Nereide Stela Santos Magalhães

Recife, 2004

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

LABORATÓRIO DE IMUNOPATOLOGIA KEIZO-ASAMI

Lipídeos e Membranas

Profa Dra Nereide Stela Santos Magalhães

2004

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CURSO DE EXTENSÃO EM BIOQUÍMICA

Lipídeos e Membranas

• Classificação de lipídeos

• Propriedades de agregados lipídicos

• Membranas biológicas

• Proteínas ligadas a lipídeos

Membranas Biológicas

• Composição

• Lipídeos Membranares

• Proteínas Membranares

• Modelo de Mosaico Fluido da estrutura

membranar

• A Membrana de Eritrócitos

Membranas: definição e funções

• Membranas são estruturas complexas compostas

de lipídeos, proteínas e carboidratos. São

estruturas assimétricas constituídas de duas

camadas (bicamada) com uma superfície interna e

uma superfície externa que diferem entre si.

• Membranas são estruturas altamente viscosas,

quase plásticas.

Membranas: definição e funções

• Duas camadas de fosfolipídios unidas de forma não

covalente, termodinamicamente estáveis e

metabolicamente ativas.

• Moléculas de proteínas específicas estão ancoradas nas

membranas com funções específicas (organelas, células

ou organismo).

• A membrana plasmática forma um compartimento

fechado em torno do protoplasma celular para separar

uma célula da outra, permitindo assim a individualidade

celular.

Membranas Biológicas

• Participam ativamente na comunicação intra e extra

celular

• Formam compartimentos especializados no interior da

célula (organelas)

• Comportam enzimas

• Funcionam com elementos integrais no sistema

excitação/resposta

• Provêem sítios para a produção de energia (e.g.

fotossíntese ou fosforilação)

Teorias da Origem da Vida

• “Membranas se originaram primeiro”.

• As forças hidrodinâmicas e aerodinâmicas acopladas por solvataçãoe energia livre entrópica geraram clones auto-replicativos, ricos em Potássio, como sistemas fechados membranares.

• Há bilhões de anos: membranas rudimentares

• Vacúolos (sacos) contendo gotículas de moléculas primitivas auto-replicativasdissolvidas.

• Estas membrana permitiram a criação de um meio interno – pré-requisito para a origem da vida.

ESTRUTURA E PROPRIEDADES DE MEMBRANAS

ESTRUTURA E PROPRIEDADES DE MEMBRANAS

Escala Cronológica da Evolução da VidaBattail, 2002

Teorias da Origem da Vida

• Experimentos realizados por Banghan(1993), evidenciaram a hipótese de que as membranas lipídicas precederam o DNA

ou a síntese protéica.

• Lipossomas clonados devem ter servido como superfície catalítica para reações que ocorreram próximas à superfície da membrana, na interface de compartimentos aquosos e lipídicos de cada unidade auto-replicativa (Deamer, 1997).

Manutenção da Vida• A vida foi originada em meio aquoso

– Reações enzimáticas

– Processos celulares e sub-celulares

As membranas, portanto, internalizam e compartimentalizam a água do organismo.

Manutenção da Vida– Fluido intracelular (2/3 água total)

• Produção de energia• Armazenamento de energia• Utilização da energia• Manutenção (reparo celular, replicação, etc.)

– Fluido extracelular (1/3 água total)• Fornece nutrientes para a célula

glicose, aminoácidos, ácidos graxos, O2, íons etc.

• Remoção de CO2; metabólicos; material tóxico; etc.

Relevância Biomédica• A integridade das membranas garantem os processos

celulares normais

• Alterações na estrutura das membranas afetam

– Balanço hidrolítico

– Fluxo de íons

Alterações nos processos celulares que originam doenças.

