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Análise de OGM
técnicas analíticas detectam:porção de DNA do gene inserido
PCR (polymerase chain reaction) é método mais usadoproteína expressa pelo gene
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)LFS (lateral flow “strip tests”)
Análise de OGM
necessários métodos muito sensíveisproteínas expressas a muito baixas concentrações
ppm ɼ g/g
métodos usados:HPLCelectroforese capilarensaios imunológicos
muito sensíveis (ppb, ppt)grande especificidadeELISALFSwestern blot
MS
Métodos de análise de proteínas
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Análise de OGM
ELISAusa 2 anticorpos
um é específico para um antigeneoutro está ligado covalentemente a uma enzima e reage com
complexos antigene-anticorpoquantidade de reagente ligado à enzima que resta após
análise depende da quantidade de proteína a analisar existente na amostra
presença da enzima demonstrada pela adição de uma solução de uma molécula incolor (substrato)
convertida em solução colorida pela enzimacor proporcional ao teor de proteína (antigene)
ensaio sandwichensaio competitivo
Métodos de análise de proteínas
elisa.mov
Análise de OGM
ELISA sandwichanticorpo ligado à proteína é imobilizado numa superfície sólida
placa de micro-titulação de 96 poçosnormalmente poliestirenopermite processamento simultâneo de várias amostras
material a ser testado é extraído e tamponizadoanticorpo na placa é incubado com amostra
captura proteína a analisar na amostra
Métodos de análise de proteínas
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Análise de OGM
ELISA sandwichadiciona-se anticorpo detector
liga-se ao antigenejunta-se anticorpo ligado a uma enzima
liga-se ao anticorpo detectoradiciona-se o substrato
convertido em forma detectável pela enzima
Métodos de análise de proteínas
Análise de OGM
ELISA sandwichcor resultante indica concentração do antigene presente na
amostradirectamente proporcional
Métodos de análise de proteínas
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Análise de OGM
LFSmuito simplespermite determinar se concentração de uma proteína está acima
ou abaixo de um dado patamarteste de gravidez
semelhantes aos ELISA sandwichusa pequenas esferas coloridas ligadas aos anticorpos para
produzir um sinal positivoamostra separada da proteína alvo por imobilização do
anticorpo de captura numa membrana porosaamostra atravessa anticorpo imobilizado por capilaridade
da membranaELISA mais sensível que LFS devido à presença da enzima
nalguns casos LFS pode detectar até ppb
Métodos de análise de proteínas
Análise de OGM
LFS
Métodos de análise de proteínas
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Análise de OGM
LFSimobiliza-se um anticorpo capaz de se ligar à proteína alvo
numa zona da membrana porosaoutro anticorpo capaz de se ligar à proteína reveste a superfície
de pequenas esferas coloridassecas e colocadas antes da zona de teste
quando amostra líquida as reconstitui, fluem por capilaridade junto com amostra
proteína da amostra liga-se à partícula com o anticorpoatravessa a membrana até ser capturada pelo anticorpo
imobilizado na zona de testevai-se formando uma linha colorida
indica presença de antigene na amostra
Métodos de análise de proteínas
Análise de OGM
Western blotusado sobretudo em laboratóriocombina 2 tecnologias
electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)separa diversas proteínas numa mistura, segundo PM
ensaio imunológicodetecta proteína específica após separação
detecção até ao nível de picograma
Métodos de análise de proteínas
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Análise de OGM
Western blotpreparação da amostra para PAGE
aquecer em tampão contendo agentes redutores e detergentes
desnaturação proteicaamostra aplicada no gel e separada por electroforese
Métodos de análise de proteínas
Análise de OGM
Western blotproteínas transferidas do gel para uma membrana de
nitroceluloseincubada com solução de complexo anticorpo-enzima
formação de banda corada na zona em que proteína fica imobilizada
cálculo de PM por comparação da posição relativamente a outras proteínas de PM conhecido
Métodos de análise de proteínas
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Análise de OGM
Western blotsó reage com proteínas desnturadasanálise de alimentos muito processados
capaz de determinar teores muito baixos de proteína
Métodos de análise de proteínas
Análise de OGM
diversos ensaios de PCR dão resultados qualitativos ou quantitativosmais usado é o teste de varrimento
varrimento da molécula de DNA para encontrar as sequências de iniciação e terminação do gene inserido
Métodos de análise de DNA
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Análise de OGM
Métodos de análise de DNA
Análise de OGM
PCRdetecção de características genéticas não aprovadasdetecção de mistura de alimentos
OGM e não OGMnecessária extracção de DNA de boa qualidade a partir da
