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ALEXANDRE DERMARGOS
FGF-2: estudo de estrutura e função
Tese apresentada ao Instituto de Química da
Universidade de São Paulo para obtenção do
Título de Doutor em Ciências (Bioquímica)
Orientador: Prof. Dr. Hugo Aguirre Armelin
São Paulo
2007
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Alexandre Dermargos
FGF-2: estudo de estrutura e função
Tese apresentada ao Instituto de Química da
Universidade de São Paulo para obtenção do
Título de Doutor em Ciências (Bioquímica)
Aprovado em: ____________ Banca Examinadora Prof. Dr. _______________________________________________________ Instituição: _______________________________________________________ Assinatura: _______________________________________________________ Prof. Dr. _______________________________________________________ Instituição: _______________________________________________________ Assinatura: _______________________________________________________ Prof. Dr. _______________________________________________________ Instituição: _______________________________________________________ Assinatura: _______________________________________________________ Prof. Dr. _______________________________________________________ Instituição: _______________________________________________________ Assinatura: _______________________________________________________ Prof. Dr. _______________________________________________________ Instituição: _______________________________________________________ Assinatura: _______________________________________________________
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Aos meus pais, que mesmo sem saber nada sobre ciência, me ensinaram as coisas mais essenciais da
vida, que me permitiram trilhar este caminho.
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Agradecimentos
Apesar de vivermos com o relógio em nossos pulsos, muitas vezes não nos damos conta que tudo tem uma hora para começar e tudo tem uma hora para terminar. Parece estranho, mas num país que ama chuteiras, as pessoas às vezes não percebem que a vida é parecida com uma partida de futebol, tem momentos eletrizantes, outros sem graça, alguns mais alegres, outros tristes. A principal diferença entre a vida e o futebol, é que a partida de futebol dura 90 minutos e o juiz soa o apito final. A vida não sabemos o quanto durará. Bom, chegou a hora de terminar um ciclo na minha vida, o doutorado, afinal o juiz já estava olhando para o relógio. Apresento a vocês, a minha tese (o tão famoso livro que sempre falava a minha família que estava escrevendo), que acabou de nascer. Venho a agradecer algumas pessoas que tornaram este parto possível... Ao Prof. Dr. Hugo Aguirre Armelin, meu chefe e orientador. Obrigado, por ter orientado (tirado e colocando pedras no meu caminho), pela liberdade, paciência e pela amizade. Levarei comigo um pouco de sua extensa sabedoria e sei que um dia sentirei falta dos momentos de “Forrest Gump – O Contador de Historias”, onde tive a oportunidade única de ouvir direto de um personagem real, histórias de como a bioquímica se formou. Aos colegas do Laboratório de Pesquisa de Fatores de Crescimento, Ciclo Celular e Hormônios, atuais (Carlinha, D. Cleusa, Jac, Ju, Mari, Nakano, Tati) pelas conversas úteis e fúteis tornado o ambiente do nosso laboratório agradável, pela pipoca, bolachas e café. Aos ex-membros (Ana, Cau, Carol, Celina, Érico, Kátia, Ivan, D. Maria, Miriam, Paula, Rose, Telma, entre outros) pelo convívio de anos a fio. Não poderia esquecer: Eva, que sempre a encontrava sorrindo no laboratório aos sábados; Forti, meu afilhado turrão, um verdadeiro “Rui Chapéu” do bilhar, obrigado pelos conselhos acadêmicos e pessoais; Gilson, com que divido não só a bancada e bagunça, mas também idéias e projetos, obrigado pelo aprendizado e amizade; e ao Matheus Henrique, camisa 9 (grande artilheiro do seu time), exímio fazedor de meio e professor da “arte”, obrigado por ser um bom garoto! Aos vizinhos e amigos de bloco: Camila, César, Margot, Susan e todos os demais do Laboratório da Profa. Dra. Bianca Zingales; Edlaine e demais do Laboratório da Profa. Dra. Ohara Augusto; todos sempre solícitos e amigáveis. Ao meu “amigo-irmão” Aurélio, que muitas vezes me ensinou bioquímica e lições de vida. Ao Marcelão, Sô e Shadow vizinhos que se tornaram amigos. As bancas de qualificação e de defesa da tese, por aceitarem e colaborarem com o enriquecimento do trabalho e pessoal, fortalecendo a minha formação cientifica. Ao Instituto de Química da USP, em seus professores e funcionários; a todo o corpo docente do Departamento de Bioquímica, pela formação que vem desde a graduação pela dedicação não só acadêmica, mas também pessoal.
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Ao LNLS (Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, Campinas – SP) aonde foram realizados os experimentos de modelagem molecular e duplo hibrido de levedura. Ao Dr. Sergio Oyama, pelas conversas sobre a vida e ciência, por ter me guiado nos caminhos da bioquímica “virtual” e pela amizade. Ao Prof. Dr. Nilson I. T. Zanchin e a Tereza Lima, pela sua dedicação, por um treinamento em bioquímica “úmida” de bancada e pela colaboração. Ao Prof. Dr. Rui Curi e membros do seu laboratório, pelo auxilio nos experimentos de morte celular envolvendo o FACS e pelo convívio. A Profa. Dra. Ana Campa pela colaboração nos trabalhos não apresentados nesta tese, mas que acredito que em breve serão publicados. Não poderia esquecer o seio familiar. Aos meus pais Markoss (in memorian) e Cecy, pelo amor, carinho, puxões de orelhas, conselhos e pedidos da calma. Apesar de serem simples e não saberem nada de ciência, sempre me incentivaram a estudar e me apoiaram em tudo. Minha “irmã” Idi, conselheira, apaziguadora e minha fã incondicional. Meus primos-irmãos que estão distantes, mas sempre preocupados e carinhosos. A minha madrinha Victoria, pelo amor, carinho e histórias do meu passado sírio. Elaine, este livro começou a nascer quando nos “conhecemos” e agora ele está nascendo. Sei da sua contribuição nele. Sei também o quanto sou feliz por encontrar em você, o conselho e o julgamento, a alegria de viver e uma coragem inexplicavel, isto sem falar que você é também o amor da minha vida. E a todos os meus “não citados” amigos, agora posso dizer que terminei de escrever o meu livro.
Este projeto teve o suporte financeiro da FAPESP e CNPq.
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”You may be right and I may be wrong, and with a litttle effort we may get nearer to the truth”
“Voçê pode estar certo e eu posso estar errado, e
com um pequeno esforço nós podemos juntos chegar mais próximos da verdade”.
Karl Popper
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Resumo Dermargos, A. FGF-2: estudo de estrutura e função. 156p. Tese - Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo. FGFs compreendem um grande família de 24 proteínas, participando de processos chaves nos mais variados tecidos, tendo funções parácrina, autócrina e intrácrina, regulando mitogênese, diferenciação celular, morfogênese e cicatrização. Mas, a relação estrutura-função dos FGFs é pobremente entendida. O membro protótipo desta família é o FGF-2, que apresenta quatro isoformas moleculares incluindo a forma de 18 kDa que é secretada e se liga aos receptores específicos (FGFRs) e dispara uma complexa sinalização. As outras isoformas, de alto peso molecular (21, 22 e 22,5 kDa) são expressas por códons alternativos (CUG) e permanecem no interior da célula interagindo com parceiros moleculares desconhecidos. Para antecipar mecanismos e parceiros do FGF-2 HMW foi realizada modelagem molecular desta isoforma que mostrou: uma estrutura do N-terminal da proteína com motivo β→α→β e manutenção do barril β. A busca por parceiros intracelulares, foi realizada através da técnica do duplo hibrido de levedura, usando um biblioteca de cDNA de cérebro de rato. Foram encontrados 4 possíveis parceiros: BRD2, UBE2I, BRPF1, PC4. Todas essas interações foram confirmadas através do crescimento da levedura em meio sem histidina, produção de β-galactosidase e ensaios de “pull-down” com GST. Analises por FACS confirmam que FGF2 não causa apoptose em células adrenais tumorais Y1 de camundongo, mas promovem um acumulo de células na fase S com bloqueio do ciclo celular e da proliferação, configurando uma forma de senescência. Resultados com as células humanas HEK-ER:Ras permitem fazer a seguinte generalização: FGF2 induz senescência em células malignas transformadas pelos oncogenes ras. A superexpressão da proteína de fusão FGF-2(18kDa):protA, mas não a da FGF-2(22,5 kDa):protA, protege a célula Y1 da senescência induzida por FGF-2. Por outro lado, a superexpressão destas mesmas isoformas de FGF-2 fusionadas à proteína A em células imortalizadas Balb3T3 não causou transformação celular e nem alterou a resposta mitogênica destas células ao FGF-2 recombinante adicionado ao meio de cultura. Células Y1 quando tratadas com FGF-2 recombinante produz ROS intracelular e libera anions superóxido no meio extracelular. Além disso, o anti-oxidante NAC protege estas células da indução de senescência induzida por FGF-2, sugerindo que ROS pode ser intermediário no disparo de senescência por FGF-2. Palavras-chave: FGF, FGF-2, estrutura e função de proteínas, proliferação celular, senescência, morte celular.
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Abstract Dermargos, A. FGF-2: Study of structure and function. 2007. 156p. PhD Thesis - Graduate Program in Biochemistry. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo. FGFs comprise a large family of 24 proteins that play key roles in a number of tissues as local paracrine, autocrine and intracrine regulators of mitogenesis, cellular differentiation, organ morphogenesis and tissue repair. Structure-function relationship among FGFs is still poorly understood. FGF-2, the family prototype member, exists as four molecular species. The 18 kDa form is released to the extra-cellular milieu and binds to specific receptors (FGFR), initiating a complex array of signals. Other isoforms of higher molecular weights (21, 22 and 22,5 kDa) are translated from alternative codons (CUG) and remain inside of the cell interacting with unknown partners. Aiming to anticipate mechanisms and partners, we modeled the FGF2-HMW molecule, showing that the protein displays a β→α→β motif in the N-terminal region and maintains the β-barrel structure common to all FGFs. By the yeast two-hybrid method, using a cDNA rat brain library, we found four possible partners for FGF2-HMW: BRD2, UBE2I, BRP1 and PC4. All partners were confirmed by yeast growth without histidine, production of β-galactosidase and “pull-down” assays with GST. FACS analyses confirmed that FGF2 does not cause apoptosis in mouse Y1 adrenal tumor cells. But, FGF2 inhibited S phase progression blocking cell cycle and proliferation, characterizing a form of senescence. In addition, results obtained with the human HEK-ER:Ras cells support the following general statement: FGF2 triggers senescence in malignant cells transformed by ras oncogenes. Ectopic expression of the fusion protein FGF-2(18 kDa):protA, but not of FGF-2(22,5 kDa):protA, protected Y1 cells senescence induced by FGF-2. On the other hand, ectopic expression of FGF-2 isoforms fusioned to protA in Balb3T3 immortalized cells did not cause transformation and neither modified the mitogenic response of this cell to recombinant FGF2. Recombinant FGF-2 stimules Y1 cells to produce intracellular ROS and to release superoxide anions into intracellular medium. Moreover, the ROS scavenger NAC protect Y1 cells from senescence induced by FGF-2, suggesting that ROS may be mediate senescence triggering induced by FGF-2. Keywords: FGF, FGF-2, protein structure and function, cell proliferation, senescence, cell death.
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Lista de Abreviaturas e Siglas BrdU bromodeoxiuridina 4-OHT 4-hidroxitamoxifen ACTH Hormônio Adrenocorticotrópico ou Adrenocorticotropina AKT ou PKB Proteína kinase B DMEM “Dulbeco modified Eagle medium” DTT ditiotreitol ERK Extracellular signal regulated kinase ERK “Extracellular signal regulated kinase” FACS Análise de citometria de fluxo, FACS, do inglês: FCS Soro fetal bovino FCS Soro fetal bovino, do inglês: Fetal calfum serum FGF Fator de crescimento de fibroblasto FGFR Receptores específicos para FGF GDP Guanosina difosfato GTP Guanosina trifosfato HSGAG Heparan-sulfato glicoaminoglicano IPTG “Isopropilthiogalactoside” MAPK “Mitogen-Activated Protein Kinase” NAC N-acetil-L-cisteína ORF Abertura de fases de leitura, do inglês “Open reading frame” p53 Proteína repressora p53 PBS Solução salina tamponada PBSA Solução salina tamponada sem Ca
+2 sem Mg
+2
pERK ERK fosforilada (ativa) PI Iodeto de propídio; PI, do inglês: “propidium iodide” PI3K Fosfatidilinositol-3 Kinase PKA Proteína quinase A
PKC Proteína quinase C PLC “Fosfolipase-C” PMA Phorbol 12-myristate-13-acetate PMSF Fenilmetano Sulfonil Fluoreto Ras “Rat Sarcoma Virus”
RMN Ressonância Magnética Nuclear
ROS Espécies reativas de oxigênio; ROS, do inglês: reactive oxygen species.
SDS Dodecil sulfato de sódio TCA Ácido tricloro acético
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Índice
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 16
1.1. A família dos Fatores de Crescimento de Fibroblastos (FGFs) ...................... 17
1.2. O FGF-2 ................................................................................................. 23
1.3. Os FGFRs (Fibroblast growth factor receptors) ........................................... 27
1.4. Proteínas: domínios funcionais e complexos protéicos ................................ 30 1.4.1. Duplo-híbrido de levedura .................................................................. 31 1.4.2. Modelagem Molecular ........................................................................ 35 1.4.3. Proteínas de fusão............................................................................. 37
1.5. Ciclo celular: proliferação, senescência e morte. O papel do FGF-2 e de ROS 41
1.6. A Linhagem Celular Y1............................................................................. 46
2. OBJETIVOS................................................................................................... 48
2.1. Objetivo geral ......................................................................................... 49
2.2. Objetivos específicos desta tese ............................................................... 49
3. MATERIAIS E METODOS ................................................................................ 51
3. MATERIAIS................................................................................................ 52 3.1. Linhagens celulares.............................................................................. 52 3.2. Linhagem de levedura .......................................................................... 52 3.3. Plasmídeos .......................................................................................... 53 3.4. Fator de crescimento de fibroblasto ....................................................... 53 3.5. Inibidores de Fosfatase ou Protease ...................................................... 54 3.6. Kits ..................................................................................................... 54 3.7. Drogas e Antibióticos ............................................................................ 55 3.8. Soro e meio de cultura ......................................................................... 55 3.9. Isótopo radioativo ................................................................................ 56 3.10. Enzimas............................................................................................. 56 3.11. Anticorpos ......................................................................................... 56 3.12. Oligonucleotídeos:.............................................................................. 57 3.13. Soluções............................................................................................ 58 3.14. Reagentes ......................................................................................... 59 3.15. Equipamentos .................................................................................... 59
3.2. MÉTODOS .............................................................................................. 61 3.2.1. Cultura de células.............................................................................. 61 3.2.2. Carenciamento celular ....................................................................... 61 3.2.3. Transfecção de células ....................................................................... 62 3.2.4. Extração de RNA ............................................................................... 63 3.2.5. Reações de RT-PCR ........................................................................... 64 3.2.6. Extração dos produtos do PCR............................................................ 64 3.2.7. PCR em Tempo Real (PCR quantitativo ou Real-time PCR)..................... 65
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3.2.8. Extração de proteína ......................................................................... 65 3.2.9. SDS-PAGE......................................................................................... 66 3.2.10. Western blot ................................................................................... 66 3.2.11. Síntese de DNA detectada por incorporação de timidina tritiada .......... 67 3.2.12. Medida de proliferação celular por contagem em hemocitômetro ......... 68 3.2.13. Ensaios de citometria de fluxo (FACS) ............................................... 68
3.2.13.1. Determinação de fragmentação de DNA utilizando-se de iodeto de propídeo................................................................................................. 69 3.2.13.2. Determinação morte celular por apoptose utilizando-se anexina V . 69 3.2.13.3. Determinação da produção de ROS utilizando-se dihidroetidina ..... 70
3.2.14. Morte celular detectada por ensaio de formação de colônias ............... 70 3.2.15. Transformação de Bactérias.............................................................. 71 3.2.16. Preparação de DNA Plasmidial .......................................................... 71 3.2.17. Sequenciamento.............................................................................. 71 3.2.18. Coloração de gel de poliacrilamida com Coomasie-Blue....................... 72 3.2.19. Coloração com nitrato de prata de gel de poliacrilamida...................... 72 3.2.20. Fracionamento celular da proteína de fusão FGF-2 fusionado a Proteína A................................................................................................................. 73 3.2.21. Purificação de lisados celulares em resina de IgG Sepharose............... 74 3.2.22. Transformação de leveduras ............................................................. 74 3.2.23. Ensaio de metabolização de X-Gal..................................................... 75 3.2.24. Extração de DNA genômico de levedura ............................................ 75 3.2.25. Clonagem, isolamento e sequenciamento dos plasmídeos recombinantes................................................................................................................. 76 3.2.26. Produção de espécies reativas de oxigênio através do método da Lucigenina ................................................................................................. 77 3.2.27. Modelagem Molecular ...................................................................... 77
4. RESULTADOS ................................................................................................ 78
4.1. Construção do modelo do FGF-2 HMW ...................................................... 79 4.1.1. Busca de um modelo para N-terminal do FGF-2 HMW........................... 80 4.1.2. Modelagem molecular do FGF-2 HMW................................................. 85 4.1.3. Validação do modelo do FGF-2 HMW................................................... 88
4.2. Identificação de parceiros de FGF-2 (22,5 kDa), usando a metodologia do duplo-hibrido de levedura ............................................................................... 91
4.2.1. Construção do cDNA de FGF-2(22,5kDa) e ensaio de duplo hibrido de levedura .................................................................................................... 91 4.2.2. Análise das proteínas ligantes de FGF-2 HMW (22,5 kDa) detectadas pelo ensaio de duplo híbrido ............................................................................... 93
4.3. Expressão ectópica de espécies de FGF-2 e fenótipo celular ........................ 99 4.3.1. Em células Balb 3T3, expressão ectópica de FGF-2 não causa transformação, enquanto tratamento com FGF-2 exógeno recombinante dispara mitogênese e não promove morte celular ................................................... 101 4.3.2. FGF-2 não dispara apoptose, mas bloqueia o ciclo celular de células Y1 na fase S ...................................................................................................... 103 4.3.3. Expressão ectópica do oncogene H-RasV12 tornam células humanas imortalizadas suscetíveis ao bloqueio da proliferação por FGF-2 exógeno ...... 108
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4.3.4. Transfecção, seleção e isolamento de sub-linhagens clonais de células Y1 expressando FGF-2(18kDa):ProtA e FGF-2(22,5kDa):ProtA........................... 111 4.3.5. Expressão ectópica de FGF-2(18 kDa):protA, mas, não de FGF-2(22,5 kDa)protA, protege as células Y1 de senescência induzida por FGF-2 exógeno............................................................................................................... 114
4.4. Pode ROS serem mediadores no disparo de senescência iniciado por FGF-2 na linhagem adrenocortical Y1........................................................................... 118
5. DISCUSSÃO ................................................................................................ 124
5.1. A modelagem do FGF-2 HMW (22,5 kDa) ................................................ 125
5.2. Ensaios de duplo hibrido em busca de parceiros intracelulares de FGF-2 HMW (22,5 kDa)................................................................................................... 127
5.3. Natureza do fenômeno de senescência e bloqueio da proliferação celular induzida por FGF-2....................................................................................... 130
5.4. ROS pode participar na mediação do disparo de senescência por FGF-2..... 132
5.5. Conseqüências da expressão ectópica de isoformas de FGF-2 em células imortalizadas não tumorigênicas e células malignas Y1 ................................... 135
6. CONCLUSÕES ............................................................................................. 137
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................... 140
SÚMULA CURRICULAR..................................................................................... 154
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Índice de Figuras
Figura 1.1 – Alinhamento dos FGFs.................................................................... 21 Figura 1.2 – Estruturas cristalografadas dos FGFS............................................... 21 Figura 1.3 – Analise filogenética da família dos FGFs........................................... 22 Figura 1.4 – Processamento do FGF-2................................................................ 24 Figura 1.6 – Representação do sistema de duplo híbrido ..................................... 33 Figura 1.7 – Esquema da técnica de purificação por afinidade de complexos. ........ 40 Figura 1.8 – Fases do ciclo celular. .................................................................... 41 Figura 1.9 – A linhagem adrenocortical Y1.......................................................... 47 Figura 3.1 – Curva de dose para higromicina ...................................................... 63 Figura 4.1 – Predição da estrutura secundária do FGF-2 HMW. ............................ 82 Figura 4.2 - Resultado do alinhamento do “threading”......................................... 83 Figura 4.3 – A proteína homologa RCC-1 e o fragmento 1-55............................... 84 Figura 4.4 – Coleta de estruturas e gráfico de RMSD do fragmento 1-55............... 84 Figura 4.5 – Gráfico de RMSD durante a durante a dinâmica molecular do FGF-2 HMW............................................................................................................... 86 Figura 4.6 – Coleta de estruturas do FGF-2 HMW durante a dinâmica molecular.... 86 Figura 4.7 – Variação da estrutura secundária do modelo durante a dinâmica molecular. ....................................................................................................... 87 Figura 4.8 – Cartoon da estrutura do FGF-2 HMW............................................... 87 Figura 4.9 – Gráfico de Ramachandran do modelo final do FGF-2 HMW. ............... 89 Figura 4.10 – Oligos desenhados para a porção do cDNA correspondente ao N-terminal do FGF-2 HMW.................................................................................... 92 Figura 4.11 Eletroferogramas corados com Coomassie de lisados de bactérias transformadas com as construções codificantes das proteínas de fusão com GST indicadas acima. .............................................................................................. 96 Figura 4.12 Eletroferograma corado com Coomassie de proteínas de fusão com GST induzidas por IPTG adsorvidas a esferas de Glutationa-Sepharose 4B. .................. 97 Figura 4.13 Western-blot realizado com o anticorpo anti FGF-2. ........................... 98 Figura 4.14 - Ensaios de incorporação de 3H-timidina em células Balb 3T3 e seus clones. .......................................................................................................... 102 Figura 4.15 - Ensaio de colônia em células Balb 3T3 e seus clones. .................... 103 Figura 4.16 - Analises realizadas por citometria de fluxo.................................... 106 Figura 4.17 - Medidas de ciclo celular efetuadas por citometria de fluxo. ............ 107 Figura 4.18 Ensaios iniciais com células HEK ER:Ras G12................................... 110 Figura 4.19 Western-blot para FGF-2 nas sublinhagens de Y1. ........................... 112 Figura 4.20 – Fracionamento celular. ............................................................... 113 Figura 4.21 – Fracionamento celular protéico e a localização de FGF-2. .............. 114 Figura 4.22 - Ensaios de proliferação celular em células Y1 e seus clones. .......... 115 Figura 4.23 - Ensaio de colônia em células Y1 e seus clones sem a presença de FCS..................................................................................................................... 116 Figura 4.24 – Ensaios de colônia em células Y1 e clones na presença de Soro. .... 116 Figura 4.25 - Ensaio de quimiluminescência amplificado por Lucigenina em células Y1................................................................................................................. 120
xiv
Figura 4.26 - Produção de ROS intracelular. ..................................................... 121 Figura 4.27 - Ensaio de colônia: curva dose-resposta para o antioxidante (N-acetil-L-cisteína). ....................................................................................................... 122 Figura 4.28 - Ensaio de colônia em células Y1 com adição de antioxidante.......... 123 Figura 5.1 - Interações proteína-proteína descritas pelas isoformas de FGF-2...... 129 Figura 5.2 – Esquemas das vias de sinalização envolvidas com o disparo de senescência ou proliferação. ........................................................................... 133 Figura 5.3 - Curva padrão de β-NADH nos ensaios de quimiluminescência. ......... 135
xv
Índice de Tabelas
Tabela 3.1 – Plasmídeos utilizados neste trabalho ................................................ 53
Tabela 4.1 – Estruturas da família dos FGFs resolvidas experimentalmente............. 90
Tabela 4.2 – Resultado da busca por similaridade para os membros da família dos FGFs. ............................................................................................................... 90
Tabela 4.3 – Resultados da análise através do BLAST dos cromatogramas das colônias que cresceram e foram positivas a β-gal no ensaio de duplo-híbrido (para todos E=0) ....................................................................................................... 94
Tabela 4.4 – Resultados das análises realizadas por citometria de fluxo para apoptose..................................................................................................................... 104
Tabela 4.5 – Ensaios de 3H-timidina para outras sublinhagens de Y1.................... 117
Tabela 4.6 – Ensaios de colônia para outras sublinhagens de Y1 ........................ 117
Tabela 5.1 – Interações proteína-proteína descrita na literatura para FGF-2 e suas isoformas. ...................................................................................................... 129
Tabela 5.2 – FGF-2 induz células Y1 a entrar em S, mas não chegam a completar a mitose............................................................................................................ 132
16
1. INTRODUÇÃO
17
1.1. A família dos Fatores de Crescimento de Fibroblastos (FGFs)
Os FGFs (do inglês “Fibroblast Growth Factor”, ou fatores de
crescimento de fibroblastos), formam uma família de proteínas que receberam a
nomenclatura baseada na origem de sua atividade biológica promotora de
proliferação em fibroblastos em cultura. Seguido de uma designação numérica,
(ORNITZ & ITOH, 2001; DRAPER et al., 2004), preservado pelo uso e adotado em
definitivo, atualmente a designação FGF tem apenas valor histórico, pois os FGFs não
são exclusivamente fatores de crescimento e nem exercem efeitos específicos em
fibroblastos (BAIRD, 1993).
O primeiro, de 24 membros descritos da família dos FGFs foi o FGF-
2. Este foi descrito inicialmente por Armelin em 1973 e confirmado por
Gospodarowicz em 1974, que demonstraram que o extrato hipofisário bovino possuía
um fator de crescimento de caráter básico e natureza protéica para fibroblastos de
camundongo da linhagem 3T3 (ARMELIN, 1973 e GOSPODAROWICZ, 1974).
Atualmente, existe uma extensa literatura sobre os FGFs, desde mera
correlação até estudos fenomenológicos mais detalhados. Os FGFs têm papel central
em diversos fenômenos biológicos, tais como desenvolvimento (YAMAGUCHI &
ROSSANT, 1995), diferenciação celular, migração, divisão, organogenese, proliferação
(ARMELIN, 1973 e GOSPODAROWICZ et al., 1978 e 1986) cicatrização de feridas
(CLARKE, 1993 e CUEVAS et al., 1988) e angiogênese (BASILICO & MOSCATELLI,
1992). Apesar da função dos FGFs ser bem caracterizada os mecanismos de ação
dos mesmos ainda não estão completamente elucidados.
18
Os FGFs são expressos em uma grande variedade de organismos (de
invertebrados a animais superiores) e nos mais diversos estágios do desenvolvimento
(embrião, feto e tecido adulto). Por outro lado, em organismos unicelulares, tais
como Eschericia coli e Saccharmoyces cerevisiae, não foram identificados genes
homólogos que expressam FGFs (ITOH & ORNITZ, 2004).
No desenvolvimento embriônico, os FGFs participam na regulação da
proliferação celular, migração e diferenciação, influenciando a organogênese. No
adulto participam na sinalização de vias de regulação da homeostasia e na
cicatrização de feridas (ORNITZ, 2005; HUANG & STERN, 2005; ZHANG et al.,
2006a). A expressão inadequada dos FGFs leva ao desenvolvimento de doenças tais
como retinopatia diabética, proliferação tumoral, artrite reumatóide e arteriosclerose
(FOLKMAN & KLAGSBRUN, 1987). O conhecimento da função e dos mecanismos de
ação e interação dos FGFs são importantes alvos para a terapêutico, visto a ampla
gama de fenômenos que ele participa.
De um modo geral, os FGFs são descritos como proteínas
monoméricas, de peso molecular variando de 16 a 30 KDa, com grande afinidade por
heparan sulfato (HS) e proteoglicanos sulfatados (HSPG) (BURGESS & MACIAG,
1989). A afinidade do FGF com a heparina é bastante explorada, principalmente nos
processos de purificação dos FGFs por cromatografia de afinidade (SHING et al.,
1984).
O proteoglicano heparan sulfato presente na membrana celular ou na
matriz extracelular, carrega carboidratos carregados negativamente com grupos
sulfatos. Ele tem um papel importante na interação do FGF com o seu receptor
(FGFR – “Fibroblast Growth Factor Receptor”), facilitando a dimerização e a ativação
19
dos receptores, através da formação de um complexo ternário (FGF-FGFR-HS).
