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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
PATRICIA XAVIER LIMA GOMES
ABRASAMENTO INDUZIDO POR NICOTINA: ESTUDO DA PROGRESSÃO
TEMPORAL E INFLUÊNCIA DO SEXO NAS ALTERAÇÕES
NEUROQUÍMICAS EM RATOS PERIADOLESCENTES
FORTALEZA/CE
2016
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PATRICIA XAVIER LIMA GOMES
ABRASAMENTO INDUZIDO POR NICOTINA: ESTUDO DA PROGRESSÃO
TEMPORAL E INFLUÊNCIA DO SEXO NAS ALTERAÇÕES
NEUROQUÍMICAS EM RATOS PERIADOLESCENTES
Tese submetida à Coordenação do
Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia, da Universidade Federal
do Ceará, como requisito parcial para
obtenção do grau de Doutor em
Farmacologia.
Orientadora: Dra. Danielle Macêdo
Gaspar
FORTALEZA/CE
2016
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PATRICIA XAVIER LIMA GOMES
ABRASAMENTO INDUZIDO POR NICOTINA: ESTUDO DA PROGRESSÃO
TEMPORAL E INFLUÊNCIA DO SEXO NAS ALTERAÇÕES
NEUROQUÍMICAS EM RATOS PERIADOLESCENTES
Tese apresentada a Coordenação do Programa de Pós-graduação em Farmacologia
como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Farmacologia.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________
Profa. Dra. Danielle Macêdo Gaspar (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará - UFC
______________________________________________________
Prof. Dr. Jair Guilherme dos Santos Júnior
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
______________________________________________________
Prof. Dr. Vasco Pinheiro Díogenes Bastos
Centro Universitário Estácio do Ceará - ESTÁCIO
______________________________________________________
Prof. Dr. Eduardo Ribeiro Honório Júnior
Centro Universitário Christus (UNICHRISTUS)
______________________________________________________
Profa. Dra. Mariana Lima Vale
Universidade Federal do Ceará - UFC
5
À minha mãe, por todas as renúncias, em prol
de mais um degrau atingido em minha vida;
por todas as orações, por todas as suas
palavras de fé e ‘siga em frente’, que me
fizeram chegar até aqui.
6
AGRADECIMENTOS
À DEUS, por ser o meu refúgio e minha fonte de força nos momentos felizes e adversos
encontrados ao longo desta caminhada;
À minha tão amada Mãe, Mairtes Xavier, por ter abdicado durante muito tempo de seus
sonhos em prol da realização profissional de seus filhos. Nada que eu faça poderá
recompensar tão sublime amor;
Ao meu pai e meus irmãos, Evandro Teixeira, Ana Karolinne e Evandro Júnior, por
formarem a base familiar que sempre precisei;
Ao meu noivo Marcelo, por ser tão presente e incentivar-me na busca por novos
horizontes;
À minha orientadora Danielle Macedo Gaspar, na qual tive a oportunidade de conviver
academicamente por todos estes anos, sendo inspiração para todos que seus orientandos;
À minha banca de qualificação: Professores Vasco Diógenes, Marta do Carmo,
Emiliano Vasconcelos por terem corrigido com tanto empenho e contribuído de forma
engrandecedora para a finalização deste trabalho;
Aos professores Jair Guilherme, Vasco Diógenes, Eduardo Ribeiro e Mariana Vale, por
terem aceitado participar da minha banca de defesa de tese e pela grande contribuição
neste trabalho;
Ao meu braço direito e esquerdo Fernanda Yvelize e Gersilene, por toda a ajuda nos
experimentos e pela amizade verdadeira em todas as horas;
Aos meus amigos que conheci através da bancada, por toda a ajuda nos experimentos e
pelas conversas descontraídas: Adriano, Taciana, Alyne Mara, Leonardo, Vládia,
Isabelle, Adriana, Rafaela, Germana, Roberta, Tatiane.
Aos técnicos do laboratório que põem ordem em nossa casa científica: Vilani e Lena;
À profa. Mariana Vale e sua orientanda Anamaria, que sempre se mostraram tão
acessíveis e dispostas a auxiliar na execução de parte metodológica deste trabalho;
Aos professores do laboratório de neuropsicofarmacologia pelos conhecimentos
repassados: profa. Glauce, profa. Silvania, profa. Cléa, profa. Geanne, prof. David;
Aos professores do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, pela contribuição na
construção da minha formação como docente;
Às agencias de fomento à pesquisa: CNPq e CAPES;
E a todos que direta ou indiretamente, contribuíram para a finalização deste ciclo.
Muito Obrigada!!!
7
“Enquanto mais me aprofundo nas ciências,
mais me aproximo de Deus.”
Albert Einstein
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RESUMO
O abrasamento tem sido usado classicamente como um modelo experimental para a
epilepsia do lobo temporal. Nas últimas décadas, tem sido também usado para
conceituar os mecanismos gerais envolvidos na progressão de uma vasta gama de
desordens neuropsiquiátricas. O modelo de abrasamento pode ser induzido por
estimulação sublimiar elétrica ou química. Recentemente, o abrasamento induzido por
nicotina (NIC) foi caracterizado farmacologicamente e histologicamente, abrindo
perspectivas para melhor compreender os efeitos comportamentais e neuroquímicos da
NIC na neuroprogressão envolvida no fenômeno do abrasamento. Neste contexto, foram
atribuídos efeitos relevantes dependentes do sexo na neurobiologia do abrasamento
induzido pó NIC, cujos mecanismos não foram totalmente elucidados. Baseado nisto, o
presente estudo objetivou investigar a progressão temporal e influência do sexo nas
alterações neuroquímicas do abrasamento induzido por NIC em ratos periadolescentes.
Ratos Wistar machos e fêmeas periadolescentes (35-37dias) receberam administração
repetida de NIC 2.0 mg/kg, intraperitonealmente, de segunda à sexta-feira. Animais
controle receberam solução salina. As convulsões foram avaliadas de acordo com a
escala de Racine nos dias 1, 10, 19, 22, 24 e 25 de administração de NIC. Trinta
minutos após a administração de NIC nos dias 1, 10 e 19 para fêmeas e 1, 10 e 25 para
os machos, os animais foram eutanasiados e as áreas cerebrais, corpo estriado (CE) e
hipocampo (HC), dissecadas para determinações neuroquímicas e imunofluorescência.
As fêmeas apresentaram maior susceptibilidade ao desenvolvimento do abrasamento
quando comparado aos machos, apresentando estágio 5 de convulsões no 19° dia de
administração de NIC, enquanto os machos apresentaram o mesmo estágio no 24º dia.
Em relação a mortalidade dos animais, as fêmeas foram mais susceptíveis aos efeitos
tóxicos da NIC com 75% de mortes neste grupo. Em relação aos níveis plasmáticos de
17β-estradiol não houve diferenças entre machos e fêmeas tratados com NIC e salina. O
conteúdo de dopamina (DA) e de seus metabólitos, DOPAC e HVA, em CE de machos
se apresentaram aumentados no 1° dia de administração de NIC, seguida por redução
destes níveis na progressão do abrasamento. Nas fêmeas, os níveis de DOPAC
reduziram quando comparado aos controles no 1° dia de tratamento com NIC,
entretanto aumentando significativamente no abrasamento. Ao passo que, os níveis de
HVA estavam reduzidos no abrasamento. No HC, os níveis de DA e metabólito nos
machos estavam reduzidos em relação aos controles no 1° dia de indução do fenômeno
e mantendo-se diminuídos no abrasamento. Quanto ao conteúdo de NE, mostrou-se
elevado em HC de fêmeas ao comparar-se aos machos no abrasamento. De modo
semelhante, a atividade da enzima acetilcolinesterase e a imunoexpressão de p-NR1 e p-
CREB estavam elevados no CE em relação aos machos no abrasamento. Por fim, as
fêmeas tratadas com NIC no abrasamento apresentaram concentrações elevadas de
BDNF no CE em relação aos controles e ratos machos. Portanto, o presente estudo
demonstrou que as fêmeas são mais susceptíveis ao fenômeno do abrasamento. Além
disso, baseado em nossos resultados, sugerimos que esta vulnerabilidade diferencial é
devido ao aumento da excitabilidade neuronal, e consequentemente, dano celular
durante a progressão temporal do abrasamento.
Palavras-chave: abrasamento, nicotina, diferenças sexuais, periadolescência
9
ABSTRACT
NICOTINE-INDUCED KINDLING: STUDY OF TEMPORAL PROGRESSION AND
SEX INFLUENCE IN NEUROCHEMICAL CHANGES IN PERIODOLESCENT
RATS
Kindling classically was used as an experimental model of temporal lobe epilepsy. In
the last decades, it has also been used to conceptualize the general mechanisms involved
in the progression of a wide range of neuropsychiatric disorders. Kindling model can be
induced by subthreshold electrical and chemical stimulus. Recently, nicotine (NIC)-
induced kindling was pharmacologically and histologically characterized, opening
perspectives to better understand the neurochemical and behavioral effects of NIC in the
neuroprogressive course involved in kindling phenomenon. In this context, relevant sex-
dependent effects have been attributed in neurobiology of NIC-induced kindling, whose
mechanisms has not been fully clarified. Therefore, the present study aimed to
investigate the temporal progression and influence of sex of neurochemical alterations
induced by NIC kindling model in periadolescent rats. Male and female Wistar rats
(aging 35-37 days) received repeated intraperitoneal NIC 2.0 mg / kg administration,
from Monday to Friday. Control animals received saline administration. The seizures
were evaluated by Racine Scale on the days 1, 10, 19, 22, 24 and 25 NIC
administrations. Thirty minutes after NIC administration on the days 1, 10 and 19 for
females and 1, 10 and 25 for males, the animals were euthanized and their brain areas,
striatum (ST) and hippocampus (HC) were dissected for neurochemical analysis and
immunofluorescence. Female animals showed greater susceptibility to the development
of kindling when compared to males, presenting stage 5 of seizures on 19th day of NIC
administration, while males presented the same stage on 24th day. In relation to animal
mortality, females were more vulnerable to the NIC toxic effects, presenting 75% of
mortality. Regarding plasma levels of 17β-estradiol, there were no differences between
males and females treated with NIC or saline. The content of dopamine (DA) and its
metabolites, DOPAC and HVA, in ST of males were higher on the 1st day of NIC
administration compared to controls, followed by reduction on the kindling progression
course. In females, DOPAC levels was reduced on the 1st day of NIC treatment,
compared to controls, however it increased in the kindling. Contrarily, HVA levels
reduced in the kindling. In HC, DA levels and its metabolites were lower in male
animals on the 1st day of NIC treatment compared to controls, and remaining reduced in
the kindling. Regarding NE content, it was higher in female HC when compared to
males in kindling model. Similarly, the activity of the acetylcholinesterase enzyme and
the immunoexpression of p-NR1 and p-CREB were higher in female NIC-kindling in
ST related to males. Finally, NIC-kindling females presented higher BDNF levels in ST
compared to NIC-kindling males and control females. Therefore, the present study
demonstrated that female animals are more vulnerable to kindling phenomenon.
Further, based on our results, we suggested that this differential vulnerability was due to
an increase in neuronal excitability and consequently cell damage during the kindling
temporal progression.
Key words: kindling, nicotine, sex differences, periadolescence
10
ABREVIATURAS
μamp – microàmpere
μl – microlitro
μM – micromolar
ºC – grau Celsius
ACh – acetilcolina
AChE – acetilcolinesterase
AMPA – ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazole-propionico
AMPc – adenosina 3',5'-monofosfato cíclico
ATC – acetiltiocolina
ATV – área tegmental ventral
BDNF – fator neurotrófico derivado do cérebro
BSA – albumina de soro bovino
Ca2+ – cálcio
CE – corpo estriado
CID-10 – Classificação Internacional de Doenças e Problemas relacionados à Saúde
CPF – córtex pré-frontal
CYP 450 – citocromo P 450
DA – dopamina
DAPI – 4 ',6-diamino-2-fenilindol
DOPAC – ácido 3,4-di-hidroxifenilacético
DTNB – ácido ditiobisnitrobenzóico
EEG – eletroencefalograma
ELT – Epilepsia do Lobo Temporal
EPM – erro-padrão da média
FGF-2 – fator de crescimento de fibroblasto tipo 2
g – grama
GABA – ácido γ-aminobutírico
iGluRs – receptores glutamatérgicos ionotrópicos
i.p – intraperitoneal
HC – hipocampo
11
HPLC – Cromatografia líquida de alta performance
HVA – ácido homovanílico
mGluRs – receptores glutamatérgicos metabotrópicos
NAC – núcleo accumbens
nAChR – receptor colinérgico nicotínico
nAChRs – receptores colinérgicos nicotínicos
NGF – fator de crescimento do nervo
NIC – nicotina
NMDA – N-metil-D-aspartato
p-CREB – proteína fosforilada de ligação ao elemento de resposta ao AMPc
PD – pós-descarga
PKA – fosfo-quinase A
PKC – fosfo-quinase C
PTZ – pentilenotetrazol
rpm – rotação por minuto
SNC – Sistema Nervoso Central
s.c. – subcutâneo
TH – tirosina hiroxilase
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Localização do complexo amigdalóide no rato para a
implantação de eletrodo.
19
Figura 2: Estruturas do sistema límbico. 23
Figura 3: Espécies vegetais que dão origem à nicotina. 23
Figura 4: Estrutura química da nicotina. 27
Figura 5: Delineamento experimental da análise comportamental no
presente estudo.
38
Figura 6: Delineamento experimental das metodologias utilizadas no
presente estudo.
39
Figura 7: Equipamento de High Performance Liquid Chromatograpy
(HPLC) eletroquímico.
42
Figura 8: Desenvolvimento do abrasamento induzido por nicotina em
ratos machos e fêmeas, periadolescentes e adultos, de acordo com o
estágio 5 da escala de convulsão de Racine (1972).
48
Figura 9: Percentual de sobrevivência dos animais submetidos ao
abrasamento induzido por nicotina.
49
Figura 10 – Níveis plasmáticos sanguíneos de 17β-estradiol de animais
machos e fêmeas submetidos ao abrasamento por nicotina.
51
Figura 11: Níveis de DA no corpo estriado de animais machos e fêmeas ao
longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
53
Figura 12: Níveis de DA no hipocampo de animais machos e fêmeas ao
longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
54
Figura 13: Níveis de DOPAC no corpo estriado de animais machos e
fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
56
Figura 14: Níveis de DOPAC no hipocampo de animais machos e fêmeas
ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina
57
Figura 15: Níveis de HVA no corpo estriado de animais machos e fêmeas
ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
59
Figura 16: Taxas de metabolização dos neurotransmissores DOPAC/DA
(A) e HVA/DA (B) em corpo estriado de animais machos e fêmeas ao
13
longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina 61
Figura 17: Taxas de metabolização dos neurotransmissores DOPAC/DA
no hipocampo de animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento
do abrasamento por nicotina.
62
Figura 18: Níveis de NE no corpo estriado de animais machos e fêmeas ao
longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
64
Figura 19: Níveis de NE no hipocampo de animais machos e fêmeas ao
longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
65
Figura 20: Atividade da enzima Acetilcolinesterase no corpo estriado de
animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento
por nicotina.
67
Figura 21: Atividade da enzima Acetilcolinesterase no hipocampo de
animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento
por nicotina.
68
Figura 22: Fotomicrografia da imunoexpressão de p-NR1 e p-CREB no
corpo estriado de ratos machos induzidos ao abrasamento por nicotina.
70
Figura 23: Fotomicrografia da imunoexpressão de p-CREB e p-NR1 no
corpo estriado de ratos fêmeas induzidas ao abrasamento por nicotina.
71
Figura 24: Imunoexpressão da subunidade NR1 fosforilado (p-NR1) do
receptor glutamatérgico NMDA em corpo estriado de animais machos e
fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
72
Figura 25: Imunoexpressão da proteína de ligação ao Elemento de
Resposta ao AMPc fosforilada (p-CREB) em corpo estriado de animais
machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por
nicotina.
73
Figura 26: Níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em
corpo estriado de animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento
do abrasamento por nicotina.
75
Figura 27: Níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em
hipocampo de animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do
abrasamento por nicotina.
76
Figura 28: Desenho do mecanismo sugerido à susceptibilidade das fêmeas
ao desenvolvimento do abrasamento por NIC.
89
14
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Grupos de tratamento no desenvolvimento do abrasamento por
NIC e metodologias analisadas.
38
Tabela 2: Caracterização dos estágios de comportamento para convulsão, de
acordo com Racine (1972).
40
15
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 18
1.1 Abrasamento 18
1.1.1 Histórico 19
1.1.2 Mecanismos gerais envolvidos no abrasamento 20
1.2 Abrasamento no estudo dos transtornos neuropsiquiátricos 22
1.2.1 Epilepsia do Lobo Temporal e Abrasamento 22
1.2.2 Transtornos psiquiátricos e Abrasamento 24
1.3 Nicotina 25
1.3.1 Características farmacológicas da nicotina 25
1.3.2 Efeitos da nicotina no Sistema Nervoso Central 27
1.3.3 Papel da nicotina no sistema monoaminérgico 28
1.3.4 Papel da nicotina no sistema glutamatérgico 30
1.4 Diferenças sexuais quanto aos efeitos da nicotina 31
1.5 Modelo de abrasamento induzido por nicotina 32
1.6 Relevância e Justificativa 33
2 OBJETIVOS 36
2.1 Objetivo Geral 36
2.2 Objetivos Específicos 36
3 MATERIAIS E MÉTODOS 37
3.1 Animais 37
3.2 Droga utilizada 37
3.3 Estratégia experimental 37
3.4 Protocolo experimental I – Tratamento dos animais e esquema de indução
do abrasamento
40
3.5 Protoloco experimental II – Determinação dos níveis de 17β-estradiol em
plasma sanguíneo de animais induzidos ao abrasamento por nicotina
41
3.6 Protocolo experimental III – Testes bioquímicos 41
3.6.1 Dissecação das áreas cerebrais 41
3.6.2 Determinação dos níveis de monoaminas e seus metabólitos em animais
induzidos ao abrasamento por nicotina
41
16
3.6.3 Determinação da atividade da enzima Acetilcolinesterase (AChE)
durante o desenvolvimento do abrasamento por nicotina
43
3.6.4 Determinação dos níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro
(BDNF)
44
3.7 Protocolo experimental IV – Determinação da expressão da subunidade
NR1 fosforilada (p-NR1) do receptor glutamatérgico NMDA e da proteína
fosforilada de ligação ao Elemento de Resposta ao AMPc (p-CREB) por
imunofluorescência
44
3.8 Análise estatística 46
4 RESULTADOS 47
4.1 Avaliação do desenvolvimento do abrasamento induzido por nicotina em
ratos
47
4.2 Determinação dos níveis plasmáticos de 17β-estradiol em animais machos
e fêmeas submetidos ao abrasamento por nicotina
50
4.3 Determinação dos níveis de monoaminas 52
4.3.1 Determinação dos níveis de dopamina (DA) de animais machos e fêmeas
ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina
52
4.3.2 Determinação dos níveis do metabólito DOPAC de animais machos e
fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina
55
4.3.3 Determinação dos níveis do metabólito HVA de animais machos e
fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina
58
4.3.4 Determinação das taxas de metabolização DOPAC/DA e HVA/DA de
animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por
nicotina
60
4.3.5 Determinação dos níveis de noradrenalina (NE) de animais machos e
fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina
63
4.4 Determinação da atividade da enzima Acetilcolinesterase (AChE) em
animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por
nicotina
66
4.5 Determinação da expressão da subunidade NR1 fosforilada (p-NR1) do
receptor glutamatérgico NMDA e da proteína fosforilada de ligação ao
Elemento de Resposta ao AMPc (p-CREB) por imunofluorescência
69
4.6 Determinação dos níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro
17
(BDNF) em animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do
abrasamento por nicotina
74
5 DISCUSSÃO 77
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
7 CONCLUSÃO
88
89
REFERÊNCIAS 90
18
1 INTRODUÇÃO
1.1 Abrasamento
O abrasamento ou kindling é considerado um modelo experimental de
epilepsia progressiva, em que ocorre aumento permanente da propensão à convulsão
seguida por repetidas estimulações elétricas ou químicas em diversas áreas cerebrais,
em intensidade inicialmente incapaz de produzir qualquer resposta comportamental ou
convulsões (KANDRATAVICIUS et al., 2014).
A primeira descrição de abrasamento relatava um processo no qual a
atividade epileptiforme conhecida como pós-descarga (PD) podia ser desencadeada pela
estimulação elétrica ou química de estruturas cerebrais (RACINE; MCLNTYRE, 1986).
Goddard (1967) foi o primeiro a demonstrar que o abrasamento de áreas subcorticais,
por estímulos de baixa intensidade (50 μamp) a intervalos dispersos produziam um
aumento na susceptibilidade para crises ou episódios convulsivos pela diminuição do
limiar da convulsão. Portanto, o abrasamento resulta em modificações progressivas e
duradouras na responsividade neuronal que se manifestam pelo aumento na duração,
complexidade e propagação da PD a partir do local de estimulação, bem como na
progressão previsível da resposta convulsiva que o acompanha (GODDARD;
MCINTYRE; LEECH, 1969; RACINE, 1972).
O fenômeno do abrasamento é considerado um importante modelo no
estudo da epilepsia, visto que, uma vez estabelecido, as mudanças são tão persistentes
que mesmo um estímulo considerado fraco provocará uma convulsão
(KANDRATAVICIUS et al., 2014), assim, podendo tornar-se manifestações
comportamentais permanentes que relembram a gênese e progressão de algumas
desordens epilépticas, como a epilepsia do lobo temporal ou, de forma mais apropriada,
a convulsão parcial complexa (PINEL; ROVNER, 1978).
Exposição a estímulos repetidos originalmente inócuos ou sublimiares,
como fatores farmacológicos (drogas de abuso) ou ambientais (estresse emocional) pode
estar relacionado com o início de alterações comportamentais, visto que após um
número suficiente de exposições, uma progressão à espontaneidade poderá ocorrer
desencadeando em processos patológicos (KRAUS, 2000). Assim, o modelo de
abrasamento é uma ferramenta valiosa para contextualizar os mecanismos gerais
envolvidos em uma variedade de transtornos neuropsiquiátricos que apresentam
19
sintomas recorrentes e cíclicos (POST, 2007), como transtornos de humor, ansiedade,
transtornos obssessivo-compulsivos e toxicodependência (POST, 2002).
Apesar do abrasamento induzido por NIC ter sido inicialmente estudado por
Bastlund et al. (2005), que demonstrou sua relação com à ativação de receptores
nicotínicos α4β2 e α7, como também, receptores NMDA (DAMAJ et al., 1999), pouco
deste mecanismo e a influência do sexo na vulnerabilidade às convulsões induzidas por
nicotina foram elucidadas.
1.1.1 Histórico
O modelo de abrasamento foi inicialmente descrito por Goddard (1967), no
qual demonstrou que através de estimulações elétricas contínuas em limiares
subconvulsivantes (50 μamp), aplicados em estruturas cerebrais de ratos, resultavam no
aparecimento de um quadro progressivo de crises motoras generalizadas, evoluindo para
convulsões, semelhante aos sintomas de alguns tipos de epilepsia (MCINTYRE et al.,
2002; MORIMOTO et al., 2004). Os estímulos eram provenientes da implantação
profunda de eletrodos em regiões cerebrais específicas responsivas ao efeito do
abrasamento, que estendem-se do bulbo olfatório ao córtex entorrinal, incluindo região
septal e hipocampo, sendo a resposta mais expressiva na amígdala, entretanto, havendo
diferenças nos limiares de indução do abrasamento nestas áreas cerebrais (GORTER;
VLIET; SILVA, 2016) (Figura 1).
Figura 1: Localização do complexo amigdaloide no rato para a implantação de
eletrodo.
Fonte: http://www.multiciencia.unicamp.br/art05_3.htm
Acesso em: 25.07.2016
20
Em décadas recentes muitos outros métodos de abrasamento foram
introduzidos na pesquisa, dentre eles o abrasamento corneal (MATAGNE;
KLITGAARD, 1998; POTSCHKA; LOSCHER, 1999) e abrasamento químico por
compostos como picrotoxina, bicuculina (NUTT et al., 1982), cocaína (ITZHAK;
MARTIN, 2000; MILLER et al., 2000; POST; KOPANDA, 1975; POST; WEISS;
PERT, 1988) e pentilenotetrazol (ERDTMANN-VOURLIOTIS et al., 1998; LITTLE;
NUTT; TAYLOR, 1987). E mais recentemente um fenômeno similar foi descrito pela
retirada após intoxicação por etanol (GONZALEZ et al., 2001), mostrando assim que
não é apenas o estímulo químico ou elétrico que poderá causar abrasamento.
A maior parte das investigações deste fenômeno focou no hipocampo e
amígdala, ao passo que outras áreas cerebrais receberam muito menos atenção, embora
o abrasamento no corpo cingulado tenha sido estudado (LEUNG; BOON, 1990).
Entretanto, isto parece ter sido parcialmente devido ao fato de que as propriedades
anatômicas, celulares e moleculares do hipocampo e amígdala já são conhecidas
detalhadamente, fazendo com que as alterações neuronais associadas ao efeito do
abrasamento sejam mais fáceis de interpretar (GORTER; VLIET; SILVA, 2016).
1.1.2 Mecanismos gerais envolvidos no abrasamento
O modelo do abrasamento mostrou ser valioso para crises convulsivas
parciais complexas, seu desenvolvimento segue um padrão característico bem definido e
tem sido estudado por diferentes pesquisadores (RACINE, 1972). Duas características
principais do abrasamento devem ser mantidas: faz-se necessário ter uma convulsão
para o abrasamento ocorrer e a convulsão induzida não é espontânea. Este fenômeno é
de longa duração, uma vez que, quando o platô é atingido e mantido, existe uma
pequena queda na resposta ao abrasamento após períodos sem estimulação
(GODDARD; MCINTYRE; LEECH, 1969; HIYOSHI; WADA, 1992). A vantagem é
que se pode controlar a frequência, severidade e tempo de intervalo entre as crises
convulsivas, bem como testar o estado e atividade de vias envolvidas (GORTER;
VLIET; SILVA, 2016).