amostrapor vezes difícil em alimentos muito processados
mais fácil em alimentos não processadosamostras bem homogeneizadas
Métodos de análise de DNA
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Análise de OGM
PCRDNA extraído é amplificado por PCR
pequena cadeia de DNA sintético (primer)sequência complementar à do DNA alvo
incubação e replicaçãoaté produção de cópias suficientes para permitir detecção
separação e reacção com produção de coridentificação e quantificação da % OGM
electroforese em gelcomparação com padrão
Métodos de análise de DNA
Análise de OGM
PCRcaracterização do DNA pode ser feita por:
digestão com enzimas de restriçãohibridização com sondassequenciação do DNA
só efectuadas em casos específicosraramente na análise de alimentos
análise por PCR pode ser automatizada e simplificada por utilização de kits
Métodos de análise de DNA
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Análise de OGM
PCRanálise quantitativausada quando legislação obriga a rotulagem acima de
determinada concentraçãogene endógeno (do material hospedeiro) tem que ser incluido
na análiseserve de gene de referênciapermite calcular teor de OGMmesmo nº de cópias para todas as variedades de planta
a ser testadascarcterístico para a espécie e não reagir com variedades
relacionadasmétodos baseados em PCR competitiva (real-time PCR)
Métodos de análise de DNA
Análise de OGM
PCRreal-time PCR
semelhante a PCR “normal”efectuada em tubo seladovariação na concentração dos produtos de reacção
seguida através de sondas fluorescentessondas hibridizam com secções de DNA das
novas cadeiasvalores permitem calcular quantidades de DNA
modificado relativamente ao da planta hospedeira
Métodos de análise de DNA
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Análise de OGM
PCRPCR específico
quando é necessário identificar a origem do material geneticamente modificado (organismo)
avaliar da existência de características não aprovadas para uso
primers desenhados para identificar regiões do genoma que representam tanto o DNA nativo como o DNA transgénico
ambos identificados num único tubo de reacçãoensaio pode ser qualitativo ou quantitativo
Métodos de análise de DNA
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas
métodos de resíduos múltiplos (MRMs)usados para detectar e medir múltiplos resíduos em diversos
alimentoscapazes de dar estimativas de confiança para maioria dos
pesticidas a níveis iguais ou inferiores aos de tolerânciaintegram passos de:
preparação da amostraextracçãopurificaçãoseparação cromatográfica com detecção on-line
quantificação automática
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas
métodos de resíduos múltiplosFDA e USDA usam 10 méodos
8 com GC2 com HPLC
nenhum MRM capaz de detectar todos os tipos de resíduo em todos os tipos de alimento
compromisso entre nº de reíduos, gama de alimentos e níveis de resíduos mensuráveis
principal vantagemvariedade de resíduos que pode ser determinada
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas
métodos de resíduo único (SRMs)usados para medir um único analito
também usado para medir seus metabolitos principais e produtos de transformação com relevância toxicológica
geralmente usam mesmos passos que MRMscada passo optimizado para analito de interesse
geralmente mais rápidos e com limites de detecção mais baixos que MRMs
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas
métodos semiquantitativos e qualitativoscapazes de detectar um nº limitado de resíduos de pesticidas
semelhantestambém designados métodos de varrimento
capazes de analisar um grande nº de amostras para a presença d um nº limitado de resíduos de pesticidas num curto período de tempo
métodos semiquantitativos dão uma estimativa da gama de concentrações de um resíduo
métodos qualitativos detectam pesticidas presentes acima de um nível pré-determinado
métodos baratos, rápidos e simplesusam:
TLCinibição enzimáticaensaios imunológicos
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas – métodos quantitativos
passos básicospreparação da amostra
planta separada em fracções comestíveis e não comestíveiscortadas, trituradas ou maceradas
extracçãosolvente adequadofiltração
isolamentopurificação do extracto bruto
separaçãocomponentes do extracto purificado separados por partição
entre fases móvel e estacionáriadetecção e quantificação
características físicas dos componentes separados na fase móvel medidas num detector
sinal relacionado com concentração
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas – métodos quantitativos
preparação da amostrapesticidas ocorrem como resíduos na superfície das plantas
distribuição não uniformepode haver contaminação de tecidos interiores se
existirem danos na superfíciefrutos e legumes não são lavados antes da análise
apenas remoção de folhas externas danificadasquando película externa não é consumida, removem-se
2 – 3 mm externoscebolas, melões, kiwis, ...
