostra muito longafunciona melhor em proteínas purificadas ou extraídas

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Método espectrofotométricodeterminação pode ser feita por fluorescência

triptofano é fluorescentemétodo inicialmente desenvolvido para leite e lacticínios

também utilizado em produtos cárneos e vegetais


Métodos turbidimétricosmedida baseada na turbidez causada pela proteína precipitada

por um agente precipitanteácido tricloroacético, ferricianeto de potássio, ácido

sulfosalicílicovantagens:

rápidosimples para amostras líquidas

proteína está em soluçãodesvantagens:

não aplicável em amostras sólidasproteína tem que ser extraída para uma solução

resultados variam com tipo de proteínapode haver precipitação de outras substânciasrequer calibração com padrões

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Método dye-bindingutilização tem aumentado

grãos de cereais, sementes de oleaginosas, lacticínios e outros produtos animais e vegetais

amostra tratada com excesso de corante aniónicoazul brilhante de Coomassie

pH da proteína ajustado (< pI)proteínas carregadas positivamente

corante e proteína reagem quantitativamentecorante liga-se aos grupos catiónicos dos resíduos His, Arg,

Lys e aos grupos terminais amina livrescorante muda de vermelho para azul

max passa de 465 nm para 595 nmformação de complexo insolúvel, separável por filtração ou

centrifugação


Método dye-bindingexcesso de corante em solução medido colorimetricamente

diferença dá indirectamente teor de proteínateor de proteína na amostra proporcional à quantidade

de corante complexado

Corantecomplex = Coranteinit – Corantelivre

para cada alimento constrói-se uma tabela de conversãopermite obter % de proteína

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Método dye-bindingprocedimento:

corante dissolvido em 95% EtOHacidificado com ácido fosfórico 85%

amostras com 1-100 g/mL proteína e BSA adicionadas ao reagente

ler absorvância a 595 nm contra branco do corantecalcular concentração da proteína a partir da curva de

calibração


Método dye-bindingcorantes utilizados:

laranja G, laranja 12, vermelho A, preto búfalo, preto amino 10B

boa correlação com método de Kjeldahlequipamentos fazem:

reacção colorimétricafiltração do complexo insolúvelmedida colorimétrica da solução filtrada

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Método dye-bindingvantagens:

simplicidaderapidez (2 min)menos interferências que método de Lowrymais sensível que método de Lowryexactidãoreprodutibilidadepreço

desvantagens:dependência do equipamentocor varia com tipo de proteína

dificuldade na escolha do padrãocomplexo pode ligar-se a cuvetes d quartzo

usar vidro ou plástico


Método do ácido bicinchoninico (BCA)proteínas reduzem iões Cu2+ a Cu+ em condições alcalinasCu+ complexa com reagente BCA (verde) tornando-o púrpuraprocedimento:

misturar solução de proteínas com reagente BCApH 11.25

incubar 30 min a 37 ºC, ou 2 h à temperatura ambiente, ou30 min a 60 ºC

escolha depende da sensibilidade pretendidatemperatura mais elevada dá melhor resposta

ler absorvância a 562 nm contra branco do reagentecurva padrão com BSA

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Método do ácido bicinchoninicovantagens:

sensibilidade semelhante a método de Lowrymétodo micro BCA mais sensível que Lowry

um único passo de misturareagente mais estável que o de Lowrypoucas interferências

desvantagens:cor instável com tempoqualquer composto capaz de reduzir Cu2+ a Cu+ interfereaçúcares redutores interferem mais que no método de Lowryconcentrações elevadas de (NH4)2SO4 interferem


Métodos que utilizam espectroscopia de absorção electrónica

vantagens:

rápidos

simples

sensíveis a baixas concentrações

desvantagens:

requerem soluções transparentes e diluídas

maioria das amostras exigem preparação complexa

homogeneização

extracção por solventes

centrifugação ou filtração

em alimentos processados pode ser difícil extrair as proteínas

absorvância depende das sequências de aminoácidos

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Outros métodos instrumentaismedição de propriedades físicas brutasmedição da adsorção de radiaçãomedição da dispersão de radiação


medição de propriedades físicas brutasdensidade

densidade das proteínas superior à da maioria dos componentes dos alimentosaumento do teor proteico provoca aumento da

densidadeteor proteico determinado através da medição da

densidadeíndice de refracção

índice aumenta com aumento do teor proteicoteor proteico determinado por medição do índice de

refracção

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medição da adsorção de radiaçãoUV-VisIV

grupos químicos no esqueleto polipeptídico possuem vibrações características6.47 m, 3300-3500 nm, 2080-2220 nm,