Estudos estruturais e cinéticos, afirmam que primeiro ocorre a formação do
complexo FGF-HS para depois ocorrer a ligação ao receptor FGFR (IBRAHIMI et al.,
2004). Na falta de heparan sulfato na célula, o FGF não consegue se ligar ao seu
receptor (YAYON et al., 1991). A membrana celular quando submetida hidrólise,
libera complexos FGF-HS, sugerindo que há um mecanismo de controle celular por
heparanase, proteoglicosidases e outras enzimas (BASHKIN et al., 1989;
MOSCATELLI et al., 1987 e FLAUMENHAFT et al., 1990). Experimentalmente in vitro,
a heparina protege os FGFs contra degradação, evitando uma desnaturação ácida ou
por calor, sugerindo que os heparan sulfatados possam funcionar como uma reserva
de fatores de crescimento (YAYON et al., 1991).
Em termos de estrutura primária a família dos FGFs é descrita, como
tendo um “core” central de 140 aminoácidos com 13 a 70% de similaridade em
mamíferos e duas cisteínas conservadas, que não participam de pontes de dissulfeto,
mas que podem ter papel fundamental na estruturação da proteína (RIFKIN &
MOSCATELLI, 1989; GALZIE et al., 1997) (Figura 1.1). Tridimensionalmente os FGFs
formam com o seu “core” central, 12 fitas pregueadas β, antiparalelas organizadas
em torno de um eixo central, formando um arranjo, denominado de barril β. Os
poucos membros da família dos FGFs que têm estruturas terciárias determinadas por
métodos experimentais, se confirmam como um barril-β (Figura 1.2) (MOHAMMADI
et al., 2005).
21
Figura 1.1 – Alinhamento dos FGFs. Figura na página anterior. Todas as seqüências dos FGFs humanos foram alinhadas e a localização das 12 folhas β estão identificadas. O trecho em hélice (αN) se refere ao N-terminal do FGF-9. O trecho em hélice α11 se refere a família dos FGFs-19, 21 e 23 que ao invés de terem dois trechos em folhas β, tem um trecho em hélice α, justamente no sitio de ligação ao receptor.
Figura 1.2 – Estruturas cristalografadas dos FGFS. Todos os membros da família dos FGFs adotam em comum um estrutura de barril β com alças variáveis. As estruturas resolvidas em complexo com o receptor estão marcadas com asterisco (*) (MOHAMMADI et al., 2005).
Estudos do nosso grupo (ainda não publicados) e de outros grupos
mostram que a superfamília de FGF pode ser dividida em 7 subfamílias, usando como
critérios as similaridades de seqüências e suas propriedades funcionais (ITOH &
ORNITZ, 2004 e POPOVICI et al., 2005) (Figura 1.3). Uma dessas subfamílias,
composta pelo FGF 19, 21 e 23 tem um comportamento parecido com hormônios,
participando de diversos processos metabólicos, tais como homeostasia da bile e
vitamina D, manutenção das concentrações séricas de fosfato, além de participar do
22
metabolismo de lipídeos e carboidratos. Uma outra característica incomum a esta
subfamília é a sua baixa atividade quando comparado aos membros clássicos dos
FGFs (FGF-1 e FGF-2) é a capacidade reduzida de ligação a heparina, explicada pelos
estudos estruturais. Apesar das diferenças em seqüência primária, todos os FGFs
mantém no sitio de ligação a heparina, o motivo estrutural de folha β (folhas beta
β10 e β12), enquanto que a subfamília dos FGFs 19, 21 e 23 tem um trecho em
hélice α (α11). Uma proteína recentemente descoberta, denominada Klotho,
aumenta a atividade do FGF-23 em mais de 10 vezes, sendo necessária, para que
haja a ligação aos FGFRs e heparan sulfato. (GOETZ et al., 2007).
Figura 1.3 – Analise filogenética da família dos FGFs. O diagrama mostra a distribuição dos membros da família dos FGFs, feita através do software ClustalW (HIGGINS, et al., 1994), baseando-se na analise da similaridade de suas seqüências.
23
A subfamília dos FHFs (Fibroblast Homologues Factor, ou fatores
homólogos de fibroblastos), composta pelos FGF 11 a 14 e que foi descoberta
através de busca de seqüências em banco de dados, não demonstram nenhuma
atividade mitogênica em células BaF3 transfectadas com o FGFRs, apesar de
manterem a estrutura de barril β (SMALLWOOD et al., 1996; OLSEN et al., 2003).
Outro ponto desta subfamília é a incapacidade de se ligar aos FGFRs e sim a canais
de sódio sensíveis a voltagem (VGSCs, do inglês Voltage-Gated Sodium Channels) e
há também a descrição de interação com uma proteína da família das MAP quinase,
denominada IB2 (do inglês, “islet-brain-2”), expressa durante o desenvolvimento
neuronal (GOLFARB, 2005).
1.2. O FGF-2
Inicialmente o FGF-2 foi denominado de bFGF (“basic Fibroblast
Growth Factor” devido ao caráter químico básico - pI = 9,6), foi caracterizado em
1986 por Abrahan, como uma proteína de 155 aminoácidos (ABRAHAN et al., 1986).
Hoje se sabe que o gene fgf-2 está localizado no cromossomo 4, entre as bandas
q26 e q27, com o tamanho de 36 kb. O FGF-2 apresenta um grande mRNA, cerca de
6,8 kb, com uma grande região 3’ não traduzida (3’-UTR, do inglês “untranslated
region”), ou seja, 85% do mensageiro não é processado e múltiplos sítios de
iniciação de leitura (um canônico, AUG e diversos não canônicos, CUG) permitindo a
síntese de espécies de 18, 21, 22, 22,5 e 34kDa, todas com C terminal comum
(Figura 1.4). A isoforma de baixo peso molecular do FGF-2 (18 kDa) é a única com o
24
códon iniciador AUG, e que tem funções parácrinas e autócrinas (ARNAUD et al.,
1999). Já as isoformas de alto peso molecular (FGF-2 HMW) permanecem no interior
da célula, tanto no núcleo como no citoplasma e participam de funções intrácrinas
(POWELL & KLAGSBRUN, 1991; TESSLER & NEUFELD, 1990).
Figura 1.4 – Processamento do FGF-2. Mostrando as diferentes isoformas do FGF 2 que são sintetizadas a partir do mesmo mRNA, diferenciando entre si, apenas pela posição do códon iniciador da transcrição. A isoforma de baixo peso molecular (18 kDa) tem o códon iniciador AUG, enquanto que as outras isoformas são resultantes do códon alternativo (CUG). A região da seqüência que está dentro da caixa ( ) indica uma região sinal de localização nuclear (NLS – “nuclear localization signal”). Note embaixo a organização genômica do FGF-2. Os números de acesso para as seqüências dos FGFs são: A32398 (22,5 kDa), AAA52532.1 (21 kDa) e AAA52533.1 (18 kDa) e para o mRNA é NM_002006.
25
O FGF-2 de 155 aminoácidos é secretado pela célula por mecanismos
ainda obscuros, pois não há nenhum sinal clássico de secreção celular. Estudos
demonstram que a secreção é dependente da energia fornecida pelas Na+ K+
ATPases (FLORKIEWICZ et al., 1998). Depois de secretado, o FGF-2 interage com os
receptores específicos da membrana e com o heparan sulfato da superfície celular. Já
as isoformas de alto peso molecular apresentam uma ou mais seqüências de
localização nuclear (NLS: “nuclear localization sequence”) na sua região N-terminal.
Sugere-se que a região N-terminal do FGF-2 pode ser importante para o
endereçamento nuclear, pois existe a capacidade de se ligar a fração ribossomal e
participar da regulação das isoformas (RENKO et al., 1990, BUGLER et al., 1991,
QUARTO et al., 1991). Através de uma alça de “feedback”, a regulação realizada
pelas isoformas de alto peso, sugerem um mecanismo intrácrino de controle,
principalmente pela capacidade das moléculas de alto peso do FGF-2 de se ligarem a
ribossomos, RNA e nucléolo, resultando na interação entre a regulação da síntese e o
funcionamento ribossomal (RE, 2003; RE & COOK, 2006).
A ligação do FGF-2 (18 kDa) ao seu receptor faz com que tanto PKA
(proteína quinase A) como PKC (proteína quinase C) provoquem mudanças
estruturais no FGF-2. PKC fosforila FGF-2 na Ser64. Esta fosforilação não apresenta
efeito biológico, não afetando a capacidade de ligação a heparina ou ao receptor
FGFR (FEIGE & BAIRD, 1989). Mas, a fosforilação de FGF-2, por PKA, na Thr112,
resulta no aumento de 3 a 8 vezes da ligação do FGF-2 ao receptor (FEIGE et al.,
1989).
Inicialmente o FGF-2 foi apresentado como um fator mitogênico
agindo sobre fibroblastos Balb 3T3 (ARMELIN, 1973; GOSPADAROWICZ, 1974;
26
GOSPODAROWICZ & MORAN, 1974). Hoje o papel biológico atribuído ao FGF-2 é
extenso: (i) participa da ativação neurotropica; (ii) é um fator de sobrevivência
celular; (iii) bloqueia a apoptose em células neuronais; (iv) é um potente agente
angiogênico; (v) está envolvido na progressão tumoral e nas metástases (BASILICO
& MOSCATELLI, 1992). O FGF-2 participa ativamente dos processos de
desenvolvimento, é um potencial regulador de genes e a sua expressão é suprimida
por interferon alfa (IFN-α) e beta (IFN-β) (DINEY et al.,1998). Sobre condições de
carenciamento, isto é a célula em meio sem soro, FGF-2 na sua isoforma de alto
peso, dispara estímulos mitogênicos (ARNAUD et al., 1999).
Estudos realizados no nosso laboratório descrevem o sinal
mitogênico de FGF-2 em células Y1. Após a adição de FGF-2 ao meio de cultura,
detectamos rapidamente a ativação de c-Ki-Ras (t < 1 min), em seguida a ativação
de ERK 1/2 (t ~ 5 min) e após 2 horas a expressão nuclear de c-Fos, sugerindo que
está ocorrendo a transição G0 → G1 do ciclo celular. Também há a indução da
entrada em S, já que temos a expressão de c-Myc, indução de ciclinas D1 e E,
fosforilação de Rb e a indução da síntese de DNA, eventos que ocorrem por volta da
6ª hora de estimulação por FGF-2 (LEPIQUE et al., 2004; ROCHA et al. 2003; LOTFI
& ARMELIN, 2001; LOTFI et al., 1997; ARMELIN et al., 1996; SCHWINDT et al.,
2003).
A resposta de FGF-2 é essencial nos processos de desenvolvimento e
morfogênese, apesar dos dados de camundongos knock-out serem contraditórios,
visto que os camundongos knock-out para fgf-2 (-/-) são viáveis, férteis e
indistinguíveis dos fgf-2 (+/+), apesar de apresentarem defeitos neuronais,
principalmente com diminuição do número de neurônios no córtex; e pela diminuição
27
na pressão sanguínea, resultante do ineficiente controle neural sobre o tônus
vascular (DONO et al., 1998; ORTEGA et al., 1998). Isto não implica em fgf-2 ser
surpérfulo e sim que a sua função é tão vital que a sua função acaba sendo
compensada por membros da família, indicando uma regulação redundante desses
processos (POWERS et al., 2000).
1.3. Os FGFRs (Fibroblast growth factor receptors)
Os FGFRs (Fibroblast growth factor receptors ou receptores de
fatores de crescimento de fibroblasto) são receptores transmembranares, do tipo
tirosina quinase. No seu lado extracelular há 3 domínios (Ig like) denominados D1,
D2 e D3. Entre os domínios D1 e D2 há uma caixa ácida e após o domínio D3
encontra se a região transmembranica. No lado intracelular, há dois domínios de
proteína tirosina quinase, que contém ao todo 7 resíduos de tirosina que podem ser
fosforilados (Tyr463, Tyr583, Tyr585, Tyr563, Tyr654, Tyr730 e Tyr766). Destes resíduos,
dois (Tyr653 e Tyr654) são essenciais para a ativação do FGFR e para a sinalização
(MOHAMMADI et al., 1996) (Figura 1.5).
A similaridade entre as seqüências primárias dos FGFRs varia de 55 a
72%. Recentemente um novo receptor (FGFR-5 ou FGFR-L1), foi descrito. Ele não
apresenta o domínio intracelular de tirosina quinase (KIM et al., 2001; SLEEMAN et
al., 2001). Mutações pontuais nas isoformas dos FGFRs levam ao desenvolvimento
anômalo do tecido ósseo, relacionadas principalmente a acrondroplasia. No caso da
acrondroplasia, a mutação ocorre em apenas de um nucleotídeo no DNA, de modo
28
que na posição 1138 uma guanina é substituída por adenina ou citosina, alterando a
seqüência do receptor (Gly380Arg) (ROUSSEAU et al., 1994; SHIANG et al., 1994).
Triagens genéticas tem identificado in vivo a participação de FGFRs mutados em
alguns tipos de câncer, evidenciando que a sinalização disparada por FGF participa
da via oncogênica de alguns tecidos. Paradoxalmente, em certas circunstancias
FGFR2-IIIb exerce um efeito supressivo em tumores. (DAILEY, 2005).
Figura 1.5 – Esquema do FGFR e suas vias de sinalização. À esquerda é mostrado um diagrama da estrutura do FGFR. À direita as principais vias de sinalizações disparadas pelo complexo FGF-FGFR-HS: PLCγ, PI3 K→ Akt → PKB, e MAPK. MAP quinases ativadas (ERKs, p38 ou JNK) vão ser translocadas para o núcleo, aonde fosforilam fatores de transcrição que irão regular a transcrição gênica.
O FGF se liga seus receptores específicos (FGFR) presentes na
membrana celular, entre as regiões D2 e D3, formando um complexo ternário (2FGF-
2FGFR-HS). Subsequentemente tem-se ativação do receptor, através da
autofosforilação cruzada dos resíduos de tirosina citoplasmáticos presentes no FGFR.
29
Esses resíduos fosforilados são reconhecidos por SH-2 e outras proteínas
adaptadoras, como Grb2 e Shc. Grb 2 se liga a SOS, formando um complexo que
ativa o oncoproteína Ras (Ras•GDP → Ras•GTP), que dispara uma cascata de
sinalização envolvendo Raf → MEK → ERK1/2. A via de ativação de Ras é crucial
para a proliferação induzida por FGF (BOILLY et al., 2000). Outra via ativada por FGF
é a de PLCγ, esta hidroliza fosfatidilinositol, formando IP3 (inositol 3-fosfato) e
diacilglicerol, liberando íons Ca+2 e ativando PKC (NUGENT & IOZZO, 2000) (Figura
1.5). A ativação das vias Ras/ERK e de PI3K resultam na entrada das células na fase
S do ciclo celular.
Além de existir 5 receptores diferentes: FGFR1, 2, 3, 4 e 5 (L-1),
todos eles são sujeitos a “splicings” alternativos, exclusivamente no domínio IgG III,
podendo adquirir mais duas isoformas, denominadas IgG-IIIb e IgG-IIIc (JAVE, 1992
e PASQUALE e SINGER, 1989). O “splicing” alternativo utiliza 1 dos 2 exons possíveis
e é essencial para determinar a afinidade da ligação do complexo FGF-FGFR-HS. Há
uma especificidade de expressão destes “splicings” em função da origem celular.
Tecidos e células de origem epitelial expressam o “splicing” IIIb e as de origem
mesenquimal o IIIc, indicando uma possível relação cruzada entre expressão de FGF
com atividade no tecido, pois o. FGF expresso no epitélio, age na isoforma IIIc
(ZHANG et al., 2006b, 2006; ZHANG et al., 2006a). Existe ainda o domínio IgG IIIa
que apresenta uma forma truncada na região transmembranar resultando num
receptor circulante de função desconhecida (JOHNSON & WILLIAMS, 1993).
A multiplicidade de ligantes (são ao todo 24 FGFs) de receptores
(são ao todo 9, contando com as isoformas), de fenômenos aos quais eles estão
associados, além da variabilidade de especificidade e respostas (alguns FGF são
30
extremamente promíscuos na ligação, enquanto outros tem uma alto grau de
especificidade), sugerem que essas variabilidades são responsáveis pelas diferentes
funções dos FGFS em cada sistema celular, que deve ser finamente regulado, por
alças autócrinas e parácrinas, que funcionam como estímulos positivos ou não.
(JAYE, 1992; PASQUALE & SINGER, 1989, GALZIE et al., 1997; ZHANG et al., 2006a).
1.4. Proteínas: domínios funcionais e complexos protéicos
Acredita-se que todas as funções complexas de um organismo são
finamente reguladas por módulos de controle, que interagem com sub-módulos,
formando uma rede de informação e de propagação de sinal. A célula e os
organismos são capazes de captar sinais do ambiente e transmiti-los para o interior e
a partir desse ponto tomar decisões.
Não podemos esquecer que toda a informação necessária para o
funcionamento de um organismo está no DNA. A analise da expressão gênica é
importante não apenas para identificar genes, mas saber como eles interagem entre
si de forma coordenada, formando uma rede de informações. Os genes produzem
mRNAs que traduzidos geraram suas respectivas proteínas. Deste modo, a análise de
genes, mRNAs e proteínas, numa determinada condição fisiológica pode levar ao
entendimento de mecanismos moleculares de controle da célula.
A análise e a montagem de redes gênicas são mais favoráveis do que
de uma rede protéica, visto que a síntese de proteína no organismo é regulada
genicamente e ainda as proteínas podem sofrer modificações pós transducionais.
31
Mas alterações nos níveis de expressão protéica podem fornecer informações a cerca
da função biológica, além de permitir a montagem e compreensão de redes
funcionais (PHIZICKY et al., 2003).
Deste modo, o ponto central da maioria dos processo biológicos é a
interação proteína-proteína e com o advento dos projetos proteomas abriu-se um
novo caminho onde se pode identificar as proteínas envolvidas em um determinado
processo, em um dado organismo ou modelo (UETZ et al., 2000; ITO et al., 2001;
GAVIN et al., 2002). Pode-se também identificar, quantificar, definir estruturas e
funções não só de proteínas, mas também de complexos protéicos, Neste aspecto,
muitas técnicas vem sendo utilizadas, tais como o duplo híbrido de levedura, a
modelagem molecular e a construção de proteínas de fusão.
1.4.1. Duplo-híbrido de levedura
As descobertas de interações físicas entre proteínas podem fornecer
informações a respeito da função e da participação das mesmas em processos
celulares. Diversos métodos podem ser utilizados para detectar essas interações,
como por exemplo, através de experimentos de imunoprecipitação, uso de proteínas
recombinantes fusionadas a “tags” (Veja mais detalhes no item 1.4.2) ou de ensaios
de duplo hibrido de levedura.
O sistema de duplo híbrido permite a detecção de interações de
proteínas in vivo, através de um ensaio artificial de transcrição. Este se baseia no
fato que ativadores de transcrição têm múltiplos domínios que podem ser separados
32
fisicamente e que interagem entre si: o domínio de ligação ao DNA (DLD, ou BD, do
inglês “binding-domain” ou ainda isca) e o domínio de ativação da transcrição (DA,
ou AD, do inglês “activation domain” ou presa) (CHIEN et al., 1991; FIELDS & SONG,
1989; FIELDS & STERNGLANZ, 1994). Neste tipo de técnica, o gene que codifica a
proteína de interesse é fusionado ao domínio de ligação ao DNA, enquanto que uma
biblioteca de cDNA é fusionada ao gene que codifica o domínio de ativação de
transcrição (Figura 1.6). Na biblioteca de cDNA, estão os fragmentos entre os quais
objetiva-se testar se há codificadores de ligantes à proteína de estudo. Quando
ocorre a interação entre a proteína de interesse e uma proteína codificada pela
biblioteca, o fator de transcrição é reconstituído e ativa o gene repórter, resultando
na visualização da interação.
33
Figura 1.6 – Representação do sistema de duplo híbrido. Lex A representa o domínio de ligação ao DNA fusionado ao FGF-2 HMW, denominado de “isca”. Gal4 é o domínio de ativação fusionado a biblioteca, denominada de “presa”. Em A e B mostra-se que apenas um dos domínios não é capaz de ativar o gene repórter. Em C há a interação entre o FGF-2-HMW e algum componente da biblioteca, reconstituindo o domínio de transcrição e ativando o gene repórter. Quando não há interação entre a presa e a isca não há ativação dos genes repórteres (Figura adaptada de OLIVER, 2000).
Um gene reporter regulado em cis por uma região promotora que
contém sítios de ligação reconhecidos por DLD permite a visualização da interação
entre a proteína de interesse e proteína codificada pela biblioteca. Neste sentido, o
primeiro gene a ser utilizado foi o LacZ, que codifica a enzima β-galactosidase. A
ativação deste repórter pode ser visualizada através da degradação de 5-bromo-4-
cloro-3-indolil-β-D-galactosideo, o X-gal, que em ao ser quebrado pela enzima, faz
com que as colônias adquiram a coloração azul. Além da coloração, os genes
repórter também podem permitir o crescimento de colônias em meio seletivo,
34
empregando-se marcas auxotróficos da S. cerevisiae. A ativação paralela de genes
reporter (como LacZ), neste caso, serve para confirmar a interação.
As grandes vantagens da técnica de duplo hibrido são que o uso de
sistemas genéticos de seleção, permitem realizar ensaios em grande escala; baixo
custo; e além do ensaios serem realizados in vivo, o que propicia que as proteínas
tenham o seu dobramento correto. As principais desvantagens são o grande numero
de falsos positivos e de falsos negativos.
Os falsos positivos ocorrem quando há a interação na levedura da
proteína de interesse com uma codificada por cDNA da biblioteca, mas ela não
ocorre no organismo em estudo ou ainda quando ocorre a ativação do gene repórter,
sem que ocorra a interação dos híbridos, devido a cepas sensíveis que podem
detectar interações transientes ou fracas (VIDALAIN et al., 2004).
Por outro lado, falso-negativos ocorrem porque muitas interações
não conseguem ser reproduzidas devido a variações na construção do sistema duplo-
híbrido, ou ainda essas proteínas para se interagir com a outras necessitam de
modificações pós-transducionais (ITO et al., 2002).
Ensaios de duplo híbrido têm sido realizados em escala genômica, de
modo a montar redes de interações protéicas em levedura. Nesses ensaios pelo
menos mais de 1000 interações já foram descritas e pelo fato de muitos domínios
estruturais serem conservados, analises computacionais permitem inferir interações
protéicas em outros organismos (UETZ et al., 2000; ITO et al., 2001; UETZ et al.,
2006). Numa analise critica sobre a metodologia de duplo hibrido, em ensaios de
grande escala, calcula-se que 50% das interações descritas são falso-positivas (von
MERING et al., 2002).
35
Por ser um ensaio artificial de transcrição, as interações encontradas
no ensaio de duplo híbrido devem ser consideradas como prováveis interações, até
que sejam validadas por outro método. A co-imunoprecipitação dos “parceiros”
através da expressão de proteínas de fusão usando como “tag” HA (hemaglutina) ou
GST (glutationa-S-transferase) é um método de escolha para a validação do ensaio
de duplo híbrido.
1.4.2. Modelagem Molecular
A estrutura tridimensional de uma proteína carrega informações
importantes a respeito da função, domínios catalíticos e regulatórios. Através da
determinação de estruturas tridimensionais, pode-se determinar funções, identificar
domínios protéicos, sítios catalíticos ou sítios de ligação e inferir a respeito das
interações protéicas e deste modo desenhar inibidores, ativadores, além de ser uma
importante ferramenta para o desenvolvimento de fármacos mais eficientes (Rational
Drug Design, ou Desenho Racional de Fármacos). Os métodos experimentais mais
utilizados para determinação estrutural são a difração de raios X e o RMN
(Ressonância Magnética Nuclear), que apresentam diversas dificuldades técnicas e
demandam muito tempo para se alcançar o objetivo. Apesar de todo o genoma
humano ter sido seqüenciado e estar depositado em banco de dados públicos,
apenas uma ínfima parte das estruturas protéicas estão resolvidas e depositadas no
“Protein Data Bank” (PDB). Este crescimento desbalanceado entre depósito de
seqüências gênicas e resolução de estruturas protéicas, gera uma limitação no
36
desenho de interações proteínas-proteínas ao nível molecular. Uma saída são os
modelos teóricos obtidos por modelagem por homologia que permitem inferir a
respeito de quais domínios estruturais estão participando da interação proteína-
proteína em estudo.
A homologia entre seqüências de aminoácidos, implica em uma
semelhança estrutural e funcional com o ancestral comum e é crucial para que a
função ancestral seja preservada. A partir de uma seqüência primária de
aminoácidos, pode-se tanto prever, como obter a estrutura protéica tridimensional
semelhante a real, suficiente para que hipóteses sejam formuladas e/ou testadas. A
esta técnica damos o nome de modelagem por homologia (BAJORATH et al., 1993;
RING & COHEN, 1993).
Basicamente, existem quatro etapas envolvidas no processo de
modelagem por homologia: a identificação e seleção do molde; alinhamento das
seqüências das proteínas alvo e molde; construção do modelo teórico; e validação do
modelo obtido.
A técnica de modelagem por homologia também foi empregada em
estudos estruturais dos FGFs. Antes da estrutura tridimensional do complexo
FGF:FGFR ser resolvida experimentalmente (PLOTNIKOV et al., 1999; STAUBER et al.,
2000), um trabalho de modelagem dos domínios extracelulares do FGFR1 foi
realizado, usando como molde a teloquina (código PDB: 1tlk) para o domínio IgG II e
para o domínio IgG III, o domínio variável da imunoglobulina Bence-jones (código
PDB: 1REI) (OYAMA et al., 1997). O prosseguimento deste trabalho levou ao
desenho de peptídeos sintéticos que inibiam a ação do FGF-1 no seu receptor, apesar
de não haver similaridade de seqüência com o FGF-1 (OYAMA et al., 1999).
37
1.4.3. Proteínas de fusão
Através do papel enzimático, estrutural e ou regulatório, a maioria
das proteínas participam de complicadas vias celulares, interagindo com outras
proteínas em pares ou como componentes de um grande complexo protéico que
pode ser estável ou transiente. Algumas proteínas interagem especificamente com
moléculas não protéicas, tais como DNA, RNA ou metabólitos e essas interações são
fundamentais para que determinadas funções biológicas aconteçam. O conhecimento
da composição de um complexo protéico, não é o suficiente para entender a função
de uma proteína, porém é necessário para entender as interações entre as proteínas,
o funcionamento de uma via, funções e interligações. Por outro lado, existe uma
linha tênue que separa essas interações protéicas realmente verdadeiras de uma
provável contaminação da amostra. (KUMAR & SNYDER, 2002; DZIEMBOWSKI &
SÉRAPHIN, 2004; GINGRAS et al., 2005).
Em resposta ao rápido crescimento da proteômica, e como
conseqüência do desenvolvimento de novas técnicas de espectroscopia de massa
(MS, do inglês “mass spectrometry”), aumentou-se o uso de proteínas recombinantes
hibridas, fusionadas com polipeptídeos que funcionam como uma etiqueta (do inglês
“tag”), o que facilita em muito a purificação em um passo (one-step purification)
passando lisados celulares por uma coluna ou resina, eluindo-os sobre condições
especificas (tampões) e ou clivagem enzimática e providenciando a identificação
desses complexos por MS (TERPE, 2003; EINHAUER & JUNGBAUER, 2001).
38
Os “tags” utilizados nesses sistemas de purificação têm uma grande
variabilidade de tamanho, podendo ser poucos aminoácidos (Poly-Arg, His-6x, FLAG,
c-myc) a subunidades (Proteína A e G, Glutationa-S-transferase, “Maltose-binding
protein”) que são ligadas ao N- ou C-terminal da proteína de interesse. (EINHAUER &
JUNGBAUER, 2001). Todos esses “tags”, independente do tamanho, compartilham
das seguintes características: purificação rápida através de um passo (do inglês
“one-step purification”); mínimos efeitos sobre a estrutura terciária e atividade
biológica da proteina de interesse; remoção especifica e fácil da proteina nativa
(quando inserido um sitio de clivagem de uma protease); aplicabilidade para um
número infinito de proteínas (TERPE, 2003).