Doenças relacionadas com defeitos em membranas

• Deficiências de α-glicosidade (lipossomas)– Armazenamento incorreto de glicogênio tipo II

• Deficiência do transportador de iodeto– Bócio congênito

• Defeito na endocitose de lipoproteínas de

baixa densidade (LDL)– Hipercolesterolemia e doenças arteriais e coronárias

FUNÇÃO DAS MEMBRANAS• Gradiente elétrico e químico-

osmótico

• Bioenergética• Ação neuronal

(propagação de impulso)

• Tradução de Sinais(sinalização celular)

• Processos Celulares– Transporte– Motilidade– Reconhecimento – Interação– Fusão

Barreiras seletivas

Interação com o meio externo

• A membrana plasmática é também

responsável pelas trocas de material com o

meio extracelular via endocitose ou

exocitose,

• apresentam áreas estruturais especiais –

junções intersticiais (gap junctions) – através

das quais as células trocam material

Membranas Intracelulares

• As membranas intracelulares asseguram a integridade

estrutural das organelas presentes no interior da célula

– Mitocôndrias

– Retículo endoplasmático

– Complexo de Golgi

– Grânulos secretores

– Lisossomas

– Membrana nuclear

Composição das Membranas

• Proteínas

• Lipídeos

Proteínas ≥ Lipídeos maioria não integrais

MielinaProteínas/lipídeos ~ 0,23

Membrana MitocondrialProteínas/lipídeos ~ 3,23 Singer (1975)

Constituição• Fosfolipídeos

– Fosfoglicerídeos (glicerol + ácidos graxos)

– Esfingolipídeos (esfingosina + ácidos graxos)• Mielina

• Glicoesfingolipídeos– Cerebrosídeos

– gangliosídeos

• Esteróis– Colesterol (mamíferos)

• Membrana plasmática

• Mitocondrias

• Complexo de Golgi

• Membrana nuclear

– ergosterol

Classificação de Lipídeos

• Ácidos graxos

• Trigliceróis

• Glicerofosfolipídeos

• Esfingolipídeos

• Colesterol

Ácidos GraxosSão compostos que apresentam uma longa cadeia hidrocarbonada e um grupo terminal carboxílico(cauda)+(cabeça)

SATURADOS INSATURADOSMonoisaturadosPoli-insaturados

Mais abundantes Mais abundantes

ácido esteárico (18:0) ácido oléico (18:1) (9)ácido palmítico (16:0) [C9=C10]

ÁCIDOS GRAXOS

Ácido Láurico 12Ácido Mirístico 14Ácido Palmítico 16Ácido Esteárico 18Ácido Araquídinico 20Ácido Berênico 22

...

Ácido Palmitoléico 16Ácido Oléico 18Ácido Linolênico (αααα-linolênico, γγγγ-linolênico) 18Araquidônico 20

Voet & Voet, 1995

Ácidos Graxos

Garrett, 1995

Triglicerídeos

Garrett, 1995

Lehninger, 2000

GLICEROFOSFOLIPÍDEOS(fosfoglicerídeos)

FOSFOLIPÍDEOSPRINCIPAIS CONSTITUINTES DAS MEMBRANAS BIOLÓGICAS

Ácido fosfatídicoFosfatidilcolina (lecitina)FosfatidiletanolaminaFosfatidilgliceroldifosfatidilglicerol (cardiolipina)FosfatidilserinaFosfatidilinositol

Alberts al., 1998 The Cell

FOSFOLIPÍDEOS

Garrett, 1995

Garrett, 1995

Alberts et al., 1998 The Cell

Cerebrosídeos

Garrett, 1995

Gangliosídeos

Garrett, 1995

Propriedades de Agregados Lipídicos

• Micelas

• Bicamadas

• Lipossomas

ESTRUTURAS LIPÍDICASMonocamadas e micelas: Em meio aquoso, os

lipídeos, espontaneamente, formam estruturas.

MONOCAMADAS (baixas concentrações)MICELAS (altas concentrações)

CMC=concentração crítica micelarBICAMADAS LIPÍDICASVESÍCULAS

Lipossomas

Lehninger, 2000

Estruturas Lipídicas

Figura 2. Agregados de lipídeos anfipáticos dispersos em água

Lehninger, 2000

Figura 3. Organização dos fosfolipídeos em micelas

Micelas

Voet & Voet, 1995

Incorporação de água em micelas com quantidade excessiva de moléculas ou com forma elipsoldal.

A Bicamada Lipídica

• Fosfolipídios formam bicamadas em água

• A bicamada lipídica é um fluido bidimensional

• A fluidez da bicamada depende da sua

composição

• A bicamada é usualmente assimétrica

• A assimetria é gerada dentro da célula

• Bicamadas lipídicas são impermeáveis a solutos

e íons

Lehninger, 2000

Figura 4. Organização dos fosfolipídeos em bicamadas

Ácidos graxos saturados

Formam “empacotamentos”, de forma organizada e rígida, de moléculas umas muito próximas das outras.

