universidade anhanguera de sÃo paulo rose … · universidade anhanguera de sÃo paulo rose...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE ANHANGUERA DE SÃO PAULO
ROSE APARECIDA SCHIAVON SANCHEZ MATURANO
EFEITO INIBITÓRIO DA PRÓPOLIS SOBRE A ATIVIDADE PROTEOLÍTICA DAS CISTEÍNO-CATEPSINAS
SÃO PAULO
2015
UNIVERSIDADE ANHANGUERA DE SÃO PAULO
ROSE APARECIDA SCHIAVON SANCHEZ MATURANO
EFEITO INIBITÓRIO DA PRÓPOLIS SOBRE A ATIVIDADE PROTEOLITICA DAS CISTEÍNO-CATEPSINAS
Dissertação apresentada à Universidade Anhanguera de São Paulo para obtenção do título de MESTRE em Biomateriais, Área de Concentração: Biomateriais em Odontologia. Orientadora: Profª Drª Andréa Anido Anido. Co-orientadora: Profª Drª. Polliana Mendes Candia Scaffa
SÃO PAULO
2015
M397e Maturano, Rose Aparecida Schiavon Sanchez
Efeito inibitório da própolis sobre a atividade proteolítica das cisteíno catepsinas. / Rose Aparecida Schiavon Sanchez Maturano – São Paulo, 2015.
88 f.: il. 30 cm Dissertação (Programa de Mestrado em Biomateriais) – Coordenadoria
de Pós- graduação, Universidade Anhanguera de São Paulo, 2015.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Andréa Anido Anido Co-orientadora: Prof.ª Dr.ª Polliana Mendes Candia Scaffa
1. Sistemas de união. 2. Enzimas proteolíticas. 3. Própolis. 4.
Resistencia de união I. Título II. Universidade Anhanguera de São Paulo.
CDD 610
ROSE APARECIDA SCHIAVON SANCHEZ MATURANO
EFEITO INIBITÓRIO DA PRÓPOLIS SOBRE A ATIVIDADE PROTEOLÍTICA DAS CISTEÍNO-CATEPSINAS
DISSERTAÇÃO APRESENTADA À UNIVERSIDADE ANHANGUERA DE SÃO PAULO PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRADO EM BIOMATERIAIS, ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: BIOMATERIAIS EM ODONTOLOGIA.
PRESIDENTE E ORIENTADOR Nome:..................................................................................................................... Titulação:................................................................................................................ Instituição:.............................................................................................................. Assinatura:.............................................................................................................. 2º Examinador Nome:....................................................................................................................... Titulação:.................................................................................................................. Instituição:................................................................................................................ Assinatura:................................................................................................................
3º Examinador Nome:........................................................................................................................ Titulação:................................................................................................................... Instituição:................................................................................................................. Assinatura:................................................................................................................. NOTA FINAL:........................................... Biblioteca Bibliotecário:............................................................................................................ Assinatura:....................................................................Data:....../....../......
São Paulo,......de ......................................de 2015.
DEDICATÓRIA
Dedico esse capítulo da história da minha vida, a uma pessoa, que me carregou e ainda
continua a me carregar no colo para que eu atinja novos horizontes. Tenho certeza de que ele
está vibrando com essa conquista.
Ao amor verdadeiro
Ao meu amor
Ao meu Pai: ALBINO SCHIAVON
Um amigo, um companheiro, que na sua essência soube me dar amor, carinho e os
ensinamentos de um ser de verdade.
Você é um presente que Deus colocou no meu caminho para me guiar e me
transformar em uma pessoa melhor, mais humana e compreensiva.
Dedico também esse capítulo a outra pessoa muito importante na minha vida meu
irmão Roberto Aparecido Schiavon Sanchez que me fez uma pessoa mais feliz. Com quem
dividi minhas alegrias e tristezas. Que partiu muito cedo e deixou saudade dos bons
momentos que passamos juntos. Eternamente no meu coração com seu sorriso fácil e gostoso,
cheio de alegria. Saudade de você e agradeço a Deus por você ter sido essa pessoa alegre e feliz,
na sua essência e no seu caráter. Te Amo.
Vocês estarão sempre no meu coração. Amo Vocês.
Eternamente juntos e com a certeza de um reencontro.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Aos meus grandes mentores: Albino Schiavon e Luzia Sanchez Schiavon, meus
mestres e doutores, que me ensinaram a conduzir a vida com caráter, dignidade, honestidade.
Sem eles não seria o que sou, não teria o que tenho, devo toda minha conduta de vida a eles.
Meus Pais Queridos. Amo muito vocês.
Ao meu irmão querido Roberto Aparecido Schiavon Sanchez que sempre foi um
incentivador dos meus estudos e por estar sempre ao meu lado.
Ao meu marido Almir Maturano, que me compreendeu nas horas difíceis e me apoiou
nessa conquista, com carinho, paciência e companheirismo. Me fortaleceu com conselhos na
realização dos meus sonhos e objetivos. Muito Obrigada.
Aos meus filhos por quem tenho um amor infinito: Caio Schiavon Maturano, Lucas
Schiavon Maturano e Danilo Schiavon Maturano. Os amores da minha vida, a alegria
dos meus dias, a luz e o perfume da minha alma, que também me incentivaram a continuar.
Tenho muito orgulho de vocês.
A minha prima-irmã, Antonia Aparecida Biangolini, que também soube me
escutar, entender e me incentivar. Muito Obrigada por amar meus filhos incondicionalmente.
Ao meu sogro Antonio Maturano. Muito Obrigada pelo carinho dado a todos nós e
aos meus filhos. Sentimos muito a sua partida. Saudade eterna.
Meu carinho por uma amiga, Izildinha dos Prazeres Cruz Reis, juntas desde a
graduação, nos cursos de aperfeiçoamento e que tão cedo partiu, mas que estará sempre dentro
do meu coração. Obrigada pela amizade sincera.
AGRADECIMENTOS
À minha Orientadora Profª Drª Andrea Anido Anido, que com companheirismo e
amizade, me deu exemplo de dedicação, paciência e profissionalismo. Os momentos que
passamos juntas ficarão eternamente no meu coração. Para você meus mais profundos
agradecimentos.
À Profª Drª Polliana Mendes Candia Scaffa, minha co-orientadora, solícita e
presente, que contribuiu de forma efetiva para que este trabalho fosse realizado e tão bem
concluído.
Ao querido Prof. Dr. Camillo Anauate Netto, que me recebeu de braços abertos
nesse novo caminho. Mostrou que capacidade caminha junto com respeito, dignidade e
sabedoria. Muito Obrigada pela consideração e confiança.
Fabiana Barbara Piveta Flores, minha companheira de Mestrado, que com seu
dinamismo e perseverança, me manteve conectada às informações importantes do nosso
aprendizado, que soube me escutar e direcionar neste novo caminho. Sentirei saudades dos
momentos que passamos juntas e agradeço muito a sua amizade.
À uma pessoa muito querida que me orienta, incentiva, aconselha e por quem sinto um
profundo respeito, Homero Gastaldo, que com sua suavidade soube me dar carinho e
atenção.
Aos Professores e Professoras do Mestrado Profissional de Biomateriais em
Odontologia – UNIAN com os quais tive o prazer de conviver em sala de aula e na clínica:
Profª. Drª. Alejandra Hortencia Miranda Gonzáles; Profª. Drª. Marcela Rocha
Oliveira Carrilho; Profª. Drª. Roberta Caroline Bruschi Alonso; Prof. Dr. Fábio
Dupart Nascimento; Prof. Dr. Hugo Roberto Lewgoy ; Prof. Dr. Paulo Henrique
Perlatti D’Alpino; Prof. Dr. Ricardo Amore; Prof. Dr. Vinicius Di Hipólito. Aprendi
nesse período de estudos a respeitá-los cada vez mais.
Aos colegas de Mestrado, Consultório e Clínica pelas experiências trocadas e
convívio que deixarão saudades.
A todos que direta ou indiretamente me ajudaram a chegar onde cheguei e alcançar um
degrau a mais nessa escalada da vida, aprendendo, compreendendo e aceitando a vida como ela
é.
Dedico, enfim, a todos que fizeram parte dessa jornada para que este trabalho fosse
realizado.
Tenho certeza que Deus colocou todos vocês no meu caminho para que esta conquista
fosse tão bem conduzida e concluída.
Com carinho e um beijo no coração de cada um!
Rose Aparecida Schiavon Sanchez Maturano
“Lute com determinação, abrace a vida com paixão, perca com classe e vença com ousadia;
porque o mundo pertence a quem se atreve e a vida é muito para ser insignificante.”
Charles Chaplin
RESUMO
O comprometimento da interface de união dentina/compósito de resina é
acompanhado por alterações morfológicas do sistema de união e do substrato
dentinário. A degradação do colágeno dentinário vem sendo relacionada à atividade
proteolítica endógena, sendo que as metaloproteinases (MMPs) e as cisteíno-
catepsinas (CTs) são enzimas presentes na matriz dentinária e estão envolvidas
neste processo de degradação. A própolis possui propriedades antioxidante e
antisséptica, agindo sobre microrganismos patogênicos orais. Sendo assim, o
objetivo deste estudo foi avaliar o potencial de inibição das própolis, verde e
vermelha nas concentrações 10µg e 100µg, sobre a CT-B purificada e as proteínas
extraídas da dentina, bem como, a sua influência na resistência de união da
interface dentina/compósito de resina. A capacidade da própolis em inibir a atividade
da CT-B e a atividade proteolítica intrínseca da dentina foi analisada por hidrólise de
substrato fluorogênico específico (Z-FR-MCA). Para determinação da atividade
proteolítica da dentina, foi realizada extração das CTs de 10 molares humanos. Para
determinar o efeito da própolis na resistência de união compósito/dentina, foi
realizado um teste de microtração. Para tanto, foram selecionados 20 molares
humanos recém extraídos, os quais tiveram a superfície dentinária exposta e
planificada com lixas de carbeto de silício #600 e foram distribuídos aleatoriamente
em 2 grupos de acordo com a técnica restauradora 1) controle – convencional; 2)
tratamento com própolis vermelha na concentração de 100 µg (n=5). Para cada
dente, foi confeccionada uma coroa em resina composta (Filtek Z100 cor A2). As
amostras foram armazenadas em estufa bacteriológica a 37ºC por 24hs, e
seccionadas para produzir palitos de 0,9 mm x 0,9 mm (especificações ISO 11405).
Os palitos foram aleatoriamente distribuídos em 2 grupos segundo o período de
avaliação (imediato e 18 meses de armazenamento). Os palitos foram testados em
máquina de ensaio universal Instron. Os dados do teste de resistência de união
foram tabulados e submetidos ao teste t com nível de significância 5 %. Os
resultados mostraram que a própolis vermelha apresentou potencial inibitório
superior à verde tanto na concentração de 10 µg quanto 100 µg. A própolis vermelha
foi capaz de inibir com maior eficiência a hidrólise do substrato fluorescente tanto
quando incubada com a enzima purificada quanto com as proteases presentes no
extrato da dentina. A avaliação da resistência de união mostrou que a própolis
vermelha é capaz de preservar a integridade da interface de união após 18 meses
de armazenamento, prevenindo a queda na resistência de união ao longo do tempo.
Palavras-chave: Sistemas de união, enzimas proteolíticas, própolis, resistência de
união.
ABSTRACT
ABSTRACT
The degradation of dentin /composite interface cause morphological alteration on the
resin layer and on dentin. In dentin, the collagen degradation has been related to
endogenous proteolytic activity of metalloproteinases (MMPs) and cysteine-
cathepsins (CTs). Propolis has antioxidant properties and acts on oral pathogenic
microorganisms. Thus, the aim of this study was to evaluate the inhibition potential of
green and red propolis, in concentrations 10µg and 100μg on the CT-B purified and
extracted dentin proteins, as well as its influence in the dentin bond strength of a
restorative composite. The propolis ability to inhibit the activity of CT-B and the
intrinsic proteolytic activity of dentin was analyzed by specific fluorogenic substrate
hydrolysis (Z-FR-MCA). For the extraction of CTs, ten human molars were used. For
microtensile bonding strength test, 20 freshly extracted human molars were selected.
The teeth had dentin surface exposed and grounded with silicon carbide sandpaper #
600. They were randomly distributed into 2 groups (control and propolis treated
dentin - n = 5). A composite resin (Filtek Z100 color A2) crown was build-up. The
samples were stored in a bacteriological incubator at 37 ° C for 24 hours, and
sectioned to produce sticks of 0.9 mm x 0.9 mm (ISO 11405 specifications). After
sticks were randomly distributed in two subgroups according to the evaluation period
(immediate and 18months), and evaluated in a universal testing machine. Bond
strength data were tabulated and submitted to test t with significance level of 5 %.
The results showed that red propolis exhibited higher inhibition than green propolis at
concentration of 10 µg or 100 µg. Red propolis was able to effectively inhibit purified
enzyme as proteases as well as enzymes present in the dentin extract. Also, red
propolis in the concentration of 100 ug could preserve the bonding interface after 18
months of storage, preventing the drop in bond strength over time.
Key words: Adhesive systems, proteolytic enzyme, propolis, bond strength.
LISTA DE ABREVIATURAS
APMA Acetato de Aminofenilmercúrio
ºC Graus Celsius
Ca++ Íons Cálcio
CATEF Câmara Técnica de Medicamentos Fitoterápicos
CAPE Ácido Fenil Éster Caféico
CHX Digluconato de Clorexidina
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CO Cicloxigenase
CTs Cisteíno-Catepsinas
CT-B Catepsina B
CT-K Catepsina K
CT-L Catepsina L
Cys Cisteína
DTT Ditiotreitol
EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
EEP Extrato Etanólico de Própolis
E64 Inibidor Específico
GAGs Glicosaminoglicano
h Hora
Hz Hertez
JAD Junção Amelodentinária
LOX Lipoxigenase
M Mol
mM Mini-Mol
µM Micro-Mol
µg Micro-Grama
MDPB Compostos Quaternários de Amônia
MEC Membrana Extracelular
mm/s Milímetros por Segundo
MMPS Metaloproteinases da Matriz
MT-MMP Metaloproteinases do Tipo Membrana
NaCl Cloreto de Sódio
nM Nanômetro
PBS Índice de Sangramento Papilar
pH Potencial Hidrogeniônico
TIMPs Inibidores Teciduais de Metaloproteinases
da Matriz
Tris-HCl Tris(Hidrometil) Aminometano Ácido
Clorídrico
UAF Unidade Arbitrária de Fluorescência
UV Radiação Ultra-Violeta
Z-FR-MCA Benzyloxycarbonyl-PheArg-Methyl-7-
Aminocoumarin Amide
Zn++ Íons Zinco
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Representação Esquemática da Estrutura Protéica das MMPs..................................................... 35
FIGURA 2 - Esquema de Ativação das MMPs............................... 36
FIGURA 3 - Representação Esquemática da Estrutura das
Cisteíno-Catepsinas Endopeptidase.......................... 39
FIGURA 4 - Amostras da Própolis Verde e da Própolis
Vermelha em sua Forma Bruta................................... 53
FIGURA 5 - Obtenção das Proteínas da Matriz Dentinária.
Dente humano(A); remoção do esmalte (B);
obtenção de fragmentos de dentina (C). ................... 54
FIGURA 6- Moinho de Bolas. Moinho de bolas com os
dispositivos de aço inox em posição utilizados
para obtenção do pó de dentina (A);
dispositivo retirado após o ciclo de moagem
contendo o pó de dentina a ser utilizado (B). ............. 55
FIGURA 7 - Cubeta e Espectofotômetro Hitachi F7000,
com câmara de monitoramento.................................. 57
FIGURA 8 - Leitor de Placas de 96 Poços...................................... 57
FIGURA 9 - Preparo dos Dentes. Limpeza e armazenamento
dos dentes (A); remoção da face oclusal dos
dentes e obtenção da fatia de dentina (B);
desgaste em politriz para remoção da área plana
em dentina e padronização da smear layer (C). ........ 58
FIGURA 10 - Obtenção dos Espécimes. Obtenção de área
plana em dentina (A); confecção de coroa em
resina composta (B); obtenção de espécimes em
forma de palito (C). ......................................................61
FIGURA 11- Máquina de Testes. Máquina Universal de Testes
Instron (A); espécime fixado em jig adaptado
à máquina de testes (B); espécime após a
realização do teste de tração (C). ............................. 61
LISTA DE QUADRO
QUADRO 1 Materiais utilizados............................60
LISTA TABELA
TABELA 1 Resistência de união (DP) MPa para
os grupos avaliados....................66
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 Atividade Enzimática da Catepsina B (em unidades
arbitrárias de fluorescência) em função das duas
concentrações da própolis vermelha (em
µg).........................................................................62
GRÁFICO 2 Atividade Enzimática da Catepsina B (em unidades
arbitrárias de fluorescência) em função das duas
concentrações da própolis verde (em
µg).........................................................................63
GRÁFICO 3 Porcentagem de inibição da atividade enzimática
da Catepsina B (em unidades arbitrárias de
fluorescência) em função das duas concentrações
da própolis vermelha (em
µg).........................................................................63
GRÁFICO 4 Porcentagem de inibição da atividade enzimática
da Catepsina B (em unidades arbitrárias de
fluorescência) em função das duas concentrações
da própolis verde (em
µg).........................................................................64
GRÀFICO 5 Atividade enzimática no extrato dentinário (em
unidades arbitrárias de fluorescência por
micrograma de proteína de dentina) em função de
diferentes concentrações de própolis (em
µg).........................................................................65
SUMÁRIO
1-INTRODUÇÃO...................................................................................................... 22
2-REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................... 26
2.1-SUBSTRATO DENTAL......................................................................................... 26
2.2-SISTEMAS DE UNIÃO......................................................................................... 28
2.2.1- Sistema de união convencional ou etch-and-rinse........................... 30
2.2.2- Sistema de união autocondicionante ou self-etch............................ 31
2.2.3- Degradação da interface adesiva...................................................... 31
2.3- ENZIMAS DA MATRIZ DENTINÁRIA.................................................................. 33
2.4-INIBIDORES SINTÉTICOS DE PROTEASES........................................................... 40
2.5- PRÓPOLIS......................................................................................................... 42
2.5.1- Composição química e propriedades biológicas da própolis............ 46
2.5.2- Uso da própolis na Odontologia....................................................... 48
3- PROPOSIÇÃO...................................................................................................... 52
4-MATERIAL E MÉTODO......................................................................................... 53
4.1- ASPECTOS ÉTICOS........................................................................................... .53
4.2-OBTENÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO DE PRÓPOLIS (EEP)............................... 53
4.3-OBTENÇÃO DAS PROTEÍNAS LIGADAS À MATRIZ DENTINÁRIA........................ 54
4.3.1- Protocolo de extração................................................................... 55
4.4- POTENCIAL INIBITÓRIO DA PRÓPOLIS SOBRE A CISTEÍNO-CATEPSINA B
(CT-B)........................................................................................................... 56
4.5- AVALIAÇÃO DA RESISTÊNCIA DE UNIÃO.......................................................... 57
4.5.1- Corte e obtenção dos espécimes...................................................... 60
4.5.2- Análise estatística............................................................................. 61
5-RESULTADOS....................................................................................................... 62
5.1- INIBIÇÃO ENZIMÁTICA..................................................................................... 62
5.2- RESISTÊNCIA DE UNIÃO................................................................................... 65
6- DISCUSSÃO......................................................................................................... 67
7-CONCLUSÃO........................................................................................................ 73
REFERÊNCIAS.......................................................................................................... 74
22
1 - INTRODUÇÃO
O avanço da Odontologia Restauradora, o aprimoramento dos materiais
poliméricos e dos sistemas de união, que são os materiais responsáveis por produzir
a adesão do material restaurador às estruturas dentais, revolucionaram a prática
odontológica caracterizando a Odontologia Adesiva (SCAVUZZI, BEZERRA &
TOBIAS, 2001).