A progressão comportamental no desenvolvimento do abrasamento sugere
que ele começa com um número limitado de circuitos neuronais e, posteriormente,
estende-se para circuitos adicionais, correlacionando-se com o componente
comportamental de crises que evoluem para convulsões, ou seja, há recrutamento de
21
outras áreas cerebrais fora do foco estimulado, que são acompanhadas pela progressão
do estágio de convulsão comportamental envolvendo clônus unilateral e então bilateral
com rearing e queda do animal (BERTRAM, 2007; POST, 2007). O aumento da
duração destas crises sugere que a resistência existente dos circuitos para a atividade
convulsiva está também enfraquecida, mostrando que o abrasamento resulta em
mudanças na capacidade do cérebro em limitar as convulsões (BERTRAM, 2007).
A propensão progressiva ou redução do limiar para induzir convulsões que
está presente durante o abrasamento sugere que algumas alterações estruturais podem
ocorrer. Entretanto, um estudo sobre alterações estruturais ocorridas em ratos induzidos
ao abrasamento em regiões corticais anteriores não mostraram mudanças na ramificação
dendrítica e densidade espinal da região cortical analisada (RACINE et al., 1975).
Posteriormente, foram encontradas que, pelo menos nos neurônios piramidais da 3°
camada do córtex frontal podem ser observadas alterações dependentes do sexo e
tempo, como diminuição da densidade, comprimento e ramificação de dendritos apicais
e basais (TESKEY; HUTCHINSON; KOLB, 1999).
Em termos de mecanismo, este fenômeno tem mostrado causar uma
facilitação da plasticidade funcional atividade-dependente, e juntamente a este processo,
há uma indução espaço-temporal de genes imediatos como c-fos e de genes efetores
tardios incluindo neuropeptídeos, fatores neurotróficos e uma variedade de outros
compostos químicos envolvidos na síntese e liberação de neurotransmissores e ação no
receptor (POST; WEISS, 1992). Mudanças nas vias de sinalização intracelular, função
de neurotransmissores, expressão de canais de íons e morfologia neuronal e
ultraestrutural também têm sido correlacionadas (SATO et al., 1996).
Foi observado um aumento dos níveis de BDNF (fator neurotrófico
derivado do cérebro) no hipocampo, hipotálamo, neocórtex e corpo estriado, no qual
tem mostrado causar hiperexcitabilidade em cortes hipocampais (SATO et al., 1996),
relacionado também ao desenvolvimento do abrasamento, pois evidências mostram que
este requer a ativação do receptor de BDNF – tropomiosina cinase B (TrkB), através de
sinalização de fosfolipases específicas (KOTLOSKI; MCNAMARA, 2010); aumento
progressivo da densidade do receptor GABAA no giro denteado, e downregulation
aguda evoluindo para upregulation deste receptor em CA1 e CA3 (LIU et al., 2009);
aumento da expressão de canais iônicos de sódio Nav1.6 em CA3 causando um
aumento persistente na corrente de sódio, e provavelmente, contribuindo para a
excitabilidade exacerbada (BLUMENFELD et al., 2009).
22
Existem evidências que sugerem que convulsões límbicas em humanos
resultam no aumento das funções afetivas límbicas, em vez de supressão (ADAMEC,
1990). O intervalo de tempo, relativamente longo, entre o início da epilepsia do lobo
temporal e o início da comorbidade dos sintomas psiquiátricos sugerem que o dano de
estruturas-chave é necessário e que se acumula ao longo do tempo, sendo determinantes
para a soma de eventos neurobiológicos que, eventualmente, irá diminuir o limiar
psicopatológico de um estado psiquiátrico normal ou prodrômico (FUJII; AHMED,
2002; KANDRATAVICIUS et al., 2012).
1.2 Abrasamento no estudo dos transtornos neuropsiquiátricos
Os modelos de abrasamento em roedores têm contribuído para o
conhecimento do efeito da ocorrência de crises epilépticas de curta duração na
fisiopatologia da epilepsia do lobo temporal (KOTLOSKI et al., 2002; SAYIN et al.,
2003) e, além disto, podem ser de maior interesse para o estudo da plasticidade neuronal
em geral, visto que as modificações neuronais produzidas pelo abrasamento podem estar
associadas a modificações em outras funções não somente vinculadas a epilepsia
(funções não-epilépticas) ou comportamentais que dependem dos neurônios afetados
(LOSCHER et al., 2003).
1.2.1 Epilepsia do Lobo Temporal e Abrasamento
A epilepsia é uma condição crônica com um grande impacto na qualidade
de vida dos portadores, sendo sua prevalência de 0,5 a 1% em toda a população mundial
e que 75% dos casos começam antes da adolescência (NUNES et al., 2011). É uma das
doenças neurológicas mais comuns e cerca de 10% da população mundial já teve pelo
menos uma crise epiléptica ao longo de toda a sua vida (PERUCCA; TOMSOM, 2011).
É um distúrbio cerebral causado pela predisposição permanente do cérebro
em gerar crises epilépticas espontâneas, recorrentes, acompanhadas de consequências
neurobiológicas, cognitivas e sociais (FISHER et al., 2005). Dentre os fatores
causadores temos fatores genéticos, estruturais, metabólicos ou desconhecidos
(BARRAGAN, 2004).
Dados epidemiológicos mostram que o tipo mais frequente de crise em seres
humanos é a epilepsia de lobo temporal (ELT), sendo a forma mais comum de epilepsia
23
focal, responsabilizando-se por pelo menos 40-50% de todos os casos desta patologia
(GUERREIRO et al., 2000; YACUBIAN, 2004).
Este tipo de epilepsia é caracterizado por crises bastantes peculiares
denominadas “crises parciais complexas”. Os circuitos primariamente envolvidos na
ELT incluem estruturas do sistema límbico, particularmente o hipocampo e a amígdala
(Figura 2). Essas estruturas participam dos processos de memória e aprendizado e
encontram-se seriamente afetadas na ELT (YACUBIAN, 2004; GUERREIRO et al.,
2000). Na forma clássica, refere-se à esclerose do hipocampo, decorrente da perda
seletiva de neurônios e do processo de gliose que acompanha a perda celular, cuja
afecção ocorre na formação hipocampal. No entanto, têm sido descritos casos de ELT
sem esclerose hipocampal, com achados patológicos que afetam outras estruturas
mesiais temporais (amígdala e córtex entorrinal) e pólo temporal, que se denomina
“epilepsia límbica” (ENGEL, 2001; 2006). A ELT com esclerose hipocampal é
caracterizada por uma forte associação a crises febris, cujo desenvolvimento
progressivo se associa a uma resistência à terapêutica medicamentosa (CENDES et al.,
2002).
Figura 2: Estruturas do sistema límbico.
Fonte: The Limbic System Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc modificado
Acesso em: 25.07.2016
24
A esclerose hipocampal refere-se a uma perda neuronal variável e seletiva
nas regiões CA1 (Setor de Sommer), CA3 e no hilo, sendo uma das características
neuropatológicas mais importantes na ELT (MELDRUM; BRUTON, 1992). Há gliose
secundária, ou seja, alteração da substância branca, e atrofia da formação hipocampal
que pode atualmente ser identificada através de ressonância magnética de alta resolução.
A perda de neurônios hilares do giro denteado geralmente é evidente, sendo por vezes a
única anormalidade (nesse caso denominada esclerose do endfolium). Em casos mais
graves, além da esclerose, há perda neuronal também em locais extra-hipocampais,
como córtex entorrinal, giro para-hipocampal, amígdala, tálamo e cerebelo. Entretanto,
a perda celular fora do hipocampo não ocorre a menos que haja também perda neuronal
nesta área (MARGERISON; CORSELLIS, 1966).
Para entender as epilepsias, inúmeras abordagens têm sido feitas, tanto pelo
estudo do tecido epiléptico após remoção cirúrgica do foco epiléptico, bem como
através de estudos dos tecidos cerebrais provenientes de animais de laboratório que são
submetidos aos modelos experimentais de epilepsia (MODY; SCHWARTZKROIN,
1997; FERNANDES et al., 2013). A alta incidência de refratariedade na ELT em
humanos, bem como seu impacto na vida do indivíduo e na sociedade, tem compelido
pesquisadores no mundo a estudar sua fisiopatologia, o que torna estes modelos
particularmente relevantes e os mais utilizados são aqueles que mimetizam a ELT,
como o modelo por pilocapina (TURSKI et al., 1983), o modelo do ácido caínico (BEN-
ARI, 1985) e o abrasamento (GODDARD, 1967).
1.2.2 Transtornos psiquiátricos e Abrasamento
O modelo de abrasamento parece ser uma valiosa ferramenta em conceituar
os mecanismos gerais envolvidos na progressão da doença para uma vasta gama de
desordens neuropsiquiátricas (POST, 2007). Em adição a importância do abrasamento
no que diz respeito à epilepsia, este fenômeno tem recebido uma grande atenção nos
esforços em contextualizar a fisiopatologia e história natural das desordens
psiquiátricas. Por exemplo, modelos de abrasamento tem sido propostos para muitos
transtornos psiquiátricos, como transtornos de humor (POST; WEISS, 1992; MULA et
al. 2010), esquizofrenia (BOB et al. 2006), abuso e dependência de drogas (MINOZZI
et al. 2008), transtornos de ansiedade (POST et al. 1997), estresse pós-traumático e dor
crônica (POST, 2007).
25
Analogamente, nessas situações de desordem psiquiátrica, um estímulo que
é, originalmente, inócuo ou sublimiar, como variáveis ambientais ou farmacológicas,
com o avançar da doença, passam a elicitar uma resposta exagerada e patológica. Os
mesmos substratos neuroanatômicos envolvidos na evolução de convulsões parciais
complexas, particulamente as do lobo temporal medial, também estão envolvidos na
modulação da ansiedade e emoção (POST, 2004).
Estudos clínicos e epidemiológicos recentes tem mostrado que, em alguns
casos, desordens psiquiátricas podem anteceder a primeira convulsão, sugerindo que a
depressão e outras doenças relacionadas ao estresse, podem em certos casos, atuar como
fator de risco para a epilepsia (HESDORFFER et al., 2006). É reforçado pelo uso de
fármacos anticonvulsivantes no tratamento de transtornos neuropsiquiátricos que
dependem da influencia dos mecanimos de abrasamento nestas desordens (POST,
2002).
1.3 Nicotina
1.3.1 Características farmacológicas da nicotina
A NIC é o maior componente psicoativo do tabaco e é uma das substâncias
de abuso mais consumidas no mundo (USHHS, 1988). Dados da Organização Mundial
da Saúde estimam que 6 milhões de óbitos sejam atribuídos ao tabagismo no mundo
anualmente (WHO, 2011), dos quais 200 mil são no Brasil (WHO, 2008). Existe um
aumento nas taxas de consumo, particularmente entre os adolescentes e mulheres, como
também uma redução da idade de início ao consumo. Adolescentes constituem o grupo
considerado de alto risco, pois cerca de 60% iniciam o consumo do cigarro aos 13 anos
de idade, e mais que 90% dos fumantes iniciam antes dos 20 anos (WHO, 2013).
É um alcalóide natural derivado de duas espécies vegetais, Nicotiana
tabacum e Nicotiana rustica (Figura 3A e 3B, respectivamente), no qual foi isolada em
1828 da folha do tabaco por Posselt e Reiman. Dos cerca de 3.000 componentes
presentes no cigarro, a NIC é a principal responsável pela tolerância e dependência,
sendo a substância mais estudada (BALFOUR, 2004). O cigarro apresenta 800 mg de
tabaco por unidade, dos quais 9 a 17 mg são de NIC e cerca de dez por cento deste valor
é absorvido pelo indivíduo fumante (BENOWITZ, 1999).
26
Figura 3: Espécies vegetais que dão origem à nicotina.
A - Nicotiana tabacum B - Nicotiana rústica
Fontes: http://www.botanik.de/files/images/Nicotiana%20tabacum.preview.jpg;
http://toxicopoeia.com/botany/plants/image/Nicotiana%20Rustica.jpg
Acesso em: 05.07.2016
A NIC é uma amina terciária composta por anéis de piridina e pirrolidina
(Figura 4). É rapidamente absorvida pelas vias respiratórias, membranas bucais e pele,
entretanto, por ser uma base extremamente forte sua absorção no estômago é limitada,
sendo absorvida mais eficientemente no intestino. Cerca de 80-90% desta substância
são alterados no corpo, principalmente no fígado pelo sistema citocromo 450 (CYP450),
no qual o gene codificador CYP2A6 é ativo nessa metabolização, entretanto podendo
ser metabolizada também nos rins e nos pulmões. A cotinina é o principal metabólito,
enquanto a nicotina-1’-N-óxido e a 3-hidroxicotinina e metabólitos conjugados são
encontrados em menores quantidades. Tanto a NIC quanto seus metabólitos são
rapidamente eliminados pelos rins (BENOWITZ, 1998; ROSEMBERG, 2002;
GOODMAN; GILMAN, 2005).
As ações farmacológicas da NIC são mediadas através da ligação a
receptores colinérgicos nicotínicos (nAChR), encontrados no sistema nervoso central
(SNC), nos gânglios autonômicos periféricos, na glândula supra-renal, em nervos
sensitivos e na musculatura estriada esquelética (MARQUES et al., 2001). Estes
receptores são pentâmeros compostos por diferentes combinações de subunidades α e β,
sendo exemplos típicos de canais iônicos regulados por ligantes, ou seja, receptores
ionotrópicos (GOTTI et al., 2006).
27
Figura 4: Estrutura química da nicotina.
Fonte: http://www.quimica.seed.pr.gov.br/modules/galeria/detalhe.php?foto=1866&evento=5
Acesso em: 05.07.2016
A NIC é conhecida por seus efeitos sobre a função cardiovascular através da
estimulação simpática neural. Efeitos simpaticomiméticos da nicotina são mediados por
vários mecanismos, podendo ocorrer pela ativação de quimiorreceptores periféricos e
efeitos diretos no tronco cerebral, resultando em cronotropismo e ionotropismo positivo,
vasoconstrição coronária e da pressão arterial, secreção de adrenalina e noradrenalina
pela medula adrenal (BENOWITZ, 1999). No sistema gastrintestinal leva ao aumento
da motilidade e secreção. Na junção neuromuscular resulta em fasciculações e espamos
musculares (PANUS et al., 2011).
1.3.2 Efeitos da nicotina no Sistema Nervoso Central
A NIC é capaz de atravessar a barreira hemato-encefálica e exercer efeitos
no SNC através da ligação aos receptores nicotínicos neuronais, ativando e/ou
dessensibilizando estes receptores, nos quais medeiam os efeitos fisiológicos do
neurotransmissor acetilcolina (ACh) (DANI, 2001). Produz vários efeitos,
preponderantemente excitatórios, ou seja, estimulando a liberação de outros
neurotransmissores, como noradrenalina, dopamina, GABA, endorfinas, entre outros
(BRODIE, 1991; KISHIOKA et al., 2014).
Em baixas doses a NIC afeta o aprendizado, diminui a ansiedade, altera as
respostas cardiovasculares, de termorregulação e nocicepção (BENOWITZ, 1999).
28
Estudos in vitro têm mostrado que a NIC protege ou atenua danos induzidos por
peptídeos β-amilóides, inflamação por lipopolissacarídeos, álcool e hipóxia (LIU;
ZHAO, 2004; TIZABI et al., 2004; HEJMADI et al., 2003). Esta ação neuroprotetora
parece ser mediada pela ativação de receptores nicotínicos (PICCIOTTO; ZOLI, 2008),
visto que estes mecanismos de transdução de sinal envolvem direta ou indiretamente a
modulação de cálcio e outros mecanismos antiapoptóticos através dos receptores
supracitados, entretanto, estas vias potenciais são ainda pouco compreendidas
(STEVENS et al., 2003; BUCKINGHAM et al., 2009). Em modelos animais, resulta no
desenvolvimento da sensibilização comportamental, tal como aumento da atividade
locomotora e efeitos estereotipados (HARROD et al., 2004).
Em altas doses produz comportamentos mais drásticos, incluindo
eventualmente a indução de convulsões tônico-clônicas em roedores (SALAS et al.,
2003). A administração da NIC in vivo e em culturas celulares desencadeia o aumento
da expressão de vários genes relacionados com a neurossecreção incluindo os
relacionados à síntese das enzimas biossintetizadoras de catecolaminas, estimulando
assim sua liberação (BENOWITZ, 1999).
Em áreas cerebrais como hipocampo, a NIC provoca melhora da atenção e
da memória; no córtex pré-frontal, atua sobre as funções de comportamento social; e
sobre o sistema noradrenérgico do locus coeruleus, relaciona-se com as respostas ao
estresse e está implicado na depressão. Estes efeitos são semelhantes aos produzidos por
outras substâncias, como cocaína ou anfetaminas (SENA; FERRET-SENA, 2004;
WATKINS; KOOB; MARKOU, 2000). A NIC promove também um rápido, mas
pequeno aumento do estado de alerta (HEISHMAN; TAYLOR; HENNINGFIELD,
1994), e diminui o apetite (SENA; FERRET-SENA, 2004).
A NIC também exerce efeitos dinâmicos sobre o cérebro em
desenvolvimento, produzindo diversas consequências que dependem criticamente do
tempo de exposição. Durante a adolescência pode interferir com circuitos límbicos,
resultando na potencialização da vulnerabilidade à dependência, aumento da
impulsividade e transtornos de humor (DWYER et al., 2009).
1.3.3 Papel da nicotina no sistema monoaminérgico
A NIC atua em receptores colinérgicos expressos em vias dopaminérgicas
no cérebro, que estão associados com abuso de substâncias e recompensa. Uma destas
29
vias é a mesolímbica, e é constituída por neurônios dopaminérgicos da área tegmental
ventral que se projetam ao núcleo accumbens localizado no estriado ventral (KLOET;
MANSVELDER; VRIES, 2015). A área tegmental ventral apresenta receptores
colinérgicos e quando estimulados alteram os níveis de DA em várias regiões cerebrais,
incluindo o NAC, no qual tem sido implicado em alterações nos comportamentos
emocionais e cognitivos, especialmente relacionados à regulação da adição induzida
pela recompensa (WILLUHN et al., 2010).
A ativação da via mesolímbica envolve receptores colinérgicos com
subunidades α4/α6β2 e α7, e a sensibilidade à recompensa por NIC pode ser modulada
pela sinalização de dopamina através de interações com receptores D1 e D2, entretanto
os exatos receptores pré e pós-sinápticos ainda não são conhecidos (GOTTI et al., 2010;
LAVIOLETTE et al., 2008).
Assim como outras drogas de abuso, como a cocaína e a anfetamina, a NIC
ao ativar os circuitos cerebrais dopaminérgicos, aumenta a atividade locomotora e
promove o comportamento de auto-administração em humanos e em animais de
laboratório (VEZINA; MCGEHEE; GREEN, 2007). Estudos com microdiálise mostram
que a administração sistêmica ou local de NIC produz aumento dose-dependente nos
níveis de dopamina no NAC de animais (SIDHPURA, REDFERN; WONNACOTT,
2007) e no corpo estriado de humanos fumantes (MONTGOMERY et al., 2007).
Diferenças sexuais são identificadas em relação aos efeitos da NIC neste
sistema. Estudos mostram uma significante ativação de receptores dopaminérgicos no
estriado ventral de machos e menos pronunciada nas fêmeas, apontando a ação da DA
como principal substrato nestas diferenças sexuais biológicas, caracterizadas por uma
resposta rápida (COSGROVE et al., 2014), por outro lado, evidências sugerem que a
liberação de dopamina no corpo estriado é maior em fêmeas do que em ratos machos
(WALKER et al., 2000), como também que os receptores dopaminérgicos D1 e D2
estriatais de ratos machos são hiperexpressos na adolescência em relação às fêmeas,
diminuindo, gradualmente, durante a vida adulta, independentemente das alterações
hormonais da puberdade (ANDERSEN et al., 2000).
Há também diferenças sexuais nos efeitos regulatórios a longo prazo em
receptores nicotínicos (COSGROVE et al., 2012), bem como efeitos a longo prazo
sobre os receptores dopaminérgicos (BROWN et al., 2012). Portanto, exposição a
psicoestimulantes podem causar mudanças robustas nos receptores dopaminérgicos no
30
cérebro em desenvolvimento que manifestarão efeitos em longo prazo no
comportamento na fase adulta (THANOS et al., 2007).
O sistema noradrenérgico também pode ser modulado pela NIC, e leva ao
aumento na atividade simpática periférica (GRASSI et al., 1994). Em modelos animais
a administração sistêmica de NIC aumenta os níveis de noradrenalina (NE) extracelular
e este efeito é mediado pelo locus ceruleus, principal região de neurônios
noradrenérgicos no cérebro. A NIC exerce efeitos diretos no locus ceruleus, como o
aumento da taxa de disparo neuronal e a liberação de NE (MITCHELL, 1993;
CZUBAK et al., 2010).
1.3.4 Papel da nicotina no sistema glutamatérgico
O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do SNC e é um
importante modulador da neuroplasticidade, uma vez que participa da transmissão
sináptica fisiológica, potenciação em longo prazo, a maturação neuronal e sinaptogênese
(MARMIROLI; CAVALETTI, 2012). Por outro lado, o glutamato tem sido implicado
como o principal fator responsável pela excitotoxicidade, um processo em que a
liberação excessiva ocorre em associação a desordens neurológicas, como esclerose
lateral amiotrófica, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, epilepsia, isquemia
cerebral e esquizofrenia (CUOMO et al., 2009; BITANIHIRWE et al., 2009).
A NIC aumenta a transmissão glutamatérgica através da ligação a receptores
nicotínicos homoméricos α7 localizados em terminais pré-sinápticos, sobretudo no
córtex pré-frontal e em estruturas límbicas, e dessensibilização de α4β2-nAChRs em
neurônios gabaérgicos (MANSVELDER; MCGEHEE, 2000; DICKINSON; KEW;
WONNACOTT, 2008). A NIC parece estar relacionada à elevação da sinalização de
glutamato via mecanismos dopaminérgicos, tais como os descritos para a cocaína
(MANSVELDER et al., 2002).
O envolvimento dos receptores NMDA também foi reportado, mostrando
que a liberação de glutamato via estimulação de receptores nicotínicos pré-sinápticos
tem sido implicado na ação convulsiva da NIC, e que um potente antagonista do
receptor de glutamato do subtipo NMDA, MK-801 (dizocilpina), mostrou suprimir o
desenvolvimento de convulsões induzidas por NIC (FEDELE et al., 1998; DAMAJ et
al., 1999). Além de receptores nicotínicos, a liberação de dopamina no núcleo
accumbens é controlada por receptores NMDA (KELLEY; THRONE, 1992) e a
31
ativação acentuada destes receptores podem promover eventos celulares severos,
incluindo prejuízos na homeostase de cálcio neuronal, disfunção mitocondrial e a
ativação de vias apoptóticas (DUCHEN, 2000).
1.4 Diferenças sexuais quanto aos efeitos da nicotina
Homens e mulheres exibem atitudes e habilidades diferentes, experimentam
emoções diferentes em resposta aos estímulos sociais e ambientais, e mostram uma
distinta susceptibilidade ao estresse, doenças e transtornos mentais. Um número
crescente de estudos está direcionado em avaliar as diferenças sexuais na
toxicodependência, assim o gênero também pode influenciar as respostas
comportamentais à exposição aguda e crônica das drogas de abuso (FATTORE et al.,
2014; BECKE; HU, 2008).
As taxas de abuso são mais baixas em mulheres do que em homens,
entretanto o número de mulheres usando e abusando de substâncias prescritas e ilegais
está em ascensão (LYNCH, 2009). Evidências indicam que homens e mulheres podem
diferir em seus hábitos de fumar (GRUNBERG et al., 1991; PERKINS; SCOTT, 2008).
No geral, as mulheres fazem uso de NIC mais cedo, atingem os critérios de dependência
rapidamente e entram em programas de tratamento mais precocemente do que os
homens (CHEN; MATTA; SHARP, 2007; SOFUOGLU; MOONEY, 2009).
Adolescentes do sexo feminino parecem apresentar uma particular vulnerabilidade à
NIC (COLLINS et al., 2004; LEVIN et al., 2003), e estas utilizam mais produtos
derivados do tabaco, além de ter uma maior dificuldade em parar o seu uso quando
comparadas ao sexo masculino (PAULY, 2008; PERKINS; SCOTT, 2008).
Modelos animais têm mostrado também que roedores machos e fêmeas
apresentam diferenças na sensibilidade aos efeitos da NIC. Por exemplo, roedores
fêmeas adquirem comportamento de auto-administração mais rápido e em esquemas de
doses mais baixas, apresentam maior consumo de droga, exibem maior motivação e
comportamento de busca (DELFINO et al. 2001; LYNCH, 2009), e são mais sensíveis a
antinocicepção induzida por esta droga em modelos de dor aguda e crônica (CHIARI et
al., 1999). Exibem também um maior aumento da atividade locomotora após a
administração intravenosa crônica de NIC (BOOZE et al., 1999). Quanto às crises
32
convulsivas induzidas pela mesma, observou-se que estas crises são mais severas em
fêmeas (TESKEY; HUTCHINSON; KOLB, 1999).
Estas diferenças sexuais são suportadas pela influência dos hormônios
gonadais, visto que os níveis destes hormônios mudam através do ciclo menstrual
(humanos) ou estral (roedores). Estudos em humanos que mostram os efeitos da fase do
ciclo menstrual sobre o consumo de cigarros e sobre as ações psicoativas da NIC são
conflitantes, entretanto a maioria relata que a fase do ciclo menstrual pode influenciar os
sintomas auto-relatados de abstinência em mulheres (ALLEN et al., 2008). Pesquisas
em animais sugerem que os hormônios ovarianos podem influenciar nos efeitos agudos
da NIC, como por exemplo, a administração exógena de estrógeno em fêmeas tem um
efeito pró-convulsivante, ou seja, acelera o tempo para o início da convulsão (TESKEY;
HUTCHINSON; KOLB, 1999).
