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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e

desenvolvimento de gel à base do extrato

ALEXANDRE BEZERRA GALINDO

RECIFE 2007

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e

desenvolvimento de gel à base do extrato

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, em cumprimento às exigências para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

ALEXANDRE BEZERRA GALINDO Orientador: Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto

RECIFE 2007

ii

Galindo, Alexandre Bezerra

Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato / Alexandre Bezerra Galindo. – Recife: O Autor, 2007.

xii, 86 folhas : il., fig., tab., quadros.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de

Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2007.

Inclui bibliografia e anexos.

1. Própolis vermelha – Atividades biológicas.2. Própolis vermelha - Medicamento . I. Título.

615.012 CDU (2.ed.) UFPE 615.18 CDD (20.ed.) CCS2007-92

iii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

Reitor

Amaro Henrique Pessoa Lins

Vice-Reitor

Gilson Edmar Gonçalves e Silva

Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação

Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

Diretor do Centro de Ciências da Saúde

José Thadeu Pinheiro

Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde

Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros

Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

Jane Sheila Higino

Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

Samuel Daniel de Souza Filho

Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Pedro José Rolim Neto

Vice-Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Beate Saegesser Santos

v

AGRADECIMENTOS

A Deus, por todas as bênçãos concedidas na minha vida e pela força durante toda essa

jornada.

À Universidade Federal de Pernambuco, em particular ao Programa de Pós-Graduação

em ciências Farmacêuticas, pela oportunidade de realização deste curso.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto, pela oportunidade, orientação e

apoio.

À minha família, mãe, pai, irmã e irmão, por todo investimento, compreensão e

confiança, muito importantes para meu sucesso.

Às minhas amigas Sarah Lustosa, Aíla Karla e Dra. Karina Randau, por todo incentivo e

carinho que demonstraram por mim durante o mestrado, além do apoio incondicional

em todos os momentos.

Aos colegas do Laboratório de Tecnologia de Medicamentos (LTM), pela convivência e

apoio recebido, em especial aos colegas Ádley, Mariana, Januária, Diego, Regina,

Magaly, Jeckson, Tacizo, Luciana e Amanda.

Aos colegas de Mestrado, pela convivência e experiências compartilhadas durante o

curso, em especial aos colegas Júlio, Rafael, Mariana e Fabiana.

Aos amigos, Jenayce, Marília, Michelle, Rafaella e Jurandy, pelo incentivo e paciência.

À empresa Mel Brasil, na pessoa do Sr. José Maria Pereira, pelo fornecimento da

matéria-prima (própolis), indispensável para a realização deste trabalho.

vi

“Nunca ande pelo caminho traçado, pois ele conduz somente até onde os outros chegaram.”

Alexandre Graham

vii

SUMÁRIO

Lista de Abreviaturas e Siglas........................................................................................ ix Lista de Símbolos........................................................................................................... x Lista de Figuras.............................................................................................................. xi Lista de Tabelas e Quadros............................................................................................ xii Resumo.......................................................................................................................... xiii Abstract.......................................................................................................................... xiv Introdução...................................................................................................................... 1 Objetivos........................................................................................................................ 4 Geral............................................................................................................................... 4 Específicos..................................................................................................................... 4 Capítulo I - Própolis: Química e Farmacologia (Artigo submetido à Revista Brasileira de Farmacognosia)......................................................................................... 5 Capítulo II – Variabilidade Sazonal dos Constituintes da Própolis Vermelha e Bioatividade em Artemia salina (Artigo submetido à Revista Brasileira de Farmacognosia).............................................................................................................. 22 Capítulo III - Influência da variação sazonal na atividade antioxidante e fenóis totais de extratos de própolis vermelha (Artigo a ser submetido à Revista LWT).................. 36 Capítulo IV – Perfil fitoquímico e avaliação da atividade cicatrizante da própolis vermelha em lesões provocadas em dorso de ratos........................................................ 55 Capítulo V – Desenvolvimento de gel à base de extrato de própolis vermelha e validação do método analítico para doseamento de flavonóides (Artigo a ser submetido à RBCF)................................... 69 Conclusões e Perspectivas.............................................................................................. 80 Conclusões..................................................................................................................... 81 Perspectivas.................................................................................................................... 82 Referências Bibliográficas............................................................................................. 83 Anexos............................................................................................................................ 86

viii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANOVA Análise de Variância CCD Cromatografia em camada delgada CG-MS Cromatografia a gás – Espectrometria de massa COX Ciclooxigenase DL50 Dose letal para 50% de morte das cobaias DMSO Dimetilsulfóxido DP Desvio padrão DPPH 1,1-difenil-2-picrilhidrazil EEP Extrato etanólico de própolis EROs Espécies reativas de oxigênio LTM Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos pH Potencial de hidrogênio iônico PE Pernambuco PI Piauí UFPE Universidade Federal de Pernambuco

ix

LISTA DE SÍMBOLOS

% porcentagem µL microlitro mL mililitro L litro µg micrograma mg miligrama g grama nm nanômetro cm centímetro M molar mM milimolar Mo molibdênio min minuto h hora ± mais ou menos < menor que n número de amostras R2 coeficiente de correlação oC graus Celsius v/v porcentagem volume por volume m/v porcentagem massa por volume ® marca registrada rpm rotações por minuto cP centipoise

x

LISTA DE FIGURAS

Capítulo 3 Figura 1 - Porcentagem de inibição do radical DPPH pelo extrato etanólico de própolis referente ao mês de fevereiro de 2006 em função do tempo........................ 47 Figura 2 - Porcentagem de inibição do radical DPPH pelo extrato etanólico de própolis referente ao mês de junho de 2006 em função do tempo.............................. 47 Figura 3 - Porcentagem de inibição do radical DPPH pelo extrato etanólico de própolis referente ao mês de outubro de 2006 em função do tempo.......................... 47 Capítulo 4 Figura 1 - Cauterização com ponta esférica de bisturi elétrico.................................. 61 Capítulo 5 Figura 1 - Curva de regressão linear obtida a partir da média de três curvas............ 75

xi

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Capítulo 2 Tabela 1 – Compostos voláteis identificados em amostras de própolis vermelha de Pernambuco (% do íon corrente total)........................................................................ 30 Capítulo 3 Tabela 1 - Conteúdo de fenóis totais das amostras de própolis coletadas nos meses de fevereiro, junho e outubro de 2006........................................................................ 45 Tabela 2 – Capacidade de seqüestrar o radical DPPH (% de inibição)...................... 47 Tabela 3 – Atividade antioxidante total dos extratos metanólicos de própolis em AAR% rutina............................................................................................................... 48 Tabela 4 – Atividade antioxidante pelo método do peróxido de hidrogênio............. 49 Capítulo 4 Tabela 1 - Formulação da emulsão a frio................................................................... 60 Quadro 1 - Grupos de animais e esquemas de tratamento para o estudo de cicatrização.................................................................................................................. 61 Quadro 2 - Resultados da avaliação macroscópica do grupo controle negativo....... 63 Quadro 3 - Resultados da avaliação macroscópica do grupo controle positivo........ 64 Quadro 4 - Resultados da avaliação macroscópica do grupo teste............................ 64 Capítulo 5 Tabela 1 – Formulações dos lotes de bancada desenvolvidos................................... 72 Tabela 2 – Resultado da linearidade.......................................................................... 75 Tabela 3 – Resultados da exatidão, comprovada pelo teste t-Student....................... 76 Tabela 4 – Resultados da repetitividade..................................................................... 76 Tabela 5 – Controle físico-químico dos géis obtidos................................................. 77

xii

RESUMO

CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO DE PRÓPOLIS VERMELHA, AVALIAÇÃO

DE SUAS PROPRIEDADES BIOLÓGICAS E DESENVOLVIMENTO DE GEL À

BASE DO EXTRATO

A própolis é um material resinoso e balsâmico produzido pelas abelhas a partir do

exudato de árvores, ramos, pólen e flores. Sua composição depende da época, vegetação

e local de coleta, entre outros fatores, sendo, portanto, bastante variada. A própolis tem

sido objeto de estudos farmacológicos devido às suas propriedades antibacteriana,

antifúngica, antiviral, antiinflamatória, hepatoprotetora, antioxidante, antitumoral,

cicatrizante, entre outras. O presente trabalho teve por objetivos a caracterização do

extrato de própolis vermelha de Goiana-PE, Brasil, através da determinação dos seus

constituintes voláteis por CG-EM; biomonitoramento, através da avaliação de sua

toxicidade sobre Artemia salina Leach; avaliação de suas propriedades biológicas,

antioxidante e cicatrizante; e desenvolvimento de gel à base do extrato, avaliando a

estabilidade das preparações obtidas, bem como validando a metodologia para o

doseamento de flavonóides nos géis. Através da extração por headspace dinâmico e

identificação por cromatografia gasosa acoplada com espectrometria de massas (CG-

EM), foram identificados 34 constituintes voláteis, tendo como constituintes

majoritários o trans-anetol, α-copaeno e o metil cis-isoeugenol. O ensaio de letalidade

em Artemia salina Leach demonstrou DL50 de 18,9 µg/mL, sugerindo uma possível

atividade antitumoral. Quanto à atividade antioxidante, os resultados demonstraram que

a própolis vermelha analisada possui atividade antioxidante, comprovada por diferentes

métodos, e que tal atividade está relacionada ao seu teor de compostos fenólicos, bem

como à época de sua coleta. A própolis em estudo apresentou bons resultados no estudo

de cicatrização por segunda intenção em dorso de ratos, quando comparada ao padrão

D-pantenol. Os resultados obtidos na validação do método analítico para doseamento de

flavonóides foram tratados estatisticamente por Análise de Variância one-way

(ANOVA) e teste t de Student. O método demonstrou atender aos requisitos exigidos

pela legislação vigente, RE nº 899, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, sendo

linear, exato e preciso.

Palavras-chave: própolis vermelha, constituintes químicos, atividades biológicas, gel

xiii

ABSTRACT

CHARACTERIZATION OF THE RED EXTRACT OF PROPOLIS, EVALUATION

OF ITS BIOLOGICAL PROPERTIES AND GEL DEVELOPMENT TO BASE OF

THE EXTRACT

Propolis is a resinous and balsamic substance collected by bees from the tree (branches,

pollen and flowers) exsudates. Its composition is dependent of the season, vegetation

and site of collection, among other features, and furthermore, it is widely varied.

Propolis has been an object of pharmacological investigations in consequence of its

antibacterial, antifungal, antiviral, anti-inflammatory, hepatoprotector, antioxidant,

antitumoral, immune-modulatory properties, among others. The objective of this study

was the characterization of the extract of red propolis form Goiana-PE through the

determination of its volatile constituents by GC-MS; biomonitoring through the

evaluation of its toxicity on Artemia salina Leach; evaluation of its biological

properties, antioxidant and cicatrizant; and development of gel using the extract,

evaluating the stability of solutions obtained, as well validating the methodology to the

doses of flavonoids into the gels. Through the extraction by dynamic headspace and

identification by Gas Chromatography connected with Mass Spectrometry (GC-MS)

were identified 34 sesquiterpenoids constituents, as majority constituents presenting the

trans-anethol, α-copaene and methyl cis-isoeugenol. The essay of lethality in Artemia

salina Leach showed DL50 of 18.9 µg.mL-1, suggesting a possible antitumoral activity.

The results showed that this red propolis has an antioxidant activity, evidenced by

different methods, and this activity is related with its contents of fenolic compounds, as

well as the season of the collection. This propolis showed good cicatrisation after a

second intention in rats when is compared to the D-pantenol standard. The method is

adequate to the condition required by the current legislation, RE no 899, of the National

Agency of Sanitary Vigilance, and is linear, exact and accurate.

Keywords: red propolis, chemical constituents, biological activities, gel

xiv

INTRODUÇÃO

GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato

INTRODUÇÃO

A própolis é uma mistura complexa, formada por material resinoso e balsâmico

coletado pelas abelhas dos ramos, flores, pólen, brotos e exudatos de árvores; além

desses, na colméia, as abelhas adicionam secreções salivares e enzimas (PEREIRA et

al., 2002; FRANCO et al., 2000). Sua composição química é bastante complexa e

variada, estando intimamente relacionada com a ecologia da flora de cada região

visitada pelas abelhas (PARK et al., 2002) e com o período de coleta da resina (ROCHA

et al., 2003). Por isso, é considerada uma das misturas mais heterogêneas encontradas

em fontes naturais. Hoje mais de 300 constituintes já foram identificados e/ou

caracterizados em diferentes amostras (BURDOCK, 1998).

A própolis tem sido objeto de estudos farmacológicos devido às suas

propriedades antibacteriana, antifúngica, antiviral, antiinflamatória, hepatoprotetora,

antioxidante, antitumoral, cicatrizante, imunomodulatória, entre outras (BANKOVA,

2005; KOSALEC et al., 2005; ALENCAR et al., 2005). No Brasil, são descritas

propriedades biológicas e composição química distintas para diferentes amostras

coletadas em diferentes partes do país. Porém, essa variação é facilmente explicada pela

grande biodiversidade brasileira (PEREIRA et al., 2002).

As atividades antibacteriana e antifúngica da própolis têm sido as propriedades

biológicas mais extensivamente estudadas (KUJUNGIEV et al., 1999). Entretanto, a

atividade antioxidante merece especial interesse, pois a própolis poderia ser aplicada

topicamente com sucesso para prevenir e tratar a pele danificada (MARQUELE et al.,

2006), sendo os flavonóides relatados como os mais abundantes e efetivos antioxidantes

na própolis. A propriedade cicatrizante da própolis, assim como várias outras

2


propriedades biológicas, também está relacionada com flavonóides e ácidos fenólicos

(ARVOUET-GRAND et al., 1994).

A maioria dos estudos, porém, tem como objeto a própolis verde, já bem

caracterizada e conhecida em todo mundo. Com relação à própolis vermelha, a qual foi

utilizada neste estudo, há poucos relatos na literatura, tanto sobre sua composição

química, como de suas atividades biológicas.

Neste contexto, este trabalho foi desenvolvido visando caracterizar e quantificar

constituintes químicos da própolis vermelha, como compostos fenólicos (dentre eles os

flavonóides) e compostos voláteis (por CG-EM). Avaliaram-se também suas

propriedades biológicas (citotoxicidade, atividade antioxidante e cicatrizante), as quais,

como demonstradas, podem ser correlacionadas à constituição química, para o

desenvolvimento de um produto farmacêutico à base do extrato de própolis vermelha.

Assim, algumas lacunas deixadas nas pesquisas científicas sobre a própolis vermelha

poderão ser esclarecidas e as informações obtidas, sobre um tipo de própolis tão pouco

explorado, servirão de base para estudos posteriores.

3


OBJETIVOS

Geral

• Caracterização do extrato de própolis vermelha da região de Goiana–PE, Brasil,

avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do

extrato.

Específicos

• Caracterização e quantificação dos constituintes voláteis do extrato de própolis

vermelha por cromatografia gasosa acoplada a espectrofotômetro de massa (CG-

EM), avaliando sua variabilidade sazonal;

• Testar a bioatividade (toxicidade) em Artermia salina Leach;

• Quantificação do teor de fenóis totais e flavonóides;

• Avaliar a influência da variação sazonal na atividade antioxidante e fenóis totais de

extratos da própolis;

• Avaliação da atividade cicatrizante em lesões provocadas em dorso de ratos;

• Desenvolvimento de gel à base de extrato de própolis vermelha e validação do

método analítico para doseamento dos flavonóides na forma farmacêutica.

4


CAPÍTULO 1

PRÓPOLIS: QUÍMICA E FARMACOLOGIA

(Artigo submetido à Revista Brasileira de Farmacognosia)

5


Própolis: Química e Farmacologia

Sarah R. Lustosa1, Alexandre B. Galindo1, Karina P. Randau2, Pedro J. Rolim Neto1∗

1Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Ciências

Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brasil,

2Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas,

Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brasil.

Resumo

Própolis é uma mistura complexa, formada por material resinoso e balsâmico. Sua

composição química é complexa e variada, estando relacionada com a flora de cada

região visitada pelas abelhas e com o período de coleta da resina. Inclui flavonóides,

ácidos aromáticos, terpenóides e fenilpropanóides, ácidos graxos e vários outros

compostos. A própolis tem sido objeto de intensos estudos farmacológicos e químicos

nos últimos 30 anos. Em várias partes do mundo é indicada para melhorar a saúde e

prevenir doenças. Atualmente, é disponível em várias formas farmacêuticas como

cápsulas, extratos, enxaguatório bucal, na forma de pó, entre outras. Ainda são

necessários estudos correlacionando a composição química com a atividade biológica,

definindo cada tipo de própolis com a sua aplicação terapêutica. É uma tarefa

imprescindível para um mercado cada vez maior e exigente em todo o mundo.

Unitermos: Própolis, constituintes químicos, atividade biológica.

Abstract: “Propolis: Chemistry and Pharmacology”. Propolis (bee glue) is a complex

mixture, formed by resinous and balsamic material. It is variable and complex chemical

∗ [email protected] Tel/Fax: (81) 3272 1383

6

mailto:*[email protected]


composition, being related with the flora of each region visited by the bees and with the

period of resin´s collection. Chemical compositon as flavonoids, aromatic acids,

terpenoids and phenylpropanoids, fat acid, and others compounds are found in such

propolis. For the last 30 years, propolis has become the subject of intense

pharmacological and chemical studies. In different parts of the world it is indicated to

improve the health and to prevent illnesses. Currently, it is available in some

pharmaceutical forms as capsules, extracts, mouthrinses, powder form, among others.

Indeed, there are necessit correlating studies the chemical composition with the

biological activity, defining each type of propolis with its therapeutical application. It´s

an essential task for a market ever bigger and demanding in the whole world.

Keywords: Propolis, chemical constituents, biological activity

Introdução

A palavra própolis é derivada do grego pro-, em defesa, e polis-, cidade ou

comunidade, isto é, em defesa da comunidade (Pereira et al., 2002). É uma mistura

complexa, formada por material resinoso e balsâmico coletado pelas abelhas dos ramos,

flores, pólen, brotos e exudatos de árvores; além desses, na colméia, as abelhas

adicionam secreções salivares e enzimas (Pereira et al., 2002; Franco et al., 2000).

Para produção de própolis, abelhas usam materiais resultantes de uma variedade

de processos botânicos em diferentes partes das plantas. São substâncias ativamente

secretadas pelas plantas bem como exudatos de feridas nas plantas: materiais lipofílicos

nas folhas e germes, látex, resinas, etc (Bankova (b), 2005; Capasso; Castaldo, 2002).

As abelhas de fato usam a própolis para protegê-las contra insetos e

microrganismos, no reparo de frestas ou danos à colméia, no preparo de locais

7


assépticos para postura da abelha rainha e na mumificação de insetos invasores

(Marcucci, 1996).

De modo geral, contém 50-60% de resinas e bálsamos, 30-40% de ceras, 5- 10%

de óleos essenciais, 5% de grão de pólen, além de microelementos como alumínio,

cálcio, estrôncio, ferro, cobre, manganês e pequenas quantidades de vitaminas B1, B2,

BB6, C e E (Park, et al., 2002; Burdock, 1998; Funari; Ferro, 2006; Menezes, 2005;

Woisky et al., 1998).

A coloração da própolis depende de sua procedência. Varia de marrom escuro

passando a uma tonalidade esverdeada até o marrom avermelhado. Possui odor

característico que pode variar de uma amostra para outra (Marcucci, 1996).

Na Europa, América do Norte e oeste da Ásia, a fonte dominante de própolis é o

exudato do botão de álamo (Populus sp.). Entretanto, na América do Sul a espécie

vegetal do gênero Populus não é nativa, existindo uma grande diversidade vegetal para

retirada de resina, o que dificulta a correlação da própolis com a fonte produtora (Park

et al., 2002). Outras espécies vegetais empregadas como fontes de própolis em várias

partes do mundo são pinheiros, carvalho, salgueiro, acácia, entre outras (Markham et al.,

1996).

A própolis vermelha é reportada como sendo típica de Cuba e da Venezuela,

onde as origens botânicas foram identificadas como Clusia nemorosa (Clusiaceae) e

Clusia scrobiculata, respectivamente (Trusheva et al., 2006).

A própolis é um dos muitos produtos naturais que vem sendo utilizado durante

séculos pela humanidade (Vargas et al., 2004). Os egípcios conheciam as propriedades

anti-putrefativas da própolis e empregavam para embalsamar cadáveres. Além disso, foi

reconhecida por suas propriedades medicinais por médicos gregos e romanos como

8


Aristóteles, Dioscorides, Plínio e Galeno (Capasso; Castaldo, 2002). O uso de extratos

de própolis na medicina popular data de 300 a.C. (Da Silva et al., 2006).

Na África do Sul, na guerra ao final do século XIX, foi amplamente utilizada

devido às suas propriedades cicatrizantes e na segunda guerra mundial foi empregada

em várias clínicas soviéticas (Pereira et al., 2002).

A própolis começou a ser apreciada como meio para tratamento de problemas de

saúde nos anos de 1950 e 1960 na ex-União Soviética e em países do leste da Europa,

como Bulgária, República Tcheca e Polônia. Nos países do oeste europeu, na América

do Sul e do Norte e no Japão, a própolis não adquiriu popularidade até 1980. Na metade

dos anos 80, tornou-se um importante produto na medicina alternativa e complementar.

Hoje, o Japão é o principal importador de própolis, com preferência pela própolis

brasileira (Salatino et al., 2005).

O termo própolis já era descrito no século XVI na França e a Farmacopéia de

Londres do século XVII lista a própolis como droga oficial (Capasso; Castaldo, 2002;

Pereira et al., 2002; Cao et al., 2004). Em 1908 surgiu o primeiro trabalho científico

sobre suas propriedades químicas e “composição”, indexado no Chemical Abstracts

(referência n° 192). Em 1968 surgiu no Chemical Abstracts o resumo da primeira

patente utilizando a própolis (Romena, para a produção de loções para banho). Até

meados do ano 2000, o número de trabalhos publicados citados no Chemical Abstracts

totaliza 450, oriundos de 39 países (dos cinco continentes), além de 239 patentes

(Pereira et al., 2002).

No Brasil, o interesse pela própolis aconteceu somente na década de 80 com o

trabalho pioneiro de Ernesto Ulrich Breyer (1981), demonstrando em seu livro,

“Abelhas e saúde”, as propriedades terapêuticas da própolis e sua utilização como

antibiótico natural (Lima, 2006).

9


Composição Química

A composição química é bastante complexa e variada, estando intimamente

relacionada com a ecologia da flora de cada região visitada pelas abelhas (Park et al.,

2002) e com o período de coleta da resina (Rocha et al., 2003). Além disso, a

variabilidade genética das abelhas rainhas também influencia na composição química

(Park, 1998). Deste modo, um número significativo de trabalhos com a química da

própolis foi publicado para entender que sua composição química varia grandemente e

depende da flora local e da região de coleta (Bankova (a), 2005).

O melhor indicador da origem botânica da própolis é análise da sua composição

química comparada com a provável fonte vegetal. A determinação da origem geográfica

e, principalmente, a origem vegetal, se faz importante no controle de qualidade e até

mesmo na padronização das amostras de própolis para uma efetiva aplicação terapêutica

(Park et al., 2002).

Alguns componentes estão presentes em todas as amostras de própolis, enquanto

outros ocorrem somente em própolis derivadas de espécies particulares de plantas

(Vargas et al., 2004).

A composição química da própolis inclui flavonóides (como a galangina,

quercetina, pinocembrina e kaempferol), ácidos aromáticos e ésteres, aldeídos e cetonas,

terpenóides e fenilpropanóides (como os ácidos caféico e clorogênico), esteróides,

aminoácidos, polissacarídeos, hidrocarbonetos, ácidos graxos e vários outros compostos

em pequenas quantidades (Hu et al., 2005; Hayacibara et al., 2005; Ozkul et al., 2004;

Matsuda et al., 2002; Rocha et al., 2003). Há também na sua constituição elementos

inorgânicos como o cobre, manganês, ferro, cálcio, alumínio, vanádio e silício

(Marcucci, 1996). De todos esses grupos de compostos, certamente o que vem

chamando mais atenção dos pesquisadores é o dos flavonóides (Lima, 2006). A eles,

10


bem como aos ácidos fenólicos, são atribuídas as propriedades antibacteriana, antiviral e

antioxidante (Volpi; Bergonzini, 2006).