Em princípio a adesão ao esmalte é alcançada de forma fácil e previsível
(GORACCI et al., 2004) em contrapartida a adesão ao tecido dentinário ainda é um
desafio a ser superado. Por se tratar de um substrato complexo de difícil
hibridização, diversos complicadores tendem a degradar a interface adesiva, como a
presença de umidade e da matriz orgânica. Assim para que o procedimento adesivo
seja satisfatório e bem sucedido, o conhecimento das características histo-
morfológicas dos tecidos dentais envolvidos se faz necessário para que a adesão
possa ser eficiente nos dois substratos.
O esmalte dental é um tecido homogêneo apresentando em sua composição
96% de cristais de hidroxiapatita (material inorgânico) e 4% restantes água e
conteúdo orgânico. Em contrapartida a dentina é um tecido heterogêneo, apresenta
em sua composição 50% de material inorgânico, 30% de conteúdo orgânico (fibrilas
de colágeno) e 20% de água (LINDE & GOLDBERG, 1993), essas diferenças são
fatores complicadores que tendem a degradar a interface adesiva ao longo do
tempo, o que demonstra que os requisitos para que a técnica adesiva possa ser
eficiente nos substratos envolvidos é de difícil padronização.
A presença de conteúdo orgânico faz com que o procedimento adesivo no
tecido dentinário deva ser realizado com critério e parcimônia. Com a finalidade de
se obter uma adesão confiável em dentina, os sistemas de união são extensamente
avaliados e aprimorados (CARVALHO et al., 2004).
No entanto, mesmo com tantos estudos e avanços, as restaurações ainda
perdem sua efetividade, apresentam manchamentos, falhas em suas margens e
recidiva de cárie, o que demonstra a sua limitação com o tempo.
23
Estudos indicam que o comprometimento da interface de união é
acompanhado por alterações morfológicas que revelam a desestruturação tanto do
sistema de união quanto da dentina modificada pelo procedimento adesivo
(HASHIMOTO et al., 2003; PASHLEY et al., 2004; HEBLING et al., 2005; KOSHIRO
et al., 2005; CARRILHO et al., 2007). Desta forma podemos concluir que a
degradação tanto da porção resinosa quanto da porção orgânica da camada híbrida
diminui a longevidade das restaurações adesivas ao longo do tempo.
Após a constatação de que a degradação enzimática comprometia a
estabilidade das restaurações, estudos se voltaram para o entendimento de como as
enzimas presentes no tecido dentinário poderiam ser ativadas apontando que sua
ação poderia interferir na adesão dos materiais restauradores. Dentre as enzimas
envolvidas no processo de metabolismo e remodelação do colágeno dentinário
estão as metaloproteinases da matriz (MMPs) (MARTIN-DE LAS HERAS,
VALENZUELA & OVERALL, 2000; PASHLEY et al., 2004) e as cisteíno-catepsinas
(CTs) (TERSARIOL et al., 2010).
As MMPs presentes na cavidade oral, relacionadas aos processos
fisiológicos, atuam na organização e mineralização da matriz orgânica durante a
dentinogênese, sugerindo que a presença destas enzimas na dentina tenha
participação na remodelação da matriz dentinária antes ou durante este processo
(MARTIN-DE LAS HERAS, VALENZUELA & OVERALL, 2000). Nos processos
patológicos participam em carcinomas e tumores de glândulas salivares (SORSA,
TJÄDERHANE & SALO, 2004), na degradação da matriz dentinária (PASHLEY et
al., 2004), e também atuam na progressão da doença periodontal (SORSA et al.,
2006).
As CTs são enzimas pertencentes à família da papaína conhecidas como
enzimas multifuncionais envolvidas na remodelação tecidual, na degradação do
colágeno e na clivagem das proteínas da membrana (TURK, TURK & TURK., 2000),
também relacionadas às doenças periodontais, reabsorção óssea e processos
tumorais (DICKINSON, 2002). Recentes estudos observaram a presença e atividade
das CTs em dentina (TERSARIOL et al., 2010; NASCIMENTO et al., 2011). A
expressão gênica de diferentes CTs (B, C, F, H, K, L, O, S, V, X e W) foi
24
demonstrada no tecido pulpar humano e em odontoblastos, e foi reportada a
presença de CT-B em dentina sadia (TERSARIOL et al., 2010). Segundo
Nascimento e colaboradores (2011), houve um aumento na expressão e na
atividade desta enzima em dentina cariada quando comparado à dentina sadia.
Na busca em estabelecer uma forma de inibir estas enzimas, a clorexidina
(CHX) foi utilizada e demonstrou ter uma ação inibitória potente na atividade de
MMP-2, -8 e -9 (GENDRON et al., 1999) e incentivou alguns pesquisadores a
determinar a possibilidade de estabilizar a matriz orgânica na área de união
compósito de resina e dentina. Isto levou a inúmeros trabalhos in vitro (PASHLEY et
al., 2004; CARRILHO et al., 2007a) e in vivo (HEBLING et al., 2005; CARRILHO et
al., 2007b; BRACKETT et al., 2007), que demonstraram que a CHX apresenta
efeitos positivos sobre a preservação desta área de união, oferecendo assim uma
alternativa valiosa para minimizar o processo de degradação da matriz orgânica.
Como uma alternativa natural, a própolis vem sendo utilizada como
coadjuvante no tratamento das patologias orais na Clínica Odontológica. Na
Endodontia foi utilizada como irrigante endodôntico e promoveu a regeneração
apical de dentes acometidos de necrose pulpar (SCHELLER et al., 1978), foi
utilizada diretamente sobre a polpa dental podendo retardar a inflamação pulpar,
estimulando a formação de dentina reparadora (SABIR et al., 2005). Na Periodontia
foi observada redução da placa bacteriana e melhora satisfatória nos casos de
gengivite (MARTINEZ-SILVEIRA, 1988), nas aftas bucais foi observada redução dos
sintomas dolorosos já nas primeiras aplicações (GARCIA & GARGUERA, 1993).
Além disso, foi utilizada como proteção medicamentosa em alvéolos de dentes
recém avulsionados promovendo uma melhor regeneração (D’AURIA et al., 2003;
MARTIN & PILEGGI, 2004).
A própolis se mostra um recurso promissor, visto que sua ação sobre
microrganismos responsáveis pela doença periodontal e pela instalação da cárie,
através de sua utilização como solução enxaguatória bucal foi realizada e
demonstrou resultados favoráveis (ANAUATE-NETTO et al., 2013; ANAUATE-
NETTO et al., 2014; ERCAN et al., 2015). Desta forma, a própolis surgiu como uma
25
alternativa natural por suas propriedades bioativas, antioxidante, antissépticas e por
agir em diversos microrganismos patogênicos orais.
Portanto, avaliar o potencial de inibição da própolis, verde e vermelha, sobre a
CT-B purificada e as proteases extraídas da dentina sadia, bem como, verificar a
influência da própolis sobre a resistência de união da interface dentina/compósito de
resina, torna-se de extrema valia na busca por estabelecer maior longevidade para
os procedimentos restauradores. Se for possível promover um selamento efetivo dos
substratos dentais sadios, com maior longevidade, certamente os riscos de novos
processos patológicos serão reduzidos, e, por conseguinte, maior será a
preservação do remanescente dental.
26
2 - REVISÃO DE LITERATURA
Esta revisão está dividida em tópicos, para melhor entendimento das
estruturas dentárias e das técnicas operatórias envolvidas na realização dos
procedimentos adesivos.
2.1- SUBSTRATO DENTAL
O esmalte é o tecido mais mineralizado do corpo humano, sua composição é
de 96% de conteúdo mineral sob a forma de cristais de hidroxiapatita e 4% restantes
constituídos por água e material orgânico (KATCHBURIAN & ARANA, 2004).
Portanto a adesão torna-se mais previsível e duradoura por se tratar de um
substrato homogêneo.
A dentina assemelha-se ao osso, apresentando em sua composição química,
aproximadamente 70% de matéria inorgânica, 20% de material orgânico proveniente
dos componentes da matriz extracelular secretada pelos odontoblastos durante sua
formação e 10% de água em peso. Em volume a dentina apresenta 50% da sua
composição formada por minerais, 30% conteúdo orgânico e 20% água (LINDE &
GOLDBERG, 1993). O componente inorgânico consiste em cristais de hidroxiapatita
semelhante ao osso, cemento e esmalte, encontrados dentro e entre as fibrilas de
colágeno mineralizadas, por sua vez o componente orgânico é formado por uma
rede de fibrilas de colágeno que engloba os cristais de hidroxiapatita, imersa em
uma substância amorfa (BUTLER, RITCHIE & BRONCKERS, 1997; BUTLER, 1998).
A dentina por sua resiliência apresenta propriedade de proteger o órgão
dental e sua inter-relação com o esmalte, caracteristicamente friável, permite que os
dentes consigam absorver e dissipar as ações fisiológicas da mastigação e as
diferenças de temperaturas que a estrutura dental é constantemente submetida
(TEN CATE, 1994).
27
Junto ao tecido pulpar, localiza-se a pré-dentina que representa a matriz
dentinária antes da mineralização e, à medida que as fibrilas de colágeno são
mineralizadas, passa a se chamar dentina. Este processo vai sendo renovado com a
formação de uma nova camada de pré-dentina (BUTLER, 1992).
A dentina apresenta característica tubular, cujos túbulos dentinários estão
dispostos radialmente, suas curvaturas primárias percorrem trajetos sinuosos a partir
da superfície pulpar em direção à junção amelodentinária e ao cemento, seu maior
diâmetro está voltado para a câmara pulpar e, à medida que se aproxima da polpa,
há a ocorrência de uma maior densidade de túbulos por área delimitada, com maior
diâmetro e maior permeabilidade. São responsáveis pela transmissão dos estímulos
dolorosos à polpa (LUNDY & STANLEY, 1969a). Estima-se em 20.000/mm² o
número de túbulos na porção externa, 40.000/mm² na porção central e 50.000/mm²
na porção interna, mais próximo da polpa (OLSSON, OILO & ADAMCZAK, 1993).
Os túbulos dentinários vão se tornando mais estreitos ocorrendo uma intensa
ramificação próximo à junção entre esmalte e dentina que vai sendo mineralizada
pela matriz dentinária, formando desta forma os canalículos dentinários (ARANA-
CHAVEZ & MASSA, 2004; KATCHBURIAN & ARANA, 2004).
Entre os túbulos dentinários observa-se a dentina intertubular que é formada
pela deposição mineral que ocorre sobre a matriz orgânica entre as fibrilas de
colágeno, alto conteúdo orgânico, portanto rica em fibras colágenas e menos
mineralizada que a dentina peritubular (MARSHALL et al., 1997).
A dentina peritubular origina-se a partir da deposição dos cristais de apatita
entre os espaços vazios existentes na matriz orgânica, apresenta pequena
quantidade de fibras colágenas, alto conteúdo mineral, circunda os limites dos
túbulos dentinários reduzindo o seu diâmetro e frequentemente sua deposição está
associada ao envelhecimento fisiológico do órgão dental, conduzindo assim à
obliteração dos túbulos dentinários e da dentina radicular (HOLLAND, 1994).
A dentina compõe a maior parte do dente, sendo responsável por formar toda
sua estrutura. Considerada um tecido conjuntivo avascular, parcialmente
mineralizado, em consequência da grande quantidade de sais de cálcio secretado
pela polpa, conferindo uma coloração branco-amarelada ao tecido, que vai se
28
tornando mais escurecido com o avanço da idade, apesar de ser sólido, é um tecido
vivo e elástico. A dentina primária é depositada no período da odontogênese e se
forma até o completo irrompimento do dente e a formação do ápice radicular. Após
esse período ocorre a diminuição na deposição de dentina pelos odontoblastos,
caracterizando a dentina secundária, que é depositada contínua e lentamente
durante toda vida do órgão dental, promovendo uma diminuição fisiológica do
volume da câmara pulpar e do canal radicular (SMITH, 2002).
O desenvolvimento da dentina acontece antes do esmalte e do cemento,
delimita o modelo da coroa, das cúspides e bordas incisais, do tamanho e número
de raízes, além de ser responsável pela forma e composição da maior parte do
dente (BERKOVITZ, HOLLAND & MOXHAM, 2004).
A mineralização da dentina ocorre com a deposição dos cristais de
hidroxiapatita sobre a matriz orgânica pré-existente (KATCHBURIAN & ARANA,
2004).
2.2- SISTEMAS DE UNIÃO
A grande procura por uma Odontologia Estética vem de encontro com a
conservação das estruturas dentais, sem a necessidade de desgastes
desnecessários dos tecidos mineralizados para a reabilitação das superfícies
comprometidas, por lesões de cáries, fraturas ou desgastes, possibilitando o
desenvolvimento de inúmeras técnicas clínicas, aprimorando com isso os sistemas
de união utilizados na Odontologia Moderna (LAXE, 2007).
Os sistemas de união preconizam a utilização do condicionamento ácido
promovendo a desmineralização seletiva dos prismas de esmalte resultando em
microporos que aumentam a energia de superfície permitindo molhamento deste
tecido e favorecendo a retenção mecânica do material (SILVERSTONE et al., 1975;
CARVALHO et al., 2004). Em dentina Fusayama e colaboradores (1979),
propuseram o condicionamento em dentina com a finalidade de remoção da smear
layer.
29
A desmineralização das dentinas peri e intertubular expõe os túbulos
dentinários, as fibrilas de colágeno, removendo completamente a smear layer
(PASHLEY & CARVALHO, 1997; TAY & PASHLEY, 2001), diminuindo a energia de
superfície que deve ser melhorada com a aplicação de uma solução de monômeros
diluídos em solventes, com características hidrofílicas, o primer e do adesivo
propriamente dito, que é composto de monômeros hidrofóbicos, que após sua
polimerização resultam na formação de uma estrutura denominada camada híbrida
(NAKABAYASHI, KOJIMA & MASUHARA, 1982).
A presença de umidade na dentina desmineralizada é fundamental para que a
água possa manter os espaços dos cristais de hidroxiapatita impedindo o
colabamento das fibrilas de colágeno. Vale salientar que o controle criterioso da
umidade dentinária é importante para que o processo de hibridização seja eficaz no
selamento da dentina e na preservação da restauração na técnica úmida de
hibridização (KANCA, 1992a, b). O mesmo cuidado é fundamental no que concerne
à desidratação excessiva pelos jatos de ar ocasionando a contração das fibrilas de
colágeno, resultando em colapso da matriz orgânica, reduzindo a permeabilidade da
zona desmineralizada (CARVALHO et al., 1996).
Segundo Perdigão & Ritter (2003) o condicionamento ácido é uma maneira
eficaz de aumentar a adesividade mecânica e diminuir o manchamento marginal na
interface de união dente/restauração, prevenindo cáries recorrentes e irritação
pulpar. Após o condicionamento ácido é realizada uma lavagem abundante para
remoção de subprodutos, seguida da aplicação do primer e do adesivo, que irão
penetrar na dentina desmineraliza (TAY & PASHLEY, 2001).
Com a evolução dos materiais e o surgimento de novas técnicas
restauradoras, os sistemas de união tornaram-se fundamentais em diversas
aplicações clínicas, com o objetivo de unir o material restaurador às estruturas
dentárias, modificando a morfologia e fisiologia do esmalte e da dentina
(CARVALHO et al., 2004).
Atualmente os sistemas de união são indicados na realização de restaurações
estéticas, alteração de cor e tamanho dos dentes, colagem de fragmentos,
braquetes ortodônticos, pinos intrarradiculares, restaurações indiretas (REIS , 2006).
30
Com a finalidade de obter uma adesão confiável em dentina, os sistemas de
união passaram a ser o foco das pesquisas e estudos, na tentativa de aprimorar os
materiais poliméricos.
Com isto surgiram diferentes estratégias de união que distinguem os sistemas
disponíveis atualmente. Abordaremos os sistemas de união convencional e o
autocondicionante por serem os sistemas atualmente utilizados pelos cirurgiões-
dentista.
2.2.1- Sistema de união convencional ou etch-and-rinse
Este sistema de união preconiza a utilização de um passo operatório de
condicionamento ácido do esmalte e dentina, denominado condicionamento ácido
total. O passo operatório do condicionamento ácido da superfície do esmalte e da
dentina é realizado em uma etapa distinta, com a aplicação de um ácido inorgânico
geralmente o ácido fosfórico entre 30 e 40% promovendo em esmalte a capacidade
de criar uma desmineralização seletiva formando com isso irregularidades em sua
estrutura, favorecendo desta forma uma união confiável e duradoura
(BUONOCORE, 1955).
Nestes sistemas a aplicação pode ser realizada seguindo duas técnicas:
a) sistema de união convencional em três frascos: onde o condicionamento
ácido é aplicado no primeiro passo, realiza-se a lavagem abundante com spray de ar
e água, secagem sem desidratar a dentina, aplicação do primer e do adesivo e
procedendo à polimerização que completa o procedimento adesivo ou, ainda;
b) sistema de união convencional em dois frascos: o condicionamento ácido é
realizado no primeiro passo, realiza-se a lavagem abundante com spray de ar e
água, secagem sem desidratar a dentina e a aplicação do primer em combinação
com o adesivo que estão reunidos em um único frasco, ou ainda em frascos
separados, com a necessidade de promover a mistura com cada um deles, para que
a aplicação seja realizada simultaneamente, em seguida a polimerização.
31
2.2.2- Sistema de união autocondicionante ou self-etch
Estudos realizados por Watanabe, Nikaido & Nakabayashi (1990) e Watanabe
(1992), descreveram a utilização de uma técnica de união em que inclui a aplicação
de um ácido em uma etapa separada e, sim, a aplicação de monômeros com
características ácidas. Estes materiais podem ser apresentados das seguintes
formas:
a) sistemas de união autocondicionantes em dois frascos: nos quais numa
primeira etapa realiza-se a aplicação de um primer composto de monômeros com
características ácidas, para remoção parcial da smear layer, na tentativa de
contornar as dificuldades apresentadas e, numa segunda etapa, a aplicação do
adesivo propriamente dito;
b) sistemas de união autocondicionantes em frasco único: que na tentativa de
simplificar ainda mais a técnica, foi criado em 1999 o primeiro adesivo
autocondicionante de passo único, onde todos os componentes do sistema são
aplicados no tecido dental de uma única vez, agindo simultaneamente promovendo
a hibridização dos tecidos.
