UBA III – Biologia Molecular

Aula prática 2 2013/2014

Maria José Correiamariacorrei@gmail.com

17/10/2013

• Eletroforese em gel de agarose• Vizualização do DNA isolado na aula anterior

em geis de agarose.

Sumário P2:

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• Separação de diferentes fragmentos de DNA em função da sua mobilidade num campo elétrico

• Fatores que influenciam a migração de DNA em gel• Peso molecular• Conformação do DNA• Concentração de agarose• Voltagem aplicada• Composição do tampão de eletroforese

http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/eletroforese.php

Eletroforese em gel de agarose

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Eletroforese: preparação do gel de agarose

1. Preparar uma solução de agarose em tampão TAE (1x) com concentração final de 1% (m/v).

2. Aquecer a mistura em microondas até toda a agarose se ter dissolvido.

3. Montar o suporte do gel na respetiva base de preparação do gel. 4. Colocar o pente formador de poços na posição correta.5. Verter a agarose no suporte eliminando bolhas de ar que se tenham

formado e deixar solidificar à temperatura ambiente.6. Retirar o pente cuidadosamente para não danificar os poços.7. Colocar o suporte na tina de eletroforese, de modo a que os poços

estejam do lado do elétrodo negativo, e adicionar tampão TAE(1x)

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Electroforese: preparação das amostras

1. Adicionar tampão de carga amostras de DNA de cada um isoladas na aula anterior.

2. Aplicar as amostras nos respetivos poços com uma micropipeta, evitando a contaminação dos poços adjacentes.

3. Reservar um dos poços para aplicar marcador de pesos moleculares (para referência)

4. Colocar a tampa na tina e verificar se a migração das amostras se dá no sentido cátodo-ânodo (preto-vermelho).

5. Estabelecer a corrida a 100V durante 30 minutos. 6. Depois da corrida, desligar a tina e retirar o gel e colocá-lo numa tina

com corante.7. Lavar o gel com água (40-55ºC)8. Examinar os resultados.

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