Pelo menos 300 compostos foram identificados em diferentes amostras de

própolis, com mais de 100 em cada uma (Marcucci et al., 2001). Em 2000, doze tipos

distintos de própolis brasileira foram quimicamente caracterizados e classificados de

tipo 1 a 12 por Park et al. (Alencar et al., 2005; Hayacibara et al., 2005).

As amostras tropicais de própolis, especialmente as brasileiras, têm mostrado

diferenças significantes nas suas composições químicas em relação à própolis da zona

temperada. Por essa razão, a própolis brasileira têm se tornado objeto de grande

interesse por parte dos cientistas (Trusheva et al., 2006). A própolis verde brasileira,

produzida em São Paulo e Minas Gerais é constituída principalmente de derivados

prenilados do ácido p-cumárico e possui grande quantidade de flavonóides, muitos dos

quais não estão presentes em própolis da Europa, América do Norte e Ásia (Simões et

al., 2004).

Propriedades Biológicas



antioxidante, antitumoral, imunomodulatória, entre outras. (Bankova (a), 2005; Kosalec

et al., 2005; Alencar et al., 2005). Esse potencial biológico se deve a um sinergismo que

ocorre entre os muitos constituintes (Marcucci, 1996).

Antimicrobiana

As atividades antibacteriana e antifúngica da própolis têm sido as propriedades

biológicas mais extensivamente estudadas (Kujungiev et al., 1999). São atribuídas

principalmente à flavonona pinocembrina, ao flavonol galangina e ao éster feniletil do

11


ácido caféico, com um mecanismo de ação baseado provavelmente na inibição do RNA-

polimerase bacteriano (Uzel et al., 2005). Outros componentes como os flavonóides, o

ácido caféico, ácido benzóico, ácido cinâmico, provavelmente agem na membrana ou

parede celular do microorganismo, causando danos funcionais e estruturais

(Scazzocchio et al., 2005).

A própolis possui atividade antibacteriana maior contra bactérias Gram-positivas

e limitada contra Gram-negativas (Lu et al., 2005; Marcucci et al., 2001). Estudo

realizado com extratos de própolis comercializados no Brasil mostrou atividade

antimicrobiana pronunciada contra bactérias Gram-positivas e Candida albicans ATCC

10231, e atividade menos evidente contra Gram-negativos e Candida albicans FT 2010

(Rezende et al., 2006).

Até o momento, não se tem dados que respondam o porquê desta menor

atividade dos extratos de própolis contra bactérias Gram-negativas. Estas bactérias

possuem uma parede celular quimicamente mais complexa e um teor lipídico maior, o

que pode explicar essa maior resistência (Vargas et al., 2004).

Própolis também tem demonstrado excelentes atividades fungistática e

fungicida, em testes in vitro, contra leveduras identificadas como agentes causadores de

onicomicoses (Oliveira et al., 2006).

Antiinflamatória

A atividade antiinflamatória observada na própolis parece ser devida à presença

de flavonóides, especialmente galangina. Este flavonóide apresenta atividade inibitória

contra a ciclooxigenase (COX) e lipooxigenase. Tem sido relatado também que o ácido

fenil éster caféico (CAPE), possui atividade antiinflamatória por inibir a liberação de

ácido aracdônico da membrana celular, suprimindo as atividades das enzimas COX-1 e

COX-2 (Borrelli et al., 2002).

12


A própolis tem demonstrado ação antiinflamatória também por inibir a síntese

das prostaglandinas, ativar a glândula timo, auxiliando o sistema imune pela promoção

da atividade fagocítica e estimulando a imunidade celular (Kosalec et al., 2005).

Antioxidante

A atividade antioxidante merece especial interesse, pois a própolis poderia ser

aplicada topicamente com sucesso para prevenir e tratar a pele danificada (Marquele et

al., 2006).

Flavonóides são relatados como os mais abundantes e efetivos antioxidantes na

própolis. Existe uma correlação entre o alto conteúdo de flavonóides totais e a atividade

anti-radicais livres em extratos de própolis da Argentina (Ahn et al., 2007). Da Silva et

al. (2006) sugerem que os flavonóides desempenham importante papel na atividade

antioxidante de extratos de própolis brasileira, mas outros fatores poderiam estar

envolvidos (Choi et al., 2006). Embora estudos com extratos etanólicos de própolis

sejam mais comuns, é relatado que o extrato aquoso da própolis possui uma boa

atividade antioxidante, associada ao alto teor de compostos fenólicos (Mani et al.,

2006).

Antiviral

Não existem muitos relatos sobre a atividade antiviral da própolis. Marcucci

(1995) cita uma ação virucida da própolis nos vírus do herpes simplex (HSV) e da

estomatite vesicular (VSV). Em estudo realizado na Ucrânia, foi comparada a eficácia

de pomada de própolis canadense com pomadas de aciclovir e placebo (veículo) no

tratamento de pacientes com herpes genital tipo 2 recorrente. A preparação de própolis

contendo flavonóides apresentou-se mais efetiva que as outras duas na cicatrização das

lesões e redução dos sintomas locais (Vynograd et al., 2000).

13


Estudos in vitro sugerem que a própolis tem uma potente atividade antiviral

contra as variantes X4 e R5 do HIV-1. Atividade similar foi observada com linfócitos

CD4+ operando, pelo menos em parte, como inibidor da entrada viral (Gekker et al.,

2005).

Cicatrizante

A propriedade cicatrizante da própolis, assim como várias outras propriedades

biológicas, está relacionada com flavonóides e ácidos fenólicos (Arvouet-Grand et al.,

1994). Em estudo no qual foi comparada a propriedade cicatrizante de um creme de

própolis com um creme de sulfadiazina de prata, foi demonstrado que os ferimentos

tratados com própolis apresentaram menos inflamação e mais rápida cicatrização do que

aqueles tratados com sulfadizina de prata (Gregory et al., 2002).

Imunomodulatória

Sy et al. (2006) demonstraram que o tratamento com extrato de própolis atenua

as inflamações das vias aéreas em ratos, provavelmente por sua habilidade em modular

a produção de citocina. Sendo assim, seria um novo agente no tratamento da asma.

Orsolic et al. (2004) demonstraram que derivados hidrossolúveis de própolis, ácido

caféico, éster feniletil do ácido caféico e quercetina poderiam ser extremamente úteis no

controle do crescimento tumoral em modelos experimentais.

Outras propriedades

Há relatos de que a própolis baixa a pressão arterial e os níveis de colesterol no

sangue (Capasso; Castaldo, 2002). Em muitos países, a própolis e o mel são usados

para o tratamento de infecções das vias aéreas (Tavares et al., 2006).

Como antiprotozoário, a própolis mostrou-se ativa contra Toxoplasma gondii,

Trichomonas spp. e Giardia lamblia (Dantas et al., 2006). Testes in vitro com extratos

de própolis foram realizados contra Trypanosoma cruzi e mostraram atividade contra as

14


formas epimastigotas desse parasita, sendo uma possível alternativa para o tratamento

da Doença de Chagas (Prytzyk et al., 2003).

Própolis também tem sido bastante utilizada em odontologia, estando presente

em enxagüatórios bucais e cremes dentais para prevenir cáries e tratar gengivites e

estomatites (Pietta et al., 2002). Em experimentos na área de Endodontia, Cariologia,

Cirurgia Oral, Periodontia e Patologia Oral, teve uma atuação positiva na reorganização

tecidual, ação antiinflamatória e antibacteriana (Manara et al., 1999).

Panorama Atual

A própolis é usada em várias partes do mundo onde é indicada para melhorar a

saúde e prevenir doenças como inflamação, doenças do coração, diabetes e câncer

(Kadota et al., 2002). Problemas tratados com própolis incluem mau hálito (halitose)

eczema, infecções na garganta, úlceras e infecções urinárias. (Pereira et al., 2002).

Atualmente, a própolis é usada como um remédio popular e está disponível na

forma de cápsulas, como um extrato (hidroalcoólico ou glicólico), como enxaguatório

bucal, na forma de pó, entre outras (Capasso; Castaldo, 2002). Também é empregada

em cosméticos e na indústria alimentícia na forma de alimentos funcionais (Alencar et

al., 2005; Sforcin et al., 2000).

Muitos produtos à base de própolis comercializados no Brasil possuem registro

no Ministério da Agricultura, que preconiza os limites para fixação de identidade e

qualidade da própolis na Instrução Normativa nº 3, de 19 de janeiro de 2001 (Brasil,

2001). Os produtos que contêm própolis e que apresentem indicações terapêuticas

podem ser registrados como medicamentos específicos segundo a Resolução-RDC nº

132, de 29 de maio de 2003, D.O.U. de 02/10/2003, sendo classificados como

15


opoterápicos (Brasil, 2003). A comprovação de segurança e eficácia segue a nota

técnica da CATEF - Câmara Técnica de Medicamentos Fitoterápicos (CATEF, 2005).

O consumo de própolis no mundo é estimado em cerca de 700-800 toneladas/

ano (Da Silva et al., 2005). Faltam estatísticas oficiais sobre o volume de própolis

produzido anualmente no Brasil, o que é exportado e o que é consumido pelo mercado

interno. Existem apenas avaliações de produtores e exportadores que situam a produção

brasileira entre 49 e 150 toneladas anuais. O cálculo de 150 toneladas pode estar

superestimado, mas é mais realista. O consenso é que o Brasil é o segundo maior

produtor mundial, logo atrás da China (Lima, 2006).

Nas últimas décadas, foi observado um aumento, em todo o mundo, no uso de

produtos naturais (Hayacibara et al., 2005). Entretanto, apesar desse aumento e do fato

de existir uma considerável quantidade de informações disponíveis no que concerne aos

aspectos químicos e biológicos da própolis, sua aplicação terapêutica ainda pode ser

considerada incipiente (Funari & Ferro, 2006).

Atualmente, inúmeros trabalhos demonstram as atividades biológicas da própolis

bem como suas aplicações terapêuticas. Essas virtudes conduzem a própolis a um

verdadeiro modismo. Porém, é preciso estabelecer alguns pontos importantes. Apesar de

ser aceita por órgãos regulatórios como produto com finalidade terapêutica, a própolis

precisa ser padronizada quimicamente para garantir sua qualidade, eficácia e segurança.

O que não é fácil, pois, como já foi visto vários fatores podem interferir na sua

composição química. Também são necessários estudos que relacionem a composição

química com a atividade biológica, pois assim seria possível correlacionar o tipo de

própolis com a sua aplicação terapêutica. Isso é uma tarefa imprescindível para um

mercado cada vez maior e exigente em todo o mundo.

16


Referências Bibliográficas

Ahn M, Kumazawa S, Usui Y, Nakamura J, Matsuka M, Zhu F, Nakayama T 2007. Antioxidant activity and constituents of propolis collected in various áreas of China. Food Chem 101: 1400-1409. Alencar SM, Aguiar CL, Guzmán JP, Park YK 2005. Composição química de Baccharis dracunculifolia. Ciência Rural 35: 909-915. Arvouet-Grand A, Vennat B, Pourrat A, Legret P 1994. Standardization of propolis extract and identification of principal constituents. J Pharm Belg 49: 462-468. Bankova V 2005 (a). Chemical diversity of propolis and the problem of standardization. J Ethnopharmacol 100: 114-117. Bankova V 2005 (b). Recent trends and important developments in propolis research. ECAM 2: 29-32. Borrelli F, Maffia P, Pinto L, Ianaro A, Russo A, Capasso F, Ialenti A 2002. Phytochemical compounds involved in the anflammatory effect of propolis extract. Fitoterapia 73: S53-S63. Brasil. Ministério da Agricultura. Instrução Normativa nº3 – Anexo VI – Regulamento técnico para fixação de identidade e qualidade de própolis. Diário Oficial da República Federativa do Brasil. Brasília, 19 Jan. 2001. Brasil. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº 132, de 29 de Maio de 2003. Diário Oficial da União, de 02 de Outubro de 2003. Burdock GA 1998. Review of the biological properties and toxicity of bee propolis (propolis). Food Chem Toxicol 36: 347-363. Cao YH, Wang Y, Yuan Q 2004. Analysis of flavonoids and phenolic acid in propolis by capillary electrophoresis. Chromatographia 59: 135-140. Capasso F, Castaldo S 2002. Propolis, an old remedy used in modern medicine. Fitoterapia 73: S1-S6. CATEF- Câmara Técnica de Medicamentos Fitoterápicos. Nota Técnica sobre o Registro de Produtos Contendo Própolis 2005. Disponível em < E:\Própolis\Anvisa - Instituição - Câmaras Técnicas - Câmara Técnica de Medicamentos Fitoterápicos - CATEF.htm> Acesso em: 10 out 2006. Choi YM, Noh DO, Cho SY, Suh HJ, Kim KM, Kim JM 2006. Antioxidant and antimicrobial activities of propolis from several regions of Korea. LWT 39: 756-761. Da Silva JFM, Souza MC, Matta SR, Andrade MR, Vidal FVN 2006. Correlation analysis between phenolic levels of Brazilian propolis extracts and their antimicrobial and antioxidant activities. Food Chem 99: 431-435.

17


Dantas AP, Olivieri BP, Gomes FHM, De Castro SL 2006. Treatment of Trypanosoma cruzi-infected mice with propolis promotes changes in the immune response. J Ethnopharmacol 103: 187-193. Franco SL, Brusch ML, Moura LPP, Bueno JHP 2000. Avaliação Farmacognóstica da própolis da região de Maringá. Rev Bras Farmacogn 9: 1-10. Funari CS, Ferro VO 2006. Análise de Própolis. Ciênc Tecnol Aliment 26: 171-178. Gekker G, Hu S, Spivak M, Lokensgard JR, Peterson PK 2005. Anti-HIV-1 activity of propolis in CD4+ lymphocyte and microglial cell cultures. J Ethnopharmacol 102: 158-163. Gregory SR, Piccolo N, Piccolo MT, Piccolo MS, Heggers JP 2002. Comparison of propolis skin cream to silver sulfadiazine: a naturopathic alternative to antibiotics in treatment of minor burns. J Alter Complement Med 8: 77-83. Hayacibara MF, Koo H, Rosalen PL, Duarte S, Franco EM, Browen WH, Ikegaki M, Cury JA 2005. In vitro and vivo effects of isolated fractions of Brazilian propolis on caries development. J Ethnopharmacol 101: 110-115. Hu F, Hepburn HR, Li Y, Chen M, Radloff SE, Daya S 2005. Effects of ethanol and water extracts of propolis (bee glue) on acute inflammatory animal models. J Ethnopharmacol 100: 276-283. Kadota S, Banskota AH, Nagaoka T, Sumioka LY, Tezuca Y, Awale S, Midorikawa K, Matsushige K 2002. Antioproliferative activity of the Netherlands propolis and its active principles in cancer cell lines. J Ethnopharmacol 80: 67-73. Kosalec I, Pepeljnjak S, Bakmaz M, Vladimir-Knezevic S 2005. Flavonoid analysis and antimicrobial activity of commercially available propolis product. Acta Pharm 55: 423-430. Kujumgiev A, Tsvetkova I, Serkedjieva Y, Bankova V, Christov R, Popov S 1999. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis of different geographic origin. J Ethnopharmacol 64: 235-240. Lima MG 2006. A produção de própolis no Brasil. São João da Boa Vista: São Sebastião Editora e Gráfica. Lu L, Chen Y, Chou C 2005. Antibacterial activity of propolis against Staphylococcus aureus. Int J Food Microbiol 102: 213-220. Manara LRB, Gromatzky A, Conde MC, Bretz WA 1999. Utilização da própolis em odontologia. Rev FOB 7: 15-20. Mani F, Damasceno HCR, Novelli ELB, Martins EAM, Sforcin JM 2006. Propolis: Effect of different concentrations, extracts and intake period on seric biochemical variables. J Ethnopharmacol 105: 95-98.

18


Marcucci MC 1995. Propolis: chemical composition, biological properties and therapeutic activity. Apidologie 26: 83-99. Marcucci MC 1996. Propriedades biológicas e terapêuticas dos constituintes químicos da própolis. Quim Nova 19: 529-536. Marcucci MC, Ferreres F, García-Viguera C, Bankova VS, De Castro SL, Dantas AP, Valente PHM, Paulino N 2001. Phenolic compounds from Brazilian propolis with pharmacological activities. J Ethnopharmacol 74: 105-112. Markham KR, Mitchel KA, Wilkins AL, Daldy JA, Lu Y 1996. HPLC and CG-MS identification of the major organic constituents in New Zeland propolis. Phytochemistry 42: 205-211. Marquele FD, Oliveira ARM, Bonato PS, Lara MG, Fonseca MJV 2006. Propolis extract release evaluation from topical formulations by chemiluminescence and HPLC. J Pharm Biomed Anal 41: 461-468. Matsuda AH, Machado LB, Mastro NL 2002. Thermal analysis applied to irradiated propolis. Radiat Phys Chem 63: 353-355. Menezes H 2005. Própolis: Uma revisão dos recentes estudos de suas propriedades farmacológicas. Arq InstBiol 72:405-411. Oliveira ACP, Shinobu CS, Longhini R, Franco SL, Svidzinski TIE 2006. Antifungal activity of propolis extract against yeasts isolated from onychomycosis lesions. Mem Inst Oswaldo Cruz 101: 493-497. Orsolic N, Knezevic AH, Sver L, Terzic S, Basic I 2004. Immunomodulatory and antimetastatic action of propolis and related polyphenolic compounds. J Ethnopharmacol 94: 307-315. Ozkul Y, Silici S, Erõglu E 2004. The anticarcinogenic effect of propolis in human lymphocytes culture. Phytomedicine 12: 742-747. Park KY, IkegakI M, Abreu JAS, Alcici NMF 1998. Estudo da preparação dos extratos de própolis e suas aplicações. Ciênc Tecnol Aliment 18: 313-318. Park YK, Alencar SM, Scamparine ARP, Aguiar CL 2002. Própolis produzida no sul do Brasil, Argentina e Uruguai: Evidências fitoquímicas de sua origem vegetal. Ciência Rural 2: 997-1003. Pereira AS, Seixas FRMS, Aquino Neto FR 2002. Própolis: 100 anos de pesquisa e suas perspectivas futuras. Quim Nova 25: 321-326. Pietta PG, Gardana C, Pietta AM 2002. Analytical methods for quality control of propolis. Fitoterapia 73: S7-S20.

19


Prytzyk E, Dantas AP, Salomão K, Pereira AS, Bankova VS, De Castro SL, Aquino Neto FR 2003. Flavonoids and trypanocidal activity of Bulgarian propolis. J Ethnopharmacol 88: 189-193. Rezende GPSR, Pimenta FC, Costa LRRS 2006. Antimicrobial activity of two Brazilian commercial propolis extracts. Braz J Oral Sci 5: 967-970. Rocha L, Dos Santos LR, Arcenio F, Carvalho ES, Lúcio EMRA, Araújo GL, Teixeira LA, Sharapin N 2003. Otimização do processo de extração de própolis através da verificação da atividade antimicrobiana. Rev Bras Farmacogn 13: 71-74. Salatino A, Teixeira EW, Negri G, Message D 2005. Origin and chemical variation of Brazilian propolis. ECAM 2: 33-38. Scazzocchio F, D’Auria FD, Alessandrini D, Pantanella F 2005. Multifactorial aspects of antimicrobial activity of propolis. Microbiological Research 4: 327-333. Sforcin JM, Fernandes JR A, Lopes CAM, Bankova V, Funari SRC 2000. Seasonal effect on Brazilian propolis antibacterial activity. J Ethnopharmacol 73: 243-249. Simões LMC, Gregorio LE, Da Silva Filho AA, De Souza ML, Azzolini AECS, Bastos JK, Lucisano-Valin YM 2004. Effect of Brazilian green propolis on the production of reactive oxygen species by stimulated neutrophils. J Ethnopharmacol 94: 59-65. Sy LB, Wu Y, Chiang B, Wang Y, Wu W 2006. Propolis extracts exhibit an immunoregulatory activity in an OVA-sensitized airway inflammatory animal model. Int Immunopharmacol 6: 1053-1060. Tavares JP, Martins IL, Vieira AS, Lima FAV, Bezerra FAF, Moraes MO, Moraes MEA 2006. Estudo de toxicologia clínica de um fototerápico a base de associações de plantas, mel e própolis. Rev Bras Farmacogn 16: 350-356. Trusheva B, Popova M, Bankova V, Simova S, Marcucci MC, Miorin PL, Pasin FR, Tsvetkova I 2006. Bioactive constituents of Brazilian red propolis. ECAM 3: 249-254. Vargas AC, Loguercio AP, Witt NM, Da Costa MM, Sá e Silva M, Viana LR 2004. Atividade antimicrobiana “in vitro” de extrato alcoólico de própolis. Ciência Rural 34: 159-163. Volpi N, Bergonzini G 2006. Analysis of flavonoids from propolis by on-line HPLC-electrospray mass spectrometry. J Pharm Biomed Anal 42: 354-361. Vynograd N, Vynograd I, Sosnowski ZA 2000. Comparative multi-centre study of the efficacy of propolis, acyclovir and placebo in the treatment of genital herpes (HSV). Phytomedicine 7: 1-6. Woisky RG, Salatino A 1998. Analysis of propolis: some parameters and procedures for chemical quality control. J Apicultural Research 37: 99-105.

20


Uzel A, Sorkun K, Önçag Ö, Çogulo D, Gençay Ö, Salih B 2005. Chemical compositions and antimicrobial activities of four different Anatolian propolis samples. Microbiological Research 160: 189-195.

21


CAPÍTULO 2

VARIABILIDADE SAZONAL DOS CONSTITUINTES DA

PRÓPOLIS VERMELHA E BIOATIVIDADE EM Artermia salina

(Artigo submetido à Revista Brasileira de Farmacognosia)

22


Variabilidade sazonal dos constituintes da própolis vermelha e

bioatividade em Artermia salina

Lívio César Cunha Nunes1, Alexandre Bezerra Galindo3, Annalu da Silva Oliveira de

Deus1, Daniel Arcanjo Rufino1, Karina Perrelli Randau2, Haroudo Satiro Xavier2,

Antônia Maria das Graças Lopes Citó1, Pedro José Rolim Neto3∗

1Núcleo de Tecnologia Farmacêutica, Universidade Federal do Piauí, 60400-000,

Teresina, PI, Brasil,


Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brasil,


Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brasil.

Resumo

A própolis é uma substância resinosa coletada pelas abelhas de diversas partes das

plantas. Sua composição depende da época, vegetação e local de coleta. Apresenta

diversas atividades biológicas como antimicrobiana, antioxidante, antitumoral, dentre

outras. Foi realizado estudo da variabilidade sazonal, nos meses de fevereiro, junho e

outubro de 2006, dos constituintes voláteis da própolis vermelha de Pernambuco através

da extração por headspace dinâmico e identificação por cromatografia gasosa acoplada

com espectrometria de massas (CG-EM). Foram identificados 34 constituintes voláteis,

sendo monoterpenos e monoterpenóides, sesquiterpenos e sesquiterpenóides,

fenilpropanóides, aldeídos, cetonas e n-alcanos. Os constituintes majoritários foram o

trans-anetol, α-copaeno e o metil cis-isoeugenol. Também foi realizado o perfil

fitoquímico por cromatografia em camada delgada (CCD), através da qual os

∗ [email protected] Tel/Fax: (81) 3272 1383

23

mailto:[email protected]


constituintes fenólicos foram identificados como majoritários. Com o extrato bruto

metanólico da própolis, realizou-se o ensaio de letalidade em Artemia salina, que

demonstrou DL50 de 18,9 µg/mL, sugerindo uma possível atividade antitumoral.