2.2.3- Degradação da interface adesiva
A degradação da interface adesiva ocorre nas duas porções que formam a
camada híbrida: a porção resinosa constituída pelos monômeros resinosos dos
sistemas de união e a porção orgânica proveniente da matriz extracelular do tecido
dentinário (NAKABAYASHI, KOJIMA & MASUHARA, 1982; HASHIMOTO et al.,
2003; HEBLING, PASHLEY & TJÄDERHANE, 2005; CARRILHO et al., 2007a;
CARRILHO et al., 2007b).
Na tentativa de esclarecer essas dificuldades, foi reportada pela primeira vez
por Tjäderhane e colaboradores (1998) que a atividade proteolítica intrínseca da
dentina foi capaz de clivar o colágeno desestruturado, sugerindo que a atividade das
enzimas proteolíticas estaria relacionada à presença destas enzimas no tecido
comprometido.
32
Estudos demonstraram que a degradação do colágeno se dá pela atividade
proteolítica endógena de enzimas como as metaloproteinases da matriz (MMPs)
(PASHLEY et al., 2004) e as cisteíno-catepsinas (CTs) (TERSARIOL et al., 2010;
NASCIMENTO et al., 2011) enzimas ligadas ao colágeno, que por um desequilíbrio
metabólico expõem a matriz dentinária à degradação e compromete a durabilidade
da adesão entre o sistema de união e o substrato dental.
Assim, é importante conhecer as enzimas que em atividade determinam a
degradação da área de união, pela proteólise do colágeno, levando à falha da
restauração. A fragilidade da interface de união, no entanto não estaria relacionada
apenas aos materiais poliméricos, mas sim um efeito combinado entre a degradação
dos componentes resinosos com o substrato dentinário, reduzindo a sobrevida das
restaurações adesivas (MARTIN-DE LAS HERAS, VALENZUELA & OVERALL,
2000).
Embora os sistemas de união e os compósitos de resina estejam
extremamente bem desenvolvidos, as restaurações ainda falham com o passar do
tempo, apresentando pigmentações, fendas, recidiva de cárie que comprometem a
durabilidade destas restaurações. Diversos estudos passaram a ser desenvolvidos
para determinar quais as possíveis causas destas limitações, independentes do
material restaurador e do sistema de união utilizado, apontando que a ação das
enzimas proteolíticas presentes na dentina poderia interferir na adesão de materiais
restauradores (TJÄDERHANE et al., 1998; HASHIMOTO et al., 2003; SOUZA et al.,
2003; CHERSONI, 2004; PASHLEY et al., 2004; TEZVERGIL-MUTLUAY et al.,
2010).
Após a constatação da presença de enzimas no complexo dentino-pulpar, o
estudo do perfil e da atividade das diferentes classes de proteases, tornou-se
fundamental para elucidar um melhor entendimento dos processos fisiopatológicos
que ocorrem na cavidade bucal, à medida que ocorre a degradação da matriz
orgânica dentinária. Desta forma, investigar a função destas proteases endógenas
torna-se necessário para que a degradação da interface adesiva seja melhor
entendida e com isso minimizada, por não se saber sobre seu real papel nos
processos de degradação da matriz abreviando o sucesso das restaurações
adesivas (VIDAL, 2012).
33
2.3- ENZIMAS DA MATRIZ DENTINÁRIA
O interesse sobre as MMPs e as CTs tem sido foco de estudos. Abordaremos
estas duas classes de enzimas com o propósito de entender seus mecanismos de
ação.
As metaloproteinases da matriz (MMPs) são endopeptidases responsáveis
pela degradação dos componentes da matriz extracelular (MEC) e das membranas
basais. A descoberta das MMPs provavelmente ocorreu quando Gross & Lapièrre
(1962) encontraram uma enzima ativa na cultura de fragmentos da pele de ratos, a
qual degradou a tripla hélice do colágeno tipo I maduro. Foram inicialmente
classificadas segundo a especificidade das enzimas em relação ao seu substrato
alvo presente na matriz extracelular e, agrupadas como colagenases (hidrólise de
colágeno tipo I e II), gelatinases (hidrólise de gelatina ou colágeno desestruturado),
estromelisinas (hidrólise da fração proteica de proteoglicanos, glicoproteínas) e
matrilisinas (ativação de outras MMPs por meio da hidrólise de pró-domínios).
Embora didática essa classificação não reflete a variabilidade de suas funções, pois
os membros da família das MMPs podem atuar em conjunto participando do
metabolismo dos componentes da matiz extra-celular e das membranas basais.
Desta forma a melhor forma de classificá-las seria à partir de sua estrutura/seus
domínios e dos locais onde exercem suas funções, podendo formar grupos entre as
classes secretadas para a matriz extracelular, tornando-se ativas desempenhando
suas funções enzimáticas específicas, ou atuando entre as classes de enzimas
quando estão ligadas as MMPs tipo membrana ligadas à membrana das células
(MT-MMP), como mostra a Figura 1 (EGEBLAD & WERB, 2002).
As principais MMPs encontradas na cavidade bucal são as gelatinases MMP-
2 e MMP-9, cujo aumento está associado às doenças periodontais; e a colagenase
MMP-8 que em quantidade aumentada desencadeia a gengivite e a periodontite
(MÄKELÄ et al., 1994).
As MMPS são um importante grupo de enzimas proteolíticas responsáveis
pela degradação da matriz extracelular e membranas basais, são endopeptidases
metal-dependentes em função da dependência de íons metálicos para exercer sua
34
atividade. De forma geral, a estrutura das MMPs é formada por um pró-domínio, um
domínio catalítico com um sítio de ligação com o zinco, uma região de união
(“hinge”) e por um domínio hemopexina carboxi-terminal. No domínio catalítico são
identificadas repetições contendo cisteína, as quais estão relacionadas à atividade
destas proteases. Essas proteases requerem a presença de íons cálcio para manter
sua estrutura terciária estável e íons zinco para conservar a funcionalidade do sitio
ativo, como mostra a Figura 2 (VISSE & NAGASSE, 2003).
35
Figura 1- Representação Esquemática da Estrutura Protéica das MMPs. De 1 a 5 estão representados os cinco tipos de estruturas identificadas nas MMPs secretadas e de 6 a 8 estão representadas as estruturas das MMPs tipo membrana (MT-MMPs). (1) Estrutura composta por uma sequência sinal na extremidade amino-terminal (Pre) que direciona as enzimas para a rota secretória, importação pelo retículo endoplasmático e posterior secreção; por um pró-peptídeo (Pro)com um grupo tiol (SH) que mantém o zimogênio ou forma inativa da enzima; e por um domínio catalítico que contém um sítio de ligação ao zinco (Zn). (2) Podem ainda ser encontrados outros domínios adicionados a essa estrutura mais simplificada, como, por exemplo, o domínio tipo hemopexina, que é conectado ao domínio catalítico por uma região de união denominada hinge, e que tem como função mediar a interação das MMPs com os inibidores teciduais de MMPs (TIMPs) moléculas presentes na superfície celular e substratos proteolíticos. A primeira e a última das repetições de hemopexina são ligadas por uma ligação di-sulfeto (S-S). (3) MMPs que contém insertos de repetições de fibronectina que se assemelham à moléculas de ligação ao colágeno tipo II. Essa estrutura é responsável pela ligação da enzima à estrutura do colágeno e da gelatina. (4) As MMPs ativadas por furina contém um sítio de reconhecimento para serino proteinases intracelulares tipo furina (Fu) entre seus domínios pró-peptídeo e domínio catalítico, e que permite a ativação intracelular dessas proteases. (5) O sítio de reconhecimento para furina também é encontrado nas MMPs com inserto tipo vitronectina (Vn). (6) As MT-MMPs incluem as MMPs que possuem um domínio transmembrana na extreminadade C-terminal (TM) e um domínio citoplasmático curto (Cy). (7) As MT-MMPs também podem se apresentar ancoradas à membrana pelo glicosilfosfatidilinositol (GPI). (8) A MMP-23 representa um terceiro tipo de MT-MMP e possui uma ancoragem sinal na extremidade N-terminal (AS) que reconhece a membrana celular e é considerada uma MMP transmembrana tipo II. A MMP-23 também é caracterizada por um domínio contendo cisteína (CA) e um domínio tipo imunoglobulina (IgG-like). Fonte: Egeblad & Werb, 2002.
36
As MMPs são sintetizadas na forma de pró-enzimas inativas, chamados de
zimogênios e mantidas inativas pela conservação de um grupo sulfridila da cisteína
que compõe o pró-pepetídeo e pela ligação de um elemento zinco no domínio
catalítico, formando uma ponte mantendo o domínio catalítico da enzima latente.
São ativadas no ambiente pericelular dos tecidos por segmentação de uma parte
dos zimogênios denominada pró-peptídeo pelo rompimento da ponte de ligação
cisteína-zinco. Este processo faz com que o zimogênio (inativos) se torne MMPs
(ativas) (MURPHY & KNAUPER, 1997), como mostra a Figura 2.
As alterações de pH são capazes de ativar as MMPs salivares. Estudos
mostram maior atividade de MMPs e maior degradação da matriz orgânica dentinária
quando estas enzimas são submetidas a um pH levemente ácido (pH 4,5 a 5,5),
sugerindo que a “ativação ácida”, atue na desmineralização do tecido dentinário
(WANG & HUME, 1988; CAMPS & PASHLEY , 2000).
A ativação das MMPs requer a remoção do pró-peptídeo e rompimento da
ponte de cisteína-zinco que pode ocorrer devido à ação de outras proteases como
as CTs, de outras MMPs, pela ação de substâncias químicas como a acetato de
aminofenilmercúrio (APMA) ou ainda em consequência da diminuição do pH do meio
(VISSE & NAGASE ,2003).
Figura 2- Esquema de Ativação das MMPs. As MMPs são secretadas na forma inativa (zimogênio). Uma vez que o pró-domínio é removido pela clivagem na região entre pró-domínio e domínio catalítico, a enzima torna-se ativa. Fonte: Page-McCaw, Ewald & Werb, 2007.
37
As MMPs clivam os componentes da matriz extracelular nos processos
fisiopatológicos. Nos eventos fisiológicos do complexo dentino-pulpar a presença
das MMPs está relacionada ao processo de mineralização dentinária, durante a
dentinogênese; na remodelação do colágeno dos tecidos periodontais; no processo
de irrompimento dental; na organização e mineralização da matriz orgânica;
regulação de respostas inflamatórias (GOLDBERG et al., 2003). Em processos
patológicos, o excesso de atividade das MMPs está associado na progressão da
lesão de cárie (TJÄDERHANE et al., 1998), na inflamação pulpar e na progressão
da doença periodontal (SORSA et al., 2006).
A atividade e a estabilidade das MMPs são controladas por inibidores
específicos, denominados Inibidores Teciduais de MMPs (TIMPs), que são proteínas
glicolisadas que participam da regulação do metabolismo da matriz extracelular.
Assim o equilíbrio entre a produção de MMPs e de TIMPs mantém a homeostase da
matriz extracelular (SOUZA & LINE, 2002).
Assim como as MMPs, as cisteíno-catepsnias (CTs) pertencem a uma classe
de proteases capazes de degradar componentes da matriz extracelular. Atualmente
existem 11 CTs humanas: B, C, F, H, K, L, O, S, V, X e W. As CTs são enzimas
lisossomais exercendo suas funções metabólicas em pH ácido (4,5 a 5,5).
Pertencem à família C1 das enzimas semelhantes à papaína envolvidas nos
processos fisiológicos e patológicos que desempenham importante papel nos
processos celulares do organismo. São enzimas conhecidas por serem
multifuncionais envolvidas na clivagem das proteínas da membrana, na degradação
da matriz extracelular e na remodelação tecidual. As CTs são sintetizadas como pré-
pró-peptídeos, quando estas enzimas são enviadas ao retículo endoplasmático o
pré-peptídeo é removido ocorrendo sua ativação, o que pode acontecer pela auto-
ativação em pH ácido ou por ação de outras proteases (TURK, TURK & TURK,
2000).
No entanto apesar desta característica de atividade em meio ácido onde se
mostram mais estáveis (DICKINSON, 2002) algumas CTs mostraram atividade e
efetividade hidrolisando e digerindo componentes da matriz orgânica em pH próximo
do neutro (TURK et al., 2012). A catepsina-B (CT-B) representa um exemplo desta
dupla atividade visto que sua função de exopeptidase cliva as ligações peptídicas
38
próximas do carboxi-terminal das proteínas em pH ácido (4,5 a 5,5) e sua função de
endopeptidase, cliva as ligações peptídicas em regiões centrais das proteínas em
pH próximo do neutro entre 6,5 a 7,4 (NÄGLER et al., 1997).
Essa dupla funcionalidade da CT-B se justifica por possuir uma alça de
oclusão de aproximadamente 20 resíduos de amino-ácidos mantendo seu sítio
catalítico obstruído o que favorece sua atividade enzimática de exopeptidase em pH
ácido, e em pH neutro a alça de oclusão é parcialmente deslocada favorecendo sua
atividade exopeptidásica (TURK & GUNCAR, 2003).
Em sua estrutura as CTs são formadas por dois domínios denominados L e R,
domínio esquerdo e direito, respectivamente. Segundo Turk e colaboradores (2012),
o domínio L tem três α-hélices, sendo que a principal possui 30 resíduos de
aminoácidos. O domínio R tem uma estrutura em forma de barril, com uma estrutura
enrolada fechada na base por uma α-hélice e no topo por um resíduo histidina. O
sítio ativo da enzima é a interface entre os dois domínios que forma um sulco
semelhante à letra “V”. No centro do sulco encontram-se dois resíduos, um Cys25
na extremidade N-terminal da hélice central e um resíduo His163 como parte do
domínio R. Para a atividade proteolítica desta enzima, esses dois resíduos
catalíticos formam o par iônico tiolato-imidazol (FIG. 3).
Segundo estudos realizados por Vidal (2012) pode-se concluir que diferentes
MMPs e CTs estão presentes tanto em dentina sadia quanto em dentina cariada,
com maior abundância no tecido cariado, onde a atividade proteolítica endógena
também é maior, indicando que uma série de processos bioquímicos ocorra na
progressão da cárie, envolvendo não apenas a desmineralização da estrutura
dental, mas também uma resposta à injúria por parte do tecido pulpar e dos
odontoblastos. Além disso, esses resultados suportam os achados de que essas
enzimas atuem em conjunto na degradação da matriz orgânica dentinária nas lesões
de cárie.
Em eventos patológicos as CTs fazem parte do grupo das cisteíno-proteases
que participam dos processos celulares mais especializados, são encontradas nos
lisossomos, degradam as proteínas de seu interior e, podem degradar a matriz
extracelular de proteínas como o colágeno tipo I (BURLEIGH, BARRET & LAZARUS,
1974). Estão envolvidas em processos de progressão tumoral e inflamatórios, em
doenças sistêmicas como diabetes e doenças degenerativas como: doença de
39
Alzheimer, distrofia muscular, esclerose múltipla (TURK & GUNCAR, 2003;
VASILJEVA & TURK, 2008), além de patologias que envolvam estados de
remodelação do tecido, artrite reumatóide e aterosclerose (POZGAN et al., 2010).
Em patologias orais as CTs estão relacionadas aos processos degenerativos
do periodonto de inserção (fibras de colágeno), à reabsorção da matriz óssea
(periodonto de sustentação) e à progressão de processos tumorais na cavidade
bucal, com evidências de que sua disfunção estaria relacionada com a
transformação de tumores do estado pré-malígno para malígno (TSUJI et al., 2001;
MOGI & OGOTO, 2007).
Atualmente a catepsina K (CT-K) é a única CT que degrada o colágeno em
seu estado íntegro (colágeno tipo I). Por ser altamente expressa em osteoclastos
remodelando a matriz óssea, é considerada enzima-chave no remodelamento ósseo
em movimentações ortodônticas (TSUJI et al., 2001), no avanço da doença
periodontal e altas concentrações de CT-K foram encontradas no fluido crevicular
gengival de pacientes com periodontite crônica (MOGI & OTOGOTO, 2007).
Sua capacidade de clivar a tripla hélice da estrutura do colágeno está
relacionada à formação de complexos entre a CT-K e glicosaminoglicano (GAGs),
Figura 3- Representação Esquemática da Estrutura das Cisteíno-Catepsina Endopeptidase (baseado na estrutura da CT-L). No esquema, as cadeias são mostradas em verde sendo que os elementos estruturais secundários são mostrados em azul (α-hélice) e em vermelho (folhas β). Os resíduos Cys e His no sítio ativo da enzima estão mostrados em amarelo. Fonte: Turk et al., 2012.
40
assim uma única molécula de CT-K com uma molécula de condroitim sulfato
possibilita o alinhamento de várias moléculas de CT-K, conferindo com isso sua
capacidade de degradar o colágeno em seu estado íntegro (LI et al., 2008).
Nestas situações de desequilíbrio o uso de inibidores sintéticos na tentativa
de prevenir ou desacelerar a degradação da interface de união dentina/compósito de
resina se faz necessária.
2.4- INIBIDORES SINTÉTICOS DE PROTEASES
Na tentativa de prevenir a degradação dentinária, e prolongar a estabilidade
das restaurações adesivas, a utilização de inibidores sintéticos pode ser uma
alternativa valiosa para minimizar os efeitos da degradação do colágeno e de outros
componentes da matriz orgânica dentinária.
O colágeno é uma proteína fibrosa, insolúvel e resistente à ação de
proteases, devido ao denso empacotamento molecular. A conformação do colágeno
em tripla hélice o torna resistente à maioria das proteases. A desestruturação só é
possível após a clivagem da tripla hélice, deixando-o susceptível a ação das outras
proteases, sendo que a MMP-8 e a CT-K são capazes de hidrolisar essa estrutura
(VISSE & NAGASE, 2003).
Um estudo realizado por Pashley e colaboradores (2004) mostrando que a
utilização digluconato de clorexidina como uma solução aquosa de clorexidina 2% foi
capaz de reduzir a atividade gelatinolítica do substrato dentinário, fez com que o
digluconato de clorexidina fosse o primeiro inibidor sintético a ser investigado, com a
finalidade de propiciar interfaces adesivas mais estáveis. Sua ação antibacteriana
explica seu mecanismo de ação sobre a inibição das proteases da dentina
(ATHANASSIADIS, ABBOTT & WALSH, 2007).