Ácidos graxos insaturados

Não permitem o empacotamento rígido dasMoléculas, originando agregados flexíveise fluidos.

Lehninger, 2000

Figura 5. Organização dos fosfolipídeos em vesículas - lipossomas

Voet & Voet, 1995

Lipossomas multilamelares

(MLV)

Lipossomaunilamelar(SUV)

Vesículas Multilamelares

Estrutura das Membranas Biológicas

Lehninger, 2000

Figura 1. Arquitetura supramolecular das membranas

Variedade de Composição

• Grande variedade de proteínas

Diferentes funções nas membranas

• Grande variedade de lipídeos

(>100 tipos diferentes em células eucarióticas)

Composição das Membranas

• Lipídeos das membranas

Auto-agregação em torno de um meio aquoso

CCA= concentração crítica de agregação

10-10 M/l e 10-5 M/l

Organização dos Lipídeos nas Membranas

• Bicamada lipídica

• Forma hexagonal Inversa – (exceto esteróides)

• Cúbica

ESTRUTURAS

A capacidade de transição entre as diferentes conforma-ções permite a funcionalidade das membranas.

Fosfolipídeos das Membranas de Eucariotos

(80—90% do total de lipídeos)

• Derivados da colina– PC fosfatildicolina

– SM esfingomielina

• Derivados amínicos– PE Fosfatildietanolamina

– PS Fosfatildilserina

Diversidade dos Lipídeos nas Membranas

• 1. Variabilidade Intermembranas

– A Composição lipídica está associada com a função

– Membranas das organelas apresentam composição lipídica diferente

Composição Lipídica das Membranas Biológicas

Lehninger, 2000

Distribuição assimétrica de fosfolipídeos entre a membrana plasmática interna e externa de eritrócitos.

Tipos de gradiente intracelular

Lipídeos

Esfingomielina Colesterol

↑

↓

↓

↓

↓

↑Membrana Plasmática

Membrana Nuclear

Membrana Mitocondrial

Quantidade Relativa de SM e CH em diferentes organelas

• SM

--

3%

5%

7%

12%

• CH

3%

5%

8%

12%

15%

Mitocôndria

Núcleo

Retículo Endoplasmático

Complexo de Golgi

Membrana Plasmática

• organela

Efeito do Envelhecimento sobre a Homeostase Membranar

• ↑ colesterol e esfingomielina

• ↑ saturação das cadeias policarbonadas

Deterioração da Homeostase

Membranas: Assimetria

Proteínas x Lipídeos• Lipídeos

– Membrana externa• Fosfatidilcolina

• Esfingomielina

• Colesterol (↑↑↑↑ [ ])

– Membrana interna• Fosfatidilserina

• Fosfatidiletanolamina

• Colesterol (↓↓↓↓ [ ])

Membranas: Assimetria

Proteínas × Lipídeos• Proteínas

– Distribuição irregular de proteínas na membrana

– Assimetria da membrana externa: presença de carboidratos conjugados à proteínas

– Assimetria da membrana interna: presença de enzimas

– Assimetria regional (local)• Gap junctions – Junções intersticiais

• Sinapses

Membranas: “Turnover”

• Membranas são estruturas dinâmicas com renovação (turnover) de proteínas e lipídeos.

Movimento de lipídeos

Membrana externa x membrana interna

• Movimento transverso– Flip-flop (interna ���� externa)

• Movimento lateral– Difusão ao longo da membrana (µµµµm/s)

Homeostase membranar

• Troca espontânea de Fosfolipídeos entre membranas.

• Processo lento: t1/2 de várias horas• Colesterol (t1/2 de minutos ou horas)

• Depende da atividade de proteínas transportadoras de lipídeos

• (50 – 2500 nmol.m-1.mg-1)

• Mecanismo (?)processo homeostático multifatorial, depende da energia envolvendo:

– A síntese de lipídeos membranares– Transporte vesicular

Lehninger, 2000

Movimentos dos Lipídeos na Estrutura das Membranas Biológicas

Razões para a Assimetria Lipídica das Membranas

• A assimetria permite um meio adequado para as enzimas membranares– Reorientação de PS e PE: controle ou ativação

de enzimas específicas.

