VII Simposio de Recursos Genéticos para Aniê'i ~... _

ESTUDO DA DIVERSIDADE ECOLÓGICA DE BACTÉRIAS ENDOFMOLECULAR, EM GERMOPLASMAS DE MILHO TROPICAIS s-PC033

José Edson F. FIGUEIRED01, Marta A. TEIXEIRA2, G~ilhelJlle V. C. LlMA3, Clara H. C. SILVA4, StéfanoC. LOPES5, Eliane A. GOMES6, Claudia T. GUIMARAES ,Ubiraci G. P. LANA8, A. V. FOLGUERAS-

FLATSCHART9, Wellington BRESSAN10

1,2,3,4,5,6,7,8,9,10Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas-MG, Brasil1jeff@cnpms.embrapa.br, 2marta910@yahoo.com.br, 3guilherme611 @yahoo.com.br,

4clarahelena10@yahoo.com.br, 5stefano.pf@hotmail.com, 6eliane@cnpms.embrapa.br,7claudia@cnpms.embrapa.br, 8ubiraci@cnpms.embrapa.br, 9aureavff@cnpms.embrapa.br,

10bressan@cnpms.embrapa.brRESUMO·

Técnicas moleculares (SDS-PAGE e sequenciamento de rDNA) foram utilizadas para identificar 42 isoladosbacterianos de milho doce tropical. Vinte e quatro isolados formaram seis grupos distintos, os demais foramconsiderados únicos. O sequenciamento amino-terminal de um polipeptídio de 42 kDa, abundante na maioria dosisolados, revelou alta identidade com flagelina H de Bacil/us. O sequenciamento parcial do gene ribossômico 16Srevelou que todos os isolados pertencem ao gênero Bacíl/us spp, sendo que B. subtilis (15 isolados) e B. pumílis(12 isolados) foram mais frequentes. Os resultados indicaram que a técnica de SDS-PAGE constitui em procedimentorápido e barato para identificar réplicas de bactérias em coleções e bancos de germoplasmas e sequenciamentode rDNA foi preciso para identificar grupos taxonômicos.

INTRODUÇÃO

Atualmente, a diversidade biológica tem recebidogrande importância, principalmente quanto a suapreservação, em vista aos processos de degradaçãodos ecossistemas naturais. A grande importância dosmicroorganismos em ecossistemas, e considerandoque apenas uma parte dessa diversidade é conhecida,o desenvolvimento de estudos que explorem essadiversidade, através do isolamento, caracterização eutilização da microflora em processos agrícolasconstitui-se um processo fundamental como fonte demateriais genéticos. O estudo da microflora emcoleções e Bancos são' importantes para identificar epreservar a variabilidade genética de espécies queapresentam importância sócio-economica atual oupotencial para sua utilização em benefício dodesenvolvimento agrícola sustentável.Microorganismos endofíticos não patogênicos, comobactérias não patogênicas, encontradas na rizosferadas culturas agrícolas e mesmo nos tecidos vegetaistem mostrado estimuladoras do crescimento dasplantas, fertilizantes biológicos, agentes de controlebiológico de fitopatógenos e agentes despoluentesdo solo e águas. Além disso, microorganismosendofíticos tem mostrado potencial como novas fontesde genes, proteínas e compostos bioquimicos Oobjetivo deste trabalho foi estudar a diversidadegenética de bactérias endofíticas não patogênicas,em ecossistema de produção de milho, degermoplasmas tropicais, por meio da técnica SDS-PAGEe sequenciamento parcial deo gene ribossomal16S.

MATERIAL E MÉTODO

Bactérias endofíticas foram isoladas degermoplasma tropicais de milho doce. Folhas deplantas de milho foram coletadas, lavadas e ~superficialmente desinfestadas. Pedaços da folha(2 -3 cm) foram plaqueadas em Meio D2 (Kado& Heskett, 1970) e incubadas a 28 C por 48 -72 horas. Colônias foram isoladas, purificadas einoculadas em plantas de fumo para testes depatogenicidade. Quarenta e dois isolados nãopatogênicos foram identificados por técnicasmoleculares SDS-PAGE (Laemmli, 1970;Jackman, 1985) e sequenciamento de rDNA. Aextração de DNA genômico foi efetuada de acordocom Gurtler & Stanisich (1996). As sequênciasparciais do rDNA 16S foram depositadas noEMBLlGenBank/DDB e analizadas no GenBankdatabase usando o algoritmo BLASTTN eCLUSTRAL W para identificação dos isolados.O polipeptídio de aproximadamente 42 kDa,presente na maioria dos isolados foi purificadopor eletroeluição e a extremidade aminoterminalfoi determinada por degradação de Edman emseqüenciador automático (Applied BioSystems477A).

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VII Simposio de Recursos Genéticos para Amé"i"ica:

RESULTADO E DISCUSSÃO

Os perfis eletroforéticos (Figura 1) foram utilizados para comparação dos 42 isolados, sendo distribuídosem 6 grupos: grupo 1 (Endo 1; Endo 2); grupo 2 (Endo 5, Endo 6); grupo 3 (Endo 3, Endo 7, Endo 9,Endo 13, Endo 14, Endo 15, Endo 16, Endo 17, Endo19, Endo 21, Endo 22); grupo 4 (Endo 29, Endo30); grupo 5 (Endo 31, Endo 34); grupo 6 (Endo 32, Endo 36, Endo 37, Endo 38, Endo 41)" Osequenciamento aminoterminal do polipeptídio de aproximadamente 42 kDa (figura 1) mostrou altaidentidade com f1agelinaH de Bacillus. Os dados gerados pela sequência parcial do gene 168 mostraramque os 42 isolados pertencem ao gênero Bacil/us sendo B. subtilis o mais prevalecente (15 isolados).Os demais isolados foram: como B. pumilis (12 isolados), B. licheniformes (7 isolados), B. cereus (5isolados) e B. amiloliquefascens ( 3 isolados). e confirmou os dados de SDS-PAGE, indicando que operfil protéico é um método eficiente e de baixo custo para identificar réplicas em coleções de Bacillusspp. quando um grande número de isolados deve ser identificado.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 l4 l5 16 17 18 19 2021 22~~~~':-

• j">-'. -o.

M 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

Figura 1. Perfil eletroforético (8DS-PAGE) de extrato protéico total de 42 bactérias endofíticas (1-42)isoladas do milho doce brasileiro. Polipeptídio de 42 kDa (seta). M = marcador de peso molecularRainbow Pharmacia.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

GURTLER, V., Stanisich, V. A 1996. New approches to typing and identification of bacteria by using the 16S-23S rDNA spacerregion. Microbiology, 142,3-16.

JACKMAN, P.J.H. 1985. Bacterial taxonomy based on eletrophoretic whole-cell protein patterns, In:Goodfellow, Mo,Minnikin, DE(eds.) Chemical Methods in bacterial systematics. Academic Pres, London, UK, p. 115-129.

KADO, Col.; Heskett, M.G. 19700 Selective media for isolation of Agrobacterium, Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas andXanthomonas. Phytopatology, 60, 969-976.

LAEMMLI, U.K. 1970. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bactheriophage T4. Nature 227,680-685.

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