Recentemente um método genérico foi desenvolvido para purificar
proteínas expressas fisiologicamente, ou seja, em condições normais ou nativas,
denominado de TAP (do inglês, “Tandem Affinity Purification”, ou purificação
seqüencial por afinidade). Este método é baseado no uso de dois “tags”: o primeiro,
um domínio de ligação da proteína A que é purificado em uma coluna de afinidade
de IgG e o outro “tag” utilizado é o calmodulina. Entre os dois “tags” é colocado um
sítio de reconhecimento da TEV protease (TEV: “Tobacco etch vírus”) e a proteína de
estudo é colocada a montante do sitio de calmodulina. O procedimento é realizado
da seguinte forma: o extrato protéico é colocado em incubação com a resina de IgG,
depois é eluído através da clivagem com a protease TEV. O eluato é usado em um
nova purificação usando a resina de Ca+2-calmodulina. A eluição da resina é feita
com EGTA. De um modo geral, este processo de purificação foi otimizado para um
alto rendimento e para manter a integridade do complexo, utilizando-se condições
semelhantes às condições intracelulares. Em seguida, os eluatos são submetidos a
39
um SDS-PAGE, tem bandas excissadas, tratadas com tripsina e submetidas à análise
dos fragmentos em MALDI-TOF (“matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-
flight mass spectrometry”) (RIGAUT et al., 1999; GAVIN et al., 2002).
Para acharmos parceiros intracelulares das isoformas de FGF-2,
utilizamos a técnica de purificação por afinidade de complexos protéicos, usando
como “tag” o domínio de ligação da proteína A de Staphulococcal aureus (UHLÉN et
al. 1983; NILSSON et al. 1985), que é purificado através de resina de IgG Sepharose.
Um melhor detalhamento da técnica está na Figura 1.7.
40
Figura 1.7 – Esquema da técnica de purificação por afinidade de complexos. Descrição técnica de purificação por afinidade de complexos protéicos associada com espectroscopia de massa que serão realizados com as proteínas de fusão FGF-2 e HMW fusionados a proteína A. A: Os plasmídeos com as proteínas de fusão foram transfectados em células adrenocorticais tumorais (Y1) utilizando o reagente Lipofectina (Invitrogen). A expressão desta proteina de fusão foi verificada através de Western-blot. Os clones escolhidos serão lisados e os extratos submetidos a uma coluna de afinidade e eluídos para depois serem submetidos a um gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE). Após um certo numero de géis onde poderemos verificar a reprodutibilidade da técnica sobre diversas condições experimentais, passaremos a identificação desses complexos, utilizando a técnica de espectroscopia de massa (MALDI-TOF). B: Utilizaremos como “isca” (bait) a proteína A. que está fusionada como o FGF-2 e sua isoforma de alto peso molecular. Após a formação do complexo FGF-2:proteina A com as proteínas existentes no meio intracelular, esperamos isolar os complexos através de cromatografia por afinidade. C: Desenho esquemático do protocolo experimental mostrando as etapas envolvidas, desde a preparação dos extratos nucleares, passando pelo SDS-PAGE, excissão das bandas, digestão com tripsina e aplicação das amostras em MALDI-TOF.
41
1.5. Ciclo celular: proliferação, senescência e morte. O papel do FGF-2 e de
ROS
Qualquer organismo para o seu desenvolvimento precisa ter um
equilíbrio entre proliferação e morte. O ciclo celular (Figura 1.8), é um fenômeno
complexo, finamente regulado e composto de 4 fases: i) fase S (síntese de DNA),
objetiva a geração de uma única e exata copia do seu material genético; ii) fase M
(mitose), onde ocorre a repartição de todos os componentes celulares entre as duas
células filhas idênticas; e iii) as fases G1 e G2 (do inglês “gap”, fenda) que
proporcionam a célula, tempo adicional para o seu crescimento e para checagem
condições ambientais e de replicação (NORBURY & NURSE, 1992).
Figura 1.8 – Fases do ciclo celular. As células crescem continuamente na interfase, que é composta de 3 fases: S, G1 e G2. Na mitose, o núcleo e depois o citoplasma se dividem originando duas células filhas idênticas a célula mãe.
42
O ciclo celular é controlado por quinases dependentes de ciclinas
(CDKs, do inglês “Cyclin Dependent Kinases”). As CDKs ao se ligarem a proteina
ciclina, são ativadas e ativam fatores de transcrição permitindo o avanço do ciclo
celular. A transição G1→S é iniciada pelo complexo CDK4/ciclina D, que fosforila pRb,
liberando o fator de transcrição E2F, que irá ativar a transcrição de genes necessários
para a replicação do DNA. Se algum dano ocorreu ao DNA, entra em ação p53
(proteína supressora de tumor) que retardando a entrada em S, acionando assim um
sistema de reparo ou levando a célula a apoptose.
O controle apropriado do ciclo celular é crucial para a sobrevivência
da célula. A inativação inapropriada do ciclo está envolvida com doenças
neurodegenerativas, e falhas no ciclo permitem com que células tumorais
sobrevivam, podendo originar um câncer. Apoptose e senescência são “programas”
celulares que funcionam como um mecanismo de defesa, contra uma excessiva
sinalização mitogênica a que as células possam estar expostas (SCHMITT, 2003).
A apoptose é caracterizada por uma série de alterações bioquímica e
morfológicas, tais como: proteólise específica em cascata, extensiva perda de volume
celular, condensação de cromatina, fragmentação do DNA através da ativação de
endonucleases dependentes de Ca+2 , e a formação de corpos apoptóticos que serão
fagocitados por macrófagos, levando a um aumento da resposta inflamatória. A
maquinaria que aciona todos os fenômenos apoptóticos, depende uma família de
proteases que apresentam uma cisteína no sitio ativo e cliva suas proteínas-alvo em
ácido aspártico. Essas proteases são denominadas caspases (do inglês, “Cystein-
dependent ASPartate-specific proteASES”). Elas são sintetizadas na célula na sua
forma inativa (procaspases) e ao serem ativadas, clivam-se e ativam outras
43
procaspases, de modo a formar uma cascata de amplificação proteolítica, que
desencadeiam todos os processo apoptóticos, através da clivagem de proteínas
chaves na célula, levando a uma morte controlada (COHEN, 1997; NICHOLSON &
TORNBERRY, 1997). É importante ressaltar que uma vez disparado este sinal, a
célula não tem condições de reverte-lo.
O outro fenômeno, senescência foi descoberto através de estudos
em cultura de células humanas primarias, observou-se que as mesmas cessavam a
sua proliferação, in vitro, após um numero finito de replicações (HALFLICK, 1965). O
evento mais relacionado a senescência é a diminuição do tamanho do telômero,
indicando não somente o número de divisões que uma célula sofreu, como também,
a quantidade acumulada de danos. O mecanismo de bloqueio da proliferação é
simples, e acaba bloqueando a transmissão de mutações acumulada de uma célula
mãe para uma célula filha (COLAVITTI & FINKEL, 2005). Por muito tempo, acreditou-
se que senescência era apenas um artefato de cultura de células e ainda hoje não há
um mecanismo de disparo e execução bem estabelecidos. Como medidas de
senescência são adotadas: alterações de morfologia celular e o aumento na atividade
de β-galactosidase endógena (DIMRI et al., 1995; COLAVITTI & FINKEL, 2005).
A senescência pode ser disparada por ROS (do inglês, “Reactive
Oxygen Species”), mas especificamente por peróxido (H2O2) ou por uma
superexpressão da onco-proteína Ras. Tanto ROS, como Ras induzem a uma
permanência da célula na fase G1 do ciclo celular, além de aumentar a expressão de
p53 e p16(ink4) (COLAVITTI & FINKEL, 2005). O “stress” celular, que pode ser
causado por dano ao DNA, hipóxia, privação de fatores de crescimento, ação
mitogênica dos oncogenes e encurtamento do telômero, induzem p53. A
44
superexpressão de p53 pode tanto induzir apoptose, como levar a uma permanência
na fase G1 do ciclo celular, que nada mais é do que senescência (MACIP et al., 2003).
Fibroblastos humanos que entraram em senescência por hiperóxia ou por peróxido
(CHEN, 1998), ao perderem a funcionalidade de p53, através de mutações sitio-
dirigida, esses fibroblastos crescerem normalmente (CHEN, 1994).
As espécies reativas de oxigênio podem ser utilizadas como um
indicador do “estresse oxidativo”. ROS inclui espécies que podem ser moleculares
(peróxido de hidrogênio, H2O2), íons (íon hipoclorito, OCl-), ou radicais com elétrons
desemparelhados (hidroxil, OH• e superóxido, O2-•). A presença do oxigênio na célula
é fundamental para a sua sobrevivência, mas a formação intermediária de ROS traz
altos riscos de danos à estrutura e aos processos celulares. A formação de ROS pode
ocorrer por diferentes mecanismos, tais como a interação de radiação ionizante com
moléculas biológicas, como subproduto da cadeia respiratória de elétrons e
sintetizado por sistemas multienzimáticos (NADPH oxidase), presentes principalmente
em fagocíticos. Representantes da família de NOXs, que incluem o sistema NADPH
oxidase, também estão presentes em fibroblastos (MEIER et al., 1991) e células
tumorais. (SZATROWSKI & NATHAN, 1991).
Através de dano ao DNA, indiretamente, ROS pode disparar
apoptose. Sinalização pró-apoptótica causada por ROS ocorre, através da
estimulação de SAPK, JNK e p38 (IRANI, 2000). Contraditoriamente, ROS pode
desencadear sinais anti-apoptóticos, como a ativação de NFκB ou da via de
Akt/ASK1. Do mesmo modo, ânions superóxido é inibidor natural de Fas, que por sua
vez é indutor de apoptose, através dos receptores de morte celular (“death
receptor”) (CLEMENT & STAMENKOVIC, 1996; BEDARD & KRAUSE, 2007).
45
A decisão entre esses fenômenos celulares distintos e contraditórios,
não é bem entendida (MACIP et al., 2003), afinal a célula pode direcionar-se para
apoptose, crescimento ou senescência. Acredita-se que alguns fatores podem
interferir nesta decisão, entre eles: magnitude e duração do sinal de ROS; localização
subcelular da isoforma de NOXs; conjunto de alvos submetidos a reações de redox
dentro da sinalização envolvida e o metabolismo de superóxido (antiapoptótico)
“versus” peróxido de hidrogênio (pró-apoptótico) (CLÉMENT & PERVAIZ, 2002;
BEDARD & KRAUSE, 2007).
Fatores de crescimento podem estimular a produção de ROS
intracelularmente em células não fagocitárias (SUNDARESAN et al., 1995;
THANNICKAL et al., 2000).
O FGF-2 que inicialmente foi identificado como um potente mitogeno
para células, através da ativação da p44/p42 MAPK também está superexpresso em
tumores (BIKFALVI et al., 1997). Apesar de não haver relação entre mutação e
câncer a expressão do FGF-2 está relacionada com o grau de malignidade do tumor
e seu prognostico de tratamento (TAKAHASHI et al., 1992; BASHKIN et al., 1989). A
expressão do FGF-2 ainda pode ser aumentada em resposta a fatores inflamatórios,
como o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) e o interferon-gama (INF-γ)
(SAMANIEGO et al., 1998).
Apesar de sempre está relacionado a crescimento e proliferação,
alguns trabalhos demonstram que FGF-2 é capaz de induzir uma parada no
crescimento celular e até mesmo a morte. A indução da morte celular pelo FGF-2
está associada a uma parada no ciclo celular em G1 e pela ativação das caspases
46
iniciadoras (caspases 2, 8 e 10) e efetoras (caspases 3, 6 e 7), independentemente
da ativação de p53 (BURCHILL & WESTWOOD, 2002).
A proteína Ras é um ponto de convergência de diversas vias de
sinalização, sendo necessária a sua presença durante a transição G0-G1. Ras está
ativo em 10-25% dos cânceres humanos (BOS, 1989). Fatores de crescimento,
citocinas, hormônios e neurotransmissores estimulam os seus receptores, que
através de uma GEF (do inglês, “Guanine Nucleotide Exchange Factor” ou fator
trocador de nucleotídeo de guanina) promovem a troca de Ras•GDP por Ras•GTP
levando a ativação de Ras (CAMPBELL et al., 1998 e YAMAMOTO et al., 1999).
1.6. A Linhagem Celular Y1
A linhagem de células Y1 (YASUMURA et al, 1966) são derivadas de
um tumor funcional da córtex adrenal de camundongo, possuem o proto-oncogene
c-Ki-ras amplificado (SCHWAB et al., 1983) e cuja superexpressão parece necessária
para manter o estado celular maligno (KIMURA & ARMELIN, 1988). Células Y1 são
responsivas ao hormônio ACTH: ao serem estimuladas sofrem um processo de
arredondamento celular, em função de alterações do seu citoesqueleto, além de
iniciar um processo de esteroidogênese (Figura 1.9).
Além de ser capaz de produzir FGF-2 (Figura 1.9), as células Y1 ao
serem tratadas com este fator de crescimento, iniciam uma resposta mitogênica
incluindo uma rápida ativação de ERK 1/2, ativação dos genes de resposta primária e
47
da síntese de proteína de c-fos, c-jun e c-myc (KIMURA et al., 1993a; KIMURA et al.,
1993b, LOTFI et al., 1997).
As vantagens experimentais da linhagem Y1 incluem: funcionalidade
(estimuladas por ACTH produzem esteróides), capacidade de serem clonaveis e
transfectaveis, resistência ao carenciamento de soro e estabilidade cariotipica. Deste
modo usamos esta linhagem no nosso laboratório, não só para o estudo da ação
hormonal de ACTH em adrenais, como para estudos de controle do ciclo celular em
geral.
Figura 1.9 – A linhagem adrenocortical Y1. Em A, temos fotografias mostrando a linhagem adrenocortical Y1 crescendo em meio DMEM com 10% FCS e crescendo em ACTH (1nM). É visível o efeito de alteração do citoesqueleto característico desta célula ao tratamento com ACTH (arredondamento celular). Em B, Células Y1 ao serem tratadas com FGF-2 induzem a estimulação de ERK 1/2 (LOTFI ECT al., 1997). Em C, Crescendo em meio DMEM com 10% FCS, células Y1 são capazes de produzirem FGF-2 na isoforma de 18 kDa e mais duas isoformas de alto peso (22 e 24 kDa) (REBUSTINI ECT al., dados não publicados).
48
2. OBJETIVOS
49
2.1. Objetivo geral
O campo de estudos a respeito da família dos FGFs, iniciado em
meados da década de 70s, expandiu-se explosivamente nos últimos 20 anos,
contando atualmente com bem mais de 30 mil artigos na literatura especializada (ISI
e/ou PubMed), 50% dos quais envolvendo FGF-2, o fundador da família. Apesar
disso, as funções do FGF-2 e das suas isoformas permanecem ainda obscuras,
embora o FGF2 seja tradicionalmente classificado como um fator mitogênico e,
provavelmente, oncogênico. Dadas estas premissas, a meta de longo prazo
inicialmente proposta para esta tese era elucidar estrutura e função das isoformas de
FGF2. Mas, para focalizar o projeto em objetivos específicos miramos algumas
questões bem definidas: i) a cadeia N-terminal da isoforma de alto peso molecular
altera a estrutura protéica básica do FGF-2? ii) Quais são os parceiros moleculares
que interagem fisicamente com isoformas do FGF-2 nos complexos protéicos
intracelulares? iii) FGF-2 é fator oncogênico ou pode ser fator anti-tumoral ou,
mesmo, ambos?
2.2. Objetivos específicos desta tese
1) Fazer a modelagem molecular e verificação da estrutura da
isoforma de 22,5 kDa do FGF-2 (FGF-2 HMW);
50
2) Buscar parceiros moleculares das duas principais isoformas de
FGF-2, a extracelular de 18 kDa e a intracelular de 22,5 kDa (FGF-2 HMW) através
da metodologia de duplo-híbrido em levedura e da expressão ectópica, na linhagem
Y1 de células adrenais tumorais de camundongo, de proteínas de fusão envolvendo
as isoformas de FGF2 fusionadas ao domínio de ligação da proteína A como “tag”;
3)Verificar, primeiro, se FGF2 induz a produção de ROS nas células
adrenais Y1 e, segundo, se ROS podem ser segundos mensageiros de FGF2 no
disparo de senescência em células Y1.
51
3. MATERIAIS E METODOS
52
3. MATERIAIS
3.1. Linhagens celulares
A linhagem celular Y1 (YASUMURA ECT al., 1966) é derivada de um
tumor funcional da adrenocórtex de camundongo, foi obtida da ATCC (American Type
Culture Collection - Rockville, MD). Ela possui o proto-oncogene c-Ki-ras amplificado,
tendo como conseqüência direta a elevada expressão da forma ativa da proteína Ki-
Ras (Ki-Ras-GTP) (SCHWAB et al., 1983; KIMURA & ARMELIN, 1988).
A linhagem Balb 3T3 é proveniente de células mesenquimais
pluripotentes de embrião de camundongos isogênicos Balb/c (AARONSON &
TODARO, 1968).
3.2. Linhagem de levedura
A cepa de levedura L40 [MATa, his3D200, trp1-901, leu2-3112, ade2,
LYS2::(lexA-HIS3) (URA3::lexA-lacZ) GAL4] foi cultivada em meio YNB com 2%
glicose e suplementado por adenosina, leucina e histidina.
53
3.3. Plasmídeos
Os plasmídeos utilizados para o desenvolvimento do projeto estão
na tabela abaixo.
Tabela 3.1 – Plasmídeos utilizados neste trabalho Plasmídeo Origem e função pNLexA fornecido por Erica Golemis do Fox Chase Câncer Center pJEB-1 construído por Catarina Akiko Miyamoto (IQ USP); pcDNA3.1(+):higro obtido comercialmente (Invitrogen)
pACT2 obtido comercialmnte (Clontech). Usado como presa para a biblioteca
de cDNA pBTM116:kan construído no laboratório do Prof. Nilson Zanchin (LNLS) onde foi feita a
troca de marca de seleção (de ampicilina para kanamicina) do plasmídeo comercial pBTM116
pTL-2 fusão do domínio de expressão (ADHp:LexA:ADHt) do pNLexA, com o “backbone” do pBTM116:kan com a finalidade de trocar marca de seleção ampicilina para kanamicina.
pGEX-4T1 codifica o domínio de ligação dos fragmentos de cDNAs obtidos nos ensaios de duplo hibrido, fusionados a GST (Glutationa S Transferase). Obtido comercialmente (GE Healthcare)
3.4. Fator de crescimento de fibroblasto
O FGF-2 recombinante foi produzido e gentilmente doado pelo Dr. A.
G. Gambarini (Instituto de Química, USP). Esses foram aliquotados em PBSA, na
concentração de 135μM e diluídos 1:1000 em DMEM no momento anterior ao uso.
54
3.5. Inibidores de Fosfatase ou Protease
Ortovanadato de sódio (1 mM), aprotinina (2 μg/mL, solução estoque
de 1mg/mL feita em 0,01 M HEPES pH 7,0), pepstatina (2 μg/mL, solução estoque de
1 mg/mL em etanol absoluto); NaF (1 mM) PMSF (2 μg/mL, solução estoque de 1
mg/mL em isopropanol) e DTT (1 mM); foram obtidos da Sigma Chemicals Co. (St.
Loius, EUA).
3.6. Kits
Quick Ligation (New England Biolabs, Beverly, EUA) - reações de
ligação;
Lipofectin (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) - transfecção em células
de mamíferos;
Kit ECL Western blotting Enhanced Chemiluminescence (GE
Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) - Western blot;
DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing kit (Amersham
Pharmacia, Buckinghamshire, Reino Unido) – sequenciamento;
QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN, Hilden, Alemanha) – mini-prep de
plasmídeos.
55
3.7. Drogas e Antibióticos
Ampicilina (Sigma Chemical Co., St. Louis, EUA) - solução estoque
100 mg/mL em água, foi utilizada para a seleção de bactérias transformadas;
Geneticina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) - solução estoque 100
mg/ml em água, foi utilizada para a seleção de clones de células de mamíferos;
Higromicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) - solução estoque 50
mg/ml em PBS A, foi utilizada para a seleção de clones de células de mamíferos.
3.8. Soro e meio de cultura
Para linhagens celulares foi utilizado o meio DMEM - Dullbeco's
Modified Eagle Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com FCS -
Fetal Calf Serum (Cultilab).
Para bactérias foram utilizados os seguintes meios de cultura:
LB - Luria Bertani Medium - (Triptona 10 g/L, extrato de levedura 5
g/L, NaCl 10 g/L, pH 7,5);
2YT – Triptona 16g/L, extrato de levedura 10g /L, NaCl 5g/L, pH 7,0;
YPD – Extrato de levedura 10 g/L, Peptona 20 g/L, Glicose 20 g/L.
56
3.9. Isótopo radioativo
3H-timidina (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido).
3.10. Enzimas
Enzimas de restrição: Eco RI, HindIII, XhoI, NotI, Bam HI, PstI (New
England Biolabs - Beverly, EUA).
Taq DNA polimerase recombinante, DNAse I Amplification Grade,
RNAse H e Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA).
3.11. Anticorpos
Policlonais de coelho: anti-c-Fos (Santa Cruz Biotecnologies - Santa
Cruz, CA, EUA);
Monoclonais de camundongo: anti-H-Ras da Santa Cruz
Biotecnologies (Santa Cruz, CA, EUA);
Anticorpo anti-Erk1-2 e anti-phospho-Erk1-2 (Thr202 e Tyr204) da
New England Biolabs (Beverly, MA, EUA);
Anticorpo horseradish peroxidase labeled anti-rabbit e anti-mouse
(HRP) (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido).
3.12. Oligonucleotídeos:
Nome do oligo Seqüência (5´ → 3´) Objetivo FGF_REVERSE TCCCTCGAGGGCTCTTAGCAGACATTGGAAGAAA Inserir sitio de Xho I e retirar o códon de terminação (TGA).
Comum a todas as construções com FGF-2. FGF_FOWARD ATGAATTCACCATGGCTGCTGGTTCTATCACTACT
Inserção do FGF-2 no pNLex A Inserir um sítio de Eco RI no oligo Fonte: pJEB-1 (inserção do FGF-2 bovino modificado no vetor pET-3d)
FGF_HMW ATGAATTCATGGGGGACCGCGGGCGCGGCCGC Inserir um sitio de Eco RI e mudar o códon iniciador de CTG para ATG. Desenho do N-terminal de alto peso (FGF HMW)
PROTEÍNA A FOWARD CCCTCGAGGGATGGCAGGCCTTTGCGCAACA Inserção de um sitio de Xho I e do códon de inicialização ATG. C-terminal do FGF-2 fusionado com proteína A
PROTEÍNA A REVERSE GCTCTAGATCACGCGTCTACTTTCGGCGC Inserir códon de terminação na proteína A e um sitio de Xba I GAPDH Foward GCACCAACCAACTGCTTAGC GAPDH Reverse TTCTTCCACCACTTCGTCC
Região do intron delimitada: 192 pb. Fragmento d c-DNA, delimitado pelos oligos: 339 pb (humano) e 325 pb (camundongo)
Nome do oligo Seqüência (5´ → 3´) Objetivo 03 UBE 2i FW GGAATTCCAACATGTCGGGGATCGCCCT 03 UBE 2i RV CCCTCGAGGGTCATGAGGGCGCAAACTT 05 BRD and PHD FW GGAATTCCACCTCAGTTCTGTTCTCCAAA 05 BRD and PHD RV CCCTCGAGGGTCAGTCATTACGATATACC 06 BRD 2 FW GGAATTCCGAGATACCTACCACTGTCCTC 06 BRD 2 RV CCCTCGAGGGTCATGCAAGGCCAAGTGCA 07 RNA cofactor 4 FW GGAATTCCCCGAGCGAAGCGATGCCT 07 RNA cofactor 4 RV CCCTCGAGGGTCACAGTTTTGTTACTGCA
Oligosnucleotídeos específicos para as seqüências encontradas nos ensaios de duplo hibrido de levedura (UBE2I, BRD2, RING3 e PC4). Elas foram amplificadas e clonadas no vetor pGEX4T1, utilizando as seguintes enzimas de restrição: EcoRI/ XbaI
3.13. Soluções
MOPS (5X) – 200mM MOPS, 50mM NaAc, 5mM EDTA, pH7,0;
Tampão de amostra para RNA – 10% formaldeído, 50% formamida,
10% glicerol, 2mM EDTA, 0,025% azul de bromofenol, 0,025% xileno cianol, 1X
MOPS;
TBE (5X) – 450mM Tris-borato, 10mM EDTA, pH 8,0;
Tampão de amostra para DNA (5X) - 50% glicerol, 1mM EDTA,
0,125% azul de bromofenol, 0,125% xileno cianol;
Reagente de Bradford - Bio-Rad Protein Assay, Dye Reagent
Concentrate;
Tampão de corrida para SDS-PAGE - 25 mM Tris-base, 250 mM
glicina, 0,1% SDS, pH 8,3;
Tampão de amostra (2X): Tris-HCl 100mM, ditiotreitol 200mM, SDS
4%, azul de bromofenol 0,2%, glicerol 20%;
Tampão de transferência para SDS-PAGE: 25 mM Tris-base, 0,2 M
glicina, 20% metanol (pH8,5);
IPTG – solução estoque 1M;
Tampão de lise MAPK - 62,5 mM Tris-HCl (pH6,8), 2% SDS, 10%
glicerol, 50 mM DTT, 0,1% azul de bromofenol;
Líquido de cintilação (4g PPO + 0,1g POPOP + 1L Tolueno);
Transfo Buffer (Para 10 mL solução: 1 mL de KCM 10x e 1,5 mL de
solução de 10% PEG – polietileno glicol);
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KCM 10x (1 M de cloreto de potássio; 0,3 M de cloreto de cálcio e
0,5 M de cloreto de magnésio);
Tampão de lise para extração de DNA de levedura: 2% Triton X-100;
1% SDS; 100 mM de NaCl e 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0);
Tampão Z: 60 mM de Na2HPO4; 10 mM de. KCl, 1 mM MgSO4;
0,025% SDS; 50 mM de β-mercaptoetanol;
X-Gal: dissolvido em N,N-dimetilformamida na concentração final de
20 mg/mL.
3.14. Reagentes
Iodeto de propídio e anexina V (Molecular Probes, Carlsbad, CA,
EUA), ácido trifluoroacético (TCA), Albumina sérica bovina (BSA) (todos Sigma, St.
Loius, EUA); Metanol, Etanol, HCl (ácido clorídrico) e Formaldeído em solução
(Merck, Rio de Janeiro, Brasil); SDS (“sodium dodecyl sulfate”, dodecil sulfato de
sódio) e IPTG (“isopropil-tio-β-galactosídeo”) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA).
3.15. Equipamentos
Espectrofotômetro de Cintilação Líquida Computadorizado (Packard);
aparelho FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Juan, CA, EUA) com
laser de íon Argônio (488 nm), estufas de CO2 para cultura de células (Forma
Scientific, Waltham, MA, EUA), espectrofotômetro ultropec 3100 (GE Healthcare,
60
Buckinghamshire, Reino Unido), balança analítica modelo 200DS (Denver
Instruments, Göttingen, Alemanha), termociclador modelo epgradientS (Eppendorf,
Hamburg, Alemanha), Sistemas de eletroforese Biômetra modelos V16 e
Horizon11/14 (Biometra, Goettingen, Alemanha), centrifuga de mesa modelo 5410c
(Eppendorf, Hamburg, Alemanha).
61
3.2. MÉTODOS
3.2.1. Cultura de células
Todos os estoques das linhagens celulares foram mantidos
congelados em nitrogênio líquido. Após o descongelamento, as células foram
mantidas em cultura em garrafas ou placas de poliestireno em meio completo: DMEM
complementado com soro fetal bovino em 10%. As culturas foram mantidas em
estufa à 37 ºC e 5 % CO2.
A troca do meio foi feita a cada três dias e no caso de subcultivo, o
meio foi aspirado, as células foram lavadas com PBSA (NaCl 140mM, KCl 2,7mM,
Na2HPO4 anidro 8mM e KH2PO4 1,5mM – solução com pH 7,2) e tripsinizadas
(solução 0,1% em PBSA e 1 mM de EDTA). Quando as células se soltam, foram
ressuspensas em DMEM com soro e distribuída em várias placas ou garrafas.
3.2.2. Carenciamento celular
Para o carenciamento, lavou-se as células duas vezes com PBS e
uma vez com meio de cultura DMEM sem adição de FCS, objetivando eliminar
qualquer traço de soro. Em seguida, adicionou-se DMEM sem soro fetal bovino. A
adição de hormônios ou fatores de crescimento foi realizada após 48 horas de
carenciamento.