Unitermos: Própolis vermelha, constituintes voláteis, Artemia salina

Abstract: “Seasonal Variability of Red Propolis Constituents and Brine shrimp

bioassay”. Propolis is a resinous hive product collected by honeybees from plant

sources. The composition of the propolis depends upon the season, vegetation, and the

area of collection. It presents a diverse biological activities such as antimicrobial,

antioxidant and antitumoral. The seasonal variability of the red propolis constituents

from Pernambuco State were accomplished in the months of February, June and

October of 2006. The volatile red propolis constituients were captured by the dynamic

headspace technique and analyzed by GC-MS. In the analysis of the samples, 34

constituents were identified such as the mono and sesquiterpens, phenylpropanoids,

aldehydes, cetons and n-alcanes, presenting as majority constituents the trans anethol,

α-copaene and methyl cis-isoeugenol. The phytochemistry profile was performad by

Thin Layer Chromatography (TLC), throught this technique the majorities constituents

were identified as phenols. The Brine shrimp bioassay were evaluated of the red

propolis methanolic extract, which demonstrated a DL50 of 18,9 µg/mL and a activity

antitumoral was suggesting possible.

Key words: Red propolis, volatile constituents, Artemia salina

Introdução

A própolis é considerada uma das misturas mais heterogêneas encontradas em

fontes naturais, sendo que mais de 300 constituintes já foram identificados e/ou

24


caracterizados em diferentes amostras (Burdock, 1998). As abelhas (Apis mellifera)

usam esta substância para protegê-las contra insetos e microorganismos, empregando-a

em finas camadas nas paredes internas das colméias para vedar buracos e rachaduras,

reparar e fortalecer os favos de mel, proteger a entrada da colméia, no preparo de locais

assépticos para a postura da abelha rainha e na mumificação de insetos invasores

(Bankova et al., 2000).

A própolis é coletada por abelhas a partir de diversas partes das plantas como

brotos, botões florais, casca e exsudatos resinosos (Park et al., 1997). As propriedades

biológicas da própolis estão diretamente ligadas a sua composição química e este

possivelmente é o maior problema para o uso da própolis na terapia, tendo em vista que

a sua composição química varia com a flora da região, locais e épocas de coleta, com a

técnica empregada para a produção (tipo de coletores) e com as características genéticas

(gênero e espécie das abelhas). Este conjunto de fatores exerce, portanto, uma enorme

importância nas suas propriedades físicas, químicas e biológicas (Pereira et al., 2002;

Park et al., 1998; Bianchini, 1998).

No Brasil, são descritas propriedades biológicas e composição química distintas

para diferentes amostras coletadas em diferentes partes do país. Essa variação é

facilmente explicada pela grande biodiversidade brasileira (Pereira et al., 2002). Com

relação à variação sazonal, a diminuição em alguns componentes biologicamente ativos,

como no caso dos fenólicos, é acompanhada pelo aumento de outros, por exemplo

ácidos diterpênicos. Deste modo, pode-se esperar que algumas atividades biológicas,

relacionadas a estes compostos (antibacteriana, antifúngica), sejam similares em

diferentes estações do ano (Bankova et al, 1998).

Park et al. (2002) classificaram a própolis brasileira em 12 tipos de acordo com a

região geográfica de origem, composição química e vegetação de onde foi extraída.

25


Porém, a própolis vermelha, a qual é encontrada sobretudo nas áreas litorâneas das

regiões norte e nordeste, ainda é pouco estudada. O presente trabalho objetiva

caracterizar os constituintes químicos, principalmente os voláteis, da própolis vermelha

de Pernambuco e realizar o biomonitoramento através da avaliação de sua

citotoxicidade sobre Artemia salina Leach.

Material e Métodos

As amostras foram coletadas numa área de restinga, cidade de Goiana-PE

(distrito de Atapuz), nos meses de fevereiro, junho e outubro de 2006, acondicionadas

em recipiente plástico opaco, hermeticamente fechado e conservadas sob refrigeração.

Identificação dos constituintes voláteis

7,5 g de cada uma das amostras de própolis foram submetidos à técnica de

headspace dinâmico por duas horas, utilizando-se como armadilha para a captura dos

voláteis o Porapak-Q® (Divinilbenzeno/Etilvinilbenzeno). Os constituintes voláteis

foram dessorvidos do polímero pela adição de diclorometano, que em seguida foi

eliminado por um jato de nitrogênio. Posteriormente, a análise dos constituintes foi

realizada num cromatógrafo SHIMADZU GC-17A acoplado a um espectômetro de

massas GCMS-QP5050A equipado com uma coluna capilar de sílica fundida DB-5

(95% polidimetilsiloxano e 5% difenil, 30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro

externo, 0,25 µm de diâmetro interno). A programação utilizada para injeção e corrida

das amostras foi a seguinte: injetor: 220ºC, detetor: 240ºC, coluna: 60ºC a 240ºC,

3ºC.min-1. O gás de arraste foi hélio com vazão de 1 mL. min-1.

A identificação dos constituintes foi realizada por inspeção visual dos seus

espectros de massas comparando-os com espectros da literatura (Adams, 1995),

26


observando principalmente os parâmetros pico do íon molecular e pico base, além de

comparação com espectros de uma biblioteca computacional (Wiley 299) através da

comparação dos índices de Kovats calculados em co-injeção de uma série homóloga de

n-alcanos, com os índices de Kovats encontrados na literatura (Adams, 1995).

Perfil fitoquímico da própolis através da CCD

1,0 g de própolis triturado de cada um dos três meses de coleta foi submetido à

extração metanólica (20 mL). Alíquotas de 10 μl foram analisadas por cromatografia em

camada delgada (placas de gel de sílica Merck - Alemanha, art.105554) para análise da

presença de grupos de metabólitos, empregando-se diversas fases móveis e reveladores

adequados (Harborne, 1984; Wagner; Bladt, 1996; Sena Filho et al., 2006).

Bioensaio de letalidade sobre Artemia salina

O ensaio de toxicidade sobre a Artemia salina Leach foi realizado de acordo

com a metodologia proposta por Meyer (1982). 1g da própolis foi submetido à extração

em metanol por 24 horas sob agitação (EB-MeOH). A partir de 20 mg do extrato seco,

foram preparadas soluções de 1, 3, 10, 30, 100, 300 e 1000 µg/mL, em triplicata, que

foram ressuspensas em clorofórmio (CHCl3) e 0,1mL de dimetilsulfóxido (DMSO).

Para o teste de letalidade, 10 espécimes do microcrustáceo, com 48 horas de eclosão em

água do mar e água destilada (1:1), foram colocados em cada um dos tubos e em três

tubos controle (CHCl3 + DMSO). Após 24 horas, contou-se o número de mortos e os

resultados obtidos foram tabulados e submetidos à análise de Probitos no software

estatístico SPSS® for Windows 10.0, obtendo-se o valor da DL50, com intervalo de

confiança de 95%.

27


Resultados e Discussão

Constituintes voláteis

Através da técnica de headspace dinâmico e da análise por CG-EM, foram

identificados 34 constituintes voláteis, considerando as três amostras da própolis

vermelha. A Tabela 1 apresenta os constituintes voláteis identificados de acordo com a

classe química. Pelos resultados, evidencia-se uma composição química em voláteis

bastante variada, destacando-se como constituintes majoritários trans-anetol, α-copaeno

e metil cis isoeugenol. O trans-anetol, bem como o elemicin, foram apresentados em

estudo recente por Marcucci et al. (2006) como componentes majoritários de uma

amostra de própolis vermelha de Maceió-Alagoas, o que nos leva a correlacionar as

origens comuns para esse tipo de própolis. O elemicin foi citado como componente da

própolis pela primeira vez no estudo de Marcucci et al. (2006). Nesse estudo, nas três

amostras de própolis, o fenilpropanóide elemicin foi também identificado. Petri et al.

(1988) classificaram a própolis de clima temperado em dois tipos, conforme o

constituinte volátil majoritário o ß-eudesmol ou o benzoato de benzila. Vários estudos

evidenciaram que a própolis destas regiões origina-se principalmente de botões florais

de plantas da espécie Populus, choupo, (Bankova, 2000). Nos países de clima tropical, a

composição química da própolis é de difícil caracterização, dada a grande diversidade

da flora e por sua composição química diferir bastante da própolis produzida em regiões

de clima temperado.

A variação na composição química em voláteis, entre as três amostras coletadas,

em diferentes épocas do ano, foi pequena, havendo 17 constituintes comuns dentre os

compostos identificados. Contudo, apenas na amostra coletada em outubro foi

evidenciado o sesquiterpenóide δ-cardinol e os sesquiterpenos ß-gurjuneno,

28


isocariofileno e δ-cadineno. Os n-alcanos foram identificados na amostra do mês de

junho, assim como o monoterpenóide 1,8 cineol e o sesquiterpeno α-selineno.

No entanto, vale ressaltar que o constituinte majoritário foi o mesmo nas três

amostras, o trans-anetol, e que o percentual deste composto foi relativamente alto,

particularmente na amostra coletada em outubro 52,58%. Também destaca-se nas três

amostras o alto teor de fenilpropanóides, sendo cerca de 66% para a amostra coletada

em outubro. Os constituintes dos óleos essenciais pertencem a dois grupos de

metabólitos originados de rotas biossintéticas diferentes: o grupo dos terpenos, cuja rota

biossintética deriva de unidades de isopreno; e o grupo dos compostos aromáticos,

derivados dos fenil-propanóides e que tem como precursor o ácido chiquímico (Dewick,

2003). A amostra coletada no mês de outubro corresponde a estação após o período das

chuvas no Nordeste, época em que a maioria das espécies vegetais nativas floresce e por

isso a produção de própolis é maior nesta época do ano. Na estação das chuvas, as

abelhas visitam arbustos e subarbustos, enquanto que no período seco as espécies

lenhosas são as principais fontes de néctar, pólen e resina para as abelhas, mostrando

assim uma mudança no pasto apícola e, conseqüentemente, uma variação na

composição química da própolis (Costa, 2005). Ainda nas três amostras estudadas

observa-se grande percentual de sesquiterpenos. Esses compostos, juntamente com

fenilpropanóides, são responsáveis por diversas atividades farmacológicas, com

destaque para o constituinte majoritário trans-anetol, o qual apresenta atividades

comprovadas, tais como: analgésica, anestésica, antigenotóxica, antioxidante, dentre

outras (Nirmala et al., 2005). Este mostrou-se ainda como sendo o principal constituite

do óleo essencial de anis (Pimpinella anisum), dotado de atividade inseticida e

antifúngica (Costa, 2002; Harbone, 1998; Moersdorf, 1966; Shukla, 1987). Essas e

29


outras atividades atribuídas aos demais constituintes indicam um bom potencial

farmacológico para a própolis em estudo.

Tabela 1. Compostos voláteis identificados em amostras de própolis vermelha de Pernambuco (% do íon corrente total)

Fev Jun Out Composto IK* IK**

% área

Hidrocarbonetos monoterpênicos 4,11 5,26 0,90

p-cimeno 1026 1026 0,60 0,52 --

Limoneno 1031 1031 3,51 4,74 0,90

Monoterpenos oxigenados 1,52 3,17 1,22

1,8-cineol -- 1034 -- 0,39 --

Linalool 1098 1099 1,52 2,78 1,22

Hidrocarbonetos sesquiterpênicos 32,00 17,08 20,96

α-cubebeno 1351 1355 1,17 0,33 2,49

α-copaeno 1376 1382 14,70 5,97 7,27

β-gurjuneno 1409 1417 -- -- 0,34

β-cariofileno 1418 1420 0,85 3,45 1,48

α-bergamoteno 1436 1440 0,51 0,88 0,49

Farneseno -- 1420 7,54 1,82 1,16

trans-β-farneseno -- 1458 0,58 -- 1,02

D-Germacreno 1480 1482 0,65 - --

α-selineno 1494 1503 -- 0,41 --

Isocarofileno -- 1502 -- -- 0,33

β-bisaboleno 1509 1513 6,00 2,39 5,29

δ-cadineno -- 1530 -- -- 1,09

cadineno 1538 1530 -- 1,83 --

Sesquiterpenos oxigenados -- -- 0,32

δ-cadinol -- 1500 -- -- 0,32

30


Hidrocarbonetos aromaticos -- -- 0,48

Naftaleno -- 1186 -- -- 0,48

Álcoois, aldeídos e cetonas 20,48 6,00 9,09

4-hiroxi-4-metil -heptan-2-ona -- 851 14,42 -- 0,41

6-metil-5-hepten-2-ona 985 985 1,00 1,01 --

Octanal 1001 1001 0,50 0,58 0,78

Nonanal 1102 1103 1,52 1,90 2,46

n-Decanal 1204 1205 1,14 1,31 4,49

anisaldeido 1252 1255 1,20 1,20 0,95

n-Dodecanal 1417 1409 0,70 -- --

Hidrocarbonetos alifáticos -- 1,84 --

Tetradecano -- 1399 -- 0,55 --

Pentadecano 1500 1499 -- 0,85 --

hexadecano 1600 1598 -- 0,44 --

Fenil propanoides 37,10 65,92 66,32

Estragol -- 1200 3,62 6,16 3,61

trans-anetol 1283 1288 25,58 48,05 52,58

Metil-cis isoeugenol 1402 1404 5,61 8,18 7,38

trans-metil isoeugenol 1447 1497 0,83 1,35 1,16

Elemicin 1554 1555 1,46 2,18 1,59

Não identificados 4,79 0,73 1,19

IK* (Índice de Kovats calculado) IK** (Índice de Kovats da literatura)

Análise Fitoquímica

A cromatografia em camada delgada mostrou um mesmo perfil fitoquímico para

a própolis entre os meses de coleta. Os metabólitos secundários majoritários da própolis

foram os derivados fenólicos (flavonóides, antraquinonas) e terpenos (monoterpenos,

31


sesquiterpenos, triterpenos e esteróides), além da presença de açúcares. Não foi

detectada a presença de alcalóides, iridóides, saponinas, cumarinas, derivados

cinâmicos, fenilpropanoglicosídeos, proantocianidinas condensadas e

leucoantocianidinas. Flavonóides como quercetina, kaempferol, luteolina e apigenina,

também não foram detectados, mesmo sendo reportados na literatura em outras própolis

(Pietra et al., 2002; Salatino et al., 2005). Porém, há uma grande controvérsia em

relação ao teor de flavonóides nas amostras brasileiras (Pereira et al., 2002). Bankova et

al. (1995) concluíram que as própolis brasileiras têm uma baixa concentração de

flavonóides e ésteres de ácidos fenólicos, possuindo altas concentrações de ácido

dihidroxicinâmico, acetofenonas preniladas e alguns terpenóides específicos. Ainda

Bankova et al. (2000) citam que em alguns casos os flavonóides são importantes

componentes presentes na própolis brasileira. Aga et al. (1994) determinam os

compostos prenilados como os maiores constituintes da própolis brasileira e relatam que

a atividade antibacteriana destes compostos pode ser aumentada com o aumento do

número de resíduos prenil na molécula, como citado por Marcucci et al. (2001).

Bioensaio com Artemia salina Leach

No ensaio de toxicidade sobre Artemia salina, o extrato bruto metanólico da

própolis apresentou DL50 igual a 18,9 µg/mL, com intervalo de confiança a 95% entre

14,6 - 24,8 µg/mL. Este resultado sugere uma atividade antitumoral, devido a DL50 ser

menor que 1000 µg/mL, dosagem letal máxima para uma substância ser considerada

ativa, além de uma correlação estatística entre a DL50 e a atividade antitumoral

(McLaughlin, 1993). Banskota et al. (1998) demonstraram que o extrato metanólico de

uma amostra de própolis possui uma citotoxicidade considerável contra células de

32


tumor de cólon, devido ao seu conteúdo de compostos fenólicos. Testes in vitro têm

demonstrado atividade antitumoral da própolis tanto citostática quanto citotóxica.

Conclusão

A composição química dos compostos voláteis da própolis vermelha do Estado

de Pernambuco mostrou-se variada, destacando-se como constituintes majoritários o

trans-anetol, α-copaeno e o metil cis-isoeugenol. A própolis apresenta como

constituintes majoritários os compostos fenólicos, do tipo flavónoides, antraquinonas e

fenóis. Estas substâncias na própolis são representadas pelas agliconas de flavonóides,

ácidos fenólicos e seus ésteres, os quais são responsáveis pela grande variedade das

propriedades biológicas (Banskota et al., 1998; Burdock, 1998; Koo & Park, 1997;

Banskota et al., 2000).

O bioensaio de letalidade em Artemia salina sugere uma promissora atividade

antitumoral para esta própolis a partir de seu conteúdo em compostos fenólicos

confirmado. Dessa maneira, a expansão da indústria de própolis vermelha só será

possível, de forma segura, com a padronização da matéria-prima e dos produtos

acabados, levando-se em conta a diversidade da vegetação regional, a atividade de

coleta das diferentes variedades de abelhas e com o estabelecimento da eficácia e

segurança dos produtos obtidos.

Agradecimento(s)

A CAPES a ao CNPq pelo apoio financeiro e a Mel Brasil pelas amostras de própolis.

Referências Bibliográficas

Adams RP 1995. Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography/Mass Spectroscopy. , Allured, Carol Stream, IL, USA.

33


Aga H, Shibuya T, Sugimoto T, Kurimoto M, Nakagina S 1994. Isolation and identification of antimicrobial compounds in Brazilian propolis. Biosci Biotechnol Biochem 58: 945-946. Bankova V, Christov R, Kujumgiev A, Marcucci M C, Popov S 1995. Chemical composition and antibacterial activity of Brazilian propolis. Z Naturforsch 1995: 167-172. Bankova V, Castro S, Marcucci MC 2000. Propolis: recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie 31: 3-15. Bankova V, Boudourova-Krasteva G, Popov S, Sforcin JM, Funari SRC 1998. Seasonal variations of the chemical composition of Brazilian propolis Apidologie 29: 361-367. Bankova V, Castro S, Marcucci MC 2000. Propolis: recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie 31: 3-15. Banskota AH, Tezuka Y, Adnyana IK, Midorikawa K, Matsushige K, Message D, Huertas AAG, Kadota S 2000. Cytotoxic, hepatoprotective and free radical scavenging effects of propolis from Brazil, Peru, the Netherlands and China. J Ethnopharmacol 72: 239-246. Banskota AH, Tezuka Y, Prasain JK, Matsushige K, Saiki I, Kadota S 1998. Chemical constituents of Brazilian propolis and their citotoxic activities. J Nat Prod 29: 896-900. Bianchini L, Bedendo I P 1998. Efeito antibiótico da própolis sobre bactérias fitopatogênicas. Sci agric Piracicaba 55: 149-152. Burdock G A 1998. Review of the biological properties and toxicity of bee propolis (propolis). Food Chem Toxicol 36: 347-363. Costa, Aloisio Fernandes. 2002 . Farmacognosia. 6. ed. Lisboa: Fundacao Calouste Gulbenkian. Dewick, P.M. 2003. Medicinal Natural Products. Chichester: John Wiley & Sons, 507 p. Nirmala Devi, T. D., Armugasamy, S. and Vijayalatha, K. 2005. Herbs for Good Health. Publications of Centre for Indian Knowledge Systems, Kottupuram, India 12 pp. Harbone JB 1998. Phytochemical methods. 3.ed. London: Chapman & Hall. Koo MH, Park YK 1997. Investigation of flavonoid aglycones in propolis collected by two different varieties of bees in the same region. Biosci Biotechnol Biochem 61: 367-369.

34


Marcucci MC, Trusheva B, Popova M, Vassya Bankova V, Simova S, Miorin PL, Pasin FR, Tsvetkova I 2006. Bioactive Constituents of Brazilian Red Própolis, Advance Access Publication, eCAM 3:249–254. Marcucci MC, Ferreres F, García-Viguera C, Bankova VS, De Castro SL, Dantas AP, Valente PHM, Paulino N 2001. J. Ethnopharmacol 74: 105. McLaughlin JL, Chang CJ, Smith DL 1993. In Human Medicinal Agents from Plants, Kinghorn, A. D. & Balandrin, M. F., eds., Symposium Series No. 534, American Chemical Society, Washington, D.C. 112-137. Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE, McLaughlin JL 1982. Brine shrimp: A convenient general bioassay for active plant constituents. Planta Med 45: 31-34. Moersdorf, K. 1966. Ciclic terpenes and their choleretic action. Clin. Ther., n.7, p.442-3. Park KY, Alencar SM, Aguiar CL 2002. Botanical origin and chemical composition of Brazilian propolis. J Agric. Food Chem 50: 2502–2506. Park YK, Koo MH, Ikegaki M, Contado JL 1997. Comparison of the flavonoid aglycone contents of Apis mellifera propolis from various regions of Brazil. Arquivos de biologia e tecnologia, 40: 97-106. Park YK, Abreu JAS, Ikegabi M, Cury JA, Rosalen P L 1998. Antimicrobial activity of propolis on oral microorganisms. Curr Microbiol 36: 24-29. Pereira AS, Seixas FRMS, Neto FRA 2002. Propolis: 100 anos de pesquisa e suas perspectivas futuras. Quim Nova 25: 321-326. Petri, G., Lemberkovics, E. and Foldvari, M. 1988. Examination of differences between propolis (bee glue) produced from different floral environments. In Flavours and Fragrances: a world perspective (eds. Lawrence, B.M., Mookherjee, B.D., Willis, B.J.). Elsevier Sci. PubI., Amsterdam, p.439-446. Pietta PG, Gardana C, Pietta A M 2002. Analytical methods for quality control of propolis. Fitoterapia 73: suppl. 1: S7-20. Salatino A, Teixeira EW, Negri G, Message D 2005. Origin and chemical variation of Brazilian propolis eCAM 2, 33-38. Sena Filho JG, Melo JGS, Saraiva AM, Gonçalves AM, Psiottano MNC, Xavier HS 2006. Rev.Bras. Farmacogn. 16, 506. Shukla, H.S., Tripathi, S.C. Antifungal substance in the essential oil of anise (Pimoinella anisum L.). Agric. Biol. Chem., v. 51, n.7, p.1991-3, 1987. Wagner H, Bladt S 1996. Plant drug analysis – A thin layer chromatography atlas; Springer: Munich, 2ªed.

35


CAPÍTULO 3

INFLUÊNCIA DA VARIAÇÃO SAZONAL NA ATIVIDADE

ANTIOXIDANTE E FENÓIS TOTAIS DE EXTRATOS DE

PRÓPOLIS VERMELHA

(Artigo a ser submetido à Revista LWT)

36


Influência da variação sazonal na atividade antioxidante e fenóis totais de

extratos de própolis vermelha

Alexandre Bezerra Galindoa, Sarah Rodrigues Lustosaa, Mariana Trycia Brasileiroa,

Amanda Alencar do Egitoa, Jeckson Luiz da Silvaa, Karina Perrelli Randaub, Lívio

César Cunha Nunesc, Pedro José Rolim Netoa∗

aLaboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Ciências


bLaboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas,

Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brasil,

cNúcleo de Tecnologia Farmacêutica, Universidade Federal do Piauí, 60400-000,

Teresina, PI, Brasil.

Resumo

Recentemente, tem crescido consideravelmente o interesse pela descoberta de

antioxidantes de ocorrência natural para uso em alimentos ou produtos medicinais, em

substituição aos antioxidantes sintéticos. A própolis tem sido objeto de estudos

farmacológicos devido às suas propriedades biológicas, dentre elas a antioxidante. Neste

trabalho avaliou-se a influência da sazonalidade na atividade antioxidante e teor de

fenóis de extratos etanólicos de própolis vermelha, bem como se estabeleceu a

correlação entre ambos, sendo a capacidade antioxidante avaliada por diferentes

métodos (DPPH, H2O2 e atividade antioxidante total). Os resultados demonstraram que

a própolis vermelha analisada possui atividade antioxidante, comprovada pelos

∗ [email protected]

37


diferentes métodos, e que tal atividade está relacionada ao seu teor de compostos

fenólicos, bem como à época de sua coleta.