• Fusão de membranas: – Controle do lado no qual as membranas começam a

fusão.

• Assimetria incorreta de fosfolipídeos × situações patológicas

Manutenção da estabilidade da assimetria das membranas

• Proteínas responsáveis pela síntese de lipídeos

• Atividade de Flipases (proteínas específicas)

• Ex. Flipases– 1. Aminofosfolipídeos translocases

– 2. Proteínas da resistência multidroga (MDR)

• Transporte de drogas anfifílicas e fosfolipídeos do lado externo para o lado interno da membrana plasmática.

• Expressão de genes MDR3 (humano) e Andr2 (ratos) translocação de fosfatidilcolinas de cadeia longa.

• Expressão do gene MRD1 movimento de fosfolipídeos que possuam no mínimo uma cadeia pequena.

•Ex. Flipases

– 3. Complexos protéicos

redistribuição rápida de fosfolipídeos após a entrada de Ca2+ na células

– 4. Proteínas ATP-independente transportadoras de fosfolipídeos

(glicerofosfolipídeos e glicoesfingolipídeos)

• Ex. Flipases

Retículo endoplasmático e complexo de Golgi

Hipóteses para assimetria nas Membranas

• 1. Promoção de um meio assimétrico para as enzimas membranares– Reorientação de PS e PE constitui um meio de controle

ou “trigger” de enzimas específicas.

• 2. Fusão de membranas, controlando o lado na qual as duas membranas começam a fundir.

• 3. Manutenção da curvatura das membranas através de forças controladoras de bombas lipídicas e enzimas, responsáveis pelo fluxo transmembranar de fosfolipídeos– Eventos que ocorrem durante a formação de vesículas

endocíticas.

Importância da Assimetria Lipídica nas Membranas

• Assimetria fosfolipídica incorretasituações patológicas.

β-talassemia= PS camada interna -> camada externa de eritrócitos.

Exposição de PS ao sangue => anemia; ↓ t1/2 eritrócitos.

Reconhecimento de OS pelos macrófagos e apoptose celular.PS tem papel importante no estado hipercoagulaçãoassociado à β-talassemia severa.

Distribuição Lipídica numa Membrana Plana

• Há evidências que os lipídeos são organizados lateralmente em domínios distintos:• Organização lateral de longo-alcance(fluorescência)

• Organização lateral de curto-alcance

(espectroscopia)

Assimetria Membranar

• Proteínas e Lipídeos => – Diferentes quantidades nas partes internas e externas da membrana biológica.

• Membrana Plasmática de Eucariotos:PS, PE, PI (monocamada interna)

PC, SM, GL (monocamada externa)

• A composição de Ácidos Graxos, mesmo em lipídeos contendo cabeças polares idênticas, é diferente nos dois lados da bicamada.

• ASSIMETRIA MEMBRANAR

Transporte de proteínas apical e basolateral

– Rede de trabalho trans-Golgi (complexo)– Endossomo basolateral

Tráfego de proteínas nas células epiteliais Via de transdução: Clássica sinalização –– proteína G- proteínas quinases)

Relevância na Transdução de sinais e na expressão gênica

• Fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (Chave da transdução)

Hidrólise (fosfolipase C)

Diacilglicerol

Inositol trifosfato20 MENSAGEIROS

Esfingomielina e ácido fosfatídico metabólicos

Efeitos Ambientais

• A composição lipídica de membranas responde a modificações de fatores ambientais (e.g., dieta, temperatura...)

Efeitos de idade ou doença

•A composição lipídica modifica-se com o desenvolvimento e idade da células.

Condições patológicas (células malignas, aterosclerose, etc.)