62
3.2.3. Transfecção de células
Para a transfecção, as células foram plaqueadas em uma densidade
de 104 células/mL (aproximadamente 50% de confluência). A transfecção de DNA foi
efetuada com Lipofectina conforme recomendações do fornecedor (Invitrogen,
Carlsbad, CA, EUA). As células transfectadas foram subcultivadas em três placas
contendo meio DME com 10% FCS, higromicina (200 µg/mL). Colônias resistentes
foram isoladas usando higromicina como agente de seleção e propagadas em meio
de manutenção (DMEM, 10% FCS e 50 µg/mL de higromicina). Para verificar a
expressão da proteína de fusão, foram realizados ensaios de “Western-blot” e
também por RT-PCR.
A seleção se deu através de suplementação do meio de cultura com
higromicina. Para definir qual a melhor concentração de higromicina que deveria ser
adicionada ao meio, foi realizada uma curva de dose, de onde concluímos que em
todas as densidades, exceto a mais alta (100 x 104 células no dia 0) a concentração
de 200 µg/mL de higromicina foi suficiente para “matar” as células Y1 que não
portavam nenhum plasmídeo de resistência a higromicina (Figura 3.1).
63
Figura 3.1 – Curva de dose para higromicina A curva de dose para higromicina foi realizada da seguinte maneira: a partir de um plaqueamento inicial (que variou de 10 a 100 x 104 células em uma placa “multiwell” de 6 poços; área = 9,5 cm2) todas as células foram submetidas a seleção com higromicina (o antibiótico foi diluído em meio de cultura – DMEM com 10% FCS – tendo concentrações finais que variaram de 0 a 250 µg/mL) por 14 dias. A adição de antibiótico foi feita 24 horas após o plaqueamento. Após os 14 dias de seleção, as células foram fixadas com formaldeído (3,7%) e coradas com cristal violeta.
3.2.4. Extração de RNA
RNA total foi isolado a partir de células em cultura (placas de 100
mm de diâmetro, Corning Inc., Corning, NY, EUA) usando o reagente Trizol®
(Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Após a extração a qualidade do RNA foi avaliada
através de gel desnaturante (1% agarose e 7% de formaldeído em MOPS) e
quantificada espectrofotometricamente (260 e 280 nm).
64
3.2.5. Reações de RT-PCR
As amostras de RNA foram tratadas com DNAse I (1 uL). Em seguida
realizou-se a reação de transcrição reversa (RT) com a enzima SuperScript II®
(Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) usando-se oligo dT. Em algumas reações houve
adição de DMSO (5%) no meio reacional com o intuito de desestabilizar estruturas
secundárias que existiam no mRNA da proteína de interesse (FGF-2). Após o termino
da RT as amostras foram tratadas com RNAse H e em seguidas usadas na reação de
PCR (reação de polimerase em cadeia).
De cada produto da RT foi retirado um volume de 2 uL, adicionado
dNTPs, MgCl2 (concentrações variando de 1,5 a 2 mM), oligos específicos, tampão da
enzima e enzima Taq DNA Polimerase (0,5 U) para a reação de PCR. As amplificações
ocorreram em 30-35 ciclos, com as seguintes condições: desnaturação a 94ºC por
1,5 minutos; anelamento a 55-72ºC por 1,5 minutos; e polimeração a 72ºC por 2
minutos.
3.2.6. Extração dos produtos do PCR
Os cDNAs amplificados foram separados por eletroforese em gel de
agarose (1,2 %), excissados e purificados através dos kits GFX (Amersham
Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido) ou QIAprep (Qiagen, Hilden, Alemanha)
65
3.2.7. PCR em Tempo Real (PCR quantitativo ou Real-time PCR)
Para o ensaio de qPCR as células foram plaqueadas e mantidas em
crescimento exponencial por 48 h, quando foram então lisadas com o reagente Trizol
(Invitrogen) para a extração de RNA, seguindo-se as orientações do fabricante. O
RNA é tratado com DNAse (Inivtrogen, Carlsbad, CA, EUA) por 10 min e em seguida
submetido a reação de transcriptase reversa com a enzima SuperScript III
(Invitrogen).
Após a obtenção do cDNA, as amostras serão submetidas ao ensaio
de PCR em tempo real (qPCR), onde a reação será realizada na presença do
reagente SYBR Green (ABI – Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) conforme
indicações do fabricante. Foi utilizado como controle e para normatização, o primer
de HPRT1, um “housekeeping gene”.
3.2.8. Extração de proteína
As células foram plaqueadas em placas de 100 mm de diâmetro e ao
atingirem confluência de aproximadamente 80%, procedeu-se a extração do
conteúdo protéico. As células eram lavadas duas vezes com PBS (KCl 2,7mM, NaCl
137mM, Na2HPO4 anidro 8mM, KH2PO4 1,5mM, CaCl2.2H2O 0,68mM e MgCl.6HO
0,49mM – solução com pH 7,2) gelado e lisadas com tampão RIPA (50mM Tris-HCl
pH 8,0, 150mM NaCl, 0,5% deoxicolato de sódio, 1% NP-40, 0,1% SDS) contendo os
66
inibidores de proteases (adicionados no momento da lise). Após incubação em gelo
por 10 minutos, as células foram raspadas com o auxilio de um policial (“cell
scraper”), centrifugadas a 14.000 rpm por 10 min e realizada a coleta do
sobrenadante. A dosagem de proteína total foi feita utilizando-se o reagente de
Bradford (BioRad) (BRADFORD, 1976).
3.2.9. SDS-PAGE
Adiciona-se cerca de 100 μg de proteína total a um tubo mantido em
gelo. Em seguida adiciona-se tampão de amostra para proteína 4x e em seguida
ferve-se o tubo com as amostras por 10 minutos. Após este tempo é feita a aplicação
das amostras em gel de poliacrilamida (10-15 % de acrilamida) e procede-se a
eletroforese (65V de um dia para o outro – “overnight”).
3.2.10. Western blot
Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana de
nitrocelulose (Hybond C-Extra, GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido),
através de uma cuba “semi-dry” (Bio Rad). Terminado o processo de transferência, a
membrana foi corada com Ponceau-S (0,1% Ponceau, 10% ácido acético glacial),
para verificar a eficiência da transferência. Lavou-se a membrana com TBS-T (10mM
Tris base p H8,0, 150mM NaCl, 0,1% Tween-20) 3 ciclos de 10 min, bloqueiou-se a
membrana quanto a ligação inespecífica do anticorpo com 5 % de leite desnatado
67
em TBS-T por 2 horas, a temperatura ambiente. Foi feita a incubação com o
anticorpo primário (“overnight”, anticorpo diluído 1:1000 em TBS-T a 4 ºC). No dia
seguinte, lavou-se novamente a membrana com TBS-T e incubou-se com o anticorpo
secundário ligado a peroxidase por 1 hora. Após esta hora, lava-se novamente a
membrana com TBS-T, e fez-se a detecção com o kit ECL Western blotting Enhanced
Chemiluminescence (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido), de acordo com
as recomendações do fabricante.
3.2.11. Síntese de DNA detectada por incorporação de timidina tritiada
Foram plaqueadas 5x104 células/well (multi-well Corning, 12
wells/placa) em meio DMEM com 10 % FCS por 24 horas, após este período as
células foram sincronizadas em G0 (DMEM com 0,5% FCS por 48 horas). Após este
período as células foram estimuladas com os fatores descritos em cada experimento
e adiciona-se ao meio de cultura 3H-timidina (1 µCi/mL) e timidina fria (não tritiada,
10-7M) pelo período de 24 horas.
Completados os tratamentos o meio com o radioativo succionado e
as células foram fixadas com ácido tricloroacético (TCA 10%) e lisadas com NaOH
0,5M. O lisado foi então transferido para filtros de papel, que foram lavados na
seqüência com TCA 5 %, etanol (70 %), acetona e secos em estufa à 40 ºC por 2h.
Os filtros já secos foram colocados em frascos apropriados contendo 5 mL de líquido
de cintilação e contados no contador de cintilação líquida.
68
3.2.12. Medida de proliferação celular por contagem em hemocitômetro
Foram plaqueadas 3-5x104 células/ P35 (35mm – Corning Inc.,
Corning, NY, EUA) em meio de cultura DMEM com os respectivos tratamentos. A cada
24h as células foram coletadas: 3 placas para cada condição são lavadas com PBS,
suspensas em tripsina e diluídas 1:4 em DMEM. Imediatamente após a coleta foi
feita para contagem das células em hemocitômetro (câmara de Neubauer).
3.2.13. Ensaios de citometria de fluxo (FACS)
Foram plaqueadas 1 a 5x106 células/placas de 35 mm (Corning Inc.,
Corning, NY, EUA) em meio DMEM com 10 % FCS por 24 horas, após este período as
células foram sincronizadas em G0 por 48 horas. Após este período as células foram
estimuladas conforme descrito em cada experimento.
As células foram submetidas aos tratamentos descritos abaixo e
analisadas em aparelho FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Juan,
CA). Dez mil eventos foram analisados por amostra e os dados foram analisados
usando o software WinMDI (http://facs.scripps.edu/pub/pc/wm28w95.exe), Cell
Quest ou Cylchred ( CytonetUK, University of Wales College of Medicine, U.K.,
http://www.cardiff.ac.uk/medicine/haematology/cytonetuk/documents/Cylchred.exe).
69
3.2.13.1. Determinação de fragmentação de DNA utilizando-se de iodeto
de propídeo
As células foram tripsinizadas, ressuspensas em tampão de lise
(citrato de sódio 1 g/L e Triton X-100 1 g/L) contendo iodeto de propídeo (2 µg/mL)
e incubadas ao abrigo da luz, por no mínimo 15 minutos. Após a incubação
realizamos a leitura da fluorescência no comprimento de onda 560-580 nm (FL2) em
citometro de fluxo.
3.2.13.2. Determinação morte celular por apoptose utilizando-se anexina V
As células foram tripsinizadas, lavadas com o tampão de ligação (10
mM Hepes pH 7,4; 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 e 1,8 mM CaCl2). O
sedimento foi ressuspendindo em 100 µL do tampão de ligação contendo anexina V-
FITC (diluição 1:500). Os tubos foram incubados, ao abrigo da luz, por 20 minutos.
Após a incubação, foi ajustado o volume para 400 µL de tampão de ligação. No caso
de marcação dupla com iodeto de propídeo, adicionamos 40 µL de uma solução de
iodeto de propídeo (100 ug/mL). A leitura da fluorescência foi realizada no
comprimento de onda 513-530 nm (FL1) em citometro de fluxo.
70
3.2.13.3. Determinação da produção de ROS utilizando-se dihidroetidina
As células foram tratadas com os seus estímulos e 30 min após a
adição da dihidroetidina (DHE) as células foram tripsinizadas, lavadas com PBS e
ressuspendidas em PBS. A leitura da fluorescência foi realizada no comprimento de
onda >650 nm (FL3) em citometro de fluxo.
3.2.14. Morte celular detectada por ensaio de formação de colônias
O protocolo padrão resume-se ao plaqueamento de 1000 células/P60
(60 mm – Corning Incorporated, Corning, NY, EUA) em meio DMEM e seus
respectivos tratamentos (indicado em cada experimento). Decorridas 24 horas do
plaqueamento e seus respectivos tratamentos, as células foram lavadas (1 vez com
PBS e mais duas vezes com DMEM, a 37ºC) e voltam a crescer em meio completo
(DMEM + 10% FCS). A cada 2-3 dias o meio é renovado até o momento da fixação
das colônias. Após 10-15 dias formam-se colônias visíveis e suas células foram
fixadas em formaldeído 3,7% por 15 min e coradas em cristal violeta (10 min).
71
3.2.15. Transformação de Bactérias
Foi incubado 100μL de uma suspensão da bactéria competente
DH5α, 100 ng do plasmídeo de interesse e 80 uL de tampão de transformação em
gelo por 15 a 30 min. Transferiu-se a suspensão a temperatura ambiente por 10
minutos. Adicionou-se 1 mL de LB a cultura e incuba-se a 37oC por 1h. Plaqueou-se
as bactérias em LB sólido contendo 50μg/mL de ampicilina. As colônias
transformadas foram coletadas e expandidas em meio LB líquido.
3.2.16. Preparação de DNA Plasmidial
Após transformação das bactérias com o plasmídeo de interesse, fez-
se uma “mini-prep” utilizando-se o kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN, Hilden,
Alemanha). Os plasmídeos foram quantificados por gel de agarose (1%) e
espectrofotometricamente (260 e 280 nm). Também foram seqüenciados e
analisados por digestão enzimática.
3.2.17. Sequenciamento
O sequenciamento foi realizado utilizando-se o kit Big Dye
Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), que se baseia no método de
terminação de cadeia por dideoxinucleotídeos (ddNTPs). Os ddNTPs foram marcados
72
com dois tipos de corantes: fluoresceína e quatro tipos diferentes de rodaminas, um
para cada ddNTP. A fluoresceína absorve energia incidente do laser do equipamento
de detecção e transfere para a rodamina, que por sua vez emite luz em seu
comprimento de onda característico. Esta transferência de energia aumenta a
sensibilidade do método.
3.2.18. Coloração de gel de poliacrilamida com Coomasie-Blue
Incubou-se o gel em uma solução de Coomassie blue R (0,25 g em
metanol:água:ácido acético – 45%, 10% e 45%) por no mínimo 1 hora. Após esse
período mergulhou-se o gel em solução descolorante (metanol:água:ácido acético –
45%, 10% e 45%) até o aparecimento das bandas.
3.2.19. Coloração com nitrato de prata de gel de poliacrilamida
Incubou-se o gel em solução I (30% etanol e 10% ácido acético) por
30- 180 min. Em seguida, incubou-se o gel na solução II (Para 100 mL de solução:
30% etanol, 2 mL de solução de glutaraldeído a 25%; 2 mL, 6,8 g de acetato de
sódio; 0,2 g de tiossulfato de sódio) por no mínimo 30 minutos, podendo ser
“overnight”. No dia seguinte, lavou-se o gel em água destilada (5 ciclos de 10
minutos) e incubou-se o gel na solução III (Para 100 mL de solução: 0,1 g de nitrato
de prata e 57,2 uL de solução de formaldeído a 35%) por 20 minutos. Em seguida
lavar brevemente em água destilada e incubou-se na solução IV (Para 100 mL de
73
solução: 2,4 g de carbonato de sódio; 28,6 uL de solução de formaldeído a 35%) até
o aparecimento das bandas. Ao surgir as bandas no gel, transferiu-se para a solução
V (1,86 g de EDTA/100 mL de água destilada) para bloquear a revelação.
3.2.20. Fracionamento celular da proteína de fusão FGF-2 fusionado a
Proteína A
Para preparar as frações nucleares e citoplasmáticas da proteína de
fusão FGF-2 fusionada a proteína A, células da linhagem celular Y1, foram cultivadas
em placas de cultura de 100 mm (Corning Incorporated, Corning, NY, EUA) até a
confluência de 80%. Posteriormente, as células foram tripsinizadas, centrifugadas e
congeladas a -80°C. O fracionamento celular foi realizado conforme descrito por
Watkins & Norbury (2004) com algumas modificações. As células foram
descongeladas e lavadas em PBS, centrifugadas a 240g e ressuspendidas em tampão
TMN [10 mM de Tris pH 7,5, 1,5 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 1 mM de NaF, 1 mM DTT e
os inibidores de proteases PMSF (1 mM), pepstatina, aprotinina e leupeptinina (2
µg/ml)]. A suspensão foi incubada por 15 minutos no gelo e as células lisadas em
homogenizador Douncer (10 vezes). As células homogeneizadas foram centrifugadas
a 1500g por 5 minutos a 4°C para sedimentar a fração nuclear. O sobrenadante foi
recolhido como a fração citoplasmática. O sedimento nuclear foi ressuspendido em
tampão TKM (50 mM de Tris pH 7,5, 5 mM de MgCl2, 25 mM de KCl 1 mM de NaF, 1
mM de DTT e os mesmos inibidores de proteases do tampão TMN) na proporção de
1:1. A fração nuclear foi sonicada por 5 vezes por 5 segundos em sonicador.
Posteriormente, o homogeneizado foi centrifugado a 1500g a 4°C por 5 minutos.
74
3.2.21. Purificação de lisados celulares em resina de IgG Sepharose
Inicialmente foi feita a lavagem da resina e o equilíbrio, conforme o
protocolo da resina IgG Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare, Buckinghamshire,
Reino Unido). Os extratos celulares foram incubados de 30 minutos até 3 horas,
sempre a 4ºC e sob agitação. A lavagem da resina com os lisados foi realizada em 3
ciclos com tampão TST (50mM de Tris pH 7,6; 150 mM de NaCl, 0,05% de Tween
20) e a eluição com 60 µL de 0,5 M de ácido acético pH 3,4. As amostras foram
posteriormente analisadas por SDS-PAGE e “Western-blot”.
3.2.22. Transformação de leveduras
Uma colônia de levedura foi inoculada em 5 mL de meio YPD e
incubada a 30 ºC por 20 horas. Após esse tempo, foi retirada 20 uL dessa cultura e
inoculada em 10 mL de meio YPD. Essa cultura foi incubada a 30 ºC por 24 horas. A
seguir as células foram contadas e um inóculo de células de 5 x 106 células em 75
mL de meio YPD foi realizado. O crescimento dessa cultura foi acompanhado ate que
foi atingida a densidade de 2 x 107 células/mL. Um volume equivalente a 108 células
foi centrifugado por 5 minutos a 7.000 rpm. O sobrenadante foi descartado, o
sedimento foi lavado com 400 uL de acetato de lítio a 0,1 M e a suspensão foi
centrifugada por 30 segundos. O sobrenadante foi descartado e sobre o sedimento
foi adicionado, nessa ordem: 240 ul de PEG 50% (p/v); 36 uL de acetato de lítio 1 M;
75
25 uL de solução de esperma de salmão a 2 mg/mL e 50 uL da solução contendo o
plasmídeo a ser transformado (aproximadamente 1 ug). A mistura foi homogenizada
e incubada a 30 ºC por 30 minutos. A mistura foi centrifugada pro 30 segundos, o
sedimento ressuspendido em 500 uL de H2O MilliQ e a solução foi semeada em
placas seletivas apropriadas. As placas foram colocadas a 30ºC e o crescimento das
colônias transformantes foi aguardado de um período de 3 a 5 dias.
3.2.23. Ensaio de metabolização de X-Gal
Colônias representativas de levedura a serem analisadas, foram
semeadas em placa seletiva contendo sobre ela, filtro de nitrocelulose. Após o
crescimento das colônias sobre o filtro, esse foi retirado da placa e mergulhado em
nitrogênio liquido para que as colônias congelassem. Em seguida, o filtro congelado
foi embebido em uma solução contendo 2% de X-Gal e tampão Z, e deixado em
estufa a 37 ºC de 1 a 3 horas. As colônias que produziram a enzima β-galactosidase,
expressaram a cor azul, devido a metabolização do substrato X-Gal.
3.2.24. Extração de DNA genômico de levedura
Uma colônia de levedura foi inoculada em 2 mL de meio YPD e
incubada a 30 ºC por 20 horas. Decorrido esse tempo, a suspensão foi centrifugada
por 5 minutos e o sedimento foi ressuspendido em 200 uL de tampão de lise. O tubo
foi imerso em nitrogênio liquido e depois em um banho-maria a 95 ºC. Esse
76
procedimento foi repetido mais duas vezes. Em seguida o tubo foi agitado,
adicionou-se 200 uL de clorofórmio, agitado novamente e centrifugado por 3
minutos. Retira-se a fase aquosa, adiciona-se 400 uL de etanol gelado e manteve-se
a temperatura ambiente por 5 minutos. Centrifugou-se por 5 minutos e o sedimento
é lavado em 500 uL de etanol 70%. Centrifugou-se novamente por 5 minutos,
descartasse o sobrenadante e o sedimento foi seco a temperatura ambiente.
Ressupendeu-se em 10 uL de TE.
3.2.25. Clonagem, isolamento e sequenciamento dos plasmídeos
recombinantes
Os fragmentos obtidos após o isolamento eram ligados aos
plasmídeos (pMOSBlue e pGEM) e submetidos a reação de ligação. Cepas de
bactérias competentes DH-5α foram utilizadas para a clonagem. Após a seleção dos
clones utilizando placas com LB Agar (“Luria Bertani Medium” com 1,5% agar),
houve a seleção com IPTG (isopropil β-tiogalactopiranosídeo, 100 mM) e X-Gal (5-
bromo-4-cloro-3 indolil-β-galactosídeo).
Os clones “positivos” foram extraídos através da técnica de midi-
prep, utilizando o kit “QIAprep Midiprep” (Qiagen, Hilden, Alemanha) e a presença
dos fragmentos de cDNA clonados foram confirmadas por varreduras por PCR e por
sequenciamento utilizando o kit “BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction” (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).
77
3.2.26. Produção de espécies reativas de oxigênio através do método da
Lucigenina
Alíquotas de células (1 x 106 células/mL) foram incubadas por 10
minutos a 37 ºC com 100 µL de lucigenina (1,5x10-4 mol/L), juntamente com os
estímulos. A quimiluminescência foi lida em intervalos regulares, ao longo de 30
minutos a 37ºC, em Luminômetro Microplate LB 96V EG & G Berthold. Dessa forma,
foi obtida: uma curva de quimiluminescência x tempo (em minutos) e a partir desta
curva, calculou-se o valor da área integrada (área sob a curva) de 0 a 30 minutos,
valor este que foi utilizado para a construção de curvas dose-resposta.
3.2.27. Modelagem Molecular
Os estudos de modelagem molecular foram realizados no LNLS
(Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, em Campinas-SP) sob orientação do Dr.
Sergio Oyama Jr., em uma estação Sun, utilizando os módulos BIOPOLYMER e
HOMOLOGY do programa INSIGHT II (Byosym/Molecular Simulation Inc., San Diego,
CA). Os cálculos de dinâmica molecular e minimização de energia foram realizados
no vácuo através do programa GROMACS.
78
4. RESULTADOS
79
4.1. Construção do modelo do FGF-2 HMW
A estrutura do FGF-2 foi resolvida experimentalmente e depositada
no “Protein Data Bank” (PDB, Banco de Dados de Proteínas), sob o código 1BLA, em
1996 (MOY et al., 1996). Esta estrutura foi obtida por RMN, contém todos os 155
aminoácidos que compõem a molécula do FGF-2. Anteriormente a estrutura do FGF-
2 fora resolvida pela técnica de cristalografia (código PDB: 1BFB, 4FGF, 1BAS;
ZHANG et al., 1991; ERIKSSON et al., 1991; ZHU et al., 1991 ) mas com baixa
resolução.
De uma maneira geral a família dos FGFs estruturalmente se
enquadra num modelo de barril β. Alterações são encontradas nos trechos em alça e
principalmente entre as folhas β10 e β12, onde a estrutura da subfamília dos FGFs
19, 21 e 23 adquirem uma conformação de α-hélice. No caso do FGF-2 HMW que
tem 55 aminoácidos a mais, localizados na porção N-terminal da proteína, nos
propusemos a resolver as seguintes dúvidas não avaliadas anteriormente: i) o N-
terminal do FGF-2 HMW poderia formar uma estrutura estável?; ii) caso este N-
terminal forme alguma estrutura terciária, seria possível identificar algum domínio
estrutural que indicasse possíveis parceiros? Estas informações são importantes para
inferirmos a respeito da ligação do FGF-2 HMW com parceiros obtidos através das
técnicas de duplo hibrido de levedura ou por purificação por afinidade de complexos.
Neste sentido, procuramos por um modelo para o FGF-2 HMW,
partindo inicialmente da construção apenas do N-terminal, já que o resto da
estrutura estava resolvida experimentalmente (apresentado no item 4.1.1). Depois,
80
descrevemos no item 4.1.2 a fusão do N-terminal ao FGF-2, de modo a obter o
modelo do FGF-2 HMW e realizar a dinâmica molecular para verificar a estabilidade
da estrutura. Por ultimo, no item 4.1.3, mostramos a validação do modelo do FGF-2
HMW ao qual chegamos.
4.1.1. Busca de um modelo para N-terminal do FGF-2 HMW
Usando a ferramenta BLAST (KARLIN & ALTSCHUL, 1990) iniciamos
a busca por similaridade de seqüências na base de dados do PDB, para o N-terminal
do FGF-2 HMW que tem 55 aminoácidos. Nesta busca não conseguimos encontrar
nenhuma estrutura resolvida experimentalmente com similaridade suficiente para
que fosse construído por homologia o N-terminal do FGF-2 HMW. Para saber se o
segmento poderia formar algum motivo estrutural, usamos o programa PSIPRED
v2.3 (JONES, 1999). Este programa através da comparação da seqüência primária do
FGF-2 HMW, com o banco de dados estruturais do PBD, estima uma conformação
para a proteína em estudo, no nosso caso, o FGF-2 HMW. A predição da estrutura
secundária do FGF-2 HMW nos revelou segmentos de α-hélices, folhas β e trechos
randômicos (Figura 4.1). Pela figura 4.1 pode-se observar que o barril β, que é o
núcleo central estrutural da família dos FGFs, foi mantido.
Para a busca de um “template” para o N-terminal do FGF-2 HMW,
usamos o software “LOOPP” (MELLER & ELBER, 2001;
http://cbsuapps.tc.cornell.edu/loopp.aspx), que utiliza técnicas de “threading”. O
“threading” é uma abordagem recente, que se baseia na comparação da seqüência
de uma proteína de interesse, com modelos descritivos de enovelamento de
81
proteínas, analisando-se a distância entre os resíduos de aminoácidos, a estrutura
secundária de cada fragmento e as características físico-químicas de cada resíduo.
O software nos forneceu como melhor opção de “template”, a
estrutura de uma proteína reguladora da condensação de cromossomos (RCC,
“regulator of chromosome condensation protein”), depositada no PDB sob o código
1A12 (RENAULT et al., 1998). A Figura 4.2 mostra o alinhamento fornecido pelo
programa. Nota-se que há uma grande diferença na seqüência primária do nosso
peptídeo, o N-terminal do FGF-2, com o template, a proteína RCC (35,2% de
identidade), mas estudos demonstram que mesmo proteínas com baixa identidade
de seqüência apresentam enovelamentos semelhantes, quando construídas pela
técnica de “threading” (JONES, 1999).
82
Figura 4.1 – Predição da estrutura secundária do FGF-2 HMW. A predição da estrutura secundária realizada pelo software PSIPRED está sobre a seqüência. Os cilindros azuis representam α-hélices e as setas vermelhas representam as folhas β enquanto que os trechos randômicos (“randon coil”) estão representados por um traço preto. Acima da predição está um índice de confiança dado pelo software. O gráfico mostra um trecho em α-hélices no N-terminal e um barril-β no C-terminal.
83
Figura 4.2 - Resultado do alinhamento do “threading”. Alinhamento do N-terminal do FGF-2 HMW com a proteína condensadora de cromossomos RCC-1 (Código do PBD: 1A12), que foi utilizada como molde para a construção. O alinhamento foi gerado pelo programa LOOPP.
A partir do alinhamento foi realizada a construção do modelo para o
N-terminal do FGF-2 HMW, considerando este segmento como um peptídeo isolado,
o peptídeo 1-55. Usando-se das coordenadas atômicas da RCC1 e o com auxilio do
modulo HOMOLOGY, pertencente ao pacote INSIGHT II (Molecular Simulation Inc.,
San Diego, CA, http://www.accelrys.com) foi realizada inicialmente a construção do
modelo do peptídeo 1-55, por homologia (Figura 4.3). Em seguida a minimização de
energia do modelo foi realizada, e objetivando à verificação da estabilidade
termodinâmica desse peptídeo, realizamos uma dinâmica molecular de 1000 ps (300
K; pH 7,0) através do programa GROMACS (LINDAHL et al., 2001). A qualidade da
estrutura foi verificada através do programa PROCHECK (LASKOWSKI et al., 1998).
Parte desses resultados está mostrada na Figura 4.4.
84
Figura 4.3 – A proteína homologa RCC-1 e o fragmento 1-55. Em A, a estrutura da proteína RCC-1, com a região “homologa” ao N-terminal do FGF-2 mostrada em vermelho. Em B, detalhe do fragmento 1-55 antes da minimização de energia.
Figura 4.4 – Coleta de estruturas e gráfico de RMSD do fragmento 1-55. A esquerda termos uma serie de imagens sobrepostas de C-α, coletada durante a dinâmica molecular do peptídeo 1-55. Duas grandes famílias conformacionais são identificadas, baseadas na analise dos valores de RMSD (gráfico à direita). Coleções de estruturas em vermelho a laranja foram coletadas entre 250 a 350ps. As estruturas coloridas em amarelo, azul e verde são representativas dos últimos 200ps da simulação.
