universidade federal de pelotas -...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Parasitologia
Dissertação
Leishmaniose visceral canina: Investigação clínica, laboratorial e epidemiológica em cães de
canís de doze municípios do Rio Grande do Sul
Lourdes Caruccio Hirschmann
Pelotas, 2013
LOURDES CARUCCIO HIRSCHMANN
LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA: Investigação clínica, laboratorial e epidemiológica em cães de canís de
doze municípios do Rio Grande do Sul
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Parasitologia da Universidade Federal de Pelotas, como
requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (área do conhecimento:
Parasitologia).
Orientador: Prof. Dr. Claudiomar Soares Brod
Pelotas, 2013
Dados de catalogação na fonte: Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901
Biblioteca de Ciência & Tecnologia – UFPel
H669l Hirschmann, Lourdes Caruccio
Leishmaniose visceral canina: Investigação clínica, laboratorial e epidemiológica em cães de canís de doze municípios do Rio Grande do Sul / Lourdes Caruccio
Hirschmann. – 65f. – Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Parasitologia. Universidade Federal de Pelotas. Instituto de Biologia. Departamento de Microbiologia
e Parasitologia. Pelotas, 2013. – Orientador Claudiomar Soares Brod.
1.Parasitologia. 2.Leishmania chagasi. 3.Hemoparasita. 4.Zoonose. 5.Diagnóstico. I.Brod, Claudiomar Soares. II.Título.
CDD: 616.9364
H669l Hirschmann, Lourdes Caruccio
Leishmaniose visceral canina: Investigação clínica, laboratorial e epidemiológica em cães de canís de doze municípios do Rio Grande do Sul / Lourdes Caruccio
Hirschmann. – 65f. – Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Parasitologia. Universidade Federal de Pelotas. Instituto de Biologia. Departamento
de Microbiologia e Parasitologia. Pelotas, 2013. – Orientador Claudiomar Soares Brod.
1.Parasitologia. 2.Leishmania chagasi. 3.Hemoparasita. 4.Zoonose. 5.Diagnóstico. I.Brod,
Claudiomar Soares. II.Título.
CDD: 616.9364
Banca examinadora:
_____________________________________ Médica Veterinária Drª. Anelise Afonso Martins
_____________________________________ Prof. Dr. Carlos James Scaini
_____________________________________ Profª.Drª. Nara Amélia da Rosa Farias
_____________________________________
Prof. Dr. Claudiomar Soares Brod (Orientador)
Dedicatória
Dedico este trabalho aos meus pais Jaime e Georgeta, meu marido Léo Vítor, minha irmã
Ana Délia, meus amigos e animais, por tudo que representam na minha vida!
Agradecimentos
Agradeço a Deus por estar sempre me iluminando e me dando graças. E agradeço a
Ele por tudo que vou agradecer abaixo, pois nada é meu, é dEle tudo o que tenho!
Aos meus pais por acreditarem em mim, pelo apoio, pela paciência comigo em
tantos momentos, pelo ensinamento deixado, pelo amor dado de tantas formas, pela
dedicação desde sempre, principalmente por não me deixarem desistir nos
momentos de dificuldade, e simplesmente por serem os melhores pais que eu
poderia ter na vida.
Ao Léo Vítor, meu marido, que tanto me ajudou nesta caminhada, me mostrando o
melhor de mim, me dando forças nos momentos em que precisei, principalmente por
ter apoiado e participado ativamente junto comigo neste estudo desde o começo, me
acompanhando nas partes práticas de coleta, ajudando a segurar os cães, pelas
idas ao laboratório aos fins de semana, perdendo de aproveitar para me auxiliar
lavando o material do projeto, pelas muitas edições de mapas e figuras do projeto,
me acompanhando até altas madrugadas, deixando de lado seus próprios interesses
para me ver feliz, resumindo por ser este amor que és, sempre disposto a ajudar,
sem reclamar, sem vacilar, sem pensar duas vezes, estando ao meu lado dia após
dia pro que der e vier!
Aos animais, especialmente os meus gatinhos (Ariel, Alemão e Gatão) e minhas
cachorras (Sol e Chiquita) por serem uma companhia verdadeira, acolhedora,
divertida em todos os momentos da minha vida, amo vocês muito!!
A todos meus amigos que de alguma forma se colocaram no meu lugar e
entenderam os momentos que estive distante por motivos de estudo, por motivo de
crescimento profissional, em especial as amigas que sempre estiveram presentes de
todas as formas possíveis nesta fase da minha vida, Rosália Garcia Neves, Carolina
Rodeghiero, Diana Penha e Juliana Berny, que em momentos marcantes estiveram
presentes me dando forças para chegar onde estou agora!
Aos amigos Pedritenses, Anelise Martins e família, Cíntia e João, Ida Maria de
Oliveira, Sherol Rodrigues e família, Thaís e Jansen, Daniele e Alex, Vanessa
Nunes, pessoas queridas e maravilhosas, que tenho tanto carinho, me ajudaram em
momentos de dificuldade com uma palavra amiga, com apoio, momentos em que
estive longe da família, com tantas responsabilidades e muitas vezes sem saber a
quem recorrer, quando eu estava com medo e insegura no trabalho e na nova
cidade, vocês foram um porto seguro, estiveram ao meu lado para me mostrar o
lado bom de tudo! Uma nova família que não importa onde eu estiver vou levar
comigo!
A coordenação da Universidade Federal do Pampa - Campus Dom Pedrito, em
especial a Diretora Nádia Bucco, que em todo momento autorizou meus
afastamentos para esta qualificação, pela amizade e empenho em proporcionar o
meu bem-estar e crescimento profissional. Muito obrigado!
Aos amigos do laboratório do CCZ/UFPel, Joana Caetano, Vanessa, Caroline
Simon, Jaqueline Radin, Leonardo Prestes, aos estagiários do projeto Anna Luiza
Silva, Marcelo Leal e Bárbara Ponzilacqua, pela participação e colaboração desde o
início do projeto, sempre dispostos a ajudar, a aprender junto comigo, os quais me
proporcionaram momentos de muita alegria e conhecimento.
Ao meu orientador Claudiomar Soares Brod, por acreditar na minha capacidade, por
me incentivar na pesquisa com a Leishmaniose visceral canina, por me acrescentar
maiores ensinamentos, as vezes difíceis para mim, mas que serão muito úteis, como
as medidas de efeito, visão de epidemiologia, entre outros, agradeço pela
compreensão em que estive distante, por entender a mudança de vida que passei,
por me dar liberdade para fazer minhas atividades com tranquilidade, pela confiança,
dedicação e amizade.
A Ana Recuero por ser uma lutadora, sempre dedicada aos estudos, sempre se
esforçando, sempre divertida, sempre nos levando um cafezinho nas horas de
cansaço e uma palavra de conforto. Obrigado!
Ao Departamento de Parasitologia/UFPel, pela compreensão em tantos momentos,
especialmente professora Nara Farias e coordenador Marcos Villela, obrigado pelo
apoio!!!
Aos colegas de Pós-graduação, pelos estudos e conhecimento compartilhado.
A CAPES pelo incentivo aos meus estudos, proporcionando condições para eu
pesquisar cada vez mais e aprimorar conhecimento.
Ao Ministério da Saúde pela colaboração com os Kits de diagnóstico doados ao
projeto, obrigado por ajudar desta forma com a pesquisa.
Ao LACEN/RS, especialmente a Raquel Ramos, pelo ensino e participação nos
exames de diagnósticos, por ter dedicado um tempo do seu trabalho para me
auxiliar, tirando minhas dúvidas e pela sua generosidade.
Ao laboratório Biogene, Imunodot, na colaboração e interesse no projeto.
Aos canis municipais e ONG’s que se dispuseram a participar da pesquisa,
interessando-se pelo conhecimento da doença em questão, se prontificando a
ajudar, especialmente por serem humildes e cuidarem dos animais com tanto
carinho.
Resumo
HIRSCHMANN, Lourdes. Leishmaniose visceral canina: Investigação clínica,
laboratorial e epidemiológica em cães de canis de doze municípios do Rio Grande do Sul. 2013. 65f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Parasitologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas – RS.
A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é uma zoonose de caráter crônico, sistêmica, que acomete diversos mamíferos, causada pelo protozoário Leishmania
(Leishmania) chagasi, que é transmitido pela hematofagia da fêmea do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis. A LVC apresenta ampla distribuição geográfica, e com alto
potencial de letalidade. O Rio Grande do Sul era considerado um estado do Brasil sem casuística da doença, ou seja, não endêmico. Porém, em 2008 foram registrados casos autóctones de LVC em municípios de região oeste do estado. O
objetivo deste estudo foi realizar um levantamento da presença de cães soropositivos em canis de doze municípios do Rio Grande do Sul, considerando os
aspectos clínicos, epidemiológicos e laboratoriais, comparando métodos e protocolos de diagnóstico. Com isso, pode-se detectar precocemente uma possível disseminação da doença, incentivando campanhas de controle e prevenção,
evitando assim futuros surtos. Este estudo foi realizado em uma área do RS sem diagnóstico para LVC, sendo avaliados o total de 165 cães provenientes dos
municípios de Alegrete, São Francisco de Assis, Santiago, Dom Pedrito, Bagé, Caçapava do Sul, Cachoeira do Sul, Piratini, Arroio Grande, Capão do Leão, Rio Grande e Camaquã. Os animais foram submetidos à avaliação clínica geral, sendo
observadas principalmente lesões tegumentares e linfoadenopatias. Na avaliação laboratorial, realizou-se hemograma completo, exame parasitológico e sorológico.
Os achados clínicos de cada animal e os resultados das técnicas laboratoriais foram submetidos a análise estatística no programa EpiInfo versão 6.04. Sinais dermatológicos, anemia normocítica normocrômica, alterações plaquetárias e
leucocitose com neutrofilia foram apresentados pelos animais sororreagentes. A pesquisa sorológica foi realizada através das técnicas de Imunofluorescência
Indireta (IFI), ensaio imunoenzimático (ELISA) e Dual Plate Plataform (DPP). Constatou-se taxa de 33,94% (56/165) na IFI, 6,67% (11/165) no DPP, 3,03% (5/165) na IFI e DPP e 6,06% (10/165) no ELISA. Destes confirmados no ELISA,
cinco (5/10) foram reagentes na IFI, e apenas três (3/10) foram positivos no DPP, resultando em três cães soropositivos conforme o protocolo atual preconizado pelo
Ministério da Saúde. A comparação das técnicas sorológicas demonstrou que DPP e IFI isoladamente apresentaram uma Acurácia de 65,45%. Já na análise dos mesmos testes quando se considerou o teste de ELISA como padrão ouro, a Acurácia do
DPP foi de 90,91% e a da IFI 66,06%. Entretanto, quando se considerou somente resultados positivos no DPP e IFI, a Acurácia aumentou para 94,55%, com um valor
de Kappa=0,375, ou seja, com concordância considerável. Conclui-se que a pesquisa em áreas sem diagnóstico do RS, revelou presença de cães sororreagentes em quatro municípios do RS: Cachoeira do Sul (2), São Francisco de
Assis (1), Dom Pedrito (1) e Rio Grande (1). Palavras-chave: Leishmania chagasi. Hemoparasita. Zoonose. Diagnóstico.
Abstract
HIRSCHMANN, Lourdes. Canine visceral leishmaniasis : Clinical, laboratorial and
epidemiological investigation in kennel dogs of twelve cities in Rio Grande do Sul. 2013. 65f .Dissertation (Master’s degree) – Post-graduation Program of Parasitology. Federal University of Pelotas, Pelotas – RS.
The canine visceral leishmaniasis (CVL) is a chronic zoonotic systemic disease,
which affects numerous mammals, caused by protozoa Leishimania (Leishimania) chagasi which is transmitted by the hematophagy of the female phlebotominae Lutzomyia longipalis. The CVL shows vast geographical distribution and great
lethality potential. Rio Grande do Sul was considered a non-endemic state. However, in 2008, autochthonous cases of the disease in Western cities of the state were
reported. The aim of this study was to survey the presence of seropositive dogs in kennels in twelve municipalities of Rio Grande do Sul considering the clinical, epidemiological and laboratory aspects therefore being able to early detect a
possible spreading of the disease – encouraging prevention and controlling campaigns in order to avoid future outbreaks. This study was conducted in an area
without diagnosis for the disease, collecting sampling material of 165 dogs from the cities of Alegrete, São Franscico de Assis, Santiago, Dom Pedrito, Bagé, Caçapava do Sul, Cachoeira do Sul, Piratini, Arroio grande, Capão do Leão, Rio Grande and
Camaquã. Animals were submitted to general clinical evaluation and tegumentary and lymphadenopathy injuries. In the laboratory evaluation, CBC, parasitological and
serological examinations were performed. The information of each animal was described in detail in the form of clinical examination and then submitted to EpiInfo version 6.04. Dermatological signs, normocytic normochromic anemia, platelet
changes and neutrophilic leukocytosis were presented by the suspected and confirmed animals. Serological analysis was performed using the techniques of
indirect immunofluorescence (IIF), enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and Dual Plate Platform (DPP). It was found the rate of 33.94% (56/165) reagents for Leishmania chagasi in the IIF, the DPP showed that 6.67% (11/165) were positive,
while 3.03 % (5/165) were positive in both tests (IIF and DPP) and ELISA showed a 6.06% (11/165). In these confirmed by ELISA, five (5/10) were reagents in IIF and
only three (3/10) were positive in DPP, resulting in three seropositive canines according to the updated protocol recommended by the Ministry of Health. A comparison of serological techniques demonstrated that DPP and IIF alone showed
an accuracy of 65.45% while in the analysis of the same tests, considering ELISA as a gold standard, the accuracy of the DPP was 90.91% and IFF showed 66.60%.