Colesterol nas MembranasBiológicas

Alberts et al., 1998 The Cell

Colesterol

• Age como um mediador, controlando a fluidez da membrana

– Efeito de condensação nas regiões de desordem dos fosfolipídeos

– Efeito de desordem nas regiões ordenadas ou na fase cristalina

↑↑↑↑ Fluidez ���� ↑↑↑↑ permeabilidade (H2O, íons)

Voet & Voet, 1995

Função do Colesterol• Fluidez × temperatura de transição de fase (Tg)

• Colesterol de intercala nas moléculas de fosfolipídeos– Grupo OH interface aquosa

– Estrutura esteróide hidrofóbica na monocamada

Colesterol: Temperatura de Tansiçãode Fase (Tg)

• T>Tg

– Estrutura rígida esteroidal interage com os grupamentos ácidos dos fosfolipídeos ����menor movimento; menor fluidez

• T<Tg

– Interação do colesterol com cadeias acilasinterferindo no alinhamento ����

menor T estado fluido; gel ocorre (mantém fluidez em ↓↓↓↓T)

INTERAÇÕES NÃO COVALENTES NASBICAMADAS LIPÍDICAS

As bicamadas lipídicas possuem tendência inerente a serem extensas

As bicamadas lipídicas podem fechar sobre si mesmas e formar vesículas

As bicamadas lipídicas são auto selantes, pois um orifício na bicamada é energeticamente desfavorável

INTERAÇÕES NÃO COVALENTES NASBICAMADAS LIPÍDICAS

Hidrofóbicas

Forças atrativas de van der Waals

Caudas hidrocarbonadas

Atrações eletrostáticas

Pontes de hidrogênio

Cabeças polares - água

Moléculas de água são liberadas das caudas hidrocarbonadas dos lipídeos quando essas caudas ficam seqüestradas no interior apolar da bicamada

T< Tm

bicamada organizada com cadeias alifáticasrelativamente imobilizadas (conformação extendida máxima)

área superficial/ lipídeo é mínimaespessura da bicamada é máxima

T>Tm

fase líquida (mobilidade das cadeias alifáticas é intermediária entre os estados sólido e liquido dos alcanos).área superficial/ lipídeo aumentaespessura da bicamada diminui de 10 a 15 %

Transição de fases em bicamadas

Transição de fases em bicamadas1. As transições de fases são sempre endotérmicas;

o calor é absorvido enquanto a temperatura aumenta

durante a transição

2. Fosfolipídeos apresentam temperaturas de transição

de fase específica (Tm): aumenta com o comprimento

da cadeia alifática, diminui com a insaturação e

depende da natureza do grupo polar da cabeça

3. Em bicamadas de fosfolipídeos puros, a transição

ocorre em faixa estreita de temperatura. Ex:

Tm dimiristoilfosfatidilcolina = 0,2°C.

4. Membranas biológicas apresentam faixa larga de transição

de fase e dependem fortemente da composição dos lipídeos e

proteínas.

Transição de fases em bicamadas

5. Para certas bicamadas de lipídeos, uma modificação no estado físico, chamada de pré-transição, ocorre de 5°a 15°C abaixo de Tm. Estas pré-transições envolvem inclinação das cadeias hidrocarbonadas

6. Geralmente a fase de transição está relacionada com modificação do volume.

7. A transição de fase da bicamada é muito sensível à presença de solutos que interagem com os lipídeos, tais como cations divalentes, substâncias lipossolúveis, peptídeos e proteínas

Garrett, 1995

Proteínas Integrais (globulares)

• Glicoforina (eritrócitos)

• Imunoglobulinas (linfócitos)

• Receptores (membrana plasmática)

• Anquirina (eritrócitos), citoesqueleto

• Espectrina (eritrócitos), citoesqueleto

Proteínas Periféricas

Voet & Voet, 1995

Proteínas integrais em bicamadas lipídicas são “solvatadas” pelos lipídeos através de interações hidrofóbicas entra a proteína e a cauda apolar dos lipídeos.

Proteinas Integrais das Membranas

Alberts et al., 1998 The Cell

Associação de proteínas integrais com os lipídeos da bicamada: αααα-hélice, folhas ββββ, ligação covalente com lipídeos, interação não covalente com outras proteínas.