85
4.1.2. Modelagem molecular do FGF-2 HMW
Com o modelo da estrutura do peptídeo 1-55, que representa a
porção N-terminal do FGF-2 HMW pronto, ligamo-lo a estrutura depositada no PDB
do FGF-2 (1BLA), o que resultou no modelo teórico da isoforma de 22,5 kDa do FGF-
2 (o FGF-2 HMW). Este modelo foi refinado, através de uma nova minimização de
energia e uma simulação de dinâmica molecular (1 ns, 300K). Todos os cálculos
foram efetuados pelo programa GROMACS (LINDAHL et al., 2001).
A coleta de dados, baseada na diferença de RMSD (root-mean-
square deviation, ou desvios de quadrados mínimos), que nada mais é do que uma
função de distância, medida entre os átomos em uma estrutura em um dado instante
e os mesmos átomos em outro momento, mostra que há três grandes períodos de
equilíbrio, mostrados na Figura 4.5. Estes três períodos podem ser visualizados pelos
três quadrados com cores mais claras, entre os intervalos de 150-250 ps, 450-550 ps
e entre 850 a 950 ps. Nestes locais ocorrem uma menor variação na media das
distancias dos Cα da estrutura. A coleta dessas estruturas está apresentada na
Figura 4.6. Na Figura 4.7 mostra-se a variação dos domínios estruturais durante a
dinâmica molecular. E por último, pode-se observar a estrutura final obtida na Figura
4.8.
86
Figura 4.5 – Gráfico de RMSD durante a durante a dinâmica molecular do FGF-2 HMW. Matriz com a comparação dos pares de RMSD (Root Mean Square Deviation), resultante da simulação de dinâmica molecular realizada pelo FGF-2 HMW (22,5 kDa).
Figura 4.6 – Coleta de estruturas do FGF-2 HMW durante a dinâmica molecular. Superposição de C-α das estruturas do FGF-2 HMW coletadas durante a simulação de dinâmica molecular. Foram coletadas as estruturas durante 100 ps, nos intervalos que apresentaram menor diferença de RMSD (150-250 ps, 450-550 ps e entre 850 a 950 ps). Nota-se uma maior mobilidade da estrutura no início do equilíbrio e no final a porção N-terminal adquiri uma conformação estável, consistindo de α-hélice com dois trechos em folha β.
87
Figura 4.7 – Variação da estrutura secundária do modelo durante a dinâmica molecular. Durante a dinâmica molecular praticamente não há alteração da estrutura secundária no segmento 55-210 do FGF-2 HMW (parte superior da figura). Em compensação o motivo de α-hélice estabilizada pelas folhas-β só começa a se estabelecer ao final da dinâmica, nos últimos 200ps.
Figura 4.8 – Cartoon da estrutura do FGF-2 HMW. Traço dos C-α da estrutura do FGF-2 HMW coletada durante a simulação de dinâmica molecular.
88
4.1.3. Validação do modelo do FGF-2 HMW
Finalizada a construção, era necessário validar o modelo obtido para
FGF-2 HMW. Para tanto, utilizamos do programa PROCHECK (LASKOWSKI et al.,
1998). Este programa avalia a geometria da estrutura protéica, utilizando-se de
parâmetros estereoquímicos derivados das estruturas depositadas no PDB. Dentre os
parâmetros que podem ser avaliados, levamos em consideração a posição dos
ângulos diédricos phi (φ) e psi (ψ), os quais são colocados no diagrama de
Ramachandran (RAMACHANDRAN & SASISEKHARAN, 1968).
Os resíduos plotados no diagrama de Ramachandran podem ser
localizados em uma das seguintes regiões: central (“core”), permitida (“allowed”),
generosamente permitida (“generously allowed”) e não permitida (“disallowed”).
Quanto a posição dos resíduos analisados no diagrama de Ramachandran (210
resíduos no total), o modelo do FGF-2 HMW (Figura 4.9) exibiu 78,1% dos resíduos
nas regiões mais favoráveis, 20% em regiões adicionais, 1,2% em regiões
generosamente permitidas e finalmente 0,6% (1 resíduo) de resíduos em regiões
não permitidas. Os resíduos de glicina (33 no total) possuem como cadeia lateral um
átomo de hidrogênio, logo, o Cα não possui quiralidade e são representados por
triângulos no gráfico de Ramachandran. E o número de prolinas na estrutura é de 15
resíduos.
89
Figura 4.9 – Gráfico de Ramachandran do modelo final do FGF-2 HMW. O diagrama mostra a distribuição dos ângulos phi e psi (medidos em graus) para o modelo do FGF-2 HMW após a dinâmica molecular. Os resíduos de glicina estão indicados por triângulos e os outros por quadrados. O gráfico foi gerado pelo programa PROCHECK.
Apesar de todos os membros da família dos FGFs serem descritos
estruturalmente como um barril β e terem uma similaridade de seqüência, eles
conseguem ter especificidades diferentes ao mesmo receptor. A fim de observar,
como são as diferenças entre os membros da família dos FGFs, ao nível de estrutura,
continuamos o trabalho de busca por modelos para os outros FGFs. Inicialmente foi
realizada a busca por similaridade em banco de dados, usando a base do PDB, para
a escolha dos “templates”, além das predições de suas estruturas secundárias
(PSIPRED). Iniciamos o refinamento dos modelos resolvidos experimentalmente por
cristalografia (Tabelas 4.1 e 4.2). Esses estudos, possibilitaram uma análise,
subdividindo a família dos FGFs em 7 subfamílias que além da sua similaridade de
seqüência, preservam também as propriedades funcionais (ITOH & ORNITZ, 2004;
90
POPOVIC et al., 2005; e Figura 1.3). Houve um pequeno avanço na determinação
das estruturas da família dos FGFs: novos membros (FGF-8, FGF-10 e FGF-19;
MOHAMMADI et al., 2005) tiveram a sua estrutura resolvida a posteriori da nossa
analise, mas todos eles mantém a estruturação de barril β.
Tabela 4.1 – Estruturas da família dos FGFs resolvidas experimentalmente. FGF Número de
acesso
aa’s Nº PDB Metodologia Região
1 CAA46661.1 155 1RML RMN (26) Lys(24):Asp(154)
2 AAA52448.1 155 1BLD RMN (30) Met(1):Ser(155)
4 P08620 206 1IJT Raio X (1,8 Å) Gly(79):Leu(206)
7 AAA63210.1 194 1QQL Raio X (2,3 Å) Asp(9):Ser(139)
9 BAA03572.1 208 1IHK Raio X (2,2 Å) Thr(52):Ser(208)
Tabela 4.2 – Resultado da busca por similaridade para os membros da família dos FGFs. FGF Número de
acesso pb Template
(Molde) E-value
3 (int-2) CAA32615.1 239 1G82 5 e-29 5 AAB06463.1 268 1G82 7 e-28 6 (hst-6) CAA45054.1 198 1IJT 3 e-47 10 BAA22331.1 208 1QQL 2 e-36 11 AAB18913.1 243 1G82 2 e-27 12 AAB18914.1 245 1G82 2 e-28 13 AAB18915.1 225 1IHK 5 e-26 14 AAB18916.1 247 1G82 5 e-30 16 BAA24956.1 207 1IHK 9 e-75 20 BAB03633.1 211 1G82 6 e-76 21 BAA99415.1 209 1IJT 5 e-12 22 BAB13479.1 170 1QQL 9 e-29
91
4.2. Identificação de parceiros de FGF-2 (22,5 kDa), usando a metodologia
do duplo-hibrido de levedura
4.2.1. Construção do cDNA de FGF-2(22,5kDa) e ensaio de duplo hibrido
de levedura
Utilizamos a técnica do duplo híbrido de levedura para identificar as
possíveis proteínas que interagem com a porção N-terminal do FGF-2 HMW (22,5
kDA). Para tanto, iniciamos isolando o cDNA do FGF-2 HMW, através da amplificação
do cDNA de linhagens celulares e também da biblioteca comercial de cDNA de
cérebro fetal humano (Clontech Laboratories Inc, Palo Alto, CA, EUA). Como não
obtivemos êxito no isolamento do cDNA, através da RT-PCR, optamos pela
construção de um cDNA semi-sintético desenhando oligos para a porção
correspondente ao N-terminal da proteína (Figura 4.10). Estes oligos foram anelados
e fusionados ao cDNA do FGF-2 (18kDa), que já se encontrava inserido no plasmídeo
pJEB-1, construído anteriormente em nosso laboratório (MIYAMOTO, 1992) e
utilizado para a produção do FGF-2 recombinante desde então.
92
oligo 1 RV 3’-gTacccActgTcTccATcTccATcTcgTgaTggcccAccAtccgaTccAccATccccATcccc -5’ oligo 1 FW 5’-aattcAtgggTgacAgAggTAgAggTAgAgcActAccgggTggTaggctAggTggTA-3’ mRNA FGF-2 CTGGGGGACCGCGGGCGCGGCCGCGCGCTGCCGGGCGGGAGGCTGGGGGGCC M G D R G R G R A L P G G R L G G oligo 2 RV 3´-AgcacgTggcctcTcccagcctccATccccATccccgTccccAtgccgAcgTggggc -5’ oligo 2 FW 5’-ggggTAggggTcgtgcAccggagAgggtcggaggTAggggTAggggcAggggTacgg-3’ mRNA FGF-2 GGGGCCGGGGCCGTGCCCCGGAGCGGGTCGGAGGCCGGGGCCGGGGCCGGGGGACGG R G R G R A P E R V G G R G R G R G T >oligo 3 RV 3´-gcgTcgTggtcgTcgTgcccctagggccggcccAgggcgtccAtggtac-5’ >oligo 3 FW 5’-cTgcAccccgcgcAgcAccagcAgcAcggggatcccggccgggTcccgcaggTac-3’ mRNA FGF-2 CAGCACCCCGCGCGGCTCCAGCGGCTCGGGGATCCCGGCCGGGCCCCGCAGGGAC A A P R A A P A A R G S R P G P A G T
Figura 4.10 – Oligos desenhados para a porção do cDNA correspondente ao N-terminal do FGF-2 HMW. As bases alteradas estão em letras maiúsculas nos oligos e as respectivas trincas sublinhadas no mRNA do FGF-2.
Na porção sintetizada, correspondente ao N-terminal da proteína (55
aminoácidos), foram realizadas algumas alterações nas bases, para diminuir o
conteúdo de GC em relação ao mRNA existente e para termos códons que fossem
preferencialmente mais expressos em leveduras e bactérias (Figura. 4.10).
O cDNA semi-sintético do FGF-2 HMW foi inserido no plasmídeo pTL-
2. O plasmídeo pTL-2 foi construído a partir do pNLexA – gentilmente fornecido pela
Dra. E. Golemis do Fox Chase Câncer Center (Filadélfia, EUA). O pNLexA foi digerido
com SphI, de modo a liberar o domínio de expressão: ADHp:LexA:ADHt. O domínio
de expressão foi subclonado no vetor pBTM116:kan. Com essas construções
obtivemos o domínio de ligação ao DNA (BD) da proteína LexA fusionada ao FGF-2
HMW (com o domínio do LexA na porção C-terminal e o FGF-2 HMW na porção N-
terminal) que foi utilizada como “isca” para o ensaio de duplo hibrido. O ensaio foi
realizado contra uma biblioteca comercial de cDNA de cérebro fetal humano
(Clontech Laboratories Inc, Palo Alto, CA, EUA) fusionada ao domínio de ativação
93
(AD) de GAL4. Todo o ensaio de duplo híbrido foi desenvolvido no laboratório do Dr.
Nilson I. T. Zanchin (LNLS, Campinas-SP).
4.2.2. Análise das proteínas ligantes de FGF-2 HMW (22,5 kDa) detectadas
pelo ensaio de duplo híbrido
A interação entre LexA-FGF-2 HMW (isca) e as proteínas ligantes
(presas) foi detectada pelo crescimento de leveduras em meio sem histidina e pela
produção da β-galactosidase. Oito clones celulares de levedura cresceram em meio
sem histidina e dentre esses, cinco foram positivos para o ensaio de β-galactosidase.
Destes clones celulares, foram obtidos clones de cDNA, que foram seqüenciados e
analisados pelo programa BLAST, levando a identificação de cinco diferentes
proteínas, como apresentado na Tabela 4.3.
94
Tabela 4.3 – Resultados da análise através do BLAST dos cromatogramas das colônias que cresceram e foram positivas a β-gal no ensaio de duplo-híbrido (para todos E=0)
Melhor “match” no BLAST
Score (bits)
Id Id (%) Numero de Acesso no GenBank
Nome do Gene (Locus Link)
LocusID Função
Homo sapiens bromodomain containing 2 (BRD2), mRNA
1048,55 613/650 94 NM_005104.2 BRD2: bromodomain containing 2
6046 A proteína tem atividade serina/treonina quinase e esta envolvida em espermatogênese. Localização nuclear.
Homo sapiens chromosome 14 BAC 98L12, complete sequence
1062,01 619/651 95 AC008015
Enzima conjugada a ubiquitina humana (UBE2I) (UBC9 homologa a de levedura)
1113,9 915,8
631/648 476/476
97 100
HSU45328 BT006932.1|
UBE2I: enzima conjugada com ubiquitina E2I (UBC9 homologa a de levedura)
7329 Proteína envolvida no catabolismo dependente de ubiquitina e envolvida no ciclo da ubiquitinina. Capacidade de modificação proteica.
Homo sapiens bromodomain and PHD finger containing, 1 (BRPF1), mRNA
698,6 423/457 94 NM_004634.1 BRPF1: bromodomain and PHD finger containing, 1
7862 O produto tem propriedades de se ligar a DNA e está envolvido na regulação da transcrição, DNA-dependente e localizada no núcleo celular.
Cofator (coativador) 4 humano da RNA polymerase II (cDNA clone MGC:23773 IMAGE:4134117),
1010,1 706,3
615/657 378/384
93 98
BC022339.1 HSPCAP15
PC4: cofactor 4 de ativação da RNA polimerase II
10923 A proteína tem capacidade de se ligar a simples fita de DNA. Envolvida na transcrição e sua regulação através da promoção da polimerase II. Localizada no complexo de fatores de transcrição (núcleo).
95
Nossos resultados de sequenciamento indicam que um dos clones
tem similaridade com uma região de um BAC (“Homo sapiens chromosome 14 BAC
98L12”). A região do cromossomo que teve similaridade com o clone, não está
dentro de uma região codificadora (descrita no arquivo do GenBank, BENSON et al.,
2007), nem dentro de uma ORF (predição pelo GeneMark, BORODOVSKY &
McININCH, 1993).
Todos os cDNAs oriundos dos clones celulares positivos no ensaio de
duplo híbrido foram subclonados no vetor pGEX4T1 (GE Healthcare), através de
oligos (ver o desenho dos oligos no Item 3.1.12 – Oligosnucleotídeos, em Materiais e
Métodos) nos quais foram inseridos dois sítios de restrição: EcoRI e XbaI , para que
deste modo fosse possível realizar a sub-clonagem, envolvendo a fusão com uma
seqüência codificante de GST. Bactérias E. coli competentes foram transformadas
com estas construções, induzidas ou não com IPTG (1 mM), centrifugadas, lisadas e
analisadas através de SDS-PAGE. Os eletroferogramas obtidos mostram bandas
protéicas específicas induzidas com IPTG (Figura 4.11).
96
Figura 4.11 Eletroferogramas corados com Coomassie de lisados de bactérias transformadas com as construções codificantes das proteínas de fusão com GST indicadas acima. IPTG (1 mM) claramente induz bandas específicas nas canaletas de UBE2i:GST, BRPF1:GST e PC4:GST.
Os lisados de bactérias contendo as proteínas fusionadas com GST
induzidas por IPTG (Figura 4.11) foram centrifugados e os respectivos sobrenadantes
incubados com uma suspensão de esferas de Glutationa Sepharose 4B (Amersham
Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido) por 30 minutos a 4ºC. Em seguida, as
esferas de Sepharose foram centrifugadas, lavadas e aplicadas no topo de canaletas
de uma placa de SDS-PAGE para analisar as frações protéicas adsorvidas à
Glutationa-Sepharose. O eletroferograma da Figura 4.12 exibe bandas abundantes
altamente purificadas correspondentes a UBE2i:GST, BRPF1:GST e PC4:GST e
apenas um sinal muito pálido de RING3:GST.
97
Figura 4.12 Eletroferograma corado com Coomassie de proteínas de fusão com GST induzidas por IPTG adsorvidas a esferas de Glutationa-Sepharose 4B. A comparação com o eletroferograma da Figura 4.11 demonstra a alta eficiência de purificação das proteínas de fusão.
Para testes iniciais de ligação física de FGF-2 às proteínas da Tabela
4.3, detectadas e isoladas pelo método de duplo híbrido, lisados de bactéria
induzidas com IPTG (Figura 4.11) foram incubados com: a) FGF-2 (18kDa)
recombinante e b) lisado de células Y1 que contem FGF-2 endógeno de baixo e alto
peso molecular (ver Figura 1.9). Nestas incubações (1h a 4ºC ) também foram
incluídas alíquotas de suspensão de esferas de Glutationa-Sepharose 4B. Em seguida,
as bolinhas de Sepharose foram processadas para análise das proteínas adsorvidas
por SDS-PAGE e “Western-blot” através de um anticorpo específico para FGF-2.
Conforme mostra a Figura 4.13, o “Western-blot” detecta em todas as canaletas da
incubação com o FGF-2 recombinante bandas fortes em torno de 18kDa e bandas
positivas mais muito fracas por volta de 40kDa, sugerindo que de fato o FGF-2
recombinante interagiu fisicamente com as proteínas fusionadas a GST. No caso da
98
incubação com lisado das células Y1 aparece sinais fraquíssimos entre 18 e 22 kDa
que poderia ser devido a espécies de FGF-2 endógenos carregados pelas proteínas
fusionadas a GST.
Figura 4.13 Western-blot realizado com o anticorpo anti FGF-2. Lisados bacterianos obtidos (Figura 4.11) foram incubados com FGF-2 recombinante e lisado celular de células Y1, seguida de adsorção a esferas de Glutationa-Sepharose 4B.
Em conclusão, o método do duplo híbrido permitiu detectar, isolar e
identificar proteínas nucleares que são bons candidatos a ligantes intracelulares de
FGF-2. Nenhuma destas proteínas tinha sido anteriormente descritas como possíveis
ligantes de FGF-2.
99
4.3. Expressão ectópica de espécies de FGF-2 e fenótipo celular
Os planos originais deste projeto previa a transfecção de construções
de cDNA codificante de formas de FGF-2 fusionadas a proteína A em células Y1 para
conseguir expressão ectópica de FGF-2(18kDa):protA e FGF-2(22,5 kDa):protA. A
etiqueta de proteína A destas espécies de FGF-2 devia servir para o isolamento por
afinidade de complexos protéicos intracelulares destes FGFs. Uma premissa
importante desta abordagem é que estas formas de FGF-2 com proteína A de
expressão ectópica deveriam se comportar como as suas respectivas análogas
endógenas, isto é, ocupar os mesmos sítios intracelulares e formar os mesmos
complexos protéicos. Mas, a expressão da proteína exógena freqüentemente alcança
níveis muito mais altos do que os das análogas endógenas podendo levar a artefatos
de distribuição intracelular e mudanças no fenótipo da célula transfectada.
A transfecção e expressão ectópica de FGF-2 foi explorada durante
anos atrás para testar a hipótese de que FGF-2 é oncogênico e, por isso, sua
expressão ectópica deveria causar transformação maligna em linhagens celulares
imortalizadas, como , por exemplo, a linhagem Balb 3T3. Os resultados obtidos nessa
época não foram congruentes e conclusões consensuais não foram alcançadas.
Assim, Sassada et al., 1988 e Neufeld et al., 1988 transfectaram Balb 3T3 com um
vetor de expressão contendo o cDNA de FGF-2, mostrando que os transfectantes
adquirem um fenótipo transformado com capacidade de crescer a altas densidades
de saturação e em suspensão (“soft-agar”), mas a adição de anticorpos anti-FGF-2
ao meio de cultura revertia este fenótipo (SASSADA et al., 1988 e NEUFELD et al.,
1988). Por outro lado, Rogelj, et al., 1988 e Blam et al., 1988 chegaram a resultados
100
diferentes: a) observaram que expressão ectópica de FGF-2 não era suficiente para
transformação maligna; b) quando construíram um cDNA de FGF-2 contendo uma
seqüência adicional 5’ para um peptídeo sinal de secreção, verificaram que expressão
ectópica desta forma de FGF-2 ainda não era suficiente para transformação maligna,
mas gerava transfectantes com propensão à transformação espontânea com poucas
gerações em cultura (ROGELJ, et al., 1988 e BLAM et al., 1988). Apesar dos 20 anos
que se passaram desde então estes experimentos não foram re-examinados e os
resultados daquela época permanecem sem explicação conciliatória.
Recentemente em nosso laboratório demonstramos duas respostas
antagônicas induzidas por FGF-2 exógeno adicionado ao meio de cultura celular: (i) a
resposta mitogênica clássica; e (ii) uma resposta inesperada de bloqueio da
proliferação aparentemente por indução de morte celular não apoptótica (COSTA et
al., 2004; COSTA, 2005). Esta segunda e inesperada resposta induzida por FGF-2 foi
observada na linhagem adrenocortical tumorigênica Y1, cujo estado maligno
depende da manutenção de altos níveis constitutivos de c-Ki-Ras-GTP. Estes
resultados levaram-nos a propor a hipótese de que FGF-2 promove mitogênese em
células normais ou imortalizadas não tumorigênicas (resposta mitogência clássica),
mas, em células malignamente transformadas por um dos oncogenes ras o FGF-2
bloqueia a proliferação em decorrência da indução de morte ou senescência celular.
Durante o desenvolvimento deste projeto de tese, múltiplos
experimentos foram conduzidos para testar: a) a hipótese de ação anti-tumor de
FGF-2; b) efeitos da expressão ectópica de espécies de FGF-2 em células
imortalizadas Balb3T3 e células malignas Y1. Os principais resultados destes
101
experimentos que são pertinentes aos objetivos específicos desta tese são descritos
nas sub-seções a seguir.
4.3.1. Em células Balb 3T3, expressão ectópica de FGF-2 não causa
transformação, enquanto tratamento com FGF-2 exógeno recombinante
dispara mitogênese e não promove morte celular
Células Balb 3T3 foram transfectadas com vetores plasmidiais
carregando cDNAs codificantes para, respectivamente, as proteínas de fusão FGF-
2(18 kDa):protA e FGF-2(22,5 kDa):protA, além do marcador genético que confere
resistência a higromicina. Colônias resistentes a higromicina foram isoladas dando
origem a sub-linhagens clonais que passaram por uma triagem para verificar níveis
de expressão de mRNA por PCR e de proteína por “Western-blot” para ambos FGF-2
fusionados a proteína A. As sub-linhagens transfectantes com alta expressão dos
FGF-2 não mostraram nenhum sinal de transformação morfológica, indicando que a
expressão ectópica destas formas de FGF-2 fusionadas a proteína A não é suficiente
para causar transformação celular. Quando estas mesmas sub-linhagens foram
tratadas por FGF-2 recombinante adicionado ao meio de cultura responderam com
mitogênese detectada pela estimulação da tomada de 3H-timidina em DNA (Figura
4.14) e se mostraram totalmente resistentes à morte induzida por FGF-2 pelo critério
de ensaios clonogênicos (Figura 4.15). Portanto, sub-linhagens de Balb3T3 com
expressão ectópica de formas de FGF-2 fusionadas à proteína A são fenotipicamente
indistinguíveis da linhagem parental.
102
Figura 4.14 - Ensaios de incorporação de 3H-timidina em células Balb 3T3 e seus clones. Ensaios de incorporação de 3H-timidina foram realizados, seguindo o protocolo descrito em Materiais e Métodos. Os dados de incorporação de 3H-timidina são provenientes de 2 experimentos, realizados em triplicata, foram normalizados e estão representados pela média ± desvio-padrão. (** p < 0,001, * p < 0,05; e quando todas as medidas são comparadas com o controle p<0,0001 (***), exceto quando indicado). Nas outras situações, diferenças não significantes (p>0,05). Valores de p, obtidos através do teste de comparação múltipla Student-Newnan-Keuls.
103
Figura 4.15 - Ensaio de colônia em células Balb 3T3 e seus clones. Foi seguido o protocolo descrito em Materiais e Métodos. Os valores são provenientes de 2 experimentos independentes, realizados em triplicata, foram normalizados e estão representados pela média ± desvio-padrão. Valores de p, retirado do Teste t não pareado, com aproximação de Welch´s.
4.3.2. FGF-2 não dispara apoptose, mas bloqueia o ciclo celular de células
Y1 na fase S
Utilizamos a técnica de citometria de fluxo (FACS, do inglês
Fluorescence Activated Cell Sorting) para realização de ensaios de fragmentação de
DNA (apoptose), viabilidade celular (necrose) e dupla marcação com anexina V
conjugada com FITC e iodeto de propídeo (apoptose e necrose).
104
As células foram tratadas com FGF-2 em concentrações que variaram
de 2 a 25 ng/mL por 24 horas. Foi utilizado como controle positivo staurosporina
(1µM) e DMSO (5%) que são indutores de apoptose e necrose, respectivamente.
Como controle negativo, utilizamos células que estavam em cultura com DMEM
suplementado com 10% FCS. Nas condições estudadas (Tabela 4.4 e Figura 4.16)
não se observaram evidências seja de morte celular por apoptose ou por necrose.
Na Tabela 4.4 mostram-se os resultados numéricos das análises de
fragmentação de DNA e de apoptose. Todos os dados da tabela estão expressos em
porcentagem (%) ± desvio-padrão. Para a análise da fragmentação de DNA, os
valores foram retirados a partir da determinação de um intervalo (M1 – Marker 1,
considerado intervalo em que as células estão integras) e analisados pelo software
WinMDI (http://facs.scripps.edu). Para a analise de apoptose e necrose, os
quadrantes foram delimitados baseando-se nos controles positivos e negativos, como
se nota não houve resultados significativos de apoptose.
Tabela 4.4 – Resultados das análises realizadas por citometria de fluxo para apoptose 10% FCS 10% FCS + 10
ng/mL FGF-2 p
M1 (PI) Fragmentação de DNA
91 ± 1 92 ± 3 p = 0,6388 (ns)
Q4 (Anexina V-FITC + PI)
1,2 ± 0,2 3,7 ± 0,3 p = 0,00127 (**)
Analise estatística realizada através do Teste t não pareado, com aproximação de Welch´s (**, muito significante).
Na Figura 4.16, são apresentadas imagens representativas de dois
tratamentos: o controle, células crescendo em10%FCS-DMEM (parte superior da
figura); e células tratadas com FGF-2 (10 ng/mL) por 24 horas (parte inferior da
figura). Em A e D, observamos o gráfico representativo da fragmentação do DNA,
105
onde no controle temos 90,5% do DNA integro e na célula tratada com FGF-2,
89,5%. Em B e E, observamos a analise de anexina V-FITC no eixo x e a marcação
com PI no eixo y, mostrando que menos de 0,5% das células são apoptóticas,
independente do tratamento. E por ultimo em C e F, temos a análise da dispersão
para tamanho (FSC – forward scatter, no eixo x) e complexidade interna (SSC – side
scatter, no eixo y). Observamos que ocorreu um aumento da granulosidade e/ou
complexidade celular SSC (side scatter), quando a linhagem parental é submetida a
tratamentos com FGF-2.
106
Figura 4.16 - Analises realizadas por citometria de fluxo. Análises realizadas por citometria de fluxo (FACS – Fluorescence-activated cell sorting) realizados na linhagem parental Y1. (Dados relativos a 10.000 eventos, analises realizadas pelo software WinMDI, veja também a Tabela 4.4, na página anterior). Na parte superior da figura observamos a célula Y1, crescendo em DMEM com 10%FCS e na parte inferior a célula tratada por 24 horas com FGF-2 (10 ng/mL). Gráficos representativos das analises realizadas: Em A e D, temos analise da fragmentação de DNA, em B e E as células foram marcadas com iodeto de propídeo e anexina V-FITC, para determinação de apoptose e/ou necrose e em C e F, temos a analise do tamanho celular (FSC) e da complexidade celular (SSC).
Também foram realizadas por citometria de fluxo, analises de ciclo
celular na linhagem parental Y1 (Figura 4.17). Células Y1 foram plaqueadas,
carenciadas por 48 horas e estimuladas com 10% FCS ou 10% FCS + 10 ng/mL FGF-
2 por 24 e 48 horas. Nas culturas controle (10% FCS) o perfil de distribuição da
população entre as fases do ciclo em 24h é compatível com o término de uma
duplicação quase sincrônica das células; o perfil de 48 horas é semelhante ao de 24
107
horas e está de acordo com o esperado para uma população que cresce
continuamente em estado estacionário num meio de cultura ótimo para proliferação.