However, when considering only the positive results in DPP and IIF, the accuracy increased to 94.55%, with Kappa=0.375, that is, with considerable agreement. Concluding the investigation of non-endemic districts, five seropositive dogs were
revealed: in Cachoeira do Sul (2), in São Francisco de Assis (1), in Dom Pedrito (1) and in Rio Grande (1).
Key-words: Leishmania chagasi. Hemoparasite. Zoonosis. Diagnosis.
Lista de Figuras
Figura 1 – Forma amastigota de Leishmania spp......................................... 18
Figura 2 – Forma promastigota de Leishmania spp.…………………..…...... 18
Figura 3 – Ciclo biológico da Leishmania spp. ………………...........……..... 19
Figura 4 – Vetor Lutzomyia longipalpis ………………….........................….. 20
Figura 5 – Identificação do cão, coleira numerada. Camaquã/RS…………. 25
Figura 6 – Extensão da área em estudo, onde foi desenvolvido trabalho a
campo, Rio Grande do Sul…………………………………...……. 26
Figura 7 – Avaliação e punção dos linfonodos............................................. 27
Figura 8 – Lâmina de IFI LVC. IMUNOTEST®. Verde= reação
positiva........................................................................................ 32
Figura 9 – Placa de ELISA LVC Bio-maguinhos®. Amarelo= reação
positiva........................................................................................ 32
Figura 10 – Teste rápido LVC DPP Bio-maguinhos®. A linha esquerda
representa a banda de teste, indicando um resultado
positivo........................................................................................ 32
Figura 11 – Mapa do estado do Rio Grande do Sul demonstrando as
regiões com casos de Leishmaniose visceral canina, no
período de 2011 a 2012…………………………………………..... 35
Figura 12 – Cão soropositivo IFI, ELISA e DPP. Dom
Pedrito/RS.................................................................................... 36
Figura 13 – Cão soropositivo IFI, ELISA e DPP. São Francisco de
Assis/RS...................................................................................... 36
Figura 14 – Cão soropositivo IFI e ELISA. Cachoeira do
Sul/RS.......................................................................................... 36
Figura 15 – Cão Soropositivo IFI e ELISA. Cachoeira do
Sul/RS.......................................................................................... 36
.
Lista de Tabelas
Tabela 1 – Medidas de efeito dos testes diagnósticos, tabela de contingência
2 X 2.................................................................................................... 28
Tabela 2 – Prevalência de anticorpos anti-Leishmania chagasi, na IFI
(Imunofluorescência Indireta), DPP (Dual Plate Plataform) e ELISA
(Ensaio Imunoenzimático) em 165 cães pertencentes aos 12
municípios pesquisados no Rio Grande do Sul, RS, período de
janeiro de 2011 a dezembro de
2012……………………………………………………………………....... 31
Tabela 3 – Comparação de métodos sorológicos utilizando associações de
protocolos dos testes de IFI, DPP e ELISA, realizados nos 165 cães
provenientes de área indene de Leishmaniose visceral canina no
estado do Rio Grande do Sul……………………………………………. 33
Tabela 4 – Aspectos clínicos dos cinco cães soropositivos para L. chagasi
pertencentes a quatro municípios de área indene no estado do Rio
Grande do Sul, no período de 2011 a
2012……………………………………………………………………….... 34
Tabela 5 – Aspectos epidemiológicos de cinco cães soropositivos para L.
chagasi pertencentes aos quatro municípios de área indene no
estado do Rio Grande do Sul, no período de 2011 a
2012……………………………………………………………………….... 35
Lista de Abreviaturas e Siglas
µG – Micrograma
µM – Micrometro
A – Acurácia
A.– Arroio
BA – Bahia
CCZ – Centro de Controle de Zoonoses
CE – Ceará
CEVS – Centro Estadual de Vigilância em Saúde
COL. – Coleta
CEEA – Comitê de Ética em Experimentação Animais
CFMV – Conselho Federal de Medicina Veterinária
CRMV – Conselho Regional de Medicina Veterinária
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
DPPIFI – DPP + IFI
DPP – Dual Plate Plataform
EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético (anticoagulante)
EIE – Ensaio Imuno Enzimático
ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ES – Especificidade
et al. – e colaboradores
FN – Falso negativo
FP – Falso positivo
FNS – Fundação Nacional de Saúde
g/dL – Grama por decilitro
HE – Hematoxilina e eosina
IGG – Imunoglobulina G
IFI – Imunofluorescência indireta
IND – Indeterminado
KM – Quilômetros
LACEN – Laboratório Central do Estado
L. – Leishmania (gênero)
LTA – Leishmaniose tegumentar americana
LVC – Leishmaniose visceral canina
MA – Maranhão
MS – Mato Grosso do Sul
MG – Minas Gerais
MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MS. – Ministério da Saúde
NNN – Novy – Macneal – Nicolle
ONG’s – Organizações Não-Governamentais
PA – Prevalência aparente
PAAF – Punção aspirativa por agulha fina
PA – Pará
PCR – Reação em Cadeia pela Polimerase
pH – Unidade de acidez/alcalinidade
PI – Piauí
PREV – Prevalência
PPT – Proteína plasmática total
PT – Portugal
PV – Prevalência verdadeira
RJ – Rio de Janeiro
RN – Rio Grande do Norte
RS – Rio Grande do Sul
S. FCO. ASSIS – São Francisco de Assis
SP – São Paulo
SE – Sensibilidade
SRD – Sem raça definida
TO – Tocantins
TPC – Tempo de preenchimento capilar
TR – Teste rápido
UFPel – Universidade Federal de Pelotas
UI – Unidade internacional
VPN – Valor preditivo negativo
VPP – Valor preditivo positivo
Қ – Coeficiente de correlação kappa
Sumário
INTRODUÇÃO………………………………………………………………………… 15
1 REVISÃO DE LITERATURA………………………………………………………. 17
1.1 Leishmaniose visceral …………………………………………………………… 17
1.1.1 Histórico………………………………………………………………………….. 17
1.1.2 Taxonomia………………………………………………………………………. 18
1.1.3 Morfologia e ciclo evolutivo……………………………………………………. 18
1.1.4 Vetores e reservatórios………………………………………………………… 19
1.1.5 Transmissão…………………………………………………………………….. 20
1.1.6 Distribuição geográfica……………………………………………………….… 21
1.1.7 Aspectos clínicos da doença………………………………………………… .. 21
1.1.8 Métodos diagnósticos………………………………………………………..… 22
2 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 25
2.1 Animais estudados......................................................................................... 25
2.2 Delineamento................................................................................................. 25
2.3 Exame clínico................................................................................................. 26
2.4 Exame parasitológico…........................................................………………… 26
2.5 Hemograma.................................................................................................... 27
2.6 Sorologia........................................................................................................ 27
2.7 Análise estatística.......................................................................................... 28
3 RESULTADOS................................................................................................. 30
4 DISCUSSÃO.................................................................................................. ... 37
5 CONCLUSÕES……….....………………………………………………………..… 46
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……….……………………………………… 47
ANEXOS…………………………………………………..…………………………… 55
APENDICES......................................................................................................... 57
15
INTRODUÇÃO
A leishmaniose visceral é uma doença parasitária crônica, cuja forma
visceral (LV) no Brasil, é causada pela Leishmania (Leishmania) chagasi (Maia-
Elkhoury et al, 2008). A LV foi uma zoonose caracterizada como doença de caráter
eminentemente rural. Recentemente, expandiu-se para áreas urbanas e se tornou
problema de saúde pública no Brasil e em outras áreas do continente americano,
sendo uma endemia em franca expansão. Atualmente, encontra-se entre as seis
endemias consideradas prioritárias no mundo (BRASIL, 2011a).
É uma doença infecciosa sistêmica considerada importante endemia pela
Organização Mundial de Saúde, com ampla distribuição geográfica e caracterizada
pelo alto potencial de letalidade (MOREIRA, 2012). Na América Latina 90% dos
casos ocorrem no Brasil, sendo que a maior prevalência da doença é no nordeste e
a menor na região Sul (BRASIL, 2011a).
Os hospedeiros são vários mamíferos, sendo que o cão é o principal
hospedeiro doméstico, e existem os hospedeiros silvestres como canídeos
silvestres, roedores, gambá e a preguiça (VILELA et al., 2013).
A transmissão da L. chagasi para o homem e outros hospedeiros
vertebrados ocorre durante a hematofagia de Lutzomyia longipalpis (LAINSON &
RANGEL, 2005).
As medidas de controle incluem o diagnóstico e tratamento dos casos
humanos, combate ao vetor e a identificação e eutanásia dos reservatórios,
particularmente os cães (RIBEIRO, 2007). O tratamento de cães não é uma medida
recomendada, pois não diminui a importância do cão como reservatório do parasito.
(BRASIL, 2006).
O diagnóstico baseia-se nos dados epidemiológicos (área endêmica ou área
silenciosa), analisando aspectos clínicos e os exames laboratoriais. Os exames
recomendados pelo Ministério da Saúde até 2011 eram ELISA como exame de
triagem e IFI como confirmatório. A partir de 2012, o Ministério da Saúde apresentou
uma nota técnica utilizando um teste rápido imunocromatográfico como triagem e
ELISA como teste confirmatório da doença, sendo este protocolo o que apresentou
maior eficácia.
Até novembro de 2008, o Rio Grande do Sul era considerado uma área sem
ocorrência de LV, porém foi notificado um caso suspeito de LVC em um cão
16
proveniente de São Borja. A seguir, houve desencadeamento de investigação
epidemiológica neste e em outros municípios, registrando a presença de Lutzomyia
longipalpis e de cães sororreagentes com caracterização de Leishmania chagasi. Os
municípios de São Borja e Uruguaiana foram considerados área de transmissão,
sendo encontrado o vetor, casos de LV em humanos e caninos autóctones, com
caracterização do parasito (CEVS/RS, 2011).
Neste trabalho foi realizado um levantamento da presença de cães
soropositivos em área indene do RS, especificamente de municípios da região Sul
até os municípios da fronteira oeste do estado, onde ocorreram os primeiros focos
da doença, compreendendo uma área de 148.000 km², onde se localizam 68 dos
496 municípios do RS. Na área em estudo, entrou-se em contato telefônico com as
secretarias de saúde de todos os 68 municípios, muitas alegaram que não possuíam
canil público, outras se recusaram a participar da pesquisa devido à preocupação
em descobrir a presença da doença. Dos contatados, somente doze municípios
(17,6%) aceitaram participar da pesquisa: Alegrete, São Francisco de Assis,
Santiago, Dom Pedrito, Bagé, Caçapava do Sul, Cachoeira do Sul, Piratini, Arroio
Grande, Capão do Leão, Rio Grande e Camaquã, sendo coletadas amostras de 165
cães e avaliados os aspectos clínicos, laboratoriais e epidemiológicos.
17
1 REVISÃO DE LITERATURA
1.1 Leishmaniose visceral
1.1.1 Histórico
A Leishmaniose visceral (L.V.) foi descrita na Grécia em 1835 quando então
era denominada "ponos" ou "hapoplinakon". Foi na Índia em 1869 que recebeu o
nome "kala-jwar" que quer dizer febre negra ou "kala-azar" que significa pele negra
em virtude do discreto aumento da pigmentação da pele ocorrido durante a doença
(MARZOCHI et al.,1981).
Em 1913, Migone, no Paraguai, descreveu um caso de LV em material de
necropsia de um paciente vindo do Brasil, da cidade de Boa Esperança, Mato
Grosso (ALENCAR et al., 1983). No entanto, a LV no Brasil foi relatada pela primeira
vez em 1934, sendo que o primeiro surto foi em 1954 na cidade de Sobral, no
estado do Ceará (BRAGA, 2009). A partir de um estudo realizado para o diagnóstico
e distribuição da febre amarela no Brasil, foram encontrados 41 casos positivos para
Leishmania spp., sendo identificados em lâminas de viscerotomias praticadas post-
mortem, em indivíduos oriundos das regiões Norte e Nordeste (PENNA et al., 1934
apud BRASIL, 2006).
A seguir, Lutzomyia longipalpis foi incriminado como espécie vetora e foram
descobertos os primeiros casos da infecção em cães, o grupo de Evandro Chagas
contribuiu significativamente para o estudo da LV através da observação em animais
domésticos (7 cães e 1 gato) infectados por L.(L.) chagasi e constatou que o inseto
hematófago encontrado freqüentemente dentro e nos arredores dos domicílios dos
pacientes com LV era o flebotomíneo da espécie Lutzomyia longipalpis (CHAGAS,
1936).
De acordo com CRMV/MS (2002) o cão é o principal reservatório e
geralmente após casos de infecção em cães surgem casos humanos.
Lainson et al. (1987) acreditam que a L. chagasi seja realmente uma espécie
autóctone da América do Sul, pois encontraram altas taxas de infecção em canídeos
originários da Amazônia.
18
Atualmente Leishmania spp. são observadas no mundo todo, na Ásia, na
Europa, no Oriente Médio, na África e nas Américas (BRASIL, 2006).