Proteínas Membranares

EnzimasTransportadorasEstruturaisAntígenos (histocompatibilidade)Receptores

Retículo endoplasmático = 6~8 proteínas membranaresMembrana plasmática > 100 proteínas membranares

Alberts et al., 1998 The Cell

Proteínas Membranares• Proteínas associam-se à bicamadas lipídicas de

várias formas• Uma cadeia polipeptídica usualmente cruza a

bicamada como um αααα-hélice• Proteínas membranares podem ser solubilizadas

por detergentes e purificadas• A estrutura completa só é conhecida para umas

poucas proteínas de membrana• A superfície da célula é revestida com

carboidratos• Células podem restringir o movimento das

proteínas membranares

Membranas: Permeabilidade Seletiva

• A membrana plasmática apresenta

permeabilidade seletiva e age como uma

barreira, mantendo, portanto,uma composição

diferente entre o meio intracelular e

extracelular.

• A permeabilidade seletiva é devida à presença

de proteínas que formam canais e bombas para

íons e substratos; e por receptores específicos

para moléculas sinalizadoras tais como

hormônios.

Lehninger, 2000

Disposição da glicoforinana bicamada da membrana plasmática de eritrócitos.

Remoção de proteínas das membranas. Periféricas: pH, força iônica, remoção de Ca2+ por agentes quelantes, phospholipiase C. Integrais: detergente.

Lehninger, 2000

Lehninger, 2000

Difusão Lateral de Proteínas nas Membranas Biológicas

Figura 7. Restrição de difusão lateral da glicoforina em eritrócitos

Estrutura das Membranas Biológicas

Figura 8. Separação das bicamadas de fosfolipídeos das membranaspela técnica de criofractura

Lehninger, 2000

Classificação e Nomenclatura de Fosfolipídeos

Há várias maneiras de classificação:• Classes de fosfolipídeos• Forma ou tipo de ligação da cadeia alifática com o esqueleto fosfolipídico

• Grupos da cabeça polar• Variabilidade da cadeia, em termos de n0 de átomos de Carbono, grau de insaturação, tipo duplas ligação, presença de anéis etc.

Interações entre Componentes da Membrana

• Formação de microdomínios

• Volume livre na membrana

Membranologia Moderna

• Organização em longa ou curta escala da estrutura membranar versus função

Transdução de Sinal e Expressão Gênica

• PIP2 IP3 + diaglicerol (lipídeo)

(hidrossolúvel)

• Esfingomielina

• Acido fosfatídico

Seletividade para cabeça polar(diacilgliceróis e fosfatídeos)

Seletividade para determinadas cadeias acilas

• Fluidez e/ou separação lateral de fases nas membranas

• A expressão de genes relacionados ao estresse ou genes que controlam a composição lipídica

• A composição da membrana lipídica: regulação da função de proteínas celulares

Efeitos do meio na composição da membranas (lipídeos)

• Dieta

• Temperatura

• Desenvolvimento

• Idade celular

• Transformação maligna

• Aterosclerose

Distúrbios na homeostase

Modificações na composição lipídica

Propriedades celulares

Eliminação das células apoptóticas

Agregação e Organização de Lipídeos

“Parâmetro de empacotamento” (Israelachvili et al., 1980)

PP= V/a.lc

• V= volume hidrofóbico• a= área superficial ocupada pela região polar do

anfifílico na interface água-ar• lc= Comprimento da região hidrofóbica

– Comprimento da cadeia hidrocarbonada (fosfolipídeos e glicerídeos)

– Núcleo estoroidal (esteróides)

Parâmetro:

• PP~1

• PP<1

• PP>1

• PP<<1

Moléculas cilíndricas

Micelas

Estruturas hexagonais inversas (fase II)

Esferas (vesículas)

Bicamadas!

Modificações

• Temperatura

• pH

• Força iônica do meio

Modificação PP

Modificação no estadode agregação

Predição da forma do agregado de anfifílicos em misturas

• Estimação grosseira cálculo do valor da formação de médio PP

bicamadas em misturas

de fosfolipídeosΣ PPn

PE + CH (PP > 1) bicamadaLiso-PCGangliosídeos micelasÁcidos graxosLiso-PC + AG bicamada

• Interação anfifílica com íons ou moléculas polares

Alteração PP

• Fase lamelarMicelas

Hexagonal

Bicamada Lipídica (PP~1)

Bicamada Lipídica (PP~1)

• Simetria: quase planar

cilíndrica

periódica (tipo fase cúbica)

• Cadeias hidrocarbonadas oposta

(pode haver superposição)