Apesar da prevalência de adição à NIC parecer ser maior em homens, os
efeitos a curto e longo-prazo do uso dessa droga podem ser particularmente mais
danosos em mulheres. Contudo, os mecanismos neurobiológicos destas diferenças ainda
não estão elucidados (PAULY, 2008).
1.5 Modelo de abrasamento induzido por nicotina
A ação convulsiva da NIC está bem documentada (BENOWITZ, 1999), mas
pouco de seu mecanismo foi determinado. Foi demonstrado que estas convulsões
induzíveis são originadas no hipocampo e são centralmente mediadas envolvendo os
receptores nicotínicos com subunidades α3, α7 e β4 (DAMAJ et al., 1999; KEDMI et
al., 2004), pontuando o papel destes receptores na modulação da excitabilidade cerebral,
(LOSCHER et al., 2003).
Nesse contexto, a primeira evidência de abrasamento induzido por NIC foi
descrita por Bastlund et al. (2005), no qual mostraram que exposição repetida a doses de
NIC (2mg/kg) levam a um aumento da responsividade comportamental e ao surgimento
de crises convulsivas com o decorrer do esquema de administrações. Esse modelo
apresenta um padrão distinto de envolvimento neuroanatômico, em relação aos modelos
de abrasamento gabaérgico e de estimulação elétrica da amígdala já propostos, e parece
depender da ativação de receptores nicotínicos α4β2 e α7 e receptores NMDA, já
33
envolvidos em convulsões agudas induzidas por NIC (SALAS et al., 2004;
BASTLUND et al., 2005).
Além disso, semelhante a outros modelos de convulsão, como os induzidos
por ácido caínico, pilocarpina e pentilenetetrazol (PTZ) (SHIN et al. 2011), e de
abrasamento induzido por PTZ (AGARWAL et al. 2011), a produção de radicais livres
e o dano oxidativo resultante também tem sido destacados no desenvolvimento do
abrasamento por NIC. Estudos realizados por nosso grupo de pesquisa mostraram que
há importante redução das defesas antioxidantes e aumento da peroxidação lipídica no
córtex pré-frontal, hipocampo e corpo estriado de ratos submetidos a esse modelo,
sendo estes efeitos atenuados por uma substância antioxidante. Evidenciou-se também
uma sensibilidade diferencial em relação à idade e ao sexo dos animais na indução deste
modelo, cujos animais periadolescentes e fêmeas mostraram-se mais vulneráveis aos
efeitos da NIC (GOMES et al., 2013; OKAMURA et al., 2016).
Nos últimos anos, um crescente corpo de evidências sugere que o estresse
oxidativo, a inflamação e mudanças na neurotransmissão glutamatérgica e
dopaminérgica podem desempenhar um importante papel em muitas doenças
neuropsiquiátricas, incluindo adição, transtornos de humor e esquizofrenia. Esses novos
conhecimentos acerca da fisiopatologia destas desordens permitem que novos alvos
terapêuticos sejam desenvolvidos e explorados (DEAN et al., 2011).
1.6 Relevância e Justificativa
O abrasamento tem recebido uma grande atenção nos esforços para entender
a fisiopatologia e história natural dos transtornos psiquiátricos, visto que, uma ampla
gama destes transtornos foi implicada nos mecanismos de sensibilização, como também
a convulsão tem sido relacionada a várias patologias neurológicas, o que faz sua
prevalência ter números consideráveis, mostrando-se como um importante modelo no
estudo da epilepsia do lobo temporal. Nesse modelo, não apenas os episódios
comportamentais podem tornar-se mais severos como também podem mostrar uma
tendência à recorrência, e, por fim, à espontaneidade (POST, 2007). Com isso, o
fenômeno do abrasamento além de notável importância para o desenvolvimento da
epileptogênese, também tem se mostrado bastante conveniente para a explicação dos
cursos progressivos e de longa evolução de muitos transtornos neuropsiquiátricos.
34
O cigarro é uma das drogas de abuso mais comercializadas em todo o
mundo, e embora exista uma alta prevalência acerca do consumo de tabaco pelos
adolescentes, estudos relacionados à neurobiologia da adição por NIC têm sido
direcionados, em ensaios pré-clínicos, principalmente, em animais adultos, visto que,
um dos desafios de modelos pré-clínicos de adolescência é definir a faixa etária que seja
compatível aos humanos.
Adolescência em ratos é definida do 21° ao 59° dia pós-natal (TIRELLI;
LAVIOLA; ADRIANI, 2003), visto que há semelhanças no processo puberal de ratos e
humanos (PLANT, 2015). Outro importante fator é na investigação da sensibilidade ao
sistema de recompensa, pois um argumento que tem sido em favor de ratos como um
modelo animal para o estudo da adolescência, é que ambos, ratos e humanos
adolescentes, diferem de suas contrapartes adultas em motivação e recompensa, ou seja,
há maior sensibilidade à recompensa em grupos etários mais jovens do que adultos
(DOREMUS-FITZWATER; VARLINSKAYA; SPEAR, 2010).
Há evidências no qual a exposição cada vez mais precoce às drogas de
abuso possa ser um forte preditor do uso prolongado e dependência às drogas e dados
indicam que o cérebro em desenvolvimento pode ser afetado diferentemente dos adultos
quando expostos à NIC devido receptores nicotínicos regularem aspectos críticos do
cérebro neste período (DWYER; MCQUON; LESLIE, 2009).
Recentemente, estudos realizados por nosso grupo de pesquisa
demonstraram haver uma influencia relacionada ao sexo na susceptibilidade ao
desenvolvimento do abrasamento por NIC, pois foi evidenciado que as fêmeas
periadolescentes, faixa etária que corresponde à adolescência em humanos, apresentam
uma maior vulnerabilidade aos efeitos nocivos neste fenômeno, acompanhadas de
alterações sexo-dependentes no sistema oxidativo, como redução dos níveis de defesas
antioxidantes (GOMES et al., 2013). A influência do estresse oxidativo pode ser
confirmada pelo fato destas alterações terem sido parcialmente revertidas pelo fármaco
com propriedade antioxidante, a N-acetilcisteína (OKAMURA et al., 2016).
Considerando as características únicas de responsividade à NIC do cérebro
adolescente, e que as diferenças sexuais pertinentes relacionadas a neurobiologia deste
fenômeno não terem sido, até o presente momento, totalmente elucidada, a análise
detalhada dos mecanismos que estão envolvidos nestas diferenças, certamente poderia
abrir novos caminhos para decifrar a complexidade acerca das bases biológicas que
35
envolvem os transtornos psiquiátricos e, possivelmente, contribuir para novas
perspectivas quanto ao tratamento.
36
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
• Investigar a progressão temporal e influência do sexo nas alterações
neuroquímicas induzidas pelo fenômeno de abrasamento por NIC em ratos
periadolescentes.
2.2 Objetivos Específicos
• Verificar as diferenças comportamentais em animais machos e fêmeas
submetidos ao fenômeno do abrasamento induzido por NIC;
• Analisar os níveis de monoaminas e metabólitos em corpo estriado e hipocampo
de animais machos e fêmeas periadolescentes durante o desenvolvimento do
abrasamento por NIC;
• Avaliar as diferenças em relação ao sexo da atividade da acetilcolinesterase em
corpo estriado e hipocampo durante o desenvolvimento do abrasamento por
NIC;
• Investigar as diferenças na expressão da subunidade NR1 fosforilada (p-NR1) do
receptor glutamatérgico NMDA e proteína fosforilada de ligação ao elemento de
resposta ao AMPc (p-CREB) nestes grupos de animais induzidos ao
abrasamento;
• Analisar os níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em ratos
periadolescentes machos e fêmeas.
37
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos e fêmeas 35 dias após o nascimento
(periadolescentes), pesando entre 80-100g, provenientes do Biotério Central da
Universidade Federal do Ceará (UFC), ambientados em grupos de 6 animais em caixas
de propileno 26 ± 2 ºC, a um ciclo claro/escuro de 12 h, recebendo ração padrão e água
“ad libitum”. A presente pesquisa foi iniciada após aprovação do Comitê de Ética e
Pesquisa Animal (CEPA) da UFC, com protocolo nº 49/2014 e os experimentos foram
conduzidos de acordo com o Guia de Cuidados e Usos de Animais de Laboratório do
Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos da América (OLFERT
et al., 1993).
3.2 Droga utilizada
A solução de NIC foi obtida sob a forma de base livre, (−)-Nicotine
hemisulfate salt (Sigma-Aldrich®, EUA). A dose foi escolhida baseada em um estudo
anterior realizado por este grupo de pesquisa, no qual a dose 2.0 mg/kg (dose
subconvulsivante) foi capaz de induzir o abrasamento com baixa incidência de mortes
dos animais (GOMES et al., 2013). As soluções foram preparadas diariamente e
administrada por via intraperitoneal (0,1ml/ 100 g de peso corporal).
3.3 Estratégia experimental
As metodologias descritas abaixo visaram investigar a progressão temporal e a
influência do sexo nas alterações neuroquímicas durante a indução do abrasamento por
NIC em animais machos e fêmeas periadolescentes. A primeira metodologia utilizada
foi a indução do abrasamento em ratos machos e fêmeas periadolescentes (n=8 por
grupo), a fim de verificar o período de tempo que este leva para ocorer, bem como as
diferenças quanto ao desenvolvimento do fenômeno (Figura 5).
38
Figura 5: Delineamento experimental da análise comportamental no presente
estudo.
Fonte: elaborado pelo autor.
Após a indução do abrasamento e determinação dos períodos para o
desenvolvimento do fenômeno, no qual foram 25 dias de tratamento para os machos e
19 dias de tratamento para as fêmeas, justificado pelo estudo de Gomes et al. (2013)
desenvolvido no Laboratório de Neuropsicofarmacologia que tomou por base o modelo
desenvolvido por Bastlund et al. (2005), os animais foram foram tratados novamente
com NIC 2.0 mk/kg, bem como os grupos controles foram tratados com solução salina,
e divididos em grupos (Tabela 1) para que as análises bioquímicas fossem realizadas
(Figura 6).
Tabela 1: Grupos de tratamento no desenvolvimento do abrasamento por NIC e
metodologias analisadas.
Grupos Metodologias / N° de animais por sexo
Controle Macho
1 dia
Controle Fêmea
1 dias
- Monoaminas e metabólitos / 8 animais
- Acetilcolinesterase / 8 animais
- BDNF / 8 animais
Controle Macho
10 dias
Controle Fêmea
10 dias
- Monoaminas e metabólitos / 8 animais
- Acetilcolinesterase / 8 animais
- BDNF / 8 animais
39
Controle Macho
Abrasamento
Controle Fêmea
Abrasamento
- Dosagem hormonal
- Monoaminas e metabólitos / 8 animais
- Acetilcolinesterase / 8 animais
- BDNF / 8 animais
- Imunofluorescência / 4 animais
Nicotina Macho
1 dia
Nicotina Fêmea
1 dia
- Monoaminas e metabólitos / 8 animais
- Acetilcolinesterase / 8 animais
- BDNF / 8 animais
- Imunofluorescência / 4 animais
Nicotina Macho
10 dias
Nicotina Fêmea
10 dias
- Monoaminas e metabólitos / 8 animais
- Acetilcolinesterase / 8 animais
- BDNF / 8 animais
Nicotina Macho
Abrasamento
Nicotina Fêmea
Abrasamento
- Dosagem hormonal
- Monoaminas e metabólitos / 8 animais
- Acetilcolinesterase / 8 animais
- BDNF / 8 animais
- Imunofluorescência / 4 animais
Figura 6: Delineamento experimental das metodologias utilizadas no presente
estudo.
Fonte: elaborado pelo autor.
40
3.4 Protocolo experimental I - Tratamento dos animais e esquema de indução do
abrasamento
O abrasamento foi induzido de acordo com método previamente descrito
por Bastlund et al. (2005). Os animais (n=8 por grupo) receberam repetidas injeções de
NIC na dose de 2.0 mg/kg, i.p., administradas todos os dias da semana (segunda-feira à
sexta-feira) durante 4 semanas, entretanto na 4º semana a última aplicação ocorreu na
quinta-feira. A quantificação das convulsões foi feita por observação visual por um
período de 15 minutos imediatamente após a administração de NIC nos dias 1, 10, 19,
22, 24 e 25. O tempo de observação limitou-se por 15 minutos, visto que estudos
prévios mostraram que para a dose de NIC utilizada este tempo é suficiente
(BASTLUND et al., 2005; GOMES et al., 2013). Os animais controle receberam
solução salina pelo mesmo intervalo de tempo (4 semanas).
Para determinação da atividade convulsivante, os animais foram avaliados
pela escala de Racine (1972), modificada por Itzhak e Martin (2000), nos quais os
estágios são classificados conforme mostrado na Tabela 2.
Tabela 2: Caracterização dos estágios de comportamento para convulsão, de
acordo com Racine (1972).
Escala de comportamento de Racine (1972)
Estágio Alterações comportamentais observadas
1 Comportamento normal
2 Hiperatividade
3 Movimentos verticais repetidos, estereotipados
4 Movimentos clônicos das patas dianteiras e “rearing”
5 Movimentos clônicos de patas dianteiras e traseiras, flexão da
cabeça e corpo inteiro e perda completa do controle postural
Fonte: adaptada de Itzhak e Martin (2000).
O abrasamento completo foi considerado quando o animal apresentou
manifestações correspondentes ao estágio 5, caracterizado por clonias de membros
41
anteriores e posteriores, flexão da cabeça e corpo inteiro e perda completa do controle
postural, ou seja, ataques motores completos.
3.5 Protocolo experimental II – Determinação dos níveis de 17β-estradiol em
plasma sanguíneo de animais induzidos ao abrasamento por nicotina
Após a indução do abrasamento por NIC, os animais (n=8 por grupo) foram
submetidos à coleta de sangue por punção do sinus retro-orbital. Os níveis de 17β-
estradiol foram determinados através do kit ADVIA Centaur (Bayer Diagnostics,
Tarrytown, NY, EUA) usando o método de quimioluminescência, de acordo com as
instruções do fabricante. Os níveis plasmáticos de 17β-estradiol são dados em
picogramas por ml (pg/ml).
3.6 Protoloco experimental III - Testes bioquímicos
3.6.1 Dissecação das áreas cerebrais
Ao longo da administração de NIC para indução do abrasamento, os
animais foram eutanasiados por decapitação, os encéfalos retirados rapidamente e
colocados sobre papel alumínio em uma placa de Petri com gelo. O córtex cerebral foi
divulsionado e rebatido para os lados, expondo parte do corpo estriado. O hipocampo
e corpo estriado foram isolados das estruturas circunjacentes por divulsionamento
(ZILLES; WREE, 1985). Terminada a dissecação, o corpo estriado (CE) e hipocampo
(HC) foram colocados em eppendorfs devidamente identificados, pesados e
conservados em freezer – 80ºC para uso nas determinações abaixo.
3.6.2 Determinação dos níveis de monoaminas e seus metabólitos em animais
induzidos ao abrasamento por nicotina
A determinação dos níveis de monoaminas e seus metabólitos ocorreram ao
longo do desenvolvimento do abrasamento induzido por NIC. Os animais (n=8 por
grupo) foram decapitados e seus cérebros imediatamente dissecados sobre gelo nos dias
1, 10 e 19 (fêmeas) e dias 1, 10 e 25 (machos) de indução do abrasamento por NIC. O
CE e HC foram retirados e utilizados para preparar homogenatos a 10% e 20%,
42
respectivamente. Estas áreas foram utilizadas por estarem envolvidas na fisiopatologia
da adição, visto que a NIC é uma droga de abuso e seu uso desencadeia alterações
neuroquímicas nestas áreas.
Para a determinação dos níveis de catecolaminas, foi utilizado o
equipamento de High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (Figura 7). Os
detectores eletroquímicos que medem corrente associada com a redução ou oxidação de
solutos são chamados detectores amperométricos ou coulométricos. Neste estudo, foi
utilizado o tipo amperométrico que reage com uma quantidade muito menor de soluto,
em torno de 1%.
Figura 7: Equipamento de High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
eletroquímico
Fonte: Arquivo pessoal.
- Procedimento experimental
O CE e HC foram sonicados em ácido perclórico (HCLO4) a 10% e 20%,
respectivamente, por 30 segundos e centrifugados por 15 minutos em centrífuga
refrigerada a 15.000 rpm. Uma alíquota de 20 µl do sobrenadante foi, então, injetada no
equipamento de HPLC para a análise química.
Para a análise das monoaminas e metabólitos, uma coluna CLC-ODS(M)
com comprimento de 25 cm, calibre 4,6 mm e diâmetro da partícula de 3µm da
Shimadzu-Japão foi utilizada. A fase móvel utilizada foi composta por tampão ácido
cítrico 0,163 M, pH 3,0, contendo ácido octanosulfônico sódico, 0,69 M (SOS) como
reagente formador do par iônico, acetonitrila 4 % v/v e tetrahidrofurano 1,7 % v/v.
Noradrenalina (NE), Dopamina (DA), Ácido 3,4-di-hidroxifenilacético (DOPAC) e
Ácido homovanílico (HVA) foram eletroquimicamente identificados através de um
detector amperométrico (Modelo L-ECD-6A, Shimadzu, Japão) pela oxidação em um
43
eletrodo de carbono vítreo fixado em 0,85 V, relativo a um eletrodo de referência de
Ag-AgCl (HALLMAN; JONSSON, 1984). Valores de HVA em HC não foram
apresentados nos resultados por não terem sido identificados no cromatograma.
- Padrões
Os padrões foram preparados em uma concentração final de 4 ng de NE,
DA, DOPAC, HVA (Sigma-Aldrich®, EUA). A partir da altura ou área dos picos
desses padrões, as amostras foram calculadas no programa Microsolf Excel® em um
computador e os resultados expressos em nanogramas por grama (ng/g) de tecido.
3.6.3 Determinação da atividade da enzima Acetilcolinesterase (AChE) durante o
desenvolvimento do abrasamento por nicotina
A realização deste método ocorreu ao longo do desenvolvimento do
abrasamento induzido por NIC. Os animais (n=8 por grupo) foram eutanasiados por
decapitação e seus cérebros imediatamente dissecados sobre gelo nos dias 1, 10 e 19
(fêmeas) e dias 1, 10 e 25 (machos) de indução do abrasamento por NIC. O CE e HC
foram retirados e utilizados para preparar homogenatos a 10%. A atividade da AChE foi
determinada segundo Ellman et al. (1961), tendo como princípio a medida da
velocidade de produção de tiocolina à proporção que a acetiltiocolina (ATC), utilizada
como substrato, é hidrolisada. A coloração é medida em 412 nm, através de um
espectrofotômetro (Modelo Beckman Coulter DU 720, EUA).
A atividade enzimática é medida através da leitura da variação da
absorbância por minuto, durante 3 minutos, sendo a reação linear durante pelo menos 10
minutos. A atividade específica foi expressa em nanomoles de ATC hidrolisados por
miligrama de proteína por minuto (nmoles/mg de proteína/min).
- Reação:
44
No presente estudo os tecidos foram homogeneizados em tampão fosfato
10% e o homogenato (5µL) foi adicionado a uma cubeta contendo 500µL do tampão,
895µl de água destilada e 50µL de ácido ditiobisnitrobenzóico (DTNB) 0,01M e a
absorbância zerada.
Após a absorbância ser deixada em zero a cubeta foi retirada e acrescentado
50µL de iodeto de acetiotiocolina (ATC) sendo a absorbância novamente registrada por 3
min em 412 nM. A atividade da enzima foi calculada como modificações na absorbância
do minuto 3 para o minuto 0, relativo ao conteúdo de proteína contido no homogenato. A
dosagem da concentração de proteínas foi realizada utilizando o método de Bradford
(1976).
3.6.4 Determinação dos níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)
A realização deste método ocorreu ao longo do desenvolvimento do
abrasamento induzido por NIC. Os animais (n=8 por grupo) foram eutanasiados por
decapitação e seus cérebros imediatamente dissecados sobre gelo nos dias 1, 10 e 19
(fêmeas) e dias 1, 10 e 25 (machos) de indução do abrasamento por NIC. Após
homogeneização das áreas cerebrais a 20 volumes de tampão PBS pH 7,4 adicionado de
inibidores de protease (Sigma-Aldrich®, EUA), o nível de BDNF de cada amostra foi
quantificado por ensaio imunoenzimático (ELISA; R&D Systems, EUA) de acordo com
as instruções do fabricante. Os resultados foram expressos como picograma de
BDNF/mg de proteína total determinada pelo método de Bradford (1976).
3.7 Protocolo experimental IV – Determinação da expressão da subunidade NR1
fosforilada (p-NR1) do receptor glutamatérgico NMDA e da proteína fosforilada
de ligação ao Elemento de Resposta ao AMPc (p-CREB) por imunofluorescência
A determinação deste método ocorreu no 1° dia e último dia (19° para
fêmeas e 25° para machos) de administração de NIC. Os animais (n=4 por grupo) foram
anestesiados, via intraperitoneal, com uma mistura de cetamina (100mg/kg) e xilazina
(10mg/kg); e depois, foi realizada a perfusão intracardíaca com 300 mL de solução
salina e 300 mL de solução de paraformaldeído (PFA) 4%. O encéfalo foi removido, em
seguida, foi colocado em formol tamponado por 2 horas, e após, a crioproteção em
45
sacarose 30% por 2 dias. Posteriormente, os encéfalos foram acondicionados com
tissue-tek®, em freezer, à temperatura de -80°C.
Com os encéfalos extraídos, foram feitos cortes em fatias com espessura de
15µm no criostato (Leica CM1850), à temperatura de -24°C e armazenados em lâminas
gelatinizadas. A marcação para p-NR1 e p-CREB foi realizada em fatias (15 µm de
espessura) representativas do CE. Os cortes foram fixados por 2 minutos em metanol e
ficaram imersos em PBS até o momento de começar a imunofluorescência. Em seguida,
foi feita a recuperação antigênica com tampão citrato 0,1M (pH 6,0), sob aquecimento
em forno micro-ondas, por 15 minutos, à temperatura de 95°C. Após o resfriamento,
obtido em temperatura ambiente, por 20 minutos, foi feita a permeabilização da
membrana nuclear com triton X-100 (0,1%) e foi feito o bloqueio com albumina sérica
bovina (BSA) 5% acrescida de glicina 0,3M por 30 minutos para todas as lâminas. Os
cortes foram lavados com PBS e incubados, durante a noite, à temperatura de 4°C, com
os anticorpos primários feito em coelho anti-phospho NR1 (Ser-897 Millipore®) e
cabra anti-phospo CREB (Santa Cruz Biotechnology®) na diluição 1:200 em BSA 5%.
As lâminas foram lavadas e incubadas, durante 1 hora e 30 minutos, com os anticorpos
secundários anti-igG de coelho Alexa flúor 568 (Invitrogen®) e anti-igG de cabra Alexa
flúor 488 (Invitrogen®) na diluição de 1:400 em BSA 5%. Para a marcação dos núcleos,
os cortes foram incubados, durante 30 minutos, com o anticorpo DAPI (Invitrogen®) na
diluição 4 µl em 200 ml de BSA 5%. Em seguida, as lâminas foram lavadas com PBS,
montadas com Prolong Gold (Invitrogen®) e fotografadas no microscópio confocal
Olympus F1000, com uma magnificação de 20x.
A quantificação da área marcada nas fotos foi feita diferenciando as áreas
marcadas (pixels) pela maior saturação de cor associada à marcação (verde ou
vermelha). Para isso foi utilizado o programa Fiji Image J. O procedimento foi baseado
na saturação da cor associada à marcação positiva para um determinado marcador. Os
limites necessários para definição de pixels marcados e não marcados foram definidos
previamente. Para a quantificação da área marcada foram utilizadas 4 fotos (de animais
diferentes) por grupo experimental. Os resultados dessa quantificação foram
apresentados em porcentagem, a qual foi calculada a marcação positiva de um
determinado marcador em relação à área total da foto, que foi considerada 100%. Os
marcadores quantificados foram p-NR1 e p-CREB, de modo que a co-marcação
(“merge”) foi utilizada para mostrar a expressão de p-NR1 e p-CREB.
46
3.8 Análise estatística
A análise dos dados foi realizada através do software GraphPad Prism,
versão 5.0 para Windows, GraphPad Software, San Diego Califórnia EUA. Os
resultados comportamentais foram analisados através da curva de sobrevivência
utilizando o teste Log-rank (Mantel-Cox). Os dados hormonais foram analisados por
ANOVA de uma via seguida pelo teste de Student-Newman-Keuls como teste post-hoc.
Os resultados bioquímicos e de imunofluorescência foram analisados por ANOVA de
duas vias seguida pelo teste de Tukey como teste post-hoc. Valores significativos para
as análises foram consideradas quando p< 0,05.
47
4 RESULTADOS
4.1 Avaliação do desenvolvimento do abrasamento induzido por nicotina em ratos
O comportamento decorrente do abrasamento é caracterizado pela
ocorrência de convulsões no estágio 5 (de acordo com a escala de Racine, ver
metodologia). Foi observado que a administração diária (segunda-feira à sexta-feira) de
NIC na dose de 2.0 mg/kg em ratos machos periadolescentes (n=8) e fêmeas
periadolescentes (n=8) foi capaz de induzir o abrasamento ao longo do tempo. No
primeiro dia de administração, nenhum animal convulsionou. No dia 19, as fêmeas
apresentaram estágio 5 mais precocemente (p<0,05 quando comparado aos machos)
após o início do tratamento mantendo-se até o último dia de tratamento, enquanto que
os machos apresentaram estágio 5 apenas no 24º dia de tratamento (Figura 8). No 25°
dia de administração todos os animais fêmeas e machos apresentaram, respectivamente,
estágio 5 de convulsão (p<0,05 quando comparado ao 1° dia de tratamento). Os machos
se mostraram mais resistentes ao desenvolvimento do abrasamento, quando comparados
às fêmeas visto que apenas 75% (n=6) dos animais deste grupo apresentaram convulsão
estágio 5, enquanto no grupo de fêmeas 87,5% (n=7) atingiram este estágio (Figura 8).