1.1.2 Taxonomia
Reino: Protista
Sub-reino: Protozoa
Filo: Sarcomastigophora
Sub-filo: Mastigophora
Classe: Zoomastigophorea
Ordem: Kinetoplastida
Família: Tripanosomatidae
Gênero: Leishmania
Espécie: Leishmania chagasi
1.1.3 Morfologia e Ciclo evolutivo
Leishmania spp. possui duas formas de desenvolvimento: a promastigota
flagelada e a amastigota intracelular (SOUZA, 2004). A Leishmania é um parasita
com ciclo de vida digenético alternando entre um hospedeiro mamífero e insetos
vetores (DOSTÁLOVÁ et al., 2012). Durante o ciclo de vida a Leishmania foi se
adaptando a ambientes variados e heterogêneos em relação ao inseto vetor e
hospedeiros vertebrados, que diferem no pH, temperatura e outros parâmetros
(VOLF et al., 2008). Amastigota (3-6 µm): arredondada e imóvel, aflagelada,
conforme Figura 1. Promastigota (15-23 µm): flagelada, móvel, vive no meio
extracelular, na luz do trato digestivo, conforme Figura 2.
Figura 1 – Forma amastigota de Leishmania spp.
Fonte: Atlas de parasitologia Clínica Viqar Zaman, 1979.
Figura 2 – Forma promastigota de
Leishmania spp. Fonte: www.fiocruz.br
19
Quanto ao ciclo evolutivo do parasita (Fig. 3), a infecção no hospedeiro
invertebrado ocorre quando a fêmea do vetor durante o repasto sanguíneo ingere
macrófagos parasitados de um vertebrado infectado. (VOLF et al., 2008). No interior
do inseto, as amastigotas diferenciam-se em promastigotas, dividem-se e prendem-
se nas microvilosidades intestinais do vetor, desta forma não serão eliminadas
durante a digestão (SILVA, 2006). No flebotomíneo, encontramos a forma
promastigota, divide-se por mitose e diferencia-se na forma metacíclica, forma
infectante, que migra para a probóscide do inseto e é inoculada no hospedeiro
invertebrado, nos mamíferos, no repasto sanguíneo. Nos hospedeiros mamíferos, a
forma metacíclica é fagocitada por macrófagos (WINTER, 2012).
Figura 3 – Ciclo biológico da Leishmania spp. (adaptado de www.cdc.gov).
1.1.4 Vetores e reservatórios
Flebotomíneos são vetores de Leishmania spp, (VOLF et al., 2008), e são
classificados como dípteros, família: Psychodidae, sub-família: Phlebotominae
(DOSTÁLOVÁ et al., 2012). Nas Américas a principal espécie vetora é Lutzomya
longipalpis (CEVS/RS, 2011), Figura 4.
20
Figura 4 – Vetor Lutzomyia longipalpis Fonte: Manual de LV. MS, 2006.
São insetos pequenos (1,5 - 2 mm de comprimento), principalmente
encontrados em regiões tropicais e subtropicais. Existem dois gêneros de
importância médica, Phlebotomus e Lutzomyia (KILLICK-KENDRICK R., 1999 apud
DOSTÁLOVÁ et al., 2001).
Os principais hospedeiros domésticos da LV são: homem e o cão, enquanto
que os hospedeiros silvestres são: canídeos silvestres (raposas) e marsupiais
(gambá), conforme VILELA (2013).
Segundo Thomé (1999) as leishmanioses são doenças que acometem o
homem e várias espécies animais, entre elas o cão, o gato (mais raramente), e
diferentes espécies de animais silvestres.
1.1.5 Transmissão
O desiquilibrio ecológico e a presença do cão como reservatório doméstico
suscetível, colaborou com a urbanização da LVC e a domiciliação de insetos
transmissores de zoonoses, inclusive vetores responsáveis pela transmissão da
leishmaniose (AMORÁ, 2006).
No Brasil, duas espécies, até o momento, estão relacionadas com a
transmissão da doença, Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia cruzi. A primeira espécie
é considerada a principal espécie transmissora de L. chagasi no Brasil e,
recentemente, Lutzomyia cruzi foi incriminada como vetora no estado do Mato
21
Grosso do Sul. Nas regiões Norte e Nordeste, Lutzomia longipalpis foi encontrado
originalmente nas matas participando do ciclo primário de transmissão da doença
(BRASIL, 2003).
1.1.6 Distribuição geográfica
Tem ampla distribuição ocorrendo na Ásia, na Europa, no Oriente Médio, na
África e nas Américas, onde também é denominada Leishmaniose visceral
americana (LVA) ou Calazar neo-tropical. Na América Latina, a doença já foi descrita
em pelo menos 12 países, sendo que 90% dos casos ocorrem no Brasil (BRASIL,
2006).
Em 2010, a região Nordeste teve 47,1% dos casos, seguida pelas regiões
Norte (18,0%), Sudeste (17,8%), Centro-Oeste (8,6%) e Sul (0,1%). Atualmente,
está distribuída em 21 Unidades Federadas, atingindo as cinco regiões brasileiras
(BRASIL, 2011a).
O Rio Grande do Sul era considerado área indene para LV até 2008, quando
foram registrados casos autóctones em São Borja e Uruguaiana (CEVS/RS, 2011).
1.1.7 Aspectos clínicos da doença
É uma doença que possui apresentação clínica variada, de formas
assintomáticas até o quadro clássico da parasitose, evidenciado pela presença de
febre, anemia, hepatoesplenomegalia, além de tosse seca, leucopenia e
hipergamaglobulinemia (OLIVEIRA et al., 2010).
Classicamente os cães apresentam lesões cutâneas, descamação e
eczemas, principalmente no espelho nasal e orelhas. Nos estágios mais avançados
os cães podem apresentar onicogrifose, esplenomegalia, linfoadenopatia, alopecia,
dermatites, ceratoconjuntivite, coriza, apatia, diarréia, hemorragia intestinal, edemas
de membros e vômitos (ARRUDA, 2009).
22
1.1.8 Métodos diagnósticos
O diagnóstico em cães pode ser feito com base nas características clínicas,
confirmado por métodos laboratoriais parasitológicos e imunológicos (BONATES,
2003). Através dos sinais clínicos e fatores epidemiológicos pode-se suspeitar de
leishmaniose, porém são necessários exames laboratoriais específicos para
confirmar o diagnóstico, citados abaixo:
Isolamento em cultura;
Exame direto parasitológico;
IFI
ELISA
Teste rápido imunocromatográfico
PCR
O isolamento em cultura é feito através da inoculação em meios de cultura
especiais, contendo agar e sangue de coelho, o meio geralmente utilizado é o NNN,
(Neal, Novy, Nicolle) que pode ser acrescido de fase líquida constituída de
Schnneider’s medium, com 1.000 UI de penicilina/mL e 100µg de sulfato de
gentamicina/Ml. Leishmania spp. são cultivadas entre 24-26°C e observadas em
microscopia óptica comum ou invertida, semanalmente, até quatro semanas. Os
tubos positivos devem ser encaminhados para laboratórios de referência para
identificação da espécie (BRASIL, 2006).
O exame parasitológico serve para demonstração direta do parasita, pode
ser feito através de punção de linfonodo, baço e medula óssea (SUNDAR et al.,
2002). Além disso, pode ser feito imprinting durante necropsias, ou seja, impressões
de fragmentos de tecidos de baço são realizadas em lâminas de microscopia,
fixadas em metanol e coradas pelo Giemsa. Analisa-se até 100 campos
microscópicos na objetiva de 100x e os campos positivos com formas amastigotas
são contados. A intensidade do parasitismo é graduada da seguinte forma: até 10%
dos campos positivos (+); de 11 a 30% (++); 31 a 60% (+++); 65 a 100% (++++). Os
tecidos dos animais que não apresentarem amastigotas em nenhum dos campos
são considerados negativos (–) (TASCA et al., 2009).
Também se pode realizar exames histológicos – HE: Amostras de tecidos de
baço de animais são coletadas e fixadas em solução de formalina tamponada a 10%
e pH 7,4, emblocadas em parafina para o exame histológico de rotina e coradas com
23
hematoxi lina e eosina (HE). Para avaliação do grau parasitário adota-se o seguinte
procedimento: Tecido negativo: ausência de amastigotas (–). Tecido suspeito (+)
quando ha lesões de fraca intensidade que não permitia uma avaliação conclusiva,
ou quando o grau de contraste da coloração não é suficiente para permitir uma
visualização perfeita das amastigotas, se presentes. Tecido fracamente positivo
(++), quando apenas alguns macrófagos são visualizados com amastigotas, mas
concentrados apenas em algumas áreas. Tecido moderadamente positivo (+++),
quando em torno de 50% do tecido está comprometido com macrófagos infectados.
Fortemente positivo (++++), quando a secção tecidual analisada encontra-se quase
que completamente comprometida, tanto pelas lesões, quanto pela presença dos
macrófagos parasitados (TASCA et al., 2009).
Apesar de discordâncias entre alguns autores (FERRER, 1999; KOUTINAS
et al., 2001; MOREIRA et al., 2002) o exame parasitológico é considerado, ainda, o
teste confirmatório para o diagnóstico da doença. A observação direta de formas
amastigotas do parasito em esfregaços de aspirado de linfonodo, medula óssea,
baço, fígado, pele e sangue corados por Giemsa, Leishman ou Panótico® é uma
forma segura, simples, rápida e pouco traumática para o diagnóstico da
enfermidade. A especificidade desse método é de 100%, mas a sensibilidade
depende do grau do parasitismo, do tipo de material biológico coletado, do seu
processamento e coloração, além do observador. A sensibilidade pode ser de 50% a
83% em amostras de medula óssea, entre 30% e 85% em amostras de linfonodo e
entre 71% a 91% quando ambos os tecidos (FERRER, 1999; KOUTINAS et al.,
2001) estão combinados. Quando o parasitismo é intenso não há problemas para
um diagnóstico rápido e seguro; contudo, em muitos casos, especialmente em
animais assintomáticos, nos quais apenas poucas formas amastigotas estão
presentes nos tecidos, o diagnóstico parasitológico torna-se difícil e duvidoso. Esse
problema pode ser solucionado com a utilização de técnicas mais sensíveis para a
detecção de parasitos, tais como a imunofluorescência direta e a imunohistoquímica
(LAURENTI, 2009).
Existem diversos exames laboratoriais citados na literatura, porém no Brasil,
os testes mais utilizados no diagnóstico de LV humana e canina são a IFI e ELISA,
sendo considerado, sobretudo este último, teste de escolha para inquéritos
populacionais (GONTIJO et al., 2004).
24
IFI tem sido amplamente utilizada para diagnóstico de várias doenças
parasitárias, podendo apresentar reações cruzadas principalmente com a
leishmaniose tegumentar americana (LTA) e a doença de Chagas. O resultado
considerado sororreagente é aquele que possua título igual ou superior ao ponto de
corte que é a diluição de 1:40 (BRASIL, 2006).
ELISA consiste na reação de anticorpos presentes nos soros com antígenos
solúveis e purificados de Leishmania spp. obtidos a partir de cultura in vitro. Este
antígeno é adsorvido em microplacas, e os soros diluídos são adicionados
posteriormente (BRASIL, 2006).
O teste rápido imunocromatográfico (TR DPP® LVC – Bio-Manguinhos) é um
teste de triagem para detecção de anticorpos específicos para L. chagasi, em soro,
plasma ou sangue total venoso em cães, este teste contem proteínas recombinantes
K28 de L. chagasi e a Proteína A Conjugada ao Ouro Coloidal, adsorvidos em
Membrana de Nitrocelulose (BIO-MANGUINHOS, 2011).
Exames complementares como os testes moleculares (PCR),
histopatológicos e imunohistoquímicos estão disponíveis nos Laboratórios de
Referência Nacional para elucidação de diagnóstico e caracterização de espécie
(ARRUDA, 2009).
25
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Animais estudados:
Foram estudados cães procedentes de canis ou de ONG’s de 12 municípios
do Rio Grande do Sul. Foram selecionados aleatoriamente cerca de 15 cães por
canil, utilizou-se apenas focinheira para contenção dos animais. Os animais foram
identificados por coleiras numeradas e fotografados para posterior identificação,
conforme Figura 5. Este estudo foi aceito pelo Comitê de Ética em Experimentação
Animal (CEEA) da Universidade Federal de Pelotas (CEEA/UFPEL 2134).
Figura 5 – Identificação do cão, coleira numerada. Camaquã/RS
2.2 Delineamento:
Foi traçada uma linha imaginária do município de Rio Grande ao município
de São Borja (540 Km em linha reta), traçando-se duas linhas paralelas 137km
acima e abaixo da linha imaginária, resultando em uma área de cerca de 148.000
Km2, conforme mapa (Figura 6). Na área de estudo, foram selecionados 12
municípios, dos quais foi autorizada a pesquisa em canis municipais ou ONG’s,
através de um termo de consentimento livre e esclarecido, conforme Apêndice A.
Dentre os municípios consultados na área de estudo, os que autorizaram a pesquisa
foram Alegrete, São Francisco de Assis, Santiago, Dom Pedrito, Bagé, Caçapava do
26
Sul, Cachoeira do Sul, Piratini, Arroio Grande, Capão do Leão, Rio Grande e
Camaquã, onde se totalizou a coleta de material biológico de 165 animais.
Figura 6 – Extensão da área em estudo, onde foi desenvolvido trabalho a campo, Rio Grande do Sul.
2.3 Exame clínico:
Foram coletadas amostras de sangue de cães pertencentes aos canis
municipais ou ONGs dos 12 municípios, no período de janeiro de 2011 a dezembro
de 2012. Os animais foram submetidos à avaliação clínica geral (frequência cardíaca
e respiratória, temperatura retal, avaliação dos linfonodos, coloração das mucosas e
avaliação dermatológica), conforme Apêndice B.