Bicamadas

• Interação entre as cabeças polares– Pontes de Hidrogênio– Ligações iônicas

• Repulsão entre as cabeças polares– Estérica– Eletrostática– Forças de hidratação

Formação de Lipossomas

• Dispersão de lipídeos em água (T >Tc)

• Vesículas esféricas em bicamadas

– Unilamelares (SUV)

– Multilamelares (MLV)

• MLV

energia

• SUV >40 nm lipídeos polares (+)>100 nm lipídeos polares (-)PE vesículas instáveis

• Lipossomas SUV agregação/fusão

tensão de empacotamento

Lipossomas

Conformações na Cadeia Alifática dos Lipídeos em Bicamadas

• Fase em gel (Lβ):organizada configuração trans

• Espessura de camada d1=1,27 nC de lipídeos (cadeia alifática)

nC = numero de C por Cadeia

Duplas ligações ↓ o comprimento de cadeia hidrocarbonada

~0,5 nm (cada =)

Membranas Biológicas:Organização de Bicamadas

• Fase fluida lamelar (Lα)

• A orientação da desordem das cadeias aumenta não linearmente com os terminais das cadeias

• Parâmetro de Ordem

– Grau de insaturação da cadeia

– Comprimento total das cadeias

Substâncias que afetam a ordem (organização) das Membranas

• Fluidez do interior da membrana é essencial:– Barreira para o transporte de solutos polares

– Solvente para substâncias menos polares

• Colesterol: alta afinidade com cadeias saturadas

• Peptídeos

• Proteínas: ↑ ou ↓ a ordem das membranas

dependendo da forma e dimensão

Região das Cabeças Polares e Adjacências

• Função da Interfase membrana – solução em sistemas biológicos(diferentes extensões em diferentes sistemas biológicos)

ComprimentoPC = cabeça polar 0,5 nm (fosfato)

0,9 nm (glicerol)Região interfacial de 0,8 nm (no mínimo)

PEG-lipídeos = 4 – 10 nm ou 15 nm(PEG 2000, PEG 5000)

Glicocálix células eucarióticas = 10 nmGlicocálix de bactérias gram-negativas = > 10 nm

• A região rica em proteínas e lipídeos próxima a superfície da membrana

Transição suave entre o interior da membrana (livre de carga) e a fase externa (rica em carga– íons e eletrólitos, maior constante dielétrica)

• ↑ espessura ↑ hidração da membrana

↓ eletrólitos na fase externa

• Intumescimento:

• Lipídeos muito polares e substâncias com cabeça polar longa

• > interfase > intumescimento

• Lipídeos pouco polares e substâncias com cabeça polar curta

• < interfase < intumescimento

• Adsorção de H2O e moléculas polares↑ interfase => ↑ mobilidade das partes polares da moléculas

• ↑ T

• alarga a região interfacial nas fases lamelar, sub-lamelar e não lamelar.

• Interfase membrana – solução (reconhecimento diferente)

• Segmentos de duas membranas diferentes

• Formação de complexo

• Reconhecimento seletivo

• Adaptação de moléculas “estranhas”

• Resposta imune

Distribuição de Carga nas Membranas

• Distribuição não uniforme de cargas na região superficial da membrana

• Interfase = ↑ polaridade (perfil dielétrico)• Interior (núcleo) = ↓ polaridade

• Mobilidade de cargas superfície (interfase)• (redistribuição)

– Mobilidade– Entropia– Repulsão eletrostática

Distribuição de cargas• A distribuição de cargas na interface difere daquela

nas moléculas isoladas

Aumento na parte mais externa da região interfacial

• Interfaces de Membranas Biológicas(difícil modelagem)

Propriedades eletrostáticas da extensa interface:• Várias regiões consecutivas com diferentes

densidades de carga, comprimento, polaridade,....

Propriedades Eletrostáticas das Membranas

• A maioria das membranas biológicas são carregadas com cargas negativas

Potencial eletrostático de superfície• Potencial zeta = mobilidade eletroforética de cargas

• Medidas: – zeta potenciômetro => eletroforese– Zeta-sizer => espectroscopia de correlação de fótons– Sondas de Fluorescência => Ex. HC (7-heptadecil-7-

hidroxicumarina)

Hidratação da Membrana• Região hidratada

~0,1 a 0,3 nm

Superfície de hidratação × polaridade

• Bicamada H2O => unidade termodinâmica que reage consistentemente às variações externas.