Por outro lado, quando as células Y1 são tratadas com FGF-2 há um acúmulo
crescente de células em S entre 24 e 48 horas e também uma parcela elevada da
população em G2, além de diminuição correspondente da fração em G1. Portanto, as
células entram na fase S, à semelhança da cultura controle, mas FGF-2 impede a
progressão normal das células através da transição S → G2.
70
21
9
76
17
7
50
33
17
37
47
16
0%
20%
40%
60%
80%
100%
24 horas 48 horas 24 horas 48 horas
Controle (10% FCS) FGF-2 (10 ng/mL)
G2
S
G0/G1
Figura 4.17 - Medidas de ciclo celular efetuadas por citometria de fluxo. Análises realizadas por citometria de fluxo (FACS – Fluorescence-activated cell sorting) realizados na linhagem parental Y1. (Dados relativos a 10.000 eventos, analises realizadas pelo softwares WinMDI e Cylchred). Células Y1 foram plaqueadas, carenciadas por 48 horas e estimuladas com 10% FCS e 10% FCS + 10 ng/mL FGF-2 por 24 horas ou 48 horas, conforme indicado no gráfico. Os dados mostram que FGF-2 aumenta a quantidade de células em S e não altera o conteúdo em G2. Resultados representativos de 3 experimentos.
Os resultados acima relatados confirmam e ampliam as observações
originais de nosso laboratório (COSTA et al., 2004 e COSTA, 2005) e, também,
corroboram a hipótese de ação anti-proliferativa de FGF-2 sobre células malignas
108
dependentes dos oncogenes ras. Os dados aqui apresentados mostram que FGF-2
(18kDa) recombinante bloqueia irreversivelmente a proliferação das células Y1 sem
provocar apoptose ou necrose, sugerindo que FGF-2 dispara senescência em células
malignas dependentes de ras. De fato, Costa (COSTA, 2005) levantou a hipótese de
que FGF-2 inicia senescência em células Y1 e, mais recentemente mostramos em
nosso laboratório (FORTI & AREMLIN, manuscrito submetido) que FGF-2 induz SA-β-
Gal (“Senescence-Associated β-galactosidase”) em células Y1. Mas, os mecanismos
de senescência são ainda essencialmente desconhecidos (LEVINE et al., 2006),
embora se admita que envolvam bloqueio do ciclo celular na fase G1 (SHERWOOD et
al., 1988). Conforme os resultados desta tese mostram FGF-2 bloqueia o ciclo celular
das células Y1 na fase S implicando que deve ser um processo de senescência
diferente dos mencionados na literatura recente.
4.3.3. Expressão ectópica do oncogene H-RasV12 tornam células humanas
imortalizadas suscetíveis ao bloqueio da proliferação por FGF-2 exógeno
É óbvio que o fenômeno de senescência induzido por FGF-2 em
células Y1 ganharia muito em importância potencial se não fosse uma peculiaridade
dessa linhagem de células adrenocorticais malignas de camundongo. Para testes
iniciais da generalidade desse fenômeno, nosso laboratório mostrou que sub-
linhagens de Balb 3T3 malignamente transformadas pelo oncogene H-RasV12
também são suscetíveis de entrar em senescência induzida por FGF-2 (18kDa)
recombinante (COSTA, 2005; FORTI et al., manuscrito em preparação). Mas, um
109
teste de generalização deste fenômeno mais estringente foi feito com células
humanas durante o desenvolvimento desta tese, cujos resultados são relatados a
seguir.
Conseguimos, como doação, do Prof. Christopher M. Counter, da
Duke University, North Caroline, USA (LIM & COUNTER, 2005) a linhagem humana
HEK-TtH de células imortalizadas com os antígenos T e t de SV40 e a subunidade
catalítica da telomerase (hTERT). Células HEK-TtH podem ser transformadas em
malignas pela expressão ectópica do oncogene H-RasV12. O Prof. Counter também
nos mandou uma amostra policlonal de células HEK-TtH transformadas uma
construção do oncogene H-RasV12 fusionado ao cDNA do domínio de ligação de
hormônio do receptor de estrógeno (ER-RasV12). Esta sublinhagem policlonal
denominada HEK-ER-Ras somente exibe o fenótipo maligno se for tratada com 4-
hidroxitamoxifeno (4-OHT), um conhecido análogo de estrógeno. Portanto, com esta
sublinhagem podemos explorar o fenótipo imortalizado não tumorigênico na ausência
de 4-OHT ou imortilazado e maligno em presença de 4-OHT.
Nossos resultados mostram que células HEK-ER:Ras desenvolvem
mais colônias num ensaio clonogênico quando tratadas com FGF-2 ou 4-OHT, mas o
número de colônias diminui drasticamente (55% em relação ao controle), se forem
tratadas com ambos 4-OHT e FGF-2 (Figura 4.18, em A). A interpretação destes
resultados é simples: FGF-2 promove a proliferação das células de fenótipo
imortalizado; por outro lado, 4-OHT induz a proteína ER-RasV12 (ver ensaio de PCR
Figura 4.18, em B e de Western blot na Figura 4.18, em D) condicionando o fenótipo
maligno que intensifica a proliferação mas torna as células suscetíveis de entrar em
senescência induzida pro FGF-2. Portanto, estes resultados constituem-se numa forte
110
evidência experimental a favor da generalização do fenômeno observado com células
Y1, isto é, FGF-2 distingue células apenas imortalizadas de células malignas,
promovendo a proliferação das primeiras e bloqueando o ciclo celular das últimas
(senescência).
Figura 4.18 Ensaios iniciais com células HEK ER:Ras G12. Em A temos uma representação do ensaio de colônia realizado com a linhagem HEK ER:Ras G12, onde a indução de tamoxifeno e por conseqüência a expressão do oncogene ras leva a uma diminuição do numero de colônias quando tratadas com FGF-2. Em B, gráfico do qPCR realizado para medir os níveis de h-H-Ras, onde a adição de 4-OHT eleva em cerca de 10 vezes a expressão do mRNA de Ras. E em C, ensaio de “Western-blot” contra o anticorpo de H-Ras (Santa Cruz, ). HEKi é o nome simplificado de mais de HEK-TtH e HEK Ras de HEK-TtH-RasV12.
111
4.3.4. Transfecção, seleção e isolamento de sub-linhagens clonais de
células Y1 expressando FGF-2(18kDa):ProtA e FGF-2(22,5kDa):ProtA.
Preparações do vetor pcDNA 3.1 (+) higro, respectivamente,
portando cDNA de FGF-2 (18kDa) e do FGF-2 HMW (22,5kDa) ambos fusionados a
proteína A foram transfectadas em células Y1. Colônias foram selecionadas com
higromicina e isoladas para gerarem múltiplas sub-linhagens clonais transfectantes
estáveis (procedimentos detalhados em Métodos). Um conjunto destas sub-linhagens
foram submetidas a uma triagem para verificar níveis de expressão ectópica dos
mRNAs (RT-PCR) e das proteínas de fusão (Western blot). No Western da Figura
4.19 todas as canaletas mostram as isoformas endógenas de FGF-2 (na parte
inferior, próximo a marca de 20 kDa). Na parte superior da figura aparecem as
bandas de FGF-2 fusionado a proteína A, cujas intensidades são bastante variáveis
indo de níveis não detectáveis a super-expressão (Fig. 4.19). Estão destacados em
vermelho os clones escolhidos para análises mais detalhadas.
112
Figura 4.19 Western-blot para FGF-2 nas sublinhagens de Y1. Os lisados celulares e o ensaio de “Western-blot” foram realizados, conforme descrito em Materiais e Métodos. A incubação da membrana foi contra o anticorpo primário (FGF-2, Santa Cruz Biotechnology) overnight e em seguida com o anticorpo secundário (anti-IgG-HRP, Amersham Biosciences) por 2 horas. A revelação foi através da técnica de quimiluminescência (kit ECL, Amersham Biosciences). Em destaque (dentro da box vermelha) os clones escolhidos.
Os 6 clones transfectantes escolhidos (3 do FGF-2(18kDa):protA: Y1
F1.2, Y1 F1.3 e Y1 F1.4; e 3 do FGF-2(22,5kDa):protA: Y1 FH1.3 A, Y1 FH 2.3 A e
Y1 FH 3.2 A) foram submetidos a fracionamento celular separando fração
citoplasmática e nuclear (segundo WATKINS & NORBURY, 2004) com o fim de
analisar a distribuição intracelular dos FGF-2 fusionados a proteína A. A posteriori
foram escolhidos mais dois clones Y1 F1.8 e Y1 F1.10 que apresentam uma menor
expressão da proteína de fusão. Como critério de contaminação cruzada entre
núcleo e citoplasma foi adotada a presença das proteínas c-Fos (exclusivamente
nuclear) e H-Ras (exclusivamente citoplasmática) monitoradas pro Western blot. Por
esse critério a Fig.4.20 indica frações nucleares bastante puras, enquanto as frações
citoplasmáticas aparecem muito contaminadas com material nuclear. Apesar dessa
contaminação das frações citoplasmáticas a distribuição dos FGF-2 fusionados a
proteína A foram examinados por Western blot com anti-FGF-2. Conforme a Fig.4.21
mostra entre os 3 clones com expressão abundante de FGF-2 (18kDa) somente um
113
(Y1-F1.3A) apresenta quantidade significante da proteína de fusão na fração
nuclear, sugerindo que a distribuição da proteína exógena pode ser irregular entre
clones celulares diferentes com níveis semelhantes de expressão. No caso do FGF-2
HMW (22,5 kDa):proteína A nenhum dos 3 clones celulares se destaca pela presença
da proteína de fusão na fração nuclear. Naturalmente, os artefatos de contaminação
limitam mas não invalidam esta interpretação dos resultados.
Figura 4.20 – Fracionamento celular. Extratos protéicos citoplasmáticos e nucleares de diversos clones, obtidos através do método descrito por Watkins, que foram submetidos a “Western-blot” contra os anticorpos de c-fos e H-Ras, usados para marcação nuclear e citoplasmática respectivamente.
114
Figura 4.21 – Fracionamento celular protéico e a localização de FGF-2. Extratos protéicos citoplasmático e nuclear de diversos clones, obtidos através do método descrito por Watkins, que foram submetidos a “Western-blot” contra o anticorpo de FGF-2, visando saber qual fração seria a mais rica em FGF-2. Seta em verde indica altura esperada para a fusão FGF-2(22,5 kDa):protA e em vermelho para FGF-2(18 kDa):protA.
4.3.5. Expressão ectópica de FGF-2(18 kDa):protA, mas, não de FGF-2(22,5
kDa)protA, protege as células Y1 de senescência induzida por FGF-2
exógeno
Durante a caracterização das sub-linhagens clonais de Y1 que
expressam as proteínas de fusão FGF-2 com proteína A, obtivemos resultados
inesperados. As sublinhagens que expressam FGF-2(18 kDa):protA são resistentes à
senescência induzida por FGF-2, já as que expressam FGF-2(22,5 kDa):protA
permanecem tão sensíveis a FGF-2 quanto a linhagem parental Y1. Estas conclusões
decorrem dos resultados de; i) Ensaios de incorporação de 3H-timidina (Figura 4.22
115
A, C e E); ii) Curvas de crescimento (Figura 4.22 B, D e F), e; iii) Ensaios de
clonogênicos (Figuras 4.23 e 4.24).
Figura 4.22 - Ensaios de proliferação celular em células Y1 e seus clones. Ensaios de incorporação de 3H-timidina (gráficos à esquerda) e curvas de crescimento (à direita), realizados para a linhagem parental Y1 (“wild-type”) e clones que expressam a proteína de fusão FGF-2(18 kDa):protA e FGF-2(22,5 kDa):protA. Em ambos os ensaios foi utilizada a concentração de 10 ng/mL de FGF-2. No ensaio de incorporação de 3H-timidina o tratamento foi de 24 horas e nos ensaios de curva de crescimento o meio foi substituído a cada 2 dias, juntamente com o tratamento (10 ng/mL FGF-2). Os dados de incorporação de 3H-timidina são provenientes de 6 experimentos e estão representados pela média ± desvio-padrão. (** p<0,01 e * p<0,05, utilizando o teste Student-Newman-Keuls - Teste paramétrico, ANOVA). Os gráficos das curvas de crescimento são representativos dos clones e os ensaios foram realizados em triplicata.
116
Figura 4.23 - Ensaio de colônia em células Y1 e seus clones sem a presença de FCS. As células foram plaqueadas em meio DMEM com 0,5% FCS por 24 horas, tratadas ou não com FGF-2 (10 ng/mL). Gráficos representativos de um dos clones. Em azul temos a linhagem parental Y1, em vermelho um clone que expressa a proteína de fusão FGF-2(18 kDa):protA e em verde a proteína FGF-2(22,5 kDa):protA. Ensaio realizado em triplicata; os valores estão expressos pela média ± desvio-padrão valor de p, obtido através do Teste t não pareado, com aproximação de Welch´s.
Figura 4.24 – Ensaios de colônia em células Y1 e clones na presença de Soro. As células foram plaqueadas em DMEM com 10% FCS. Gráficos representativos de um dos clones, ensaio realizado em triplicata; os valores estão expressos pela média ± desvio-padrão; valor de p, obtido através do Teste t não pareado, com aproximação de Welch´s.
117
Os dados das figuras acima (4.22, 4.23 e 4.24) são representativos,
mas outras sublinhagens foram também testadas gerando resultados e conclusões
idênticas, conforme mostram as Tabelas 4.5 e 4.6.
Tabela 4.5 – Ensaios de 3H-timidina para outras sublinhagens de Y1 0,5% FCS 10% FCS % FCS controle FGF-2
p em relação
ao controle
controle FGF-2 p em
relação ao
controle Y1 F 1.2 100 ± 17 122 ± 12 p=0,0321
(*) 142 ± 7 138 ± 11 p=0,4739
Y1 F 1.4 100 ± 25 125 ± 35 p=0,1883 115 ± 20 123 ± 43 p=0,6918 Y1 FH 1.3 A 100 ± 39 78 ± 22 p=0,2679 85 ± 24 70 ± 25 p=0,3167 Y1 FH 2.3 A 100 ± 18 77 ± 23 p=0,0858 92 ± 18 70 ± 15 p=0,0470
(*) Analise estatística realizada através do Teste t não pareado, com aproximação de Welch´s (*, significante). Tabela 4.6 – Ensaios de colônia para outras sublinhagens de Y1
10% FCS controle FGF-2 (10
ng/mL)
N p em relação ao controle (10% FCS)
Y1 F 1.4 100 ± 16 62 ± 24 3 p=0,1068 Y1 FH 1.3 A 100 ± 9 39 ± 5 6 p<0,0001 (***) Y1 FH 2.3 A 100 ± 21 68 ± 23 9 p=0,0076 (**) Analise estatística realizada através do Teste t não pareado, com aproximação de Welch´s (**, muito significante; ***, extremamente significante).
Estes resultados inesperados embora envolvendo um fenômeno
complexo, revelam que as isoformas FGF-2 (18 kDa) e FGF- 2 HMW (22,5 kDa)
parecem ter roteiros e funções intracelulares diferentes, podendo implicar em
diferenças na distribuição intracelular e na formação de complexos protéicos. Por
outro lado, curiosamente, ambas as proteínas na forma recombinante produzida em
bactéria e purificadas tem a mesma atividade de induzir senescência nas células Y1.
118
4.4. Pode ROS serem mediadores no disparo de senescência iniciado por
FGF-2 na linhagem adrenocortical Y1
O fenômeno de senescência induzido por FGF-2 em células malignas,
conforme os resultados desta tese e de outros sub-projetos de nosso laboratório,
depende da atividade oncogênica dos oncogenes ras e não se restringem apenas às
células Y1. Os mecanismos subjacentes a este fenômeno são ainda obscuros, mas
dos nossos estudos focalizados nas células Y1 podemos afirmar que o disparo de
senescência por FGF-2 depende de 3 fatores: a) receptores específicos de FGF
(FGFRs), cujo bloqueio pelo inibidor específico PD173074 protege completamente as
células da senescência induzida por FGF-2 (SALOTTI, resultados não publicados); b)
altos níveis constitutivos de K-Ras-GTP (COSTA, 2005) e c) RhoA-GTPase, cuja
atividade na forma de RhoA-GTP é indispensável para o disparo da senescência pois
o bloqueio da ativação de RhoA protege as células dos efeitos deletérios de FGF-2
(FORTI & AREMLIN, submetido a publicação; FORTI et al., manuscrito em
preparação). Por outro lado, cabe destacar que as vias mitogênicas de ERK1/2 e
PI3K/Akt, cuja ativação pelos FGFRs é bem conhecida, quando totalmente
bloqueadas por inibidores específicos não conferem nenhuma proteção celular da
senescência induzida por FGF-2.
O fenômeno da senescência está descrito na literatura há mais de 40
anos (HAYFLICK, 1962), mas só nos últimos 5 anos foi reconhecido como mecanismo
importante de proteção dos organismos contra o desenvolvimento de tumores
(LOWE et al., 2004). No entanto, seus mecanismos moleculares ainda são
119
essencialmente desconhecidos (LEVINE et al., 2006). No caso das células Y1 temos
indagado como FGFRs acionados por FGF-2 podem ativar RhoA que por hipótese é
etapa crítica na iniciação do disparo da senescência. Entre os intermediários possíveis
nesta etapa pode-se citar ROS. No decorrer do desenvolvimento do projeto desta
tese esta possibilidade foi avaliada.
Não sabíamos se a linhagem Y1 era capaz de produzir ROS e se
havia um aumento desta produção quando submetida a tratamentos com FGF-2.
Para verificar a capacidade de produção de ROS da linhagem Y1 realizamos ensaios
de quimiluminescência amplificada por lucigenina, para verificar a produção de
anions superóxido extracelularmente e dihidroetidina para verificação da produção de
ROS intracelular.
Nos ensaios de quimiluminescência amplificada por lucigenina,
observamos que existe uma correlação positiva entre o sinal da lucigenina e o
aumento da concentração de FGF-2 utilizada, mostrando-nos que FGF-2 induz a
produção de anions superóxido de forma dose dependente nas condições utilizadas
no ensaio (Figura 4.25).
120
Figura 4.25 - Ensaio de quimiluminescência amplificado por Lucigenina em células Y1. Células Y1 estimuladas com FGF-2 (10ng/mL) e lucigenina (1 mM) foi adicionada. A placa foi colocada em Luminômetro e as medidas foram feitas por 30 minutos. Observa-se que ao aumentar a concentração de FGF-2, aumenta-se a emissão de luz, quando comparada com o controle. Ensaios realizados em triplicada e apresentados na forma de média ± desvio-padrão.
Como dado complementar, realizamos a medida de ROS
intracelularmente usando dihidroetidina (Figura 4.26). Observou-se no ensaio que há
um aumento da fluorescência e, portanto da produção de ROS intracelular, quando a
linhagem Y1 é tratada com FGF-2 (10 ng/mL) e quando há o tratamento
concomitante de FGF-2 e 10 mM N-acetil-L-cisteína (NAC, um antioxidante)
consegue-se reduzir esta produção.
121
Figura 4.26 - Produção de ROS intracelular. Células Y1 foram plaqueadas, sincronizadas em G0 por 48 horas e estimuladas com FGF-2 (10 ng/mL). Ao mesmo tempo foi adicionada dihidroetidina (1 µM). Após 30 minutos, as células foram tripsinizadas, lavadas com PBS-A e submetidas a leitura em citometro de fluxo (FACS – Fluorescence-activated cell sorting). Foi feita a leitura de 10.000 eventos e a media de fluorescência foi medida pelo software CellQuest. Ensaios realizados em triplicada e apresentados na forma de média ± desvio-padrão. Valores de p, retirado do teste de Student-Newman-Keuls. (*, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001).
Para verificar se a indução da senescência causada por FGF-2,
ocorria via “stress” oxidativo, usamos como antioxidante, o N-acetil-L-cisteína (NAC),
nos ensaios de colônia. Num ensaio inicial de curva de dose-resposta observamos
que concentrações acima de 1 mM de NAC são benéficas aumentando o número de
colônias macroscópicas crescidas (Figura 4.27).
122
Figura 4.27 - Ensaio de colônia: curva dose-resposta para o antioxidante (N-acetil-L-cisteína). A comparação entre as concentrações de 1 e 2 mM com as outras menores, todas tem extrema significância (***, p<0,001), exceto os valores de 1mM comparada com 0,5mM (**, p<0,01). Todas as outras comparações são sem significância estatística (p>0,05).Valores de p, retirado do teste de Student-Newman-Keuls.
Múltiplos desenhos de protocolo experimental foram tentados para
evidenciar e medir o possível efeito protetor de NAC contra a senescência induzida
pro FGF-2 em células Y1. Os resultados da Figura 4.28 ilustram uma diferença critica
de protocolo: a) a adição concomitante de NAC e FGF-2 não evidenciam nenhuma
ação protetora do antioxidante, mesmo que a concentração de NAC chegue a 10 mM
(dados não apresentados na Figura 4.28); b) mas se NAC for adicionado 4 horas
antes de FGF-2 aparece um efeito protetor do anti-oxidante. Portanto, por esse
critério experimental ROS pode ser um intermediário relevante no disparo de
senescencia por FGF-2.
123
Figura 4.28 - Ensaio de colônia em células Y1 com adição de antioxidante. Foi utilizada a concentração de 0,3 mM de NAC. O tempo de adição (+4h e +8h), se refere à quantas horas após o plaqueamento, o agente foi adicionado. Todos em relação ao controle e a NAC são *** (p<0,001), exceto NAC versus controle (ns): ** (p<0,01). Valores de p, retirado do teste de Student-Newman-Keuls.
.
124
5. DISCUSSÃO
125
5.1. A modelagem do FGF-2 HMW (22,5 kDa)
A melhor maneira de resolver uma estrutura protéica é através de
métodos experimentais, tais como o RMN e a cristalografia de raio x. O tamanho da
cadeia protéica e o empirismo do processo de formar cristais são obstáculos para a
determinação experimental da estrutura tridimensional de uma proteína. Uma saída
para esses entraves é a modelagem molecular por homologia. Com ela conseguimos
obter um modelo estrutural tridimensional e partir dele inferir a sua função.
Neste sentido, construímos o modelo para o FGF-2 HMW. Esse
apresenta o “core” característico da família dos FGFs: o barril β, mas o seu N-
terminal apresenta-se com um grande trecho em “random coil” e um pequeno
segmento na forma de folha-β:α-hélice:folha-β (Figura 4.8). A coleta de estruturas
durante a dinâmica molecular que realizamos (Figura 4.7, 1ns, 300K, pH 7,0) mostra
que o barril se manteve estável durante todo o tempo da dinâmica.
Os nossos dados são condizentes com análise experimental sobre
estabilidade de estrutura realizada com o FGF-1. Cabe lembrar que o FGF-1 tem uma
alta similaridade de seqüência e estrutura com o FGF-2, sendo os dois considerados
membros protótipos da família dos FGFs. Analises de dicroísmo circular (CD, circular
dichroism) mostram que o FGF-1 é estruturalmente estável entre pH 4,0 e 9,0,
sofrendo desnaturação térmica em temperaturas acima de 47ºC – temperatura esta
que diminui significativamente nas regiões acida (pH<6,0) e básica (pH>8,0) (CHI et
al, 2001).
Apesar das diferenças entre os modelos teóricos (OYAMA, 1997 e
1999) e os experimentais do FGFR (STAUBER et al., 2000; PLOTNIKOV et al., 1999),
126
a modelagem do FGFR possibilitou a construção de peptídeos, inicialmente idênticos
à seqüência do FGFR-1 que eram capazes de reprimir a proliferação celular induzida
pelo FGF. Após a identificação do sitio de ligação do FGF ao receptor, foram
desenhados peptídeos cíclicos que, embora não apresentassem similaridade com a
estrutura primaria do FGF-1 ou FGFR foram capazes de se ligar ao receptor e
promover a resposta mitogênica (síntese de DNA). Deste modo, mostra-se que esta
técnica é eficaz para o desenho de compostos com ação terapêutica contra um alvo
protéico.
Resultados nossos de superposição de carbonos alfa (Cα) de nosso
modelo do FGF-2 HMW (22,5kDa) com a estrutura cristalográfica do FGF-2 ligado ao
FGFR1 (PLOTNIKOV et al., 1999, código PDB 1CVS), mostra que existe a
possibilidade de FGF-2 HMW (22,5kDa) se ligar e ativar o receptor. Estudos
publicados mostrando que a proteína recombinante de 210 aminoácidos (FGF-2
HMW) é capaz de induzir a proliferação celular (PATRY et al., 1994), confirmam esta
predição feita a partir do nosso modelo teórico. Além disso, no nosso laboratório,
recentemente produzimos a proteína recombinante do FGF-2(22,5 kDa):protA que
ativa ERK 1/2 em intensidade equivalente a FGF-2 recombinante de 18 kDa na
linhagem adrenocortical Y1 (MURATA et al., dados não publicados).
Este trabalho de modelagem iniciou-se numa época em que apenas
5 estruturas estavam resolvidas (Tabela 4.1). As primeiras estruturas resolvidas
experimentalmente da família dos FGFs foi a dos FGF-1 e -2, que mostraram a
existência de 12 folhas β antiparalelas (β1-β12), num arranjo de 3 jogos de quatro
folhas β. Posteriormente foi identificado os sítios de ligação de heparina entre a alça
das folhas β1-β2 e entre as regiões de folha β10-β12. E finalmente FGF-4, FGF-7,
127
FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-19 tiveram as suas estruturas resolvidas
experimentalmente (MOHAMMADI et al., 2005; Figura 1.1 e 1.2), mostrando que há
diferenças entre as regiões de “loop” que conectam as folhas β, do mesmo modo
observa-se que as regiões N- e C-terminal são bem flexíveis.
5.2. Ensaios de duplo hibrido em busca de parceiros intracelulares de FGF-
2 HMW (22,5 kDa)
As funções e os mecanismos mitogênicos do FGF-2 (18kDa) que
dependem da ativação dos FGFRs membranares estão bem descritos na literatura.
Muito embora pouco se saiba das funções e mecanismos da internalização celular do
complexo FGF-2/FGFR. Por outro lado, as funções e mecanismos das isoformas
intracelulares do FGF-2 de alto peso molecular permanecem muito obscuras.
Contudo, alguns poucos parceiros intracelulares do FGF-2 e suas isoformas foram
identificados, a maioria por ensaios de duplo hibrido de levedura. Mas, há poucas
publicações usando FGF-2 ou suas isoformas como isca em ensaios de duplo híbrido
e os resultados obtidos são limitados e insuficientes para esclarecer função e
mecanismos. Nesse sentido nossos resultados com ensaios de duplo híbrido em
leveduras são oportunos e complementam a literatura existente.
Nos ensaios de duplo híbrido, nós identificamos 5 proteínas
nucleares diferentes (Tabela 4.3) que interagem com FGF-2 HMW: UBE2I, BRPF1,
BRD2 e PC4. Todas essas interações foram confirmadas pelo crescimento da levedura
128
em meio sem histidina, pela produção da β-galactosidase e pelos ensaios iniciais de
afinidade com as proteínas fusionada a GST.
Na Tabela 5.1 e na Figura 5.1 temos um painel das interações do
FGF-2. Sabe-se que ele interage com interage com FIF (FGF-2 interacting factor; VAN
DEN BERGHE et al., 2000), uma proteína nuclear com propriedades antiapoptóticas;
envolvida na regulação de respostas de sobrevida/stress; com a proteína ribossomal
S19 (SOULET et al., 2001), e L6/TAXREB107 (SHEN et al., 1998) que está envolvida
na regulação da montagem pré-ribossomal. Duas proteínas que participam da
mesma via bioquímica, a de montagem de complexos spliceosomais, interagem com
o FGF-2: a SMN (do inglês, survival motoneuron protein, proteína motoneuronal de
sobrevivencia) e a subunidade de 66kDa do fator de “splicing” SF3a (SF3a66) (CLAUS
et al, 2003 e 2004; GRINGEL et al., 2004).