2.4 Exame parasitológico:
O diagnóstico de LVC foi baseado na observação direta de formas
amastigotas de Leishmania spp. através da PAAF (Punção Aspirativa Por Agulha
fina) de linfonodos palpáveis (aspirado de linfonodo poplíteo ou submandibular),
conforme Figura 7. A punção foi executada com uma agulha hipodérmica 25 x 7 mm
e uma seringa descartável de 5 mL acoplada. A agulha foi descartada da seringa, o
êmbolo repuxado e a agulha acoplada à seringa para então despejar o material em
27
lâminas de vidro, distribuído com ajuda de outra lâmina no formato de squashes.
Após secar ao ambiente, as lâminas foram coradas pelo método Panótipo Rápido.
Figura 7 – Avaliação e punção dos linfonodos.
2.5 Hemograma:
A coleta de sangue para avaliação do hemograma foi realizada por punção
da veia cefálica e coletados 4 mL de sangue, em tubos com anticoagulante (EDTA).
O material foi encaminhado para ser realizado o hemograma completo no
Laboratório de Análises Clínicas da UFPel.
2.6 Sorologia:
Também foram coletados 4 mL de sangue em tubos sem anticoagulante
para análise sorológica. Estas amostras foram acondicionadas em caixas
isotérmicas e transportadas ao laboratório do CCZ/UFPel, onde o soro foi separado
e armazenado a -20ºC até o seu processamento.
Os soros foram avaliados pela Imunofluorescência indireta (IFI) usando o kit
de diagnóstico comercial IMUNOTESTE®, que contém o substrato antigênico de
Leishmania chagasi, este teste foi realizado de acordo com o protocolo do
fabricante. Também foi feito ELISA (EIE LVC Bio-manguinhos®), que contém
antígenos solúveis e purificados de Leishmania major like e o teste rápido (DPP LVC
Bio-manguinhos®), utilizando proteínas recombinantes K28 de Leishmania chagasi e
a Proteína A Conjugada ao Ouro Coloidal, adsorvidos em Membrana de
Nitrocelulose. ELISA e DPP foram realizados de acordo com o protocolo do
fabricante, (Anexo A).
28
2.7 Análise estatística:
Todos resultados foram confrontados, comparando os diferentes canis de
cada região, diferenciando os sinais clínicos e exames complementares através do
programa EpiInfo versão 6.04 (DEAM et al., 1994), efetuando-se o teste χ2 e análise
multivariada nos fatores significantes no χ2, bem como as medidas de associação
(Sensibilidade, Especificidade, Valor Preditivo Positivo e Negativo, Acurácia e
coeficiente de correlação kappa).
Tabela 1 – Medidas de efeito dos testes diagnósticos, tabela de contingência 2 X 2.
TESTE PADRÃO OURO TOTAL
DIAGNÓSTICO Positivos Negativos
Positivos
VP(a) FP(b)
Erro tipo I ou Erro alfa
a + b
Negativos
FN(c)
Erro tipo II ou Erro beta
VN(d)
c + d
TOTAL a + c b + d a+b+c+d
Sensibilidade (Se) - É definida como a probabilidade de um teste ser
positivo, em pacientes com a doença em estudo. Proporção de VP que um teste é
capaz de detectar.
Se =
Especificidade (Es) - É definida como a probabilidade de um teste ser
negativo, em pacientes livres da doença em estudo. Proporção de VN que um teste
é capaz de detectar.
Es =
Valor Preditivo Positivo (VPP) - É a probabilidade de doença em um
animal com um resultado positivo no teste.
VPP =
Valor Preditivo Negativo (VPN) - É a probabilidade de que um animal não
tenha a doença quando o resultado do teste é negativo.
29
VPN =
Acurácia (A) - É a proporção de todos os resultados positivos e negativos
corretos de um teste.
A =
Falso-Positivo (FP) – Número de indivíduos com resultado positivo no teste
que não confirmam pelo padrão ouro. Também chamado de Erro tipo I ou Erro alfa
do teste.
Falso-Negativo (FN) – Número de indivíduos com resultado negativo no
teste que não confirmam pelo padrão ouro. Também chamado de Erro tipo II ou Erro
beta do teste.
Prevalência Verdadeira (PV) – É a proporção de indivíduos positivos
detectados pelo padrão ouro.
PV =
Prevalência Aparente (PA) – É a proporção de indivíduos positivos
detectados pelo teste.
PA =
Coeficiente de correlação kappa (Қ) - O Teste Kappa é uma medida de
concordância inter-testes e mede o grau de concordância além do que seria
esperado tão somente pelo acaso. Para descrevermos se há ou não concordância
entre dois ou mais métodos de classificação, utilizamos a medida Kappa que é
baseada no número de respostas concordantes, ou seja, no número de casos cujo
resultado é o mesmo entre os testes. Esta medida de concordância assume valor
máximo igual a 1, que representa total concordância ou ainda pode assumir valores
próximos e até abaixo de 0, os quais indicam nenhuma concordância.
Os valores de kappa são avaliados de acordo com os parâmetros abaixo:
Concordância pobre: 0
Concordância ligeira: 0-0,20
Concordância considerável: 0,21-0,40
Concordância moderada: 0,41-0,60
Concordância substancial: 0,61-0,80
Concordância excelente: 0,81-1
30
3 RESULTADOS
Foram realizados três testes: IFI, DPP e ELISA, conforme o protocolo antigo
e o protocolo atual, descrito pelo Ministério da Saúde para LVC. Dos 165 cães
avaliados, constatou-se que 33,94% (56/165) reagiram para Leishmania chagasi na
IFI; 6,67% (11/165) foram reagentes no DPP, 3,03% (5/165) foram reagentes em
ambos os testes (IFI e DPP) e 6,06% (10/165) no ELISA. Destes confirmados no
ELISA, cinco (5/10) foram reagentes na IFI, e apenas três (3/10) foram positivos no
DPP, resultando em três cães soropositivos conforme o protocolo atual preconizado
pelo Ministério da Saúde. Os três cães soropositivos no teste de ELISA e DPP
(protocolo atual) eram provenientes de Dom Pedrito, Rio Grande e São Francisco de
Assis. Os cinco cães positivos no ELISA e IFI (protocolo antigo) incluíam os três
cães reagentes no protocolo antigo e procedentes de Cachoeira do Sul (tab. 2).
Depois de confirmados estes resultados, o serviço de vigilância epidemiológica foi
notificado, conforme Apêndice C.
Na tabela 3, podem ser observadas as medidas de efeito (valor preditivo
positivo; valor preditivo negativo; sensibilidade; especificidade; acurácia; coeficiente
de correlação kappa) ao confrontarem-se três testes de diagnóstico (ELISA; IFI;
DPP): Avaliando o resultado de dois testes em série (triagem e confirmatório), e
também na associação dos resultados positivos de dois testes de triagem (IFI+DPP)
com o teste confirmatório (ELISA).
Na análise das técnicas sorológicas verificou-se que ao os resultados
positivos de dois testes DPP + IFI (DPPIFI) com o padrão ouro ELISA, constatou-se
uma sensibilidade de 30,0%, uma especificidade de 98,71% e valores de VPP de
60,0% e VPN de 95,93%. A associação encontrou uma acurácia de 94,55% e um
coeficiente de correlação kappa de 0,375, demonstrando uma melhor combinação
do que a recomendada pelo protocolo atual (DPP+ELISA) que apresentou uma
sensibilidade de 30,0%, uma especificidade de 94,84% e valores de VPP de 27,27%
e VPN de 95,45%. A associação encontrou uma acurácia de 90,91% e um
coeficiente de correlação kappa de 0,237 (tab. 3).
31
Tabela 2 – Prevalência de anticorpos anti-Leishmania chagasi, na IFI
(Imunofluorescência Indireta), DPP (Dual Plate Plataform) e ELISA (Ensaio
Imunoenzimático) em 165 cães pertencentes aos 12 municípios pesquisados no Rio
Grande do Sul, RS, período de janeiro de 2011 a dezembro de 2012.
MUNICÍPIOS ELISA IFI DPP IFI1 DPP2 IFI3 Prev 1 Prev 2 Prev 3
Col. Pos Neg Ind Pos Neg. Pos Neg. ELISA ELISA DPP
Alegrete 15 0 15 0 3 12 2 13 0 0 0 0.00 0.00 0.00
A. Grande 15 0 14 1 6 9 3 12 0 0 2 0.00 0.00 13,33
Bagé 15 0 15 0 5 10 0 15 0 0 0 0.00 0.00 0.00
Caçapava Sul 15 3 12 0 1 14 0 15 0 0 0 0.00 0.00 0.00
Cachoeira Sul 9 2 7 0 6 3 0 9 2 0 0 22,22 0.00 0.00
Camaquã 17 1 16 0 6 11 1 16 0 0 0 0.00 0.00 0.00
Capão Leão 18 0 17 1 6 12 1 17 0 0 0 0.00 0.00 0.00
Dom Pedrito 14 1 13 0 3 11 2 12 1 1 1 7,14 7,14 7,14
Piratini 7 0 7 0 5 2 0 7 0 0 0 0.00 0.00 0.00
Rio Grande 10 1 9 0 7 3 1 9 1 1 1 10,00 10,00 10,00
S. Fco. Assis 15 1 14 0 7 8 1 14 1 1 1 6,67 6,67 6,67
Santiago 15 1 12 2 1 14 0 15 0 0 0 0.00 0.00 0.00
TOTAL 165 10 151 4 56 109 11 154 5 3 5 3,03 1,82 3,03 1 Protocolo Ministério da Saúde até 2012 2 Protocolo Ministério da Saúde depois de 2012 3 Duas técnicas, usando o teste confirmatório IFI e o triagem teste rápido DPP Col. = número de coletas
Nas figuras 8, 9 e 10 podem ser verificados os resultados positivos
encontrados neste trabalho, utilizando os testes de IFI, ELISA e DPP,
respectivamente. Na IFI foram considerados positivos soros com títulos ≥ 1:40,
conforme preconizado pelo fabricante do kit. O ELISA foi considerado reagente (ou
positivo) quando apresentou densidade óptica maior que o ponto de corte (cut off)
encontrado através do leitor de placas, o ponto de corte é feito a partir de um
cálculo:
Cálculo do Cut-Off (CO)
XCN: Média da DO dos CN
CO=XCN X 2 = 0,186
FC=CO X 1,2 = 0, 223
A DO entre 0,186 e 0,223 foram os cães sororreagentes indeterminados,
abaixo de 0,186 foram os cães não reagentes e acima de 0,223 foram considerados
cães sororreagentes no ELISA. Este teste foi realizado com apoio do LACEN/RS. Já
no DPP foi considerado positivo quando apareceu duas linhas, a linha do controle e
a linha teste, e foi considerado negativo quando só apareceu a linha do controle.
32
Figura 8 – Lâmina de IFI LVC. IMUNOTEST®.
Coloração Verde= reação positiva
Figura 9 – Placa de ELISA LVC Bio-maguinhos
®.
Coloração Amarelo= reação positiva.
Figura 10 – Teste rápido LVC DPP Bio-maguinhos®
A linha esquerda representa a banda de teste, indicando um resultado positivo.
33
Tabela 3 – Comparação de métodos sorológicos utilizando associações de protocolos dos testes de IFI, DPP e ELISA, realizados nos 165 cães provenientes de área indene de Leishmaniose visceral canina no estado do Rio Grande do Sul.
IFI DPP
DPP Pos Neg Total PV PA, FP FN VPP VPN Se Es A Қ IFI Pos Neg Total
Pos 5 6 11 Pos 5 51 56 Neg 51 103 154 Neg 6 103 109
Total 56 109 165 Total 11 154 165
IFI/ DPP 33,94 6,67 54,54 33,12 45,45 66,88 8,93 94,50 65,45 0,042 DPP/ IFI 6,67 33,94 91,07 5,50 8,93 94,50 45,45 66,88 65,45 0,042
ELISA/ DPP 6,06 6,67 72,73 4,55 27,27 95,45 30,0 94,84 90,91 0,237
ELISA/ DPPIFI 6,06 3,03 40,0 4,38 60,0 95,93 30,0 98,71 94,55 0,375
ELISA/ IFI 6,06 33,94 91,07 4,59 8,93 95,41 50,0 67,1 66,06 0,054 ELISA2/ DPPIFI 6,21 3,11 40,0 4,49 60,0 95,51 30,0 98,68 94,41 0,374
ELISA2/ DPP 6,21 6,83 72,73 4,67 27,27 95,33 30,0 94,7 90,68 0,236 ELISA2/ IFI 6,21 34,78 91,07 4,76 8,93 95,24 50,0 66,23 65,22 0,052
ELISA ELISA ELISA
DPP Pos Neg Total DPPIFI Pos Neg Total IFI Pos Neg Total
Pos 3 8 11 Pos 3 2 5 Pos 5 51 56 Neg. 7 147 154 Neg. 7 153 160 Neg. 5 104 109
Total 10 155 165 Total 10 155 165 Total 10 155 165
ELISA2 ELISA2 ELISA2 DPP Pos Neg Total DPPIFI Pos Neg Total IFI Pos Neg Total
Pos 3 8 11 Pos 3 2 5 Pos 5 51 56
Neg. 7 143 150 Neg. 7 149 156 Neg. 5 100 105
Total 10 151 161 Total 10 151 161 Total 10 151 161
DPPIFI= soros reagentes tanto na IFI quanto no DPP; Pos= Positivo; Neg = Negativo; PV = Prevalência Verdadeira, PA = Prevalência Aparente; FP= Falso Positivo; FN= Falso Negativo; VPP = Valor Preditivo Positivo; VPN = Valor Preditivo Negativo; Se = Sensibilidade; Es=Especificidade; A=Acurácia; Қ = coeficiente de
correlação kappa; ELISA2=Resultado do ELISA não considerando os quatro soros com valor indeterminado.