Palavras-chave: própolis vermelha, fenóis totais, atividade antioxidante

Abstract

Recently, the discovery interest for natural antioxidant substances growing increasingly

for the use of the medicinal and foods products, in substitution to synthetic antioxidant

substances.The propolis have been object of pharmacologyc studies due its biological

activity, amongst the antioxidant properties. In this work it was evaluated the

sazonalidade influence in the antioxidant activity and total phenolic content of red

própolis ethanolic extratcts, as well as if it established the correlation between both,

being the antioxidant capacity evaluated by different methods (DPPH, H2O2 and total

antioxidant activity). The results had demonstrated that the red propolis analyzed

possess antioxidant activity, demonstrate for the different methods. This activity is

related with total phenolic content, as well as, on the time of its collection.

Key words: red propolis, total phenols, antioxidant activity

1. Introdução

Espécies reativas de oxigênio (EROs) são formadas continuamente nas células

como conseqüência tanto de reações bioquímicas oxidativas como de fatores externos

(RUSSO et al., 2002). Estas incluem radicais livres, como o ânion superóxido (O2-) e o

radical hidroxil (–OH), e espécies não-radicais livres, como o H2O2 e o oxigênio singleto

(1O2) (Gülcin et al., 2005; Kumar et al., 2005; Ardestani & Yazdanparast, 2006).

O estresse oxidativo, induzido por radicais de oxigênio, provoca danos em

biomoléculas essenciais como carboidratos, proteínas, aminoácidos, lipídios, ácidos

38


nucléicos, entre outra substâncias oxidáveis (Nagai et al., 2001; Melo et al., 2006;

Ardestani & Yazdanparast, 2006; Sharififar et al., 2006), contribuindo, então, para o

envelhecimento e a instalação de doenças crônico-degenerativas, como câncer, doenças

cardiovasculares, artrite, úlcera gástrica, entre outras (Melo et al., 2006; Siddhuraju,

2007; Stratil et al., 2007; Kumaran & Karukumaran, 2007).

Nos seres vivos, a produção de radicais livres é controlada por diversos

compostos antioxidantes, os quais podem ter origem endógena, como, por exemplo, as

enzimas antioxidativas (superóxido dismutase, catalase, glutation peroxidase, entre

outras), ou serem provenientes da dieta alimentar e outras fontes (por exemplo,

tocoferóis, ácido ascórbico, polifenóis, selênio e carotenóides) (Sousa et al., 2007;

Ardestani & Yazdanparast, 2006; Zhenbao et al., 2007).

De uma forma geral, denominam-se antioxidantes as substâncias que presentes

em concentrações baixas, comparadas ao substrato oxidável, retardam

significativamente ou inibem a oxidação do substrato (Sousa et al., 2007). Eles podem

agir através de um ou mais mecanismos, tais como inibição de radicais livres e

complexação de metais (Duarte-Almeida, 2007).

Recentemente, tem crescido consideravelmente o interesse pela descoberta de

antioxidantes de ocorrência natural para uso em alimentos ou produtos medicinais, em

substituição aos antioxidantes sintéticos, os quais estão sendo restritos devido aos seus

efeitos carcinogênicos (Kumaran & Karukumaran, 2007).

Dentre as diversas classes de substâncias antioxidantes de ocorrência natural, os

compostos fenólicos têm recebido muita atenção nos últimos anos (Siddhuraju, 2006;

Stratil et al., 2006). Antioxidantes fenólicos funcionam como seqüestradores de radicais

livres e algumas vezes como quelantes de metais, agindo tanto na etapa de iniciação

como na propagação do processo oxidativo (Soares, 2002, Duarte-Almeida et al., 2006).

39


Própolis é uma mistura complexa, formada por material resinoso e balsâmico


desses, na colméia, as abelhas adicionam secreções salivares e enzimas (Pereira et al.,

2002; Franco et al., 2000). Sua composição é bastante variada e já foram identificados

mais de 300 constituintes (Cunha et al., 2004; Silici & Kutluca, 2005), dentre eles

podemos citar ácidos graxos e fenólicos, flavonóides (flavonas, flavanonas, flavonóis),

terpenos, esteróides, álcoois e aldeídos aromáticos, sesquiterpenos, entre outros

(Marcucci et al., 2001). Contudo, a proporção dessas substâncias varia e depende do

local e da época da coleta (Da Silva et al., 2005).



antioxidante, antitumoral, imunomodulatória, entre outras (Bankova, 2005; Kosalec et

al., 2005; Alencar et al., 2005). Esse potencial biológico se deve a um sinergismo que

ocorre entre os muitos constituintes (Marcucci, 1996).

Vários autores relatam que algumas das propriedades biológicas,

particularmente a atividade antioxidante, em extratos etanólicos de própolis, se deve em

parte ao seu alto conteúdo de flavonóides (Adelmann, 2005). Embora estudos com

extratos etanólicos de própolis sejam mais comuns, é relatado que o extrato aquoso da

própolis possui uma boa atividade antioxidante, associada ao alto teor de compostos

fenólicos (Mani et al., 2006).

Existe uma correlação entre o alto conteúdo de flavonóides totais e a atividade

anti-radicais livres em extratos de própolis da Argentina (Ahn et al., 2007). Da Silva et

al. (2006) sugerem que os flavonóides desempenham importante papel na atividade

antioxidante de extratos de própolis brasileira, mas outros fatores poderiam estar

envolvidos (Choi et al., 2006).

40


Há vários estudos comparativos da atividade antioxidante de própolis de

diferentes origens geográficas, como Japão, China, Brasil e Estados Unidos. Porém, há

poucos estudos relacionando a atividade antioxidante da própolis com seus constituintes

químicos (Kwmazawa et al., 2004), bem como estudos que relatem atividades

biológicas, dentre elas a antioxidante, da própolis vermelha.

Paralelamente ao crescimento do interesse por antioxidantes de origem natural,

há um aumento no uso de métodos para estimar a eficiência de substâncias como

antioxidante (Molyneux, 2004). Diversas técnicas têm sido utilizadas para determinar a

atividade antioxidante in vitro (Duarte-Almeida et al., 2006), porém, apesar da

diversidade de métodos, não existe um procedimento metodológico universal (Melo et

al., 2006).

A quantificação espectrométrica de compostos fenólicos é realizada por meio de

uma variedade de técnicas, porém a que utiliza o reagente Folin-Ciocalteau é a mais

comumente empregada (Sousa et al., 2007; Stratil et al., 2006).

Este trabalho objetivou avaliar a influência da sazonalidade na atividade

antioxidante e teor de fenóis de extratos etanólicos de própolis vermelha, bem como

estabelecer a correlação entre teor de fenóis e a capacidade antioxidante, sendo esta

avaliada por diferentes métodos.

2. Materiais e métodos

2.1. Preparação dos extratos

Foram preparados extratos etanólicos de própolis vermelha (EEP) a 20% (m/v)

de três amostras do apiário da região de Goiana, PE, Brasil, coletadas nos meses de

fevereiro, junho e outubro de 2006. Realizou-se maceração durante 48 h em soluções

41


hidroalcoólicas a 70%, 80% e 90%. Após esse tempo, os extratos foram filtrados e

acondicionados em frasco de vidro âmbar.

2.2. Determinação dos fenóis totais

Foi construída uma curva padrão, utilizando como substância de referência o

ácido tânico. Alíquotas de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 mL da solução aquosa de ácido tânico a

100 µg/mL foram transferidas para balões volumétricos de 100 mL e adicionados 5 mL

de Folin-Ciocalteau. Após 2 minutos, foram adicionados 10 mL de solução de carbonato

de sódio 15% e o volume foi completado com água destilada. As soluções foram

deixadas em repouso por 30 minutos e foram lidas a 760 nm. As amostras foram

preparadas utilizando 3 mL dos extratos hidroalcoólicos de própolis a 2 mg/mL

(referentes aos meses de fevereiro, junho e outubro de 2006). O branco do sistema foi

preparado da mesma forma, sem a alíquota da amostra.

2.3. Atividade antioxidante

2.3.1. Análise qualitativa

Os extratos de própolis (hexânico, clorofórmico, metanólico e hidroalcoólicos a

20% m/v) foram analisados por cromatografia em camada delgada (CCD), usando

rutina como padrão positivo. As placas foram eluídas em AcOEt- HCOOH-AcOH- H2O

(100:0.2:0.2:0.2v/v) e AcOEt- HCOOH-AcOH- H2O (100:0.3:0.3:0.3 v/v) (Wagner &

Bladt, 1996) e, após secagem, foram nebulizadas com solução a 0,4 mM do radical

DPPH em MeOH. As placas foram observadas até o aparecimento de manchas amarelas

sob fundo de coloração púrpura, indicativa de possível atividade antioxidante (Soler-

Rivas et al., 2000).

42


2.3.2. Método do radical livre DPPH• (1,1-difenil-2-picrilhidrazil)

Foi preparada uma solução estoque de DPPH em metanol na concentração de 0,4

mM. A partir desta, foram feitas diluições de 0.2, 0.1, 0.05, 0.025 e 0.0125 mM. A

curva de calibração foi construída a partir dos valores da absorbância a 517 nm de todas

as soluções.

Alíquotas (0,6 mL) das soluções metanólicas de própolis, preparadas a partir dos

extratos hidroalcoólicos a 90%, com concentrações totais de própolis de 25, 50 e 100

μg/mL, foram colocadas em diferentes tubos de ensaio. Em seguida, 5,4 mL da solução

de DPPH em metanol (0,05 mM) foram adicionados e, após agitação, os tubos foram

deixados em repouso ao abrigo da luz. Ao final de 15, 30, 45 e 60 min, a absorbância foi

medida a 517 nm e a capacidade de seqüestrar o radical, expressa como percentual de

inibição, calculada de acordo com a seguinte equação matemática:

% inibição = Abs controle – Abs da amostra x 100 Abs controle

Onde: Abs controle = absorbância do controle (solução de DPPH sem antioxidante)

Abs amostra = absorbância da amostra a ser testada

O mesmo procedimento foi realizado empregando-se soluções metanólicas de

padrão rutina, nas concentrações de 12.5, 25.0, 50.0, 100.0 e 200.0 μg/mL, para a

construção de uma curva padrão (Melo et al., 2006).

2.3.3. Determinação da capacidade antioxidante total

A atividade antioxidante dos extratos foi avaliada pelo método do

fosfomolibdênio, descrito por Prieto, Pineda e Aguilar (1999). O ensaio baseia-se na

redução do Mo(VI) – Mo(V) pelo extrato e subseqüente formação do complexo verde

de fosfato/Mo(V). A 0,6 mL das soluções metanólicas (25, 50 e 100 μg/mL) foram

adicionados 6 mL da solução reagente (ácido sulfúrico 0,6 M, fosfato de sódio 28 mM e

43


molibdato de amônio 4 mM). Os tubos contendo a solução reacional foram incubados a

95oC por 90 minutos. Em seguida, a absorbância da solução foi medida a 695 nm,

usando como branco uma solução contendo metanol no lugar do extrato. A atividade

antioxidante foi expressa em atividade antioxidante relativa ao padrão rutina (AAR%),

dada pela fórmula (Kumaran & Karukumaran, 2007):

AAR% = Abs (amostra) – Abs (branco) x 100 Abs (rutina) – Abs (branco)

2.3.4. Método do Peróxido de Hidrogênio

Uma solução (4 mM) de peróxido de hidrogênio foi preparada em tampão

fosfato (pH 7,4). A concentração de peróxido de hidrogênio foi determinada

espectrofotometricamente no comprimento de onda de 230 nm, usando absortividade

molar de 81 (mol/L)-1 cm-1 (Yen & Chen, 1995). Às soluções metanólicas de própolis

(25, 50 e 100 μg/mL), adicionou-se a solução de peróxido de hidrogênio (0,6 mL).

Após 10 minutos de reação, à temperatura ambiente (25ºC), realizou-se leitura em

espectrofotômetro, em comprimento de onda de 230 nm, contra solução branco

contendo o extrato em tampão sem peróxido de hidrogênio. A atividade antioxidante foi

expressa em percentual conforme a seguinte fórmula:

(%) = 1 – (Abs da amostra – Abs branco) x 100 Abs controle

2.3.5. Análise estatística

Os experimentos foram realizados em triplicata. Os resultados são apresentados

como média ± desvio padrão (DP). O teste t, a análise de variância (ANOVA) e o teste

de Tukey foram utilizados para a análise estatística. Valores de p≤0,05 foram

considerados como indicativos de significância.

44


3. Resultados e Discussão

3.1. Determinação dos fenóis totais

O índice de fenóis totais foi determinado pelo método de Folin & Ciocalteau

(1927). O reagente consiste da mistura dos ácidos fosfomolibídico e fosfotunguístico,

no qual o molibdênio e o tungstênio encontram-se no estado de oxidação 6+, porém, em

presença de certos agentes redutores, como os compostos fenólicos, formam-se os

chamados molibdênio azul e tungstênio azul, nos quais a média do estado de oxidação

dos metais está entre 5 e 6 e cuja coloração permite a determinação da concentração das

substâncias a 765 nm (Kuskoski et al., 2006; Sousa et al., 2007).

O teor de fenóis totais, bem como a variação entre as amostras analisadas,

encontram-se na Tabela 1. Observou-se que o índice de fenóis foi maior para extratos

etanólicos a 90%. No que se refere à sazonalidade das amostras analisadas, o teor de

fenóis foi crescente na seguinte ordem: fevereiro < junho < outubro.

Tabela 1 Teor de fenóis totais das amostras de própolis coletadas nos meses de fevereiro, junho e outubro de 2006

Amostras Extrato etanólico *Fenóis totais (%)±DP

70% 7,116 ± 0,053 80% 7,613 ± 0,042 Fevereiro/06 90% 8,440 ± 0,034 70% 9,095 ± 0,053 80% 8,039 ± 0,069 Junho/06 90% 9,315 ± 0,099 70% 13,334 ± 0,077 80% 13,617 ± 0,117 Outubro/06 90% 13,476 ± 0,113

*Média ± DP, n = 3

3.2. Análise qualitativa

A avaliação preliminar qualitativa dos extratos por CCD, revelada com solução

metanólica a 0,4 mM de DPPH, revelou a existência de substâncias com atividade

45


antioxidante, evidenciadas pela presença de manchas amarelas sobre fundo púrpuro,

resultantes da redução do radical DPPH. Porém, para os extratos etanólicos a 90%, a

existência de substâncias com atividade antioxidante ficou mais evidente. Por isso,

levando-se também em consideração o teor de fenóis totais, esses extratos foram eleitos

para dar continuidade ao estudo.

3.3. Método do radical livre DPPH

Entre os métodos químicos aplicados para determinar a capacidade antioxidante

de um composto em capturar radicais livres, o método DPPH (1,1,-difenil-2-

picrilhidrazil) é um dos mais utilizados por ser considerado prático, rápido e estável

(Kuskoski et al., 2006).

A equação da curva de calibração do DPPH foi A = 10,489C + 0,0053, onde A é

a absorbância no comprimento de onda de 517 nm e C corresponde à concentração de

DPPH, e o coeficiente de correlação R2 = 0,9999.

As amostras testadas foram obtidas a partir dos extratos hidroalcoólicos a 90%,

visto que foram os que apresentaram o maior teor de fenóis totais, procedendo-se da

mesma forma para os demais testes.

A capacidade de seqüestrar o radical DPPH, expressa em % de inibição exibida

pelos extratos e padrão rutina nas concentrações de 25, 50 e 100 µg/mL e no intervalo

de tempo entre 0-60 min, encontra-se na Tabela 2.

Todas as amostras de própolis apresentaram atividade seqüestradora do radical

DPPH e essa atividade foi crescente à medida que se aumentou a concentração da

amostra, conforme pode ser observado nas Figuras 1, 2 e 3. Além disso, a amostra de

própolis referente ao mês de outubro/06, a qual apresentou o maior teor de fenóis,

demonstrou também maior atividade seqüestradora do radical DPPH.

46


Tabela 2 Capacidade de seqüestrar o radical DPPH (% de inibição)

15 min 30 min 45 min 60 min Amostras [ ] de 25 µg/mL* Rutina 37,48a±0,50 39,74a±0,78 41,62a±0,91 43,29a±1,15

Própolis outubro/06 30,50b±1,02 31,48b±0,94 33,31b±2,51 33,71b±2,52 Própolis junho/06 27,36c±1,08 25,86bc±1,44 29,24b±2,49 29,58b±2,29

Própolis fevereiro/06 20,86d±0,46 22,20c±1,48 22,96c±1,28 22,74c±1,82 [ ] de 50 µg/mL*

Rutina 58,99a±0,98 62,75a±2,01 65,26a±0,95 66,94a±1,65 Própolis outubro/06 38,73b±1,66 39,50b±0,70 41,66b±2,65 41,60b±1,09 Própolis junho/06 31,97b±0,89 34,51c±1,69 35,31c±1,80 35,30c±0,57

Própolis fevereiro/06 27,41d±1,02 28,17d±1,29 29,15d±2,16 29,22d±1,79 [ ] de 100 µg/mL*

Rutina 81,80a±1,03 84,07a±1,52 84,31a±1,22 84,52a±1,33 Própolis outubro/06 46,76b±2,62 49,24b±2,99 49,24b±3,14 52,67b±3,13 Própolis junho/06 42,22b±0,77 43,96b±0,26 43,96b±0,48 46,46bc±1,07

Própolis fevereiro/06 41,50b±3,70 43,45b±3,46 43,45b±3,54 45,68c±3,58 *Média ± DP, n=3; letras iguais, na mesma coluna e numa mesma concentração, indicam que, no nível de 5%, não há diferença estatisticamente significativa entre as respectivas médias pelo teste de Tukey.

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

15 30 45 60Tempo (min)

% In

ibiç

ão

25µg/ml 50µg/ml 100µg/ml

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

15 30 45 60Tempo (min)

% In

ibiç

ão


0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

15 30 45 60Tempo (min)

% In

ibiç

ão


Figura 2. Porcentagem de inibição do radical DPPH pelo extrato etanólico de própolis referente ao mês de junho de 2006 em função do tempo.

Figura 1. Porcentagem de inibição do radical DPPH pelo extrato etanólico de própolis referente ao mês de fevereiro de 2006 em função do tempo.

Figura 3. Porcentagem de inibição do radical DPPH pelo extrato etanólico de própolis referente ao mês de outubro de 2006 em função do tempo.

47


Segundo alguns autores, o tempo de medida de reação entre o radical e a amostra

de 30 minutos é suficiente, embora outros autores determinem 20 minutos (Kuskoski et

al., 2006). Avaliamos os intervalos de 15, 30, 45 60 minutos de reação, porém a análise

estatística revela que não há diferenças significativas entre as determinações efetuadas

nos diferentes intervalos de tempo para uma mesma concentração de amostra.

3.4. Determinação da capacidade antioxidante total

O método fosfomolibdênio é baseado na redução do Mo(VI) para Mo(V), pelo

composto antioxidante, e formação do complexo verde fosfato/Mo(V), o qual tem

absorção máxima a 695 nm (Kumaran & Karukumaran, 2007).

A atividade antioxidante total das soluções metanólicas de própolis a 25, 50 e

100 µg/mL é mostrada na Tabela 3. Os resultados estão expressos em atividade

antioxidante relativa ao padrão rutina (AAR% rutina). O estudo revelou que a atividade

antioxidante é maior para a própolis referente ao mês de outubro/06 (3ª coleta) e que seu

aumento ocorre concomitantemente com o aumento da concentração das amostras.

Tabela 3 Atividade antioxidante total dos extratos metanólicos de própolis em AAR% rutina

Amostras AAR% rutina ± DP* Própolis fevereiro/06

25 µg/ml 19,27±3,36 50 µg/ml 27,72±2,37 100 µg/ml 39,72±2,16

Própolis junho/06 25 µg/ml 28,44±3,64 50 µg/ml 32,78±1,79 100 µg/ml 40,83±2,63

Própolis outubro/06 25 µg/ml 38,34±4,58 50 µg/ml 44,36±2,13 100 µg/ml 55,41±2,83

*Média ± DP, n=3

48


3.5. Método do Peróxido de Hidrogênio

A capacidade de inibir o efeito oxidativo do H2O2 também demonstrou ser maior

com o aumento da concentração dos extratos de própolis (Tabela 4). Neste método, a

própolis referente ao mês de outubro/06 também apresentou maior atividade

antioxidante. Apesar de, numericamente, a atividade antioxidante ter sido mais elevada

neste método, tal resultado não pode ser comparado aos demais, visto que não há um

procedimento metodológico universal para se avaliar a capacidade antioxidante, pois

cada um deles avalia um mecanismo de ação diferente.

Tabela 4 Atividade antioxidante pelo método do peróxido de hidrogênio

Amostras Atividade antioxidante (%) ± DP* Própolis fevereiro/06

25 µg/ml 53,12±2,19 50 µg/ml 56,23±1,57 100 µg/ml 59,81±1,82

Própolis junho/06 25 µg/ml 64,48±1,96 50 µg/ml 67,58±1,80 100 µg/ml 69,52±1,16

Própolis outubro/06 25 µg/ml 71,41±1,26 50µg/ml 74,65±1,75

100 µg/ml 75,50±1,15 *Média ± DP, n=3

4. Conclusão

Os resultados demonstraram que o teor de fenóis totais varia com a sazonalidade

e concentração da solução hidroalcoólica empregada na extração, sendo maior para

extratos hidroalcoólicos a 90% e para a própolis referente ao mês de outubro de 2006.

Esta mesma amostra apresentou maior capacidade antioxidante em todos os métodos

empregados, levando à correlação entre a atividade antioxidante, o teor de fenóis totais

e a sazonalidade.

49


Portanto, conclui-se que a própolis vermelha analisada possui atividade

antioxidante, comprovada por diferentes métodos, e que tal atividade pode ser

relacionada ao seu teor de compostos fenólicos, bem como à época de sua coleta.

Referências

1. Adelmann, J. (2005). Própolis: Variabilidade composicional, correlação com a flora

e bioatividade antimicrobiana/antioxidante. Dissertação de Mestrado, UFPR,

Curitiba.

2. Ahn M., Kumazawa S., Usui Y., Nakamura J., Matsuka M., Zhu F. & Nakayama T.

(2007). Antioxidant activity and constituents of propolis collected in various áreas

of China. Food Chem., 101, 1400-1409.

3. Alencar S.M., Aguiar C.L., Guzmán J.P. & Park Y.K. (2005). Composição química

de Baccharis dracunculifolia. Ciência Rural, 35, 909-915.

4. Ardestani, A. & Yazdanparast, R. (2006). Antioxidant and free radical scavenging

potential of Achillea santolina extracts. Food Chemistry, doi:10.1016/ j.foodchem.

200.10.066.

5. Bankova, V. (2005). Chemical diversity of propolis and the problem of

standardization. J Ethnopharmacol, 100, 114-117.

6. Choi, Y.M., Noh, D.O., Cho, S.Y., Suh, H.J., Kim, K.M. & Kim, J.M. (2006).

Antioxidant and antimicrobial activities of propolis from several regions of Korea.

LWT, 39, 756-761.

7. Cunha, I.B.S., Sawaya, A.C.H.F., Caetano, F.M., Shimizu, M.T., Marcicci, M.C.,

Drezza, F.T., Povia, G.S. & Carvalho, P.O. (2004). Factors that influence the yield

and composition fo Brazilian própolis extracts. J. Braz. Chem. Soc., 15, 964-970.

50


8. Da Silva, J.F.M., Souza, M.C., Matta, S.R., Andrade, M.R. & Vidal, F.V.N. (2006).

Correlation analysis between phenolic levels of Brazilian propolis extracts and their

antimicrobial and antioxidant activities. Food Chem, 99, 431-435.

9. Da Silva, M.S., Citó, A.M.G., Chaves, M.H. & Lopes, J.A.D. (2005). Triterpenóides

tipo cicloartano de própolis de Teresina-PI. Quím. Nova, 28, 801-804.

10. Duarte-Almeida, J.M., Santos, R.J., Genovese, M.I. & Lajolo, F.M. (2006).

Avaliação da atividade antioxidante utilizando sistema β-caroteno/ácido linoléico e

método de seqüestro de radicais DPPH. Ciênc. Tecnol. Aliment., 26, 446-452.