Evidenciou-se também que as fêmeas periadolescentes foram mais
susceptíveis à morte com o tratamento com NIC na dose 2.0 mg/kg, pois houve apenas
25% de sobrevivência neste grupo ao longo do tempo quando comparado com os
machos (p<0,05) (Figura 9).
48
Figura 8 – Desenvolvimento do abrasamento induzido por nicotina em ratos
machos e fêmeas periadolescentes, de acordo com o estágio 5 da escala de
convulsão de Racine (1972).
1 1 0 1 9 2 2 2 4 2 5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
M a c h o s
F ê m e a s
*, a
*, b
**
* *
D ia s d e t ra ta m e n to
Es
tág
io 5
de
co
nv
uls
ão
(N
º d
e r
ato
s)
Cada linha representa o número de animais que apresentaram o estágio 5 de convulsão
em relação ao tempo de tratamento. Os animais receberam NIC na dose 2,0 mg/kg, via
intraperitoneal, por 25 dias durante a semana de segunda a sexta-feira. A análise dos
resultados foi feita através da curva de sobrevivência utilizando o teste Log-rank
(Mantel-Cox). *p<0,05 quando comparado ao primeiro dia de administração de NIC (dia 1). a, b p<0,05 no 19º dia e 22º dia em relação ao macho periadolescente, respectivamente.
49
Figura 9 – Percentual de sobrevivência dos animais submetidos ao abrasamento
induzido por nicotina.
M a c ho s F ê m e a s
0
20
40
60
80
100
*
% d
e S
ob
rev
ivê
nc
ia
Cada barra representa o número de animais que sobreviveram após 25 dias de
administração de NIC. Os animais receberam NIC (2,0 mg/kg, via intraperitoneal) por
25 dias durante a semana, segunda-feira à sexta-feira. A análise dos resultados foi feita
através de ANOVA de uma via seguida pelo teste de Student-Newman-Keuls como
teste post-hoc. *p<0,05 quando comparado aos animais machos.
50
4.2 Determinação dos níveis plasmáticos de 17β-Estradiol em animais machos e
fêmeas induzidos ao abrasamento por nicotina
Após a indução do abrasamento por NIC, os animais foram submetidos à
coleta de sangue por punção do sinus retro-orbital. Não houve diferenças significativas
nos níveis de 17β-estradiol em ratos machos e fêmeas periadolescentes submetidos ao
abrasamento, permanecendo com os níveis hormonais similares aos animais controles
congêneres [Controle macho: 909,9 ± 42,99 pg/ml (n=5); Abrasamento macho: 949,1 ±
50,91 pg/ml (n=4); Controle fêmea: 850,6 ± 63,97 pg/ml (n=5); Abrasamento fêmea:
954,8 ± 52,39 pg/ml (n=4)]. Portanto, nenhuma diferença foi observada em relação ao
sexo nos níveis plasmáticos deste hormônio.
51
Figura 10 – Níveis plasmáticos sanguíneos de 17β-estradiol em animais machos e
fêmeas submetidos ao abrasamento por nicotina.
C o n t ro le A b ra s a m e n t o C o n t ro le A b ra s a m e n t o
0
500
1000
15001
7
-Es
tra
dio
l (p
g/m
l)
M a c h o s F ê m e a s
Cada barra representa a média ± EPM de 4-5 animais por grupo. A análise dos
resultados foi feita através de ANOVA de uma via seguida pelo teste de Student-
Newman-Keuls como teste post-hoc para comparações múltiplas.
52
4.3 Determinação dos níveis de monoaminas
4.3.1 Determinação dos níveis de dopamina (DA) de animais machos e fêmeas ao
longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina
Os resultados na Figura 11 mostram uma elevação significativa dos níveis
de DA no CE de ratos machos no 1° dia de administração de NIC na dose de 2.0 mg/kg
quando comparados às fêmeas tratadas com NIC no mesmo período [NIC macho 1 dia:
4,92 ± 0,28 ƞg/g (n=6); NIC fêmea 1 dia: 0,34 ± 0,05 ƞg/g (n=8), p<0,05], bem como
em relação aos animais Controle macho [NIC macho 1 dia: 4,92 ± 0,28 ƞg/g (n=6);
Controle macho 1 dia: 0,96 ± 0,17 ƞg/g (n=6), p<0,05], porém os níveis deste
neurotransmissor diminuem ao longo do desenvolvimento do abrasamento nos machos
tratados com NIC em relação ao 1° dia de administração [NIC macho 1 dia: 4,92 ± 0,28
ƞg/g (n=6); NIC macho 10 dias: 3,02 ± 0,31 ƞg/g (n=5); NIC macho Abrasamento:
0,326 ± 0,07 ƞg/g (n=7), p<0,05].
Não houve diferenças significativas quanto ao conteúdo de DA em CE de
fêmeas tratadas com NIC ao longo do desenvolvimento do fenômeno (Figura 11).
No HC os níveis de DA mostram-se reduzidos significativamente no grupo
NIC machos 1 dia quando comparados ao controle e mantendo-se diminuídos no
abrasamento [NIC macho 1 dia: 0,027 ± 0,006 ƞg/g (n=6); Controle macho 1 dia: 0,084
± 0,008 ƞg/g (n=6); NIC macho Abrasamento: 0,022 ± 0,007 ƞg/g (n=6), p<0,05]
(Figura 12).
Não houve diferenças significativas nas fêmeas em relação aos machos nos
níveis de DA em HC nas fêmeas no início de indução e desenvolvimento do fenômeno
(Figura 12).
53
Figura 11: Níveis de DA no corpo estriado de animais machos e fêmeas ao longo do
desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
D
A n
an
og
ram
as
/g t
ec
ido
1 d ia 10 d ia s A b ra s a m e n t o
0
1
2
3
4
5
6
7C o n tro le M a c h o
N ic o tin a M a c h o
C o n tro le F ê m e a
N ic o tin a F ê m e a
a
a ,b
*
b ,c
#
Cada barra representa a média ± EPM de 5-8 animais por grupo. A análise dos
resultados foi feita através de ANOVA por duas vias seguida pelo teste de Tukey como
teste post-hoc. a,b,c p<0,05 quando comparado com animais controle, NIC 1 dia e NIC 10 dias,
respectivamente, pareados por sexo.
* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 1 dia. # p<0,05 quando comparado ao grupo macho 10 dias.
Abreviaturas: DA = dopamina
54
Figura 12: Níveis de DA no hipocampo de animais machos e fêmeas ao longo do
desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
DA
na
no
gra
ma
s/g
te
cid
o
1 d ia 10 d ia s A b ra s a m e n t o
0 .00
0 .05
0 .10
0 .15
0 .20C o n tro le M a c h o
N ic o tin a M a c h o
C o n tro le F ê m e a
N ic o tin a F ê m e a
a
b
a ,b
a ,c
c
Cada barra representa a média ± EPM de 5-8 animais por grupo. A análise dos
resultados foi feita através de ANOVA por duas vias seguida pelo teste de Tukey como
teste post-hoc. a,b,c p<0,05 quando comparado com animais controle, NIC 1 dia e NIC 10 dias,
respectivamente, pareados por sexo.
Abreviaturas: DA = dopamina
55
4.3.2 Determinação dos níveis do metabólito DOPAC de animais machos e fêmeas
ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina
Os resultados na Figura 13 mostram um aumento significativo dos níveis de
DOPAC no CE de ratos machos no 1° dia de administração de NIC na dose de 2.0
mg/kg quando comparados às fêmeas tratadas com NIC no mesmo período [NIC macho
1 dia: 3,42 ± 0,19 ƞg/g (n=6); NIC fêmea 1 dia: 0,51 ± 0,06 ƞg/g (n=8), p<0,05], bem
como em relação aos animais Controle macho [NIC macho 1 dia: 3,42 ± 0,19 ƞg/g
(n=6); Controle macho 1 dia: 1,72 ± 0,23 ƞg/g (n=6), p<0,05], porém os níveis deste
metabólito diminuíram ao longo do desenvolvimento do abrasamento nos machos
tratados com NIC em relação ao 1° dia de administração [NIC macho 1 dia: 3,42 ± 0,19
ƞg/g (n=6); NIC macho 10 dias: 1,66 ± 0,32 ƞg/g (n=5); NIC macho Abrasamento: 0,94
± 0,06 ƞg/g (n=7), p<0,05].
O conteúdo de DOPAC em CE de fêmeas está reduzido no 1° dia de
indução do fenômeno em relação aos controles [NIC fêmea 1 dia: 0,51 ± 0,06 ƞg/g
(n=8); Controle fêmea 1 dia: 1,57 ± 0,16 ƞg/g (n=6), p<0,05]. No entanto, no
abrasamento, estes níveis no grupo NIC fêmeas estavam aumentados ao comparar-se
com o 1° e 10° dias de adminitração da substância [NIC fêmea 1 dia: 0,51 ± 0,06 ƞg/g
(n=8); NIC fêmea 10 dias: 0,60 ± 0,10 ƞg/g (n=6); NIC fêmea Abrasamento: 1,48 ±
0,20 ƞg/g (n=8), p<0,05] (Figura 13).
No HC é evidenciado uma diminuição aguda do conteúdo de DOPAC nos
animais NIC macho 1 dia ao comparar com os animais controles [NIC macho 1 dia:
0,179 ± 0,028 ƞg/g (n=6); Controle macho 1 dia: 0,290 ± 0,026 ƞg/g (n=5), p<0,05]. Os
níveis deste metabólito mostram-se também reduzidos acentuadamente em machos
tratados com NIC no abrasamento em relação aos machos que foram submetidos a 1 e
10 dias de adminitração de NIC [NIC macho Abrasamento: 0,033 ± 0,009 ƞg/g (n=8);
NIC macho 1 dia: 0,179 ± 0,028 ƞg/g (n=6); NIC macho 10 dias: 0,276 ± 0,03 ƞg/g
(n=6), p<0,05] (Figura 14).
Em HC de fêmeas observa-se também uma redução dos níveis de DOPAC
no grupo NIC fêmea 1 dia ao comparar-se com o grupo NIC macho [NIC fêmea 1 dia:
0,036 ± 0,005 ƞg/g (n=8); NIC macho 1 dia: 0,179 ± 0,028 ƞg/g (n=6), p<0,05], bem
como ao Controle fêmea [NIC fêmea 1 dia: 0,036 ± 0,005 ƞg/g (n=8); Controle fêmea 1
dia: 0,131 ± 0,012 ƞg/g (n=6), p<0,05], conforme figura 14.
56
Figura 13: Níveis de DOPAC no corpo estriado de animais machos e fêmeas ao
longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
DO
PA
C n
an
og
ram
as
/g t
ec
ido
1 d ia 10 d ia s A b ra s a m e n t o
0
1
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3
4
5
N ic o tin a M a c h o
C o n tro le F ê m e a
N ic o tin a F ê m e a
C o n tro le M a c h o
a
*
b
b
a
b ,c
#
Cada barra representa a média ± EPM de 5-8 animais por grupo. A análise dos
resultados foi feita através de ANOVA por duas vias seguida pelo teste de Tukey como
teste post-hoc. a,b,c p<0,05 quando comparado com animais controle, NIC 1 dia e NIC 10 dias,
respectivamente, pareados por sexo.
* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 1 dia. # p<0,05 quando comparado ao grupo macho 10 dias.
Abreviaturas: DOPAC = Ácido 3,4-di-hidroxifenilacético
57
Figura 14: Níveis de DOPAC no hipocampo de animais machos e fêmeas ao longo
do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
D
OP
AC
na
no
gra
ma
s/g
te
cid
o
1 d ia 10 d ia s A b ra s a m e n t o
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3
0 .4
0 .5
0 .6
C o n tro le F ê m e a
N ic o tin a F ê m e a
C o n tro le M a c h o
N ic o tin a M a c h o
a
*
a
a ,b
c
#
a ,b ,c
Cada barra representa a média ± EPM de 5-8 animais por grupo. A análise dos
resultados foi feita através de ANOVA por duas vias seguida pelo teste de Tukey como
teste post-hoc. a,b,c p<0,05 quando comparado com animais controle, NIC 1 dia e NIC 10 dias,
respectivamente, pareados por sexo.
* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 1 dia. # p<0,05 quando comparado ao grupo macho 10 dias.
Abreviaturas: DOPAC = Ácido 3,4-di-hidroxifenilacético
58
4.3.3 Determinação dos níveis do metabólito HVA de animais machos e fêmeas ao
longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina
Na concentração de HVA em CE foi mostrado um aumento significativo no
grupo NIC macho 1 dia quando comparado ao grupo NIC fêmea 1 dia, como também
quando comparado ao Controle macho [NIC macho 1 dia: 0,84 ± 0,03 ƞg/g (n=6);
Controle macho 1 dia: 0,31 ± 0,05 ƞg/g (n=6), p<0,05]. Entretanto, ocorre uma queda
dos níveis deste metabólito em machos ao longo do desenvolvimento do fenômeno
(NIC macho 1 dia: 0,84 ± 0,03 ƞg/g (n=6); NIC macho 10 dias: 0,45 ± 0,06 ƞg/g (n=5);
NIC macho Abrasamento: 0,19 ± 0,02 ƞg/g (n=7), p<0,05] (Figura 15).
As fêmeas tratadas com NIC apresentam uma diminuição da concentração
de HVA no 1° dia de indução do abrasamento em relação ao grupo controle [NIC fêmea
1 dia: 0,19 ± 0,02 ƞg/g (n=8); Controle fêmea 1 dia: 0,56 ± 0,02 ƞg/g (n=6), p<0,05],
como também no desenvolvimento do fenômeno, ou seja, no abrasamento [NIC fêmea
Abrasamento: 0,24 ± 0,02 ƞg/g (n=7)] (Figura 15).
O conteúdo de HVA em HC dos grupos estudados não foi identificado no
cromatrograma.
59
Figura 15: Níveis de HVA no corpo estriado de animais machos e fêmeas ao longo
do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
HV
A n
an
og
ram
as
/g t
ec
ido
1 d ia 10 d ia s A b ra s a m e n t o
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5C o n tro le M a c h o
N ic o tin a M a c h o
C o n tro le F ê m e a
N ic o tin a F ê m e a
a
*
b
ba
a ,b
#
a ,c
Cada barra representa a média ± EPM de 5-8 animais por grupo. A análise dos
resultados foi feita através de ANOVA por duas vias seguida pelo teste de Tukey como
teste post-hoc. a,b,c p<0,05 quando comparado com animais controle, NIC 1 dia e NIC 10 dias,
respectivamente, pareados por sexo.
* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 1 dia. # p<0,05 quando comparado ao grupo macho 10 dias.
Abreviaturas: HVA = Ácido homovanílico
60
4.3.4 Determinação das taxas de metabolização dos neurotransmissores
DOPAC/DA e HVA/DA de animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento
do abrasamento por nicotina
As figuras 16A e 16B apresentam as taxas de metabolização dos
neurotransmissores DOPAC/DA e HVA/DA em corpo estriado, respectivamente.
Houve um aumento nas taxas de DOPAC/DA nos grupos NIC machos e fêmeas no
abrasamento em relação aos grupos NIC 1 dia e NIC 10 dias em ambos os sexos [NIC
macho Abrasamento: 3,96 ± 0,41 (n=6); NIC macho 1 dia: 0,70 ± 0,03 (n=7); NIC
macho 10 dias: 1,73 ± 0,24 (n=6); NIC fêmea Abrasamento: 3,97 ± 0,40 (n=6); NIC
fêmea 1 dia: 1,76 ± 0,14 (n=7); NIC fêmeas 10 dias: 0,79 ± 0,25 (n=5), p<0,05]. Nas
taxas de HVA/DA, foi observada uma elevação nos machos no abrasamento quando
comparados ao grupo NIC macho 1 dia [NIC macho Abrasamento: 0,80 ± 0,05 (n=6);
NIC macho 1 dia: 0,17 ± 0,009 (n=7), p<0,05]. Nas fêmeas tratadas com NIC, a taxa de
metabolização HVA/DA apresenta-se inferior aos controles [NIC fêmea 1 dia: 0,67 ±
0,05 (n=7); Controle fêmea 1 dia: 1,85 ± 0,19 (n=6); NIC fêmeas 10 dias: 1,19 ± 01,2
(n=6); Controle fêmea 10 dias: 1,82 ± 0,18 (n=6); NIC fêmea Abrasamento: 0,69 ± 0,04
(n=6); Controle fêmea Abrasamento: 1,85 ± 0,26 (n=6), p<0,05].
A figura 17 apresenta a taxa de metabolização DOPAC/DA em HC, no qual
houve um aumento significativo no grupo NIC machos 1 dia quando comparado ao
grupo NIC fêmea 1 dia [NIC macho 1 dia: 6,4 ± 0,73 (n=6); NIC fêmea 1 dia: 2,39 ±
0,36 (n=6)], sequenciada por uma redução destes valores em animais NIC machos no
dia 10 e abrasamento [NIC macho 1 dia: 6,4 ± 0,73 (n=6); NIC macho 10 dias: 1,83 ±
0,33 (n=6); NIC macho Abrasamento: 1,72 ± 0,25 (n=6), p<0,05]. Os animais fêmeas
não apresentaram diferenças significativas entre os grupos.
61
Figura 16: Taxas de metabolização dos neurotransmissores DOPAC/DA (A) e
HVA/DA (B) em corpo estriado de animais machos e fêmeas ao longo do
desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
D O P A C /D A
Ta
xa
de
me
tab
oli
za
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o
1 d ia 10 d ia s A b ra s a m e n t o
0
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2
3
4
5
6
C o n tro le F ê m e a
N ic o tin a F ê m e a
C o n tro le M a c h o
N ic o tin a M a c h o
a ,b ,c a ,b ,c
a
a
H V A /D A
Ta
xa
de
me
tab
oli
za
çã
o
1 d ia 10 d ia s A b ra s a m e n t o
0
1
2
3
4
C o n tro le F ê m e a
N ic o tin a F ê m e a
N ic o tin a M a c h o
C o n tro le M a c h o
ba a
*
a
Cada barra representa a média ± EPM de 5-8 animais por grupo. A análise dos
resultados foi feita através de ANOVA por duas vias seguida pelo teste de Tukey como
teste post-hoc. a,b,c p<0,05 quando comparado com animais controle, NIC 1 dia e NIC 10 dias,
respectivamente, pareados por sexo.
* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 10 dias.
Abreviaturas: DA = Dopamina; DOPAC = Ácido 3,4-di-hidroxifenilacético; HVA =
Ácido homovanílico
Figura A
Figura B
62
Figura 17: Taxas de metabolização dos neurotransmissores DOPAC/DA no
hipocampo de animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do
abrasamento por nicotina.
D O P A C /D A
Ta
xa
de
me
tab
oli
za
çã
o
1 d ia 10 d ia s A b ra s a m e n t o
0
2
4
6
8
10
C o n tro le F ê m e a
N ic o tin a F ê m e a
C o n tro le M a c h o
N ic o tin a M a c h o
a
*
bb
Cada barra representa a média ± EPM de 5-8 animais por grupo. A análise dos
resultados foi feita através de ANOVA por duas vias seguida pelo teste de Tukey como
teste post-hoc. a,bp<0,05 quando comparado com animais controle e NIC 1 dia, respectivamente,
pareados por sexo.
* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 1 dia.
Abreviaturas: DA = Dopamina; DOPAC = Ácido 3,4-di-hidroxifenilacético
63
4.3.5 Determinação dos níveis de noradrenalina (NE) de animais machos e fêmeas
ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina
Os resultados da Figura 18 mostram os níveis do neurotransmissor NE em
CE reduzidos no grupo NIC macho abrasamento quando comparado ao grupo NIC
macho 10 dias [NIC macho Abrasamento: 0,88 ± 0,11 ƞg/g (n=6); NIC macho 10 dias:
1,55 ± 0,24 ƞg/g (n=5), p<0,05]. Em relação às fêmeas, observou-se diminuição dos
níveis de NE nos animais NIC fêmea Abrasamento quando comparados aos animais
NIC fêmea 10 dias [NIC fêmea Abrasamento: 0,09 ± 0,01 ƞg/g (n=7); NIC fêmea 10
dias: 1,32 ± 0,09 ƞg/g (n=5), p<0,05], como também se mostram reduzidos ao
comparar-se aos machos tratados com NIC no abrasamento [NIC fêmea Abrasamento:
0,09 ± 0,01 ƞg/g (n=7); NIC macho Abrasamento: 0,88 ± 0,11 ƞg/g (n=6), p<0,05].
No HC de ratos machos foi evidenciado que os níveis de NE estão
diminuídos significativamente no grupo NIC macho abrasamento quando comparado ao
grupo NIC macho 10 dias [NIC macho Abrasamento: 0,02 ± 0,004 ƞg/g (n=7); NIC
macho 10 dias: 0,32 ± 0,03 ƞg/g (n=5), p<0,05]. Nas fêmeas, o conteúdo deste
neurotransmissor apresenta-se aumentado nos grupos NIC 10 dias e NIC abrasamento,
em relação ao 1° dia de administração [NIC fêmea 10 dias: 0,58 ± 0,03 ƞg/g (n=6); NIC
fêmea Abrasamento: 0,74 ± 0,11 ƞg/g (n=6); NIC fêmea 1 dia: 0,06 ± 0,01 ƞg/g (n=6),
p<0,05], como também se mostram elevados significativamente ao comparar-se aos
machos tratados com NIC no 10° dia de administração e no abrasamento [NIC fêmea 10
dias: 0,58 ± 0,03 ƞg/g (n=6); NIC macho 10 dias: 0,32 ± 0,03 ƞg/g (n=5); NIC fêmea
Abrasamento: 0,74 ± 0,11 ƞg/g (n=6); NIC macho Abrasamento: 0,02 ± 0,004 ƞg/g
(n=7)] (Figura 19).
64
Figura 18: Níveis de NE no corpo estriado de animais machos e fêmeas ao longo do
desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
NE
na
no
gra
ma
s/g
te
cid
o
1 d ia 10 d ia s A b ra s a m e n t o
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5C o n tro le M a c h o
N ic o tin a M a c h o
C o n tro le F ê m e a
N ic o tin a F ê m e a*
a ,b
a ,b
c
c
#
Cada barra representa a média ± EPM de 5-8 animais por grupo. A análise dos
resultados foi feita através de ANOVA por duas vias seguida pelo teste de Tukey como
teste post-hoc. a,b,c p<0,05 quando comparado com animais controle, NIC 1 dia e NIC 10 dias,
respectivamente, pareados por sexo.
* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 1 dia. # p<0,05 quando comparado ao grupo macho abrasamento.
Abreviaturas: NE = Noradrenalina
65
Figura 19: Níveis de NE no hipocampo de animais machos e fêmeas ao longo do
desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
N
E n
an
og
ram
as
/g t
ec
ido
1 d ia 10 d ia s A b ra s a m e n t o
0 .0
0 .5
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1 .5C o n tro le M a c h o
N ic o tin a M a c h o
C o n tro le F ê m e a
N ic o tin a F ê m e a
a ,b
a ,b
b
*
c
#
Cada barra representa a média ± EPM de 5-8 animais por grupo. A análise dos
resultados foi feita através de ANOVA por duas vias seguida pelo teste de Tukey como
teste post-hoc. a,b,c p<0,05 quando comparado com animais controle, NIC 1 dia e NIC 10 dias,
respectivamente, pareados por sexo.
* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 10 dias. # p<0,05 quando comparado ao grupo macho abrasamento.
Abreviaturas: NE = Noradrenalina
66
4.4 Determinação da atividade da enzima Acetilcolinesterase (AChE) de animais
machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina
A atividade da enzima AChE mostrou-se elevada significativamente no CE
de animais NIC fêmeas no abrasamento ao comparar com animais NIC machos neste
período [NIC fêmea Abrasamento: 10,59 ± 0,89 nmol/g/min (n=6); NIC macho
Abrasamento: 3,02 ± 0,61 nmol/g/min (n=6), p<0,05], bem como também, quando
comparada aos grupos NIC fêmea 1 dia e NIC fêmea 10 dias [NIC fêmea Abrasamento:
10,59 ± 0,89 nmol/g/min (n=6); NIC fêmea 1 dia: 5,62 ± 0,80 nmol/g/min (n=7); NIC
fêmea 10 dias: 4,26 ± 0,88 nmol/g/min (n=6), p<0,05] (Figura 20).
No HC foi evidenciada uma acentuada elevação da atividade desta enzima
em animais machos submetidos à administração aguda de NIC, ou seja, no 1º dia de
tratamento, quando comparados aos grupos controle macho e NIC fêmeas 1 dia [NIC
macho 1 dia: 11,53 ± 1,18 nmol/g/min (n=6); Controle macho 1 dia: 2,17 ± 0,35
nmol/g/min (n=7); NIC fêmea 1 dia: 3,72 ± 0,50 nmol/g/min (n=8), p<0,05]. Entretanto,
no decorrer do desenvolvimento do fenômeno de abrasamento induzido por NIC nos
machos é observado uma diminuição da atividade da enzima AChE atingindo valores
semelhantes aos seus controles, em comparação aos animais NIC macho 1 dia [NIC
macho 1 dia: 11,53 ± 1,18 nmol/g/min (n=6); NIC macho 10 dias: 2,47 ± 0,35
nmol/g/min (n=8); NIC macho Abrasamento: 2,99 ± 0,43 nmol/g/min (n=8); Controle
macho 10 dias: 1,77 ± 0,29 nmol/g/min (n=6); Controle macho Abrasamento: 2,22 ±
0,42 nmol/g/min (n=6), p<0,05]. Não houve diferenças significativas entre machos e
fêmeas quanto à atividade da AChE nos animais que desenvolveram o abrasamento
(Figura 21).