34
Os cães soropositivos apresentaram alterações hematológicas variadas
como: trombocitopenia e eosinofilia (Dom Pedrito), anemia normocítica
normocromica e trombocitopenia (Rio Grande), neutrofilia e eosinopenia (Cachoeira
do Sul) e anemia normocítica normocrômica, trombocitose e leucocitose com
neutrofilia (Cachoeira do Sul). Entretanto o cão soropositivo de São Francisco de
Assis não apresentou alteração no hemograma.
Na avaliação do exame direto, através do esfregaço do conteúdo dos
linfonodos não foram observadas amastigotas. No entanto, na palpação dos
linfonodos 60% (3/5) dos cães soropositivos apresentaram alteração, como
linfonodos aumentados (Rio Grande), aumentados e sensíveis à palpação (São
Francisco de Assis) e endurecidos (Cachoeira do Sul). Os aspectos clínicos e
epidemiológicos podem ser evidenciados nas tabelas 4 e 5, e na Figura 11 disposta
abaixo.
Tabela 4 – Aspectos clínicos dos cinco cães soropositivos para L. chagasi
pertencentes a quatro municípios de área indene no estado do Rio
Grande do Sul, no período de 2011 a 2012.
Verificou-se neste estudo que os principais sinais clínicos encontrados em
cães soropositivos foram: linfonodos aumentados (60%) e lesões dermatológicas
(60%). Seguido em menor frequência de sinais como desidratação (40%) e
emagrecimento (40%). Os sinais menos observados foram pa lidez de mucosa
(20%), alteração no TPC (20%) e presença de lesão ocular (20%). Quanto aos sinais
vitais, observou-se que a frequencia cardíaca e frequencia respiratória estavam
dentro dos padrões para a espécie, porém em relação a temperatura corporal todos
cães soropositivos apresentaram temperatura abaixo de 38ºC.
Aspectos clínicos Municípios
Dom Pedrito Rio Grande São Francisco de
Assis
Cachoeira do
Sul
Cachoeira do
Sul
Cão 1 Cão 2 Cão 3 Cão 4 Cão 5
Condição corporal Hidratado Desidratado Hidratado Hidratado Desidratado Estado nutricional s/alteração Caquético s/alteração s/alteração Magro Mucosas Pálidas Róseas Róseas Róseas Róseas
TPC s/alteração s/alteração s/alteração Alterado s/alteração Linfonodos s/alteração Alterados Alterados s/alteração Alterados Lesão dermatológica Presente Presente Ausente Ausente Presente
Lesão ocular Ausente Presente Ausente Ausente Ausente
35
As lesões dermatológicas encontradas nos cães sororreagentes para LVC
foram: lesão ulcerada principalmente ao redor das orelhas e alopecia (Dom Pedrito);
descamação cutânea, alopecia, despigmentação e nódulos intradérmicos (Rio
Grande); descamação cutânea, alopecia e lesão ulcerada (Cachoeira do Sul) e o
cão de São Francisco de Assis era assintomático. Todos os cães soropositivos
apresentaram pêlo seco. Nas Figuras 12, 13, 14 e 15, pode-se visualizar os quatro
cães sororreagentes (oligossintomáticos), o cão de Rio Grande/RS não possui foto.
Tabela 5 – Aspectos epidemiológicos de cinco cães soropositivos para L. chagasi
pertencentes aos quatro municípios de área indene no estado do Rio
Grande do Sul, no período de 2011 a 2012.
Aspectos epidemiológicos
Municípios
Dom Pedrito Rio Grande São Francisco
de Assis Cachoeira do
Sul
Cachoeira do Sul
Cão 1 Cão 2 Cão 3 Cão 4 Cão 5
Raça Pastor SRD SRD Dachshund SRD
Sexo Macho Macho Fêmea Fêmea Fêmea Tipo de pelagem Longo Médio Curto Curto Curto
Presença de ectoparasitas
Pulgas e
Demodex spp.
Ausente Pulgas Pulgas Pulgas
Mês da coleta Dezembro Setembro Abril Julho Julho
Região no RS Sudoeste Extremo sul Sudoeste Centro sul Centro sul
Figura 11 – Mapa do estado do Rio Grande do Sul demonstrando as regiões com casos de Leishmaniose visceral canina, no período de 2011 a 2012.
36
Figura 12 - Cão soropositivo IFI, ELISA e DPP. Dom Pedrito/RS.
Figura 13 – Cão soropositivo IFI, ELISA e DPP. São Francisco de Assis/RS.
Figura 14 – Cão soropositivo IFI e ELISA. Cachoeira do Sul/RS.
Figura 15– Cão Soropositivo IFI e ELISA. Cachoeira do Sul/RS.
37
4 DISCUSSÃO
O diagnóstico da leishmaniose visceral na região sul do país é raro e
realizado a partir de focos endêmicos de outras regiões do país (SANTA ROSA &
OLIVEIRA,1997 apud POCAI et al., 1998). Este estudo foi importante pois registrou
soropositividade em cães de regiões sem diagnóstico para LVC.
A prevalência de 3,03% (5/165) de cães soropositivos utilizando a
associação ELISA triagem e IFI confirmatório (protocolo utilizado até 2012), e a
prevalência de apenas 1,82% (3/165) de cães soropositivos utilizando DPP triagem
e ELISA confirmatório (protocolo utilizado atualmente), demonstrou que houve uma
redução da sensibilidade do diagnóstico para leishmaniose visceral canina,
podendo, portanto estar subestimando casos de LVC ou o protocolo antigo poderia
resultar em muitos falsos positivos.
A prevalência de 33,94% (56/165) determinada somente pelo método de IFI
em regiões não endêmicas pode indicar que este teste apresenta alta sensibilidade,
entretanto resultando muitos falso-positivos. A IFI tem sido amplamente utilizada
para o diagnóstico de várias doenças parasitárias, podendo ser observadas reações
cruzadas principalmente entre a leishmaniose visceral, leishmaniose tegumentar
americana e a doença de Chagas (BRASIL, 2006). No trabalho realizado por Lira et
al. (2006) foi detectada reação cruzada na IFI para demodicose e ehrlichiose. Estas
reações inespecíficas ocorrem devido à complexidade antigênica dos
tripanossomatídeos, que compartilham vários epítopos comuns (BADARÓ et al.,
1986). Em contrapartida, Guimarães et al. (2009) demonstraram não haver reação
cruzada entre Babesia spp., Toxoplasma gondii, Neospora sp. e Leishmania spp.
Oliveira et al. (2008) também concluíram não haver reação cruzada entre anticorpos
para Leishmania spp., Babesia canis e Ehrlichia canis. Silva (2009) concluiu que
outra forma de reação cruzada pode ser por anticorpos vacinais.
Este estudo foi feito em região não endêmica e em cães de canis municipais
ou ONGs, que não possuíam o protocolo de vacinação para as doenças mais
frequentes. Portanto, provavelmente os resultados sorológicos desta pesquisa não
entrariam neste parâmetro de falso-positivo pela vacinação.
38
Segundo Gonçalves (2010), pode apresentar resultados falso-negativos
(anticorpos inativos, janela imunológica) e falso-positivos (sangue hemolisado,
anticorpos persistentes de infecção antiga). Títulos baixos podem apresentar
reações cruzadas com outras parasitoses.
Na orientação fornecida pelo Bio-Manguinhos/Fundação Oswaldo Cruz,
fabricante de IFI e ELISA PARA LVC o desempenho da IFI para amostras de soro
oscila em torno de 90% de sensibilidade e 80% de especificidade. Isto explicaria a
prevalência maior em cães soropositivos utilizando o teste de IFI e ELISA. Lira et al.
(2006) demonstraram que para obter maior sensibilidade, os kits (EIE-LVC e IFI-
LVC) devem ser usados em paralelo, no entanto para conseguir maior
especificidade melhor utilizá-los em série (EIE-LVC+IFI-LVC).
No estudo realizado por Silva et al. (2011), a associação de ELISA+IFI
demonstrou moderada concordância, com coeficiente Kappa de 0,41. Gonçalves
(2010) encontrou acurácia de 57,78% utilizando IFI e ELISA, com concordância
considerável com coeficiente de kappa 0,24. No caso deste estudo, em regiões não
endêmicas, a combinação IFI+ELISA demonstrou acurácia semelhante de 66,06%,
mas concordância pobre com valor de kappa 0,054.
Segundo Boarino et al. (2005), a combinação de diferentes antígenos em um
mesmo ensaio também é uma abordagem a ser explorada no diagnóstico da LVC. A
formação de um antígeno quimérico, produzido por múltiplos epítopos, demonstrou
sensibilidade e especificidade superiores a 95% quando aplicado em ELISA.
Conforme Grimaldi et al. (2012), o teste DPP®, produzido pelo Instituto de
Tecnologia em Imunobiológicos Bio-Manguinhos, que une dois antígenos
recombinantes (rK39 e rK26) apresentou potencial promissor, entretanto, apresentou
elevada sensibilidade apenas para cães sintomáticos (98%), pois em assintomáticos
esta foi baixa (47%), isso indica que é necessário inserir mais antígenos no teste
rápido para tornar a detecção de anticorpos anti-Leishmania mais eficaz na fase
inicial da doença
Neste trabalho, considerando DPP como triagem e ELISA como
confirmatório, em um cenário de prevalência real de 6.06% e prevalência aparente
de 6,67, a sensibilidade foi de 30%, a especificidade de 94,84%, a acurácia de
90,91% e o valor de kappa de 0,237. Comparando o protocolo antigo com o
protocolo atual, verificou-se que a sensibilidade do teste diminuiu em 20%, mas a
especificidade aumentou em 27,74%. O número de falso-positivos diminuiu em
39
cerca de 18%, o de falso-negativos permaneceu o mesmo. Entretanto o VPP que
era de 8,93% subiu para 27,27%. Gonçalves (2010) obteve resultados semelhantes,
quando comparou isoladamente os testes de DPP e IFI: o teste rápido obteve
46,67% (21/45) de soropositividade, enquanto que a IFI obteve 84,44% (38/45).
De acordo com Schubach (2011), DPP pode ser usado pelo Programa
Nacional de Controle das Leishmanioses, por ser de fácil execução e leitura, e
também por ser possível utilizá-lo em amostras de sangue total a campo, porém
apresenta baixa sensibilidade e especificidade. Além disso, Gonçalves (2010)
verificou em seu trabalho, que o teste rápido apresenta sensibilidade mais alta
quando comparado a IFI.
O Ministério da Saúde, por meio da Nota Técnica Conjunta 01/2011
substituiu o protocolo da LVC, sendo uti lizado o DPP® como teste de triagem e
ELISA como teste confirmatório. Segundo Faria e Andrade (2012), sugerem que
poderão ocorrer falhas nesses resultados, causando a eliminação de um número
desconhecido de animais falso-positivos.
Entretanto para explicar que estes resultados de sensibilidade e
especificidade do teste dependem das condições epidemiológicas em que ele é
aplicado, ou seja, da prevalência da doença. Por exemplo, se o DPP® fosse utilizado
em cenários de diferentes prevalências reais conhecidas, poderíamos saber quantos
não infectados poderiam ser eliminados, bem como, quantos positivos não
detectados. Se fosse uti lizado o DPP® com a sensibilidade de 89% e a
especificidade de 69% (SCHUBACH, 2011), se aplicássemos isto em um cenário de
prevalência real de 1,8% (áreas hipoendêmicas ou não endêmicas) e
pretendêssemos avaliar 10.000 cães, teríamos 182 cães reagentes e 9818 não
reagentes. Com a sensibilidade e especificidade do DPP® acima especificada,
teríamos 162 verdadeiro-positivos e 6774 verdadeiro-negativos e consequentemente
completando a tabela de contingência, teríamos 3044 falso-positivos e 20 falso-
negativos, o que se traduziria em um VPP do teste de 5,05%, um VPN de 99,71%,
uma acurácia de 69,36% e um kappa de 0,06. Se aplicássemos o mesmo teste em
um cenário de prevalência real de 50% (áreas endêmicas) e com os mesmos 10.000
animais, teríamos um VPP de 78,69%, um VPN de 87,14%, uma acurácia de
82,45% e uma concordância substancial com um kappa de 0,65. Entretanto, se
fosse aplicado em áreas hiperendêmicas, com prevalência real de 90%, o VPP seria
de 96,27%, o VPN de 41,07%, a acurácia de 87% e o kappa moderado de 0,45.
40
Segundo Gonçalves (2010), a associação DPP e ELISA demonstrou
acurácia de 86,67% e valor de coeficiente de kappa de 0,73, com concordancia
substancial, valor de acurácia aproximado ao observado no presente estudo
(A=90,91%), porém K=0,237.
A utilização das técnicas imunocromatográficas abriu um novo panorama no
diagnóstico realizado em campo. O MS substituiu o protocolo de diagnóstico da LVC
pelo DPP (imunocromatográfico) como opção de triagem e o ELISA como teste
confirmatório. Entretanto, a sensibilidade dos antígenos empregados nessas
técnicas ainda deixa a desejar o que leva crer que o uso de novos antígenos a
serem empregados em tiras imunocromatográficas apresenta uma perspectiva
bastante animadora para o desenvolvimento de testes de campo (FARIA e
ANDRADE, 2012).
Neste trabalho, o melhor resultado apresentado foi a combinação dos
resultados positivos DDP/IFI em série, com ELISA padrão ouro, resultando no
aumento da especificidade do teste (Es=98.71%), melhor acurácia (94,55) e melhor
coeficiente kappa (0,375), comparado às outras combinações.
No que se refere ao diagnóstico parasitológico não foi observado amastigota
no esfregaço de sangue dos cães soropositivos. Conforme o estudo de Lira et al.