11. Franco, S.L., Brusch, M.L., Moura, L.P.P. & Bueno, J.H.P. (2000). Avaliação

Farmacognóstica da própolis da região de Maringá. Rev Bras Farmacognosia, 9, 1-

10.

12. Gülcin, I., Alici, H.A. & Cesur, M. (2005). Determination of in vitro antioxidant and

radical scaveging activities of propofol. Chem. Pharm. Bull., 53, 281-285.

13. Kosalec, I., Pepeljnjak, S., Bakmaz, M. & Vladimir-Knezevic, S. (2005). Flavonoid

analysis and antimicrobial activity of commercially available propolis product. Acta

Pharm, 55, 423-430.

14. Kumar, R.S., Sivakumar, T., Sunderam, R.S., Gupta, M., Mazumdar, U.K.,

Gomathi, P., Rajeshwar, Y., Saravanan, S., Kumar, M.S., Murugesh, K. & Kumar,

K.A. (2005). Brazilian Journal and Biological Research., 38, 10015-1024.

15. Kumaran, A. & Karakumaran, J. (2007). In vitro antioxidant activities of methanol

extracts of five Phyllanthus species from India. LTW, 40, 344-352.

16. Kumazawa, S., Hamazsaka, T. & Nakayama, T. (2004). Antioxidant activity of

propolis of various geographic origins. Food chemistry, 84, 324-339.

51


17. Kuskoski, E.M., Asuero, A.G., Morales, M.T. & Fett, R. (2006). Frutos tropicais

silvestres e polpa de frutas congeladas: atividade antioxidante, polifenóis e

antocianinas. Ciência Rural, 36, 1283-1287.

18. Mani, F., Damasceno, H.C.R., Novelli, E.L.B., Martins, E.A.M. & Sforcin, J.M.

(2006). Propolis: Effect of different concentrations, extracts and intake period on

seric biochemical variables. J Ethnopharmacol, 105, 95-98.

19. Marcucci, M.C. (1996). Propriedades biológicas e terapêuticas dos constituintes

químicos da própolis. Quim Nova. 19, 529-536.

20. Marcucci, M.C., Ferreres, F., Garcia-Viguera, C., Bankova, V.S., De Castro, S.L.,

Dantas, A.P., Valente, P.H.M. & Paulino, N. (2001). Phenolic compounds from

Brazilian própolis with pharmacological activities. J. Ethnopharmacol., 74, 105-

112.

21. Melo, E.A., Maciel, M.I.S., Lima, V.L.A.G., Leal, F.L.L., Caetano, A.C.S. &

Nascimento, R.J. (2006). Capacidade antioxidante de hortaliças usualmente

consumidas. Ciênc. Tecnol. Aliment., 26, 639-644.

22. Mensor, L.L. (2001). Screening of brazilian plant extracts for antioxidant activity by

the use of DPPH free radical method. Phytotherapy Research., 15, 127-130.

23. Molyneux, P. (2004). The use the stable radic al diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for

estimating antioxidant activity. Songklanakarin J. Sci. Technol., 26, 211-219.

24. Nagai, T., Sakai, M., Inoue, R., Inoue, H. & Suzuki, N. (2001). Antioxidative of

some commercially honeys, royal jelly, and propolis. Food Chemistry, 75, 237-240.

25. Pereira, A.S., Seixas, F.R.M.S. & Aquino Neto, F.R. (2002). Própolis: 100 anos de

pesquisa e suas perspectivas futuras. Quim Nova, 25, 321-326.

26. Prieto, P., Pineda, M. & Aguilar, M. (1999). Spectrophotometric quantitation of

antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex:

52


specific application to the determination of vitamin E. Analytical Biochemistry, 269,

337-341.

27. Russo, A., Longo, R. & Vanella, A. (2002). Antioxidant activity of propolis: role

caffeic acid phenethyl ester and galangin. Fitoterapia, 73, S21-S29.

28. Sharififar, F., Moshafi, M.H., Mansouri, S.H., Khoshademas, M. & Koshinoodi, M.

(2006). In vitro avaluation of antibacterial and antioxidant activities of the essential

oil and methanol extracts of endemic Zataria multiflora Boiss. Food Control, 18,

800-805.

29. Siddihuraju, P. (2007). Antioxidant activity of polyphenolic compounds extracted

from deffated raw heated Tamarindus indica seed coat. LTW, 40, 982-990.

30. Silici, S. & Kutluca, S. (2005). Chemical composition and antibacterial activity of

própolis colleted by three different races of honeybees in the same region. J.

Ethnopharmacol., 99, 69-73.

31. Soares, S.E. (2002). Ácidos fenólicos como antioxidantes. Rev. Nutr., 15, 71-81.

32. Soler-Rivas, C., Espín, J.C. & Wichers, H. J. (2000). An easy fast test to compare

total free radical scavenger capacity of foodstuffs. Phytochem. Anal., 11, 330-338.

33. Sousa, C.M.M., Rocha e Silva, H., Vieira Júnior, G.M., Ayres, M.C., Costa, C.L.S.,

Araújo, D.S., Cavalcante, L.C.D., Barros, E.D., Araújo, P.B.M., Brandão, M.S. &

Chaves, M.H. (2007). Fenóis totais e atividade antioxidante de cinco plantas

medicinais. Quím, Nova, 30, 351-355.

34. Stratil, P., Kledjus, B. & Kuban, V. (2007). Determination of phenolic compounds

and their antioxidant activity in fruits and cereals. Talanta, 71, 1741-1751.

35. Wagner, H., Bladt, S. (1996) . Plant drug analysis – A thin layer chromatography

atlas; Springer: Munich, 2ªed.

53


36. Yen, G.C. & Chen, H.Y. (1995). Antioxidant activity of various tea extracts in

relation to their antimutagenicity. J. Agric. Food Chem., 43, 27-32.

37. Zhenbao, J., Fei, T., Ling, G., Guanjun, T. & Xiaolin, D. (2007). Antioxidant

properties of extracts from jumingzi (Cassia tora L.) evaluated in vitro. LTW, 40,

1072-1077.

54


CAPÍTULO 4

PERFIL FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

CICATRIZANTE DA PRÓPOLIS VERMELHA EM LESÕES

PROVOCADAS EM DORSO DE RATOS

55


Perfil fitoquímico e avaliação da atividade cicatrizante da própolis

vermelha em lesões provocadas em dorso de ratos

Introdução

A capacidade auto-regenerativa é um fenômeno universal nos organismos vivos.

Nos organismos unicelulares, está restrita à presença de enzimas responsáveis pela

regeneração de elementos estruturais e de moléculas de alta complexidade. Em

organismos superiores, além destes, também ocorre o reparo de tecidos que pode se dar

de duas formas: pela regeneração com a reposição da atividade funcional do tecido ou

pela cicatrização com restabelecimento da hemostasia do tecido com perda da sua

atividade funcional pela formação de cicatriz fibrótica (BALBINO et al., 2005).

A cicatrização constitui um processo biológico complexo e dinâmico de

restauração de estruturas celulares e camadas teciduais (AQUINO et al., 2006; GOMES

et al., 2006), envolvendo fenômenos bioquímicos e fisiológicos que se comportam de

forma harmoniosa a fim de garantir a restauração tissular (MANDELBAUM et al.,

2003). Tem início a partir da perda de integridade da pele, gerando uma solução de

continuidade que atinge os planos subjacentes em diversos graus (MARTINS et al.,

2003). Fatores ambientais e fisiológicos exercem grande impacto na evolução da

cicatrização, podendo exercer influência na qualidade da cicatriz, no tempo de

cicatrização e na presença ou não de complicações (BIONDO-SIMÕES et al., 2006).

Diferentes classificações didáticas são utilizadas para facilitar o entendimento de

um processo totalmente dinâmico e com fases interdependentes como a cicatrização

(MANDELBAUM et al., 2003). Existem autores que consideram três (GOMES et al.,

2006) ou quatro estágios (MARTINS et al., 2003). Outros autores classificam de uma

forma mais completa dividindo o processo em cinco fases principais: coagulação,

56


inflamação, proliferação, contração da ferida e remodelação (MANDELBAUM et al.,

2003).

Na cicatrização por segunda intenção, o tecido de granulação, formado pela

proliferação de fibroblastos e capilares, constitui barreira contra infecção, superfície

para migração do epitélio e tem papel na contração da ferida (RAHAL et al., 2001).

Apesar do desenvolvimento nas áreas de síntese orgânica, biologia molecular e

biologia industrial, parte dos fármacos empregados na cicatrização permanece sendo

obtida de matérias-primas naturais (AQUINO et al., 2006). Por isso, a descoberta de

substâncias que possam modelar a resposta à agressão tecidual tem sido objeto de

pesquisas (BATISTA et al., 2006), havendo, atualmente, um crescente interesse em

produtos medicinais naturais (RAHAL et al., 2001).

A própolis é um complexo resinoso formado pela mistura de substâncias

retiradas de botões de flores de árvores ou cascas de árvores com substâncias do próprio

organismo da abelha. Sua composição química varia de acordo com o local da coleta e

com a vegetação nativa no qual o apiário está instalado (WOISKY & SALATINO,

1998; BURDOCK, 1998; FRANCO et al., 2000) e inclui flavonóides (como a

galangina, quercetina, pinocembrina e kaempferol), ácidos aromáticos e ésteres,

aldeídos e cetonas, terpenóides e fenilpropanóides (como os ácidos caféico e

clorogênico), esteróides, aminoácidos, polissacarídeos, hidrocarbonetos, ácidos graxos e

vários outros compostos em pequenas quantidades (HU et al., 2005; HAYACIBARA et

al., 2005; OZKUL et al., 2004; MATSUDA et al., 2002; ROCHA et al., 2003).

A utilização medicinal da própolis na cicatrização foi descrita primeiramente

pelos gregos, especialmente Aristóteles, Dioscorides e Hipócrates. Romanos, como

Plínio e Galeno, também descreveram esse uso medicinal (FUNARI et al., 2007). Na

África do Sul, na guerra ao final do século XIX, foi amplamente utilizada devido às

57


suas propriedades cicatrizantes e na Segunda Guerra Mundial foi empregada em várias

clínicas soviéticas (PEREIRA et al., 2002).

As propriedades de regeneração tecidual, como cicatrização de úlceras, feridas

hepatoproteção, possivelmente estão relacionadas com a atividade antioxidante da

própolis. Quando os radicais livres são produzidos, dificultam ou mesmo impedem que

ocorra a regeneração das células no local. A remoção dos mesmos pelos flavonóides da

própolis permitiria que o órgão ou tecido doente pudesse se regenerar normalmente

(MENEZES, 2005; LIMA, 2006).

Em estudos histológicos do processo de cicatrização, os resultados preliminares

indicaram uma aparente mudança na atividade celular nos tecidos que passaram por

tratamento com extrato etanólico de própolis (EEP) com aumento visual no número de

fibroblastos e colágeno em relação aos tecidos de grupos controle observados (LIMA,

2006).

Em estudo, no qual foi comparada a propriedade cicatrizante de um creme de

própolis com um creme de sulfadiazina de prata, foi demonstrado que os ferimentos

tratados com própolis apresentaram menos inflamação e mais rápida cicatrização do que

aqueles tratados com sulfadiazina de prata (GREGORY et al., 2002).

Este trabalho teve como objetivos realizar o perfil fitoquímico da própolis

vermelha, quantificar seu teor de flavonóides e avaliar in vivo a atividade cicatrizante do

extrato hidroalcoólico de própolis vermelha, veiculado num creme, no reparo de

ferimentos (queimaduras) com perda de substância tecidual e cicatrização por segunda

intenção em dorso de ratos.

58


Parte Experimental

Preparação do extrato

Foi preparado extrato etanólico de própolis vermelha (EEP) a 20% (m/v) de

amostra do apiário da região de Goiana-PE, Brasil. Realizou-se maceração durante 48 h

em solução hidroalcoólica a 70%. Após esse tempo, o extrato foi filtrado e

acondicionado em frasco de vidro âmbar.

Perfil fitoquímico através da Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

Alíquotas de 5µL dos EEPs a 70% foram submetidas à CCD (cromatoplacas de

gel de sílica Merck-Alemanha), empregando-se diversas fases móveis: A [AcOEt-

HCOOH-AcOH- H2O (100:11:11:27v/v)]; B [B-Benzene–AcOEt (97: 3 v/v)]; C

[AcOEt-HCOOH-AcOH- H2O (100:0,5:0,5:0,5v/v) ]; D [n-BuOH-Me2CO- Tampão

fosfato pH= 5,0 (40:50:10v/v)], E [Éter-tolueno-AcOH 10% (50:50:50 v/v)] e

reveladores adequados. Também foram utilizados padrões de flavonóides.

Teor de Flavonóides Totais

O teor de flavonóides foi determinado segundo metodologia descrita por Funari

& Ferro (2006) para doseamento de flavonóides em própolis. Inicialmente, uma curva-

padrão com quercetina di-hidratada, tomada como substância de referência, foi

construída. Alíquotas de 2 a 6 mL de solução etanólica de quercetina, a 50 µg/mL,

foram transferidas para balões volumétricos de 25 mL, contendo 1 mL de solução de

cloreto de alumínio a 5,0%. O volume final de cada balão foi ajustado com etanol.

Como branco do sistema, 1 mL da solução aquosa de cloreto de alumínio diluído em

balão de 25 mL foi utilizada. Decorridos 30 min, foi tomada a leitura de cada solução a

59


425 nm, em espectrofotômetro. Para a quantificação de flavonóides na amostra, foram

utilizados 2 mL de solução de própolis.

Obtenção do creme

Para veiculação do extrato, foi preparada uma emulsão a frio, conforme

formulação descrita na Tabela 1. O Permulen (TR-1) foi disperso em óleo mineral. Em

seguida, acrescentou-se o novemer (EC-1) até homogeneização. Em outro recipiente,

dissolveu-se o silense em água destilada e esta mistura foi adicionada a anterior.

Procedeu-se agitação até completa homogeneização. Por último, adicionaram-se os

conservantes, previamente dissolvidos em álcool, e o extrato de própolis.

Tabela 1. Formulação da emulsão a frio Componentes Quantidade (%)

Permulen (TR-1) 0,4 Novemer (EC-1) 2,0 Silsense (DW-18) 1,0 Óleo mineral 4,0 Nipagim 0,15 Nipazol 0,05 Extrato de própolis 15,0 Água destilada q.s.p. 100

Estudo de cicatrização in vivo

O estudo de cicatrização in vivo foi realizado com ratos Wistar (Ratus

norvegicus) machos adultos, com idade de 2-3 meses e peso de 180-250 g, os quais

foram mantidos durante o período experimental em gaiolas plásticas (polipropileno),

forradas com maravalha trocada a cada dois dias.

Os animais foram divididos em três grupos de cinco animais cada, conforme

descrito no Quadro 1. Após marcados e pesados, todos foram anestesiados com 0,2

mL, para cada 100 g de peso corpóreo, de uma mistura de 1:1 dos anestésicos ketamina

60


a 5% e xilazina a 2%. A administração da solução anestésica foi realizada por via

intraperitoneal, sendo utilizadas para isso agulhas de insulina e seringas de 1,0 mL.

Quadro 1. Grupos de animais e esquemas de tratamento para o estudo de cicatrização

Grupo I (controle negativo)

Animais tratados dermatologicamente com placebo (creme sem extrato de própolis)

Grupo II (controle positivo)

Animais tratados dermatologicamente com D-pantenol

Grupo III (teste)

Animais tratados dermatologicamente com creme à base de extrato de própolis

Em seguida, procedeu-se a tricotomia do dorso dos animais, os quais foram

postos em decúbito dorsal sobre mesa operatória com campo cirúrgico estéril, para a

realização da assepsia do dorso com álcool iodado a 0,3%.

Figura 1. Cauterização com ponta esférica de bisturi elétrico

Posteriormente, foram realizadas as cauterizações (queimaduras), utilizando-se,

para este fim, a ponta esférica de um bisturi elétrico, o qual proporcionou um dano

tecidual cutâneo (queimadura de 3º grau) de 0,3cm de diâmetro e uma profundidade que

atingiu os tecidos subcutâneos, porém preservando a fascia muscular da região,

conforme descrito por Martorelli (2006).

O tratamento dos animais foi realizado conforme determinado para cada grupo.

As aplicações (controle positivo, controle negativo ou amostra teste) foram realizadas

com uma posologia padrão, por via tópica, e realizada a cada 24 horas durante 14 dias.

No 3º, 7º e 14º dias de tratamento, os animais foram sedados para que fossem realizadas

61


fotografias da região do ferimento e para a análise macroscópica das fases de

cicatrização.

As avaliações macroscópicas das feridas foram realizadas em todos os animais,

sendo os critérios de avaliação previamente estabelecidos nos seguintes padrões:

presença de infecção, presença de halo hiperêmico, formação de crosta cicatricial,

presença de borda necrótica, fundo sangrante da ferida e cicatriz final (MARTORELLI,

2006).

Resultados e Discussão

Perfil Fitoquímico

O ensaio fitoquímico evidenciou a presença de mono e sesquiterpenos,

triterpenos e esteróides, açúcares redutores e flavonóides. Não foi detectada a presença

de alcalóides, iridóides, saponinas, cumarinas, derivados cinâmicos,

fenilpropanoglicosídeos, proantocianidinas condensadas e leucoantocianidinas.

Flavonóides como quercetina, kaempferol, luteolina e apigenina, também não foram

detectados, mesmo sendo reportados na literatura em outras própolis (PIETTA et al.,

2002; SALATINO et al., 2005).

Teor de flavonóides totais

O teor de flavonóides na amostra analisada foi de 2,300% (±0,005), sendo quase

cinco vezes maior do que mínimo especificado (0,5%) pelo Ministério da Agricultura,

na Instrução Normativa nº3 – ANEXO VI – Regulamento técnico para fixação de

identidade e qualidade de própolis (Diário Oficial da República Federativa do Brasil,

DOU de 19/01/2001).

62


Estudo de cicatrização in vivo

Os critérios utilizados para avaliação macroscópica foram a presença de

infecção, presença de halo hiperêmico, formação de crosta cicatricial, presença de borda

necrótica, fundo sangrante da ferida e cicatriz final (MARTORELLI, 2006).

Na fase inicial (3 dias), foi verificada a ação do produto na etapa de inflamação

aguda. Verificamos que, na fase intermediária, a reparação conjuntiva, através da

deposição extracelular de colágeno, ficou demonstrada a eficácia do creme à base de

extrato de própolis, dada a rapidez do processo cicatricial seguido da regressão do

processo inflamatório. Esta fase intermediária é que divide o processo de cicatrização,

com a reparação conjuntiva e inflamação crônica, que se caracteriza pelo infiltrado

mononuclear.

A última etapa permite avaliar a qualidade do tecido cicatricial, presença ou

ausência de fibrose e falha na recomposição do tecido. Observamos excelente qualidade

do tecido cicatricial na região dorsal dos animais tratados, quando comparados com o

grupo controle. Os Quadros 2, 3 e 4 trazem os resultados das avaliações macroscópicas

dos grupos controle negativo, controle positivo e teste realizados nos 3º, 7º e 14º de

tratamento.

Quadro 2. Resultados da avaliação macroscópica do grupo controle negativo Dias de Tratamento Aspectos

Macroscópicos 3 7 14 Infecção ausente ausente sem vestígios

Halo hiperêmico presente visível ausente Bordas necróticas ausente ausente ausente

Crosta espessa visível ausente Fundo sangrante vestígios não verificado ausente

Cicatriz final - - ausente

63


Quadro 3. Resultados da avaliação macroscópica do grupo controle positivo Dias de Tratamento Aspectos

Macroscópicos 3 7 14 Infecção ausente ausente ausente

Halo hiperêmico discreto ausente ausente Bordas necróticas não verificadas ausente não verificadas

Crosta vestígios ausente ausente Fundo sangrante espessa sem vestígios recuperado

Cicatriz final espessa normal pêlo recuperado Quadro 4. Resultados da avaliação macroscópica do grupo teste

Dias de Tratamento Aspectos Macroscópicos 3 7 14

Infecção ausente ausente ausente Halo hiperêmico vestígios ausente ausente Bordas necróticas ausente ausente ausente

Crosta ausente ausente ausente Fundo sangrante ausente ausente ausente

Cicatriz final não verificada sem vestígios pêlo recuperado

Os resultados obtidos do perfil fitoquímico, teor de flavonóides totais e ensaio de

cicatrização corroboram com os relatos descritos na literatura, nos quais relata-se que as

propriedades de regeneração tecidual, como cicatrização de úlceras e feridas,

possivelmente estão relacionadas aos flavonóides, os quais removem radicais livres

produzidos que são responsáveis por difilcutar ou mesmo impedir que ocorra a

regeneração das células no local. A remoção dos mesmos pelos flavonóides da própolis

permitiria que o órgão ou tecido doente pudesse se regenerar normalmente (MENEZES,

2005; LIMA, 2006).

Conclusão


triterpenos e esteróides, açúcares redutores e flavonóides, sendo estes presentes em

teores maiores do que o especificado pelo Ministério da Agricultura, na Instrução

Normativa nº 3 – ANEXO VI – Regulamento técnico para fixação de identidade e

64


qualidade de própolis (Diário Oficial da República Federativa do Brasil, DOU de

19/01/2001).

A partir destes ensaios pré-clínicos de atividade cicatrizante, evidenciou-se que o

extrato de própolis vermelha de Pernambuco desenvolveu atividade cicatrizante do

ponto de vista de avaliação dos aspectos clínicos macroscópicos em relação ao padrão

D-pantenol.

Referências bibliográficas

1. AQUINO, J.U.; CZECZKO, N.G.; MALAFAIA, O.; DIETZ, U.A.; RIBAS FILHO,

J.M.; NASSIF, P.A.N.; ARAÚJO, U.; BORONCELLO, J.; SILVA SANTOS, M.F.;

SANTOS, E.A.A. Avaliação fitoterápica de Jatropha gossepiifolia L. na

cicatrização de suturas na parede abdominal ventral de ratos. Acta Cirúrgica

Brasileira, v.21, supl.2, p.61-66, 2006.

2. BALBINO, C.A.; PEREIRA, L.M.; CURI, R. Mecanismos envolvidos na

cicatrização: uma revisão. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v.41, n.1,

p.27-51, 2005.

3. BATISTA, C.P.; TORRES, O.J.M.; MATIAS, J.E.F.; MOREIRA, A.T.R.;

COLMAN, D.; LIMA, J.H.F.; MACRI, M.M.; RAUEN JÚNIOR, R.J.; FERREIRA,

L.M.; FREITAS, A.C.T. Efeito do extrato aquoso de Orbignya phaletara (babaçu)

na cicatrização do estômago em ratos: estudo morfológico e tensiométrico. Acta

Cirúrgica Brasileira, v.21, supl.3, p.26-32, 2006.

4. BIONDO-SIMÕES, M.L.P.; ALCANTARA, E.M.; DALLAGNOL, J.C.;

YOSHIZUMI, K.O.; TORRES, L.F.B.; BORSATO, K.S. Cicatrização de feridas:

estudo comparativo em ratos hipertensos não tratados e tratados com inibidor da

65


enzima da enzima conversora da angiotensina. Rev. Col Brás Cir., v.33, n.2, 2006

(periódico da Internet)

5. BURDOCK, G.A. Review of the biological properties and toxicity of bee propolis

(propolis). Food Chem Toxicol., v.36, p.347-363, 1998

6. FRANCO, S.L.; BRUSCHI, M.L.; MOURA, L.P.P.; BUENO, J.H.F. Avaliação

farmacognóstica de própolis da região de Maringá. Rev Bras Farmacogn., v.9, p.1-

10, 2000.

7. FUNARI, C.S. & FERRO, V.O. Análise de própolis. Ciênc. Tecnol. Aliment., v.26,

171-178, 2006.

8. FUNARI, C.S.; FERRO, V.O.; MATHOR, M.B. Analysis of propolis from

Baccharis dracunculifolia DC. (Compositae) and its effects on mouse fibroblasts.