sementes e pedúnculos removidosdegradação de pesticidas pode ser acelerada por maceração
da amostrapartículas de solo ou outros contaminantes visíveis podem ser
removidos por acção mecânica suave
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas – métodos quantitativos
extracçãoobjectivo:
recuperar máxima quantidade possível de analito numa solução
solventes usados:acetonitrilo ou acetona
adição de sal anidro (NaCl, Na2SO4) para absorver água
OUadição de água para facilitar purificação por partição
contra outro solvente orgânicopode ocorrer formação de emulsões
minimizado por adição de um sal à fase aquosapodem ser destruídas por centrifugação
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas – métodos quantitativos
extracção (processo alternativo, mais simples)amostra colocada numa suspensão com ~70% H2Oadicionam-se acetonitrilo e diclorometano ou acetona e éter
de petróleojunta-se NaCl
agita-se fortementefase orgânica seca sobre Na2SO4
redução de volume, diluída em solvente adequado e de novo concentrada
passos repetidos até completa remoção dos solventes de extracção
podem interferir com detectorconcentrado pode ser directamente injectado em GC
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas – métodos quantitativos
isolamentoextracto bruto parcialmente purificado antes da separaçãoanalitos separados de interferentes na detecçãograu de isolamento depende do tipo de detector e da
cromatografiapasso mais moroso e mais sensível a errosextracto bruto (água-acetona ou água-acetonitrilo)
particionado contra solvente orgânico relativamente apolar
fase orgânica levada à securaresíduo pode ainda ser purificado por cromatografia em
colunaadsorção ou exclusão molecular
depende do analito e da matriz
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas – métodos quantitativos
isolamento (técnicas alternativas)extracção em fase sólida (SPE)
pequenas quantidades de material de empacotamento em pequenas colunas ou discos
não reutilizáveispurificarconcentrarderivatizar
menos frequente
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas – métodos quantitativos
isolamento (técnicas alternativas)microextracção em fase sólida (SPME)
fibras revestidas com um polímero imersas em extracto aquoso ou retidas no espaço de cabeça de uma amostra
analitos difundem para polímeroapós equilíbrio, fibra colocada no injector do GC
desorção térmica dos analitos para a coluna
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas – métodos quantitativos
isolamento (técnicas alternativas)extracção assistida por micro-ondas
tempo de extracção e volume de solvente fortemente reduzidos
operação a temperatura superior ao ponto de ebulição do solvente
transferência rápida do analito para a fase do solvente
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas – métodos quantitativos
isolamento (técnicas alternativas)extracção acelerada
pequenas quantidades de solventes a temperatura e/ou pressão elevadas
até 200 ºC e 10.3 – 13.8 MPatempos curtos de operação
< 10 min
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas – métodos quantitativos
derivatizaçãonormalmente pré-coluna
por vezes pós-colunadiversas reacções de derivatização para pesticidas
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas – métodos quantitativos
separaçãoGC
colunas de empacotamentocolunas capilares
melhor resoluçãomelhores limites de detecção
colunas megaboreintermédias entre capilares e de empacotamento
melhores características de ambos os formatoselevada resolução, mesmo a fluxo elevadomaior capacidade que as capilares
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas – métodos quantitativos
separaçãoGC
detectores tiram partido do facto de a maioria dos pesticidas conterem heteroátomos (não H, C, O)
FID (ionização de chama)S ou P
ECD (captura electrónica)halogéneos, S, N
condutividadehalogéneos, S, N
termo-iónicosN, P
MSelevada selectividade qualitativa e quantitativa
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas – métodos quantitativos
separaçãoGC
padrão interno mais usado:clorpirifos
pesticida bem separado na maioria das colunasdetectado em todos detectores de GC
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas – métodos quantitativos
separaçãoHPLC
restrito a analitos não voláteis ou termicamente instáveisN-metil carbamatos
vantagem:isolamento dos analitos é menos extenso
detectores:UVfluorescência
por vezes necessário derivatizarpré ou pós-coluna
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas – métodos quantitativos
confirmação químicaconfirmação da detecção para aumentar grau de confiançamais eficaz seria obtenção de resultdos concordantes usando
2 métodos independentes, baseados em princípios analíticos diferentes