1560-1670 nmabsorção de radiação IV a determinados

comprimentos de onda usada para quantificar concentração proteica numa amostra

permite análise rápida e on-linenão destrutivonão necessita muita preparação de amostraelevado custo incialrequer calibração demorada


medição da adsorção de radiaçãoNMR

usado para determinar concentração total de proteínasmedição da área dos picos correspondentes à fracção

proteica permite determinar o teor proteico

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medição da dispersão de radiaçãodispersão de luz

turbidez de uma solução directamente proporcional à concentração de agregados de proteínas presentes

dispersão de ultra-sonsvelocidade e absorção de ultra-sons proporcionais à

concentração de agregados proteicos presentes


Outros métodos instrumentaisvantagens:

não destrutivospouca preparação de amostramedidas rápidas e precisas

desvantagens:requerem curvas de calibraçãodependem do tipo de proteína e do alimentoválidos apenas para analisar alimentos com composições

simples

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Métodos físicospouco utilizados

índice de refracçãodensidade específicaviscosidadetensão superficialcondutividadepolarização


Comparação dos métodosaplicações oficiais

métodos Kjeldahl e Dumas e em alguns casos UV-Viscontrolo de qualidade

métodos rápidos e simplesIV

estudos fundamentais em laboratóriométodos rápidos, precisos e sensíveis a baixas concentrações

UV-Vis

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Comparação dos métodosfactores a ter em conta:

métodos Kjeldahl, Dumas e IV requerem pouca preparação de amostra

métodos de UV-Vis requerem muita preparaçãométodos Dumas e Kjeldahl medem N orgânico totalmétodo do biureto mede ligações peptídicasmétodo de Lowry mede ligações peptídicas e aminoácidos

aromáticosIV é um método indirectométodos UV-Vis são mais sensíveismétodos de Lowry, dye-binding, BCA e UV mais sensíveis que

Kjeldahl, Dumas e biureto


Comparação dos métodosfactores a ter em conta:

métodos IV são rápidos (< 1 min)método de Dumas é automatizado e rápido (< 5 min)métodos UV-Vis permitem analisar diversas amostras

simultaneamentedisponibilidade de equipamentorigor da medidatécnica destrutiva ou nãofacilidade de operaçãoprocessamento do alimento (aquecimento,...) pode reduzir a

eficácia da extracção de proteínas

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proteínas separadas com base em:diferentes propriedades físico-químicas

tamanhocargaadsorçãosolubilidadeestabilidade térmica


métodos de purificação mais comuns:precipitaçãocromatografia de permuta iónicacromatografia de afinidadecromatografia de exclusão molecular

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escolha da técnica de separação depende de:objectivo da análisequantidade de amostra disponívelpureza desejadaequipamento disponíveltipo de proteínas presentepreçoter em conta que estrutura tridimensional da proteína pode ser

alterada durante separaçãoefeito das condições ambientais sobre a estrutura da proteína e

suas interacçõespHforça iónicasolventetemperatura...


Métodos baseados em características de solubilidadesolubilidade determinada pela sequência de aminoácidos

condiciona tamanho, forma, hidrofobicidade e carga eléctricaproteínas solubilizadas ou precipitadas selectivamente por

alteração de:pHforça iónicaconstante dielétricatemperatura

usados quando grandes quantidades de amostra disponíveisrápidosbaratosnão influenciáveis por outros componentes dos alimentos

frequentemente usados como 1º passo em processos de separação

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Salting outproteínas, em solução aquosa, precipitadas quando concentração

salina excede um valor críticoágua “liga-se” ao sal, deixando de estar disponível para

hidratar as proteínas(NH4)2SO4, NaCl, KCl

procedimento:sal adicionado, em concentração ligeiramente inferior à

necessária para precipitar a proteína de interessesolução centrifugada

remoção de proteínas menos solúveisadição de sal em concentração ligeiramente superior à

necessária para precipitar a proteínaproteína precipita

separada por centrifugação


Salting outconcentrações elevadas de sal contaminam a solução

remoção por diálise ou ultrafiltração

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Precipitação isoeléctricaproteínas têm carga 0 no ponto isoeléctrico (pI)