(2006), 42% dos cães positivos no exame sorológico EIE-LVC e IFI-LVC e
sintomáticos para leishmaniose, não tiveram confirmação no parasitológico (padrão
ouro), assim demonstrando que o parasitológico não é sensível o suficiente.
Segundo Campillo et al., (1999) a punção de medula óssea oferece
sensibilidade superior ao aspirado de linfonodo. No entanto, neste estudo foi
utilizada a punção de linfonodo por ser a forma menos invasiva e mais rápida. A
visualização das formas amastigotas é fácil nas amostras com intenso parasitismo,
mas quando a carga parasitária é baixa pode haver dificuldade na detecção
(FERRER, 1995).
No que diz respeito aos achados hematológicos relacionados à
leishmaniose, a anemia normocítica normocrômica é caracterizada por redução na
eritropoiese, e suas causas incluem baixos níveis séricos de eritropoetina, presença
de doença inflamatória (primariamente crônica), hipoplasia ou aplasia da medula
óssea, deficiências nutricionais e insuficiências endócrinas. A ausência de
regeneração desta anemia deve-se à presença do parasito na medula óssea,
41
levando à infiltração de linfócitos, plasmócitos e macrófagos e assim
comprometendo a produção eritrocitária (COSTA-VAL et al., 2007). Nas parasitoses
que acompanham esplenomegalia, como a leishmaniose entre outras, a anemia
seria do tipo hemolítica, explicada pelo desenvolvimento do hiperesplenismo
(FARID; PATWARDHAN & DARBY, 1969). Sobre a trombocitopenia encontrada, a
leishmaniose pode levar à redução no número de plaquetas induzida por vasculite
associada à reação de hipersensibilidade tipo III, aumento da destruição plaquetária,
hepatopatia e nefropatia (FELDMAN et al., 2000). Segundo Bulla et al.(2004) e
Ciaramella et al. (2005) as alterações na quantidade e função plaquetária são mais
evidentes nos cães sintomáticos devido ao comprometimento do sistema imune no
processo inflamatório tanto na ehrlichiose quanto na leishmaniose canina. Quanto a
leucocitose com neutrofilia, dados mostram que animais com leishmaniose podem
apresentar esta alteração (FEITOSA et al., 2003; MEDEIROS et al., 2008).Estudos
vem demonstrando que a fase inicial da leishmaniose induz leucocitose associada a
neutrofilia e em estágios mais avançados, pode-se observar leucopenia com
linfopenia (BOURDOISEAU et al., 1997). Conforme estudo feito por Coutinho (2005)
os cães soropositivos não apresentaram aumento nos níveis médios de leucócitos,
não caracterizando uma leucocitose. Já a frequência de trombocitopenia foi
significativa em cães com LVC. A leucocitose é esperada em qualquer afecção que
cause uma resposta inflamatória aguda, como a leishmaniose e outras doenças. O
valor leucocitário normal de alguns animais confirmados para LVC pode estar
relacionado ao estágio da doença. Maia (2013) observou hiperproteinemia,
leucocitose e trombocitopenia nos animais suspeitos e confirmados. Neste estudo,
os cães soropositivos estavam com PPT entre 7,2-8,2g/dL, relativamente acima do
normal. O aumento da concentração de proteína plasmática (PPT) é outra alteração
laboratorial comum na leishmaniose e está associado com processos inflamatórios.
O diagnóstico através dos sinais clinicos em áreas não endêmicas é muito
dificil, pois as lesões são semelhantes às causadas por outras doenças que
acometem os cães. Contudo é importante lembrar que os sinais clinicos dependem
da virulência da cepa, dose do inóculo, estado imunológico, nutricional e também da
característica genética dos animais. Neste trabalho, a temperatura baixa encontrada
é um achado clínico comum em cães desidratados e caquéticos, pode ser também
que este sinal clínico esteja associado a outras infecções concomitantes, como a
cinomose, muito comum nesses animais errantes e também pode ser causada
42
por temperatura ambiente muito baixa. No entanto, Feitosa et al. (2000) observaram
temperatura acima de 38ºC em cães com LVC.
As lesões dermatológicas encontradas foram: lesão de pele ulcerada,
descamação cutânea, alopecia, despigmentação da pele e nódulos intradérmicos.
Lesões semelhantes foram observadas por Gonçalves (2010), sendo que as mais
frequentes foram descamação (53,33%), alopecia (44,44%) e lesões ulceradas
(40%), e nas alterações clinicas, mucosas hipocoradas estava entre as alterações
menos freqüentes, concordando com este estudo onde apenas um cão (Dom
Pedrito/RS) apresentava mucosas pálidas.
Apenas o cão de Rio Grande apresentou lesão ocular, isto se deve
provavelmente à presença dos parasitas, deposição de imunocomplexos. Tais
alterações oculares verificadas estão de acordo com estudo de Fulgêncio et al.
(2008) que observou, num total de 100 animais (200 olhos), 76 (38%) com pelo
menos uma alteração. Além disso, foi observado em alguns cães secreção
mucopurulenta e intenso acúmulo de secreção mucosa na superfície ocular. Da
mesma forma, Genaro (1993) observou secreção purulenta em 25% dos cães
estudados.
No estudo feito por Coutinho (2005) alterações cutâneas (úlceras, dermatites
e alopecias) foram bastante prevalentes nos cães positivos para LVC. Da mesma
forma, Lima et al. (2004) também encontrou lesões dermatológicas como
descamação seca (40,7%) e a alopecia (40,7%). Moreira et al. (2013) observou
conjuntivite, caquexia, onicogrifose, áreas de alopecia, descamação e ulceração na
pele, que variavam de distribuição local a disseminada em animais sintomáticos com
LVC. Contudo, neste caso as lesões observadas eram apenas localizadas.
O cão soropositivo de São Francisco de Assis/RS era assintomático quanto
às lesões dermatológicas. No trabalho de Magalhães (2012) 42% dos cães
assintomáticos eram positivos para LVC, demonstrando a importância dos cães
assintomáticos como reservatório da doença. Da mesma forma, Silva et al. (2011)
observaram em seu estudo que 78% (11/14) dos cães positivos para LVC eram
assintomáticos, reforçando a importância destes no ciclo de transmissão, como
reservatório silencioso da doença, por serem assintomáticos não atraem a atenção
de proprietários e veterinários, dificultando assim o controle da doença.
Com relação ao estado nutricional dos cães soropositivos, 40% (2/5)
apresentaram estado nutricional alterado, de magro ou caquético. Lima et al. (2004)
43
também avaliou os sinais clínicos em cães soropositivos pra LVC estando presente
em seus resultados sinais de magreza e caquexia.
Neste estudo, 60% (3/5) dos cães soropositivos apresentaram alteração nos
linfonodos. De acordo com Lima et al. (2004), os linfonodos dos cães positivos eram
sempre reativos, apresentando aumento de tamanho. Igualmente Cardoso (2012)
verificou que entre os sinais clinicos mais frequentes nos cães com LVC estava a
linfoadenomegalia. Segundo Barbosa et al.(2010), dentre os sinais clínicos mais
frequentes está a linfoadenopatia presente em 96,4% dos cães sintomáticos. Este
aumento dos linfonodos é resultado da proliferação de linfócitos B, plasmócitos,
histiócitos e macrófagos de órgãos linfoides (FEITOSA, 2001).
Em consideração aos aspectos epidemiológicos, a literatura afirma que os
principais transmissores da LVC são os flebotomíneos. Entretanto, não foi realizado
um levantamento entomológico destes insetos nos 12 municípios em questão.
Porém, 80% (4/5) dos cães soropositivos estavam infestados por pulgas, e poderiam
também anteriormente a visita a campo, já terem entrado em contato com carrapatos
ou outros ectoparasitas. Atualmente, estudos como de Coutinho et al. (2005)
descreveram a transmissão de L. chagasi por carrapatos Rhipicephalus sanguineus
no Brasil. Coutinho e Linardi (2007), ao investigar o papel das pulgas
Ctenocephalides felis felis na transmissão da LVC, verificaram que 1,9% das pulgas
retiradas de cães com LVC apresentaram formas promastigotas em esfregaços
corados pelo Giemsa, enquanto que 29,9% exibiram reação positiva pela técnica da
PCR.
Em relação ao tipo de pelagem, neste estudo, 60% (3/5) dos cães
soropositivos apresentava pêlo curto, isto ocasionado pela facilidade do inseto
realizar a picada, tornando-os com mais chances de serem infectados. Da mesma
forma, França-Silva (2003) quando verificou o comprimento do pêlo, observou que
animais de pêlo curto são mais susceptíveis a ação do vetor do que os animais de
pêlo longo. No trabalho de Filho (2008) os animais de pêlo curto também
apresentaram maior soropositividade. Igualmente observado no estudo de Rondon
(2008), em cães com pêlo curto e pelagem escura a prevalência da doença foi mais
elevada.
Quanto à predisposição racial, a maioria dos cães soropositivos deste
estudo eram sem raça definida, as únicas raças sororreagentes encontradas foram
Daschund e Pastor. Também quanto ao gênero, não houve nenhuma diferença
44
estatistica significativa quanto a soropositividade. França-Silva (2003) também não
verificou predisposição racial em adquirir a doença, embora outros autores, como
Miranda et al. (2008) demonstram predisposição racial para as raças Pastor Alemão,
Rotweiler e Boxer para leishmaniose,enquanto as raças Poodle e Yorshire Terrier
pareciam ser mais resistentes. Em relação ao fator sexo, conforme Rondon (2008) o
gênero macho ou fêmea não demonstrou influenciar a suscetibilidade do animal para
leishmaniose visceral. Da mesma forma, Nascimento (2011) verificou que o risco de
infecção para LVC é semelhante para ambos os sexos e sem predisposição racial,
não havendo diferença estatística. Almeida (2010) também não observou diferença
estatisticamente significativa entre sexos ou raças.
Durante muito tempo a Leishmaniose Visceral esteve restrita apenas a áreas
rurais, matas onde habita o inseto vetor. Com a urbanização, a doença foi
aumentando sua abrangencia para a zona urbana. A LVC estava localizada
principalmente em estados com temperatura tropical e regiões com populações mais
pobres. Conforme Manual do Ministério da Saúde (2006) os dados epidemiológicos
dos últimos dez anos revelam a periurbanização e a urbanização da leishmaniose
visceral, destacando-se os surtos ocorridos no Rio de Janeiro (RJ), Belo Horizonte
(MG), Araçatuba (SP), Santarém (PA), Corumbá (MS), Teresina (PI), Natal (RN),
São Luís (MA), Fortaleza (CE), Camaçari (BA) e mais recentemente em Três Lagoas
(MS), Campo Grande (MS) e Palmas (TO). Até a década de 90, a maioria dos casos
ocorridos foram notificados na região Nordeste do Brasil. Entretanto, este estudo
revelou 5 casos de LVC na região Sul do Brasil, região conhecida como não
endêmica, abrangendo várias áreas do RS (extremo sul, sudoeste e centro sul).
Segundo boletim epidemiológico da CEVS/RS (2011) o Rio Grande do Sul era
considerado área indene para LV até novembro de 2008, quando foi notificado um
caso suspeito de LVC em um cão proveniente de São Borja. Observou-se no
inquérito epidemiológico em Santa Maria uma amostra canina sororreagente, em
Porto Alegre, a prevalência, até dezembro de 2010, foi de 4,1%, em 72 amostras, Os
municípios com casos suspeitos caninos são aqueles onde houve casos
sororreagentes, mas ainda não foi isolado o parasita responsável pela doença.
Estão em investigação: Santa Cruz do Sul, Viamão, Cachoeira do Sul, São Luiz
Gonzaga e Santo Ângelo (CEVS/RS, 2011).
Segundo Alves (2005), uma vez confirmada a L. (L.) chagasi/infantum, deve
ser coletado material sorológico em todos os cães da área, a fim de avaliar a
45
prevalência canina e desencadear as demais medidas. No entanto, este estudo vem
agregar conhecimento sobre a doença, alertando o centro de vigilância em saúde
dos municípios estudados, a tomarem as medidas de controle e prevenção
necessárias nas regiões onde se encontrou cães reagentes a LVC.
46
5 CONCLUSÕES
Constatou-se presença de focos de Leishmaniose visceral canina em quatro
municípios do Rio Grande do Sul: Rio Grande, Dom Pedrito, Cachoeira do Sul
e São Francisco de Assis.
Nossos resultados aumentam para oito o número de municípios sobre
investigação no RS, considerando que Cachoeira do Sul já estava incluída;
A doença demanda uma situação de alerta e vigilância, pelo registro de novos
municípios com cães soropositivos;
O melhor desempenho dos resultados sorológicos sucedeu-se quando se
associou em série os resultados positivos de DPP e IFI, usando o ELISA
como teste confirmatório;
É necessário o desenvolvimento de ensaios sorológicos baseados em mais
antígenos definidos e específicos para melhorar os métodos diagnósticos
para as leishmanioses.
47
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALENCAR, J.E. et al. Expansão do calazar no Brasil. Ceará Médico, 5 (1,2): 86-102.
1983. ALMEIDA, et al. Prevalência e epidemiologia da leishmaniose visceral em cães e humanos, na cidade de Cuiabá, Mato Grosso, Brasil.Ciência Rural. V. 40, n.7, 2010.
ALVES, W.A. Controle da Leishmaniose Visceral Baseado no Reservatório Canino. In: Consulta de Expertos OPS/OMS sobre Leishmaniasis Visceral en Las Américas. 2005. Disponível em:
<http://bvs1.panaftosa.org.br/local/File/textoc/LEANES_Inf_final_leish_2005.pdf#page=98>. Acesso em: 25 abr. 2013.