não é possível para MRMsalternativas:
GC-MS para obter espectro do analito e estimativa do teor
2 detectores selectivos2 colunas com fases diferentesanalito derivatizado e recromatografado
sinal do analito desaparece e é substituído por outro
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas – métodos quantitativos
ensaios imunológicosanticorpos com elevada afinidade para o analitoelevada selectividadesimplicidaderapidezcusto moderadorequer muito trabalho e tempoanticorpos desenvolvidos para um pesticida podem reagir
com outra molécula semelhantemaioria dos pesticidas são pouco solúveis em água
tampões aquosos usados em ensaios imunológicos
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas – métodos semiquantitativos e qualitativos
TLCmenor resolução que GCuso para teste semiquantitativo de grupos limitados de pesticidas
detecção de pesticidas inibidores de colinesterasesenzimas inibidas por organofosfatos e carbamatos
HPTLC permite melhores resultados
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
produtos naturais tóxicos para outros organismosmetabolitos secundários produzidos por bolores
podem ser produzidas quer no campo quer em armazenamentomoléculas pequenas (PM < 1000)toxicidade muito variável
Análise de micotoxinas
aflatoxina B1
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
amostragemamostras de grande dimensão para reduzir errostrituradas para homogeneizar
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
análise química preliminarprocessos não quantitativos
cromatografia em minicolunaTLC
dão indicação preliminar sobra a presença do analito
Análise de micotoxinas
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
cromatografia em minicolunaexplora fluorescência natural de algumas micotoxinas
aflatoxinas, zearalenona, ocratoxina Acolunas pré-empacotadas disponíveis comercialmenteextracto sujeito a isolamento parcial e eluído na coluna com
vários solventestoxina visualizada como banda fluorescente sob luz de
365 nmlimite de detecção de ppb (ng/g)
Análise de micotoxinas
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
TLCpodem ser analisadas diversas amostras na mesma placa
requer menos padrõespermite estimativa grosseira dos teores de toxina
ajuste do volume de extracto para análise quantitativa posterior
pode existir coeluiçãoreduzida pela utilização de TLC 2D
menos amostras na mesma placarequer utilização de padrões em cada ensaio
Análise de micotoxinas
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
processos químicos quantitativosmesmo tipo de procedimentos que para pesticidas
extracçãofiltraçãoisolamentoconcentraçãoseparação cromatográficadetecção e quantificaçãoconfirmação
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
extracçãoamostra misturada com MeOH aquoso, acetona e/ou
acetonitriloalimentos ricos em gordura requerem eliminação de lípidos
extracção com hexano ou isooctanoantes, durante ou depois da solubilização da
micotoxinafiltração
remoção de sólidos em suspensão
Análise de micotoxinas
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
isolamentopartição por solventecromatografia em colunaprecipitação aniónica
remoção de pigmentos e substâncias proteicaspp induzida com ácido fosfotungstico e sais de Zn, Pb e
NHŸlimitada a extractos em solventes orgânicos polares,
contendo > 55% H2Oconcentração
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
separação2D-TLCHPLC
mais populardetecção por UV ou fluorescência
derivatização pré ou pós coluna de fase reversa para aumentar a resposta da fluorescência
sensibilidade: ppmGC
apenas em poucos casos
Análise de micotoxinas
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
métodos bioquímicosensaios imunológicos
ensaios rádio-imunológicos (RIA)ELISAdetecção ao nível do pg - ngrápidossimplesfiáveis
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
separação por imunoafinidadeutilização de anticorpos para isolar toxinas a partir de matriz
biológicasimplesgrau de isolamento superior a métodos tradicionaisexistem colunas comerciais preparadas
material de empacotamento adsorve selectivamente as toxinas a partir de um extracto bruto
técnica de concentraçãoanalitos libertados com um solvente orgânico polar
Análise de micotoxinas
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
separação por imunoafinidadecromatografia pode usar anticorpos monoclonais
passo de isolamento antes da determinação fluorimétrica de aflotoxina M1 no leite
leite misturado com NaClcentrifugado e filtrado
aliquota cromatografada sob ligeira pressão positivaanalito eluído analisado por fluorescência
Análise de micotoxinas
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
medicamentos administrados em doses terapêuticascombater doenças em animais produtores de alimentos