Somente a isoforma de baixo peso do FGF-2 (18 kDa) é exportada
para o meio extracelular, por um mecanismo independente do sistema ER/Golgi. O
FGF-2 após se ligar ao seu receptor e disparar a cascata de sinalização, é
internalizado e o direcionamento do FGF-2 para o núcleo é mediado pela proteína
transloquina (BOSSARD et al., 2003). A transloquina é especifica para o FGF-2 que é
secretado (18 kDa) e a sua inibição diminui a presença deste fator de crescimento no
núcleo celular. O FGF-2 (18kDa) pode também interagir com UBF (upstream binding
factor) e regular a transcrição de RNAr (SHENG et al., 2005) e também se ligar a
RSK2 (90 kDa ribosomal S6 kinase 2), formando um complexo que permamenece
ativo para fosforilar a histona H3, durante a transição G0 → G1 do ciclo celular
(SOULET et al., 2005). Intracelularmente o FGF-2 pode estimula CK2, a qual fosforila
nucleolina, regulando a biogênese ribossomal (BONNET et al., 1996).
129
Tabela 5.1 – Interações proteína-proteína descrita na literatura para FGF-2 e suas isoformas. Espécie Isca Biblioteca
utilizada Canditado Referencia
HMW LexA Cérebro de rato adulto
SF3a66 GRINGEL et al., 2004
HMW NLexA NIH 3T3 cDNA L6/TAXREB107 SHEN et al, 1998 FGF-2 pAS2 Linfócito humano FIF VAN DEN BERGHE et al.,
2000 FGF-2 Placenta humana Transloquina BOSSARD et al., 2003 HMW Co-imunoprecipitação SMN CLAUS et al, 2003 FGF-2 “pull-down” FGF-2:GST UBF SHENG et al., 2005 FGF-2 Streptavidina “beads” CK2 & nucleolina BONNET et al., 1996 FGF-2 Co-imunoprecipitação RSK2 SOULET et al., 2005 FGF-2 Co-imunoprecipitação
(GST:FGF-2) S19 SOULET et al., 2001
Figura 5.1 - Interações proteína-proteína descritas pelas isoformas de FGF-2. Esta figura mostra as principais interações atribuídas a FGF-2 e suas isoformas, bem como os seus efeitos. Veja no texto maiores detalhes (Adaptada de Sørensen et al., 2006).
130
Apesar dessas interações descritas, elas apenas fazem sugestões de
mecanismos, não resolvendo o problema da função principalmente das isoformas de
alto peso molecular. Como observado na Figura 5.1, a maioria das interações tem a
ver com a transcrição de RNA e a biogênese de ribossomos. Já os nossos resultados
obtidos (Tabela 4.3), indicam a participação em atividades extra-nucleolares da RNA
polimerase II e da regulação de cromatina.
Os nossos estudos de modelagem com o FGF-2 HMW mostraram que
o mesmo apresenta um motivo de beta-alfa-beta na porção N-terminal, alem do
barril. Ambos os domínios não permitem antecipar interação estrutural com os
nossos resultados do duplo hibrido (Tabela 4.3). Duas boas candidatas têm domínios
de bromo, que se liga a DNA, assim como o FGF-2 HMW também tem esta
capacidade principalmente pelos motivos existentes na região N-terminal: uma
seqüência “RGG box” modificada e pelo motivo beta-alfa-beta. Estamos produzindo
no nosso laboratório FGF-2 HMW (22,5 kDa) recombinante e ensaios de “pull-down”
com essa isoforma estão em andamento.
5.3. Natureza do fenômeno de senescência e bloqueio da proliferação
celular induzida por FGF-2
Os nossos estudos mostram que FGF-2 pode participar de dois
fenômenos antagônicos: a atividade mitogênica canônica; e disparo de senescência
(Células Y1 com poucas horas de tratamento com FGF-2 são induzidas a entrar em
senescência) (COSTA, 2005). Afirmamos que este fenômeno de morte é senescência,
131
devido a ausência de sinais de necrose e de apoptose e pelos ensaios de indução da
atividade da β-galactosidase associada à senescência (“Senescence-Associated β-
galactosidase”, SA-β-Gal, o único marcado molecular de senescência descrito)
positivos (FORTI et al., manuscrito em preparo).
Nossas analises realizadas por citometria de fluxo, mostram que não
ocorreu nem indução de necrose, nem de apoptose nas condições estudadas (Figura
4.16). Observamos que há um aumento da complexidade celular, através da
avaliação do SSC e uma também um pequeno aumento no tamanho celular. Esse
evento é descrito como uma característica do processo natural de senescência em
fibroblastos (ANGELLO et al., 1989). Já as medidas de ciclo celular, mostram que
FGF-2 bloqueia a entrada em G2 de células Y1 (Figura 4.17), tendo um acumulo de
células na fase S do ciclo celular. No controle (células carenciadas por 48 horas e
estimuladas por soro), 70% das células estão em G1 e apenas 8% em S. Já nas que
sofreram tratamento com FGF-2, entre 50 a 37% encontram-se em G1 e 33 a 47%
se acumulam em S. Não podemos esquecer que FGF-2 também dispara uma
resposta mitogênica induzindo a transição G0→G1 e a entrada na fase S medida pela
porcentagem de núcleos marcados com BrdU, conforme resultados já publicados por
nosso laboratório (LEPIQUE et al., 2004, ROCHA et al. 2003, LOFTI & ARMELIN,
2001, LOFTI et al., 1997, ARMELIN et al., 1996, COSTA et al., 2005). Os resultados
apresentados nesta tese, através da analise de FACS, confirmam os dados obtidos na
tese de Érico T. Costa (COSTA, 2005; reprodução dos dados na Tabela 5.2), através
da marcação com BrdU e de incorporação com 3H-timidina. Ambos os dados,
mostram que FGF-2 induzindo a entrada na fase S do ciclo celular e concomitante
132
bloqueando a fase S, que está tese reafirma por método independente através da
análise de FACS.
Tabela 5.2 – FGF-2 induz células Y1 a entrar em S, mas não chegam a completar a mitose. Marcação
com BrdU (%)
Incorporação de 3H-timidina (103 cpm)
Núcleos mitóticos (%)
Não Tratadas 18 17,1 ± 4,4 1,2 ± 0,6 10% FCS 94 80,6 ± 3,7 6,2 ± 1,8 10% FCS + FGF-2 (10 ng/mL)
82 32,2 ± 5,2 0,7 ± 0,7
FGF-2 (10 ng/mL) 60 17,5 ± 5,2 0 Dados de marcação provenientes de COSTA, 2005. Células Y1 sincronizadas em G0/G1 foram estimuladas por tratamentos de 18h de soro (10% FCS) e/ou FGF-2 (1 nM). Durante as últimas 8h anteriores a coleta as células foram tratadas com BrdU (50 µM) ou 3H-Timidina (3HTdR, 1µCi/ml; 10-7M) sendo então processadas como descrito em Métodos. *N=1500. **N=2. ***N=6000.
5.4. ROS pode participar na mediação do disparo de senescência por FGF-
2.
Células Y1 tratadas com FGF-2 aumentam a liberação de anions
superóxido (O2•-) extracelular e a de ROS intracelular (Figuras 4.25 e 4.26). Estes
nossos resultados corroboram dados da literatura, mostrando aumento da produção
de ROS quando fibroblastos em cultura são estimulados com fatores de crescimento
(THANNICKAL et al., 2000). Além disso, a adição do antioxidante NAC ao meio de
cultura 4 horas antes de FGF-2 protege significativamente células Y1 da senescência
induzida por FGF-2 (Figura 4.28). Estes resultados sugerem que ROS podem ter
papel relevante na mediação do disparo de senescência por FGF-2. É importante
133
destacar que NAC (0,3 a 10mM) bloqueia a produção de ROS induzida por FGF-2 em
células Y1.
Sabemos que FGF-2 em células Y1 ativa as vias de ERK; PI3K/Akt e
RhoA. A entrada na fase S do ciclo depende de ERK e PI3K, mas não de RhoA
(Figura 5.2). O uso de inibidores para as vias clássicas mitogênicas de FGF-2 (ERK1/2
e PI3K/Akt) não confere nenhuma proteção celular à senescência induzida por FGF-
2. Por outro lado, o uso de inibidores de Rho-A, protege a célula da senescência
induzida por FGF-2, mostrando que Rho-GTP é indispensável para o disparo de
senescência (FORTI & ARMELIN, submetido à publicação). O uso de inibidores para
FGFR (PD173074) protege a célula do efeito deletério de FGF-2 (SALOTTI, dados não
publicados), mostrando que tanto o FGFR como Rho-GTP são fundamentais para o
disparo do processo. Os resultados mostrados nesta tese indicam que ROS podem
hipoteticamente participar como mediador da ativação de Rho-GTP pelo FGFR.
Figura 5.2 – Esquemas das vias de sinalização envolvidas com o disparo de senescência ou proliferação. Após a ativação do FGFR pelo FGF-2 há o disparo de duas vias antagônicas: a) vias mitogênicas clássicas: PI3K e ERK1/2; b) senescência é dependente de Rhoa-GTP e Ras-GTP.
134
Resultados do laboratório e desta tese mostram que a indução de
senescência por FGF-2 é dependente de altos níveis de Ras-GTP. Tanto a linhagem
adrenal Y1, como 3T3 B61 (transformadas por H-Ras-V12) apresentam altos níveis
constitutivos de Ras-GTP e sofrem senescência quando tratadas com FGF-2. Nesta
tese mostramos que a linhagem HEK ER:Ras, onde a expressão de Ras é
condicionada à presença de 4-OHT no meio, a senescência só é disparada quando
ocorre a estimulação concomitantemente com FGF-2 e 4-OHT (Figura 4.18).
Durante a padronização dos ensaios de quimiluminescência
amplificados por lucigenina, curvas dose-resposta para β-NADH foram realizadas,
para definir a concentração ideal de trabalho com a linhagem Y1, bem como saber se
a linhagem produzia ROS, dependente ou não de β-NADH. Na Figura 5.3, os
resultados desta padronização mostram uma diferença intrigante entre a linhagem
parental Y1 de um lado e suas sublinhagens transfectantes por outro: notoriamente
com o aumento de [β-NADH] as células que expressam ectopicamente altos níveis
das isoformas de FGF-2 fusionadas a Proteína A (F1.3 e FH2.3A) produzem muito
mais O2•- liberado extracelularmente que as células parentais Y1. Estes resultados
revelam uma correlação entre níveis intracelulares de FGF-2 e produção de ROS que
merece ser oportunamente estudada.
135
Figura 5.3 - Curva padrão de β-NADH nos ensaios de quimiluminescência. As curvas obtidas em função da concentração de β-NADH, para a linhagem parental Y1, para o clone Y1 F1.3, que expressa a proteína de fusão FGF-2(18 kDa):protA e Y1 FH 2.3 A que expressa a proteína FGF-2(22,5 kDa):protA. Notar que a produção basal de superóxido em todas as linhagens é igual.
5.5. Conseqüências da expressão ectópica de isoformas de FGF-2 em
células imortalizadas não tumorigênicas e células malignas Y1
A expressão ectópica das isoformas de FGF-2 fusionadas a proteína A
nas células imortalizadas Balb 3T3 não produziram sinais de transformação e nem
influenciaram a resposta mitogênica desta célula ao FGF recombinante adicionado ao
meio de cultura.
Por outro lado, nossos resultados mostram que a superexpressão da
proteína de fusão FGF-2(18 kDa):protA, mas não de FGF-2(22,5 kDa):protA, protege
136
a célula Y1 da senescência induzida por FGF-2 .Curiosamente, ambas as proteínas
recombinantes FGF-2 (18 kDa) e FGF-2 HMW (22,5 kDa) induzem tanto as vias
mitogênicas (ativação de ERK 1/2), como o fenômeno de senescência em células Y1,
quando adicionadas ao meio de cultura. Esses resultados indicam que ambas as
proteínas podem ativar vias e fenômenos semelhantes a partir dos FGFRs, mas
parecem ter roteiros e funções intracelulares diferentes.
137
6. CONCLUSÕES
138
1. O modelo teórico do FGF-2 de alto peso molecular construído mostra que o
segmento N-terminal carregado positivamente (RGG box) não altera a estrutura de
barril-β característica dos FGFs. E, a superposição dos Cα do modelo com os Cα do
FGF2(18kDa) indica que não há impedimento para o FGF2(22,5kDa) se ligar e,
possivelmente, ativar os FGFR´s.
2. Através de ensaios de duplo híbrido, nós identificamos 4 proteínas nucleares
diferentes que interagem com FGF-2 HMW: UBE2I, BRPF1, BRD2 e PC4. Todas essas
interações foram confirmadas pelo crescimento da levedura em meio sem histidina,
pela produção da β-galactosidase e pelos ensaios iniciais de afinidade com as
proteínas fusionadas a GST.
3. Ensaios clonogênicos com as linhagens celulares Y1 de camundongo e HEK-
ER:Ras de humanos, confirmam e expandem dados anteriores do laboratório
demonstrando que FGF2 dispara senescência, bloqueando proliferação, em células
malignas transformadas pelos oncogenes ras.
4. Análises por citometria de fluxo mostram que células Y1 quando tratadas com
FGF-2 não sofrem apoptose (não há fragmentação do DNA, nem exposição de
fosfadil-serina - evidenciada com anexina V). Mas observa-se um acumulo de células
na fase S com conseqüente bloqueio do ciclo celular e da proliferação, configurando
uma forma de senescência diferente do tipo descrito e admitido na literatura atual.
139
5. A superexpressão da proteína de fusão FGF-2(18 kDa):protA, mas não a da FGF-
2(22,5 kDa):protA, protege a célula Y1 da senescência induzida por FGF-2. Por outro
lado, a superexpressão destas mesmas isoformas de FGF-2 fusionadas à proteína A
em células imortalizada Balb3T3 não causou transformação celular e nem alterou a
resposta mitogênica destas células ao FGF-2 recombinante adicionado ao meio de
cultura.
6. Células Y1 quando tratadas com FGF-2 recombinante produz ROS intracelular e
libera anions superóxido no meio extracelular. Além disso, o anti-oxidante NAC
protege estas células da indução de senescência induzida por FGF-2, sugerindo que
ROS pode ser intermediário no disparo de senescência por FGF-2.
140
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
AARONSON, S. A. & TODARO, G. J. Development of 3T3-like lines from Balb-c mouse embryo cultures: transformation susceptibility to SV40.J Cell Physiol., 72 (2), 141-8, 1968 ABRAHAM, J. A.; WHANG, J. L.; TUMOLO, A.; MERGIA, A.; FRIEDMAN, J.; GOSPODAROWICZ, D.; FIDDES, J. C. Human basic fibroblast growth factor: nucleotide sequence and genomic organization. EMBO J., 5 (10), 2523-8 , 1986. ANGELLO, J. C.; PENDERGRASS. W. R.; NORWOOD, T. H.; PROTHERO, J. Cell enlargement: one possible mechanism underlying cellular senescence. J. Cell Physiol., 140, 288-294, 1989. ARMELIN, H. A. Pituitary extracts and steroid hormones in the control of 3T3 cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70(9), 2702-06, 1973. ARMELIN, H. A., LOTFI, C. F. P. & LEPIQUE, A. P. Regulation of growth by ACTH in the Y-1 line of mouse adrenocortical cells. Endocr Res., 22 (4), 373-83, 1996. ARNAUD, E.; TOURIOL, C.; BOUTONNET, C.; GENSAC, M. C.; VAGNER, S.; PRATS, H.; PRATS, A. C. A new 34-kilodalton isoform of human fibroblast growth factor 2 is cap dependently synthesized by using a non-AUG start codon and behaves as a survival factor. Mol Cell Biol., 19(1), 505-14, 1999. BAIRD, A. Fibroblast growth factors: what's in a name? Endocrinology. 132(2), 487-8, 1993. BAJORATH, J.; STENKAMP, R.; ARUFFO, A. Knowledge-based model building of proteins: concepts and examples.Protein Sci., 2 (11), 1798-810, 1993. BASHKIN, P.; DOCTROW, S.; KLAGSBRUN, M.; SVAHN, C. M.; FOLKMAN, J.; VLODAVSKY, I. Basic fibroblast growth factor binds to subendothelial extracellular matrix and is released by heparitinase and heparin-like molecules. Biochemistry, 28(4), 1737-43, 1989. BASHKIN, P.; DOCTROW, S.; KLAGSBRUN, M.; SVAHN, C. M.; FOLKMAN, J.; VLODAVSKY, I. Basic fibroblast growth factor binds to subendothelial extracellular matrix and is released by heparitinase and heparin-like molecules. Biochemistry, 28 (4),1737-43, 1989. BASILICO, C.; MOSCATELLI, D. The FGF family of growth factors and oncogenes. Adv Cancer Res., 59, 115-65, 1992.
141
BEDARD, K.; KRAUSE, K. The NOX Family of ROS-generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology. Physiol Rev 87, 245-313, 2007. BENSON, D. A.; KARSCH-MIZRACHI, I.; LIPMAN, D. J.; OSTELL, J.; WHEELER, D. L. GenBank. Nucleic Acids Res, 35 (Database issue), D21-5, 2007 BIKFALVI, A.; KLEIN, S.; PINTUCCI, G.; RIFKIN, D. B. Biological roles of fibroblast growth factor-2. Endocr Rev., 18 (1), 26-45, 1997. BLAM, S. B.; MITCHELL, R.; TISCHER, E.; RUBIN, J. S.; SILVA, M.; SILVER, S.; FIDDES, J. C.; ABRAHAM, J. A.; AARONSON, S. A. Addition of growth hormone secretion signal to basic fibroblast growth factor results in cell transformation and secretion of aberrant forms of the protein. Oncogene, 3 (2), 129-36, 1998. BOILLY, B.; VERCOUTTER-EDOUART, A. S.; HONDERMARCK, H.; NURCOMBE, V.; LE BOURHIS, X. FGF signals for cell proliferation and migration through different pathways. Cytokine Growth Factor Rev., 11 (4), 295-302, 2000. Review. BONNET, H.; FILHOL, O.; TRUCHET, I.; BRETHENOU, P.; COCHET, C.; AMALRIC, F.; BOUCHE, G. Fibroblast growth factor-2 binds to the regulatory beta subunit of CK2 and directly stimulates CK2 activity toward nucleolin. J Biol Chem, 271 (40), 24781-7, 1996. BORODOVSKY, M. & MCININCH, J. GeneMark: parallel gene recognition for both DNA strands. Computers & Chemistry, 17 (19), 123-133, 1993. BOS, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res., 49 (17), 4682-9, 1989. BOSSARD, C.; LAURELL, H.; VAN DEN BERGHE, L.; MEUNIER, S.; ZANIBELLATO,C.; AND PRATS, H. Translokin is an intracellular mediator of FGF-2 trafficking. Nat. Cell Biol., 5, 433–439, 2003. BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72, 248-54, 1976. BUGLER, B.; AMALRIC, F.; PRATS, H. Alternative initiation of translation determines cytoplasmic or nuclear localization of basic fibroblast growth factor. Mol Cell Biol., 11 (1), 573–577, 1991. BURCHILL, S. A.; WESTWOOD, G. Mechanism of basic fibroblast growth factor-induced cell death. Apoptosis, 7, 5-12, 2002. BURGESS, W. H.; MACIAG, T. The heparin-binding (fibroblast) growth factor family of proteins. Annu Rev Biochem., 58, 575-606, 1989.
142
CAMPBELL, S. L.; KHOSRAVI-FAR, R.; ROSSMAN, K. L.; CLARK, G. J.; DER, C. J. Increasing complexity of Ras signaling. Oncogene, 17(11), 1395-413, 1998 CHEN, Q. M.; BARTHOLOMEW, J. C.; CAMPISI, J.; ACOSTA, M.; REAGAN, J. D.; AMES, B. N. Molecular analysis of H2O2-induced senescent-like growth arrest in normal human fibroblasts: p53 and Rb control G1 arrest but not cell replication. Biochem J., 332 (1), 43-50, 1998. CHEN, Y.; CHEN, P. L.; LEE, W. H. Hot-spot p53 mutants interact specifically with two cellular proteins during progression of the cell cycle. Mol Cell Biol., 14 (10), 6764-72, 1994. CHI, Y.; KUMAR, T. K. S.; WANG, H.; HO, M.; CHIU, I & YU, C. Thermodynamic Characterization of the Human Acidic Fibroblast Growth Factor: Evidence for Cold Denaturation. Biochemistry, 40, 7746-7753, 2001. CHIEN, C. T.; BARTEL, P. L.; STERNGLANZ, R.; FIELDS, S. The two-hybrid system: a method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest. Proc Natl Acad Sci U S A., 88( 21), 9578-82, 1991. CLARKE, M. S.; KHAKEE, R.; MCNEIL, P. L. Loss of cytoplasmic basic fibroblast growth factor from physiologically wounded myofibers of normal and dystrophic muscle. J Cell Sci., 106, 121-133, 1993. CLAUS, P.; BRUNS, A.F.; GROTHE, C. Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) is associated with RNA from small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs) via binding to the survival of motoneuron (SMN) protein. Biochem. J., 384, 1–7, 2004. CLAUS, P.; DORING, F.; GRINGEL, S.; MULLER-OSTERMEYER, F.; FUHLROTT, J.; KRAFT, T.; GROTHE, C. Differential intranuclear localization of fibroblast growth factor-2 isoforms and specific interaction with the survival of motoneuron protein. J. Biol. Chem., 278, 479–485, 2003. CLÉMENT, M. V.; PERVAIZ, S. Intracellular superoxide and hydrogen peroxide concentrations: a critical balance that determines survival or death. Redox Rep., 6 (4), 211-4, 2001. CLEMENT, M. V.; STAMENKOVIC. I. Superoxide anion is a natural inhibitor of FAS-mediated cell death. EMBO J, 15 (2), 216–225, 1996. COHEN, G.M. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J., 326 (1), 1-16, 1997 COLAVITTI, R.; FINKEL, T. Reactive Oxygen Species as mediators of cellular senescence. IUBMB Life, 57 (4), 277-281, 2005.
143
COSTA, E. T. Ações antagônicas de FGF2 em células tumorais de camundongo:disparo de mitogênese e de morte celular. 2005. 133p. Tese. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2005. COSTA, E. T.; FORTI, F. L.; ROCHA, K. M.; MORAES, M. S.; ARMELIN, H. A. Molecular mechanisms of cell cycle control in the mouse Y1 adrenal cell line. Endocr Res, 30 (4), 503-9, 2004. CUEVAS, P.; BURGOS, J.; BAIRD, A. Basic fibroblast growth-factor (FGF) promotes cartilage repair in vivo. Biochem Biophys Res Commun., 156 (2), 611-618, 1988. DAILEY, L.; AMBROSETTI, D.; MANSUKHANI, A; BASILICO, C. Mechanisms underlying differential responses to FGF signaling Cytokine Growth Factor Ver., 16 (2), 233–247, 2005. DIMRI, G. P.; LEE, X.; BASILE, G.; ACOSTA, M.; SCOTT, G.; ROSKELLEY, C.; MEDRANO, E. E.; LINSKENS, M.; RUBELJ, I.; PEREIRA-SMITH, O.; PEACOCKE, M; CAMPISI, J. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A., 92(20), 9363-7, 1995. DINNEY, C. P.; BIELENBERG, D. R.; PERROTTE, P.; REICH, R.; EVE, B. Y.; BUCANA, C. D.; FIDLER, I. J. Inhibition of basic fibroblast growth factor expression, angiogenesis, and growth of human bladder carcinoma in mice by systemic interferon-alpha administration. Cancer Res., 58(4), 808-14, 1998. DONO, R.; TEXIDO, G.; DUSSEL, R.; EHMKE, H.; ZELLER, R. Impaired cerebral cortex development and blood pressure regulation in FGF-2-deficient mice. EMBO J., 17 (15), 4213-25, 1998. DRAPER, B. W.; STOCK, D. W.; KIMMEL, C. B. Zebrafish FGF-24 functions with fgf8 to promote posterior mesodermal development. Development, 130 (19), 4639-4654, 2004. DZIEMBOWSKI, A.; SÉRAPHIN, B. Recent developments in the analysis of protein complexes. FEBS Lett., 556 (1-3), 1-6, 2004. EINHAUER, A.; JUNGBAUER, A. The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. J Biochem Biophys Methods., 49 (1-3), 455-65, 2001. ERIKSSON, A. E.; COUSENS, L.S.; WEAVER, L. H.; MATTHEWS, B. W. Three-dimensional structure of human basic fibroblast growth factor. Proc Natl Acad Sci USA, 88(8), 3441-5, 1991., FEIGE, J. J.; BAIRD, A. Basic fibroblast growth factor is a substrate for protein phosphorylation and is phosphorylated by capillary endothelial cells in culture. Proc Natl Acad Sci U S A., 86(9), 3174-8, 1989.
144
FEIGE, J.; BRADLEY, J. D.; FRYBURG, K.; FARRIS, J.; COUSENS, L. C.; BARR, P. J.; BAIRD, A. Differential effects of heparin, fibronectin, and laminin on the phosphorylation of basic fibroblast growth factor by protein kinase C and the catalytic subunit of protein kinase A. J Cell Biol, 109 (6), 3105-3114, 1989 FIELDS S, STERNGLANZ R. The two-hybrid system: an assay for protein-protein interactions. Trends Genet., 10 (8), 286-92, 1994. FIELDS, S.; SONG, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 340 (6230), 245-6, 1989. FLAUMENHAFT, R.; MOSCATELLI, D.; RIFKIN, D. B. Heparin and heparan sulfate increase the radius of diffusion and action of basic fibroblast growth factor. J Cell Biol., 111 (4), 1651-9, 1990. FLORKIEWICZ, R.Z.; ANCHIN, J; BAIRD, A. The inhibition of FGF-2 export by cardenolides implies a novel function for the catalytic subunit of Na+ K+ ATPase. J Biol Chem., 273 (1), 544-551, 1998. FOLKMAN, J.; KLAGSBRUN, M. Vascular physiology. A family of angiogenic peptides. Nature, 329 (6141), 671-2, 1987. GALZIE, Z.; KINSELLA, A. R.; SMITH, J. A. Fibroblast growth factors and their receptors. Biochem Cell Biol, 75 (6), 669-685, 1997. GAVIN, A.C.; BOSCHE, M.; KRAUSE, R.; GRANDI, P.; MARZIOCH, M.; BAUER, A.; SCHULTZ, J.; RICK, J.M.; MICHON, A.M.; CRUCIAT, C.M.; REMOR, M.; HOFERT, C.; SCHELDER, M.; BRAJENOVIC, M.; RUFFNER,H.; MERINO, A.; KLEIN, K.; HUDAK, M.; DICKSON, D.; RUDI, T.; GNAU, V.; BAUCH, A.; BASTUCK, S.; HUHSE, B.; LEUTWEIN, C .; HEURTIER, M.A.; COPLEY, R.R.; EDELMANN, A.; QUERFURTH, E.; RYBIN, V.; DREWES, G.; RAIDA, M.; BOUWMEESTER, T.; BORK, P.; SERAPHIN, B.; KUSTER, B.; NEUBAUER, G.; SUPERTI-FURGA, G. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature, 415 (6868), 141–147, 2002. GINGRAS, A.C.; AEBERSOLD, R. & RAUGHT, B. Advances in protein complex analysis using mass spectrometry. J Physiol, 563 (1), 11-21, 2005. GOETZ, R.; BEENKEN, A.; IBRAHIMI, O. A.; KALININA, J.; OLSEN, S. K.; ELISEENKOVA, A. V.; XU, C.; NEUBERT, T. A.; ZHANG, F.; LINHARDT, R. J.; YU, X.; WHITE, K. E.; INAGAKI, T.; KLIEWER, S. A.; YAMAMOTO, M.; KUROSU, H.; OGAWA, Y.; KURO-O, M; LANSKE, B.; RAZZAQUE, M. S.; MOHAMMADI, M. Molecular insights into the klotho-dependent, endocrine mode of action of fibroblast growth factor 19 subfamily members. Mol Cell Biol., 27 (9), 3417-3428, 2007. GOLFARB, M. Fibroblast growth factor homologous factors: evolution, structure, and function. Cytokine Growth Factor Rev., 16 (2), 215-220, 2005.