Journal Ethnopharmacology, v.111, p.206-212, 2007.

9. GOMES, C.S.; CAMPOS, A.C.L.; TORRES, O.J.M.; VASCONCELOS, P.R.L.;

MOREIRA, A.T.R.; TENÓRIO, S.B.; TÂMBORA, E.M. SAKATA, K.; MORAES,

H.; FERRER, A.L.S. Efeito do extrato de Passiflora edulis na cicatrização da parede

abdominal de ratos: estudo morfológico e tensiométrico, v.21, supl.2, p.9-26, 2006.

10. GREGORY, S.R.; PICCOLO, N.; PICCOLO, M.T.; PICCOLO, M.S.; HEGGERS

J.P. Comparison of propolis skin cream to silver sulfadiazine: a naturopathic

alternative to antibiotics in treatment of minor burns. J Alter Complement Med, v.8,

p.77-83, 2002.

11. HAYACIBARA, M.F.; KOO, H.; ROSALEN, P.L.; DUARTE, S.; FRANCO, E.M.;

BROWEN, W.H.; IKEGAKI, M.; CURY, J.A. In vitro and vivo effects of isolated

fractions of Brazilian propolis on caries development. J Ethnopharmacol, v.101,

p.110-115, 2005.

66


12. HU, F.; HEPBURN, H.R.; LI, Y.; CHEN, M.; RADLOFF, S.E.; DAYA, S. Effects

of ethanol and water extracts of propolis (bee glue) on acute inflammatory animal

models. J Ethnopharmacol, v.100, p.276-283, 2005.

13. LIMA, M.G. A produção de própolis no Brasil. São João da Boa Vista: São

Sebastião Editora e Gráfica, 2006.

14. MANDELBAUM, S.H.; DI SANTIS, E.P.; MANDELBAUM, M.H.S. Cicatrização:

conceitos atuais e recursos auxiliares – Parte I. An. Bras. Dermatol., v.78, n.4,

p.393-410, 2003.

15. MARTINS, P.S.; ALVES, A.L.G.; HUSSNI, C.A.; SEQUEIRA, J.L.; NICOLETTI,

J.L.M.; TOMASSIAN, A. Comparação entre fitoterápicos de uso tópico na

cicatrização de pele em eqüinos. Archives of Veterinary Science, v.8, n.2, p.1-7,

2003.

16. MARTORELLI, S.B.F. Efeito antiinflamatório e cicatrizante do extrato

hidroalcoólico de Schinus terebinthifolius Raddi (Aroeira) a 30% em orobase -

Estudo in vitro. Tese de Doutorado, UFPB, João Pessoa, 2006.

17. MATSUDA, A.H.; MACHADO, L.B.; MASTRO, N.L. Thermal analysis applied to

irradiated propolis. Radiat Phys Chem, v.63, p.353-355, 2002

18. MENEZES, H. Própolis: uma revisão dos recentes estudos de suas propriedades

farmacológicas. Arq. Inst. Biol., v.72, n.3, p.407-411, 2005.

19. Ministério da Agricultura, 2001, Instrução Normativa nº3 – ANEXO VI –

Regulamento técnico para fixação de identidade e qualidade de própolis. Diário

Oficial da República Federativa do Brasil, DOU de 19/01/2001.

20. OZKUL, Y.; SILICI, S.; ERÕGLU, E. The anticarcinogenic effect of propolis in

human lymphocytes culture. Phytomedicine, v.12, p.742-747, 2004.

67


21. PEREIRA, A.S.; SEIXAS, F.R.M.S.; AQUINO NETO, F.R. Própolis: 100 anos de

pesquisa e suas perspectivas futuras. Quim Nova, v.25, p.321-326, 2002.

22. RAHAL, S.C.; ROCHA, N.S.; BLESSA, E.P.; IWABE, S.; CROCCI, A.J. Pomada

orgânica natural ou salina isotônica no tratamento de feridas limpas induzidas em

ratos, v.31, n.6, p.1007-1011, 2001.

23. ROCHA, L.; DOS SANTOS, L.R.; ARCENIO, F.; CARVALHO, E.S.; LÚCIO,

E.M.R.A.; ARAÚJO, G.L.; TEIXEIRA, L.A.; SHARAPIN, N. Otimização do

processo de extração de própolis através da verificação da atividade antimicrobiana.

Rev Bras Farmacogn, v.13, p.71-74, 2003.

24. WOISKY, R.G.; SALATINO, A. Analysis of propolis: some parameters and

procedures for chemical quality control. J Apicultural Res, v.37, p.99-105, 1998.

68


CAPÍTULO 5

DESENVOLVIMENTO DE GEL À BASE DE EXTRATO DE

PRÓPOLIS VERMELHA E VALIDAÇÃO DO MÉTODO

ANALÍTICO PARA DOSEAMENTO DE FLAVONÓIDES

(Artigo a ser submetido à RBCF)

69


Desenvolvimento de gel à base de extrato de própolis vermelha e

validação do método analítico para doseamento de flavonóides

Alexandre Bezerra Galindo1, Diego Cavalcanti Perrelli1, Jeckson Luiz da Silva1,

Karina Perrelli Randau2, Pedro José Rolim Neto1∗




Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brasil.

RESUMO

Os géis hidrofílicos têm sido muito usados em produtos cosméticos e como base

dermatológica. A própolis tem sido objeto de estudos farmacológicos devido às suas

propriedades antibacteriana, antiinflamatória, antioxidante, cicatrizante, entre outras. O

presente trabalho teve por objetivo desenvolver formulações de géis tópicos à base de

extratos hidroalcoólicos de própolis vermelha, da região de Goiana-PE, Brasil, e co-

validar o método descrito por Funari & Ferro (2006), para realizar o doseamento de

flavonóides na forma farmacêutica. Quanto à validação do método analítico, esta

proporcionou resultados confiáveis para o doseamento de flavonóides totais na forma

farmacêutica, sendo linear, exato e preciso. As formulações obtidas foram avaliadas

após sua preparação e apresentaram parâmetros físico-químicos compatíveis com o

especificado.

Unitermos: própolis vermelha, gel, doseamento de flavonóides


70


INTRODUÇÃO

Os géis hidrofílicos têm sido muito usados em produtos cosméticos e como base

dermatológica, pois apresentam fácil espalhamento, não são gordurosos e podem

veicular princípios ativos hidrossolúveis e lipossomas. Dentre as matérias-primas usadas

na preparação de géis, tem-se destacado os ácidos carboxivinílicos (Carbopois®) e os

ácidos poliacrílicos (Pemulen®) (Corrêa et al., 2005).

Própolis é uma mistura complexa, formada por material resinoso e balsâmico


desses, na colméia, as abelhas adicionam secreções salivares e enzimas (Pereira et al.,

2002; Franco et al., 2000). Sua composição é bastante variada e já foram identificados

mais de 300 constituintes (Cunha et al., 2004; Silici & Kutluca, 2005), dentre eles

podemos citar, ácidos graxos e fenólicos, flavonóides (flavonas, flavanonas, flavonóis),

terpenos, esteróides, álcoois e aldeídos aromáticos, sesquiterpenos, entre outros

(Marcucci et al., 2001).



antioxidante, antitumoral, imunomodulatória, entre outras (Bankova, 2005; Kosalec et

al., 2005; Alencar et al., 2005). Vários autores relatam que algumas das propriedades

biológicas, particularmente a atividade antioxidante, em extratos etanólicos de própolis,

se deve em parte ao seu alto conteúdo de flavonóides (Adelmann, 2005).

O método utilizado para a quantificação de flavonóides totais baseia-se na

propriedade do cátion alumínio de formar complexos estáveis com flavonóides,

ocorrendo, na análise espectrofotométrica, um deslocamento para maiores

comprimentos de onda e uma intensificação de suas absorbâncias. Desta forma, é

possível determinar a quantidade de flavonóides na amostra, evitando-se a interferência

71


de outras classes de substâncias fenólicas, principalmente a dos ácidos fenólicos (Funari

& Ferro, 2006).

O presente trabalho teve por objetivo desenvolver formulações de géis tópicos à

base de extratos hidroalcoólicos de própolis vermelha da região de Goiana-PE, Brasil, e

co-validar o método descrito por Funari & Ferro (2006) de doseamento de flavonóides

em própolis, para realizar o doseamento de flavonóides na forma farmacêutica.

MATERIAIS E MÉTODOS

Extrato de própolis

Foi utilizado extrato hidroalcoólico de própolis a 20% (m/v) com 2,3% de

flavonóides em equivalentes de quercetina, o qual foi preparado a partir de amostras de

própolis vermelha da região de Goiana - PE, Brasil.

Obtenção dos géis

Para o desenvolvimento dos géis à base de extrato de própolis vermelha, foi

empregada uma planificação quali-quantitativa de excipientes, seguindo as formulações

descrias na Tabela I.

TABELA I - Formulações dos lotes de bancada desenvolvidos Lotes de bancada Componentes L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8

Carbopol 996 0,5% 0,5% 0,5% 0,5% 0,8% 0,8% 0,8% 0,8% Nipagim 0,1% 0,1% - - 0,1% 0,1% - - Nipazol 0,02% 0,02% - - 0,02% 0,02% - -

Sorbato de potássio - - 0,1% 0,1% - - 0,1% 0,1%

Extrato de própolis 10% 15% 10% 15% 10% 15% 10% 15%

Trietanolamina q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. Água destilada

q.s.p. 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

72


Os géis que continham os conservantes nipagim e nipazol foram obtidos pela

adição destes, previamente dissolvidos em álcool, à água, sob agitação constante. Em

seguida, adicionou-se o carbopol, pouco a pouco, até completa homogeneização. Logo

após, fez-se a adição da trietanolamina em quantidade suficiente para se obter pH entre

6,0-6,5. Por último, acrescentou-se a quantidade pré-estabelecida de extrato de própolis,

até obter um produto homogêneo. O gel foi, então, acondicionado em recipiente plástico

hermeticamente fechado.

Para os géis que continham sorbato de potássio em sua fórmula, procedeu-se

primeiramente a adição do carbopol à água, sob agitação, para então acrescentar o

conservante. Em seguida, realizou-se o mesmo procedimento adotado para as

formulações anteriores.

Após a incorporação do extrato de própolis, quando necessário, fez-se a adição

de mais trietanolamina às preparações, de forma que estas apresentassem pH ente 6,0-

6,5 (levemente ácido).

Co-validação do método analítico para doseamento de flavonóides

O teor de flavonóides nos géis foi determinado segundo metodologia descrita

por Funari & Ferro (2006) para doseamento de flavonóides em própolis. Realizou-se

uma co-validação, avaliando-se os parâmetros de linearidade, exatidão e precisão

(repetitividade).

Preparação das amostras

Alíquotas do gel referente à formulação L3 foram diluídas em etanol de modo a

obter-se soluções nas concentrações de 4.8, 7.2, 9.6, 12 e 14.4 μg/mL de flavonóides em

equivalentes de quercetina. A solução de concentração de 9,6 μg/mL foi definida como

73


100%. Ás soluções obtidas, foi adicionado 1 mL de cloreto de alumínio 5% e após 30

min realizaram-se as leituras em espectrofotômetro a 425 nm.Empregaram-se como

branco, soluções contendo placebo (gel sem extrato de própolis).

Linearidade

A linearidade foi avaliada através da análise de regressão linear pelo método dos

mínimos quadrados dos pontos médios de três curvas autênticas, utilizando cinco pontos

nas concentrações de 4.8, 7.2, 9.6, 12 e 14,4 μg/mL de flavonóides em equivalentes de

quercetina. O coeficiente de correlação obtido foi a partir das três curvas.

Exatidão

A exatidão do método foi avaliada em três níveis de concentração: 50, 100 e

150%, os quais correspondem às concentrações de 4.8, 9.6 e 14.4 µg/mL. Os testes

foram realizados em triplicata e avaliados por teste t de Student, comparando-se os

resultados em relação ao valor teórico definido para cada concentração analisada.

Precisão

A precisão foi verificada através da repetitividade, determinada pela análise de

seis amostras individuais com concentração de 9,6 µg/mL e expressa pelo coeficiente de

variação (CV).

Controle de qualidade dos géis

74


Os géis obtidos foram analisados quanto as suas características macroscópicas

(cor, aspecto), pH e viscosidade.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Linearidade

Os resultados dos pontos das três curvas de linearidade foram plotados em um

gráfico (Figura 1) e estão apresentados na Tabela II. A concentração de flavonóides em

μg/mL de equivalentes de quercetina versos a absorbância, através do método dos

mínimos quadrados, origina a equação da reta: y = 0,0306x - 0,006 e o coeficiente de

correlação R2 = 0,9969, valor este que comprova a linearidade do método, no intervalo

de variação estudado.

TABELA II - Resultado da linearidade Absorbâncias/Determinações Concentração

(μg/mL) 1 2 3 Médias Desvio padrão CV (%)

4,8 0,149 0,142 0,130 0,143 0,0051 3,58 7,2 0,207 0,217 0,210 0,211 0,0051 2,43 9,6 0,283 0,282 0,287 0,284 0,0026 0,93 12,0 0,370 0,371 0,375 0,372 0,0026 0,71 14,4 0,425 0,435 0,430 0,430 0,0055 1,17

y = 0,0306x - 0,006R2 = 0,9969

00,05

0,10,15

0,20,25

0,30,35

0,40,45

0,5

0 2 4 6 8 10 12 14 16

[ ] de flavonóides µg/mL

Abs

orbâ

ncia

FIGURA 1 - Curva de regressão linear obtida a partir da média de três curvas

75


Exatidão

A exatidão do método foi comprovada pelo estudo de três concentrações

diferentes, 4.8, 9.6 e 14.4 µg/mL (50%, 100%, 150%). Os dados estão representados na

Tabela III. O tratamento estatístico aplicado foi o teste t-Student o qual demonstrou que

o t-calculado foi menor que o t-tabelado comprovando que não houve diferença

estatisticamente significativa entre as médias das três concentrações analisadas com

95% de confiança.

Tabela III - Resultados da exatidão, comprovada pelo teste t-Student Concentração de

flavonóides na amostra (%)

Quantidade determinada (%) t calculado t tabelado

50 50,47±1,81 0,45 4,30 100 101,07±0,94 1,96 4,30 150 154,92±1,96 2,94 4,30

Precisão

Nos ensaios de repetitividade foram realizadas 06 determinações a 9,6 μg/mL,

referente a 100% da concentração. Observando-se os resultados (Tabela IV), podemos

concluir que o método tem uma boa repetitividade, visto que, o coeficiente de variação

apresenta-se inferior ao limite especificado (5,0%) pela Resolução RE nº 899 (Brasil,

2003).

TABELA IV - Resultados da repetitividade Absorbâncias/Determinações

1 2 3 4 5 6 Média Desvio padrão CV %

0,289 0,284 0,287 0,282 0,275 0,276 0,282 0,0057 2,02

Controle de qualidade dos géis

Dos oito lotes de bancada obtidos, apenas quatro (L3, L4, L7 e L8) foram

avaliados quanto as suas características físico-químicas (Tabela V), visto que, não foi

possível realizar a quantificação de flavonóides nos géis que continham nipagim e

76


nipazol em sua formulação. Tal fato deve-se à interferência que estes conservantes

promovem na leitura espectrofotométrica por absorverem em comprimentos de onda

próximos ao do método empregado para o doseamento dos flavonóides (425 nm).

TABELA V - Controle físico-químico dos géis obtidos Resultados / Formulações Parâmetros Especificações 3 4 7 8

Características macroscópicas

Gel opaco, de cor vermelha, homogêneo

Gel opaco de cor

vermelha-marrom,

homogêneo

Gel opaco de cor

vermelha-marrom,

homogêneo

Gel opaco de cor

vermelha-marrom,

homogêneo

Gel opaco de cor

vermelha-marrom,

homogêneopH 6,0 - 6,5 6,01 6,38 6,06 6,23

Viscosidade (cP)*

200000-400000 223000 180000 378000 355000

*viscosidade determinada a 1 rpm (spindle S07), viscosímetro Brookfield VD-I.

CONCLUSÃO

Através da planificação quali-quantitativa, pôde-se observar a interferência que

conservantes do grupo dos parabenos promovem no método empregado para a

quantificação de flavonóides. As demais formulações obtidas, e que foram avaliadas

após sua preparação, apresentaram parâmetros físico-químicos compatíveis com o

especificado.

Quanto à validação do método analítico, este proporcionou resultados confiáveis

para o doseamento de flavonóides totais na forma farmacêutica, sendo linear, exato e

preciso. A especificidade do método foi garantida pelo uso de soluções contendo

placebo como branco para o doseamento.

ABSTRACT

Desenvolvimento de gel à base de extrato de própolis vermelha e validação do

método analítico para doseamento de flavonóides

77


The hydrophilic gel have been very used in cosmetic products and as dermatological

base. The propolis have been object of pharmacologyc studies had to its properties

antimicrobial, antiinflammatory, antioxidant, cicatrizing, among others. The present

work had for objective to develop formulations of topical gels to the extract base of

propolis red, from region of Goiana-PE, Brazil, and validation the described method for

Funari & Ferro (2006), to the doses of flavonoids into pharmaceutical form. How much

to the validation of the analytical method, this provided resulted trustworthy for the

doses of flavonoids total in the pharmaceutical form, being linear, exact and accurate.

The gotten formulations had been evaluated its preparation after and had presented

parameters compatible physicist-chemistries with the specified one.

Uniterms: red própolis, flavonoids assay, gel

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ADELMANN, J.. Própolis: Variabilidade composicional, correlação com a flora e

bioatividade antimicrobiana/antioxidante. Dissertação de Mestrado, UFPR, Curitiba,

2005.

ALENCAR, S.M.; AGUIAR, C.L.; GUZMÁN, J.P.; PARK Y.K.. Composição química

de Baccharis dracunculifolia. Ciência Rural, v.35, p.909-915, 2005.

BANKOVA, V.. Chemical diversity of propolis and the problem of standardization. J

Ethnopharmacol, v.100, p.114-117, 2005.

BRASIL, Resolução no 899, de 29 de maio de 2003 (DOU 02/06/2003) – Guia para a

Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos – Agência Nacional de Vigilância

Sanitária – ANVISA.

78


CORRÊA, N.M.; CAMARGO JR, G.R.; IGNÁCIO, R.F.; LEONARDI, G.R..

Avaliação do comportamento reológico de diferentes géis hidrofílicos. Brazilian

Journal Pharmaceutical Sciences, v.41, n.1, jan./mar., 2005.

CUNHA, I.B.S.; SAWAYA, A.C.H.F.; CAETANO, F.M.; SHIMIZU, M.T.;

MARCICCI, M.C.; DREZZA, F.T.; POVIA, G.S.; CARVALHO, P.O.. Factors that

influence the yield and composition fo Brazilian própolis extracts. J. Braz. Chem. Soc.,

v.15, p.964-970, 2004.

FRANCO, S.L.; BRUSCH, M.L.; MOURA, L.P.P.; BUENO, J.H.P.. Avaliação

Farmacognóstica da própolis da região de Maringá. Rev Bras Farmacognosia, v.9, p.1-

10, 2000.

FUNARI, C.S. & FERRO, V.O. Análise de própolis. Ciênc. Tecnol. Aliment., v.26,

171-178, 2006.

KOSALEC, I.; PEPELJNJAK, S.; BAKMAZ, M.; VLADIMIR-KNEZEVIC, S..

Flavonoid analysis and antimicrobial activity of commercially available propolis

product. Acta Pharm, v.55, p.423-430, 2005.

MARCUCCI, M.C.; FERRERES, F.; GARCIA-VIGUERA, C.; BANKOVA, V.S.; DE

CASTRO, S.L.; DANTAS, A.P.; VALENTE, P.H.M.; PAULINO, N.. Phenolic

compounds from Brazilian própolis with pharmacological activities. J.

Ethnopharmacol., v.74, p.105-112, 2001.

PEREIRA, A.S.; SEIXAS, F.R.M.S.; AQUINO NETO, F.R.. Própolis: 100 anos de

pesquisa e suas perspectivas futuras. Quim Nova v.25, p.321-326, 2002.

SILICI, S.; KUTLUCA, S.. Chemical composition and antibacterial activity of própolis

colleted by three different races of honeybees in the same region. J. Ethnopharmacol.,

v.99, p.69-73, 2005.

79


CONCLUSÕES E

PERSPECTIVAS

80


1. Conclusões • Na composição química dos compostos voláteis da própolis vermelha, foram

identificados 34 constituintes, sendo monoterpenos e monoterpenóides,

sesquiterpenos e sesquiterpenóides, fenilpropanóides, aldeídos, cetonas e n-alcanos.

Destacaram-se como constituintes majoritários o trans-anetol, α-copaeno e o metil

cis-isoeugenol.

• No perfil fitoquímico por cromatografia em camada delgada (CCD), os constituintes

fenólicos (do tipo flavónoides, antraquinonas e fenóis) foram identificados como

majoritários.

• O ensaio de letalidade em Artemia salina, que demonstrou DL50 de 18,9 µg/mL,

sugeriu uma possível atividade antitumoral.

• Os resultados demonstraram que a própolis vermelha analisada possui atividade

antioxidante, comprovada pelos diferentes métodos, e que tal atividade está

relacionada ao seu teor de compostos fenólicos, bem como à época de sua coleta.

• A própolis em estudo apresentou bons resultados no estudo de cicatrização por

segunda intenção em dorso de ratos, quando comparada ao padrão D-pantenol.

• Através da planificação quali-quantitativa, pôde-se observar a interferência que

conservantes do grupo dos parabenos promovem no método empregado para a

quantificação de flavonóides. As demais formulações obtidas, e que foram avaliadas

após sua preparação, apresentaram parâmetros físico-químicos compatíveis com o

desejado.

• Quanto à validação do método analítico, este proporcionou resultados confiáveis

para o doseamento de flavonóides totais na forma farmacêutica, sendo linear, exato

e preciso.

81


2. Perspectivas

Este estudo aponta a necessidade de dar continuidade a pesquisas que envolvam

aspectos tanto químicos como biológicos da própolis vermelha, além daqueles que

envolvem o desenvolvimento de formas farmacêuticas à base do extrato.

Como algumas perspectivas, temos:

• Isolamento e identificação de compostos químicos da própolis vermelha, os quais

poderão ser empregados como marcadores;

• Estudo de outras atividades biológicas, como, por exemplo, antiinflamatória,

imunomodulatória, entre outras, bem como realizar estudo de cicatrização baseado

nos aspectos histológicos (microscópicos) da regeneração tecidual;

• Realizar estudo de estabilidade acelerada dos géis obtidos;

• Desenvolver outras formas farmacêuticas à base de extrato de própolis vermelha

com base nas propriedades biológicas já observadas ou em outras que venham a ser

demonstradas.

82



83



• ALENCAR, S.M.; AGUIAR, C.L.; GUZMÁN, J.P.; PARK, Y.K. Composição

química de Baccharis dracunculifolia. Ciência Rural, v.35, p.909-915, 2005.

• ARVOUET-GRAND, A.; VENNAT, B.; POURRAT, A.; LEGRET, P.

Standardization of propolis extract and identification of principal constituents. J

Pharm Belg, v.49, p.462-468, 1994.

• Bankova, V. Chemical diversity of propolis and the problem of standardization. J

Ethnopharmacol, v.100, p.114-117, 2005.

• BURDOCK, G.A. Review of the biological properties and toxicity of bee propolis

(propolis). Food Chem Toxicol, v.36, p.347-363, 1998.

• FRANCO, S.L.; BRUSCH, M.L.; MOURA, L.P.P.; BUENO, J.H.P. Avaliação

Farmacognóstica da própolis da região de Maringá. Rev Bras Farmacogn, v.9, p.1-

10, 2000.

• KOSALEC, I.; PEPELJNJAK, S.; BAKMAZ, M.; VLADIMIR-KNEZEVIC, S.

Flavonoid analysis and antimicrobial activity of commercially available propolis

product. Acta Pharm, v.55, p.423-430, 2005.