67
Figura 20 – Atividade da enzima Acetilcolinesterase no corpo estriado de animais
machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
A
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de
da
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15C o n tro le M a c h o
N ic o tin a M a c h o
C o n tro le F ê m e a
N ic o tin a F ê m e a
a ,b ,c
*
Cada barra representa a média ± EPM de 6-8 animais por grupo. A análise dos
resultados foi feita através de ANOVA por duas vias seguida pelo teste de Tukey como
teste post-hoc. a,b,c p<0,05 quando comparado com animais controle, NIC 1 dia e NIC 10 dias,
respectivamente, pareados por sexo.
* p<0,05 quando comparado ao grupo macho abrasamento.
68
Figura 21 – Atividade da enzima Acetilcolinesterase no hipocampo de animais
machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
Ati
vid
ad
e d
a A
Ch
E
m
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µg
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pro
t/m
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1 d ia 10 d ia s A b ra s a m e n t o
0
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15
20C o n tro le M a c h o
N ic o tin a M a c h o
C o n tro le F ê m e a
N ic o tin a F ê m e a
a
bb
*
a
Cada barra representa a média ± EPM de 6-8 animais por grupo. A análise dos
resultados foi feita através de ANOVA por duas vias seguida pelo teste de Tukey como
teste post-hoc. a,b p<0,05 quando comparado com animais controle e NIC 1 dia, respectivamente,
pareados por sexo.
* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 1 dia.
69
4.5 Determinação da expressão da subunidade NR1 fosforilado (p-NR1) do
receptor glutamatérgico NMDA e proteína de ligação ao Elemento de Resposta ao
AMPc fosforilado (p-CREB) por imunofluorescência
Na imunofluorescência para a subunidade NR1 fosforilada (p-NR1) do
receptor glutamatérgico NMDA, os resultados apresentados evidenciaram uma elevação
significativa da imunoexpressão no grupo NIC fêmea abrasamento ao comparar-se com
animais NIC machos abrasamento [NIC fêmea abrasamento: 4,70 ± 0,30 % (n=6); NIC
macho abrasamento: 2,80 ± 0,20 % (n=4), p<0,05], bem como também, quando
comparada aos grupos controle fêmea e NIC fêmea 1 dia [NIC fêmea abrasamento: 4,70
± 0,30 % (n=6); Controle fêmea: 1,82 ± 0,12 % (n=4); NIC fêmea 1 dia: 2,61 ± 0,51 %
(n=4), p<0,05] (Figuras 22, 23 e 24).
Na imunofluorescência para a proteína de ligação ao elemento-resposta ao
AMPc, o CREB fosforilado (p-CREB), ocorreu um evento similar ao supracitado, ou
seja, foi observado um aumento da imunoexpressão em CE de animais fêmeas tratadas
com NIC no abrasamento quando comparados ao grupo NIC macho, neste mesmo
período [NIC fêmea Abrasamento: 3,25 ± 0,28 % (n=5); NIC macho Abrasamento: 0,99
± 0,11 % (n=4), p<0,05], como também, quando comparada aos grupos controle e NIC
fêmeas 1 dia [NIC fêmea Abrasamento: 3,25 ± 0,28 % (n=5); Controle fêmea: 0,66 ±
0,23 % (n=5); NIC fêmea 1 dia: 1,38 ± 0,27 % (n=4), p<0,05] (Figuras 22, 23 e 25).
70
Figura 22 – Fotomicrografia da imunoexpressão de p-NR1 e p-CREB no corpo
estriado de ratos machos induzidos ao abrasamento por nicotina.
Azul: DAPI (marcador de neurônio); verde: p-CREB; vermelho: p-NR1; laranja: fusão.
Foto representativa de 1 animal por grupo experimental. Aumento de 20x.
100 µm 100 µm 100 µm
pp-- CC
RREE
BB ++
pp-- NN
RR11
pp
-- NNRR
11
Abrasamento
71
Figura 23 – Fotomicrografia da imunoexpressão de p-CREB e p-NR1 no corpo
estriado de ratos fêmeas induzidas ao abrasamento por nicotina.
Azul: DAPI (marcador de neurônio); verde: p-CREB; vermelho: p-NR1; laranja: fusão.
Foto representativa de 1 animal por grupo experimental. Aumento de 20x.
100 µm 100 µm 100 µm
pp-- NN
RR11
pp
-- CCRR
EEBB
++ pp
-- NNRR
11
Abrasamento
72
Figura 24 – Imunoexpressão da subunidade NR1 fosforilado (p-NR1) do receptor
glutamatérgico NMDA em corpo estriado de animais machos e fêmeas ao longo do
desenvolvimento do abrasamento por nicotina.
%
de
Áre
a M
arc
ad
a
C o n t r o le 1 d ia A br a sa m e n t o
0
2
4
6
M MF F FM
N ic o t in a
*, # , a
Cada barra representa a média ± EPM de 4-6 animais por grupo. A análise dos
resultados foi feita através de ANOVA por duas vias seguida pelo teste de Tukey como
teste post-hoc.
*,# p<0,05 quando comparado com animais controle fêmeas e NIC fêmeas 1 dia,
respectivamente. a p<0,05 quando comparado aos animais machos abrasamento.
Abreviaturas: M = machos; F = fêmeas
73
Figura 25 – Imunoexpressão da proteína de ligação ao Elemento de Resposta ao
AMPc fosforilada (p-CREB) em corpo estriado de animais machos e fêmeas ao
longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina. %
de
Áre
a M
arc
ad
a
C o n t r o le 1 d ia A br a sa m e n t o
0
1
2
3
4
5
N ic o t in a
M MF F FM
*, # , a
Cada barra representa a média ± EPM de 4-5 animais por grupo. A análise dos
resultados foi feita através de two-way ANOVA seguida pelo teste de Tukey como teste
post-hoc.
*,# p<0,05 quando comparado com animais controle fêmeas e NIC fêmeas 1 dia,
respectivamente. a p<0,05 quando comparado aos animais machos abrasamento.
Abreviaturas: M = machos; F = fêmeas
74
4.6 Determinação dos níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) de
animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por
nicotina
A análise dos níveis de BDNF pelo teste de ELISA mostrou um aumento
significante deste fator neurotrófico no CE de ratos fêmeas ao longo do
desenvolvimento do fenômeno, ou seja, no grupo NIC fêmea 10 dias, e persistindo com
os níveis elevados no grupo NIC fêmea abrasamento quando comparado aos animais
NIC fêmea 1 dia [NIC fêmea 10 dias: 2383,01 ± 77,67 pg/g (n=7); NIC fêmea
Abrasamento: 2377,42 ± 75,79 pg/g (n=6); NIC fêmea 1 dia: 1797,86 ± 73,93 pg/g
(n=6) p<0,05]. Entretanto, foi observada nos ratos machos, uma redução significativa do
conteúdo de BDNF no abrasamento em comparação às fêmeas tratadas com NIC no
mesmo período [NIC macho Abrasamento: 1349,85 ± 89,83 pg/g (n=7); NIC fêmea
Abrasamento: 2377,42 ± 75,79 pg/g (n=6), p<0,05], bem como, quando comparado aos
animais machos tratados com NIC no 1° e 10° dias [NIC macho Abrasamento: 1349,85
± 89,83 pg/g (n=7); NIC macho 1 dia: 2932,08 ± 139,74 pg/g (n=6); NIC macho 10
dias: 2683,20 ± 114,54 pg/g (n=7), p<0,05] (Figura 26).
Interessantemente, os níveis de BDNF do CE de machos controles são
aumentados em relação às fêmeas (Figura 26).
Em relação ao HC, houve diminuição significante dos níveis de BDNF nos
machos e fêmeas que desenvolveram o abrasamento, quando comparados aos animais
machos e fêmeas no 10° dia de administração de NIC, respesctivamente [NIC macho
Abrasamento: 128,74 ± 12,39 pg/g (n=6); NIC macho 10 dias: 544,94 ± 14,94 pg/g
(n=8); NIC fêmea Abrasamento: 156,57 ± 23,09 pg/g (n=7); NIC fêmea 10 dias: 264,66
± 20,59 pg/g (n=6), p<0,05], conforme apresentado na Figura 27.
75
Figura 26 – Níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em corpo
estriado de animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento
por nicotina.
BD
NF
pg
/g t
ec
ido
1 d ia 10 d ia s A b ra s a m e n t o
0
1000
2000
3000
4000C o n tro le M a c h o
N ic o tin a M a c h o
C o n tro le F ê m e a
N ic o tin a F ê m e a
*
a ,b ,c
a ,b a ,b
#
& &&
Cada barra representa a média ± EPM de 6-8 animais por grupo. A análise dos
resultados foi feita através de ANOVA por duas vias seguida pelo teste de Tukey como
teste post-hoc. a,b,c p<0,05 quando comparado com animais controle, NIC 1 dia e NIC 10 dias,
respectivamente, pareados por sexo.
* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 1 dia. # p<0,05 quando comparado ao grupo macho abrasamento. &p<0,05 quando comparado ao grupo controle macho
76
Figura 27 – Níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em
hipocampo de animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do
abrasamento por nicotina.
BD
NF
pg
/g t
ec
ido
1 d ia 10 d ia s A b ra s a m e n t o
0
200
400
600
800C o n tro le M a c h o
N ic o tin a M a c h o
C o n tro le F ê m e a
N ic o tin a F ê m e a
a ,b
*
c
c
Cada barra representa a média ± EPM de 6-8 animais por grupo. A análise dos
resultados foi feita através de ANOVA por duas vias seguida pelo teste de Tukey como
teste post-hoc. a,b,c p<0,05 quando comparado com animais controle, NIC 1 dia e NIC 10 dias,
respectivamente, pareados por sexo.
* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 10 dias.
77
5 DISCUSSÃO
No presente trabalho foi inicialmente demonstrado que a susceptibilidade ao
abrasamento por NIC é influenciada pelo sexo. Os resultados mostraram que as fêmeas
periadolescentes foram mais susceptíveis aos efeitos tóxicos da NIC, pois estes animais
desenvolveram estágio 5 de convulsão, de acordo com a escala de Racine (1972), no
19° dia administração, ao contrário dos machos periadolescentes que foram mais
resistentes, apresentando estágio 5 apenas no 24° dia de administração de NIC.
Associado a estes dados, foi observado também um elevado número de mortes no grupo
das fêmeas em relação aos machos.
A NIC tem sido descrita como o componente primário responsável por uma
ampla variedade de efeitos comportamentais e neuroquímicos (FOWLER et al., 2008;
SLOTKIN, 2002). É uma das drogas mais socialmente aceitáveis, o que a torna uma
substância de escolha inicial para experimentação entre os adolescentes. Evidências
epidemiológicas sugerem que o início precoce de experimentação desta droga está
associado a um aumento da probabilidade de desenvolvimento de dependência
(SCHRAMM-SAPYTA et al., 2009).
A adolescência é um período de desenvolvimento que implica um aumento
de sensações e busca de novidades, como também apresenta respostas mais fortes para
fatores ansiogênicos quando comparados com crianças e adultos (HOLDER;
BLAUSTEIN, 2014). Apesar do fato de que a busca pelo novo é sugerido ter um valor
preditivo à vulnerabilidade às drogas de abuso (BARDO et al., 1996; BELIN;
DEROCHE-GAMONET, 2012), na adolescência é evidenciada numerosas e dinâmicas
alterações do Sistema Nervoso Central, tais como plasticidade sináptica, eliminação e
maturação de vários sistemas neuroquímicos, bem como, mielinização contínua
(RAKIC et al., 1986; LENROOT; GIEDD, 2006).
Os efeitos da NIC são influenciados por idade e sexo, e isto é reforçado em
estudos pré-clínicos que demonstram que ratos periadolescentes são mais vulneráveis ao
efeitos comportamentais e neuroquímicos desta substância (ADRIANI et al., 2003). Em
linha com esta evidência, ratos periadolescentes quando expostos a repetidas
administrações de NIC apresentaram exacerbação das convulsões durante a idade adulta
em modelo de retirada do etanol (RILEY et al., 2010). As diferenças nos subtipos e
78
número de receptores nícotínicos ajudam a explicar esta vulnerabilidade relacionada à
idade quanto aos efeitos da NIC (DWYER et al., 2009).
Os nAChRs são expressos no cérebro humano no primeiro trimestre de
desenvolvimento e exibem um padrão complexo de expressão desenvolvimental região-
específica e temporalmente regulada. Entretanto, os picos de receptores nicotínicos com
subunidades α4β2 e α7 ligados no neocórtex e hipocampo ocorrem durante o terceiro
trimestre de desenvolvimento (COURT et al., 1997; COURT et al., 2000). Em
roedores, os níveis das subnidades α4β2 e α7 na maioria das regiões do cérebro tem sido
mostrado ser estável desde a adolescência até a idade adulta (ZHANG et al., 1998),
embora outras evidências descrevam um aumento de nAChR em adolescentes (DOURA
et al., 2008). Apesar dessas discrepâncias, subunidades α4β2 nAChR mostram
mudanças funcionais no córtex, hipocampo, estriado e tálamo durante a adolescência,
com o aumento induzido por NIC em comparação com adultos. Estas alterações podem
ser mediadas por aumento do número de receptores nestas regiões, ou por inserção de
subunidades, tais como α5 (KOTA et al., 2007).
Em muitas áreas do cérebro ocorre o aparecimento transiente de nAChRs
durante fases críticas do desenvolvimento, o que pode apresentar um papel funcional
importante na modulação desenvolvimental deste receptor, especialmente durante
períodos críticos, quando a maturação do cérebro é mais sensível à perturbação
(DWYER et al., 2009). Portanto, compreender as alterações comportamentais que
ocorrem durante a adolescência como resultado da exposição à NIC pode ajudar a
explicar porque a iniciação ao fumo neste período está associada a uma dependência em
longo prazo (CHEN; MILLAR, 1998; NIDA, 2012).
Evidências indicam que homens e mulheres podem diferir em seus hábitos
de fumar. Em geral, mulheres fumam menos cigarros por dia e tem menor dependência
de NIC (SHIFFMAN; PATON, 1999; PERKINS, 2001). O menor consumo pode estar
relacionado a diferenças de gênero nas motivações para fumar. Especificamente, as
mulheres que fumam diariamente tendem a fazê-lo em resposta a estímulos não-NIC
(tais como exposição aos estímulos, redução do estresse ou controle de peso), enquanto
os homens são mais propensos a fumar para manter os níveis de NIC (ALLEN;
ONCKEN; HATSUKAMI, 2014). Há também evidências nos resultados de parar de
fumar, em que no geral, as mulheres apresentam taxa de cessação inferiores aos dos
homens (BENOWITZ; HATSUKAMI, 1998; PERKINS; SCOTT, 2008; VOGEL et al.,
2014) e que adolescentes mulheres são particularmente vulneráveis aos efeitos da NIC.
79
No entanto, mecanismos neurobiológicos precisos relacionados a estas diferenças ainda
não estão claros (PAULY, 2008).
Em modelos animais, a NIC apresenta efeitos neuronais deletérios que se
mostram mais graves nas fêmeas. Em trabalhos anteriores foi demonstrado uma maior
susceptibilidade das mesmas aos danos causados pela sensibilização por NIC (GOMES
et al., 2013; OKAMURA et al., 2016), visto que o número de óbitos apresentado no
presente estudo foi em torno de 75% ao se equivaler o tempo de administração entre
machos e fêmeas.
Em nosso modelo de abrasamento por NIC, evidenciamos uma diferença de
sexo em relação ao padrão comportamental apresentado, visto que as fêmeas
periadolescentes desenvolveram o abrasamento mais rapidamente que o machos, ou
seja, com 19 dias de administração repetida, ao passo que os machos deu-se com 25
dias, sugerindo respostas distintas à NIC no Sistema Nervoso Central. Foi mostrado
também que as fêmeas não iniciaram o ciclo estral até o dia de desenvolvimento do
abrasamento, visto que esta observação foi confirmada pelos níveis similares do
hormônio 17β-estradiol em ambos os gêneros, ou seja, em animais machos e fêmeas,
descartando assim, a influência de hormônios esteroidais nas alterações
comportamentais e bioquímicas apresentadas neste estudo.
Existem várias explicações possíveis para as diferenças sexuais observadas
na sensibilidade ao abrasamento induzido por NIC. As fêmeas periadolescentes são
mais hiperativas em testes de campo aberto seguindo-se ao tratamento com anfetaminas
em comparação com os machos (BECKER et al., 1982). É possível que a exposição
repetida à NIC durante a adolescência interfira com os processos que normalmente estão
intrínsecos em ratas. Por exemplo, tem sido demonstrado que o estrógeno facilita a
neuroplasticidade e aprendizagem e a exposição crônica à nicotina inibe o elemento de
ligação de resposta ao estradiol em ratos (SHINGO et al., 2000). Hormônios sexuais
influenciam o início e a propagação das convulsões, apesar do estrógeno ser bem
conhecido por apresentar propriedades antioxidantes (KUMAR et al., 2011), no entanto,
nossos resultados sugerem que os níveis de estrógeno não estão envolvidos em
diferenças comportamentais quanto ao sexo apresentados neste estudo.
Está bem estabelecido que receptores nicotínicos facilitam a
neurotransmissão dopaminérgica (THRELFELL; CRAGG, 2011). Receptores que
apresentam a subunidade α4β2 são responsáveis pela liberação de DA (CHAMPTIAUX
et al., 2003), e apresentam-se em upregulation em animais periadolescentes controles e
80
tratados cronicamente com NIC (DOURA et al., 2008), regulando assim, parcialmente
os efeitos comportamentais da nicotina (PONTIERI et al., 1996).
Com base em que a modulação da transmissão dopaminérgica envolve a
participação de receptores nicotínicos e que a atividade de neurônios dopaminérgicos
pode ser inferida através da determinação dos níveis de DA, DOPAC e HVA no cérebro
ou fluido cerebrospinal (MOORE; WEST; DAWSON, 2005) decidiu-se investigar os
níveis de monoaminas e seus metabólitos em ambos os sexos durante o
desenvolvimento temporal do abrasamento por NIC (periadolescentes). Além disso,
foram calculadas as taxas de metabolização para a compreensão da renovação das
monoaminas e, assim, compreender os mecanismos envolvidos neste tipo de
abrasamento.
Os resultados do presente estudo mostram que o conteúdo de DA e
metabólitos DOPAC e HVA em corpo estriado de ratos machos estão aumentados no 1°
dia de administração de NIC, seguida por uma redução destes níveis no abrasamento,
enquanto nas fêmeas o conteúdo de DA é semelhante aos controles ao longo do
abrasamento, ao passo que DOPAC e HVA diminuíram no 1° dia de administração de
NIC, porém apenas os níveis de DOPAC elevaram-se próximo às taxas de controle no
abrasamento. As taxas estriatais de metabolização DOPAC/DA em machos e fêmeas no
abrasamento apresentam-se elevadas, sugerindo baixo fluxo e permanência destas
monoaminas na área analisada, ao passo que as taxas HVA/DA apresentam-se elevadas
no abrasamento apenas nos machos. No hipocampo, os níveis de DA e DOPAC nos
machos estão inferiores aos controles no 1° e último dia de administração de NIC
(abrasamento), ao passo que nas fêmeas o conteúdo de DA está semelhante aos
controles em ambos os períodos supracitados, e DOPAC reduzido apenas no 1° dia,
atingindo taxas próximas ao grupo controle no abrasamento. Os níveis de HVA não
foram identificados no cromatograma. As taxas de metabolização DOPAC/DA no HC
estão elevadas nos machos tratados por NIC no 1° dia de indução do abrasamento,
porém permaneceram semelhantes aos controles em machos e fêmeas no abrasamento.
O sistema dopaminérgico está amplamente difundido no cérebro. A maioria
dos neurônios dopaminérgicos estão presentes na substância negra (que se projeta para o
corpo estriado e sistema límbico) ou na área tegmental ventral (que se projeta para o
córtex frontal, amígdala e núcleo accumbens). Um estudo com administração aguda de
NIC, resultou no aumento dos níveis de DA, DOPAC e HVA no núcleo accumbens de
ratos machos (BEDNAR; FRIBERG; NORDBERG, 2004), estando em linha com
81
nossos achados, relacionando à ativação do sistema dopaminérgico mesocorticolímbico,
formado essencialmente de neurônios, cujos corpos celulares estão localizados na área
tegmentar ventral, e que liberam dopamina e ativam receptores D1 e D2 em regiões
como núcleo accumbens (BASSAREO; DI CHIARA; 1997; MARK; BLANDER;
HOEBEL, 1991). Portanto, os efeitos agudos e de curto prazo da NIC são
primariamente excitatórios e potencializam a atividade neuronal dopaminérgica (TOLU
et al., 2013).
Os neurônios dopaminérgicos são normalmente identificados pela presença
da tirosina hidroxilase (TH), enzima limitante da velocidade envolvida na síntese de
dopamina. A expressão desta enzima em dimorfismo sexual tem sido observado na
substantia negra (MA et al., 2007) e área tegmental ventral (BROWN et al., 2015), e sua
expressão pode ser influenciada pela exposição à NIC (SMITH et al., 1991). Estudo
incluindo modelo animal de doença de Parkinson por 6-OHDA mostrou que a NIC
aguda e subcrônica em doses baixas (0.6 e 0.8 mg kg−1, subcutânea) aumentam os
níveis de DA e TH no estriado de ratos machos lesionados (COSTA et al., 2001;
VISANJI et al., 2006), corroborando, em parte, com nossos dados.
Apesar da exposição aguda à NIC aumentar a RNAm (expressão gênica) de
TH e a exposição crônica aumentar a transmissão dopaminérgica (FERRARI et al.,
2002), os níveis de DA e metabólitos estriatais de ratos machos no presente trabalho
mostraram-se reduzidos em níveis próximos aos controles no abrasamento, tendendo a
um mecanismo adaptativo. Estes dados estão consistentes com estudos que revelam
nenhum efeito de injeções subcrônicas de NIC nos níveis de TH no estriado ou na
atividade desta enzima na área tegmentar ventral (SMITH et al., 1991), sugerindo
adaptações na atividade da TH decorrente à exposição crônica de NIC (BRUNZELL;
RUSSELL; PICCIOTTO, 2003), relacionando assim, a queda do conteúdo de DA com a
baixa síntese. Entretanto, a exposição crônica à NIC parece não alterar a função e
expressão do transportador de DA (VIEIRA-BROCK et al., 2015), proteína
transmembrana pré-sináptica importante na recaptação, não influenciando, portanto, nos
níveis desta monoamina.
Tem-se evidenciado também que a exposição à NIC em longo prazo induz
downregulation de receptores nicotínicos, α6β2 nAChR, subtipo-chave na regulação da
neurotransmissão dopaminérgica endógena no núcleo accumbens e ATV, reduzindo
assim, a liberação de DA (PEREZ, MCINTOSH; QUIK; 2013). Estudo de Koranda et
al. (2014) utilizando animais knockout para β2nAChR, sugeriu que a deleção da
82
subunidade β2 ou desensibilização de nAChR após exposição crônica de NIC induz
adaptações a longo prazo, como redução da transmissão dopaminérgica, e
consequentemente, parecendo prolongar o desenvolvimento do abrasamento.
Por outro lado, embora evidências anteriores sugiram que a liberação de DA
no estriado é maior em fêmeas do que em machos (WALKER et al., 2000), nossos
resultados mostraram um padrão diferente, em que o conteúdo de DA nas fêmeas
tratadas com NIC é semelhante ao controle ao longo da indução do fenômeno estudado,
e os metabólitos DOPAC e HVA, estão em níveis próximos e diminuídos em relação
aos controles no abrasamento, respectivamente. Entretanto, estas diferenças podem ser
justificadas pelo fato destas fêmeas não terem entrado em ciclo estral, visto que não
foram encontradas diferenças nos níveis de estradiol entre os grupos analisados. De
forma similar, o estudo de Torres et al. (2015) ao utilizar fêmeas ovariectomizadas
expostas à NIC (3.2 mg/kg s.c.) por 14 dias, mostraram não haver mudanças na
expressão gênica de receptores dopaminérgicos no núcleo accumbens em relação aos
controles, mas reduzido quanto às fêmeas não-ovariectomizadas. Assim, tem sido
hipotetizado que receptores estradiol de membrana (mER) estão anatomicamente
posicionados no estriado facilitando a liberação de DA induzida pela administração de
drogas de abuso e que esses hormônios são capazes de modular o sistema
dopaminérgico em fêmeas mas não em machos (ANKER; CARROLL, 2011; YOEST;
CUMMINGS; BECKER, 2014).
Para investigar os efeitos da NIC no sistema monoaminérgico, os níveis de
outra catelocamina – NE – foram analisados neste fenômeno. A estimulação pré-
sináptica de receptores nicotínicos tem mostrado induzir a liberação de NE
(CHANGEUX et al., 1998), entretanto, nossos resultados evidenciam que o conteúdo de
NE em corpo estriado de fêmeas e machos mostra-se semelhantes aos controles no 1°
dia e último dia do desenvolvimento do abrasamento, enquanto que no hipocampo, foi
identificado elevação destas taxas no abrasamento em fêmeas. Benwell e Balfour (1997)
demonstraram que administração repetida de NIC aumenta os níveis de NE em
hipocampo de ratos, corroborando em parte com nossos dados, na qual a alteração foi
encontrada nas fêmeas. Contudo, estudo de Risso et al. (2004) mostraram que a
administração de NIC por 10 dias promove um aumento na liberação de NE hipocampal
de preparações sinaptossomais resultante da upregulation de receptores glutamatérgicos
ionotrópicos – NMDA, fato este previamente observado neste trabalho, em que a
83
expressão da subunidade NR1-NMDA encontra-se aumentada em corpo estriado de
fêmeas no abrasamento.
Foi quantificado a atividade da enzima AChE e identificou-se que esta
atividade estava aumentada no corpo estriado apenas das fêmeas no abrasamento (19°
dia). Entretanto, a atividade desta enzima na área hipocampal das mesmas permaneceu
inalterada no mesmo período supracitado, sugerindo o não envolvimento da região neste
mecanismo relacionado ao fenômeno.