Este achado motivou a investigação de outras drogas com potencial inibitório
sobre as proteases da dentina. Assim, Breschi e colaboradores (2010b), avaliaram o
efeito do Galardin (GM 6001, Ilomastat) um inibidor específico de MMPs não dotado
de atividade antibacteriana, e mostraram que sua utilização favoreceu para
41
incrementar a resistência de união a longo prazo por sua capacidade inibitória da
atividade das MMPs presentes no substrato dentinário.
Stanislawczuk, Reis & Loguercio (2011) avaliaram os compostos derivados do
antibiótico tetraciclina, como doxiciclina e minociclina como possíveis inibidores das
MMPs presentes na dentina conservando a integridade das restaurações adesivas.
O tratamento da dentina com minociclina não comprometeu a adesão imediata e a
longo prazo o efeito destas duas substâncias sobre o comportamento mecânico de
interfaces de união ainda não foi reportado.
Recentes estudos utilizando a doxiciclina com concentração equivalente a
5mg/ml (0,5%) mostraram que a atividade colagenolítica da dentina foi reduzida na
sua presença (OSORIO et al., 2011; TOLEDANO et al., 2012).
Em outro estudo Osorio e colaboradores (2005) reportaram que o uso do
ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) como agente condicionante da dentina,
antes da aplicação dos sistemas de união, conseguiu reduzir a atividade proteolítica
da dentina. Posteriormente resultados semelhantes foram obtidos por Thompson e
colaboradores (2012), sugerindo que a longo prazo a utilização de EDTA poderia
estabilizar a interface de união.
É necessário ressaltar que esses efeitos foram observados antes que a
expressão e a atividade das CTs fossem identificadas. Dessa forma, a clorexidina
além de atuar sobre as MMPs também atua na inibição de pelo menos três CTs: CT-
K, CT-B e CT-L. Esses achados reforçam que o controle da atividade proteolítica
intrínseca da dentina se deve à inibição das enzimas proteolíticas tanto MMPs
quanto CTs (SCAFFA et al., 2012).
Estudos in vitro e in vivo comprovaram que o uso da clorexidina a 2% utilizada
durante a técnica de hibridização úmida, propicia a manutenção do selamento
dentinário, melhora a resistência de união entre os materiais restauradores e a
dentina, além de reduzir a degradação da união aumentando, com isso, a
longevidade das restaurações (CARRILHO et al., 2007a; CARRILHO et al., 2007b;
SCAFFA et al., 2012).
42
Outra proposta foi a utilização de metacrilatos derivados de compostos
quaternários de amônia (p.e MDPB) como alternativa de controle da atividade
proteolítica da dentina, cuja atividade inibitória sobre as MMPs vem sendo
demonstrada. Como esses compostos são polimerizáveis poderiam ser incorporados
à estrutura da restauração servindo como estabilizadores das interfaces adesivas na
atividade proteolítica da dentina (TEZVERGIL-MUTLUAY et al., 2011).
No entanto a principal limitação desses compostos inibidores Galardin,
derivados da tetraciclina, EDTA, compostos quartenários de amônia, se dá pelo fato
de sua potencialidade ser efetiva sobre as MMPs, o que controlaria apenas parte da
atividade enzimática no substrato dentinário, com exceção da clorexidina que se
mostrou eficaz tanto na inibição das MMPs quanto das CTs (GENDRON et al., 1999;
SCAFFA et al., 2012).
Apesar dos estudos descreverem vários compostos para controle da atividade
de proteolítica na destruição da matriz extracelular dos tecidos em diversas
patologias, as únicas substâncias testadas para o controle da proteólise da dentina
foram: compostos quimicamente derivados da tetraciclina (CMTs), um bisfofanato –
o zolendronato, (SULKALA et al., 2001), e uma bisguanidina - o digluconato de
clorexidina (GARCIA et al., 2009; SCAFFA et al., 2012).
Desta forma, as pesquisas estão voltadas para o uso de inibidores capazes
de atuar sobre a atividade proteolítica das duas famílias de enzimas identificadas até
o momento na dentina, as MMPs e as CTs, na tentativa de controlar o processo de
degradação da interface restauradora ao longo do tempo.
2.5 - PRÓPOLIS
Própolis é o nome dado ao produto obtido das abelhas a partir de brotos de
folhas, galhos e feridas no tronco de árvores. Etimologicamente a palavra própolis
significa em “defesa da cidade”, evidenciando a sua importância para a colônia com
inúmeras aplicações, como isolante térmico, tratamento antisséptico, vedação e
impermeabilização (KOSONOKA, 1990).
43
As abelhas coletam a resina utilizando suas mandíbulas com o auxílio do
primeiro par de patas. Logo após sua retirada a resina é triturada e enriquecida com
secreções salivares, principalmente a enzima glicosidase, responsável pela hidrólise
dos flavonóides glicosados, as angliconas permitindo o amolecimento da resina
(ASÍS, 1996). A resina amolecida é transferida para as corbículas, estruturas
especiais em suas patas traseiras, para assim serem levadas à colméia (SORKUN,
SUER & SALIH, 2001). Atua como termorregulador evitando a exposição da colônia
a correntes de ar e infestação por elementos estranhos. Várias atividades biológicas
são atribuídas à própolis como: propriedades antissépticas, anti-inflamatória,
antimicótica, bacteriostática analgésica, anticancerígena. Devido a estes efeitos
benéficos, existe um grande interesse na composição e atividade biológica da
própolis (MARCUCCI, 1995).
A própolis é uma mistura complexa, formada por material resinoso e
balsâmico coletado pelas abelhas de várias espécies das flores, ramos e exudatos
de árvores, pólen, brotos. Na colméia é utilizado como proteção contra insetos e
microrganismos, no reparo de frestas ou danos, além de proteger e manter
asséptico o local para postura da abelha rainha (MARCUCCI, 1996). O gênero e/ou
espécie da abelha influencia na qualidade da própolis (PARK et al., 1998), assim
como suas variantes de cor, odor, sabor, composição química e atividade biológica
dependem da procedência das espécies vegetais e das estações do ano assim as
diferenças existentes entre os vários tipos de própolis estão diretamente
relacionados às origens geográficas, onde há o predomínio da vegetação local
(MARCUCCI, 1995; MARCUCCI et al., 2000).
Os produtos disponíveis para as abelhas coletarem a própolis são produzidos
por uma grande variedade de processos botânicos em diferentes partes das plantas,
que podem ser substâncias secretadas pelas plantas, substâncias encontradas no
exudatos de cortes das plantas, materiais lipofílicos das folhas e dos brotos foliares,
goma, látex (BANKOVA, DE CASTRO & MARCUCCI, 2000).
Algumas própolis são fibrosas e firmes outras gomosas e maleáveis,
possuindo composição química complexa. Sua coloração pode variar do amarelo
claro, marrom esverdeado ao negro e marrom avermelhado dependendo da
44
vegetação de origem e dos fatores ambientais do local de produção (MARCUCCI et
al., 2001).
Segundo Belmiro, Oki & Fernandes (2011), existem no Brasil mais de dez
subtipos de própolis diferenciadas pela cor, odor, consistência, suas características
também estão associadas à espécie de abelha produtora e a planta de origem.
A geoprópolis originária da Amazônia possui benzofenonas preniladas como
substância característica (TOMAS-BARBERAN et al., 1993), é coletada pela abelha
Meliponinae, uma espécie de abelha sem ferrão que coleta o material resinoso das
plantas misturando-o aos produtos advindos do solo, não contém pelos vegetais
(tricomas), mas sedimentos de terra ou barro utilizados na sua elaboração (BARTH,
DUTRA & JUSTO, 1999).
A própolis marrom originária do Estado do Rio de Janeiro e da Região Sul do
Brasil, tem como elementos caracterizados a presença de epiderme com seus
anexos como estômago, tricomas, e glândulas (BASTOS, 2001), fato que a distingue
da geoprópolis.
A própolis verde, também conhecida como própolis brasileira, originária da
região sudeste, tem como fonte fornecedora a resina coletada das espículas
foliculares de espécies Baccharis, especialmente a B dracunculifolia L (Asteraceae)
conhecida popularmente como vassourinha ou alecrim-do-campo (BANKOVA, DE
CASTRO & MARCUCCI, 2000; BASTOS, OLIVEIRA & SOARES, 2000; BASTOS,
2001). É conhecida por ser um antibiótico natural, eficaz no tratamento de gripes,
resfriados, inflamações de garganta, bronquites, úlceras. Seus efeitos anti-
inflamatório e anestésico aceleram a cicatrização e promovem alívio nos casos de
queimaduras. Também é indicada em casos de afecções inflamatórias superficiais,
como estomatite, amigdalite, gengivite, periodontite. No caso de estomatite e
inflamações da garganta, o extrato alcoólico atua sintomaticamente, uma vez que
cria uma película protetora no local onde foi utilizado (SANTOS et al., 2003).
A própolis verde apresenta em sua composição os ácidos diterpênicos e
ácidos p-cumáricos prenilados, como o Artepilin C, além de apresentar alto teor de
substâncias antioxidantes que previnem o envelhecimento das células e combatem
os radicais livres (BANKSOTA et al., 1998; SALATINO et al, 2005; PAULINO et al.,
2008).
45
A própolis vermelha é típica de Cuba, sua fonte vegetal foi identificada como
sendo a Clusia nemorosa (Clusiaceae) (CUESTA-RUBIO et al., 2002) e na
Venezuela a principal origem são os exudatos provenientes da Clusia scrobiculata
(TRUSHEVA et al., 2004).
No Brasil, a própolis vermelha é característica da região nordeste, mais
especificamente na região de manguesais. Sua principal origem botânica são os
exudatos de Dalbergia ecastophyllum popularmente conhecida como rabo-de-bugiu.
Foram identificados compostos pertencentes a diferentes classes como: fenólicos,
triterpenóides, isoflavonóides, benzofenonas preniladas e epóxido da naftoquinona
(isolada pela primeira vez em um produto natural), porém seus principais compostos
são os isoflavonóides. Por sua composição química, este tipo de própolis é rica em
elementos terapêuticos e apresenta atividade antioxidante, além de atuar na
prevenção de doenças cardiovasculares, no controle do colesterol e da osteoporose.
Ela também é indicada para dermatites, ferimentos, inflamações e infecções
(TRUSHEVA et al., 2006). Apresenta atividade antibacteriana frente a S aureus
(ATCC12600) em baixa concentração, segundo Maia-Araújo e colaboradores (2011).
Outros estudos verificaram que apresenta atividade antioxidante e antimicrobiana
(BARRETO, 2008; BITTENCOURT, 2008). A presença dos compostos
rutusapurpurina A e B, presentes na planta de origem conferem a sua cor
avermelhada (PICCINELLI et al., 2011).
A literatura científica vem relatando propriedades farmacológicas da própolis,
porém trata-se de sua utilização na medicina alternativa, denominada Apiterapia
com uso abrangente em diferentes aplicações terapêuticas, sendo encontrada em
produtos farmacêuticos como: cremes, pomadas, soluções.
Os produtos à base de própolis comercializados no Brasil possuem registro
no Ministério da Agricultura, com limites preconizados para fixação de identidade e
qualidade da própolis na Instrução Normativa nº3, de 19 de janeiro de 2001
(BRASIL, 2001).
A própolis no Brasil segue um padrão não-específico para cada localização e
não considera a vegetação e suas características. A legislação determina que no
doseamento apresente o mínimo de 5% (m/m) de compostos fenólico e 0,5% (m/m)
de flavonóides (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, 2001).
46
Os produtos que contém própolis e que apresentem indicações terapêuticas
podem ser registrados como medicamentos específicos segundo a Resolução-RDC
nº 132, de 29 de maio de 2003, D.O.U., de 02 de outubro de 2003, classificados
como opoterápicos (BRASIL, 2003). A comprovação de segurança e eficácia segue
a norma técnica da Câmara Técnica de Medicamentos Fitoterápicos (CATEF, 2005).
2.5.1- Composição química e propriedades biológicas da própolis
A própolis é composta por aproximadamente 50% de resina e bálsamo
vegetal, 30% de ceras e ácidos gordurosos, 10% de óleo essencial e compostos
aromáticos, 5% pólen e 5% de várias substâncias como: ácidos graxos, ácidos
orgânicos, aminoácidos, vitaminas e minerais incluindo restos orgânicos
(BURDOCK, 1998).
Apresenta composição química muito complexa, observa-se ação anti-úlcera,
auxiliando na cicatrização, imuno-estimuladora, citostática e hipotensiva
(GHISALBERTI, 1979); atividade antiviral, in vitro, (Herpes Simplex, Influenza) em
função da presença de flavonóides (HELBIG & THEIL, 1982); atividade
antibacteriana, conferida pela presença de flavonóides, ácidos aromáticos e ésteres
(DEBUYSER, 1983; MERESTA & MERESTA, 1986); ação bactericida decorrente da
presença de ácidos ferúlico e caféico (DEBUYSER, 1983).
Diversas substâncias de estruturas químicas distintas são conhecidas na
própolis, pertencentes às seguintes classes: alcoóis, aldeídos, ácidos aromáticos,
ésteres aromáticos, flavonóides, éter, ácidos graxos, terpenóides, esteróides, amino-
ácidos (MARCUCCI, 1995).
Na própolis européia os flavonóides predominam entre as substâncias
fenólicas, já na própolis brasileira os ácidos fenólicos são bem mais abundantes.
Embora a concentração de flavonóides na própolis brasileira seja pequena, a
possibilidade de quantificá-los e utilizar os valores obtidos como parâmetro para o
controle de qualidade químico seja um dos fatores responsáveis pela preferência do
mercado internacional (MARCUCCI et al., 1998).
47
Sua composição química é complexa e variada e assim como os diversos
tipos de própolis, está relacionada com a variabilidade genética das abelhas rainhas
(PARK et al.,1998), com a flora do local visitado pelas abelhas (PARK et al., 2002), e
com o período de coleta da resina (ROCHA et al., 2003).
Mais de 200 componentes químicos foram identificados, em diversas
amostras da própolis foram encontrados: ácidos fenólicos, flavonóides (como a
galangina, quercetina, pinocembrina e kaempferol), ácidos aromáticos e seus
ésteres (ácidos: benzóico, caféico, cumárico; ésteres: acetato de benzila, benzoato
de benzila, cafeato de butila, entre outros), aldeídos e cetonas, terpenóides e
fenilpropanóides, esteroides, aminoácidos (MARCUCCI, 1996), polissacarídeos,
hidrocarbonetos, ácidos graxos (HU et al., 2005). Na sua composição encontramos
também celulose, vitaminas B1, B2, B6, C, E, niacina e ácido fólico, além de
elementos naturais como: prata, vanádio, mercúrio, ferro, cálcio, alumínio, cobre,
manganês, zinco, césio (DEBUYSER, 1983).
Em relação à ação farmacológica da própolis a principal classe de
constituintes são os compostos fenólicos que possuem diversas classes de acordo
com sua estrutura química, dentre as classes de compostos fenólicos podemos
destacar as de maior interesse, os ácidos fenólicos e os flavonóides (MARCUCCI,
1995; MARCUCCI, 1996).
Os compostos fenólicos são encontrados em plantas comestíveis e não
comestíveis a eles têm sido atribuído diversas atividades biológicas, as quais são
responsáveis pela bioatividade contra microrganismos patogênicos (BURDOCK,
1998).
Os flavonóides estão presentes em todas as partes das plantas, desde a raíz,
folhas até os frutos. Absorvem radiação na faixa do ultravioleta (UV) e da luz visível,
protegendo as plantas contra raios solares, insetos, fungos, vírus e bactérias. São
reconhecidos por suas atividades antibacterianas, antifúngicas e antivirais, por isso,
responsáveis por grande parte dos efeitos benéficos da própolis (MARCUCCI,
1995).
48
Os efeitos sinérgicos entre flavonóides, ácidos fenólicos e seus derivados
acentuam a atividade antimicrobiana da própolis, uma vez que seu efeito fungicida e
bactericida é fundamental para preservação da vida na colméia (BURDOCK, 1998).
A atividade antibacteriana é maior contra bactérias Gram-positivas quando
comparadas às bactérias Gram-Negativas (MARCUCCI et al., 2001), talvez a
explicação seria por estas bactérias apresentarem a parede celular quimicamente
mais complexa e com maior teor lipídico aumentando sua resistência (VARGAS et
al., 2004).
Sua atividade anti-inflamatória pode ser relacionada à presença de
flavonóides, especialmente galangina. Este flavonóide apresenta atividade inibitória
contra a ciclooxigenase (COX) e lipooxigenase (LOX). Além de relatos da presença
do ácido fenil éster caféico (CAPE), inibindo a liberação de ácido aracdônico da
membrana celular, suprimindo com isto as atividades das enzimas COX-1 e COX-2
(BORELLI et al., 2002). A ação anti-inflamatória observada na própolis inibe a
síntese das prostaglandinas, ativa a glândula timo auxiliando o sistema imune pela
promoção da atividade fagocítica estimulando a imunidade celular (KOSALEC et al.,
2005).
Este produto natural com amplo espectro de suas propriedades
farmacológicas é de interesse na área médica e odontológica.
2.5.2- Uso da própolis na Odontologia
A utilização da própolis na Odontologia está se tornando cada vez mais
indicada. Na Endodontia, por exemplo, foi utilizada como irrigante endodôntico e
observada regeneração de lesões apicais em dentes acometidos de necrose pulpar
através do tratamento com própolis (SCHELLER et al., 1978; GAFAR, 1986); na
Periodontia foi observado que o uso de solução hidroalcoólica de própolis a 1,5%
reduziu a placa bacteriana e nenhuma irritação bucal foi detectada, com isso
concluíram que houve uma melhora satisfatória nos casos de gengivite em quase
80% dos casos acompanhados, também os mesmos autores realizaram um trabalho
com pacientes com gengivites crônicas e úlceras bucais recorrentes ou inespecíficas
utilizando o propolan (50% de própolis, propilenoglicol em álcool 95%), onde
observaram que a região tratada com propolan mostrou uma rápida recuperação
49
pela atuação sobre bactérias gram-positivas da placa supragengival, e os efeitos
antimicrobianos, cicatrizantes, anestésicos mostraram favorecer uma regressão
rápida dos sintomas dolorosos, assim como um efeito curativo das úlceras bucais
(MARTINEZ-SILVEIRA, 1988).
Os pesquisadores Ikeno, Ikeno & Miyazawa (1991), fizeram estudos em ratos
e confirmaram o efeito da própolis sobre a cárie dentária, provaram menor incidência
do crescimento da microbiota cariogênica após aplicação de própolis, principalmente
de S mutans. Neste mesmo estudo os pesquisadores comprovaram por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) que os compostos ácido cinâmico e
ácido cafeico supostamente estariam relacionados com a atividade anticariogênica
da própolis.