proteínas agregam e precipitam devido à não existência de repulsão electrostática

diferentes sequências de aminoácidos originam diferentes pIajuste do pH da solução permite separar proteínas por

precipitação selectiva


Fraccionamento por solventesolubilidade de proteínas depende da constante dielétrica do

solventea pH e força iónica constantesdiferentes interacções electrostáticas entre grupos carregados

quando constante dieléctrica diminui, aumentam interacções electrostáticas entre grupos carregadossolubilidade das proteínas diminui

constante dieléctrica de soluções aquosas diminui quando se adicionam solventes orgânicosEtOH, acetonadiferentes proteínas requerem diferentes quantidades de

solvente orgânicoseparação proteica

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Fraccionamento por solventetrabalhar a ≤ 0 ºC para impedir desnaturação proteica

aumento de temperatura quando se misturam solventes orgânicos com água


Desnaturação de proteínas contaminantesproteínas desnaturam e precipitam quando:

temperatura muito elevadapH muito ácido ou muito básicoseparação baseada na resistência de proteínas a condições

extremadas

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Métodos baseados em características de adsorçãocromatografia de afinidade ou de permuta iónica

proteínas possuem diferentes afinidades para fase estacionária ou eluente

coluna aberta ou HPLCmétodos comuns em laboratório para separar proteínas e

aminoácidospouco comuns a nível comercial

caros e não permitem separação rápida de grandes quantidades


Cromatografia de permuta iónicamais usadaadsorção reversível das proteínas carregadas a um suporte sólido

carregadopara proteínas usam-se mais resinas aniónicas

condições (pH e força iónica) ajustadas para favorecer ligação da proteína de interesseoutras proteínas ligam-se menos fortemente e eluem mais

rapidamenteproteína de interesse eluída com outra solução tampão

diferente pH ou força iónica

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Cromatografia de permuta iónicaaplicações:

separação de proteínas no laboratórioquantificação de aminoácidos


Cromatografia de afinidadefase estacionária consiste numa molécula ligada covalentemente

a um suporte sólido ligando possui afinidade específica e reversível para uma

dada proteínacondições tampão que favorecem afinidade

outras proteínas ligam-se menos fortemente e eluem mais rapidamente

proteína de interesse eluída com outra soluçãotécnica mais eficaz para separar proteínas

cara, devido a necessidade de colunas com ligandos específicos

optimização do método requer ajuste de muitas variáveis

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Cromatografia de afinidadeaplicações:

aplicações laboratoriaispurificação de glicoproteínas

utilização de lectinas como ligantes


Métodos baseados em diferença de tamanhoPM de proteínas variam entre 104 – 106 Dseparação não depende do PM mas do raio de Stokes

raio médio de uma proteína em soluçãodepende da estrutura tridimensional

para proteínas com mesmo PM, raio de Stokes:proteína globular compacta < proteína enrolada flexível

< proteína rígidaseparação por:

diáliseultrafiltraçãocromatografia de exclusão molecular

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Diáliseutiliza membranas semi-permeáveis

permitem passagem de moléculas abaixo de uma certa dimensão

solução de proteínas colocada num tubo de diálise seladotubo colocado num grande volume de água ou tampão

lentamente agitadosolutos de baixo PM saem do tubo; restantes ficammétodo lento (até 12 h)mais usado em laboratóriofrequentemente usado para remoção de sais de soluções usadas

em salting-outtambém usada em permuta de tampões


Diálise

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Ultrafiltraçãoutiliza membranas semi-permeáveis sob pressão

permitem passagem de moléculas abaixo de uma certa dimensão

solução de proteínas colocada numa célula contendo a membranaaplica-se pressão

solutos de baixo PM atravessam membrana; restantes ficam

diversas membranas disponíveismais rápido que diáliseusada em laboratório e em escala comercialutilizada para concentrar soluções de proteínas, remover sais,

trocar tampões ou fraccionar proteínasnanofiltração pode ser usada para mesmos fins


Cromatografia de exclusão molecularsepara proteínas por PMsolução de proteína atravessa coluna empacotada com material

polimérico porosodextrano, agarosemoléculas maiores que os poros excluídas

atravessam rapidamente a colunarestantes moléculas retardadas

moléculas eluídas por ordem decrescente de tamanhoexistem diversos empacotamentos, para separar proteínas com

diferentes PM

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Cromatografia de exclusão molecularusada para:

remoção de saistrocar tampõesfraccionar proteínascálculo do PM


Cromatografia de exclusão molecularPM de proteínas desconhecidas determinadas por comparação

dos seus volumes de eluição com os de proteínas de PM conhecidográfico de volume de eluição vs. log(PM) dará uma rectaPM não está directamente relacionado com raio de Stokes