Acetilcolinesterase (AChE) é a enzima mais rápida nas células de
mamíferos, sendo um componente-chave da sinalização colinérgica, visto que é uma
enzima regulatória responsável pela finalização da transmissão de impulsos nervosos
sinápticos por meio da hidrólise da acetilcolina (MESHORER; SOREQ, 2006). Um
adaptativo aumento ou queda da atividade de AChE em compensação ao aumento ou
queda dos níveis de acetilcolina, respectivamente, tem sido extensamente descrito
(MARTELLA et al., 2009). Entretanto, a atividade de AChE é controlada através de
mecanismos de transcrição e pós-transcrição e está dramaticamente aumentada em
stress toxicológico, físico e psicológico, resultando no aumento da hidrólise e depleção
de acetilcolina em receptores colinérgicos, com consequente declínio da função cerebral
(KAUFER et al., 1998; MESHORER et al., 2002; SHOHAMI et al., 2000). A atividade
da AchE aumentada a longo prazo parece estar associada com a elevação da
excitabilidade, fato observado em estruturas do lobo temporal de ratos epilépticos, cujo
apresentaram disfunção colinérgica e hiperatividade desta enzima (ZIMMERMAN et
al., 2008).
Como discutido acima, a hiperexcitabilidade induz mudanças intracelulares
dependentes de Ca2+ na expressão de proteínas-chave colinérgicas, incluindo a redução
da expressão de colina-acetiltransferase e transportador vesicular de acetilcolina, e o
mais notável nestas alterações é a longa duração da up-regulation da AChE
(GUTIERREZ; HEINEMANN, 2001). Além disso, a AChE possui funções não-
colinérgicas em relação ao desenvolvimento, migração neuronal e crescimento de
neurites (SOREQ; SEIDMAN, 2001). Baseado nisto, pode-se pressupor que as fêmeas
desenvolveram o abrasamento mais precocemente por uma possível hiperexcitabilidade
neuronal relacionada ao aumento da atividade de AChE e que tem mostrado causar dano
às celulas neuronais (DAY; GREENFIELD, 2002), fato este não observado nos machos.
Muitos mecanismos de convulsão induzida por NIC tem sido propostos, e
todos eles envolvem a ativação inicial de nAChR centrais. A liberação de glutamato e
84
aumento da transmissão sináptica glutamatérgica podem elicitar convulsões em modelos
animais, sugerindo o envolvimento, principalmente de nAChR com subunidade α7,
canais de cálcio tipo L, receptores NMDA e formação de óxido nítrico em convulsões
induzidas por NIC (DAMAJ et al., 1999). Assim, a ativação excessiva de receptores
glutamatérgicos está implicada em algumas condições patológicas do SNC, incluindo
desordens neurodegenerativas, epilepsia, inflamação ou transtornos psiquiátricos
(ZIELINSKA et al., 2009).
Neste trabalho, visto que as principais alterações encontradas relacionadas
aos sistemas dopaminérgico e colinérgico ocorreram no corpo estriado, decidiu-se
investigar o envolvimento do sistema glutamatérgico neste modelo de abrasamento
através da imunoexpressão da subunidade NR1 fosforilada de receptores do tipo NMDA
(Ser897), pois a fosforilação direta de receptores glutamatérgicos é um mecanismo
chave na regulação da função e localização de receptores em sinapses (LEE, 2006).
As ações do neurotransmissor glutamato são mediadas por dois grandes
grupos de receptores: os ionotrópicos (iGluRs) e metabotrópicos (mGluRs). Os
receptores ionotrópicos, como NMDA e AMPA, estão envolvidos na rápida
neurotransmissão glutamatérgica, em contraste aos metabotrópicos, que são de ação
lenta e modulam a transmissão do glutamato (KEW; KEMP, 2005). Dentre todos estes
receptores, o mais estudado é o NMDA, devido ao seu envolvimento com a
neurotoxicidade, por localizar-se em membranas pós-sinápticas de sinapses excitatórias,
e alguns em membranas pré-sinápticas. NMDARs são formados pela combinação de
uma subunidade NR1 com um dos 4 subtipos da subunidade NR2 (NR2A-D) e em alguns
casos, com a subunidade NR3 (RUGGIERO et al., 2011).
Embora a NIC promova upregulation de iGluRs (GAO et al., 2010), Pistillo
et al. (2016) e Wang et al. (2007) ao analisarem a expressão de NR1 em estriado e
núcleo accumbens, respectivamente, por western blot, mostraram que a exposição
crônica à NIC não altera os níveis desta subunidade em ratos machos, corroborando
com nossos achados, que não apresentaram mudanças no 1° e último dia de indução do
abrasamento, indicando claramente que o tratamento com NIC não afeta a expressão de
p-NR1 no estriado e, consequentemente, não medeia o desenvolvimento do fenômeno
estudado.
Por outro lado, evidenciou-se um aumento da imunoexpressão de p-NR1
em corpo estriado de fêmeas induzidas ao abrasamento por NIC no dia em que este
fenômeno se desenvolveu. Estudos anteriores relatam uma possível interação entre a
85
atividade da enzima AChE e a função glutamatérgica, pois a superexpressão da AChE
altera o sistema glutamatérgico, e resulta em danos de estruturas sinápticas e da função
excitatória (DONG et al., 2004), como também o uso de inibidores da AChE, pode levar
a internalização de receptores NMDA através da estimulação de nAChR que
apresentam a subunidade α7. O aumento da subunidade NR1 fosforilada potencializa o
influxo de Ca2+, induzido pelo glutamato e desencadeando excitotoxicidade (SHEN et
al., 2010), visto que locais de fosforilação de serinas que têm sido identificados na
subunidade NR1 destes receptores são substratos para diversas proteínas quinases que
regulam o tráfego intracelular ou propriedades dos canais de receptores NMDA,
resultando em mudanças na sinalização subjacente à muitas formas de plasticidade
sináptica (LEE, 2006).
Evidências indicam que a função dos receptores NMDA-NR1 é regulada
por uma variedade de proteínas quinases, por exemplo, a ativação de PKC potencializa
correntes mediadas por receptor NMDA e o efeito sobre a regulação deste é o aumento
na taxa de canais abertos e regulação positiva da expressão do receptor na superfície
(CHEN; HUANG, 1992; LAN et al., 2001). Tal como acontece com PKC, PKA
também regula a função do receptor NMDA aumentando a amplitude de correntes pós-
sinápticas excitatórias mediadas pelo mesmo (RAMAN et al., 1996), pois estudos
recentes tem mostrado que inibidores de PKA reduzem a relativamente o influxo de
cálcio através de receptores NMDA, sugerindo que PKA regula a permeabilidade de
cálcio nestes receptores (SKEBERDIS et al., 2006). Neste trabalho, a fosforilação do
receptor NR1 ocorre na serina 897, no qual é fosforilado por PKA, resultando no
aumento da expressão de receptor NMDA, e sugerindo ser um importante regulador no
tráfego intracelular de subunidade NR1 através da via biossintética (SCOTT;
BLANPIED; EHLERS, 2003).
Outro achado também importante do presente estudo foi o aumento da
imunoexpressão de p-CREB, acompanhado pelo aumento do conteúdo de BDNF na
mesma área cerebral do grupo supracitado, enquanto os machos apresentaram redução
dos níveis deste fator neurotrófico no abrasamento.
Fatores de transcrição e fatores neurotróficos estão fortemente implicados
nos comportamentos relacionados às drogas de abuso (MCCLUNG; NESTLER, 2008).
Alterações na atividade do fator de transcrição CREB tem mostrado estar envolvida em
sensibilização psicomotora, memória, desordens afetivas, além de regular a expressão
de genes envolvidos em neuroplasticidade, sobrevivência celular e cognição,
86
desempenhando um papel crítico nas respostas adaptativas neuronais (PANDEY, 2003;
MCDAID et al., 2006; LIPSKY; MARINI, 2007).
Existe uma dualidade de relatos mostrando que a exposição crônica à NIC
não altera os níveis de p-CREB em áreas relacionadas à adição de drogas
(KIVINUMMI et al., 2011; VIEYRA-REYES; PICCIOTTO; MINEUR, 2008), e de
outros fatores, ΔFosB (MARTILLA; RAATTAMAA; AHTEE, 2006), como também
pode causar elevação da expressão de p-CREB (HU et al., 2002; MCCARTHY et al.,
2011). Entretanto nossos resultados sugerem que o desenvolvimento precoce ao
abrasamento apresentado pelas fêmeas está relacionado ao aumento da expressão de p-
CREB via sinalização NMDA (DAS et al., 1997). A ativação de receptores NMDA
medeia um rápido influxo de Ca2+ e contribuem para uma subsequente cascata de
sinalização intracelular que resulta na fosforilação do CREB (CHOE et al., 2004). Lee
et al. (2008) relataram que injeções repetidas de cocaína (20mg/kg – 9 dias) aumentam a
fosforilação da subunidade NR1-NMDA e p-CREB em estriado dorsal, bem como o uso
de antagonista NMDA, MK-801, reduz a expressão dos mesmos.
A NIC parece ter efeitos importantes e persistentes em fatores neurotróficos,
tais como fator de crescimento do nervo (NGF), fator de crescimento de fibroblasto-2
(FGF-2), neurotrofina-3 e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) (KENNY;
FILE; RATTRAY, 2000). O BDNF é um dos genes-alvo do CREB, e desempenha um
papel importante na sobrevivência, diferenciação, manutenção do desenvolvimento e
maturação de neurônios e na formação do circuito sináptico (CHAO, 2003). Liga-se ao
receptor tropomiosina cinase B – TrkB – e mostra ser importante também na morfologia
de neurônios dopaminérgicos e outros circuitos (OHIRA; HAYASHI, 2009).
Tradicionalmente, três vias de sinalização neuronal são ativadas por BDNF-TrkB, a
cascata Ras-extracelular cinase (ERK), o fosfatidilinositol 3-cinase (PI3K/Akt) e a via
fosfolipase C-gama (PLCγ), sendo esta responsável por iniciar o influxo de cálcio
através da modulação da atividade de canais iônicos via ativação de fosfoquinase C
(PKC) mediado por diacilglicerol (DAG) (YOSHI; CONSTANTINE-PATON, 2010),
contudo, os mecanismos pelos quais a NIC altera a expressão de fatores neurotróficos
ainda não estão esclarecidos e podem envolver diferentes vias de sinalização em
distintas áreas cerebrais (SON; WINZER-SEHAN, 2009).
A expressão de BDNF pode ser aumentada por psicoestimulantes em
neurônios dopaminérgicos da área tegmentar ventral e este aumento persiste durante a
abstinência e retirada destas substâncias (PU et al., 2006; GRAHAM et al., 2007).
87
Exposição repetida à NIC em baixas doses também potencializa o conteúdo de BDNF
no núcleo accumbens (CORRELL et al., 2009), e que mantém-se por 24 horas, como
também, 29 dias após a interrupção do tratamento (KIVINUMMI et al., 2011). Outro
modelo de abrasamento, induzido por pentilenotetrazol, traz a superexpressão de BDNF
dependente da ativação de receptores NMDA-NR2B, como evento associado ao
desenvolvimento deste fenômeno (ZHU et al., 2015). Interessantemente, nossos dados
mostram diferenças sexuais no conteúdo de BDNF do corpo estriado de ratos do grupo
controle, ou seja, os machos apresentam níveis fisiológicos elevados em relação às
fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento. Esse resultado corrobora com os
achados de Damborsky e Winzer-Serhan (2012), que também identificou diferenças
similares em hipocampo no 8° dia pós-natal.
A transmissão sináptica e fosforilação do receptor NMDA são reguladas
pelo BDNF-TrkB (MANDARA; LEVINE, 2008), bem como tem sido mostrado o
aumento da expressão da subunidade NR1 em cultura de neurônios hipocampais em
resposta ao tratamento com BDNF, sugerindo que o mecanismo que relaciona os níveis
deste fator neurotrófico à viabilidade de receptores NMDA na superfície celular, dá-se
pela via MAPK (CALDEIRA et al., 2007; KIM et al., 2011).
Sabe-se que o BDNF tem um papel crucial na epileptogênese, e que as vias
de sinalização hiperativadas por este podem incrementar a excitabilidade neuronal
através de alterações em várias propriedades de membrana (MHYRE; APPLEGATE,
2003).
88
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O presente estudo demonstrou que no modelo de indução do abrasamento
por NIC as fêmeas apresentam uma maior susceptibilidade aos efeitos farmacológicos
desta substância, resultante de:
• Desenvolver precocemente as alterações comportamentais inerentes ao
abrasamento;
• Apresentar elevada taxa de mortes decorrentes do abrasamento em relação aos
animais machos, evidenciando uma maior vulnerabilidade;
• Apresentar níveis elevados do neurotransmissor NE em hipocampo ao longo do
desenvolvimento do fenômeno;
• Apresentar um aumento na atividade da enzima Acetilcolinesterase em corpo
estriado no fenômeno;
• No abrasamento foi identificado um aumento na imunoexpressão da subunidade
NR1 fosforilada de receptor glutamatérgico do tipo NMDA em corpo estriado;
• Apresentar um aumento na imunoexpressão do fator de transcrição CREB
fosforilado em corpo estriado no fenômeno;
• Ter sido evidenciado elevado níveis do fator neurotrófico BDNF em corpo
estriado ao comparar-se com os animais machos no abrasamento.
89
7 CONCLUSÃO
Os nossos resultados mostram que as fêmeas são mais susceptíveis ao
modelo de abrasamento induzido por nicotina, fato este observado através do
desenvolvimento precoce das convulsões. Sugere-se que esta susceptibilidade esteja
relacionada à hiperexcitabilidade neuronal, decorrente da hiperatividade enzimática de
AChE associdada a ativação aumentada de subunidades NMDA-NR1, desencadeando
um possível influxo excessivo de Ca2+, que consequentemente, medeia sinalização de
fosfolipases e capaz de ativar p-CREB iniciando a expressão de BDNF, intensificando
assim, a neurotoxicidade. Todas estas alterações encontradas favorecem ao aumento da
excitabilidade neuronal, e consequentemente, dano celular durante a progressão
temporal do fenômeno (Figura 28).
Figura 28: Desenho do mecanismo sugerido à susceptibilidade das fêmeas ao
desenvolvimento do abrasamento por NIC.
Fonte: elaborado pelo autor.
Em relação aos machos, novos estudos acerca de mecanismos relacionados
ao desenvolvimento do abrasamento deverão ser realizados, a fim de compreender o
porquê de serem comportamentalmente mais resistentes, visto que poucas alterações
foram encontradas.
Contudo, tornam-se pertinentes estratégias terapêuticas que visem a
reversão destas características, uma vez que os mecanismos de abrasamento estão
relacionados com alguns distúrbios psiquiátricos.
90
REFERENCIAS
ADAMEC, Robert E. Does kindling model anything clinically relevant? Biological
Psychiatry, v. 27, n. 3, p. 249-79, 1990.
ANDERSEN, Susan L.; TROMPSON, Andrew T.; RUTSTEIN, Mark; TEICHER,
Martin H. Dopamine receptor pruning in prefrontal cortex during the periadolescent
period in rats. Synapse, v. 37, p.167-169, aug. 2000.
ANDERSEN, Susan L.; TROMPSON, Andrew P.; KRENZEL, Eileen; TEICHER,
Martin H. Pubertal changes in gonadal hormones do not underlie adolescent dopamine
receptor overproduction. Psychoneuroendocrinology, v. 27, p. 683-691, aug. 2002.
ADRIANI, Walter; SPIJKER, Sabine; DEROCHE-GAMONET, Véronique;
LAVIOLA, Giovanni; MOAL LE, Michel; SMIT, August B.; PIAZZA, Pier Vincenzo.
Evidence for enhanced neurobehavioral vulnerability to nicotine during periadolescence
in rats. The Journal of Neuroscience, v. 23, n. 11, p.4712-4716, jun. 2003.
AGARWAL, Nidhi Bharal; JAIN, Seema; AGARWAL, Nitin K.; MEDIRATTA,
Pramod K.; SHARMA, Krishna K. Modulation of pentylenetetrazole-induced kindling
and oxidative stress by curcumin in mice. Phytomedicine, v. 18, n. (8-9), p. 756-759,
jun. 2011.
ALLEN, Alicia M.; ONCKEN, Cheryl; HATSUKAMI, Dorothy. Women and smoking:
the effect of gender on the epidemiology, health effects, and cessation of smoking.
Current Addiction Reports, v. 1, n. 1, p. 53-60, 2014.
ALLEN, Sharon S.; BADE, Tracy; CENTER, Bruce; FINSTAD, Deborah;
HATSUKAMI, Dorothy. Menstrual phase effects on smoking relapse. Addiction
Journal, v. 103, n. 5, p. 809-821, may. 2008.
ANKER, Justin J.; CARROLL, Marily E. Females are more vulnerable to drug abuse
than males: evidence from preclinical studies and the role of ovarian hormones.
Current Topics in Behavioral Neurosciences, v. 8, p. 73-96, 2011.
BALFOUR, D. J. The neurobiology of tobacco dependence: a preclinical perspective on
the role of the dopamine projections to the nucleus. Nicotine &Tobacco Research, v.
6, p. 899-912, 2004.
BARDO, M. T.; DONOHEW, Lewis; HARRINGTON, Nancy Grant. Psychobiology of
novelty seeking and drug seeking behavior. Behavioural Brain Research, v. 77, n. (1-
2), p. 23-43, jun.1996.
BASTLUND, Jesper F.; BERRY, David; WASTSON, William P. Pharmacological and
histological characterisation of nicotine-kindled seizures in mice. Neuropharmacology,
v. 48, p. 975-983, 2005.
91
BASSAREO, Valentina; CHIARA, Gaetano Di. Differential influence of associative
and nonassociative learning mechanisms on the responsiveness of prefrontal and
accumbal dopamine transmission to food stimuli in rats fed ad libitum. The Journal of
Neuroscience, v. 17, n. 2, p. 851-861, jan. 1997.
BECKER, Jill B.; ROBINSON, Terry E.; LORENZ, Kimberly A. Sex differences and
estrous cycle variations in amphetamine-elicited rotational behavior. European
Journal of Pharmacology, v. 80, n. 1, p. 65-72, 1982.
BECKER, J.B.; HU, M. Sex Differences in Drug Abuse. Frontiers in
Neuroendocrinology, v. 29, p. 36–47, 2008.
BEDNAR, Ivan; FRIBERG, Linda; NORDBERG, Agneta. Modulation of dopamine
release by the nicotinic agonist epibatidine in the frontal cortex and the nucleus
accumbens of naive and chronic nicotine treated rats. Neurochemistry International,
v. 45, n. 7, p. 1049-1055, dec. 2004.
BELIN, David; DEROCHE-GAMONET, Véronique. Responses to novelty and
vulnerability to cocaine addiction: contribution of a multi-symptomatic animal model.
Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 2012.
BELL, Iris R.; ROSSI, John; GILBERT, Mary E.; KOBAL, Gerd; MORROW, Lisa A.;
NEWLIN, David B.; SORG, Barbara, A.; WOOD, Ronald W. Testing the neural
sensitization and kindling hypothesis for illness from low levels of environmental
chemicals. Environmental Health Perspectives, v. 105, p. 539- 547, mar. 1997.
Supplement 2.
BEN-ARI, Y. Limbic seizure and brain damage produced by kainic acid: mechanisms
and relevance to human temporal lobe epilepsy. Neuroscience, v. 14, p. 375-403, 1985.
BENOWITZ, N.L. Nicotine safety an toxicity. Oxford University Press. N. York,
1998.
BENOWITZ, Neal L.; HATSUKAMI, Dorothy. Gender differences in the
pharmacology of nicotine addiction. Addiction Biology, v. 3, p. 383-404, 1998.
BENOWITZ, Neal L. Nicotine addiction. Prim Care, v. 26, n. 3, p. 611-31, sep.1999.
BENWELL, M. E. M.; BALFOUR, D. J. K. Regional variation in the effects of nicotine
on catecholamine overflow in rat brain. European Journal of Pharmacology, v. 325,
p. 13–20, 1997.
BERTRAM, E. The relevance of kindling for epilepsy human. Epilepsia, v. 48 (Suppl.
2), p. 65–74, 2007.
BITANIHIRWE, B. K. Y.; LIM, M. P.; KELLEY, J. F.; KANEKO, T.; WOO, Tuw.
Glutamatergic deficits and parvalbumin-containing inhibitory neurons in the prefrontal
cortex in schizophrenia . BMC Psychiatry, v. 9, p. 71, nov. 2009.
92
BLUMENFELD, H. et al. Role of hippocampal sodium channel Nav1.6 in kindling
epileptogenesis. Epilepsia, v. 50, p. 44–55, 2009.
BOB, P.; GLASLOVA, K.; SUSTA, M.; JASOVA, D.; RABOCH, J. Traumatic
dissociation, epileptic-like phenomena, and schizophrenia. Neuroendocrinology
Letters, v. 27, n. 3, p. 321-326, 2006.
BOOZE, R.M.; WELCH, M.A.; WOOD, M.L.; BILLINGS, K.A.; APPLE, S.R.;
MACTUTUS, C.F. Behavioral sensitization following repeated intravenous nicotine
administration: Gender differences and gonadal hormones. Pharmacology
Biochemistry and Behavior, v. 64, p. 827– 839, 1999.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical
Biochemistry, v. 72, p. 248-254, 1976.
BRODIE, M.S. Low concentrations of nicotine increase the firing rate of neurons of the
rat ventral tegmental area in vitro. In: Adlkofer F, Thurau K, eds. Effects of nicotine on
biological systems. Birkhäuser: Basel; p. 373, 1991.
BROWN, Amira K.; MANDELKERN, Mark A.; FARAHI, Judah; ROBERTSON,
Chelsea; GHAHREMANI, Dara G.; SUMEREL, Brittany; MOALLEM, Nathasha;
LONDON, Edythe D. Sex differences in striatal dopamine D2/D3 receptor availability
in smokers and non-smokers. International Journal of Neuropsychopharmacology,
v. 15, n. 7, p. 989-994, 2012.
BROWN, Erinna C. Z.; STEADMAN, Casey J.; LEE, Theresa M.; PADMANABHAN,
Vasantha; LEHMAN, Michael N.; COOLEN, Lique M. Sex differences and effects of
prenatal exposure to excess testosterone on ventral tegmental area dopamine neurons in
adult sheep. European Journal of Neuroscience, v. 41, pp. n. 9, p. 1157-1166, may.
2015.
BRUNZELL, Darlene H.; RUSSELL, David S.; PICCIOTTO, Mariana R. In vivo
nicotine treatment regulates mesocorticolimbic CREB and ERK signaling in C57Bl/6J
mice. Journal of Neurochemistry, v. 84, n. 6, p. 1431-1441 mar. 2003.
BUCKINGHAM, Steven D.; JONES, Andrew K.; BROWN, Laurence A.; SATTELLE,
David B. Nicotinic acetylcholine receptor signalling: roles in Alzheimer’s disease and
amyloid neuroprotection. Pharmacological Reviews, v. 61, n. 1, p. 39-61, mar. 2009.
CALDEIRA, Margarida V.; MELO, Carlos V.; PEREIRA, Daniela B.; CARVALHO,
Ricardo F.; CARVALHO, Ana Luísa; DUARTE, Carlos B. BDNF regulates the
expression and traffic of NMDA receptors in cultured hippocampal neurons. Molecular
and Cellular Neuroscience, v. 35, n. 2, p. 208-219, jun. 2007.
CENDES, F.; ANTEL, S.B.; LI, L.M.; COLLINS, D.L.; KEARNEY, R.E.;
SHINGHAL, R.; ARNOLD, D.L. Predicting surgical outcome in temporal lobe epilepsy
patients using MRI and MRSI. Neurology, v. 58, n. 10, p. 1505-1512, 2002.
93
CHAO, Moses V. Neurotrophins and their receptors: a convergence point for many
signalling pathways. Nature Reviews Neuroscience, v. 4. p. 299-309, apr. 2003.
CHAMPTIAUX, Nicolas; GOTTI, Cecilia; CORDERO-ERAUSQUIN, Matilde;
DAVID, Denis J.; PRZYBYLSKI, Cédric; LÉNA, Clément; CLEMENTI, Francesco;
MORETTI, Milena; ROSSI, Francesco M.; NÓVÈRE, Nicolas Le; MCLNTOSH, J.
Michael; GARDIER, Alain M.; CHANGEUX, Jean Pierre. Subunit composition of
functional nicotinic receptors in dopaminergic neurons investigated with knock-out
mice. Journal of Neuroscience, v. 23, n. 21, p. 7820-7829, 2003.
CHEN, Jiajian; MILAR, Wayner J. Age of smoking initiation: implications for quitting.
Health Reports, v. 9, n. 4, p. 3946, 1998.
CHEN, Hao; MATTA, Shannon G.; SHARP, Burt M. Acquisition of nicotine self-
administration in adolescent rats given prolonged access to the drug.
Neuropsychopharmacology, v. 32, n. 3, p. 700-709, 2007.
CHEN, L.; HUANG, L. Y. Protein kinase C reduces Mg2+ block of NMDA-receptor
channels as a mechanism of modulation. Nature, v. 356, p. 521-523, 1992.
CHIARI, A.; TOBIN, J.R.; PAN, H-L.; HOOD, D.D.; EISENACH, J.C. Sex differences
in cholinergic analgesia I. Anesthesiology, v. 91, p. 447–454, 1999.
CHOE, Eun Sang; PARELKAR, Nikhil K.; KIM, Jong Yeon; CHO, Hyun Wook;
KANG, Ho Sung; MAO, Limin; WANG, John Q. The protein phosphatase 1/2A
inhibitor okadaic acid increases CREB and Elk-1 phosphorylation and c-fos expression
in the rat striatum in vivo. Journal of Neurochemistry, v. 89, p. 383-390, 2004.
COLLINS, Stephanie L.; WADE, Dean; LEDON, Jennifer; IZENWASSER,
Sari.Neurochemical alterations produced by daily nicotine exposure in periadolescent
vs. adult male rats. European Journal of Pharmacology, v. 502, n. (1-2), p. 75-85, oct.