145
GOSPODAROWICZ, D. & MORAN, J. Effect of a fibroblast growth factor, insulin, dexamethasone, and serum on the morphology of BALB/c 3T3 cells. Proc Natl Acad Sci U S A., 71 (12), 4648-52, 1974. GOSPODAROWICZ, D.; BIALECKI, H.; GREENBURG, G. Purification of fibroblast growth factor activity from bovine brain. J. Biol. Chem., 253 (10), 3736-3743, 1978. GOSPODAROWICZ, D.; JONES, K. L.; SATO, G. Purification of a growth factor for ovarian cells from bovine pituitary glands. Proc Natl Acad Sci U S A.,71(6), 2295-9, 1974 GOSPODAROWICZ, D.; NEUFELD, G.; SHWEIGERER, L. Molecular and biological characterization of fibroblast growth factor, an angiogenic factor which also controls the proliferation and differentiationof mesoderm and neuroectoerm derived cells. Cell Differ., 1, 1-17, 1986. GRINGEL, S. VAN BERGEIJK, J.; HAASTERT, K.; GROTHE, C.; CLAUS, P. Nuclear fibroblast growth factor-2 interacts specifically with splicing factor SF3a66 Biol. Chem., 385, 1203–1208, 2004. HALFLICK, L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Exp Cell Res., 37, 614-36, 1965. HIGGINS, D.; THOMPSON, J.; GIBSON, T.; THOMPSON, J. D.; HIGGINS, D.G.; GIBSON, T. J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res., 22, 4673-4680, 1994 HUANG, P.; STERN, M. J. FGF signaling in flies and worms: more and more relevant to vertebrate biology. Cytokine Growth Factor Rev., 16(2), 151-8, 2005. IBRAHIMI, O. A.; ZHANG, F.; HRSTKA, S. C.; MOHAMMADI, M.; LINHARDT, R. J. Kinetic model for FGF, FGFR, and proteoglycan signal transduction complex assembly. Biochemistry, 43(16), 4724-30, 2004. IRANI, K. Oxidant signaling in vascular cell growth, death, survival: a review of the roles of reactive oxygen species in smooth muscle and endothelial cell mitogenic and apoptotic signaling. Circ Res., 87, 179–183, 2000. ITO, T.; CHIBA, T.; OZAWA, R.; YOSHIDA, M.; HATTORI, M.; SAKAKI, Y. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc Natl Acad Sci USA, 98 (8), 4569–4574, 2001. ITO, T.; OTA, K.; KUBOTA, H.; YAMAGUCHI, Y.; CHIBA, T.; SAKURABA, K.; YOSHIDA, M. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1 (8), 561-6, 2002.
146
ITOH, N.; ORNITZ, D. M. Evolution of the Fgf and Ffgr gene families. Trends Genet., 20(11), 563-569, 2004. JAYE, M.; SCHLESSINGER, J.; DIONNE, C. A. Fibroblast growth factor receptor tyrosine kinases: molecular analysis and signal transduction. Biochim Biophys Acta, 1135 (2), 185-99, 1992. JOHNSON, D. E.; WILLIAMS, L. T. Structural and functional diversity in the FGF receptor multigene family. Adv Cancer Res., 60, 1-41, 1993. JONES, D.T. GenTHREADER: an efficient and reliable protein fold recognition method for genomic sequences. J Mol Biol., 287(4), 797-815, 1999. KARLIN, S.; ALTSCHUL, S. F. Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes. Proc Natl Acad Sci U S A., 87(6), 2264-8, 1990. KIM, I.; MOON, S.; YU, K.; KIM, U.; KOH, G. Y. A novel fibroblast growth factor receptor-5 preferentially expressed in the pancreas. Biochim Biophys Acta., 1518(1-2), 152-6, 2001 KIMURA, E. & ARMELIN, H. A. Role of proto-oncogene c-Ki-ras amplification and overexpression in the malignancy of Y-1 adrenocortical tumor cells. Mol Endocrinol., 7 (11), 1463-71, 1993b. KIMURA, E.; FRIGERI, C. K.; ARMELIN, H. A. Relevance of c-fos proto-oncogene induction for the steroidogenic response to ACTH, dcAMP and phorbol ester in adrenocortical cells. Mol Cell Biochem., 124 (1), 23-32, 1993a. KIMURA, E.; SONOBE, M. H.; ARMELIN, M. C.; ARMELIN, H. A. Induction of FOS and JUN proteins by adrenocorticotropin and phorbol ester but not by 3',5'-cyclic adenosine monophosphate derivatives. Braz J Med Biol Res., 21 (2), 189-201, 1988. KUMAR, A.; SNYDER, M. Protein complexes take the bait. Nature, 415 (6868), 123-124, 2002. LASKOWSKI, R. A.; MACARTHUR, M. W.; THORNTON, J. M. Validation of protein models derived from experiment. Curr Opin Struct Biol, 8 (5), 631-9, 1998 LEPIQUE, A. P.; MORAES, M. S.; ROCHA. K. M.; EICHLER, C. B.; HAJJ, G. N. M.; SCHWINDT. T. T.; ARMELIN, H. A. c-Myc protein is stabilized by fibroblast growth factor 2 and destabilized by ACTH to control cell cycle in mouse Y1 adrenocortical cells. J Mol Endocrinol., 33 (3), 623-638, 2004. LEVINE, A. J.; HU, W.; FENG, Z. The P53 pathway: what questions remain to be explored? Cell Death and Differentiation, 13, 1027–1036, 2006.
147
LIM, K. H.; COUNTER, C. M. Reduction in the requirement of oncogenic Ras signaling to activation of PI3K/AKT pathway during tumor maintenance. Cancer Cell., 8(5), 381-92, 2005. LINDAHL, E.; HESS, B.; VAN DER SPOEL, D. GROMACS 3.0: a package for molecular simulation and trajectory analysis. J. Mol. Mod., 7, 306–317, 2001 LOTFI C.F.P., TODOROVIC Z., ARMELIN H.A. & SCHIMMER B.P. Unmasking a growth-promoting effect of the adrenocorticotropic hormone in Y1 mouse adrenocortical tumor cells. J Biol Chem., 272 (47), 29886-29891, 1997 LOTFI, C. F. P. & ARMELIN, H. A. cfos and cjun antisense oligonucleotides block mitogenesis triggered by fibroblast growth factor-2 and ACTH in mouse Y1 adrenocortical cells. J Endocinol., 168 (3), 381-389, 2001. LOWE, S. W.; CEPERO, E.; EVAN, G. Intrinsic tumour suppression.Nature, 432 (7015), 307-15, 2004. MACIP, S.; IGARASHI, M.; BERGGREN, P.; YU, J.; LEE, S. W.; AARONSON, S. A. Influence of induced reactive oxygen species in p53-mediated cell fate decisions. Mol Cell Biol., 23 (23), 8576-85, 2003. MEIER, B.; CROSS, A. R.; HANCOCK, J. T.; KAUP, F. J.; JONES, O. T. Identification of a superoxide-generating NADPH oxidase system in human fibroblasts. Biochem J. , 275(Pt 1), 241-5, 1991. MELLER, J.; ELBER, R. Linear programming optimization and a double statistical filter for protein threading protocols. Proteins, 45(3), 241-61, 2001. MIYAMOTO, C. A. Produção e caracterização de fibroblast growth factor (fgf) recombinante. 1992. 79p. Dissertação. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo, 1992. MOHAMMADI, M.; OLSEN, S. K.; IBRAHIMI, O. A. Structural basis for fibroblast growth factor receptor activation. Cytokine Growth Factor Reviews, 16 (2), 107-137, 2005. MOHAMMADI, M.; SCHLESSINGER, J.; HUBBARD, S. R. Structure of the FGF receptor tyrosine kinase domain reveals a novel autoinhibitory mechanism. Cell. 86 (4), 577-87, 1996. MOSCATELLI, D.; JOSEPH-SILVERSTEIN, J.; MANEJIAS, R.; RIFKIN, D. B. Mr 25,000 heparin-binding protein from guinea pig brain is a high molecular weight form of basic fibroblast growth factor. Proc Natl Acad Sci U S A., 84 (16), 5778-82, 1987. NEUFELD, G.; MITCHELL, R.; PONTE, P.; GOSPODAROWICZ, D. Expression of human basic fibroblast growth factor cDNA in baby hamster kidney-derived cells results in autonomous cell growth. J Cell Biol, 106 (4), 1385-94, 1988.
148
NICHOLSON, D. W.; THORNBERRY, N. A. Caspases: killer proteases. Trends Biochem Sci., 22 (8), 299-306, 1997. NILSSON, B.; ABRAHMSEN, L.; UHLEN, M. Immobilization and purification of enzymes with staphylococcal protein A gene fusion vectors. EMBO J., 4 (4), 1075-80, 1985. NORBURY, C.; NURSE, P. Animal cell cycles and their control. Annu Rev Biochem., 61, 441-70, 1991. NUGENT, M. A.; IOZZO, R.V. Fibroblast growth factor-2. Int J Biochem Cell Biol., 32 (2), 115-120, 2000. OLIVER, S. Guilt-by-association goes global. Nature, 403 (6770), 601-3, 2000. OLSEN, S. K.; GARBI, M.; ZAMPIERI, N.; ELISEENKOVA, A. V.; ORNITZ, D. M.; GOLDFARB, M.; MOHAMMADI, M. Fibroblast growth factor (FGF) homologous factors share structural but not functional homology to FGFs. J. Biol. Chem., 278, 34226–36, 2003. ORNITZ, D. M. FGF signaling in the developing endochondral skeleton. Cytokine Growth Factor Rev., 16 (2), 205-13, 2005. ORNITZ, D. M.; ITOH, N. Fibroblast Growth Factors. Genome Biol., 2(3), 3005.1-3005.12, 2001. ORTEGA, S.; ITTMANN, M.; TSANG, S. H.; EHRLICH, M.; BASILICO, C. Neuronal defects and delayed wound healing in mice lacking fibroblast growth factor 2. Proc Natl Acad Sci U S A., 95 (10), 5672-5677, 1998. OYAMA, S., JR.; KIYOTA, S.; MIRANDA, M. T. M.; GAMBARINI, A. G.; VIVIANI, W. Three-dimensional Model Structure for the Extracellular Domains of Fibroblast Growth Factor Receptor-1 (FGFR-1). J Mol Model., 3, 233-239, 1997. OYAMA, S., JR.; MIRANDA, M. T. M.; KIYOTA, S.; GAMBARINI, A. G. Molecular modeling as a powerful tool for the mapping of fibroblast growth factor receptor-1 ligand binding determinants. J Mol Model., 5, 90-96, 1999. PASQUALE, E. B.; SINGER, S. J. Identification of a developmentally regulated protein-tyrosine kinase by using anti-phosphotyrosine antibodies to screen a cDNA expression library. Proc Natl Acad Sci U S A., 86 (14), 5449-53, 1989. PATRY, V.; BUGLER, B.; AMALRIC, F.; PROME, J. C.; PRATS, H. Purification and characterization of the 210-amino acid recombinant basic fibroblast growth factor form (FGF-2). FEBS Lett, 349 (1), 23-8, 1994.
149
PHIZICKY, E.; BASTIAENS, P. I.; ZHU, H.; SNYDER, M; FIELDS, S. Protein analysis on a proteomic scale. Nature, 422 (6928), 208-215, 2003. PLOTNIKOV, A. N.; SCHLESSINGER, J.; HUBBARD, S. R.; MOHAMMADI, M. Structural Basis for FGF Receptor Dimerization and Activation. Cell, 98, 641–650, 1999. POPOVICI, C.; ROUBIN, R.; COULIER, F.; BIRNBAUM, D. An evolutionary history of the FGF superfamily. Bioessays., 27(8), 849-57, 2005. POWELL, P. P. & KLAGSBRUN, M. Three forms of rat basic fibroblast growth factor are made from a single mRNA and localize to the nucleus. J Cell Physiol., 148 (2), 202-10, 1991. POWERS, C. J.; MCLESKEY, S. W.; WELLSTEIN, A. Fibroblast growth factors, their receptors and signaling. Endocr Relat Cancer, 7 (3), 165-197, 2000. QUARTO, N.; FINGER, F.P.; RIFKIN, D.B. The NH2-terminal extension of high molecular weight bFGF is a nuclear targeting signal. J Cell Physiol., 147 (2), 311 –318, 1991. RAMACHANDRAN, G. N. & SASISEKHARAN, V. Conformation of polypeptides and proteins. Adv. Protein Chem., 23, 283-437, 1968. RE, R. N. The intracrine hypothesis and intracellular peptide hormone action. Bioessays. 25 (4), 401-409, 2003. RE, R. N.; COOK, J.L. The intracrine hypotesis: an update. Regul Pept., 133, 1-9, 2006. RENAULT, L.; NASSAR, N.; VETTER, I.; BECKER, J.; KLEBE, C.; ROTH, M.; WITTINGHOFER, A. The 1.7 A crystal structure of the regulator of chromosome condensation (RCC1) reveals a seven-bladed propeller. Nature, 392 (6671), 97-101, 1998. RENKO, M.; QUARTO, N.; MORIMOTO, T.; RIFKIN, D. B. Nuclear and cytoplasmic localization of different basic fibroblast growth factor species. J Cell Physiol., 144 (1), 108-14, 1990. RIFKIN, D. B.; MOSCATELLI, D. Recent developments in the cell biology of basic fibroblast growth factor. J Cell Biol., 109(1), 1-6, 1989. RIGAUT, G.; SHEVCHENKO, A.; RUTZ, B.; WILM, M.; MANN, M. & SÉRAPHIN B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotecnol., 17 (10), 1030-1032, 1999. RING, C. S.; COHEN, F. E. Modeling protein structures: construction and their applications. FASEB J., 7 (9), 783-90, 1993.
150
ROCHA, K. M.; FORTI, F. L.; LEPIQUE, A. P.; ARMELIN; H. A. Deconstructing the molecular mechanisms of cell cycle control in a mouse adrenocortical cell line: roles of ACTH. Microsc Res Tech., 61 (3), 268-274, 2003. ROGELJ, S., WEINBERG, R. A.; FANNING, P.; & KLAGSBRUN, M. Basic fibroblast growth factor fused to a single peptide transforms cells. Nature. 331, 173-175, 1988. ROUSSEAU, F.; BONAVENTURE, J.; LEGEAL-MALLET, L.; PELET, A.; ROZET, J-M;, MAROTEAUX, P.; LE MERRER, M.; MUNNICH, A. Mutations in the gene encoding fibroblast growth factor receptor-3 in achondroplasia. Nature, 371 (6494), 252–4, 1994. SAMANIEGO, F.; MARKHAM, P. D.; GENDELMAN, R.; WATANABE, Y.; KAO, V.; KOWALSKI, K.; SONNABEND, J. A.; PINTUS, A.; GALLO, R. C.; ENSOLI, B. Vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor present in Kaposi's sarcoma (KS) are induced by inflammatory cytokines and synergize to promote vascular permeability and KS lesion development. Am J Pathol.., 152 (6), 1433-43, 1998. SASADA, R.; KUROKAWA, T.; IWANE, M.; IGARASHI, K. Transformation of mouse BALB/c 3T3 cells with human basic fibroblast growth factor cDNA. Mol Cell Biol., 8(2), 588-94, 1998. SCHIMITT, C. A. Senescence, apoptosis and therapy – cutting the lifelines of cancer. Nat Rev Cancer, 3 (4), 286-95 , 2003. SCHWAB, M.; ALITALO, K.; VARMUS, H. E.; BISHOP, J. M.; GEORGE, D. A cellular oncogene (c-Ki-ras) is amplified, overexpressed, and located within karyotypic abnormalities in mouse adrenocortical tumour cells. Nature, 303 (5917), 497-501, 1983. SCHWINDT, T.T.; FORTI, F.L.; JULIANO, M.A.; JULIANO, L.; ARMELIN, H.A. Arginine vasopressin inhibition of cyclin D1 gene expression blocks the cell cycle and cell proliferation in the mouse Y1 adrenocortical tumor cell line. Biochemistry, 42 (7), 10133-40, 2003. SHEN, B., ARESE, M., GUALANDRIS, A., RIFKIN, D.B. Intracellular association of FGF-2 with the ribosomal protein L6/TAXREB107. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 524–528, 1998. SHENG, Z.; LIANG, Y.; LIN, C. Y.; COMAI, L.; CHIRICO, W. J. Direct regulation of rRNA transcription by fibroblast growth factor 2. Mol Cell Biol, 25 (21), 9419-26, 2005. SHERWOOD, S. W.; RUSH, D.; ELLSWORTH, J. L; SCHIMKE, R. T. Defining cellular senescence in IMR-90 cells: a flow cytometric analysis. Proc Natl Acad Sci U S A, 85 (23), 9086-90, 1988.
151
SHIANG, R.; THOMPSON, L. M.; ZHU, Y. Z.; CHURCH, D. M.; FIELDER, T. J.; BOCIAN, M.; WINOKUR, S. T.; WASMUTH, J. J. Mutations in the transmembrane domain of FGFR3 cause the most common genetic form of dwarfism, achondroplasia. Cell, 78 (2), 335–42, 1994. SHING, Y.; FOLKMAN, J.; SULLIVAN, R.; BUTTERFIELD, C.; MURRAY, J.; KLAGSBRUN, M. Heparin affinity: purification of a tumor-derived capillary endothelial cell growth factor. Science, 223(4642):1296-9, 1984. SLEEMAN, M.; FRASER, J.; MCDONALD, M.; YUAN, S.; WHITE, D.; GRANDISON, P.; KUMBLE, K.; WATSON, J. D.; MURISON, J. G. Identification of a new fibroblast growth factor receptor, FGFR5. Gene, 271 (2), 171-82, 2001. SMALLWOOD, P. M.; MUNOZ-SANJUAN, I.; TONG, P.; MACKE, J. P.; HENDRY, S. H.; GILBERT, D. J.; COPELAND, N. G.; JENKINS, N. A.; NATHANS, J. Fibroblast growth factor (FGF) homologous factors: new members of the FGF family implicated in nervous system development. Proc Natl Acad Sci U S A, 93 (18), 9850-7, 1996. SOULET, F., AL SAATI, T., ROGA, S., AMALRIC, F., BOUCHE, G. Fibroblast growth factor-2 interacts with free ribosomal protein S19. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, 591–596, 2001. SOULET, F.; BAILLY, K.; ROGA, S.; LAVIGNE, A. C.; AMALRIC, F.; BOUCHE, G. Exogenously added fibroblast growth factor 2 (FGF-2) to NIH3T3 cells interacts with nuclear ribosomal S6 kinase 2 (RSK2) in a cell cycle-dependent manner. J Biol Chem, 280 (27), 25604-10, 2005. STAUBER, D. J.; DIGABRIELE, A. D.; HENDRICKSON, W. A. Structural interaction of fibroblast growth factor receptor with its ligands. Proc Natl Acad Sci USA., 97 (1), 49-54, 2000. SUNDARESAN, M.; YU, Z. X.; FERRANS, V. J.; IRANI, K.; FINKEL, T. Requirement for generation of H202 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science, 270 (5234), 296-299, 1995. SZATROWSKI, T. P.; NATHAN, C.F. Production of large amounts of hydrogen peroxide by human tumor cells. Cancer Res., 51(3), 794-8, 1991. TAKAHASHI, J. A.; FUKUMOTO, M.; IGARASHI, K.; ODA, Y.; KIKUCHI, H.; HATANAKA, M. Correlation of basic fibroblast growth factor expression levels with the degree of malignancy and vascularity in human gliomas. J Neurosurg., 76 (5), 792-8, 1992. TERPE, K. Overview of tag protein fusions from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems). Appl Microbiol Biotechnol, 60 (5), 523–533, 2003.
152
TESSLER, S. & NEUFELD, G. Basic fibroblast growth factor accumulates in the nuclei of various bFGF-producing cell types J Cell Physiol., 145 (2), 310-7, 1990. THANNICKAL, V.J., DAY. R. M.; KLINZ, S. G.; BASTIEN, M. C.; LARIOS, J. M.; FANBURG, B. L. Ras-dependent and -independent regulation of reactive oxygen species by mitogenic growth factors and TGF-β1. FASEB J. , 14 (12), 1741–1748, 2000. UETZ, P.; DONG, Y. A.; ZERETZKE, C.; ATZLER, C.; BAIKER, A.; BERGER, B.; RAJAGOPALA, S. V.; ROUPELIEVA, M.; ROSE, D.; FOSSUM, E.; HAAS, J. Herpesviral protein networks and their interaction with the human proteome. Science, 311 (5758), 239-42, 2006. UETZ, P.; GIOT, L.; CAGNEY, G.; MANSFIELD, T. A.; JUDSON, R. S.; KNIGHT, J. R.; LOCKSHON, D.; NARAYAN, V.; SRINIVASAN, M.; POCHART, P.; QURESHI-EMILI, A.; LI, Y.; GODWIN, B.; CONOVER, D.; KALBFLEISCH, T.; VIJAYADAMODAR, G.; YANG, M.; JOHNSTON, M.; FIELDS, S.; ROTHBERG, J. M. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature, 403 (6770), 623-7, 2000. UHLEN, M.; NILSSON, B.; GUSS, B.; LINDBERG, M.; GATENBECK, S.; PHILIPSON, L. Gene fusion vectors based on the gene for staphylococcal protein A. Gene, 23(3), 369-78, 1983. VAN DEN BERGHE, L.; LAURELL, H.; HUEZ, I.; ZANIBELLATO, C.; PRATS, H.; BUGLER, B. FIF wfibroblast growth factor-2 (FGF-2)-interacting-factorx, a nuclear putatively antiapoptotic factor, interacts specifically with FGF-2. Mol. Endocrinol., 14, 1709–1724, 2000. VIDALAIN, P. O.; BOXEM, M.; GE, H.; LI, S.; VIDAL, M. Increasing specificity in high-throughput yeast two-hybrid experiments. Methods, 32 (4), 363-70, 2004. VON MERING, C.; KRAUSE, R.; SNEL, B.; CORNELL, M.; OLIVER, S. G.; FIELDS, S.; BORK, P. Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions. Nature, 417 (6887), 399-403, 2002. WATKINS, S.J.; NORBURY, C. J. Cell cycle-related variation in subcellular localization of eIF3e/INT6 in human fibroblasts. Cell Prolif., 37, 149-60, 2004. YAMAGUCHI, J. P. E ROSSANT , J. Fibroblast growth factor in mammalian development. Curr Opin Genet Dev.,4, 485-491, 1995. YAMAMOTO, T.; TAYA, S.; KAIBUCHI, K. Ras-induced transformation and signaling pathway. J Biochem (Tokyo), 126 (5), 799-803, 1999. YASUMURA, Y.; BUONASSISI, V.; SATO, G. Clonal analysis of differentiated function in animal cell cultures. I. Possible correlated maintenance of differentiated function and the diploid karyotype. Cancer Res., 26 (3), 529-35, 1996.
153
YAYON, A.; KLAGSBRUN, M.; ESKO, J. D.; LEDER, P.; ORNITZ, D. M. Cell surface, heparin-like molecules are required for binding of basic fibroblast growth factor to its high affinity receptor. Cell, 64(4), 841-8, 1991. ZHANG, J. D.; COUSENS, L. S.; BARR, P. J.; SPRANG, S. R. Three-dimensional structure of human basic fibroblast growth factor, a structural homolog of interleukin 1 beta. Proc Natl Acad Sci USA, 88 (8), 3446-50, 1991. ZHANG, X.; IBRAHIMI, O. A.; OLSEN, S. K.; UMEMORI, H.; MOHAMMADI, M.; ORNITZ, D. M. Receptor specificity of the fibroblast growth factor family. J Biol Chem., 281(23), 15694-15700, 2006a. ZHANG, X.; STAPPENBECK, T. S.; WHITE, A. C.; LAVINE, K. J.; GORDON, J. I.; ORNITZ, D. M. Reciprocal epithelial-mesenchymal FGF signaling is required for cecal development. Development., 133 (1), 173-80, 2006b. ZHU, X.; KOMIYA, H.; CHIRINO, A.; FAHAM, S.; FOX, G. M.; ARAKAWA, T.; HSU, B. T.; REES, D. C. Three-dimensional structures of acidic and basic fibroblast growth factors. Science, 251 (4989), 90-3, 1991.
154
SÚMULA CURRICULAR
Alexandre Dermargos Oliveira
Nascido a 14/10/1971 em Barueri-SP, Brasil
e-mail [email protected]; [email protected]
FORMAÇÃO ACADÊMICA
Doutoramento direto em Bioquímica, Biologia Celular e Molecular junto ao Grupo de Pesquisa
de Fatores de Crescimento, Hormônios e Ciclo Celular. Instituto de Química (IQ) – USP.
Título do trabalho: FGF-2: estudo de estrutura e função.
Orientador: Prof. Dr. Hugo A. Armelin.
Ingresso em 2001 e conclusão em 2007.
Graduação em Farmácia e Bioquímica – Modalidade Fármacos e Medicamentos
USP (Universidade de São Paulo)
São Paulo – SP
Ingresso em 1995 e curso concluído em 2000
Graduado em Tecnologia Mecânica – Modalidade Projetos
FATEC – SP (Faculdade de Tecnologia de São Paulo)
São Paulo – SP
Ingresso em 1990 e curso concluído em 1993
E.E.P.S.G. Prof. Fidelino de Figueiredo
São Paulo – SP
Ensino fundamental (antigo 1º grau) concluído em 1985
Ensino médio (antigo 2º grau) concluído em 1988
VINCULO PROFISSIONAL
Técnico de Laboratório, Instituto de Química da Universidade de São Paulo. Desde março de
1997 até o presente.
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TRABALHOS COMPLETOS
PUBLICADOS EM PERIÓDICO
OIKAWA, M. K., BROINIZI, M. E. B., DERMARGOS, A., ARMELIN, H. A. & FERREIRA, J. E.
– GenFlow: Generic flow for integration, management and analysis of molecular biology
data. Genetics and Molecular Biology 2004, 27 (4) 691-695.
SUBMETIDOS A PERIÓDICO
HATANAKA, E., DERMARGOS, A., HIRATA, A. E., CARPINELLI, A. R., ARMELIN, H. A.,
NEWSHOLME, P. & CURI, R. - Oleic, linoleic and γ-linolenic acids increase ROS production by
fibroblast through NADPH oxidase system.
EM PREPARAÇÃO
DERMAGOS, A., HATANAKA, E.; ARMELIN, H. A.; CURI, R.; CAMPA, A. SAA effect on
fibroblasts ROS production and proliferatin.
PUBLICADOS EM ANAIS DE EVENTOS
DERMARGOS, A., SILVA, T. C. L., ZANCHIN, N. I. T. & ARMELIN, H. A. – “Analysis of FGF-
2-intracellular protein complexes.” XXXIV Reunião Anual da SBBq (Sociedade Brasileira de
Bioquímica e Biologia Molecular).
Águas de Lindóia, SP; 02-05 de julho de 2005.
DERMARGOS, A., CAMPA, A., ARMELIN, H. A. & HATANAKA, E. – “Serum Amyloid A (SAA)
an inductor of fibroblast cells proliferation” XX Reunião Anual da Federação de Sociedades de
Biologia Experimental – Fesbe.
Águas de Lindóia, SP; 24-27 de agosto de 2005.
156
OLIVEIRA, A. D; FAVARO, E. C.; ROCHA, F. R.; GONÇALVES, L. M.; VON DANNECKER, L. E.
C., CEOLIN, M. C. M.; MAJUMDER, P.; MOURA, S. P. & TORRES, B. B. - “Análise crítica com
bases científicas - Uma experiência de formação de professores envolvendo química” I
Encontro Paulista de Pesquisa em Ensino de Química .
Campinas - SP, 17 e 18 setembro de 2004.
OLIVEIRA, A. D.; BAPTISTA, C. S.; OIKAWA, M. K.; BROINIZI, M. E. B.; FERREIRA, J. E.;
ARMELIN, H. A. and ZINGALES, B. – “CAGEDB: Building Microarray Experiments Through
Sequence Database Analysis” I ICoBiCoBi – 1st. International Conference on Bioinformatics
and Computational Biology.
Ribeirão Preto, SP, 14-16 de maio de 2003 .
OLIVEIRA, A. D.; OYAMA JR., S.; SPISNI, A.AND ARMELIN, H. A. – “Fibroblast growth
factors structure-function relationship” XIII Reunião Anual de Usuários do LNLS (Laboratório
Nacional de Luz Síncrotron).
Campinas, SP, 17-18 de fevereiro de 2003.
OLIVEIRA, A. D.; OYAMA JR., S. AND ARMELIN, H. A. - "Fibroblast growth factors
structure-function relationship” XXXI Reunião Anual da SBBq (Sociedade Brasileira de
Bioquímica e Biologia Molecular).
Caxambu, MG, 18-21 de maio de 2002.
CANONINE, N.A.S.; SUENAGA, E.M.; ALBUQUERQUE, R.; OLIVEIRA, A.D. E YASAKA, W.J. –
“Bioequivalência das formulações cápsula e comprimido de piroxican ciclo-β-dextrina” II
Congresso do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo “Jubileu de
Prata”.
São Paulo, SP, 27-29 de novembro de 1996.