~10 nm (2 ou 3 moléculas)

• Modificação na hidratação da membrana == Mudança na estrutura

• Estresse osmótico ==

adaptação morfológica da membrana

Hidratação

• Hidratação modificação na conformação da cabeça polar dos lipídeos

• ↑ Volume exposição

• ↑ Velocidade

• ↑Motilidade

Exposição subfaseaquosa

Cabeça polar

Hidratação × Estabilidade Física e Química das Membranas

• A sub fase aquosa é a fonte de espécies reativas de Oxigênio (ROS)– Oxidação de lipídeos

• Radiação ionizantePrevenção da oxidação• Lipídeos em solventes orgânicos (<0oC)• Lipídeos – PEG

• Lipídeos – H2O =>– estabilidade de suspensões membranares

• Moléculas de H2O (raras) na bicamada =>– Instabilidade da membrana

Desidratação da Membrana

• Ligação de solutos

• Presença de lipídeos – PEG

– Desidratação da cabeça polar

– Aumento da hidratação da cadeia conjugada com o PEG

Curvatura da Membrana

• Arranjo molecular de misturas de lipídeos– Composição local

– Curvatura da bicamada

• A não uniformidade lateral da membrana

transformações locais de membranas ou na forma das vesículas

• Lipídeos mais polares ( força de repulsão na parte hidrofílica)– Concentração na região de alta curvatura

negativa

• Lipídeos com caráter predominantemente hidrofílico– Acumulam-se em regiões da membrana com

curvatura de superfície positiva

Forças e Fatores Envolvidos na Formação de Membranas

• 1. Interações proteínas – lipídeos

• Estado fluido da membrana => – fase de cristal liquido bidimensional

• Incorporação de macromoléculas – (DNA e proteínas)

Forças e Fatores Envolvidos na Formação de Membranas

• 1. Interações proteínas – lipídeos• Deformações na bicamada:

– Rearranjos locais

– Separação dos diferentes componentes da membrana

• Domínios de lipídeos carregados– Interações eletrostáticas

– Composição heterogênica de lipídeos na membrana

• Incorporação de proteína integral hidrofóbica na membrana adjacente– Deformações elásticas do meio lipídico

• Se a dP >dB(espessura da proteína) > (espessura da bicamada)

A bicamada lipídica será “esticada” para evitar a exposição das regiões hidrofóbicas das proteínas para a fase aquosa

• Se a dP = dB(espessura da proteína) = (espessura da bicamada)

A proteína rigidamente ligada => diminuição da entropia conformacional da cadeia lipídica circundante

Formação de domínio lateral por peptídeos pequenos de caráter básico

Interações eletrostáticas• Substrato para proteína C-quinase

(membrana de macrófagos)• MARCKs

(rico em alanina miristoilada)• Agregação de MARCKs na superfície da

membrana– Migração de lipídeos + para regiões abaixo– Formação de domínios laterais importantes na

transdução de sinais

ExemploExemplo

• PIP2: Seqüestrados em domínio PS

• PLC (fosfolipase): Excluída do domínio PS

• MARCKs –proteína-quinase P (fosforilação)– Dissociação de MARCKs da bicamada

PIP2 IP3+DAG

PLC

Exposição de PIPI2 a PLC

Formação de domínios em vesículas fosfolipídicas por peptídeos +

Estado de ENERGIA MÍNIMA(Ganho de energia > perda de energia)

• a) repulsão eletrostática entre lipídeos (-) que migraram para o domínio

• b) repulsão eletrostática entre peptídeos (+) que formam o domínio

• c) O domínio da entropia da mistura “lipídeos e peptídeos”

IMPORTÂNCIA– Terapia Gênica– Catiônicos– Lipossomas contendo DNA

+

Métodos de Estudo

• RMN (deuterium)• Espectroscopia RMN bidimensional de próton

associada ao ângulo de rotação mágico (MAS) –MAS NOESY

Colesterol– Microdomínios lipídicos– Organização dependente de:

• Cabeça polar• Insaturação da cadeia