2004.
CORRELL, Jennifer A.; NOEL, Daniel M.; SHEPPARD, A. Brianna; TROMPSON, K.
N.; LI, Y.; YIN, D.; BROWN, Russell W. Nicotine sensitization and analysis of brain-
derived neurotrophic factor in adolescent beta-arrestin-2 knockout mice. Synapse, v.
63, n. 6, p. 510-9, jun. 2009.
COSGROVE, Kelly P.; ESTERLIS, Irina; MCKEE, Sherry A.; BOIS, Frederic;
SEIBYL, John P.; MAZURE, Carolyn M.; KRISHNAN-SARIN, Suchitra; STALEY,
Julie K; PICCIOTTO, Marina R.; O’MALLEY, Stephanie S. Sex differences in
availability of β2*-nicotinic acetylcholine receptors in recently abstinent tobacco
smokers. Archives of General Psychiatry, v. 69, n. 4, p. 418-427, 2012.
COSGROVE, Kelly P.; WANG Shuo; KIM, Su-Jim; MCGOVERN, Erin; NABEEL
Nabulsi; GAO, Hong; LABAREE, David; TAGARE, Hemant D.; SULLIVAN, Jenna
M.; MORRIS, Evan D. Sex Differences in the Brain’s Dopamine Signature of Cigarette
Smoking. The Journal of Neuroscience, v. 34, n. 50, p. 16851-16855, dec. 2014.
94
COSTA, Gustavo; ABIN-CARRIQUIRY, J. A.; DAJAS, Federico. Nicotineprevents
striatal dopamine loss produced by 6-hydroxydopamine lesion in the substantia nigra.
Brain Research, v. 888, n. 2, p. 336-342, jan. 2001.
COURT, J. A.; LLOYD, S.; JOHNSON, M.; GRIFFITHS, M.; BIRDSALL, N. J. M.;
PIGGOTT, M. A.; OAKLEY, A. E. INCE, P. G.; PERRY, E. K.; PERRY, R. H.
Nicotinic and muscarinic cholinergic receptor binding in the human hippocampal
formation during development and aging. Developmental Brain Research, v. 10, n.
(1–2), p. 93-105, 1997.
COURT, Jenny A.; MARTIN-RUIZ, Carmen; GRAHAM, Alison; PERRY, Elaine.
Nicotinic receptors in human brain: topography and pathology. Journal of Chemical
Neuroanatomy, v. 20, n. (3–4), p. 281-298, 2000.
CUOMO, Dario; MARTELLA, Giuseppina; BARABINO, Emanuela; PLATINA,
Paola, VITA Daniela; MADEO, Graziella; SELVAM, Chelliah; GOUDET, Cyril;
OUESLATI, Nadia; PIN, Jean-Philippe; ACHER, Francine; PISANI, Antonio;
BEURRIER, Corinne; MELON, Christophe; GOFF, Lydia Kerkerian-Le; GUBELLINI,
Paolo. Metabotropic glutamate receptor subtype 4 selectively modulates both glutamate
and GABA transmission in the striatum: implications for Parkinson’s disease treatment.
Journal of Neurochemistry, v.109, 4, p. 1096- 1105, may. 2009.
CZUBAK, A.; NOWAKOWSKA, E.; GOLEMBIOWSKA, K.; KUS, K.; BURDA, K.;
METELSKA, J. Effect of venlafaxine and nicotine on the level of neurotransmitters and
their metabolites in rat brains. Journal of Physiology and Pharmacology, v. 61, n. 3,
p. 339-46, jun. 2010.
DAMAJ, M.I.; GLASSCO, W.; DUKAT, M.; MARTIN, B.R. Pharmacological
characterization of nicotine-induced seizures in mice. Journal of Pharmacology and
Experimetal Therapeuthics, v. 291, p. 1284–1291, 1999.
DAMBORSKY, J.C.; WINZER-SERHAN, U.H. Effects of sex and chronic neonatal
nicotine treatment on Na2+/K+/Cl− co-transporter 1, K+/Cl− co-transporter 2, brain-
derived neurotrophic factor, NMDA receptor subunit 2A and NMDA receptor subunit
2B mRNA expression in the postnatal rat hippocampus. Neuroscience, v. 225, p. 105-
117, 2012.
DANI, J. Overview of nicotinic receptors and their roles in the central nervous system.
Biological Psychiatry, v. 49, n. 3, p. 166-174, 2001.
DAS, Sheela; GRUNERT, Monika; WILLIAMS, Laurel; VINCENT, Steven R. NMDA
and D1 receptors regulate the phosphorylation of CREB and the induction of c-Fos in
striatal neurons in primary culture. Synapse, v. 25, n. 3, p. 227-233, mar. 1997.
DAY, T.; GREENFIELD, S. A. A non-cholinergic, trophic action of
acetylcholinesterase on hippocampal neurones in vitro: molecular mechanisms.
Neuroscience, v.111, n. 3, p. 649-656, may. 2002
95
DEAN, Olivia; GIORLANDO, Frank; BERK, Michael. N-acetylcysteine in psychiatry:
current therapeutic evidence and potential mechanisms of action. Journal of
Psychiatry Neuroscience, v. 36, n. 2, p. 78-86, mar. 2011.
DELFINO, Ralph J.; JAMNER, Larry D.; WHALEN, Carol K. Temporal analysis of
the relationship of smoking behavior and urges to mood states in men versus women.
Nicotine & Tobacco Research, v. 3, n. 3, p. 235-248, 2001.
DICKINSON, Jane A.; KEW, James N. C.; WONNACOTT, Susan. Presynaptic α7- and
β2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release
from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms. Molecular
Pharmacology, v. 74, n. 2, p. 348-59, aug. 2008.
DOREMUS-FITZWATER, T.L.; VARLINSKAYA, E.L.; SPEAR, L.P. Motivational
systems in adolescence: possible implications for age differences in substance abuse and
other risk-taking behaviors. Brain Cogn, v. 72, p. 114-123, 2010.
DOURA, Menahem B.; GOLD, Allison B.; KELLER, Ashleigh B.; PERRY, David C.
Adult and periadolescent rats differ in expression of nicotinic cholinergic receptor
subtypes and in the response of these subtypes to chronic nicotine exposure Brain
Research, v. 1215, p. 40-52, 2008.
DUCHEN, Michael R. Mitochondria and calcium: from cell signalling to cell death.
The Journal of Physiology, v. 529, p. 57-68, nov. 2000.
DWYER, Jennifer B.; MCQUOWN, Susan C.; LESLIE, Frances M. The dynamic
effects of nicotine on the developing brain. Pharmacology & Therapeutics, v. 122, n.
2, p.125-139, may. 2009.
ENGEL, Jerome. A proposed diagnostic scheme for people with epileptic seizures and
with epilepsy: Report of the ILAE task force on classification and terminology.
Epilepsia, v. 42, n. 6, p. 796-803, jun. 2001.
ENGEL, Jerome. Report of the ILAE classification core group. Epilepsia, v. 47, n. 9, p.
1558-1568, sep. 2006.
ERDTMANN-VOURLIOTIS, M.; RIECHERT, U.; MAYER, P.; GRECKSCH, G.;
HÖLLT, V. Pentylenetetrazole (PTZ)-induced c-fos expression in the hippocampus of
kindled rats is suppressed by concomitant treatment with naloxone. Brain Research, v.
11, p. 299-308, 1998.
FATTORE, L.; MELIS, M.; FADDA, P.; FRATTA, W. Sex differences in addictive
disorders. Frontiers in Neuroendocrinology, v. 35, p. 272-284, 2014.
FEDELE, E.; VARNIER, G.; ANSALDO, M.A.; RAITERI, M. Nicotine administration
stimulates the in vivo N-methyl-D-aspartate receptor/nitric oxide/cyclic GMP pathway
in rat hippocampus through glutamate release. British Journal of Pharmacology, v.
125, p. 1042–1048, 1998.
96
FERNANDES, Maria José da Silva. Epilepsia do lobo temporal: mecanismos e
perspectivas. Estudos Avançados, v. 27, n. 77, p. 85-96, 2013.
FERRARI, R.; NOVÈRE, N. Le; PICCIOTTO, M. R.; CHANGEUX, J. P.; ZOLI, M.
Acute and long-term changes in the mesolimbic dopamine pathway after systemic or
local single nicotine injections. European Journal of Neuroscience, v. 15, n. 11, p.
1810-1818, jun. 2002.
FISHER, Robert S.; BOAS, Walter Van Emde; BLUME, Warren, ELGER, Christian;
GENTON, Pierre; LEE, Phillip; ENGEL JUNIOR, Jerome. Epileptic seizures and
epilepsy: definitions proposed by the international League Against Epilepsy (ILAE) and
the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia, v. 46, n. 4, p. 470-2, apr. 2005.
FOWLER, Christie D.; ARENDS, Michael A.; KENNY, Paul J. Subtypes of nicotinic
acetylcholine receptors in nicotine reward, dependence, and withdrawal: evidence from
genetically modified mice. Behavioural Pharmacology, v. 19, n. (5-6), p. 461-484,
sep. 2008.
FUJII, Daryl; AHMED, Iqbal. Psychotic disorder following traumatic brain injury: a
conceptual framework. Cognitive Neuropsychiatry, v. 7, n. 1, p. 41-62, 2002.
GAO, Ming; JIN, Yu; YANG, Kechun; ZHANG, Die; LUKAS, Ronald J.; WU, Jie.
Mechanisms involved in systemic nicotine-induced glutamatergic synaptic plasticity on
dopamine neurons in the ventral tegmental area. The Journal of Neuroscience, v. 30,
n. 41, p.13814-13825, out. 2010.
GODDARD, G.V. Development of epileptic seizures through brain stimulation at low
intensity. Nature v. 214, p. 1020-1021, 1967.
GODDARD, G.V.; MCINTYRE, D.C., LEECH, C.K. A permanent change in brain
function resulting from daily electrical stimulation. Experimental Neurology, v. 25, p.
295–330, 1969.
GOODMAN; GILMAN. As Bases farmacológicas da terapêutica. 10º ed. Editora
McGraw Hill, Rio de Janeiro, 2005.
GOMES, P.X.L. et al. Differences in vulnerability to nicotine-induced kindling between
female and male periadolescent rats. Psychopharmacology, v. 225, p.115–126, 2013.
GONZALEZ, L.P.; VEATCH, L.M.; TICKU, M.K.; BECKER, H.C. Alcohol
withdrawal kindling: mechanisms and implications for treatment. Alcoholism: Clinical
and Experimental Research, v. 25 (5 Suppl ISBRA), p. 197S-201S, 2001.
GORTER, Jan A.; VLIET, Erwin A. Van; SILVA, Fernando H. Lopes da. Which
insights have we gained from the kindling and post-status epilepticus models? Journal
of Neuroscience Methods, v. 260, n. 15, p. 96-108, feb. 2016.
97
GRAHAM, Danielle L.; EDWARDS Scott; BACHTELL, Ryan K.; DILEONE, Ralph
GOTTI, Cecilia; ZOLI, Michele; CLEMENTI, Francesco. Brain nicotinic acetylcholine
receptors: native subtypes and their relevance. Trends in Pharmacological Sciences, v.
27, n. 9, p. 482-91, sep. 2006.
GOTTI, Cecilia; GUIDUCCI, Stefania; TEDESCO, Vincenzo; CORBIOLI, Silvia;
ZANETTI, Lara; MORETTI, Milena; ZANARDI, Alessio; RIMONDINI, Roberto;
MUGNAINI, Manolo; CLEMENTI, Francesco; CHIAMULERA, Christian; ZOLI,
Michele. Nicotinic acetylcholine receptors in the mesolimbic pathway: primary role of
ventral tegmental area α6β2* receptors in mediating systemic nicotine effects on
dopamine release, locomotion, and reinforcement. The Journal of Neuroscience, v. 30,
n. 15, p. 5311-25, apr. 2010.
GRASSI, Guido; SERAVALLE, Gino; CALHOUN, David A.; BOLLA, Gianni B.;
GIANNATTASIO, Cristina; MARABINI, Monica; BO, Albert Del; MANCIA,
Giuseppe. Mechanisms responsible for sympathetic activation by cigarette smoking in
humans. Circulation, v. 90, n. 1, p. 248-253, 1994.
GRUNBERG, N. E.; WINDERS, S. E.; WEWERS, M. E. Gender differences in
tobacco use. Health Psychology, v. 10, n. 2, p. 143-153, 1991.
GUERREIRO, C.A.M.; GUERREIRO, M.M.; CENDES, F.; LOPESCENDES, I.
Epilepsia. Lemos Editorial, São Paulo, 2000.
GUTIÉRREZ, Rafael; HEINEMANN, Uwe. Kindling induces transient fast inhibition
in the dentate gyrus-CA3 projection. European Journal of Neuroscience, v. 13, n. 7,
p. 1371-1379, 2001.
HEISHMAN, S.J.; TAYLOR, R.C.; HENNINGFIELD, J.E. Nicotine and smoking: a
review of effects on human performance. Experimental and Clinical
Psychopharmacology, v. 2, p. 345-395, 1994.
HEJMADI, M. V.; DAJAS-BAILADOR, F.; BARNS, S. M.; JONES, B.;
WONNACOTT, S. Neuroprotection by nicotine against hypoxia-induced apoptosis in
cortical cultures involves activation of multiple nicotinic acetylcholine receptor
subtypes. Molecular and Cellular Neuroscience, v. 24, n. 3, p. 779-786, nov. 2003.
HESDORFFER, D.C.; HAUSER, W.A.; OLAFSSON, E.; LUDVIGSSON, P.;
KJARTANSSON, O. Depression and suicide attempt as risk factors for Incident
unprovoked seizures. Ann. Neurol, v. 59, p. 35-41, 2006.
HIYOSHI, T.; WADA, J.A. Lasting nature of both transfer and interference in
amygdaloid kindling in cats: observation upon stimulation with 11-month rest following
primary site kindling. Epilepsia, v. 33, p. 222–227, 1992.
HOLDER, Mary K.; BLAUSTEIN, Jeffrey D. Puberty and adolescence as a time of
vulnerability to stressors that alter neurobehavioral processes. Frontiers in
Neuroendocrinology, v. 35, p. 89-110, jan. 2014
98
HU, Mei; LIU, Qing-song; CHANG, Karen T.; BERG, Darwin K. Nicotinic regulation
of CREB activation in hippocampal neurons by glutamatergic and nonglutamatergic
pathways. Molecular and Cellular Neuroscience, v. 21, n. 4, p. 616- 625, dec. 2002.
ITZHAK, Y.; MARTIN, J.L. Cocaine-induced kindling is associated with elevated
NMDA receptor binding in discrete mouse brain regions. Neuropharmacology, v.39, p.
32-39, 2000.
KANDRATAVICIUS, Ludmyla; BALISTA, Priscila Alves; LOPES-AGUIAR, Cleiton;
RUGGIERO, Rafael Naime; UMEOKA, Eduardo Henrique; GARCIA-CAIRASCO,
Norberto; BUENO-JÚNIOR, Lezio Soares; LEITE, João Pereira. Animal models of
epilepsy: use and limitations. Journal of Neuropsychiatric Disease and Treatment,
v. 10, p. 1693-1705, 2014.
KAUFER, D.; FRIEDMAN, Alon; SEIDMAN, Shlomo; SOREQ, Hermona. Acute
stress facilitates long-lasting changes in cholinergic gene expression. Nature, v. 393, p.
373-377, may. 1998.
KEDMI, M.; BEAUDET, A.L.; ORR-URTEGER, A. Mice lacking neuronal nicotinic
acetylocholine receptor beta4-subunit and mice lacking both alpha5- and beta4-subunits
are highly resistant to nicotine-induced seizures. Physiological Genomics, v. 13, p.
221–229, 2004.
KENNY, Paul J.; FILE, Sandra E.; RATTRAY, Marcus. Acute nicotine decreases, and
chronic nicotine increases the expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA in
rat hippocampus. Molecular Brain Research, v. 85, n. (1-2), p. 234-238, dec. 2000.
KRAUS, John E. Sensitization phenomena in psychiatric illness: lessons from the
kindling model. The Journal Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences, v. 12, n.
3, p. 3328-343, aug. 2000.
KELLY, Ann E.; THRONE, L. C. NMDA receptors mediate the behavioral effects of
amphetamine infused into the nucleus accumbens. Brain Research Bulletin, v.29, n. 2,
p. 247-254, aug. 1992.
KEW, James N. C.; KEMP, John A. Ionotropic and metabotropic glutamate receptor
structure and pharmacology. Psychopharmacology, v. 179, n. 1, p. 4-29, apr. 2005.
KISHIOKA, Shiroh; KIGUCHI, Norikazu; KOBAYASHI, Yuka; SAIKA, Fumihiro.
Nicotine Effects and the Endogenous Opioid System. Journal of Pharmacological
Sciences, v. 125, n. 2, p. 117-124, 2014.
KLOET, Sybren F. de; MANSVELDER, Huibert D.; VRIES, Taco J. De. Cholinergic
modulation of dopamine pathways through nicotinic acetylcholine receptors.
Biochemical Pharmacology, v. 97, n. 4, p. 425-38, oct. 2015.
KORANDA, Jessica L.; CONE, Jackson J.; MCGEHEE, Daniel S.; ROITMAN,
Mitchell F.; BEELER, Jeff A.; ZHUANG, Xiaoxi. Nicotinic receptors regulate the
dynamic range of dopamine release in vivo. Journal of Neurophysiology, v. 111, n. 1,
p. 103-11, jan. 2014.
99
KOTA, Dena; MARTIN, B. R.; ROBINSON, Susan E.; DAMAJ, M. I. Nicotine
dependence and reward differ between adolescent and adult male mice The Journal of
Pharmacology and Experimental Therapeutcs, v. 322, n. 1, p. 399-407, 2007.
KOTLOSKI, R.; LYNCH, M.; LAUERSDORF, S.; SUTULA, T. Repeated brief
seizures induce progressive hippocampal neuron loss and memory deficits. Progress in
Brain Research, v. 135:, p. 95-110, 2002.
KOTLOSKI, R.; MCNAMARA, J.O. Reduction of TrkB expression de novo in the
adult mouse impairs epileptogenesis in the kindling model. Hippocampus, v. 20, p.
713-723, 2010.
KRAUS, J.E. Sensitization Phenomena in Psychiatric Illness: Lessons from the
Kindling Model. The Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences, v.12,
p. 328–343, 2000.
KUMAR, P.; KALE, R. K.; MCLEAN, P.; BAQUER, N. Z. Protective effects of 17 β
estradiol on altered age related neuronal parameters in female rat brain. Neuroscience
Letters, v. 502, n. 1, p. 56-60, 2011.
LAN, J. Y.; SKEBERDIS, V. A.; JOVER, T.; GROOMS, S. Y.; LIN, Y.; ARANEDA,
R. C.; ZHENG, X.; BENNETT, M. V.; ZUKIN, R. S. Protein kinase C modulates
NMDA receptor trafficking and gating. Nature Neuroscience, v. 4, p. 382-390, 2001.
LAVIOLETTE, Steven R.; LAUZON, Nicole M.; BISHOP, Stephanie F.; SUN,
Ninglei; TAN, Huibing. Dopamine signaling through D1-like versus D2-like receptors in
the nucleus accumbens core versus shell differentially modulates nicotine reward
sensitivity. The Journal of Neuroscience, v. 28, n. 32, p. 8025-33, aug. 2008.
LEE, H.K. Synaptic plasticity and phosphorylation. Pharmacology & Therapeutics, v.
112, p. 810–832, 2006.
LENROOT, Rhoshel K.; GIEDD, Jay N. Brain development in children and
adolescents: insights from anatomical magnetic resonance imaging. Neuroscience &
Biobehavioral Reviews, v. 30, n. 6, p. 718-729, jan. 2006.
LEUNG, L. Stan; BOON, Kathy A. Kindling in the posterior cingulate cortex:
electrographic and behavioral characteristics. Electroencephalography and Clinical
Neurophysiology, v. 76, n. 2, p. 177-186, aug. 1990.
LEVIN, Edward D.; REZVANI, Amir H.; MONTOYA, Daniel; ROSE, Jed E.;
SWARTZWELDER, H. Scott. Adolescent-onset nicotine self-administration modeled
in female rats. Psychopharmacology, v. 169, n. 2, p. 141-149, sep. 2003.
LIPSKY, Robert H.; MARINI, Ann M. Brain-derived neurotrophic factor in neuronal
survival and behavior-related plasticity. Annals of the New York Academy Sciences,
v. 1122, p. 130-143, 2007.
100
LITTLE, H.J.; NUTT, D.J.; TAYLOR, S.C. Selective changes in the in vivo effects of
benzodiazepine receptor ligands after chemical kindling with FG 7142.
Neuropharmacology, v. 26, p. 25-31, 1987.
LIU, Qiang; ZHAO, Baolu. Nicotine attenuates β-amyloid peptide-induced
neurotoxicity, free radical and calcium accumulation in hippocampal neuronal cultures.
British Journal of Pharmacology, v. 141, n. 4, p. 746-754, 2004.
LIU, D.S.; O’BRIEN, T.J.; WILLIAMS, D.A.; HICKS, R.J.; MYERS, D.E. Lamina-
specific changes in hippocampal GABA(A)/cBZR and mossy fibre sprouting during and
following amygdala kindling in the rat. Neurobiology of Disease, v. 35, p. 337–347,
2009.
LOSCHER, W.; HEIDRUN, P.; PIOTR, W.; WOJCIECH, D.; CHRISTOPHER, G.P.
Are neuronal nicotinic receptors a target for antiepileptic drug development? Studies in
different seizure models in mice and rats. European Journal of Pharmacology, v. 466,
p. 99–111, 2003.
LYNCH, Wendy J. Sex and ovarian hormones influence vulnerability and motivation
for nicotine during adolescence in rats. Pharmacology Biochemistry and Behavior, v.
94, n. 1, p. 43-50, nov. 2009.
MA, Yuan-Yi; KONG, Shu-Zhen; YANG, Li-Jiang; MENG, Jin-Lan; LV, Le-Chun;
HE, Min. Sexual dimorphisms of dopaminergic neurons in rat substantia nigra. Acta
Physiologica Sinica, v. 59, n. 6, p. 753-758, dec. 2007.
MADARA, Joseph C.; LEVINE, Eric S. Presynaptic and postsynaptic NMDA receptors
mediate distinct effects of brain-derived neurotrophic factor on synaptic transmission.
Journal of Neurophysiology, v. 100, n. 6, p. 3175-3184, 2008.
MANSVELDER, Huibert D.; MCGEHEE, Daniel S. Long-term potentiation of
excitatory inputs to brain reward areas by nicotine. Neuron, v. 27, n. 2, p. 349-57, aug.
2000.
MANSVELDER, Huibert D.; KEATH, J. Russel; MCGEHEE, Daniel S. Synaptic
mechanisms underlie nicotine-induced excitability of brain reward areas. Neuron, v. 33,
n. 6, p. 905-19. mar. 2002.
MARGERISON, J.H.; CORSELLIS, J.A.N. Epilepsy and the temporal lobes: a clinical
encephalographic and neuropathological study of the brain in epilepsy, with particular
reference to the temporal lobes. Brain, v. 89, p. 499-530, 1966.
MARMIROLI, P.; CAVALETTI, Guido. The glutamatergic neurotransmission in the
central nervous system. Current Medicinal Cheminstry, v. 19, n. 9, p. 1269-1276, feb.
2012.
MARK, G. P.; BLANDER, D. S.; HOEBEL, B. G. A conditioned stimulus decreases
extracellular dopamine in the nucleus accumbens after the development of a learned
taste aversion. Brain Research, v. 551, n. (1-2), p. 308-310, 1991.
101
MARQUES, A.C.P.R. et al., Consenso sobre o tratamento da dependência de nicotina.
Revista Brasileira de Psiquiatria, v. 23, p. 200-214, 2001.
MARTTILA, Kristiina; RAATTAMAA, Helena; AHTEE, Liisa. Effects of chronic
nicotine administration and its withdrawal on striatal FosB/ΔFosB and c-Fos expression
in rats and mice. Neuropharmacology, v. 51, n. 1, p. 44-51, 2006.
MCCARTHY, Michael J.; DUCHEMIN, Anne-Marie; NEFF, Norton H.;
HADJICONSTANTINOU, Maria. CREB involvement in the regulation of striatal
prodynorphin by nicotine. Psychopharmacology, v. 221, n. 1, p. 143-53. may. 2012.
MATAGNE, A.; KLITGAARD, H. Validation of corneally kindled mice: a sensitive
screening model for partial epilepsy in man. Epilepsy Research, v. 31, p. 59-71, 1998.
MCDAID, John; DALLIMORE, Jeanine E.; MACKIE, Alexander R.; NAPIER, T.
Celeste. Changes in accumbal and pallidal pCREB and deltaFosB in morphine-
sensitized rats: correlations with receptor-evoked electrophysiological measures in the
ventral pallidum. Neuropsychopharmacology, v. 31, n. 6, p. 1212-1226, jun. 2006.
MCCLUNG, Colleen A.; NESTLER, Eric J. Neuroplasticity mediated by altered gene
expression. Neuropsychopharmacology, v. 33. p. 3-17, 2008.
MCINTYRE, D.C.; POULTER, M.O.; GILBY, K. Kindling: some old and some new.
Epilepsy Research, v. 50, p. 79–92, 2002.
MELDRUM, B.S.; BRUTON, C.J. EPILEPSY. In: Greenfiels neuropathology. 5th ed.
Oxford, England: Oxford University Press; p. 1246-83, 1992.
MESHORER, Eran; SOREQ, Hermona. Virtues and woes of AChE alternative splicing
in stress-related neuropathologies. Trends in Neurosciences, v. 29, n. 4, p. 216-224,
apr. 2006.
MESHORER, E.; BRYK, B.; TOIBER, D.; COHEN, J.; PODOLY, E.; DORI, A.;
SOREQ, H. SC35 promotes sustainable stress-induced alternative splicing of neuronal
acetylcholinesterase mRNA. Molecular Psychiatry, v. 10, p. 985–997, 2005.