Nos casos de aftas bucais, Garcia & Garguera (1993), utilizaram a própolis
em solução alcoólica a 70% e 24 horas após a primeira aplicação, 30 dos 40
pacientes avaliados obtiveram cura, em 7 (sete) foi realizada uma segunda
aplicação e em 3 (três) uma terceira aplicação da solução, os sintomas dolorosos
diminuíram desde a primeira aplicação em todos os pacientes observados. Na
estomatite aftosa Cabarrocas & Gomes (1994), utilizaram a própolis a 10% e
observaram que houve uma rápida diminuição da dor em 90% e pronta epitelização
clínica.
Experimentos com enxaguatório bucal a base de própolis foi utilizado para o
reparo da sulcoplastia pela técnica de Kazanjian. O estudo foi realizado em
pacientes com enxaguatório contendo 5% de própolis em solução hidro-alcoólica 5
(cinco) vezes ao dia e após 7(sete), 14(quatorze), 30(trinta) e 45(quarenta e cinco)
dias da realização da cirurgia foi realizada uma avaliação e constatado que o houve
reparação das feridas cirúrgicas intrabucais, proporcionando efeito anti-inflamatório
e analgésico (MAGRO FILHO & PERRI DE CARVALHO, 1994).
Estudos in vitro foram realizados por Dias (1997), no intuito de adquirir um
medicamento de baixo custo e toxicidade, para uso tópico na cavidade bucal com a
finalidade de controlar o processo da cárie. Foram testadas diversas marcas
comerciais de soluções hidro-alcoólica de própolis e durante o experimento puderam
50
concluir que houve efeito positivo de inibição das soluções de própolis sobre os S
mutans.
Outro estudo foi conduzido por De Paula e colaboradores (1997), a fim de
encontrar um medicamento para pacientes portadores de candidíase, avaliaram
várias marcas comerciais contendo própolis sobre culturas de cândida albicans, C
parapsolosis, C tropicalis, C glabrata, que foram cultivadas por 48hs a 25º C em
placa de petri contendo Agar sabouraud. Diferentes resultados foram encontrados e
podem estar relacionados com a concentração de própolis em cada marca utilizada
e com a sensibilidade de cada espécie de Cândida.
Avaliando a ação da própolis como uma alternativa natural de antibiótico para
uso odontológico, Santos (1999) ressalta que aplicação da própolis tem sido
investigada para diversas finalidades, porém, seu uso deve ser orientado com
prudência pois se trata de uma resina com efeitos antibióticos e como tal a conduta
de indicação e administração deve ser feita com parcimônia a fim de evitar
resistência microbiana.
Bretz (1999) utilizou própolis em exposição pulpar em comparação com o uso
de hidróxido de cálcio, e observou que não houve resultado significativo em relação
à resposta pulpar, porém em relação à formação de pontes de dentina e
reorganização de tecidos moles, a própolis foi mais eficaz. Em outro estudo foi
observado que a utilização da própolis diretamente sobre a polpa dental, pode
retardar a inflamação pulpar além de estimular a formação de dentina reparadora
(SABIR et al., 2005).
Santos e colaboradores (2003) observaram a ação antibacteriana da própolis
sobre microrganismos relacionados às doenças periodontais. D’Auria e
colaboradores (2003), Martin & Pileggi (2004) relataram a capacidade da própolis na
manutenção do ligamento periodontal, podendo ser utilizada também como proteção
medicamentosa em alvéolos de dentes recém-avulsionados.
Como alternativa terapêutica no processo de desenvolvimento da cárie, onde
há descalcificação do esmalte dentário e da dentina por ação de ácidos orgânicos
formado principalmente por Streptococcus mutans (acredita-se que estejam
envolvidos com o processo da cárie) e Lactobacillos (responsáveis pelo
51
comprometimento da lesão) atuantes sobre os carboidratos introduzidos com a dieta
alimentar (NOGUEIRA et al., 2007), a própolis por sua comprovada ação
antimicrobiana com menos riscos associados tem sido utilizada como medida
terapêutica capaz de combater curativamente e preventivamente tanto na placa
bacteriana como no processo de instalação da cárie (DUAILIBE, GONÇALVES &
AHID, 2007).
Foi conduzido um estudo comparativo entre clorexidina e própolis como
enxaguatórios sobre S mutans e Lactobacillos relacionados à cárie e a doença
periodontal. Neste trabalho os pesquisadores observaram que pacientes que
utilizaram a CHX relataram alterações no paladar e sensibilidade em mucosa, já os
pacientes que utilizaram a própolis, não relataram alterações. Além disso,
concluíram que o enxaguatório bucal com própolis tipificada foi superior na
eliminação de infecções cariogênicas em pacientes com atividade de cárie e na
supressão dos níveis salivares do S mutans (ANAUATE-NETTO et al., 2013).
Outro estudo foi realizado para comparar os efeitos de enxaguatórios a base
de própolis tipificada e CHX na saúde gengival, empregando-se um ensaio clinico
duplo-cego, randomizado, e placebo-controlado. Foram selecionados 60 pacientes
randomizados em 3 grupos, bochecharam duas vezes ao dia por 28 dias os
enxaguatórios a base de própolis tipificada 2%, clorexidina 0,12% e placebo (n = 20).
Foram realizadas medidas do índice de sangramento papilar (PBS) no tempo basal
e após 28 dias. Constataram-se os efeitos positivos do enxaguatório de própolis a
2% na reducão da inflamação gengival após uso não supervisionado por 28 dias.
Análise no sub-grupo de participantes com idade < 40 anos constatou superioridade
do enxaguatório de própolis quando comparado com o enxaguatório de clorexidina a
0,12% (ANAUATE-NETTO et al., 2014).
Recentemente um estudo clínico de Ercan e colaboradores (2015)
demonstrou que um enxaguatório à base de própolis foi eficiente em reduzir a
quantidade de placa e a inflamação gengival.
Em uma avaliação in vitro do efeito de um creme dental a base de própolis
sobre microrganismos de biofilme oral supra-gengival, Vanni e colaboradores (2015)
observaram uma significativa diminuição (80 a 88%) nas unidades formadoras de
colônias.
52
3 - PROPOSIÇÃO
Em vista da necessidade de obter um selamento mais efetivo dos substratos
dentais e procedimentos restauradores mais duradouros, o objetivo deste estudo foi:
avaliar o potencial de inibição das própolis, verde e vermelha, nas
concentrações 10µg e 100µg, sobre a CT-B purificada e as proteínas
extraídas da dentina;
avaliar a influência da própolis vermelha na resistência de união da interface
dentina/compósito de resina.
53
4 - MATERIAL E MÉTODO
4.1 - ASPECTOS ÉTICOS
Este trabalho foi submetido à Comissão de Ética da Universidade Anhanguera
de São Paulo e obteve parecer favorável para sua realização, sob o Protocolo 1624.
4.2 - OBTENÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO DE PRÓPOLIS (EEP)
As amostras de própolis tipificada verde e vermelha, na sua forma bruta foram
utilizadas para obter um extrato etanólico de própolis - EEP (Figura 4).
Figura 4 – Amostras da própolis verde e da própolis vermelha em sua forma bruta.
A obtenção do EEP foi realizada de acordo com o protocolo de Marcucci
(2006). Uma mistura de aproximadamente 75 g de própolis bruta triturada fornecida
pela Prodapys, em 250 mL de álcool etílico (p.a.) em frascos Erlenmeyers de 500
mL, que permaneceram em um shaker orbital sob agitação de 160 rpm a uma
temperatura de 40ºC por 18h. Após esse procedimento, a amostra foi armazenada
em freezer por 1 a 2 horas, para a redução do teor de gordura no extrato e
posteriormente filtrada para a separação da porção insolúvel. A porção insolúvel
ficou retida no filtro e foi seca em uma capela com ventilação por 24h. Junto às
porções insolúveis nova adição de álcool etílico (p.a.) foi realizada e novamente
devolvido ao shaker para uma nova extração. Repetindo o procedimento. O solvente
A B
54
foi evaporado em rotaevaporador a temperatura de 70°C até a obtenção do extrato
mole da própolis.
4.3 - OBTENÇÃO DAS PROTEÍNAS LIGADAS À MATRIZ DENTINÁRIA
Para a obtenção das proteínas ligadas à matriz dentinária, foi necessário
inicialmente que a dentina fosse transformada em pó, para isso, foram utilizados 10
molares humanos. Os dentes foram armazenados em freezer -80ºC e mantidos
congelados até o preparo do pó por no máximo 1 mês. A porção coronária foi
separada da porção radicular e o tecido pulpar removido. A dentina coronária foi
exposta pela remoção do esmalte com brocas carbide em alta velocidade, cortada
em pequenos fragmentos em baixa velocidade, com um disco diamantado, sob
constante irrigação (Figura 5).
Figura 5 – Obtenção das proteínas da matriz dentinária. Dente humano (A); remoção do esmalte (B); obtenção de fragmentos de dentina (C).
Os fragmentos foram secos com acetona por 5 minutos e congeladas a - 80º
C por 24 h para então serem triturados em 30 Hz durante 7 minutos em um moinho
de bolas (Retsch). O pó foi peneirado e uma alíquota de 1 g de dentina foi separada
para a extração das enzimas (Figura 6).
B C
55
Figura 6. Moinho de bolas. Moinho de bolas com os dispositivos de aço inox em posição utilizados para obtenção do pó de dentina (A). Dispositivo retirado do moinho após o ciclo de moagem contendo o pó de dentina a ser utilizado (B).
4.3.1- Protocolo de extração
A extração enzimática foi feita de acordo com o protocolo de Martin-De Las
Heras e colaboradores (2000). Inicialmente, o pó de dentina foi mantido imerso por
24 h em 2,5 M de cloreto de sódio (NaCl) sob constante agitação a 4ºC. Na
sequência, o conteúdo foi centrifugado (2.000 x por 10 min a 4ºC), o sobrenadante
foi removido e o pó foi lavado 2 vezes com 50 mL de água destilada com
temperatura aproximada de 4 ᵒC. O pó de dentina foi então incubado duas vezes em
4M de tampão hidrocloreto de guanidina 65mM (pH7,4) tris (hidrometil)
aminometano-ácido clorídrico (Tris-HCl) sob constante agitação a 4ºC por 2 dias,
totalizando 4 dias de incubação. O conteúdo foi centrifugado, o sobrenadante
removido e foram obtidos os extratos G1.1 e G1.2, a partir de cada incubação, os
quais foram combinados para se obter o extrato final G1. Este extrato foi, então,
dialisado em 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) por 4 dias a 4ºC, sendo que a solução foi
substituída no segundo dia de diálise. Em seguida, a diálise foi realizada por mais 1
dia contra água destilada a 4ºC. Ao final da diálise, o conteúdo foi armazenado em
freezer -80ºC. Ao mesmo tempo, o precipitado obtido após a centrifugação (pó de
dentina) foi incubado com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) 0,5 M (pH 7,4)
em temperatura de 4ºC sob constante agitação por 4 dias. Ao final da incubação
com EDTA, o conteúdo foi centrifugado, o sobrenadante foi removido e dialisado
56
contra água destilada a 4ºC por 4 dias. Ao final da diálise, o conteúdo foi
armazenado em -80ºC (extrato E1). Tal procedimento foi repetido por mais três
vezes com o mesmo pó e foram obtidos os extratos E2, E3 e E4. Após a
desmineralização com EDTA o precipitado foi novamente incubado, por duas vezes,
com o tampão guanidina-HCl 4M/Tris-HCl 65 mM (pH 7,4) por 2 dias a 4 ºC sob
constante agitação, repetindo o tratamento descrito para o extrato G1 e os
procedimentos de diálise para obtenção do extrato G2. O extrato utilizado para
avaliação da atividade em dentina foi o extrato final, chamado G2, que representa as
proteínas ligadas à matriz dentinária.
4.4- POTENCIAL INIBITÓRIO DA PRÓPOLIS SOBRE A CISTEÍNO-CATEPSINA
B (CT-B)
Primeiramente, um estudo foi conduzido no intuito de avaliar o possível
potencial inibitório da própolis sobre a atividade enzimática da CT-B. Para isso, a
atividade enzimática da enzima recombinante CT-B foi avaliada
espectrofluorimetricamente (Hitachi F-2500), nos comprimentos de onda específicos
de excitação e de emissão para o substrato Z-FR-MCA (benzyloxycarbonyl – Phe-
Arg-methyl-7-aminocoumarin amide), que foram 380 nm e 460 nm, respectivamente.
O ensaio foi realizado em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,6 a 37 oC. A enzima
(0,5 μL) foi pré-ativada por 5 min com solução de DTT (ditiotreitol) 1mM antes da
adição do substrato fluorogênico Z-FR-MCA (5μM). A inibição enzimática foi
realizada nas concentrações de 10 e 100 µg de própolis verde e vermelha. O perfil
de inibição foi determinado medindo a hidrólise do substrato ao longo do tempo.
Em uma segunda etapa, foram utilizadas as proteínas extraídas da dentina,
conforme descrito no protocolo de extração (Martin-De Las Heras et al., 2000). A
atividade colagenolítica/gelatinolítica das cisteíno-catepsinas foi monitorada
espectrofluorimetricamente. O ensaio foi realizado em uma placa de 96 poços e para
cada amostra foi adicionado 10μL de proteína extraída ao tampão acetato de sódio
50 mM em pH 5,6 contendo um mix com 1mM de DTT (redutor da atividade
enzimática) juntamente com 5 μM de Z-FR-MCA, (substrato fluorogênico específico
para CTs) esse mix foi incubado por 24h a 37ºC. A inibição enzimática foi realizada
57
nas concentrações de 10 e 100 µg de própolis. O ensaio foi realizado no leitor de
placa (Biotek, Synergy) nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 380 e
460 nm, respectivamente, e o experimento foi realizado em triplicata. O perfil de
inibição da própolis foi determinado medindo a diferença da fluorescência final e
inicial (Δ fluorescência) e expressa em unidades arbitrárias de fluorescência/µg de
proteína (UAF/μg de proteína).
Figura 7 - Cubeta e Espectrofluorímetro Hitachi F2500, com câmara de monitoramento.
Figura 8. Leitor de Placas de 96 Poços.
4.5 - AVALIAÇÃO DA RESISTÊNCIA DE UNIÃO
58
Para a avaliação da ação da própolis sobre os resultados de resistência de
união entre os compósitos de resina e o remanescente dental, foram selecionados
20 terceiros molares humanos extraídos com indicação ortodôntica obtidos em
consultórios particulares livres de cárie, com anuência dos pacientes e cirurgião-
dentista. Os dentes selecionados foram cuidadosamente limpos para eliminação de
tecido periodontal remanescente e armazenados em água destilada sob refrigeração
de 4ºC. Para a realização das restaurações a face oclusal dos dentes foram
seccionadas perpendicularmente ao seu longo eixo para a remoção das cúspides,
utilizando disco diamantado em máquina de corte (Labcut 1010, Extec, Enfield,
USA), sob refrigeração constante com água (Figura 9B), o remanescente coronário
foi desgastado em politriz (Beta, Buelher, USA) seguida de polimento em lixa 600
(Figura 9C) para obtenção de uma área plana em dentina padronizando a smear
layer (Figura 10 A). Nesta área obtida, o sistema de união foi realizado. O mesmo
procedimento foi realizado na porção radicular, onde o remanescente pulpar foi
removido com curetas e lima tipo Kerr para obtenção de uma cavidade livre de
tecido pulpar, sendo restaurada de acordo com os procedimentos adesivos
utilizados neste trabalho, porém sem a utilização da própolis em nenhum grupo.
Figura 9 – Preparo dos Dentes. Limpeza e armazenamento dos dentes (A); remoção da face oclusal dos dentes e obtenção da fatia de dentina (B); desgaste em politriz para obtenção da área plana em dentina e padronização da smear layer (C).
Os dentes foram distribuídos aleatoriamente de acordo com os tipos de
tratamento realizados na superfície da dentina (controle e própolis) e subdivididos de
acordo com o tempo de armazenamento até a realização de teste de resistência de
união, inicial, quando as amostras foram testadas após 24h da realização do
procedimento adesivo e restauração e, 18 meses, quando as amostras foram
armazenadas por este período até a realização do teste de resistência de união
(n=5). Os grupos e os procedimentos foram realizados como o descrito:
59
Grupo Controle - Restauração com sistema adesivo convencional Scotchbond Multi
Purpose Plus (3M): Dez (10) dentes foram submetidos ao condicionamento ácido foi
realizado utilizando Condac 37 por 15 segundos, em seguida lavagem com água por
30 segundos; secagem da superfície com papel absorvente até obtenção de uma
superfície sem excesso de umidade; aplicação do primer sob agitação por 20
segundos, removendo o excesso com leves jatos de ar até obtenção de uma
superfície uniformemente úmida, aplicação do adesivo formando uma camada
brilhante e uniforme, onde o excesso foi removido com o próprio microbrush utilizado
para sua aplicação e realizada a fotopolimerização por 40 segundos; em seguida foi
realizada a colocação do primeiro incremento de resina (Filtek Z100 cor A2) de 2mm
de espessura, fotopolimerizado por 40 segundos e um segundo incremento também
de 2mm de espessura foi colocado e fotopolimerizado por mais 40 segundos, e um
terceiro incremento foi realizado totalizando assim 6mm de espessura (Figura 10B).
Os dentes foram preparados para obtenção dos palitos (Figura 10C) para serem
submetidos ao teste de tração.
Grupo Controle Inicial: Metade dos palitos obtidos de cada dente foi conduzida ao
teste de resistência à microtração após o armazenamento em água destilada em
estufa a 37oC por 24h.
Grupo Controle 18 meses: A outra metade foi armazenada nas mesmas condições
por 18 meses, com o cuidado de realizar a troca da água destilada semanalmente e
posteriormente conduzida ao teste de microtração.
Grupo Própolis – Dez (10) dentes foram submetidos ao condicionamento ácido
realizado utilizando Condac 37 por 15 segundos, em seguida lavagem com água por
30 segundos; secagem da superfície com papel absorvente até obtenção de uma
superfície sem excesso de umidade; aplicação da própolis seguida dos passos
realizados para o Grupo Controle, para obtenção dos palitos a serem conduzidos ao
teste de tração.
Grupo Própolis Inicial: Metade dos palitos obtidos de cada dente foi conduzida ao
teste de resistência à microtração após o armazenamento em água destilada em
estufa a 37oC por 24h.
60
Grupo Própolis 18 meses: A outra metade foi armazenada nas mesmas condições
por 18 meses, com o cuidado de realizar a troca da água destilada semanalmente e
posteriormente conduzida ao teste de microtração.
Os materiais envolvidos neste estudo, suas características e composição
estão descritos no Quadro 1.
Quadro 1 – Materiais utilizados neste estudo.