AMORÁ, S.S.A. et al. Fatores relacionados com a positividade de cães para leishmaniose visceral em área endêmica do Estado do Rio Grande do Norte, Brasil Ciência Rural, Santa Maria, v.36, n.6, p.1854-1859, nov-dez, 2006.
ARRUDA, M.M. Programa de Zoonoses da Região Sul. Leishmaniose Visceral.
Manual de Zoonoses. V.1. 1ed. 2009. Disponível em: <http://www.zoonoses.org.br/absoluto/midia/imagens/zoonoses/arquivos_125856162
8/5917_manual_zoonoses_2009_11_04(baixa).pdf>. Acesso em: 25 nov. 2012.
BADARÓ, R.; REED, S.G.; BARRAL, A.; ORGE, G. & JONES. T.C. Evaluation of the micro enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antibodies in American visceral leishmaniasis: antigen selection for detection of infection specific responses. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 35. p.72-78, 1986.
BARBOSA, D. S. Soroprevalência e variáveis epidemiológicas associadas à leishmaniose visceral canina em área endêmica no município de São Luís, Maranhão, Brasil. Ciência Animal Brasileira. Goiânia, v. 11, n. 3, p. 653-659,
jul./set. 2010. BIO-MANGUINHOS, Manual de Instrução do Kit Teste Rápido LVC – DPP. 2011.
BOARINO, A.; SCALONE, A.; GRADONI, L.; FERROGLIO, E.; VITALE, F.;
ZANATTA, R.; GIUFFRIDA, M. G.; ROSATI, S. Development of recombinant chimeric antigen expressing immunodominant B epitopes of Leishmania infantum for serodiagnosis of visceral leishmaniasis. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 12, 647-653, 2005. Disponível em:
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1112073/>. Acesso em: 20 mar.
2013. BONATES, A. Leishmaniose visceral (calazar). Veterinary News, Rio de Janeiro,
ano 10, n. 61, 2003.
48
BOURDOISEAU, G.; BONNEFONT, C.; MAGNOL, J.P.; SAINT-ANDRÉ,
I.;CHABANNE, L. Lymphocyte subset abnormalities in canine leishmaniasis. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.56, n.3-4, p.345-351, 1997.
BRAGA, A.R.L. Hemocultura, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e reação em cadeia de polimerase (PCR) para Leishmania spp. Em cães e gatos
provenientes de área endêmica e não endêmica para leishmaniose. 2009. 99f.
Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu. 2009. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância das Doenças transmissíveis. Nota Técnica conjunta nº 1/2011 CGDT-CGLAB/DEVIT/SVS/MS. 2011.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Manual de vigilância e controle da leishmaniose
visceral. Brasília-DF, 2006. Disponível em:
<http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/manual_leish_visceral2006.pdf>.
Acesso em: 29 nov. 2012. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral. Brasília-DF, 2003.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Manual de vigilância e controle da leishmaniose
visceral. Brasília-DF, 2006. Disponível em:
<http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/manual_leish_visceral2006.pdf>.
Acesso em: 29 nov. 2012. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Doenças de A a Z. Leishmaniose visceral. Brasília-DF, 2011a. Disponível em:
<http://portal.saude.gov.br/portal/saude/profissional/area.cfm?id_area=1561>.Acesso
em: 27 nov. 2011. BULLA, C.; TAKAHIRA, R.K.; ARAÚJO Jr. J.P.; TRINCA, L.A.; LOPES R.S. &
WIEDMEYER, C.E. The relationship between the degree of thrombocytopenia and infection with Ehrlichia canis in an endemic area.Veterinary Research. 35: 141-146.
2004. CAMPILLO, M. C.; VAZQUEZ, F. A. R.; FERNANDEZ, A. R. M.; ACEDO.; M. C. S.;
RODRIGUEZ, S. H.; LOPEZ-COZAR, I. N.; BAÑOS, P. D.; ROMEROM H. Q.; VARELA, M. C. Parasitologia Veterinária. 1ª ed. Madrid: McGraw-Hill
Interamericana, p. 651-665, 1999. CARDOSO, S.P. Leishmaniose visceral canina (LVC): revisão de literatura e
estudo comparativo entre as técnicas de citopatologia, histopatologia e imunohistoquímica no diagnóstico da LVC em cães naturalmente infectados
do Distrito Federal. 2012. 711p. Monografia (Conclusão de curso de Medicina
Veterinária) – Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina veterinária, 2012.
49
CEVS/RS. Leishmaniose visceral no Rio Grande do Sul. Boletim epidemiológico.
Porto Alegre- RS, v.13, n.1, 2011. Disponível em: http://www.saude.rs.gov.br/upload/1337355106_v.13,%20n.1,%20mar.,%202011.pd.
Acesso em: 30 nov. 2012. CHAGAS, E. Primeira verificação em indivíduo vivo da leishmaniose visceral no Brasil. Brasil Médico. v.50, p.221-222. 1936.
CIARAMELLA P.; PELAGALLI A.; CORTESE L.; PERO, M.E.; CORONA M.; LOMBARDI P.; AVALLONE, L. & PERSECHINO A. Altered platelet aggregation and coagulation disorders related to clinical findings in 30 dogs naturally infected by Leishmania infantum. The Veterinary Journal.169: 465-467. 2005.
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINÁRIA DO ESTADO DE MATO GROSSO DO SUL (CRMV/MS). Cartilha sobre leishmaniose visceral canina.
52p. Campo Grande, 2002.
COSTA-VAL, A. P.; CAVALCANTI, R. R.;GONTIJO, N. F.; MICHALICK,
M.S.M.;ALEXANDER, B.; WILLIAMS, P.; MELO,M.N. Canine visceral leishmanisis: Relationships between clinical status, humoral immune response, haematology and Lutzomyia (Lutzomyia) Longipalpis infectivity. The Veterinary Journal, v. 174, n. 3,
p. 636-643, 2007. COUTINHO, J.F.V. Estudo clinico-laboratorial e histopatológico de cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi com diferentes graus de manifestação clínica. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) – Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Biociências, Natal/RN, 2005.
COUTINHO, M.T.Z. et al.Participation of Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) in the epidemiology of canine visceral leishmaniasis. Veterinary Parasitology.
128:149 – 55. 2005.
COUTINHO, M.T.Z; LINARDI, P.M. Can fleas from dogs infected with canine visceral leishmaniasis transfer the infection to other mammals? Veterinary Parasitology.
147:320 - 5. 2007.
DEAM, A.G., DEAM, JÁ, COULMOBIER, D., BRENDEL, K.A., SMITH, D.C., BURTON, A.H., DICKER, R.C., SULLIVAN, K., FAGAN, R.F. and ARNER, T,J. Epi
Info Version 6.0 A word processing, database, and statistics program for epidemiology on microcomputers. Centers for Disease Control and Prevention,
Atlanta, GA., 1994.
DOSTÁLOVÁ, A. VOLF, P. Leishmania development in sand flies: parasite-vector interactions overview. Parasites & Vectors. 2012. Disponível em:
<http://www.parasitesandvectors.com/content/5/1/276>. Acesso em: 10 jan. 2013.
FARIA, A.R., ANDRADE, H.M. Diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina: grandes avanços tecnológicos e baixa aplicação prática. Revista Pan-
Amazônica de Saúde. v.3(2):47-57, 2012.
50
FARID, Z.; PATWARDHAN, V.N.; DARBY, W.J. Parasitism and Anemia. The American Journal of Clinical Nutrition. 22 (5), 498.1969.
FEITOSA, M.M.; IKEDA, F.A.; LUVIZOTTO, M.C.R. & PERRI, S.H.V. Aspectos clínicos de cães com leishmaniose visceral no município de Araçatuba – São Paulo (Brasil). Clínica Veterinária. 28:36-44. 2000.
FEITOSA. M.M. Leishmaniose Visceral: um desafio crescente. Revista Intervet Pet,
p. 1-15, 2001. FEITOSA, M.M. et al. Perfi l hematológico de cães naturalmente infectados por
Leishmania chagasi no município de Araçatuba, São Paulo (Brasil): um estudo retrospectivo de 191 casos. Clínica Veterinária, v. 47, p. 42-48, 2003.
FELDMAN, B.V.; ZINKL, J.G.; JAIN, N.C. Schalm´s Veterinary Hematology. Canada: Lippincott Willians & Wilnkis, 2000.
FERRER, L. M. Clinical aspects of canine leishmaniasis. Proceedings of the
International Canine Leishmaniasis Forum. Barcelona, Spain, p. 6-10, 1999.
FERRER, L. et al. Serological Diagnosis and Treatment of Canine Leishmaniasis. Veterinary Record. v. 136, n. 20, p. 514-516, 1995.
FILHO, N.W.B.C. Aspectos epidemiológicos e soroprevalência da Leishmaniose e Babesiose em cães de raça no município de São Luis – MA. 2008. 51f.
Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) - Curso Ciências Veterinária, Área
de Sanidade Animal – Universidade Estadual do Maranhão, 2008.
FRANÇA-SILVA, J. C. et al. Epidemiology of canine visceral leishmaniasis in the endemic area of Montes Claros municipality, Minas Gerais State, Brazil. Veterinary Parasitology. 111: 161-173, 2003.
FULGÊNCIO, G.O. et al. Oftalmopatias associadas à leishmaniose visceral canina - revisão de literatura. Revista Conselho Federal de Medicina Veterinária (Brazil).
V. 14(45) p. 31-41. 2008.
GENARO, O. Leishmaniose Visceral Canina Experimental. 1993. 146 f.
Dissertação (Doutorado em Parasitologia). Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 1993. GONÇALVES, B.S. Leishmaniose visceral canina na área urbana de Cuiabá–
MT: comparação de técnicas laboratoriais, tentativa de desenvolvimento de metodologia para o diagnóstico e caracterização da espécie de Leishmania
circulante em amostra selecionada. 2010.125f. Dissertação (Mestrado em
Ciências Biológicas) - Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca – ENSP, Fundação Oswaldo Cruz, 2010.
51
GONTIJO, C.M.F.; MELO, M.N. Leishmaniose visceral no Brasil: quadro atual, desafios e perspectivas. Revista brasileira de epidemiologia. São Paulo-SP, v. 7,
n. 3, 2004. ISSN 1415-790X. Disponível em:
<http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1415-790X2004000300011&script=sci_arttext>Acesso em: 29 nov. 2012.
GRIMALDI, G. Jr. et al. Evaluation of a novel chromatographic immunoassay based on Dual-Path Platform technology (DPP® CVL rapid test) for the serodiagnosis of canine visceral leishmaniasis. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 106, 54– 59, 2012. Disponível em:
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22137538>. Acesso em: 20 mar. 2013.
GUIMARÃES, A.M. et al. Fatores associados à soropositividade para Babesia,
Toxoplasma, Neospora e Leishmania em cães atendidos em nove clínicas veterinárias do município de Lavras, MG. Revista Brasileira de Parasitologia veterinária. V. 18, supl. 1, dez. 2009.
KILLICK-KENDRICK, R. The biology and control of phlebotomine sand flies.1999. IN:
KOUTINAS, A.F., SARIDOMICHELAKIS, M.N., MYLONAKIS, M.E., LEONTIDES, L., POLIZOPOULOU, Z., BILLINIS, C., et al. A randomised, blinded, placebo-controlled clinical trial with allopurinol in canine leishmaniosis. Veterinary Parasitology.
2001;98:247-61.
KOUTINAS, A.F., SARIDOMICHELAKIS, M.N., MYLONAKIS, M.E., LEONTIDES, L., POLIZOPOULOU, Z., BILLINIS, C., et al. A randomised, blinded, placebo-controlled clinical trial with allopurinol in canine leishmaniosis. Veterinary Parasitology.
2001;98:247-61.
LAINSON R, RANGEL E.F. Lutzomyia longipalpis and the eco-epidemiology of American visceral leishmaniasis, with particular reference to Brazil: a review. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz , Rio de Janeiro, V. 100, p. 811-827,
2005.
LAINSON R, SHAW J.J. Evolution, classification and geographical distribution. 1987. IN: ED. PETERS, E.; KILLICK-KENDRICK, R. The leishmaniases in biology and medicine. Biology and Epidemiology, V.1, p.1-120, 1987.
LAURENTI, M.D. Correlação entre o diagnóstico parasitológico e sorológico na leishmaniose visceral americana canina. Boletim Epidemiológico Paulista. 2009:
6 (67):13-23.
LIMA, W.G. et al. Canine visceral leishmaniasis: a histopathological study of lymph nodes. Acta Tropica, V. 92, p. 43-53. 2004.
LIRA, et al. Canine visceral leishmaniosis: A comparative analysis of the EIE-leishmaniose-visceral-canina-Bio-Manguinhos and the IFI-leishmaniose-visceral-canina-Bio-Manguinhos kits. Veterinary Parasitology. V.137. p.11–16. 2006.
52
MAGALHÃES, L.F. et al. Quadro clínico de cães com Leishmaniose Visceral e sua correlação com a sensibilidade do teste parasitológico. Veterinária Notícias.
Uberlândia, v.18.n.2.p.67-72. 2012. Disponível em:
<http://www.seer.ufu.br/index.php/vetnot/article/view/22879/12401>. Acesso em: 25 abr. 2013.
Maia-Elkhoury AN, Alves WA, Sousa-Gomes ML, Sena JM, Luna EA. Visceral leishmaniasis in Brazil: trends and challenges. Cadernos de Saude Publica 2008;
24:2941-2947. MAIA, L.S. LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA: Aspectos clínicos e hematológicos de casos suspeitos e confirmados atendidos no Hospital
Veterinário da Universidade de Brasília em 2011. 2013. 23p. Monografia
(Conclusão do Curso de Medicina Veterinária) - Faculdade de Agronomia e Medicina
Veterinária, Universidade de Brasília, Brasília, DF, 2013. MARZOCHI, M.C.A. et al. Leishmaniose visceral-calazar. Jornal brasileiro de
Medicina. 41:69-84,1981.