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Separação por electroforeseseparação baseada no tamanho, forma e cargamigração de moléculas carregadas através de um campo eléctricoelectroforese de zona é a mais usada com proteínas

proteínas de uma mistura separadas por migração num gelgel de poliacrilamida mais comum

alternativas – amido e agarose


Electroforese não desnaturantesolução tamponizada de proteínas colocada num gel poroso

poliacrilamida, amido, agarosevoltagem aplicada ao gel

proteínas deslocam-se no gel numa direcção que depende do sinal da sua carga e a uma velocidade que é função da grandeza da cargadeslocamento também depende da fricção

relação entre tamanho da molécula e tamanho dos poros do gel

voltagem aplicada x carga molecularmobilidade =

fricção molecular

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Electroforese não desnaturantequanto mais alta a voltagem ou a carga da proteína, mais

esta se movequanto mais pequena a molécula ou maior o tamanho dos

poros do gel, mais rapidamente ela se moveseparação baseada numa combinação da carga, tamanho e forma

da proteína


Electroforese desnaturante (SDS-PAGE)sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresisproteínas separadas segundo PMproteínas desnaturadas antes da análise

misturadas com mercaptoetanol e dodecil sulfato de sódio (SDS)

mercaptoetanol quebra ligações bisulfitoSDS forma ligações hidrofóbicas com proteínas

desdobramento da estrutura, devido a repulsão entre grupos com carga negativa do SDS

cada proteína liga-se aproximadamente à mesma quantidade de SDS por unidade de comprimento

carga por unidade de comprimento e conformação idêntica em todas as proteínas

Java applet

http://www.rit.edu/~pac8612/electro/Electro_Sim.html

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Electroforese desnaturantemovimento no gel depende do tamanho da proteína

proteínas mais pequenas movem-se mais rapidamenteadiciona-se um corante à solução da proteína

azul de bromofenol, …pequena molécula crregada que migra à frente das

proteínasno fim da electroforese, gel tratado com corante

permite visualizar proteínas

distância percorrida pela proteínamobilidade relativa =

distância percorrida pelo corante


Electroforese desnaturantemobilidade relativa comparada com curva de calibração

gráfico log(PM) vs. mobilidade relativa é linear

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Electroforeseaplicações:

parte do processo de purificaçãocaracterização proteicaequipamentos comerciais permitem purificar grandes

quantidades de proteínadeterminação da composição proteica de um alimento


Electroforese de focagem isoeléctricaum dos métodos de separação de proteínas com melhor

resoluçãomodificação da electroforeseproteínas separadas segundo carga, num gel com um gradiente

de pHproteínas migram para o local em que pH = pI

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Electroforese de focagem isoeléctricagradiente de pH gerado por anfólitos

pequenos polímeros contendo simultaneamente grupos carregados positiva e negativamente

mistura de anfólitos tem milhares de polímeros com gama variada de valores de pH

anfólitos adicionados ao gel antes da polimerizaçãoapós formação do gel, aplica-se uma voltagem e anfólitos

migram segundo o seu pHgradiente de pH


Electroforese bidimensionalutilização conjunta de focagem isoeléctrica e SDS-PAGE

melhora resolução de misturas complexas de proteínascapaz de separar >1000 proteínas

proteínas separadas numa direcção segundo cargafocagem isoeléctrica

depois separadas na direcção perpendicular segundo tamanhoSDS-PAGE

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Electroforese capilarutilização de um tubo capilar em vez de um gel

fluxo electroosmótico no tubo influencia separação de proteínas


Electroforese capilarprocedimento:

amostra introduzida no recipiente de entradaaplica-se baixa pressão ou voltagem através do capilar

carregar o volume pretendido de amostra na colunabandas de proteínas detectadas por detectores semelhantes

aos usados em HPLCUV-Vis, fluorescência, condutividade

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Electroforese capilar

1. pre-albumin 2. Albumin 3. alpha 1-Acid-Glycoprotein 4. alpha 1-Antitrrypsin 5. Haptoglobin6. alpha2 macroglobulin 7. Hemopexin8. Transferrin9. Complement 10. Gamma