PRODUTO CARACTERÍSTICA COMPOSIÇÃO
Condac 37 Condicionador de superfície
Ácido fosfórico a 37% em gel pH-0,6
Adper Scotchbond Multi Purpose Plus (3M ESPE)
Primer
Adesivo
Sistema Adesivo Convencional
Solução aquosa
Solução
2-hidroxietilmetacrilato (HEMA) e um copolímero do ácido polialcenóico. (pH 3,3)
Bisfenol A diglicidil éter dimetacrilato (BIS-GMA), 2-hidroxietilmetacrilato (HEMA), aminas
Própolis Vermelha Tipificada
Solução a 10µg e 100µg
Restaurador Universal Z100 (3M ESPE)
Compósito Bisfenol-A -diglicidildimetacrilato (BIS-GMA),trietilenoglicoldimetacrilato (TEGDMA),
4.5.1 - Corte e obtenção dos espécimes
Após a realização das restaurações, os dentes foram armazenados em água
destilada por 24hs em estufa bacteriológica (Fanen, 502C) a 37ºC. Após esse
período os dentes foram seccionados através da interface de união em secções
perpendiculares à parede pulpar, após fixação dos mesmos com cera pegajosa
(Pason - Indústria e Comércio de Materiais Odontológicos LTDA- Indústria Brasileira)
em placa de acrílico (Plexiglass) e levados para a máquina recortadora (Labcut
1010, Extec, Enfield, USA) para obtenção de palitos de 0,9 mm x 0,9 mm, seguindo
as especificações da ISO 11405 (Figura 10C).
61
Figura 10 – Obtenção dos Espécimes. Obtenção de área plana em dentina (A); confecção de coroa em resina composta (B); obtenção de espécimes em forma de palito (C).
Os espécimes foram fixados à máquina de testes universal (Instron, modelo
3342, USA) e foi conduzido o teste de microtração a uma velocidade de 0,5mm/s
(Figura 11).
Figura 11 – Máquina Universal de Testes Instron (A); espécime fixado em jig, adaptado à máquina de testes (B); espécime após a realização do teste de tração (C).
4.5.2 - Análise estatística
Os dados obtidos com o teste de resistência de união à microtração foram
tabulados e submetidos ao teste de normalidade de Shapiro-Wilk, que confirmou a
distribuição normal. Assim, os dados foram submetidos ao Teste t pareado para
comparar a resistência de união obtida no “tempo inicial” e após “18 meses” de
armazenamento, considerando nível de significância de 5% (α = 0,05).
Posteriormente foi aplicado o Teste t para amostras independentes para
comparar os dados obtidos no grupo controle e no grupo que recebeu a aplicação
prévia com própolis, considerando nível de significância de 5% (α = 0,05).
A B C
62
5 – RESULTADOS
Os resultados obtidos mostraram a capacidade de inibição das própolis
tipificadas verde e vermelha sobre a atividade enzimática da CT-B no teste de
Inibição Enzimática e da própolis vermelha no teste de Resistência de União.
5.1 – INIBIÇÃO ENZIMÁTICA
No experimento que avaliou a capacidade de inibição das própolis tipificadas
verde e vermelha sobre a atividade enzimática da CT-B, os resultados mostraram
que a própolis vermelha foi capaz de inibir com maior eficiência a atividade
enzimática, no entanto a inibição foi concentração dependente (Gráfico 1). Já a
própolis verde mostrou um menor potencial de inibição (Gráfico 2).
Gráfico 1- Atividade enzimática da Catepsina B (em unidades arbitrárias de fluorescência - UAF) em função das duas concentrações da própolis vermelha (em µg).
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Catepsina B 10 µg 100 µg
Ati
vid
ade
(U
AF)
Própolis Vermelha
63
Gráfico 2- Atividade enzimática da Catepsina B (em unidades arbitrárias de fluorescência - UAF) em função das duas concentrações da própolis verde (em µg).
Os resultados mostraram que a própolis vermelha na concentração de 10 µg
foi capaz de inibir 35% da atividade enzimática. Já na concentração de 100 µg inibiu
85% da atividade da CT-B recombinante (Gráfico 3).
Gráfico 3- Porcentagem de inibição da atividade enzimática da Catepsina B (em unidades arbitrárias
de fluorescência) em função das duas concentrações da própolis vermelha (em µg).
Já a própolis verde não foi capaz de inibir eficientemente a atividade enzimática em nenhuma das concentrações testadas já que na concentração de 10µg inibiu apenas 11% e na concentração 100 µg mostrou uma inibição de 27% (Gráfico 4).
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Catepsina B 10 µg 100 µg
Ati
vid
ade
(U
AF)
Própolis Verde
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Própolis Vermelha 10 µg Própolis Vermelha 100 µg
% In
ibiç
ão
Própolis Vermelha
64
Gráfico 4 - Porcentagem de inibição da atividade enzimática da Catepsina B (em unidades arbitrárias de fluorescência) em função das duas concentrações da própolis verde (em µg).
Para o extrato dentinário, a atividade enzimática específica foi avaliada e
corresponde à diferença entre a fluorescência inicial e a fluorescência final (Δ
fluorescência), expressa em unidades arbitrárias de fluorescência (UAF).
Os resultados obtidos mostram que a própolis vermelha é capaz de inibir a
atividade das enzimas extraídas da dentina, independente da concentração utilizada.
No gráfico 5, pode-se observar que a atividade enzimática é completamente
inibida com uma baixa concentração de própolis.
0
20
40
60
80
100
Própolis Verde 10 µg Própolis Verde 100 µg
% In
ibiç
ào
Própolis Verde
65
Gráfico 5- Atividade enzimática no extrato dentinário (em unidades arbitrárias de fluorescência por micrograma de proteína de dentina) em função de diferentes concentrações de própolis vermelha (em µg).
Portanto, os resultados mostraram que a própolis vermelha tanto na
concentração de 10 µg quanto 100 µg foi capaz de inibir eficientemente a hidrólise
do substrato fluorescente pelas proteases extraídas da dentina, assim como o
observado quando foi utilizado o inibidor específico de catepsina, E-64.
5.2 - RESISTÊNCIA DE UNIÃO
De acordo com os resultados do Teste t para amostras independentes não
houve diferença significativa entre o grupo controle e o grupo tratado com própolis
no período de avaliação inicial, de modo que pôde se comprovar que o tratamento
com própolis, previamente à aplicação do sistema de união, não comprometeu o
desempenho do material (Tabela 1).
Entretanto, após 18 meses de armazenamento, observou-se que houve
diferença significativa para o grupo controle e o grupo que recebeu o tratamento
prévio com própolis, sendo que o grupo tratado apresentou média de resistência de
união estatisticamente superior ao grupo controle.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
Extrato Dentina Própolis 10 µg Própolis 100 µg E-64
Ati
vid
ade
(U
AF)
Atividade Enzimática
66
Letras distintas minúsculas em linha e maiúsculas em coluna são
estatisticamente diferentes de acordo com teste t com 5% de significância
Tabela 1 – Resistência de união (DP) MPa para os grupos avaliados
Inicial 18 meses
Controle 41,48 (16,45) aA 15,77 (1,89) bB
Própolis 50,70 (22,84) aA 29,28 (9,65) aA Letras distintas em linha e maiúsculas em coluna são estatisticamente diferentes de acordo com o Teste t com 5% de significância.
Adicionalmente, de acordo com os resultados do teste t pareado observa-se
que no grupo controle houve queda significativa de resistência de união após 18
meses de armazenamento. Já para o grupo tratado com própolis não há diferença
significativa nos valores de resistência de união entre a avaliação inicial e após 18
meses. A aplicação da própolis aparentemente previne a queda da resistência de
união ao longo do tempo.
67
6 - DISCUSSÃO
As restaurações em compósito de resina são amplamente realizadas nas
atividades clínicas do cirurgião-dentista. No entanto, trata-se de um procedimento
complexo, que pode ser afetado por inúmeros fatores. Dentre eles, a escolha do
sistema de união mais adequado à situação clínica, que pode ser a estratégia de
união convencional ou autocondicionante. Além disso, é necessário salientar que
estas restaurações estão sujeitas aos desafios decorrentes das variações térmicas,
de pH e forças decorrentes da função mastigatória e hábitos parafuncionais.
A união ao substrato dental está fundamentada no mecanismo de hibridização
que envolve a capacidade de difusão dos monômeros resinosos na matriz de
colágeno desmineralizada (NAKABAYASHI et al., 1982). Durante esse procedimento
de união, o tecido dental, é condicionado por soluções ou monômeros ácidos que
removem parte de sua estrutura mineral. O colágeno exposto pelo condicionamento
ácido e não protegido pelo compósito parece sofrer alterações em suas
características morfológicas (CARRILHO et al., 2007). Acredita-se que a
desorganização do colágeno exposto ocorra em função da ação de enzimas
proteolíticas presentes na dentina, tais como, MMPs e CTs (PASHLEY et al., 2004;
CARRILHO et al., 2007). A fragilidade da interface de união das restaurac es em
compósitos de resina é resultado de um efeito combinado entre a degradação dos
componentes resinosos e do substrato dentinário (HASHIMOTO et al., 2003;
PASHLEY et al., 2004). Na porção resinosa, com o passar do tempo, pode ocorrer a
presenc a de água no interior da camada híbrida, o que é verificado pela presença de
nanoinfiltrac ão ocasionando a degradac ão hidrolítica do adesivo, que se torna cada
vez mais permeável e susceptível à degradação, alterando suas propriedades
mecânicas. As alterações morfológicas que revelam a desnaturação parcial ou
completa dos constituintes da interface de união, isto é, dos compósitos de resina,
dos sistemas de união e da dentina modificada pelo procedimento adesivo, são
acompanhadas da redução da resistência mecânica desta interface (HEBLING et al.,
2005, CARRILHO et al., 2007b). O comprometimento isolado, ou em conjunto,
desses componentes são os responsáveis por reduzir a sobrevida das restaurações
adesivas.
68
Em função disso, estudos têm buscado compreender o papel das enzimas
intrínsecas da matriz dentinária na degradação da interface adesiva. Dentre as
principais enzimas envolvidas no processo de remodelação do colágeno dentinário,
os estudos estão voltados para ação das MMPs e CTs. Acredita-se que a matriz
orgânica dentinária seja exposta à degradação por essas duas classes de enzimas
proteolíticas em situação de desequilíbrio metabólico (TJÄDERHANE et al.,1998;
NASCIMENTO et al., 2011).
Em situações que ocorram o desequilíbrio dos mecanismos reguladores da
degradação tecidual, o uso de inibidores sintéticos desempenha um papel
importante na preservação (GENDRON et al., 1999). A clorexidina é um composto
orgânico conhecido por sua potente ação anti-séptica e antibacteriana, que age
sobre um largo espectro de microrganismos gram-positivos, gram-negativos, fungos
e alguns tipos de vírus, mostra-se efetiva na inibição de pelo menos três tipos de
metalo-proteinases MMP-2, MMP-8 e MMP-9. Os autores acreditam que o efeito
inibitório da clorexidina sobre essas MMPs se deve à sua ação quelante,
sequestradora de cálcio (GENDRON et al., 1999). As propriedades antiproteolíticas
da clorexidina parecem ser efetivas até mesmo em baixas concentrações. Estudos
utilizando a clorexidina em diferentes concentrações observaram sua capacidade de
preservar a estabilidade das restaurações adesivas ao longo do tempo (CARRILHO
et al., 2007b; BRESCHI et al., 2010a). Além da clorexidina, alguns extratos naturais
vêm sendo testados como agentes inibidores, como os polifenois (LEME et al.,
2015) Estudos que avaliam produtos naturais com características bioativas têm
ganhado interesse da comunidade em função de não apresentarem risco à
integridade dos tecidos e órgãos em comparação aos produtos sintéticos com
característica terapêutica correspondente.
A própolis é um composto orgânico, possui reconhecida ação anti-séptica e
antibacteriana, age sobre vários microrganismos, inclusive vírus (IKENO, IKENO &
MIYAZAWA, 1991; GARCIA & GARGUERA, 1993; MAGRO FILHO & PERRI DE
CARVALHO, 1994; GEBARA, ZARDETTO & MAYER, 1996; DUAILIBI,
GONÇALVES & AHID, 2007; NOGUEIRA et al., 2007; SANTOS, 1999; ANAUATE-
NETTO et al., 2013). Ela vem sendo utilizada em diversas formas de apresentação
tais como soluções, pastilhas, cremes dentais, pastas para uso em endodontia,
69
enxaguatórios bucais (MAGRO FILHO & PERRI DE CARVALHO,1990; DIAS, 1997;
DE PAULA et al., 1997; ANAUATE-NETTO et al., 2013; ANAUATE-NETTO et al.,
2014)
No presente trabalho foram utilizadas as própolis verde e vermelha, no
entanto, para maior precisão de sua composição serão necessários mais estudos
que levem em consideração a região de coleta das amostras e o processo de
tipificação. Marcucci e colaboradores (2000; 2006), desenvolveram um processo
inovador no sentido de identificá-las e, assim, indicar com maior precisão cada tipo
de própolis. Em amostras de países tropicais é comum os resultados serem não-
conclusivos o que torna necessário a realização de mais estudos, já que há uma
diversidade na flora presente, podendo as abelhas serem atraídas por mais de uma
fonte vegetal em uma mesma localidade.
Nos últimos anos a própolis tem sido auto prescrita frequentemente pela
população no tratamento de lesões bucais sem, no entanto, obedecer a forma
sistematizada de uso e sem o conhecimento prévio mais aprofundado sobre as
indicações e o mecanismo de ação dessa resina sobre os sistemas biológicos
(MANARA, 1999). Santos (1999) adverte sobre o uso da própolis com prudência,
devido a sua ação antibiótica.
Sendo assim, tornou-se de extrema valia avaliar a ação da própolis tipificada
verde e vermelha em diferentes concentrações, sobre a atividade proteolítica da CT-
B recombinante e também de proteínas extraídas da dentina, como uma alternativa
para encontrar um inibidor natural, capaz de produzir interfaces adesivas mais
estáveis.
A expressão gênica para diferentes CTs foi demonstrada por Tersariol et al.
(2010) no tecido pulpar e nos odontoblastos, os autores mostraram a presença de
CT-B em dentina sadia por imuno-histoquímica e foi observada uma correlação
positiva entre a atividade de MMPs e CTs, ambas extraídas da dentina sadia. Outro
estudo mostra a interação entre CT-B e a MMP-2 na dentina, sugerindo que ambas
tenham um importante papel na degradação do colágeno (SCAFFA et al., 2012).
Estudos demonstram que é possível verificar a atividade proteolítica por
espectrofluorimetria, por zimografia, zimografia in situ (MARTIN DE LAS HERAS,
VALENZUELA & OVERALL, 2000; TERSARIOL et al., 2010; SCAFFA et al., 2012).
70
Assim, neste estudo optamos pela utilização do espectrofluorímetro para verificar a
atividade e a inibição da CT-B.
De acordo com a metodologia empregada em nosso estudo foi possível
observar que a própolis vermelha, na concentração de 100 µg inibiu 85% da
atividade da CT-B recombinante. Verificou-se que essa ação é concentração-
dependente, uma vez que na concentração de 10 µg a capacidade de inibição foi
reduzida. Já a própolis verde não apresentou o mesmo desempenho, mostrando
uma reduzida capacidade de inibição, nas duas concentrações. Já para as enzimas
obtidas do extrato de dentina a própolis vermelha apresentou uma capacidade
inibitória excelente, com resultados comparáveis aos apresentados pelo inibidor E-
64, que é um inibidor específico para catepsina.
A partir destes resultados, tornou-se importante saber se a aplicação da
própolis vermelha poderia, também, agir favoravelmente na resistência de união
imediatamente e ao longo do tempo, como aconteceu com a clorexidina em estudos
realizados in vitro (CARRILHO et al., 2007a) e, posteriormente em estudos in vivo
(HEBLING et al., 2005; CARRILHO et al., 2007b) que indicaram que a aplicação da
solução de clorexidina após o condicionamento da dentina e previamente ao uso de
adesivos convencionais pode desacelerar o processo de degradação das interfaces
adesivas, podendo constituir uma ferramenta clínica útil na busca de maior
longevidade das restaurações adesivas (BRESCHI et al., 2010a).
Assim, foi feita a avaliação da resistência de união, inicial e após 18 meses de
armazenamento, usando a aplicação da própolis vermelha na concentração de 100
µg. Optou-se por utilizar essa concentração, pois foi o grupo que melhor inibiu a
atividade enzimática no experimento de cinética. Foi possível observar que a
resistência de união inicial das amostras que receberam a aplicação prévia da
própolis apresentou valores semelhantes aos obtidos com o grupo controle, o que
demonstra que a própolis não interfere no desempenho do sistema de união. Esse
mesmo desempenho foi observado por outros autores que realizaram o tratamento
prévio da dentina com soluções de clorexidina (HEBLING et al., 2005; CARRILHO et
al., 2007a; SCAFFA et al., 2012). Autores que utilizaram outros tipos de tratamento
previamente à aplicação de sistemas adesivos observaram este mesmo
71
desempenho (STANISLAWCZUK et. al., 2011; OSORIO et. al., 2011; e TEZVERGIL-
MUTLUAY et al., 2011; TOLEDANO et. al., 2012).
O sistema de união convencional foi utilizado neste estudo por ser um sistema
largamente utilizado nas técnicas restauradoras pelos cirurgiões-dentistas no Brasil.
Neste estudo foi utilizado o sistema de união convencional de três passos, por ter
em sua composição, monômeros hidrofóbicos que denotam maior durabilidade por
serem menos susceptíveis à degradação hidrolítica.
As amostras do grupo controle sofreram uma degradação ao longo do tempo
de armazenamento traduzida em uma significante queda na resistência de união,
assim como observado por outros autores, utilizando sistemas de união conforme
orientações dos fabricantes (CARRILHO et al., 2005; CARRILHO et al., 2007a;
CARRILHO et al., 2007b; SCAFFA et al., 2012). O mesmo não foi observado pelo
estudo de Konno (2003) que verificou valores de resistência de união inicial e após 6
meses de armazenamento, semelhantes. No entanto, nosso estudo avaliou após 18
meses de armazenamento, o que pode justificar a diferença nos resultados, visto
que quanto maior o tempo de incubação, maior a degradação na interface,
consequentemente, menores os valores da resistência de união. Atualmente sabe-
se que a ação de diferentes enzimas proteolíticas pode ser responsável pela
degradação da interface adesiva e comprometimento da resistência de união.
O uso da própolis previamente à aplicação do sistema de união proporcionou
valores de resistência semelhantes após 18 meses de armazenamento o que denota
o estabelecimento de uma maior estabilidade da união, quando comparado às
amostras do grupo controle que não recebeu o tratamento da dentina com própolis.
O mesmo foi observado por alguns estudos utilizando a clorexidina, já citados
anteriormente (HEBLING et al., 2005; CARRILHO et al., 2007a; CARRILHO et al.,
2007b; BRESCHI et. al. 2010b). Outros estudos que utilizaram o EDTA como
tratamento prévio à aplicação do sistema de união também observaram a
estabilidade de interface de união (THOMPSON et al., 2012).