• KUJUMGIEV, A.; TSVETKOVA, I.; SERKEDJIEVA, Y.; BANKOVA, V.;

CHRISTOV, R.; POPOV, S. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of

propolis of different geographic origin. J Ethnopharmacol, v.64, p.235-240, 1999.

• MARQUELE, F.D.; OLIVEIRA, A.R.M.; BONATO, P.S.; LARA, M.G.;

FONSECA, M.J.V. Propolis extract release evaluation from topical formulations by

chemiluminescence and HPLC. J Pharm Biomed Anal, v.41, p.461-468, 2006.

84


• PARK, Y.K.; ALENCAR, S.M.; SCAMPARINE, A.R.P.; AGUIAR, C.L.. Própolis

produzida no sul do Brasil, Argentina e Uruguai: Evidências fitoquímicas de sua

origem vegetal. Ciência Rural, v.2, p. 997-1003, 2002.

• PEREIRA, A.S.; SEIXAS, F.R.M.S.; AQUINO NETO, F.R. Própolis: 100 anos de

pesquisa e suas perspectivas futuras. Quim Nova, v.25, p.321-326, 2002.

• ROCHA, L.; DOS SANTOS, L.R.; ARCENIO, F.; CARVALHO, E.S.; ARAÚJO,

G.L.; TEIXEIRA, L.A.; SHARAPIN, N. Otimização do processo de extração de

própolis através da verificação da atividade antimicrobiana. Rev Bras Farmacogn,

v.13, p.71-74, 2003.

85


ANEXOS

86

----- Mensagem encaminhada de José Maria Barbosa Filho <[email protected]> ----- Data: Wed, 7 Feb 2007 05:48:29 -0300 De: José Maria Barbosa Filho <[email protected]> Reponder para: José Maria Barbosa Filho <[email protected]> Assunto: Revista Brasileira de Farmacognosia Para: [email protected] Prezado Prof. Dr. Pedro Rolim, Informo que foi dada entrada para publicação na Revista Brasileira de Farmacognosia o manuscrito intitulado "Própolis: Química e Farmacologia", de autoria de S.R. Lustosa, A.B. Galindo, K.P. Randau e P.J. Rolim Neto. Em breve lhe enviaremos o número do protocolo para acompanhamento de todo o processo. De acordo com as normas da revista este trabalho será encaminhado a dois avaliadores. Assim que tivermos os resultados da referagem, lhe comunicaremos. Atenciosamente, José M. Barbosa Filho Editor Chefe ----- Finalizar mensagem encaminhada -----

http://br.f624.mail.yahoo.com/ym/[email protected]&YY=6730&y5beta=yes&y5beta=yes&order=down&sort=date&pos=0&view=a&head=b




Artigo submetido à Revista Química Nova

PADRONIZAÇÃO DA PRÓPOLIS VERMELHA E VALIDAÇÃO

DE MÉTODO ANALÍTICO

Sarah R. Lustosa, Alexandre B. Galindo, Diego C. Perrelli, Karina P. Randau, Pedro

J. Rolim Neto∗

Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco,

Recife, PE, Brasil

Zênia M. M. Lavra, Severino Granjeiro Júnior

LAFEPE – Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco

Livio C. C. Nunes

Núcleo de Tecnologia Farmacêutica - NTF, Universidade Federal do Piauí, Teresina, PI,

Brasil


STANDARDIZATION OF RED PROPOLIS AND VALIDATION OF

ANALYTICAL METHOD

ABSTRACT: Red propolis colleted from Goiana, Pernambuco, Brazil, was

standardized following the requirements of identity and quality of the Ministery of

Agriculture. The seasonal influence of the months February, June and October 2006 was

avaliated and flavonoids assay method was validated. It was observed that all the

samples collected showed good quality, with prominence to the sample collected in

October that was found to have a high concentration of flavonoids and total phenols,

and lesser wax content. The method was linear, accurate and precise.

Keywords: Propolis, standardization, flavonoids

INTRODUÇÃO

O homem tem utilizado muitos produtos naturais ao longo da história. Dentre

eles, destaca-se a própolis, um material resinoso produzido pelas abelhas e que é

empregado na construção e reparo das colméias1,2.

A composição básica da própolis é 55% de resinas e bálsamo, 30% de ceras,

10% de óleos essenciais e 5% de pólen e, em diferentes amostras, já foram identificados

mais de 300 constituintes3,4, dentre eles podemos citar ácidos graxos e fenólicos,

flavonóides (flavonas, flavanonas, flavonóis), terpenos, β-esteróides, álcoois e aldeídos

aromáticos, sesquiterpenos, entre outros5. A proporção dessas substâncias varia e

depende do local e da época da coleta6 e a elas, especialmente aos flavonóides, são

atribuídas algumas propriedades farmacológicas da própolis, como cicatrizante7,

antioxidante8, antiinflamatória9, antimicrobiana10, entre outras.

No entanto, para ser utilizada na terapêutica, a própolis deve ser padronizada

quimicamente e os procedimentos analíticos de controle químico e microbiológico

adotados devem ser descritos e validados, o que irá garantir sua qualidade, segurança e

eficácia11,12. A validação, como parte integrante da qualidade, tem por objetivo garantir,

por meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações

analíticas, assegurando confiabilidade aos resultados13.

O presente trabalho teve por objetivo padronizar o extrato da própolis vermelha,

utilizando como parâmetro as especificações estabelecidas no Regulamento de

Identidade e Qualidade de Extrato de Própolis, do Ministério da Agricultura, Brasil14;

avaliar as possíveis variações devido à sazonalidade e validar o método de doseamento

para flavonóides totais. A própolis utilizada é produzida por abelhas da espécie Apis

mellifera, as quais utilizam para este fim resina coletada da espécie Dalbergia

ecastophyllum (L.) Taub.

PARTE EXPERIMENTAL

Materiais

Reagentes

Álcool etílico absoluto (Cinética e Nuclear, Brasil), éter de petróleo, acetato de

etila, ácido fórmico, ácido acético, benzeno, acetona, tolueno, éter, butanol (todos da

Vetec, Brasil).

Padrões de Trabalho

Quercetina Dihidratada (Sigma, Alemanha, L. 39H0598), Ácido tânico (Merck,

Alemanha, 31761, USP). Cr, Zn, Co, Cd, Cu e Ni (Fluka Chemie GmbH, Suiça) e o

Mn e Pb (Sigma-Aldrich, USA).

Própolis

Para o estudo, foram utilizadas amostras de própolis vermelha de apiário da

região de Goiana, PE, Brasil, coletadas nos meses de fevereiro, junho e outubro de

2006. Foram preparados extratos etanólicos de própolis (EEP) a 20% (m/v), das três

amostras coletadas, por maceração durante 48 h, em soluções hidroalcoólicas a 70, 80 e

90%. Após esse tempo, os extratos foram filtrados e acondicionados em frasco de vidro

âmbar.

Métodos

Analise fitoquímica através da Cromatografia em Camada Delgada (CCD):

Alíquotas de 5 µl dos EEP a 70, 80 e 90%, dos três meses de coleta (fevereiro, junho e

outubro), foram submetidas à CCD (cromatoplacas de gel de sílica Merck-Alemanha),

empregando-se diversas fases móveis e reveladores adequados15, de acordo com o grupo

de metabólitos secundários: Alcaloides, Mono e sesquiterpenos, Iridóides, Saponinas,

Cumarinas e Fenilpropanoglicosídeos16, Triterpenóides e Esteróides17, Açúcares

redutores18, Derivados cinâmicos e Flavonóides16,19, Proantocianidinas condensadas e

Leucoantocianidinas20.

Características Organolépticas: Foram avaliadas as características aroma, cor e sabor.

Perda por Dessecação: Determinada por termogravimetria segundo a Farmacopéia

Brasileira IV21. Esta análise foi realizada em triplicata e os resultados expressos em

porcentagem (% p/p).

Teor de Cinzas: Método utilizado segundo a Farmacopéia Brasileira IV21 e realizada

em triplicata. Os resultados foram expressos em porcentagem.

Teor de Cera: Pesou-se 1,0 g de própolis e colocou-se em erlenmeyers previamente

tarados. Submeteu-se à extração com três frações de 10 mL de éter de petróleo, sob

aquecimento. A própolis foi desprezada e a fração etérea evaporada. Os erlenmeyers

foram pesados e o teor de ceras calculado pela diferença entre o peso final e inicial. A

análise foi realizada em triplicada e expressa em porcentagem de ceras.

Resíduo Insolúvel em Etanol: Pesou-se 1,0 g de própolis e submeteu-se à extração

com três frações de 30 mL de etanol, filtrando após cada extração, utilizando papel de

filtro previamente tarado. Desprezou-se a fração etanólica e secou-se o resíduo em

estufa a 105º por 10 minutos. O teor de resíduo foi calculado pela diferença entre o peso

final e inicial. A análise foi realizada em duplicata e expressa em porcentagem de

resíduo insolúvel em etanol.

Determinação de Metais Pesados: Pesou-se aproximadamente 1,0 g de própolis bruta

(In natura) fez-se a digestão por 10 mL de HNO3 concentrado em bloco digestor aberto

por 10 minutos a 95±5°C. As amostras foram resfriadas e após a adição de mais 5 mL

de HNO3, novamente levadas ao bloco digestor para aquecimento a 95±5°C por mais 2

horas. Adicionou-se 5 mL de HCl e 10 mL de água destilada e foram aquecidas até que

terminasse o desprendimento de vapores de NO2 (vapor amarelado). O líquido

resultante foi filtrado, transferido para balão de 100 mL, completado o volume com

água destilada e guardados em geladeira em frasco plástico opaco. Alíquotas de 5 μL

das amostras foram injetadas em espectro de absorção atômica (Varian SPECTRA AA

220 FS), usando uma mistura de ar/acetileno tendo um fluxo de 13,5 L/min para o ar e

2,0 L/min do acetileno, tempo de leitura de 5 segundos, comprimento de onda de 228,8

nm. A curva de calibração foi feita com 7 pontos e, tanto o padrão quanto as amostras

foram feitas em triplicata Os metais pesados analisados foram: Pb, Cd, Co, Cr, Cu, Mn,

Zn e Ni.

Teor de Flavonóides Totais: Metodologia utilizada segundo Funari & Ferro22,

utilizando cloreto de alumínio na concentração de 5%. Os resultados foram expressos

em porcentagem de quercetina e representam a média de 3 determinações.

Teor de Fenóis Totais: Foi construída uma curva padrão, utilizando como substância

de referência o ácido tânico. Alíquotas de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 mL da solução aquosa de

ácido tânico a 100 µg/mL foram transferidas para balões volumétricos de 100 mL e

adicionados 5 mL de Folin-Ciocauteau. Após 2 minutos, foram adicionados 10 mL de

solução de carbonato de cálcio 15% e o volume foi completado com água destilada. As

soluções foram deixadas em repouso por 30 minutos e foram lidas a 760 nm. As

amostras foram preparadas utilizando 3 mL do extrato hidroalcoólico de própolis a 2

mg/mL. O branco do sistema foi preparado da mesma forma, sem a alíquota da amostra.

Validação do Método Analítico para Teor de Flavonóides Totais: No estudo de

validação foram avaliados os parâmetros de linearidade, exatidão e precisão

(repetitividade e precisão intermediária). A linearidade foi avaliada através da análise de

regressão linear pelo método dos mínimos quadrados dos pontos médios de três curvas

autênticas, utilizando cinco pontos nas concentrações de 4, 6, 8, 10 e 12 μg/mL do

padrão de quercetina. O coeficiente de correlação obtido foi a partir das três curvas. A

exatidão foi realizada em triplicata, através do método de adição de padrão e os

resultados expressos como percentual de recuperação. A precisão foi verificada em dois

níveis: repetitividade e precisão intermediária, sendo a primeira determinada pela

análise de seis amostras individuais e a segunda em dias diferentes por analistas

diferentes.


O perfil fitoquímico da própolis foi analisado através da cromatografia em

camada delgada (CCD). Como a CCD requer apenas cromatoplacas e considerando que

a composição da própolis varia de acordo com a região onde foi coletada, esta

metodologia parece ser útil no rápido controle de qualidade da própolis23.


triterpenos e esteróides, açúcares redutores e flavonóides. Não foi detectada a presença

de alcalóides, iridóides, saponinas, cumarinas, derivados cinâmicos,

fenilpropanoglicosídeos, proantocianidinas condensadas e leucoantocianidinas.

Flavonóides como quercetina, kaempferol, luteolina e apigenina, também não foram

detectados, mesmo sendo reportados na literatura em outras própolis24,25.

Qualitativamente não foram observadas variações no perfil cromatográfico entre as

extrações etanólicas assim como entre as datas de coleta.

As amostras de própolis apresentaram cor avermelhada, sabor suave, aroma

resinoso e balsâmico e consistência maleável à temperatura ambiente, sendo que a

amostra de outubro apresentou-se um pouco mais clara e levemente mais rígida.

Segundo Funari & Ferro22, quando apresenta-se maleável, a própolis pode indicar um

elevado teor de ceras. Sendo rígida, pode indicar um elevado teor de resinas, o que é

desejável, pois as atividades biológicas vêm sendo atribuídas a substâncias contidas

nessa fração.

A tabela 1 mostra os resultados das análises gravimétricas realizadas nas três

amostras de própolis. As amostras foram avaliadas quanto aos testes de pureza

atendendo às especificações do Ministério da Agricultura15, com exceção da amostra de

fevereiro, no parâmetro teor de ceras, que se apresentou um pouco acima do

especificado. Ainda em relação a este parâmetro, a amostra coletada em outubro

apresentou um resultado menor que as demais sugerindo uma melhor atividade

biológica.

Tabela 1

A contaminação de vegetais com metais pode ter diversas origens, tais como

acidental, proposital, contaminação do solo, de materiais de origem natural ou mineral e

durante a manufatura. Estudos recentes, realizados no Brasil com plantas de origem

nacional e outras de diversas origens, mostraram a presença de metais em altas

concentrações26. Como a qualidade da própolis é dependente da origem vegetal, foi

realizada a determinação de metais pesados nas amostras coletadas nos meses de

fevereiro, junho e outubro. Dos teores totais dos metais pesados analisados Pb, Cd, Co,

Cr, Cu, Mn, Zn, Ni, verificou-se que nem o Co nem o Cr foram identificados em

nenhuma das amostras. A terceira coleta (outubro) foi onde se obteve o menor teor de

metais pesados seguindo da primeira coleta (fevereiro) e por fim a segunda (junho),

tabela 2.

Na coleta de fevereiro o Mn apresentou um elevado teor assim como Zn na

coleta de junho, quando comparado entre os teores apresentados.

A Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA27, através de portarias

normativas, relaciona uma série de produtos alimentícios e determina as concentrações

máximas permitidas para diferentes metais, entretanto, não foi encontrada qualquer

referência a produtos oriundos da abelha, como a própolis, sob qualquer forma, no que

se refere ao chumbo.

Tabela 2

A amostra de outubro apresentou também um maior teor de flavonóides totais e

fenóis totais, conforme se observa na tabela 3. Quanto ao solvente utilizado, o álcool a

90% foi o que apresentou melhor poder de extração, tanto de flavonóides, quanto de

fenóis.

Tabela 3

Quanto à validação do método analítico, os resultados dos pontos das três curvas

de linearidade foram plotados em um gráfico (Figura 1) estão demonstrados na tabela 4.

A concentração de quercetina em μg/mL versus a absorvância Y, através do método dos

mínimos quadrados origina a equação da reta: y = 0,0757x - 0,0184 e o coeficiente de

correlação R2 = 0,9999, valor este que comprova a linearidade do método, no intervalo

de variação estudado.

Figura 1

Tabela 4

A exatidão do método foi comprovada pelo estudo de três concentrações

diferentes (50, 100, 150%), onde o percentual de recuperação médio das triplicatas de

cada concentração analisada apresentou-se dentro dos limites como mostram os

resultados da tabela 5. O tratamento estatístico aplicado foi o Teste t-Student, o qual

demonstrou que o t calculado foi menor que o t tabelado comprovando que não houve

diferença estatisticamente significativa entre as médias das três concentrações

analisadas com 95% de confiança.

Tabela 5

Para a precisão, os ensaios de repetitividade foram realizadas seis determinações

a 160 μg/mL, referentes a 100% da concentração. Observando-se os resultados, conclui-

se que o método tem uma boa repetitividade, visto que o coeficiente de variação

apresenta-se inferior ao limite especificado de 5,0% pela Resolução RE nº 899 da

ANVISA28.

A precisão intermediária entre dias e entre analistas foi realizada e o Fcalculado

obtido para analistas foi 0,7871, e para dias foi 4,009745, com Ftabelado de 5,143 e 4,757

respectivamente, não havendo diferença estatisticamente significativa entre as médias,

sendo o método considerado preciso. Os dados analíticos do método validade são

apresentados na tabela 6.

Tabela 6

CONCLUSÃO

A partir dos resultados e evidências apresentadas, a própolis vermelha da região

de Goiana, Pernambuco, Brasil, mostrou atender às especificações de identidade e

qualidade estabelecidas pelo Ministério da Agricultura, nos meses avaliados exceto a

amostra de fevereiro quanto ao teor de ceras. A amostra do mês de outubro apresentou

um maior teor de flavonóides e fenóis totais, bem como menor teor de ceras, o que

indica este mês como o mais apropriado para coleta, especialmente se a própolis for

utilizada para fins medicinais, uma vez que são atribuídas aos flavonóides várias

propriedades farmacológicas. A validação do método analítico para a quantificação do

na própolis vermelha proporcionou resultados confiáveis para o doseamento de

flavonóides totais, sendo linear, exato e preciso. Atendendo às exigências especificadas

pela International Conference on Harmonization of Tecnical Requiriments for

Registration on Pharmaceutical for Human Use- ICH preconizadas nas recomendações

da ANVISA28,29.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos à Empresa Mel Brasil pelo fornecimento das amostras de própolis

e ao LAFEPE, pela parceria estabelecida para a realização da validação do método

analítico. A Capes e ao CNPq pelo apoio financeiro.

REFERÊNCIAS

1. Pereira, A.S.; Seixas, F.R.M.S.; Aquino Neto, F.R.; Quim. Nova 2002, 25, 321.

2. Santos, F.A.; Bastos, E.M.A.; Uzeda, M.; Carvalho, M.A.R.; Farias, L.M.;

Moreira, E.S.A.; Braga, F.C.; J. Ethnopharmacol. 2002, 80, 1.

3. Cunha, I.B.S.; Sawaya, A.C.H.F.; Caetano, F.M.; Shimizu, M.T.; Marcucci,

M.C.; Drezza, F.T.; Povia, G.S.; Carvalho, P.O.; J. Braz. Chem. Soc. 2004, 15,

964.

4. Silici, S. e Kutluca, S.; J. Ethnopharmacol. 2005, 99, 69.

5. Marcucci, M.C.; Ferreres, F.; García-Viguera, C.; Bankova, V.S.; De Castro,

S.L.; Dantas, A.P.; Valente, P.H.M.; Paulino, N.; J. Ethnopharmacol. 2001, 74,

105.

6. Da Silva, M.S.S.; Cito, A.M.G.L.; Chaves, M.H.; Lopes, J.A.D.; Quim. Nova

2005, 28, 801.

7. Arvouet-Grand, A.; Vennat, B.; Pourrat, A.; Legret, P.; J. Pharm. Belg. 1994,

49, 462.

8. Ahn, M.; Kumazawa, S.; Usui, Y.; Nakamura, J.; Matsuka, M.; Zhu, F.;

Nakayama, T.; Food. Chem. 2007, 101, 1400.

9. Borrelli, F.; Maffia, P.; Pinto, L.; Ianaro, A.; Russo, A.; Capasso, F.; Ialenti, A.;

Fitoterapia 2002, 73, S53.

10. Scazzocchio, F.; D’Auria, F.D.; Alessandrini, D.; Pantanella, F.;

Microbiological Research 2005, 4, 327.

11. Woisky, R.G.; Salatino, A.; J. Apicultural Research 1998, 37, 99.

12. Bankova, V.; J. Ethnopharmacol. 2005, 100, 114.

13. Lima, L.R.; Xavier, H.S.; Meira, J.L.; Rolim Neto, P.J.; Rev. Bras. Farmacogn.

2006, 16, 562.

14. Ministério da Agricultura, 2001, Instrução Normativa nº3 – ANEXO VI –

Regulamento técnico para fixação de identidade e qualidade de própolis. Diário

Oficial da República Federativa do Brasil, DOU de 19/01/2001.

15. Sena Filho, J.G.; Melo, J.G.S.; Saraiva, A.M.; Gonçalves, A.M.; Psiottano,

M.N.C.; Xavier, H.S.; Rev. Bras. Farmacogn. 2006, 16, 506.

16. Wagner, H.; Bladt, S. Em Plant drug analysis – A thin layer chromatography

atlas; Springer: Munich, 1996, 2ªed.

17. Harbone, J. B. Em Phytochemical Method; Chapman & Hall: London, 1998.

3ªed.

18. Metz, H.; Naturwissenschaften 1961, 48, 569.

19. Neu, R.; Naturswissenschaften 1956, 43, 82.

20. Roberts, E.A.H.; Cartwright, R.A.; Oldschool, M.; J. Sci. Food Agr. 1957, 8, 72.

21. Farmacopéia Brasileira; São Paulo Ltda: São Paulo, 1988, 4ª ed.

22. Funari, C.S.; Ferro, V.O.; Ciênc. Tecnol. Aliment. 2006, 26, 171.

23. Ackermann, T.; Food Chem. 1991, 42, 135.

24. Salatino, A.; Teixeira, E.W.; Negri, G.; Message, D.; eCAM 2005, 2, 33.

25. Pietta, P.G.; Gardana, C.; Pietta, A.M.; Fitoterapia 2002, 1, S7.

26. Santana, E.Q.; Tese de doutorado, Universidade Estadual Paulista Julio de

Mesquita Filho, Brasil, 2003.

27. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA); Portaria n° 685, de

27/08/1998.

28. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA); Resolução RE nº 899, de

29/05/2003.

29. ICH International Conference on Harmonization of Tecnical Requiriments for

Registration on Pharmaceutical for Human Use. Q2A: ”Text on Validation of

Analytical Procedures” October 1994.

Tabela 1. Resultados das análises gravimétricas realizadas com amostras da própolis coletada nos meses de fevereiro, junho e outubro de 2006

Teste Especificações1 Amostra

Fevereiro/062

Amostra

Junho/062

Amostra

Outubro/062

Perda por

Dessecação

Máximo 8% 1,77 ± 0,03 2,10 ± 0,17 2,36 ± 0,40

Teor de Cinzas Máximo 5% 1,57 ± 0,19 1,46 ± 0,24 1,87 ± 0,16

Teor de Cera Máximo 25% 30,5 ± 1,5 25,0 ± 0,0 19,0 ± 3,0

Resíduo insolúvel

em etanol

Máximo 40% 31,3 ± 0,57 30,3 ± 0,57 11,6 ± 0,57

1Especificações estabelecidas pelo Ministério da Agricultura. 2Valores expressos em porcentagem.

Tabela 2. Determinação dos Metais Pesados Metais Pesados

Amostra

Fevereiro/062

Amostra

Junho/062 2Amostra

Outubro/06

Pb 13,2±1,368 21,9±1,713 6,7±0,788

Cd 0,05±0,090 0,19±0,171 0,30±0,097

Co 0,0 0,0 0,0

Cr 0,0 0,0 0,0

Cu 4,3±0,750 3,2±0,113 1,3±0,119

Mn 52,7±2,027 41,3±1,245 26,2±1,799

Zn 0,0 85,4±0,559 23,0±2,243

Ni 4,7±1,483 2,7±0,427 2,1±0,384

Tabela 3. Análises do teor de flavonóides totais e fenóis totais Especificações1 Amostra

Fevereiro/062

Amostra

Junho/062

Amostra

Outubro/062

Teste

70% 80% 90% 70% 80% 90% 70% 80% 90%

Flavonóides

Totais (%)

Mínimo de

0,5%

1,501±

0,005

1,524±

0,007

2,111±

0,002

1,590±

0,005

1,279±

0,016

1,615±

0,002

2,300±

0,005

2,351±

0,011

2,410±

0,002

Fenóis

Totais (%)

Mínimo de 5% 7,116±

0,053

7,613±

0,042

8,440±

0,034

9,095±

0,053

8,039±

0,069

9,315±

0,099

13,334±

0,077

13,617±

0,117

13,476±

0,113

1Especificações estabelecidas pelo Ministério da Agricultura. 2Valores expressos em porcentagem.