Electroforese capilarutilização obretudo laboratorial3 variantes usadas em separação de proteínas:

electroforese de zona capilarelectroforese capilar em gelfocagem isoeléctrica capilar

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Electroforese capilarelectroforese de zona capilar

semelhante a PAGEproteínas separadas em solução no interior do capilar

cheio com um tampão do pH pretendidouma única “corrida” capaz de separar moléculas

carregadas e não carregadasalterando pH ou força iónica do tampão

varia fluxo electroosmóticovariação da velocidade de migração das proteínas


Electroforese capilarelectroforese capilar em gel

proteínas separadas por tamanhoproteínas desnaturadas e dissociadas na presença de SDS

e agente redutorseparação em capilares cheios com gel de poro específico

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Electroforese capilarfocagem isoeléctrica capilar

anfólitos formam gradiente de pH no capilarproteínas separadas com base no pI


determinação da composição em aminoácidos das proteínashidrólise da amostra com ácido forte

libertação dos aminoácidosaminoácidos separados por métodos cromatográficos

permuta iónicacromatografia de afinidadecromatografia de absorção

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hidróliseHCl 6N, 24 hdiferente comportamento dos aminoácidos durante hidrólise

triptofano destruídometionina, cisteína, treonina e serina progressivamente

degradadosduração da hidrólise influencia resultados

asparagina e glutamina convertidos em ácidos aspártico e glutâmico

não se conseguem quantificarisoleucina e valina hidrolisadas mais lentamente que

restantes aminoácidostirosina e metionina podem ser oxidados

procedimentos especiais de hidrólise necessários para evitar erros


hidrólisepercas de treonina e serina calculadas por hidrólise da

amostra em 3 períodos de tempo24, 48, 72 h

compensação para degradação de aminoácidosextrapolação para tempo zero, assumindo cinética de 1ª

ordemvalina e isoleucina calculadas a partir de um hidrolisado de

72 hcisteína e cistina convertidos em ácido cístico

mais estáveltriptofano sofre hidrólise alcalina

depois cromatografado

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hidrólisehidrólise de peptídeos e proteínas origina normalmente 16 a. a.fosfoaminoácidos requerem processos especiais

análise semi-quantitativa de PSer, PThr e PTyrHCl 6N; 1-4 h; 110 ºCderivatização pré ou pós-coluna

análise lenta e resultados frequentemente mausnão é uma análise de rotina


hidróliseHCl em fase de vapor

amostra seca sob vácuo, num tubo de ensaiotubo colocado num frasco com 200 L HCl 6N e um cristal de

fenoltapar frasco com válvuladesarejar 3 vezes com Ar

fechar válvulaaquecer frasco 1 h a 150 ºC

finda a hidrólise, abrir válvulatransferir tubos com amostra para outro recipiente

secar sob vácuoguardar a -20 ºC, sob Ar, até análise

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hidróliseHCl em fase líquida

amostra seca sob vácuo, num tubo de ensaioadicionar 100 L HCl 6N, contendo 4% ácido tioglicólicodesarejar sob vácuo e selar à chamaaquecer 22 h a 110 ºCarrefecer o tubo

abrir, secar sob vácuo e analizar


separação por permuta iónicaeluição com gradiente

tampões com aumento gradual de pH e força iónicaderivatização pós-colunaapós eluição, a. a. quantificados por reacção com nihidrina

nihidrina reage com grupo amina primária dos a. a.produto de cor púrpura

medição espectrofotométrica a 570 nmprolina a 440 nm

método automatizado e adaptado para utilização com HPLC

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separação por permuta iónica


separação por RP-HPLCa. a. hidrolisados e derivatizados antes da cromatografia

derivatização com feniltiocarbamil, ...quantificação por espectroscopia UV

detecção de quantidades picomolares de a. a.tempo de análise ≤ 30 min

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quantificaçãoutilização de padrão interno

a. a. não existente nos alimentosnorleucina

resultados expressos em % molesresíduos por 100 resíduos

dividir nº moles de cada resíduo pela soma de todos e multiplicar por 100


utilização:quantificar peptídeos e proteínasdeterminação da qualidade nutricional de uma proteínacaracterizar ou identificar novas proteínas e peptídeos sintéticosdetectar a. a. não comunsdelinear estratégias de fragmentaçãocalcular PM de uma proteínadeterminar volume parcial específico de uma proteína

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