Segundo achados de Scaffa e colaboradores (2012), uma explicação razoável
para o desempenho da clorexidina em preservar a interface de união está no fato de
que ela é capaz de infiltrar a matriz dentinária e produzir precipitados que, ficam
72
selados pelo sistema de união e funcionam como uma reserva de clorexidina que
pode ser solubilizada novamente pelos fluidos dentais, tendo seu efeito protetor na
durabilidade na interface de união prolongado. Outras avaliações precisam ser
conduzidas para verificar se isso se repete com a própolis.
A própolis vermelha está em processo de tipificação que muito irá nos auxiliar
para o conhecimento de sua composição. Estudos adicionais são de extrema valia
para determinar qual (quais) componente (s) da própolis vermelha age sobre a
estrutura enzimática, buscando verificar seu mecanismo de ação, para
posteriormente, isolar e desenvolver um novo material com o objetivo de aumentar a
longevidade das restaurações.
Os resultados observados em nosso estudo confirmam a teoria de que a
própolis vermelha é capaz de inibir a atividade da CT-B, enzima diretamente
relacionada à degradação do colágeno da matriz dentinária. Além disso, a própolis
mostrou-se capaz de inibir a atividade das enzimas extraídas da dentina bem como,
na interface de união formada entre a dentina e os materiais utilizados na confecção
das restaurações estéticas.
73
7 - CONCLUSÃO
De acordo com a metodologia utilizada em nosso estudo foi possível observar
que:
a própolis verde exibiu baixa eficiência em inibir a atividade enzimática; a
própolis vermelha na concentração de 10 µg e 100 µg foi capaz de inibir a
hidrólise do substrato fluorescente com maior eficiência na concentração de
100 µg, tanto da enzima purificada quanto das proteases presentes no
extrato de dentina, portanto a inibição foi concentração dependente;
a avaliação da resistência de união, utilizando a própolis vermelha na
concentração de 100 µg mostrou que a própolis é capaz de preservar a
integridade da interface de união após 18 meses de armazenamento,
prevenindo a queda na resistência de união ao longo do tempo.
A própolis vermelha se apresentou como um produto promissor para
utilização como um inibidor natural de CT-B, sendo que novos estudos devem ser
realizados para avaliar suas propriedades.
74
REFERÊNCIAS ANAUATE-NETTO C, MARCUCCI MC, PAULINO N, ANIDO-ANIDO A, AMORE R, MENDONÇA S, BORELLI L, BRETZ WA. Effects of Typified própolis on mutasn streptococci and lactobacilli: a randomized clinical trial. Brazilian Dental Science, v.16, p.31-36, 2013. ANAUATE-NETTO C, ANIDO-ANIDO A, LEWGOY HR, MATSUMOTO R, ALONSO RCB, MARCUCCI MC, PAULINO N, BRETZ WA. Randomized, double-blind placebo-controlled clinical trial on the effects of propolis and chlorhexidine muothrinses on gingivitis. Brazilian Dental Science, v.17, p.11-15, 2014. ARANA-CHAVEZ VE, MASSA LF. Odontoblasts: the cells forming and maintaining dentine. International Journal of Biochemistry & Cell Biology, v. 36, p. 1376-73, 2004. ASÍS M. Apiterapia para todos: como usar los sitete productos de la colmena para curar. Instituto Cubano del Libro, Ciudad de la Habana: Editorial Científico-técnica, 194p, 1996. ATHANASSIADIS B, ABBOTT PV, WALSH LJ. The use calcium hydroxide, antibiotics and biocides as antimicrobial medicaments in endodontics. Australian Dental Journal, v. 52, p. 64-82, 2007. BANKOVA VS, DE CASTRO SL, MARCUCCI MC. Propolis: recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie, v.3, p.3-15, 2000. BANKSOTA AH, TEZUKA Y, PRASAIN LN, MATSUSHIGE K, SAIKI L, KADOTA S. Chemical constituents of Brazilian propolis and their citotoxic activities. Journal of Natural Products, v. 29, p. 896-900, 1998. BARRETO ALS. Estudo histomorfológico do efeito de membranas de colágeno contendo própolis vermelha sobre o processo de reparo cicatricial por segunda intenção em ratos. Dissertação de Metrado, UNIT, Aracaju, SE, Brasil, 2008. BARTH OM, DUTRA VML, JUSTO RL. Análise polínica de algumas amostras de própolis no Brasil meridional. Ciência Rural, v.29, p.663-667, 1999. BASTOS, EMAF, OLIVEIRA, VDC & SOARES AEE. Microscopic characterization of the green propolis, produced in Minas Gerais state, Brazil. Honeybee Science, v.21, p.179-180, 2000. BASTOS, EMAF. Origem botânica e indicadores de qualidade da “própolis verde” produzida no Estado de Minas Gerais, Brasil. Tese de doutorado, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil, 2001. BELMIRO MS, OKI Y, FERNANDES GW. Própolis: Nosso tesouro. Mensagem Doce, v.112, 2011.
75
BERKOVITZ BKB, HOLLAND GR, MOXHAM BJ. Anatomia, Embriologia e Histologia Bucal, 3 ed. São Paulo: Artes Médicas; Cap.9, p.125-148, 2004. BITENCOURT FO. Desenvolvimento e avaliação da atividade antimicrobiana contra Cândida albicans de formulação semi-sólidas contendo própolis vermelha. Dissertação de Mestrado, Universidade Tiradentes, UNIT, Aracaju, SE, Brasil, 2008. BORELLI F, MAFFIA P, PINTO L, IANARO A, RUSSO A, CAPASSO F, IALENTI A. Phytochemical compounds involved in the anti-inflammatory effects of propolis extract. Fitoterapia, v. 73, p. 53-63, 2002. BRACKETT WW, TAY FR, BRACKETT MG, DIB A, SWORD RJ, PASHLEY DH.The effect of chlorexidine on dentin hybrid in vivo. Operative Dentistry, v.32, p.107-11, 2007. BRASIL, 2001. Ministério da Agricultura. Instrução Normativa nº3 – Anexo VI – Regulamento técnico para fixação de identidade e qualidade de própolis. Diário Oficial da República Federativa do Brasil. Brasília, 19 Jan.2001. BRASIL, 2003. Agência Nacional de Vigilância Sanitária.Resolução RDC nº 132, de 29 de Maio de 2003.Diário Oficial da União, de 02 de Outubro de 2003. BRESCHI L, MARTIN P, MAZZONI A, NATO F, CARRILHO M, TJÄDERHANE L, VISINTINI E, CADENARO M, TAY FR, DE STEFANO DORIGO E, PASHLEY DH. Use of a specific MMP inhibitor (Galardin) for preservation of hybrid layer. Dental Material, v.26, p.571-578, 2010a. BRESCHI L, MAZZONI A, NATO F, CARRILHO M, VISINTINI E, TJÄDERHANE L, RUGGIERI A Jr, TAY FR, DORIGO EDES, PASHLEY DH. Chlorhexidine stabilizes the adhesives interface: a 2-year in vitro study. Dental Material, v.26, p.320-325, 2010b. BRETZ WA. Preliminary report on the effects or propolis on wound healing in the dental pulp. Journal Zeitschrift Naturforshung (In Press), 1999. BUONOCORE MG. A simple method of increasing the adhesion of acrylic filling materials to enamel surfaces. Journal of Dental Research, v.34, p. 849-53, 1955. BURDOCK GA. Review of the biological properties and toxicity of bee propolis. Food and Chemical Toxicology, v. 36, n. 4, p. 347-363, 1998. BURLEIGH MC, BARRET AJ, LAZARUS GS. Cathepsin B1. A lysosomal enzyme that degrades native collagen. Biochemical Journal, v.137, p.387-398, 1974. BUTLER WT. Dentin extracellular matrix and dentinogenesis. Operative Dentistry, supl v. 5, p. 18-23, 1992.
76
BUTLER WT, RITCHIE HH, BRONCKERS AL. Extracellular matrix proteins of dentine. Ciba Foundation Symposium, 205; 107-15; discussions 115-7 (Review) 1997. BUTLER WT.Dentin matrix protein. European Journal Oral Science, p.106, Suppl 1, p. 204-10 (Review),1998.
CAMPS J & PASHLEY DH. Buffering action of human dentin in vitro. Journal Adhesive Dental, v.2, p.39-50, 2000. CARRILHO MR, GERALDELI S, TAY F, DE GOES MF, CARVALHO RM, TJÄDERHANE L, REIS AF, HEBLING J, MAZZONI A, BRSCHI L, PASHLEY D. In vivo preservation of the hybrid layer by chloehexidine. Journal Dental Research, v.86, p.529-533, 2007.
CARRILHO MR, CARVALHO RM, de GOES MF, di HIPÓPLITO V, GERALDELI S, TAY FR, PASHLEY DH, TJÄDERHANE L. Clhlorhexidine preserves dentin bond in vitro. Journal Dental Research, v.8, p.90-4, 2007a. CARRILHO MRO, GERALDELI RM, TAY FR, DE GOES MF. CARVALHO RM, TJÄDERHANE L , REIS AF, HEBLING J, MAZZONI A, BRESCHI L, PASHLEY D.In vivo preservation of hybrid layer by chlorhexidine. Journal Dental Research, v.86, p. 529-533, 2007b.
CARVALHO RM, YOSHIYAMA M, PASHLEY EL, PASHLEY DH. In vitro study on the dimensional changes on human dentine after demineralization. Archives of Oral Biology, v.41, p.369-77, 1996. CARVALHO RM, TAY FR, GIANINNI M, PASHLEY DH. Effects of hydratation on bond strength to dentin. Journal Adhesive Dental, Spring; v. 6, p.13-7, 2004.
CATEF 2005. Câmara Técnica de Medicamentos Fitoterápicos. Nota Técnica sobre o Registro de Produtos Contendo Própolis 2005. Disponível em < E:\Própolis\Anvisa -Instituição - Câmaras Técnicas - Câmara Técnica de Medicamentos Fitoterápicos - CATEF.htm> Acesso em: 10/10/2006. CHERSONI S. Water movement in the hybrid layer after different dentin treatments. Dental Material, v.20, p.796-803, 2004. CUESTA–RUBIO O; FONTANA-URIBA BA, RAMIREZ-APANT T, CARDENAS Journal Zeitschhhrift fur Naturforshung, v. 57, p. 372-378, 2002. D’AURIA FD, TECCA M, SCAZZOCCHIO F, RENZINI V, STRIPPOLI V. Effect of propolis on virulence factors of Candida albicans. Journal of Chemotherapy, Italia, v.15, p.454-60, 2003. DEBUYSER E. La propolis. France. Thesis (Doctor)-Université de Nantes,1983.
77
DE PAULA AMB, DIAS SMD, SANTIAGO WK, DIAS RS, SANTOS VV. Efeito das soluções de própolis sobre microrganismos patogênicos da cavidade bucal. I. Microrganismos do Gênero Cândida. Centro Estomatologia do Curso de Odontologia, v.33, p.116, 1997. DIAS SMD. Efeito das soluções de própolis sobre microrganismos patogênicos da cavidade bucal. III - Streptococcus mutans. Centro Estomatologia do Curso de Odontologia, v.33, p.116,1997. DICKINSON DP. Cysteine peptidases of mammals their biological roles and potential effects in the oral cavity and other tisues in health and disease. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine, v.13, p.238-275, 2002. DUAILIBE SAC, GONÇALVES AG, AHID FJM. Effect of a propolis extract on Streptococcus mutans counts in vivo. Journal of Applied Oral Science, Bauru, p.420-423, set. 2007. EGEBLAD M, WERB Z. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nature Reviews Cancer, v.2 (3), p. 161-74, 2002. ERCAN N, ERDEMIR EO, OZKAN SY, HENDEK MK. The comparative effect of propolis in two different vehicles: mouthwash and chewing-gum on plaque accumulation and gingival inflammation. Europen Journal Dentistry, v.9(2), p.272-6, 2015. FUSAYAMA T, NAKAMUARA M, KUAROSAKI N, IWAKU M. Non-pressure adhesion of a new adhesive restorative resin. Journal Dental Research, v.58, n.4, p.1364-1372, 1979. GARCIA CL, GARGUERA EG. Efestos del propolan en el tratamiento de aftas bucales. Revista Cuba de Medicina Militar, v.22, p.42-45, 1993. GARCIA MB, CARRILHO MR, NÖR JE, ANAUATE-NETTO C, ANIDO-ANIDO A, AMORE R, TJÄDERHANE L, BRETZ WA. Chlorhexidine in inhibits the proteolytic activity of root and coronal carious dentin in vitro. Caries Research, v. 43, p. 92-6, 2009. GEBARA ECE, ZARDETTO CG Del , MAYER MPA. Estudo in vitro da ação antimicrobiana de substâncias naturais sobre S mutans e S sobrinus. Revista de Odontologia da Universidade de São Paulo, v.10, n.4, p.251-256, out./dez. 1996. GENDRON R, GRENIER D, SORSA T, MAYRAND D.Inhibition of activities of matrix metalloproteinases 2,8 and 9 by chlorhexidine. Clinical Diagnostic Laboratory Immunology, v.6, p. 437-9, 1999. GHISALBERTI EL. Propolis: A review. Bee World, v. 60, p. 59-84, 1979. GOLDBERG M, SEPTIER D , BOURD K, HALL R ,GEORGE A , GOLDBERG H, MENASHI S. Immunohistochemical localization of MMP-2, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2 in the forming rat incisor. Connect Tissue Research, v.44, p.143-153, 2003.
78
GORACCI C, SADEK FT, MONTICELLI F, CARDOS PE, FERRARI M. Microtensile bond strength of self-etching adhesives to enamel and dentin. Journal Adhesive Dentistry, v.6, p. 313-18, 2004. GROSS J, LAPIÈRRE CM. Collagenolytic activity in amphibinan tissues: a tissue culture assay. Proceedings of the National Academy Sciences, v. 54, p. 1197-204, 1962. HASHIMOTO M, OHNO H, SANO H, KAGA M, OGUCHI H. In vitro degradation of resin-dentin bonds analyzed by microtensile bond test, scanning and transmission electron microscopy. Biomaterials, v.24, p. 3795-3803, 2003. HEBLING J, PASHLEY DH, TJÄDERHANE L, TAY FR. Chlorhexidine arrest subclinical degradation of dentin hybrid layers in vivo. Journal Dental Research, v. 84, p.741-746, 2005. HELBIG A, THIEL K D. Comparison of the antiviral activity of oxidizing caffeic acid and hydrocaffeic acid against Herpes virus hominis types 1 and 0 in vitro. Pharmazie, v.37, p. 603-604, 1982. HOLLAND GR. Morphological features of dentine and pulp related to dentin sensitivity. Archives of Oral Biology, 39 Suppl: 35-115 (Review), 1994. HU F, HEPBURN HR, LI Y, CHEN M, RADLOFF SE, DAYA S. Effects of ethanol and water extracts of propolis (bee glue) on acute inflammatory animal models. Journal of Ethnopharmacology, v. 100, p. 276-283, 2005. IKENO K, IKENO P, MIYAZAWA C. Effects of propolis on dental caries in rats. Caries Research, v. 25, p. 347-351, 1991. KANCA J. Effect of resin primer solvents and surface wetness on resin composite bond strength to dentin. American Journal Dentistry, v. 5, p.213-221, 1992a. KANCA J. Resin bonding to wet substrate I bonding to dentin. Quintessence International New Malden, v.23, p. 39-41, 1992b. KATCHBURIAN E, ARANA V. Histologia e Embriologia Oral. 2.ed, Rio de Janeiro (RJ): Guanabara-Koogan, p.381, 2004. KONNO AN, SINHORETI MA, CONSANI S, CORRER-SOBRINHO L, CONASNI RL. Effect on the shear bond strength of adhesive systems. Braziian Dental Journal, Ribeirão Preto, v. 14(1), p. 42-47, 2003. KOSALEC I, PEPELJNJAK S, BAKMAZ M, VLADIMIR-KNEZEVIC S. Flavonoid analysis and antimicrobial activity of commercially available propolis product. Acta Pharmaceutica, v. 55, p. 423-430, 2005.
79
KOSHIRO K, INOUE S, SANO H, De MUNCK J, VAN MEERBEEK B. In vivo degradation of resin-dentin bonds produced by a self-etch and an etch-and-rinse adhesive. European Journal Oral Science, v.113 (4), p.341-8, 2005. KOSONOKA L. Propolis-snake oil legitimate medicine? American Bee Journal, v.130, 1990. LAXE LAC. Sistemas adesivos autocondicionantes. International Journal of Dentistry, v.6, p.25-29, 2007. LEME AA, VIDAL CM, HASSAN LS, BEDRAN-RUSSO AK. Potencial role of surface wettability on the long-term stability of dentin bonds after surface biomodification. Biomechical Journal, v.15, p.186, 2015. LI ZQ, KIENETZ M, CHERNEY MM, JAMES MNG, BROMME D. The crystal and molecular structures of a cathepsin K: chondroitim sulfate complex. Journal Mollecular Biologie, v.383, p. 78-91, 2008. LINDE A, GOLDBERG M. Dentinogenesis. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine, v.45 (5), p. 679-728, 1993. LUNDY T, STANLEY HR. Correlation of pulpal histopathology and clinical symptoms in human teeth subjected to experimental irritation. Oral Surgery, v.27, p.187-201, 1969a. MAGRO FILHO O, PERRI DE CARAVALHO AC. Application of propolis to dental sockets and skin wounds. Journal of Nihon University School of Dentistry, v.32, p.4-13, 1990. MAGRO FILHO O, PERRI DE CARVALHO AC. Topical effects of própolis in the repair of sulcoplasties by themodified Kazanjian techinic. Journal Nihon University Dentistry, v.36, n.2, p. 102-111, 1994. MAIA-ARAÚJO YLF, MENDONÇA LS, ORELLANA SC, ARAÚJO ED. Comparação entre duas técnicas utilizadas no teste de sensibilidade antibacteriana do extrato hidroalcoólico de própolis vermelha. Science Plena, v.7, n. 4, p. 1- 4, 2011. MANARA LRB. Utilização da própolis em Odontologia. Revista de Faculdade de Odontologia de Bauru, v.7, p.15-0, 1999. MARCUCCI MC. Propolis: chemicas composition, biológicas properties and therapeutic activity. Apidologie, v.26, p.83-89,1995.
MARCUCCI MC. Propriedades biológicas e terapêuticas dos constituintes químicos da própolis. Quimica Nova, v.19, p.529-536, 1996. MARCUCCI MC, RODRIGUES J, FERRERES F, BANKOVA V. Chemical composition of Brazilian propolis from São Paulo state. Zeitschrift Für Naturforschung,v. 53, p. 117-119, 1998.