MESHORER, Eran; ERB Christina; GAZIT, Roi; PAVLOVSKY, Lev; KAUFER,
Daniela; FRIEDMAN, Alon; GLICK, David; BEN-ARIE, Nissim; SOREQ, Hermona.
Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal
hypersensitivity. Science, v. 295, n. 5554, p. 508-512, jan. 2002.
MILLER, K.A.; WITKIN, J.M.; UNGARD, J.T.; GASIOR, M. Pharmacological and
behavioral characterization of cocaine-kindled seizures in mice. Psychopharmacology,
v. 148, p.74-82, 2000.
MINISTÉRIO DA SAÚDE. Portaria SAS/MS Nº 492, de 23 de setembro de 2010.
portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/pcdt_epilepsia_.pdf
Acesso em: 15 de maio de 2016.
102
MINOZZI, Silvia; AMATO, Laura; DAVOLI, Marina; FARREL Michael F.;
REISSER, Anelise A. R. L. Lima; PANI, Pier Paolo; LIMA, Maurício Silva de;
SOARES, Bernardo G. O.; VECCHI, Simona. Anticonvulsants for cocaine dependence.
Cochrane Database Systematic Reviews, v. 16, n. 2, apr. 2008.
MITCHELL, S. N. Role of the locus coeruleus in the noradrenergic response to a
systemic administration of nicotine. Neuropharmacology, v. 32, n. 10, p. 937-949,
1993.
MODY, I.; SCHWARTZKROIN, P.A. Acute seizures models (intact animals). In:
Epilepsy: a comprehensive textbook, eds. J. Engel Jr., TA Pedley, p. 397-404,
Lippincott-Raven Publishers, 1997.
MONTGOMERY, Andrew J.; LINGFORD-HUGHES, Anne R.; EGERTON, Alice;
NUTT, David J.; GRASBY, Paul M. The effect of nicotine on striatal dopamine release
in man: A [11C] raclopride PET study. Synapse, v. 61, n. 8, p. 637-45, aug. 2007.
MORIMOTO, K.; FAHNESTOCK, M.; RACINE, R.J.; LIU, J.L. Kindling and status
epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Progress in Neurobioly, v. 73, p. 1–
60, 2004.
MULA, Marco; MAROTTA, Antonelle Ester; MONACO, Francesco. Epilepsy and
bipolar disorders. Expert Review of Neurotherapeutics, v. 10, p. 13-23, 2010.
NAQUIRA, Daisy; ZUNINO, Edith; ARQUEROS, L.; VIVEROS, O. Humberto.
Chronic effects of nicotine on catecholamine synthesizing enzymes in rats. European
Journal of Pharmacology, v. 47, n. 2, p. 227-229, 1978.
NATIONAL INSTITUTE ON DRUG ABUSE. Tobacco/Nicotine. 2012. Disponível
em: www.drugabuse.gov/publications/research-reports/tobacconicotine. Acesso em: 15
de julho de 2016
NUNES, Jean Costa; ZAKON, Danielle Brandes; CLAUDINO, Lucia Sukys;
GUARNIERI, Ricardo; BASTOS, Alexandre; QUEIROZ, Luiz Paulo; Walz Roger;
LIN, Katia. Hipocampal sclerosis and ispislateral headache among mesial temporal lobe
epilepsy patients. Seizure, v. 20, n. 6, p. 480-484, jul. 2011.
NUTT, D.J.; COWEN, P.J.; BATTS, C.C.; GRAHAME-SMITH, D.G.; GREEN, A.R.
Repeated administration of subconvulsant doses of GABA antagonist drugs. I. Effect on
seizure threshold (kindling).Psychopharmacology,.v. 76, p. 84-87, 1982.
OKAMURA, A.M.N.C. et al. N-acetylcysteine attenuates nicotine-induced kindling in
female periadolescent rats. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological
Psychiatry, v. 67, p. 58–65, 2016.
OKIRA, K.; HAYASHI, M. A new aspect of the TrkB signaling pathway in neural
plasticity. Current Neuropharmacology, v. 7, n. 4, p. 276-85, dec. 2009.
OLFERT, E.D. et al. Guide to the Care and Use of Experimental Animals, volume 1,
2nd edn. Canadian Council on Animal Care: 1993.
103
PANDEY, Subhash C. Anxiety and alcohol abuse disorders: a common role for CREB
and its target, the neuropeptide Y gene. Trends in Pharmacological Sciences, v. 24, n.
9, p. 456-460, sep. 2003.
PANUS, Peter C.; JOBST, Erin E.; TINSLEY, Suzanne L.; MASTERS, Susan B.;
TREVOR, Anthony J.; KATZUNG, Bertram G. Farmacologia para Fisioterapeutas.
Porto Alegre: Editora Artmed, 2011.
PAULY, James R. Gender differences in tobacco smoking dynamics and the
neuropharmacological actions of nicotine. Frontiers in Bioscience, v.13, n. 2, p. 505-
516, feb. 2008.
PERKINS, Kenneth A.; SCOTT, John. Sex differences in long-term smoking cessation
rates due to nicotine patch. Nicotine & Tobacco Research, v. 10, n. 7, p. 1245-1250,
2008.
PERKINS, Kenneth A. Smoking cessation in women. Special considerations. CNS
Drugs, v. 15, n. 5, p. 391-411, 2001.
PEREZ, Xiomara A.; MCLNTOSH, J. Michael; QUIK, Maryka. Long-term nicotine
treatment down-regulates α6β2* nicotinic receptor expression and function in nucleus
accumbens. Journal of Neurochemistry, v. 127, n. 6, p. 762-771, dec. 2013.
PÉREZ, Eduardo Barragán. Daño Neurológico y Epilepsia: Estrategia y
Herramientas Multidisciplinarias de Apoyo. 2 ed. México: Editorial Linae, 2004.
PERUCCA, Emílio; TOMSON, Torbjörn. The pharmacological treatment of epilepsy in
adults. The Lancet Neurology, v. 10, n. 5, p. 446-456, may. 2011.
PICCIOTTO, Marina R.; ZOLI, Michele. Neuroprotection via nAChRs: the role of
nAChRs in neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s and Parkinson’s disease.
Frontiers in Bioscience, v. 13, n. 2, p. 492-504, feb. 2008.
PINEL, J.P.J.; ROVNER, L.I. Experimental Epileptogenesis - Kindling-Induced
Epilepsy in Rats: Experimental Neurology, v.58 (2), p.190-202, 1978.
PINHEIRO, C. R.; OLIVEIRA, E.; MANHÃES, A. C.; FRAGA, M. C.; CLAUDIO-
NETO, S.; YOUNES-RAPOZO, V.; LOTUFO, B. M.; MOURA, E. G.; LISBOA, P.C.
Exposure to nicotine increases dopamine receptor content in the mesocorticolimbic
pathway of rat dams and offspring during lactation. Pharmacology, Biochemistry and
Behavior, v.136, p. 87-101, 2015.
PISTILLO, Francesco; FASOLI, Francesca; MORETTI, Milena; MCCLURE-
BEGLEY, Tristan; ZOLI, Michele; MARKS, Michael J.; GOTTI, Cecilia. Chronic
nicotine and withdrawal affect glutamatergic but not nicotinic receptor expression in the
mesocorticolimbic pathway in a region-specific manner. Pharmacological Research,
v. 103, p. 167-176, jan. 2016.
PLANT, T.M. Neuroendocrine control of the onset of puberty. Front.
Neuroendocrinol, v. 38, p. 73-88, 2015.
104
PONTIERI, Francesco E.; TANDA, Gianluigi; ORZI, Francesco; CHIARA, Gaetano.
Effects of nicotine on the nucleus accumbens and similarity to those of addictive drugs.
Letters to Nature, v. 382, p. 255-257, jul. 1996.
POST, R.M.; KOPANDA, R.T. Letter: Cocaine, kindling, and reverse tolerance.
Lancet, v. 15, p. 409-410, 1975.
POST RM., WEISS SR, PERT A, UHDE TW. Chronic cocaine administration:
sensitization and kindling effects. In: Raskin, A., Fisher, S. (Eds.), Cocaine: Clinical
and Biobehavioral Aspects. Oxford University Press, New York, p. 109-173; 1987.
POST, Robert M. Do the epilepsies, pain syndromes, and affective disorders share
common kindling-like mechanisms? Epilepsy Research, v. 50, n. (1-2), p. 203-219,
jun. 2002.
POST, Robert M. Kindling and sensitization as models for affective episode recurrence,
cyclicity, and tolerance phenomena. Neuroscience & Biobehavioral Reviews, v. 31, n.
6, p. 858-873, jan. 2007.
POST, Robert M.; WEISS, Susan R. B. Endogenous biochemical abnormalities in
affective illness: Therapeutic versus pathogenic. Biological Psychiatry, v. 32, n. 6,
p. 469-484, 1992.
POST, Robert M.; WEISS, Susan R. B.; SMITH, Mark; LI, He; MCCANN, Una.
Kindling versus quenching - Implications for the evolution and treatment of
posttraumatic stress disorder. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 821,
p. 285-295, jun. 1997.
POST, R. M. Neurobiology of seizures and behavioral abnormalities. Epilepsia, v. 45,
p. 5-14, 2004. Supplement 2.
POST, Robert M.; WEISS, Susan R. Sensitization and kindling phenomena in mood,
anxiety, and obsessive–compulsive disorders: the role of serotonergic mechanisms in
illness progression. Biological Psychiatry, v. 44, n. 3, p. 193-206 aug. 1998.
POTSCHKA, H.; LÖSCHER, W. Corneal kindling in mice: behavioral and
pharmacological differences to conventional kindling. Epilepsy Research, v. 37, p.
109-20, 1999.
PU, Lu; LIU, Qing-song; POO, Mu-ming. BDNF-dependent synaptic sensitization in
midbrain dopamine neurons after cocaine withdrawal. Nature Neuroscience, v. 9, n. 5,
p. 605-7, may. 2006.
RACINE RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor
seizure. Eletroencepha. Clinical Neurophysiology, v. 32, p. 281-294, 1972.
RACINE, Ronald; TUFF, Larry; ZAIDE, Josef. Kindling, unit discharge patterns and
neural plasticity. Canadian Journal of Neurological Sciences, v. 2, n. 4, p. 395-405,
1975.
105
RACINE, R.J.; MCINTYRE, D.C. Kindling mechanisms: current progress on an
experimental epilepsy model. Progress Neurobiology, v. 27, p. 1-12, 1986.
RAMAN, I. M.; TONG, G.; JAHR, C. E. Beta-adrenergic regulation of synaptic
NMDA receptors by cAMP-dependent protein kinase. Neuron, v. 16, p. 415-421,
1996.
RILEY, Hugh H.; ZALUD, André W.; GRANADOS-DIAZ, Jaime L. The influence of
a chronic adolescent nicotine exposure on ethanol withdrawal severity during adulthood
in C3H mice. Alcohol and Interncional Biomedical Journal, v. 44, n.1, p. 81-87, feb.
2010.
RISSO, Francesca; PARODI, Monica; GRILLI, Massimo; MOLFINO, Francesca;
RAITERI, Maurizio; MARCHI, Mario. Chronic nicotine causes functional upregulation
of ionotropic glutamate receptors mediating hippocampal noradrenaline and striatal
dopamine release. Neurochemistry International, v. 44, p. 293–301, 2004.
ROSEMBERG, J. Pandemia do tabagismo: Enfoques Históricos e Atuais. São Paulo,
2002.
RUGGIERO, Rafael N.; BUENO-JÚNIOR, Lezio S.; ROSS, Jana B. de; FACHIM,
Helene A.; PADOVAN-NETO, Fernando E.; MERLO, Suélen; ROHNER, Carlos J. S.;
IKEDA, Érika T.; BRUSCO, Janaína; MOREIRA, Jorge E. Neurotransmissão
glutamatérgica e a plasticidade sináptica. Medicina, v. 44, n. 2, p. 143-56, 2011.
SALAS, R.; ORR-URTREGER, A.; BROIDE, R.S.; BEAUDET, A.; PAYLOR, R.; DE
BIASI, M. The nicotinic acetylcholine receptor subunit alpha 5 mediates short-term
effects of nicotine in vivo. Molecular Pharmacology, v. 63, p. 1059-1566, 2003.
SATO, K.; KASHIHARA, K.; MORIMOTO, K.; HAYABARA, T. Regional increases
in brain-derived neurotrophic factor and nerve growth factor mRNAs during
amygdaloid kindling, but not in acidic and basist growth factor mRNAs. Epilepsia, v.
37, p. 6–14, 1996.
SAYIN, U.; OSTING, S.; HAGEN, J.; RUTECKI, P.; SUTULA, T. Spontaneous
seizures and loss of axo-axonic and axo-somatic inhibition induced by repeated brief
seizures in kindled rats. The Journal of Neuroscience, v. 23, p. 2759-68, 2003.
SCOTT, D.B.; BLANPIED, T.A.; EHLERS, M.D. 2003. Coordinated PKA and PKC
phosphorylation suppresses RXR-mediated ER retention and regulates the surface
delivery of NMDA receptors. Neuropharmacology, v. 45, p. 755-767, 2003.
SCRAMM-SAPTYA, Nicole L.; WALKER, Q. David; CASTER, Joseph M.; LEVIN,
Edward D.; KUHN, Cynthia M. Are adolescents more vulnerable to drug addiction than
adults? Evidence from animal models. Psychopharmacology, v. 206, n. 1, p. 1-21, sep.
2009.
SENA, A.; FERRET-SENA, V. Neurobiologia do uso de nicotina. In: Ferreira-Borges
C, Filho HC (coords). Usos, Abusos e Dependências: Tabagismo. Lisboa: Climepsi
Editores; 2004.
106
SHEN, H.; KIHARA, T.; HONGO, H.; WU, X.; KEM, W. R.; SHIMOHAMA, S.;
AKAIKE, A.; NIIDOME, T.; SUGIMOTO, H. Neuroprotection by donepezil against
glutamate excitotoxicity involves stimulation of alpha7 nicotinic receptors and
internalization of NMDA receptors. British Journal of Pharmacology, v. 161, n. 1, p.
127-139, sep. 2010.
SHIFFMAN, SAUL; PATON, Stephanie M. Individual differences in smoking: gender
and nicotine addiction. Nicotine & Tobacco Research, p. S153-S157, 1999.
Supplement 2.
SHINGO, A. S.; YONEZAWA, M.; SAKURAI, K.; KITO, S. Nicotine inhibits
estrogen response element binding in the rat brain. Journal of Neural Transmission, v.
107, n. 12, p. 1491-5, 2000.
SHIN, Eun-Joo; JEONG, Ji Hoo; CHUNG, Yoon Hee; KIM, Won-Ki; KO, Kwang-Ho;
BACH, Jae-Hyung; HONG, Jau-Shyong; YONEDA, Yukio; KIM, Hyoung-Chun. Role
of oxidative stress in epileptic seizures. Neurochemistry International, v. 59, n. 2, p.
122-137, aug. 2011.
SHOHAMI, E.; KAUFER, D.; CHEN, Y.; SEIDMAN, S.; COHEN, O.; GINZBERG,
D. MELAMED-BOOK, N.; YIRMIYA, R.; SOREQ, H. Antisense prevention of
neuronal damages following head injury in mice. Journal of Molecular Medicine, v.
78, p. 228-236, 2000.
SIDHPURA, Nimish; REDFERN, Peter; WONNACOTT, Susan. Comparison of the
effects of bupropion on nicotinic receptor-evoked [3H]dopamine release from rat striatal
synaptosomes and slices. European Journal of Pharmacology, v. 567, n. (1-2), p. 102-
9, jul. 2007.
SKEBERDIS, V. A.; CHEVALEYRE, V.; LAU, C. G.; GOLDBERG, J. H.; PETTIT,
D. L.; SUADICANI, S.O.; LIN, Y.; BENNETT, M. V.; YUSTE, R.; CASTILLO, P. E.;
ZUKIN, R. S. Protein kinase A regulates calcium permeability of NMDA receptors.
Nature Neuroscience, v. 9, p. 501-510, 2006.
SLOTKIN, Theodore A. Nicotine and the adolescent brain: insights from na animal
model. Neurotoxicology and Teratology, v. 24, p. 369-384, jun. 2002.
SMITH, Katherine M.; MITCHELL, Stephen N.; JOSEPH, Michael H. Effects of
chronic and subchronic nicotine on tyrosine hydroxylase activity in noradrenergic and
dopaminergic neurones in the rat brain. Journal of Neurochemistry, v. 57, n. 5, p.
1750-1756, 1991.
SOREQ, Hermona; SEIDMAN, Shlomo. Acetylcholinesterase–new roles for an old
actor. Nature Reviews Neuroscience, v. 2, p. 294-302, 2001.
SOFUOGLU, Mehmet; MOONEY, Marc. Subjective responses to intravenous nicotine:
greater sensitivity in women than in men. Experimental and Clinical
Psychopharmacology, v. 17, n. 2, p. 63-9, apr. 2009.
107
STEVENS, Tanya R.; KRUEGER, Stefan R.; FITZSIMONDS, Reiko M.;
PICCIOTTO, Mariana R. Neuroprotection by nicotine in mouse primary cortical
cultures involves activation of calcineurin and l-type calcium channel inactivation. The
Journal of Neuroscience, v. 23, n. 31, p. 10093–10099, nov. 2003.
TESKEY, G. C.; HUTCHINSON, J. E.; KOLB, B. Sex differences in cortical plasticity
and behavior following anterior cortical kindling in rats. Cerebral Cortex, v. 9, n. 7, p.
675-682, 1999.
THANOS, Panayotis K.; MICHAELIDES, Michael; BENVENISTE, Helene; WANG,
Gene Jack; VOLKOW, Nora D. Effects of chronic oral methylphenidate on cocaine
self-administration and striataldopamine D2 receptors in rodents. Pharmacology
Biochemistry and Behavior, v. 87, n. 4, p. 426-433, 2007.
TIRELLI, E; LAVIOLA, G; ADRIANI, W. Ontogenesis of behavioral sensitization and
conditioned place preference induced by psychostimulants in laboratory rodents.
Neurosci. Biobehav. Rev, v. 27, p. 163-178, 2003.
TIZABI, Yousef; MANAYE, Kebreten F.; SMOOT, Duane T.; TAYLOR, Robert E.
Nicotine inhibits ethanol-induced toxicity in cultured cortical cells. Neurotoxicity
Research, v. 6, n. 4, p. 311-316, jan. 2004.
TOLU, S.; EDDINE, R.; MARTI, F.; DAVID, V.; GRAUPNER, M.; PONS, S.;
BAUDONNAT, M.; HUSSON, M.; BESSON, M.; REPERANT, C.; ZEMDEGS, J.;
PAGES, C.; HAY, Y. A. H.; LAMBOLEZ, B.; CABOCHE, J.; GUTKIN, B.;
GARDIER, A. M.; CHANGEUX, J-P; FAURE, P.; MASKOS, U. Co-activation of
VTA DA and GABA neurons mediates nicotine reinforcement. Molecular Psychiatry,
v. 18, n. 3, p. 382-393, 2013.
TORRES, Oscar V.; PIPKIN, Joseph A.; FERREE, Patrick; CARCOBA, Luis M.;
O’DELL, Laura E. Nicotine Withdrawal Increases Stress-Associated Genes in the
Nucleus Accumbens of Female Rats in a Hormone-Dependent Manner. Nicotine &
Tobacco Research, v. 17, n. 4, p. 422-430, 2015.
TURSKI, W.A.; CAVALHEIRO, E.A.; SCHWARZ, M.; CZUCZWAR, S.J.;
KLEINROK, Z.; TURSKI, L. Limbic seizures produced by pilorcapine in rats:
behavioural electroencephalographic and neuropathological study. Behavioural Brain
Research, v. 9, p. 315-355, 1983.
VAN ETTEN, M.L.; NEUMARK, Y.D.; ANTHONY, J.C. Male-female differences in
the earliest stages of drug involvement. Addiction, v. 94, p. 1413–1419, 1999.
VEZINA, P.; MCGEHEE, D. S.; GREEN, W. N. Exposure to nicotine and sensitization
of nicotine-induced behaviors. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological
Psychiatry, v. 15, n. 31, n. 8, p. 1625-38. nov, 2007.
VIEIRA-BROCK, Paula L.; MCFADDEN, Lisa M.; NIELSEN, Shannon M.; ELLIS,
Jonathan D.; WALTERS, Elliot T.; STOUT, Kristen A.; MCLNTOSH, Michael;
WILKINS, Diana G.; HANSON, Glen R.; FLECKENSTEIN Annette E. Chronic
108
Nicotine Exposure Attenuates Methamphetamine-Induced Dopaminergic Deficits. The
Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, v. 21, set. 2015.
VIEYRA-REYES, Patrícia; PICCIOTTO, Marina R.; MINEUR, Yann S. Voluntary
oral nicotine intake in mice down-regulates GluR2 but does not modulate depression-
like behaviors. Neuroscience Letters, v. 434, n. 1, p. 18-22, 2008.
VISANJI, N. P.; O’NEILL, M. J.; DUTY, S. Nicotine, but neither the alpha4beta2
ligand RJR2403 nor an alpha7 nAChR subtype selective agonist, protects against a
partial 6-hydroxydopamine lesion of the rat median forebrain bundle.
Neuropharmacology, v. 51, n. 3, p, 506-516, 2006.
VOGEL Rachel Isaksson; HERTSGAARD, Louise A.; DERMODY, Sarah S.; LUO,
Xianghua; MOUA, Lor; ALLEN, Sharon; ABSI, Mustafa al; HATSUKAMI, Dorothy
K. Sex differences in response to reduced nicotine content cigarettes. Addictive
Behaviors, v. 39, n. 7, p. 1197-1204, 2014.
WALKER, Quentin David; ROONEY, M. B.; WIGHTMAN, R. M.; KUHN, C. M.
Dopamine release and uptake are greater in female than male rat striatum as measured
by fast cyclic voltammetry. Neuroscience, v. 95, n.4, p. 1061-1070, feb. 2000.
WANG, Fan; CHEN, Hao; STEKETEE, Jeffery; SHARP, Burt M. Upregulation of
Ionotropic Glutamate Receptor Subunits within Specific mesocorticolimbic Regions
during Chronic Nicotine Self-Administration. Neuropsychopharmacology, v. 32, n. 1,
p. 103-109, 2007.
WATKINS, S.S.; KOOB, G.F.; MARKOU, A. Neural mechanisms underlying nicotine
addiction: acute positive reinforcement and withdrawal. Nicotine & Tobacco
Research, v. 2, p. 19-37, 2000.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Geneva: World Health Organization. Report
on the global Tobacco Epidemic. 2008. Disponível em:
http://www.who.int/tobacco/mpower/mpower_report_full_2008.pdf. Acesso em: 10 de
Julho de 2016.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Informe OMS sobre la Epidemia Mundial
de Tabaquismo. 2011. Disponível em:
http://www.who.int/%20tobacco/global_report/2011/es/. Acesso em: 10 de Julho de
2016.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Día Mundial sin Tabaco. 2013. Disponível
em: www.who.int/campaigns/no-tobacco-day/2013/event/es/index.html. Acesso em: 10
de Julho de 2016.
WILLUHN, Ingo; WANAT, Matthew J.; CLARK, Jeremy J.; PHILLIPS, Paul E. M.
Dopamine signaling in the nucleus accumbens of animals self-administering drugs of
abuse. Current Topics in Behavioral Neurosciences, v. 3, p. 29-71, 2010.
YACUBIAN, E.M.T. et al. Tratamento medicamentoso das epilepsias. Lemos
Editorial, São Paulo, 2004.
109
YOEST, Katie E.; CUMMINGS, Jennifer A.; BECKER, Jill B. Estradiol, dopamine and
motivation. Central Nervous System Agents in Medicinal Chemistry, v.14, n. 2, p.
83-9, 2014.
YOSHII, Akira; CONSTANTINE-PATON, Martha. Postsynaptic BDNF-TrkB
signaling in synapse maturation, plasticity, and disease. Developmental Neurobiology,
v. 70, n. 5, p. 304-22, apr. 2010.
ZEMLAN, Frank P.; HITZEMANN, Robert J.; HIRSCHOWITZ, Jack; GARVER,
David. Down-regulation of central dopamine receptors in schizophrenia. American
Journal of Psychiatry, v. 142, n. 11, p. 1334-1337, dec. 1985.
ZHANG, Xiao; LIU, Chuan; MIAO, Hui; GONG, Ze-hui; NORDBERG, Agneta.
Postnatal changes of nicotinic acetylcholine receptor alpha 2, alpha 3, alpha 4, alpha 7
and beta 2 subunits genes expression in rat brain. International Journal of
Developmental Neuroscience, v. 16, n. 6, p. 507-518, 1998.
ZHU, Xinjian; DONGC, Jingde; SHENA, Kai; BAIA, Ying; ZHANGA, Yuan; LV,
Xuan; CHAO, Jie; YAO, Honghong. NMDA receptor NR2B subunits contribute to
PTZ-kindling-induced hippocampal astrocytosis and oxidative stress. Brain Research
Bulletin, v. 114, p. 70-78, may. 2015.
ZIELIŃSKA, Elzbieta; KUC, Damian; ZGRAJKA, Wojciech; TURSKI, Waldemar A.;
DEKUNDY, Andrzej. Long-term exposure to nicotine markedly reduces kynurenic acid
in rat brain--in vitro and ex vivo evidence. Toxicology and Applied Pharmacology, v.
240, n. 2, p. 174-9. oct. 2009.
ZIMMERMAN, Gabriel; NJUNTING, Marleisje; IVENS, Sebastian; TOLNER, Elsa;
BEHRENS, Christoph J.; GROSS, Miriam; SOREQ, Hermona; HEINEMANN, Uwe;
FRIEDMAN, Alon. Acetylcholine-induced seizure-like activity and modified
cholinergic gene expression in chronically epileptic rats. European Journal of
Neuroscience, v. 27, n. 4, p. 965-975, feb. 2008.