medicamentos antimicrobianos administrados em doses subterapêuticas
antibióticosrisco devido a:
bactérias resistentestransmissão de resistência a humanos
métodos químicos para resíduos múltiplos são limitadosdirigidos a classes específicas de resíduos
Análise de resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
ensaios preliminarestradicionais
inibição do crescimento microbiano por resíduos de antibióticos presentes na amostra
processos de difusão ou baseados em turvaçãoensaios imunológicos
nalguns casos também quantitativospodem ser totalmente manuais ou parcialmente automatizadossimplesrápidos
análise de grande nº de amostrasnão específicosrespondem apenas a resíduos biologicamente activos
Análise de resíduos de medicamentos
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
ensaios baseados na turvação do meioturbidez de um meio de cultura aumenta ao longo do tempo
de crescimento de um organismo indicador
Análise de resíduos de medicamentos
Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
ensaios baseados em processos de difusãomaterial a analisar difunde através do meio de crescimento,
cultivado com esporos do organismo indicadorapós incubação, surge uma zona de inibição de germinação e
crescimentoindica presença de inibidor
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Análise de pesticidas, micotoxinas e resíduos de medicamentos
determinações químicas quantitativasmetodologia idêntica à utilizada para outros analitos residuais
pré-tratamento da amostralibertação dos resíduos ligados
resíduos solubilizados num solvente adequadoextracto bruto purificado
partição ou cromatografia em colunaanálise cromatográfica
HPLC é técnica mais usadamenor preparação de amostra que para GC
Análise de resíduos de medicamentos
Análise de contaminantes
sujidadespesadas
separadas por sedimentaçãoareia, terra, excrementos de insectos, roedores e outros
animaisleves
lipofílicasinsectos e seus fragmentos, pelos e fragmentos de
roedores e bárbulas de penaspeneiradas
diferentes tamanhos, separadas por peneirassubstâncias resultantes da putrefacção ou decomposição do alimentomateriais estranhos
adulteranteslubrificantespartículas de metal...
introduzidos intencionalmente ou por defeito no processamento
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Análise de contaminantes
identificação de contaminantes de pequenas dimensões pode ser difícil
isolamento pode ser simples ou complicadodepende do contaminante e do alimento
perca de fragmentos e variações devidas ao analista minimizadas por utilização de técnicas e métodos padronizados
Análise de contaminantes
sujidade pesada por sedimentação em frutos secospesar amostraadicionar éter de petróleo e aquecer
extrair lípidos para preparar amostra para análise de sujidade leve
perfazer volume perdido com mais éter de petróleodecantar solventeadicionar CHCl3 e deixar repousarretirar material flutuante (miolo) e ~⅔ do CHCl3repetir separação com pequenos volumes de CHCl3:CCl4 (1:1)
pedaços de casca, areia e solo sedimentam por diferença de densidade
miolo flutuaaté resíduo estar livre de partículas do fruto
Métodos
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Análise de contaminantes
sujidade pesada por sedimentação em frutos secostransferir resíduo para papel livre de cinzas
procurar sujidade pesadacontar nº de partículas
cascas, areia, solo
Métodos
Análise de contaminantes
fragmentos de insectos e pelos de roedores em farinha de centeiocontaminantes lipofílicos
extraídos para fase oleosa de uma mistura heptano/álcool num frasco de Wildman
outras partículas podem ficar retidas na fase de heptano como interferentes
método utiliza 2 reagentes para impedir esse fenómeno
solução de Tween 80 (mistura alcoólica)solução de Versene (à base de EDTA)
Métodos
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Análise de contaminantes
método de flotação para determinar sujidade leve em farinhafragmentos de insectos, pelos de roedores e outrasdigestão ácida degrada o amido
permite separação dos restantes constituintessujidade retida numa fase oleosa
separada com papel de filtrosedimentos mais pesados, resultantes da digestão, lavados e
retirados
Métodos
Análise de contaminantes
existem poucos métodos oficiais para isolamento de contaminantesmétodos alternativos
radiografia de raios Xinspecção de trigo para contaminação interna por insectos
medição de ácido úrico nas amostrascontaminação por excrementos de insectos ou pássarospermite automação
ELISAmedida quantitativa de material proveniente de insectos
medida da miosina produzida pelos insectospermite automação
espectroscopia NIRcontaminação interna por insectos no trigopermite automação
Métodos