80
MARCUCCI MC, BANKOVA V. Chemical composition, plant origin and biological activity of Brazilian propolis. Current Topics in Phytochemistry,v. 2:115-123, 1999. MARCUCCI MC, FERRERES F, CUSTÓDIO AR, FERREIRA MMC, BANKOVA VS, GARCIA-VIGUERA C. BRETZ WA. Evolution of phenolic compounds in Brazilian propolis from different geographic regions. Zeitschrift Für Naturforschung, v.55, p. 76-81, 2000. MARCUCCI MC, FERRERE Z F, GARCIA-VIGUEIRA C, BANKOVA VS, DE CASTRO SL, DANTAS AP, VALENTE PHM, PAULINO N: Phenolic compounds from Brazilian propolis with pharmacological activities. Journal of Ethnopharmacology, v.74, p. 105-112, 2001. MARCUCCI MC. Própolis Tipificada: Um novo caminho para a elaboração de Medicamentos de Origem Natural de origem apícola. Revista Fitos: Março, 1(3), 2006.
MARTIN-DE LAS HERAS S, VALENZUELA A, OVERALL CM. The matrix metalloproteinase gelatinase A in human dentine. Archives of Oral Biology v.45, p.757-765, 2000. MARTIN MP, PILEGGI R. A quantitative analysis of Propolis: a promising new storage media following avulsion. Dental Traumatology, EUA, v.20, p.85-9, 2004. MARTINES SILVEIRA G. Estudio preliminar sobre los efectos del propolan en el tratamiento de la gingivitis cronica y de las ulceras bucales. Revista Cubana Estomatologia, v.25, p.36-44, 1988. MARSHALL JR GW, MARSHALL SJ, KINNEY JH, BALOOCH M. The dentin substrate: structure: structure and properties related to bonding. Journal Dentistry, v.25 (6), p.441-58, 1997. MERESTA L, MERESTA T. Antibacterial activity of flavonoid compounds of propolis occurring in flora in Poland. APIC Abstract, v.41, p.1345, 1986. MOGI M, OTOGOTO J. Expression of cathepsin-K in gingival crevicular fluid patients with peiodontitis. Archives of Oral Biology, v.2, p.894-898, 2007. MURPHY G, KNAUPER V. Relating matrix metalloproteinase structure to funcion: Why the hemapectin domain? Matrix Biology, v.15, p.511-8, 1997. NÄGLER DK, STORER AC, PORTARO FC, CARMONA E, JULIANO L, MÉNARD R. Major increase in endopeptidase activity of human cathepsina B upon removal of occluding loop contacts. Biochemistry, v. 36, p. 12608-15, 1997. NAKABAYASHI N, KOJIMA K, MASUHARA E. The promotion of adhesion by the infiltration of monomers into tooth substrates. Journal Biomedic Material Research, v.16, p. 265-73, 1982.
81
NASCIMENTO FD, MINCIOTTI CL, GERALDELI S, CARRILHO MR, PASHLEY DH, TAY FR, et al. Cysteine cathepsins in human carious dentin. Journal Dental Research, v. 90, p. 506-511, 2011. NOGUEIRA MA, DIAZ MG, TAGAMI PM, LORSCHEIDE J. Atividade microbiana de óleos essenciais e extratos de própolis sobre bactérias cariogênicas. Revista de Ciências Faramacêuticas Básica e Aplicada, Viçosa, n.1, p. 93-97, jul.2007. OLSSON S, OILO G, ADAMCZAK E. The structure of dentin surfaces exposed for bond strength measurements. Scandinavian Journal Dentistry Research, v .101, p.180-4, 1993. OSORIO R, ERHARDT MC, PIMENTA LA, OSORIO E, TOLEDANO M. Edta treatment improves resin-dentin bonds resistance to degradation. Journal of Dental Research, v. 8, p. 736-40, 2005. OSORIO R, YAMAUTI M, OSORIO E, RUIS-REQUENA ME, PASHLEY D, TAY F. Effect of dentin etching and chlorhexidine application on metallproteinase-mediated collagen degradation. European Journal Oral Science, v.119, p. 79-85, 2011. PAGE-MCCAW A, EWALD AJ, WERB Z. Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue remodeling. Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 8(3), p.221-33, 2007. PARK YK, KOO MH, ABREU JAS, IKEGAKI M, CURY JA, ROSALEN PL. A atividade antimicrobiana da própolis sobre microrganismos orais. Microbiologia atual, v.36 ,p. 24-28, 1998. PARK YK, ALENCAR SM, SCAMPARINE ARP, AGUIAR CL. Própolis produzida no sul do Brasil, Argentina e Uruguai: Evidências fitoquímicas de sua origem vegetal. Ciência Rural, v.2, p. 997-1003, 2002. PERDIGÃO J, RITTER AV. Adesão aos tecidos dentários. In: Baratieri LN et al. Odontologia Restauradora Fundamentos e Possibilidades. 3ed. São Paulo: Santos. P.83-128, 2003. PASHLEY DH, CARVALHO RM. Dentin permeability and dentin adhesion. Journal of Dental Research, v.25, p.355-372, 1997. PASHLEY DH, TAY FR, YIU C, HASHIMOTO M, BRECHI L, CARVALHO RM, ITO S. Collagen degradation by host-derived enzymes during aging. Journal or Dental Research, v. 83, p.216-21, 2004. PAULINO N, ABREU SRL, UTO Y, KOYAMA D, NAGASAWA H, HORI H, DIRSCH VM, VOLLMAR AM, SCREMIN A, BRETZ WA: Anti-inflammatory effects of a bioavailable compound, Artepillin C, in Brazilian propolis. European Journal Pharmacology, v.587, p.296-301, 2008.
82
PICCINELLI AL, LOTTI C, CAMPONE L, CUESTA-RUBIO O, CAMPO FERNANDEZ M, RASTRELLI L. Cuban and Brazilians red própolis: botanical origin and comparative analysis by high-performance liquid chromatography-photodiode array detection/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Agricultura and Food Chemistry, v.59, p. 6484-91, 2011. POZGAN U, CAGLIC D, ROZMAN B, NAGASE H, TURK V, TURK B. Expression and activity profiling of selected cysteine cathepsins and matrix metalloproteinases in synovial fluids from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Biology Chemitry, v. 391, p.571-579, 2010. REIS A. Degradação das interfaces resina-dentina: uma revisão de literature. Revista de Odontologia da UNESP, v.3, p.191-198, 2006. ROCHA L, DOS SANTOS LR, ARCENIO F, CARVALHO ES, LÚCIO EMRA, ARAÚJO GL, TEIXEIRA LA, SHARAPIN N. Otimização do processo de extração de própolis através da verificação da atividade antimicrobiana. Revista Brasileira de Farmacologia, v. 13, p.71-74, 2003.
SABIR A, TABU CR, AGUSTIONO P, SOSROSENO W. Histological analysis of rat dental pulp tissue capped with própolis. Journal of Oral Sciences, v.47 (3), p. 135-8, 2005. SALATINO A, TEIXEIRA EW, NEGRI G, MESSAGE D. Origin and chemical variation of Brazilian propolis. CAM, v.2, p. 33-38, 2005. SANTOS VR. Própolis: antibiótico natural alternativo em odontologia. Revista do Conselho Regional de Odontologia de Minas Gerais, v.5, p.3, 1999. SANTOS FA, BASTOS EM, MAIA AB, UZEDA M, CARVALHO MA, FARIAS LM, MOREIRA ES. Brazilian propolis: physiichomecal properties, plant origin and antibacterial activity on periodontopathogens. Phytotherapy Research: PTR, Belo Horizonte, v.17, p.285-9, 2003. SCAFFA PM, VIDAL CM, BARROS N, GESTERIA TF, CARMONA AK, BRESCHI L, PASHLEY DH, TJÄRDERHANE IL,TERSARIOL IL, NASCIMENTO FD, CARRILHO MR. Chlorhexidine inhibits the activity of dental cysteine cathepsins. Journal of Dental Research, v. 91, p. 420-5, 2012. SCAVUZZI AIF, BEZERRA RB, TOBIAS PCD. Estudo comparativo in vitro da microinfiltração marginal de dois sistemas adesivos em dentes decíduos e permanentes. J Bras Clin Odontol Int, v. 5, p.151-5, 2001. SCHELLER S, LUCIAK M, TUSTANOWSKI J, KOZIOL M, OBUSZKO Z, KURYLO B. Biological properties and clinical application of própolis.IX. Arzneimittel-Forschung/ Drug Research, v.28, p.289-291, 1978. SILVERSTONE LM, SAXTON CA, DOGON IL, FEJERSKOV O. Variation in the pattern of acid etching of human dental enamel examined by scanning electron microscopy. Caries Research, v.9, p.37, 1975.
83
SMITH AJ. Dentin formation and repair. In: Hargreaves KM, Goodis HE. Seltzer and Bender’s dental pulp. Chicago: Quintessence, p. 63-94, 2002. SORKUM K, SUER B, SALIH B. Determination of chemical composition of Turkish propolis. Zeitschrift Für Naturforschung C, v. 56, p. 666-668, 2001. SORSA T, TJÄDERHANE L, SALO T. Matrix metalloproteinases (MMPs) in oral diseases. Oral Diseases, v.10, p.311-318, 2004. SORSA T, TJÄDERHNE L, KONTINEN YT, LAUHIO A, SALO T, LEE HM, GOLUB LM, BROWN DL,MÄNTYLÄ P. Matrix metalloproteinases: Contribution to pathogenesis, diagnosis and treatment of periodontal inflammation. Annals of Medicine, v.38, p.306-321, 2006. SOUZA AP, LINE SRP. The biology of matrix metalloproteinases. Revista da Faculdade de Odontologia de Bauru, v.10, p. 1-6, 2002. SOUZA AP, TREVILATTO PC, SCAREL-CAMINAGA RM, BRITO RBJ, LINE SRP. MMP-promoter polymorphism: association with chronic periodontitis severity in a Brazilian population. Journal of Clinical Periodontology, p. 202-4, 2003. STANISLAWCZUC R, REIS A, LOGUERCIO AD. A 2-year in vitro evaluation of a chlorhexidine-containing acid on the durability of resin-dentininterfaces. Journal of Dentistry, v. 39, p. 40-7, 2011. SULKALA M, WAHLGREN J, LARMAS M, SORSA T, TERONEM O, SALO T, et al. The effects of MMPs inhibitors of human salivary MMP activity and caries progression in rats. Journal of Dentistry Research, v. 80, p. 1545-9, 2001. TAY FR, PASHLEY DH. Aggressiveness of contemporary self-etching systems I: Depth of penetration beyond dentin smear layers. Dental Material, v. 17, p.296-308, 2001. TEN CATE AR. Oral Histology Development Structure and Function, 4. Ed. St Louis: Mosby, p.169-217, 1994. TERSARIOL IL, GERALDELI S, MINCIOTTI CL, NASCIMENTO FD, PAAKKLONEN V, MARTINS MT. Cysteine cathepsins in human dentin-pulp complex. Journal of Endodontics v. 36, p.475-481, 2010. TERZVERGIL-MUTLUAY A, AGEE KA, HOSHIKA T, CARRILHO M, BRESCHI L, TJÄDERHANE L. The requirement of zinc and calcium ions for functional MMP activity in demineralized dentin matrices. Dental Material, v.26, p.1059-67, 2010. TERZVERGIL-MUTLUAY A, AGEE KA, HOSHIKA T, UCHIYAMA T, TJÄDERHANE L, BRESCHI L. Inhibition of MMPs by alcohols. Dental Material, v. 27(9), p.926-33, 2011.
84
THOMPSON JM, AGEE K, SIDOW SJ, MCNALLY K, LINDSEY K, BORKE J. Inhibition of endogenous dentin matrix metalloproteinases by ethylenediaminetetraacetic acid. Journal of Endodontics, v.38, p. 62-5, 2012. TJÄDERHANE L, LARJAVAL H, SORSA T, UITTO V, LANNAS M, SALO T. The Activation and Function of Host Matrix Metalloproteinases in Dentin Matrix Breakdown in Caries Lesions. Journal of Dentistry Resarch, v. 77 (8), p.1622-1629, 1998. TOLEDANO M, YAMAUTI M, OSORIO E, OSORIO R. Zinc-inhibited MMP-mediated collagen degradation after different dentine demineralization procedures.Caries Research, v.46, p. 201-7, 2012. TOMAS-BARBERAN FA, GARCIA-VIGUERA C, VIT-OLIVER P, FERRERESF, TOMAS-LORENTE F. Phytochemical evidence for the botanical origin oftropical própolis from Venezuela. Phytochemistry, v.34, p. 191-96, 1993. TRUSHEVA, B.; POPOVA, M.; NAYDENSKI, H.;TSVETKOVA, I.; RODRIGEZ, J.G.; BANKOVA. Fitoterapia v.75, p.683-89, 2004. TRUSHEVA B, POPOVA M, BANKOVA V, SIMOVA S, MARCUCCI MC, MIORIN PL, PASIN FR, TSVERKOVA I. Bioactive constituents of Brazilian red propolis. Cam, v.3, p. 249-54, 2006. TSUJI Y, YAMASA T, KIDO MA, GOTO T, NAKATA S, AKAMINE A. Expression of cathepsin K mRNA and protein in odontoclasts after experimental tooth movement in the mouse maxilla by in situ hybridization and immunoelectron microscopy. Cell Tissue Resarch, v.303, p.359-369, 2001. TURK B, TURK D, TURK V.Lysossomal cysteine proteases: more than scavengers. Biochim Biophys Acta, v. 1477, p. 98-111, 2000. TURK D, GUNCAR G .Lysosomal cysteine protease (cathepsins): promising drug targets. Acta Crys, v.59, p.203-213, 2003. TURK V, STOKA V, VASILJEVA O, RENKO M, SUN T, TURK B. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Biochimica et Biophysica Acta, v.1824, p.68, 2012. VANNI R, WALDNER-TOMIC NM, BELIBASAKIS GN, ATTIN T, SCHMIDIN PR, THURNHER T. Antibacterial efficacy of a propolis toothpaste and mouthrinse against a supragingival multispecies biofilm. Oral Health Preventive, v.10, 2015. VARGAS AC, LOGUERCIO AP, WITT NM, DA COSTA MM, SÁ E SILVA M, VIANA LR. Atividade antimicrobiana “in vitro” de extrato alcoólico de própolis. Ciência Rural, v. 34, p. 159-163, 2004. VASILJEVA O, TURK B. Dual contrasting roles of cysteine cathepsins in cancer progression: Apoptosis versus tumor invasion, Biochimie, v.90, p.380-386, 2008.
85
VIDAL CM. Estudo da atividade proteolítica da dentina humana sadia e cariada [tese] Piracicaba: Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Universidade Estadual de Campinas, 2012. VISSE R, NAGASE H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research, v. 92, p. 827-39, 2003. WANG JD, HUME WR. Diffusion of hydrogen ion and hydroxyl ion from various sources through dentine. International Endodontic Journal, v. 21(1), p.17:26, 1988. WATANANBE I, NIKAIDO T, NAKABAYASHI N. Effect of adhesion promoting monomers on adhesion to ground dentin. Shika Zairyo Kikai, v.9, p. 888-93, 1990. WATANABE I. Photocured bonding agents to ground dentin. Journal Japan Dental Material, v.11, p. 955-73, 1992.
86
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Título da Pesquisa: Efeito inibitório sobre a atividade proteolítica das cisteínos-
catepsinas.
Nome do (a) Pesquisador (a): Profa. Dra. Andréa Anido Anido
O sra (sr.) está sendo convidada (o) a participar desta pesquisa que tem
como finalidade a avaliação do novos procedimentos para a realização de
restaurações dentais mais duradouras.
Ao participar deste estudo a sra (sr) permitirá que o (a) pesquisador (a)
Profa. Dra. Andréa Anido Anido, utilize dentes extraídos por finalidade
ortodôntica, por problemas periodontais ou com indicação para tratamento por
implante. A sra (sr.) tem liberdade de se recusar a participar, sem qualquer
prejuízo para a sra (sr.). Sempre que quiser poderá pedir mais informações
sobre a pesquisa através do telefone do (a) pesquisador (a) do projeto e, se
necessário através do telefone do Comitê de Ética em Pesquisa.
Riscos e desconforto: a participação nesta pesquisa não traz complicações
legais. Os pacientes não serão submetidos a nenhum procedimento adicional
àquele já estabelecido em seu plano de tratamento, portanto não há riscos ou
desconforto. Os procedimentos adotados nesta pesquisa obedecem aos Critérios
da Ética em Pesquisa com Seres Humanos conforme Resolução no. 196/96 do
Conselho Nacional de Saúde. Nenhum dos procedimentos usados oferece riscos à
sua dignidade.
Confidencialidade: todas as informações coletadas neste estudo são
estritamente confidenciais. Somente o (a) pesquisador (a) e o (a) orientador (a)
terão conhecimento dos dados.
Benefícios: ao participar desta pesquisa a sra (sr.) não terá nenhum
benefício direto. Entretanto, esperamos que este estudo traga informações
importantes sobre técnicas para a realização de restaurações, de forma que o
conhecimento que será construído a partir desta pesquisa possa contribuir para
aumentar a longevidade das restaurações, onde pesquisador se compromete a
divulgar os resultados obtidos.
87
Pagamento: a sra (sr.) não terá nenhum tipo de despesa para participar
desta pesquisa, bem como nada será pago por sua participação.
Após estes esclarecimentos, solicitamos o seu consentimento de forma
livre para participar desta pesquisa. Portanto preencha, por favor, os itens que
se seguem: Confiro que recebi cópia deste termo de consentimento, e autorizo a
execução do trabalho de pesquisa e a divulgação dos dados obtidos neste
estudo.
Obs: Não assine esse termo se ainda tiver dúvida a respeito.
Tendo em vista os itens acima apresentados, eu, de forma livre e esclarecida,
manifesto meu consentimento em participar da pesquisa
______________________________
Nome e Assinatura do Participante da Pesquisa
__________________________________
Nome e Assinatura do Pesquisador
Pesquisador: Prof. Dra. Andréa Anido Anido RG.: 17.961.017-X
Rua Maria Cândida, 1813, Vila Guilherme, São Paulo - CEP.: 02071-013
Telefone: (11) 2967-9147
Telefone da Comissão de Ética: (11) 2972-9000
E-mail: [email protected]
88
Universidade Bandeirante de São Paulo Comissão de Ética em Pesquisa com Seres Humanos
(Registrado no Ministério da Saúde)
UNI BAN – Campus Maria Cândida – Rua Maria Cândida, 1.813 – Vila Guilherme São Paulo/SP CEP: 02071-013
e-mail: [email protected] Telefones: (11) 2967-9110 / 9126
Protocolo de entrada: 1624 - IC
PARECER FINAL
O projeto intitulado “RESISTÊNCIA DE UNIÃO DE SISTEMAS ADESIVOS À
DENTINA TRATADA COM PRÓPOLIS TIPIFICADA” de responsabilidade da
Professora ANDRÉA ANIDO ANIDO, do PROGRAMA DE MESTRADO
PROFISSIONAL DE BIOMATERIAIS EM ODONTOLOGIA, foi analisado pela
Comissão de Ética, desta Instituição, na reunião de 06 de junho de 2012, sendo
considerado APROVADO.
Profa. Dra. Flávia Doná Simone
Presidente da Comissão de Ética