Tabela 4. Resultados em absorvância dos pontos da curva de linearidade Concentração

(ug/mL)

Curva 1 Curva 2 Curva 3

4,0 0,2929 0,2872 0,2754

6,0 0,4368 0,4346 0,4271

8,0 0,5954 0,5844 0,5851

10,0 0,7532 0,7353 0,7345

12,0 0,8935 0,8882 0,8814

Figura 1. Determinação gráfica da curva de linearidade

00,15

0,30,45

0,60,75

0,91,05

0 2 4 6 8 10 12 14[ ] µg/mL

Abs

orbâ

ncia

Seqüência1 Seqüência2Seqüência3 Linear (Seqüência2)Linear (Seqüência1) Linear (Seqüência3)

Tabela 5. Determinação dos resultados da exatidão Quantidade adicionada

(%)

Quantidade recuperada

(%)

Teste t- Student

calculado

t- tabelado

50 49,26 ± 1,2 2,12

100 100,97 ± 0,96 1,72 4,303

150 151,05 ± 0,44 4,03

Tabela 6. Dados analíticos do método validado Parâmetros Método validado

Comprimento de onda (nm) 425

Limite de detecção (LD) 0,3632

Limite de quantificação (LQ) 1,2103

Repetitividade (ug/mL) 2,52 ± 0,04

Artigo a ser submetido à Revista ECAM

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E PERFIL

FITOQUÍMICO DA PRÓPOLIS VERMELHA

Sarah Rodrigues Lustosa1, Alexandre Bezerra Galindo1, Karina Perrelli Randau3, Pedro

José Rolim Neto1, Eulália Azevedo Ximenes2

1 Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Ciências

Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco

2 Laboratório de Fisiologia e Bioquímica de Microorganismo, Departamento de

Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco


Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brasil

Resumo: Própolis é um complexo resinoso produzido por abelhas a partir de resinas de

plantas. Sua composição química varia de acordo com o local da coleta e com a

vegetação nativa. Pesquisas têm revelado inúmeras atividades biológicas da própolis,

dentre essas, a atividade antimicrobiana têm sido exaustivamente estudada. O perfil

fitoquímico de extratos da própolis vermleha foi determinado, bem como realizada a

avaliação da atividade antimicrobiana in vitro, inclusive frente à cepas multiresistentes.

O teste de biocromatografia foi realizado para identificar substâncias bioativas. Os

resultados demonstraram a presença de mono e sesquiterpenos, triterpenos e esteróides,

açúcares e flavonóides, sendo a atividade antimicrobiana visualizada na bioautocrafia

apenas para os flavonóides. Os microorganismos Gram-positivos (gêneros

Staphylococcus e Enterococccus) foram mais sensíveis quando comparados aos bacilos

Gram-negativos (Pseudomonas, Salmonella e Escherichia) e Candida albicans. As

cepas de S. aureus mostraram-se mais sensíveis ao extrato etanólico 70% , enquanto os

Enterococcus foram mais sensíveis ao extrato etanólico 80%.

INTRODUÇÃO

A própolis é um complexo resinoso formado pela mistura de substâncias

retiradas de botões de flores de árvores ou cascas de árvores com substâncias do próprio

organismo da abelha (1). Sua composição química varia de acordo com o local da coleta

e com a vegetação nativa no qual o apiário está instalado. Em geral, é composta por

50% de resina e bálsamo vegetal, 30% de cera, 10% de óleos, 5% de pólen e 5% de

várias outras substâncias e seu emprego na vida da colônia está relacionado com suas

propriedades mecânicas, sendo utilizada na construção e adaptação da colméia, e

antimicrobianas garantindo um ambiente asséptico (2-4).

Administrada sob diversas formas, é um dos produtos naturais mais utilizados

pela humanidade há vários séculos devido ao seu amplo espectro de ação, o qual está

intrinsecamente relacionado à sua composição química (5).

Várias pesquisas têm revelado inúmeras atividades biológicas da própolis:

antimicrobiana, antinflamatória, antioxidante, anti-tumoral e imunomoduladoras (6-10).

Dentre essas, a atividade antimicrobiana têm sido exaustivamente estudada, embora as

substâncias responsáveis por essas atividades ainda não tenham sido descritas em sua

totalidade. É sabido que os flavonóides contribuem mais que outros constituintes para

essa atividade biológica e que estes podem variar quali e quantitativamente de uma

amostra de própolis para outra (2,11-13).

Diferenças significativas na composição química e atividade biológica de

própolis originadas de regiões temperadas e tropicais têm aumentado o interesse de

vários pesquisadores que iniciaram vários estudos com novas amostras de própolis de

diversas regiões brasileiras (14-15).

Dos tipos de própolis brasileira, a mais popular e bem estudada é a própolis

verde, também denominada própolis alecrim a qual origina-se de Baccharis

dracunculifolia (Asteraceae) (16-18).

Recentemente Trusheva et al. (15) descreveram o isolamento e identificação de

quatorze compostos de uma amostra de própolis vermelha coletada na região nordeste

do Brasil, mais precisamente do Estado de Alagoas. Neste trabalho, compostos como

metil eugenol, metil isoeugenol, elemicina e isoelemicina foram isolados pela primeira

vez em própolis, alguns dos quais mostraram atividade antimicrobiana frente à S.

aureus, C. albicans e E. coli.

Com base neste estudo e sabendo que são escassas as pesquisas sobre própolis

vermelha brasileira, este trabalho objetivou a determinação do perfil fitoquímico de uma

amostra de própolis vermelha coletada no estado de Pernambuco, Brasil, bem como de

sua atividade antimicrobiana frente várias bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e

leveduras, algumas das quais resistentes a diversos antimicrobianos.

MATERIAIS E MÉTODOS

Amostras de Própolis. A amostra de própolis foi coletada em apiário localizado no

município de Goiana (7º41’20’’ S; 34º51’35’’), zona litorânea do estado de

Pernambuco, Brasil. Essa região caracteriza-se por um clima tropical úmido e uma

vegetação de restinga. Abelhas da espécie Apis mellifera são as responsáveis pela

produção da própolis do referido apiário, utilizando para isso resina coletada da espécie

Dalbergia ecastophyllum (L.) Taub.

Preparação dos extratos. Extratos etanólicos de própolis (EEP) a 20% (p/v) foram

obtidos por maceração durante 48h, à temperatura ambiente, utilizando soluções

etanólicas de concentrações 70, 80 e 90% v/v. Após a maceração os EEPS foram

filtrados em papel de filtro e acondicionados em frascos de vidro âmbar para posterior

análise fitoquimica e antimicrobiana.

Perfil fitoquímico. Alíquotas de 5µl dos EEPS foram submetidas à cromatografia em

camada delgada (placas cromatográficas Merck, art. 105553, gel de sílica),

empregando-se diversas fases móveis: A [AcOEt- HCOOH-AcOH- H2O

(100:11:11:27v/v)]; B [B-Benzeno–AcOEt (97: 3 v/v)]; C [AcOEt-HCOOH-AcOH-

H2O (100:0,5:0,5:0,5v/v) ]; D [n-BuOH-Me2CO- Tampão fosfato pH= 5,0

(40:50:10v/v)], E [Éter-tolueno-AcOH 10% (50:50:50v/v)] e reveladores descritos na

Tabela 1.

Tabela 1. Sistemas cromatográficos e reveladores utilizados para o perfil fitoquímico da própolis vermelha.

Metabólitos Sistemas de eluição Reveladores Referência

Alcalóides A Dragendorff 19

Mono e sesquiterpenos B Vanilina sulfúrica 19

Triterpenóides e

Esteróides

C Lieberman/Burchard 20

Iridóides A Vanilina sulfúrica 19

Saponinas A Vanilina sulfúrica 19

Açúcares redutores D Trifeniltetrazólio 21

Cumarinas E U. V. (365 nm) 19

Derivados cinâmicos A NEU 19

22

Flavonóides A NEU 19,22

Fenilpropanoglicosídeos A NEU 19

Proantocianidinas

condensadas e

Leucoantocianidinas

A Vanilina clorídrica 23

Bioautografia. O teste de bioautografia foi realizado com o objetivo de identificar

substâncias bioativas. As suspensões bacterianas foram padronizadas segundo o tubo

0,5 da escala de MacFarland, que corresponde a 108 UFC/mL.

Alíquotas de 5 μL dos EEPs foram aplicadas sobre placas cromatográficas de gel

de sílica, as quais foram submetidas ao sistema eluente específico para cada grupo de

metabólitos secundários (Tabela 1). Após adsorção das amostras, as cromatoplacas

foram depositadas em placas de Petri de 180mm, sobre as quais foram vertidos 54 mL

de ágar Mueller-Hinton inoculado com as suspensões das culturas de Staphylococcus

aureus IC 404 ou Enterococcus faecalis IC 02, de modo a obter um inóculo equivalente

a 106 UFC/mL. Após 24 h de incubação à 35 °C, as substâncias cromatograficamente

separadas e que exibiram atividade antibacteriana foram reconhecidas por meio da

formação das zonas de inibição ao redor de suas bandas.

Atividade antimicrobiana. A atividade antimicrobiana dos EEPS foi avaliada pelo

método descrito por Bauer e Kirby (24) frente a 49 microrganismos pertencentes à

coleção de culturas do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de

Pernambuco e isolados clínicos. Fizeram parte deste estudo os bacilos Gram-negativos:

Pseudomonas aeruginosa IC 01; IC 02 ; IC 03; IC 04; IC 05; IC 06; IC 07; IC10, IC 15;

UFPEDA 39), Salmonella enterica sorovar Panama 071; sorovar. Saint Paul 391;

sorovar. Rublislaw 3373; sorovar. Anatum 873; Salmonella sorovar. enteritidis

UFPEDA 415; Salmonella cholerae suis ATCC 14028, Escherichia coli IC18 e ATCC

8739; os bacilos Gram-positivos: Enterococcus faecalis IC 55671; IC 55918; IC 144; IC

68; IC 56671; IC 56354; IC 55995; IC 295; IC 222; IC 56288 e ATCC 29212 ,

Staphylococcus aureus IC 138; IC 27; IC 155; IC 311; IC 14; IC 15; IC 16; IC 404; IC

247; ATCC 6538; e levedura: Candida albicans IC 01; IC 03; IC 06; IC 07; IC 08;

IC09; IC10; IC11; IC12 e IC 15.

Culturas crescidas durante 24 horas em caldo Mueller-Hinton ou 48 horas em

caldo Sabourand foram diluídas de modo a obter suspensões microbianas de turbidez

equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland, o que corresponde a 108UFC/mL. Em

seguida, estas suspensões foram novamente diluídas de 1:100 e semeadas com swabs

estéreis na superfície do ágar Mueller-Hinton para as bactérias ou ágar Sabourand para

as leveduras (25).

Discos de papel de filtro estéreis pesando 30 mg ± 4 mg/cm2 e 6mm de diâmetro

foram saturados com 20μL dos respectivos EEPS. As placas foram incubadas a 37 ˚C

durante 24horas para as bactérias e a 30 ˚C durante 48 horas para as leveduras. Ao fim

do período de incubação, o diâmetro do halo de inibição do crescimento microbiano foi

medido com auxilio de uma régua e expresso em milímetros (mm).

Os experimentos foram realizados em duplicada e expressos pela média

aritmética.


O ensaio fitoquímico não detectou a presença de alcalóides, iridóides, saponinas,

cumarinas, derivados cinâmicos, fenilpropanoglicosídeos, proantocianidinas

condensadas e leucoantocianidinas. Entretanto, foram evidenciados mono e

sesquiterpenos, triterpenos e esteróides, açúcares e flavonóides diferentes da quercetina,

kaempferol, luteolina e apigenina, reportadas na literatura em outras própolis (14-26).

Neste trabalho não foram visualizadas diferenças do perfil fotoquímico dos três

extratos etanólicos de própolis estudados.

A bioautografia realizada para mono e sesquiterpenos, triterpenos e esteróides, e

flavonóides revelou apenas atividade antimicrobiana das bandas referentes aos

flavonóides, detectada pelas zonas de inibição do crescimento de S.aureus e E. faecalis.

A presença de flavonóides na própolis vermelha justifica sua atividade

antimicrobiana e corrobora aos dados obtidos por Burdock (2), que atribuiu aos

flavonóides e aos ácidos carboxílicos modificados, componentes majoritários e

estratégicos da própolis, a responsabilidade pela bioatividade, principalmente

antimicrobiana, contra vários microorganismos patogênicos. Como a composição da

própolis é variável, a qualidade e quantidade dos flavonóides presentes na amostra

exercem uma grande influência nesta atividade.

No Brasil, foram descritas propriedades biológicas e composição química

distintas para amostras de própolis coletadas em diferentes regiões do país. Essa

variação é devido à grande biodiversidade da flora brasileira, como também à

habilidade bioquímica das abelhas em alterar a composição nativa, adicionando-lhe

componentes próprios do seu metabolismo (5).

Há uma grande controvérsia em relação ao teor de flavonóides encontrados nas

amostras de própolis brasileiras (5). Bankova et al. (27) concluíram que as própolis

brasileiras têm uma baixa concentração de flavonóides e ésteres de ácidos fenólicos,

mas possuem altas concentrações de ácido dihidroxicinâmico, acetofenonas preniladas e

alguns terpenóides específicos. No entanto Bankova et al. (28) descreveram a presença

de flavonóides como importantes componentes na própolis brasileira.

Os compostos prenilados descritos por Aga et al. (29) e majoritários em muitas

das amostras de própolis brasileira são responsáveis pela atividade antimicrobiana.

Marcucci et al. (30) afirmaram que a atividade antimicrobiana da própolis brasileira é

diretamente proporcional à quantidade de resíduos prenil presentes nas amostras.

Os resultados obtidos neste trabalho para a atividade antimicrobiana dos três

extratos etanólicos frente a 49 microrganismos estão apresentados na Tabela 3.

Tabela 3. Atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos de própolis vermelha. Diâmetro do Halo de Inibição (mm)

Microorganismos

Extratos Etanólico 70% 80% 90%

Enterococcus faecalis IC 55671 9 11 11










Enterococcus faecalis ATCC 29212 10 10 9

Staphylococcus aureus IC 138 - - -



Staphylococcus aureus IC 311 11 10 10



Gram-positivos




Staphylococcus aureus ATCC 6538 15 11 12

Pseudomonas aeruginosa IC 01 - - -






Gram-

negativos




Pseudomonas aeruginosa UFPEDA 39 - - -

Salmonella enterica sorovar. Panama 071 - - -

Salmonella enterica sorovar. Saint Paul 391 - - -

Salmonella enterica sorovar. Rublislaw 3373 10 8 -

Salmonella enterica sorovar. Anatum 873 - - -

Salmonella sorovar. enteritidis UFPEDA 415 - - -

Salmonella cholerae suis ATCC 14028 - - -

Escherichia coli 18 - - -

Escherichia coli ATCC 8739 - - -

Leveduras Candida albicans IC 01 9 10 11

Candida albicans IC 03 8 8 8









Os cocos Gram positivos representados pelos gêneros Staphylococcus e

Enterococccus foram os mais sensíveis aos EEPS quando comparados aos bacilos

Gram-negativos (Pseudomonas, Salmonella e Escherichia) e Candida albicans. Estes

resultados corroboram aos dados descritos por Grange e Davey, Fernandes Junior, Park

et al., Burdock, Fontana et al., Marcucci et al. (31,2,32-33, 30), que descreveram uma

atividade antimicrobiana de própolis direcionada para cocos e bacilos Gram-positivos

incluindo cepas de Staphylococcus meticilina resitentes e uma atividade limitada contra

bacilos Gram-negativos.

Os perfis de sensibilidade das cepas de S. aureus aos EEPS foram semelhantes e

discretamente superiores para o extrato etanólico a 70%, cuja média dos halos de

inibição do crescimento foi de 13,8 mm (Tabela 3). Todos os EEPS foram capazes de

inibir 60% dos estafilococos avaliados, incluindo cepas resistentes, mas os resultados

observados neste trabalho para a atividade antiestafilocócica dos EEPS 70%, 80% e 90%

não corroboram aos descritos por Fernandes Junior et al. (34) que encontraram as

maiores atividades antiestafilocócicas quando os extratos de própolis eram preparados

com solução de etanol de 60 a 80%v/v.

Todas as cepas de enterococcos foram sensíveis aos EEPS mas o EEP 80%

mostrou ser o mais eficaz, cuja média de inibição do crescimento foi da ordem de 11,7

mm.

Dos três EEPS avaliados, o EEP 70% foi discretamente mais ativo na inibição do

crescimento das cepas de Candida albicans, em média de 8,5mm.

Nenhum dos extratos avaliados apresentou atividade contra as cepas multi

resistentes do gênero Pseudomonas e Staphylococcus cepas IC 155, IC 27, IC 138, IC

247, nem sobre as salmonelas, à exceção de Salmonella enterica sorovar. Rublislaw

3373. Neste caso, os vários mecanismos específicos implicados no desenvolvimento da

multiresistência aos antimicrobianos estariam intrinsecamente relacionados à resistência

aos EEPS.


1. Franco SL, Bruschi ML, Moura LPP, Bueno JHF. Avaliação farmacognóstica de

própolis da região de Maringá. Rev Bras Farmacogn 2000;9:1-10.

2. Burdock GA. Review of the biological properties and toxicity of bee propolis

(propolis). Food Chem Toxicol 1998;36:347-363

3. Funari CS, Ferro VO. Análise de Própolis. Ciên Tecn Aliment 2006; 26:171-8.

4. Woisky RG, Salatino A. Analysis of propolis: some parameters and procedures

for chemical quality control. J Apicultural Res 1998;37:99-105.

5. Pereira AS, Seixas FRMS, Aquino Neto FR. Própolis: 100 anos de pesquisa e

suas perspectivas futuras. Quím Nova 2002;25:321-326.

6. Kosalec I, Pepeljnjak S, Bakmaz M, Vladimir-Knezevic S. Flavonoid analysis

and antimicrobial activity of commercial avaiable propolis products. Acta Pharm

2005;55:423-430.

7. Alencar SM, Aguiar CL, Guzmán J P, Park YK. Composição química de

Baccharis dracunculifolia. Ciênc Rural 2005;35:909-915.

8. Santos FA, Bastos EMA, Uzeda M, Carvalho MAR, Farias LM, Moreira ESA,

Braga FC. Antibacterial activity of Brazilian propolis and fractions against oral

anaerobic bacteria. J Ethnopharmacol 2002;80:1-7.

9. Cunha IBS, Salomão K, Shimizu M, Bankova VS, Custódio AR, De Castro SL,

Marcucci MC. Antitrypanosomal activity of Brazilian propolis from Apis

mellifera. Chem Pharm Bull 2004;52:602-604.

10. Hu F, Hepburn HR, Li Y, Chen M, Radloff SE, Daya S. Effects of ethanol and

water extracts of propolis (bee glue) on acute inflammatory animal models. J

Ethnopharmacol 2005:100:276-283.

11. Marcucci MC. Propolis: chemical composition, biological properties and

therapeutic activity. Apidologie 1995;26:83-99.

12. Kujumgiev A, Tsvetkova I, Serkedjieva Y, Bankova V, Christov R, Popov S.

Antibacterial, antifungal nad antiviral activity of própolis of different geographic

origin. J Ethnopharmacol 1999;64:235-240.

13. Rocha L, Dos Santos LR, Arcenio F, Carvalho ES, Lúcio EMRA, Araújo GL, et

al. Otimização do processo de extração de própolis através da verificação da

atividade antimicrobiana. Rev Bras Farmacogn 2003;13:71-4.

14. Salatino A, Teixeira EW, Negri G, Message D. Origin and chemical variation of

Brazilian propolis. Evid Based Complement Alternat Med 2005;2:33-38.

15. Trusheva B, Popova M, Bankova V, Simova S, Marcucci MC, Miorin PL, et al.

Bioactive constituents of Brazilian red propolis. Evid Based Complement

Alternat Med 2006;3:249-254.

16. Bankova V, Boudourova-Krasteva G, Sforcin JM, Frete X, Kujumgiev A,

Maimoni-Rodella R, et al. Phytochemical evidence for the plant origin of

Brazilian propolis from São Paulo state. Z Naturforsch 1999;54c:401-5.

17. Kumazawa S, Yoneda M, Shibata I, Kanaeda J, Hamasaka T, Nakayama T.

Direct evidence for the plant origino f Brazilian propolis by the observation of

honeybee behavior and phytochemical analysis. Chem Pharm Bull 2003;51:740-

2.

18. Teixeira EW, Negri G, Meira RMSA, Message D, Salatino A. Plant origin of

green propolis: bee behavior, plant anatomy and chemistry. Evid Based

Complement Alternat Med 2005; 2:85-92.

19. Wagner H, Bladt S. Plant drug analysis – A thin layer chromatography atlas;

Springer: Munich, 1996.

20. Harbone JB. Phytochemical Method; Chapman & Hall: London, 1998.

21. Metz H.; Naturwissenschaften 1961;48:569.

22. Neu R. A New reagent for differentiating and determining fl avones of paper

chromatograms. Naturswissenschaften 1956;43:82.

23. Roberts EAH, Cartwright RA, Oldschool M. Phenolic substances of

manufactured tea. I. Fractionation and paper chromatography of water-soluble

substances. J. Sci. Food Agr. 1957, 8, 72.

24. Bauer AW, Kirby, WNN, Sherris GY, Turk M. Antibiotic susceptibility testing

by standardized single disk method. Am J Clin Pathol 1996;45:493-496.

25. Cleeland R, Grunberg E. Laboratory Evaluation of New Antibiotics in vitro and

in Experimental Animal Infections. In: C. Lorian. Antibiotics in Laboratory

Medicine. Willian & Wilkins, Batimore: 1986, 537-578.

26. Pietta PG, Gardana C, Pietta AM. Analytical methods for quality control of

propolis. Fitoterapia 2002;73:S7-S20.

27. Bankova V, Christov R, Kujumgiev A, Marcucci MC and Popov S. Chemical

composition and antibacterial activity of Brazilian propolis. Zeitschrift fur

Naturforschung 1995;50:167-172.

28. Bankova VS, de Castro SL, Marcucci MC. Propolis: recent advances in

chemistry and plant origin. Apidologie 2000;26:83-99.

29. Aga H, Shibuya T, Sugimoto T, Kurimoto M, Nakajima SH. Isolation and

identification of antimicrobial compounds in Brazilian propolis. Biosci

Biotechnol Biochem 1994;58:945-6.

30. Marcucci MC, Ferreres F, García-Viguera C, Bankova VS, De Castro SL,

Dantas AP, et al. Phenolic compounds from Brazilian propolis with

pharmacological activities. J Ethnopharmacol 2001;74:105-112.

31. Grange JM e Davey RW. Antibacterial properties of propolis (bee glue). Journal

of the Royal Society of Medicine 1990;83:159-160.

32. Park YK, Koo MH, Ikegaki M, Contado JL. Comparison of the flavonoid

aglycone contents of Apis mellifera propolis from various regions of Brazil.

Arquivos de Biologia e Tecnologia 1997;40:97-106.

33. Fontana JD, Adelmann J, Passos M, Maraschin M, Lacerda CA, Lanças FM.

Propolis: chemical micro-heterogeneity and bioactivity. In: New Jersey:Humana

press 2004;203-218.

34. Fernandes Júnior A, Balestrin ECC, Cunha MLRS. Anti-Staphylococcus aureus

activity of bee propolis extracts prepared with different ethanol concentrations.

Rev Cienc Farm 2003;24:147-152.

universidade federal de pernambuco · brasileira de farmacognosia) ... capítulo iii - influência...

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