MEDEIROS, C.M.O.; MELO, A.G.C.; LIMA, A.K.F.; SILVA, I.N.G.; OLIVEIRA,L.C.; SILVA, M.C. Perfil hematológico de cães com leishmaniose visceral no município de Fortaleza, Ceará. Ciência Animal, v.8, n.1, p.43-50, 2008.
MIRANDA, S. et al. Characterization of sex, age, and breed for a population of canine leishmaniosis diseased dogs. Research in Veterinary Science. V.85 p. 35–
38. 2008.
MOREIRA, P.R.R. et al. Influence of apoptosis on the cutaneous and peripheral lymph node inflammatory response in dogs with visceral leishmaniasis. Veterinary
Parasitology. v.192, p.149–157. 2013.
MOREIRA, E.A. Aspectos hematológicos de pacientes com leishmaniose
visceral. Academia de ciência e tecnologia. São José do Rio Preto – SP, março,
2012.
MOREIRA, M.A.B.; LUVIZOTTO, M.C.R.; NUNES, C.M.; SILVA, T.C.C.; LAURENTI, M.D.; CORBETT, C.E.P. Application of direct immunofluorescence technic for the diagnosis of canine visceral leishmaniaisis in lymph nodes aspierate. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science. 2002; 39(2):103-6.
NASCIMENTO, G.S.M. Aspectos epidemiológicos da leishmaniose visceral canina nas regiões administrativas Lago Norte e sobradinho II do Distrito
Federal – DF. 2011. 43f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) - Universidade
Federal de Goiás, Escola de Veterinária e Zootecnia, 2011.
OLIVEIRA, T.M.S. A study of cross-reactivity in serum samples from dogs positive for Leishmania sp., Babesia canis and Ehrlichia canis in enzyme-linked immunosorbent assay and indirect fluorescent antibody test. Revista Brasileira de Parasitologia veterinária. 17, 1, 7-11.2008.
53
OLIVEIRA, et al. Mortalidade por Leishmaniose Visceral: aspectos clínicos e laboratoriais. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical.
Vol.43 n.2 Uberaba, 2010. Disponível em:
<http://www.scielo.br/pdf/rsbmt/v43n2/16.pdf>. Acesso em: 29 nov. 2012. PENNA, H. A., 1934. Leishmaniose visceral no Brasil. Brasil Médico, 48: 949-950.
IN: BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Manual de vigilância e controle da leishmaniose
visceral. Brasília-DF, 2006. Disponível em:
<http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/manual_leish_visceral2006.pdf>. Acesso em: 29 nov. 2012.
RIBEIRO, V.M. Leishmaniose visceral canina - Desafio Permanente. Espaço
CRMV-MG. 2007. Disponível em: <http://www.anclivepabrasil.com.br/portal_v2/es_crmv.php?id=22>. Acesso em: 29 nov. 2012.
RONDON, F.C.M. et al. Cross-sectional serological study of canine Leishmania infection in Fortaleza, Ceará state, Brazil. Veterinary Parasitology. v. 155, p. 24–31,
2008.
SANTA ROSA, I.C.A., OLIVEIRA, I.C.S. Leishmaniose visceral: breve revisão sobre uma zoonose reemergente. 1997. IN: POCAI, E.A. et al. Leishmaniose visceral (calazar). Cinco casos em cães de Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brasil. Ciência Rural. v.28, n.3, p.501-505, 1998. Disponível em:
<http://www.scielo.br/pdf/cr/v28n3/a25v28n3.pdf>. Acesso em: 27 nov.2013.
SCHUBACH, E.Y.P. Validação da técnica de imunocromatografia rápida de
duplo percurso para o diagnóstico da Leishmaniose Visceral canina em amostras de sangue total e soro. 2011. 58f. Dissertação (Mestrado em Medicina
Tropical) – Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2011.
SILVA, et al. Laboratory tests performed on Leishmania seroreactive dogs euthanized by the leishmaniasis control program. Veterinary Parasitology. 179,
p.257–261, 2011. SILVA, S.R. Análise comparativa de métodos parasitológicos, sorológicos e moleculares na confirmação do diagnóstico em cães com sorologia positiva
para leishmaniose visceral canina. 2009. 93f. Dissertação (mestrado em Ciências
da Saúde) - Programa de Pós -Graduação em Ciências da Saúde do Centro de Pesquisas René Rachou. Doenças Infecciosas e Parasitárias, Fundação Oswaldo
Cruz, 2009.
SILVA, A.V.M. et al. Leishmaniose em cães domésticos: aspectos epidemiológicos. Cadernos de Saúde Pública, Rio de Janeiro, v.21, n.1, p.324-328, 2005.
54
SILVA, V.C. Identificação de reservatórios de zoonoses em insetos vetores por
espectrometria de massa. 2006. 56f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas)
- Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. Disponível
em:<http://repositorio.unb.br/bitstream/10482/3146/1/Dissertacao%20VLADIMIR%20COSTA%20SILVA.pdf> Acesso em: 28 nov. 2012.
SOUZA, P.R.K. Leishmania spp. Mecanismos de infecção e evasão da resposta imune. Revista Brasileira de Ciências da Saúde, ano II, N. 3. 2004.
SUNDAR, S. et al. Immunochromatographic strip-test detection of anti-K39 antibody in Indian visceral leismaniasis. Annals of Tropical Medicine and Parasitology. Jan;
96 (1):19-23,.2002.
TASCA, K.L., et al. Exames parasitológicos, imunoistoquímicos e histopatológicos para detecção de Leishmania chagasi em tecidos esplênicos de cães com leishmaniose visceral. Revista Brasileira de Parasitologia veterinária.Jaboticabal,
v. 18, n. 1, p. 27-33, jan.-mar. 2009. THOMÉ, S.M.G. Cuidado com as leishmanioses. Cães e Gatos, n. 85, p.46 a 50,
1999.
WINTER, L.M.F. Doenças Negligenciadas: - Como a Leishmania subverte as defesas do hospedeiro. Anais da 64ª Reunião Anual da SBPC. São Luís, MA.
Jul/2012. VILELA, M. MENDONÇA, S. Leishmaniose. Agência Fiocruz de Notícias. Instituto
Oswaldo Cruz. 2013.
VILELA, M. Leishmaniose: uma doença negligenciada. Revista cães & gatos. ed.
165. Mar/2013.
Volf, P.; Hostomska, J.; Rohusova, I.; Molecular Crosstalks In Leishmania-Sandfly-Host Relationships. Parasite. 2008, 15, 237.
55
ANEXOS
56 ANEXO A
Kit comercial para diagnóstico de Imunofluorescência Indireta. IMUNOTESTE
®.
Kit de ELISA (EIE LVC Bio-manguinhos
®).
Teste rápido (DPP LVC Bio-manguinhos®
).
57
APÊNDICES
58
APÊNDICE A
59
APÊNDICE B
60
61
APÊNDICE C
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS FACULDADE DE VETERINÁRIA
CENTRO DE CONTROLE DE ZOONOSES Campus Universitário - UFPEL - Prédio Nº 42, Fone (053)
3275.7424
Pelotas, __/___/____.
Ao Serviço de Vigilância Sanitária Município de ________________
A/C ___________________________________________
Sra. Diretora
Vimos através deste comunicar que, no estudo epidemiológico (“Leishmaniose visceral canina: Investigação clínica,
laboratorial e epidemiológica em cães de canis de doze municípios do Rio Grande do Sul”) que desenvolvemos em 12 municípios do Rio Grande do Sul,
lamentavelmente identificamos cães sororreagentes (de acordo com os testes e protocolo vigente do Ministério da Saúde para Leishmaniose Visceral Canina), em quatro municípios, entre os quais encontra-se o Município de ________________.
Colocamo-nos à disposição para esclarecimentos que se façam necessários, bem como sugerimos entrar em contato com CVS/RS, para que
as medidas cabíveis possam ser realizadas.
Atenciosamente
Prof. Dr. Claudiomar Soares Brod Coord. CCZ/UFPel Orientador do Projeto de Mestrado
P.S. Abaixo, encaminhamos as normas do Ministério as Saúde para Vigilância e
Controle da Leishmaniose Visceral.
62
AÇÕES DA VIGILÂNCIA DA LVC CONFORME MANUAL MS, 2006.
5.3.2 Ações de Vigilância
As ações de vigilância sobre o reservatório canino deverão ser desencadeadas,
conforme descrito: • Realizar alerta ao serviço e à classe médica veterinária, quanto ao risco da
transmissão da leishmaniose visceral canina – LVC; • Divulgar à população sobre a ocorrência da LVC na região e alertar sobre os sinais clínicos e os serviços para o diagnóstico, bem como as medidas preventivas para
eliminação dos prováveis criadouros do vetor; • Para o poder público, desencadear e implementar as ações de limpeza urbana em
terrenos, praças públicas, jardins, logradouros entre outros, destinando de maneira adequada a matéria orgânica recolhida. • Na suspeita clínica de cão, delimitar a área para investigação do foco. Define-se
como área para investigação, aquela que, a partir do primeiro caso canino (suspeito ou confirmado), estiver circunscrita em um raio de no mínimo 100 cães a serem
examinados. Nesta área deverão ser desencadeadas: • Busca ativa de cães sintomáticos para exame parasitológico e confirmação da identificação da espécie de Leishmania. Uma vez confirmada a L. chagasi, coletar
material sorológico em todos os cães da área, a fim de avaliar a prevalência canina e desencadear as demais medidas.
63
5.3.3 Monitoramento
5.3.3.1 Inquérito sorológico amostral
Este tipo de inquérito deverá ser realizado nas seguintes situações:
• Municípios silenciosos e receptivos, isto é, onde a L. longipalpis já foi detectada, mas não tenha sido confirmada a transmissão da LV humana ou canina, com a
finalidade de verificar ausência de enzootia; • Municípios com transmissão moderada e intensa, que permitirá avaliar as taxas de
prevalência em cada setor, a fim de identificar as áreas prioritárias a serem trabalhadas. O inquérito poderá ser realizado em todo ou em parte do município dependendo do
tamanho do mesmo e da distribuição do vetor. Será utilizada amostragem estratificada por conglomerados, onde o estrato é um
setor do PEAa (setorização realizada quando implementada o plano de erradicação do Aedes aegypti) e o conglomerado, o quarteirão. Para cada setor será calculada a amostra de cães considerando-se a prevalência
esperada e o número de cães do setor, conforme a tabela 2. Para aqueles municípios que já tenham uma estimativa de prevalência conhecida, utilizar este
valor como parâmetro. Caso contrário, utilizar a prevalência de 2%. Por exemplo, a amostra deverá ser tomada em cada setor, onde deverá ser sorteado um determinado número de quarteirões até atingir o número de cães que
compõem a amostra. Para efeito de cálculo do número de quarteirões a serem sorteados, considerou-se que em média cada quarteirão possui 20 imóveis, cada
imóvel 4 habitantes e que a relação do número de cães por habitante é de 1:5. Portanto, a estimativa é que haja em média 16 cães por quarteirão. Dessa forma, o
número de quarteirões a serem sorteados poderá ser determinado pela fórmula:
Onde:
Q é o número estimado de quarteirões a serem trabalhados;
n é o número de cães previstos na amostra por setor (conforme tabela a seguir); Â é o número médio de cães por quarteirão, que é igual a 16.
64
Para o sorteio dos quarteirões deverá ser utilizado o conjunto de tabelas de números
aleatórios. Sendo sorteada, primeiro a tabela e, em seguida, o primeiro número da tabela, o qual corresponderá ao primeiro quarteirão sorteado. O número de
algarismos a ser utilizado na(s) coluna(s), dependerá do maior valor numérico do quarteirão existente no setor. Para uti lização da tabela de números aleatórios, é necessário sortear a coluna e
seguir sistematicamente de cima para baixo e da esquerda para a direita. Para obter uma melhor distribuição espacial da amostra no setor, deverão ser
trabalhados 50% dos imóveis existentes no quarteirão, sistematicamente. Para tanto, iniciar o trabalho em cada quarteirão na esquina mais ao Norte (devidamente assinalada no mapa), no imóvel sorteado (primeiro ou segundo), prosseguindo
alternadamente em sentido horário, até que o quarteirão tenha sido totalmente coberto.
Setores com população canina inferior a 500 cães deverão ser agrupados com um ou mais setores contíguos, para o cálculo da amostra. Por outro lado, em municípios com população inferior a 500 cães, deverá ser realizado inquérito canino censitário.
5.3.3.2 Inquérito sorológico censitário
Este tipo de inquérito deverá ser realizado nas seguintes situações: • em zona urbana de município classificado como silencioso e receptivo com população canina menor que 500 cães;
• em setores urbanos de municípios classificados como de transmissão moderada ou intensa;
• em zona rural de municípios em qualquer uma das situações de transmissão de LV;
Este tipo de inquérito terá como objetivo o controle através da identificação de cães infectados para a realização da eutanásia, como também de avaliar a prevalência.
Estes inquéritos deverão ser realizados, anualmente, sincronizado com as demais ações de controle, por no mínimo 3 anos consecutivos, independente da notificação de novos casos humanos confirmados de LV.
A fim de não sobrecarregar os laboratórios de saúde pública de referência para a realização dos exames, o planejamento das ações deverá ser realizado em conjunto
com as instituições que compõem o Programa de Vigilância de LV no estado.
65