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TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO II

Redução de custos em análises de teor de ativos do produto

Opera®, pelo desenvolvimento de uma nova metodologia

analítica utilizando a técnica da Cromatografia Líquida de

Alta Eficiência

Aluno: Vinícius Chiquetto Faria

Orientador: Prof. Dr. Antônio Carlos França

Lorena/2012

Agradecimentos e Dedicatória

Primeiramente, gostaria de dedicar este trabalho à minha família e namorada, e

agradecer por tudo que tenho e que conquistei em toda minha vida, sempre me

apoiando e dando o suporte necessário.

Sou grato à empresa BASF S.A. pela oportunidade de estagiar em sua

dependência, tendo um crescimento profissional e pessoal extremamente

importante. Aos profissionais que me auxiliaram diariamente no desenvolvimento de

qualquer trabalho, assim como meu gerente, meus agradecimentos.

Por fim, agradeço meu orientador Prof. Dr. Antônio Carlos França, que aceitou

prontamente meu pedido de orientação, e que me deu suporte muito importante

neste trabalho, e a Escola de Engenharia de Lorena, que me propicia esta

oportunidade.

Resumo

Análises por cromatografia podem ser feitas quantitativamente ou qualitativamente

para determinar os componentes de uma amostra. Dentre os vários tipos de

cromatografia, destacam-se a gasosa e a líquida. Este trabalho tem como objetivo a

redução de custos em análises de teor de ativos do produto OPERA®, da empresa

BASF S.A., utilizando a técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Neste

projeto, será desenvolvido uma nova metodologia analítica que apresente economia

em relação à anterior, e posterior validação seguindo normas da Associação

Brasileira de Normas Técnicas.

Palavras chave: Cromatografia; BASF S.A.; Opera®; Custos

Sumário

1. Introdução 5

2. Revisão Bibliográfica 6

2.1 Cromatografia Líquida 6

2.2 Cromatografia Gasosa 10

3. Metodologia 11

4. Análise e Discussão dos Resultados 13

4.1 Testes com o preparo da amostra 14

4.2 Testes com o equipamento 14

4.2.1 Fase Estacionária 14

4.2.2 Fase Móvel 15

4.2.3 Fluxo 15

4.2.4 Temperatura da Fase Estacionária 16

4.2.5 Comprimento de Onda 16

4.2.6 Volume de injeção 16

4.2.7 Tempo de Análise 16

4.3 Validação do Método 17

4.3.1 Seletividade 17

4.3.2 Linearidade 18

4.3.3 Recuperação 20

4.3.4 Repetitividade 23

4.3.5 Precisão Intermediária 26

4.3.6 Robustez 29

4.4 Cálculos do Projeto 32

5. Conclusão 37

6. Referências 38

7. Anexos 39

7.1 Média Aritmética 39

7.2 Estimativa do Desvio Padrão 39

7.3 Teste de GRUBBS 39

7.4 Cálculo do Coeficiente de Correlação 40

7.5 Cálculo do Coeficiente de Variação 40

5

1. Introdução

A técnica de cromatografia é utilizada para a separação dos componentes

de uma amostra, que se distribuem em duas fases, uma estacionária e a outra,

móvel. Baseia-se na análise de produtos formulados por diferença de polaridade

através de uma coluna de separação, quantificando por meio de um sistema de

integrador a comparação da área do padrão cuja pureza é conhecida, com a área

da amostra em questão. Na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), a fase

estacionária é um sólido e a fase móvel é líquida. Baseia-se na análise de produtos

formulados por diferença de polaridade através de uma coluna de separação,

quantificando por meio de um sistema de integrador a comparação da área do

padrão cuja pureza é conhecida, com a área da amostra em questão.

Na CLAE, os maiores gastos de uma análise são através de consumíveis do

equipamento, preparo da amostra e dos padrões, da coluna (fase estacionária), mas

principalmente com a fase móvel, pois ao contrário da fase estacionária, esta não é

reaproveitada (resíduo) e, dependendo das condições do método, utiliza-se em

bastante quantidade para a análise.

O objetivo deste projeto visa a redução de custos nas análises de teor de

ativos do produto Opera®, da empresa BASF S.A. de Guaratinguetá - SP, pelo

desenvolvimento de um novo método analítico utilizando a CLAE. O produto em

questão é de alto valor agregado e grande número de análises, portanto, é

necessário maior agilidade na obtenção dos resultados, além da economia. O

desenvolvimento de um método com tempo de análise mais curto para esse produto

diminuiria consideravelmente os custos, devido à utilização de menos solventes,

menor desgaste da coluna cromatográfica, além de gerar menor volume de resíduo,

gerando economia para o Laboratório Analítico.

6

2. Revisão Bibliográfica

2.1. Cromatografia Líquida

Principais características:

- Grande versatilidade, já que abrange vasta gama de aplicações, com

possibilidades de configurações diversas. [4]

- Possibilidade de separações de misturas complexas, incluindo isômeros e

homólogos, em virtude da disponibilidade no mercado de grande número de colunas

cromatográficas e detectores. [4]

- Rapidez com que os resultados são obtidos, processados e quantificados,

com precisão, através de softwares e processadores de dados. [4]

- Possibilidade de análises não destrutiva de quantidades reduzidas de

amostras. [4]

- Relativa facilidade de interpretar os resultados, com possibilidade de

realizar análises quantitativas, através de padrões internos ou externos. [4]

Todas estas vantagens permitem ampla utilização da técnica, tanto em

laboratórios de análise e de pesquisa, como nos complexos industriais, onde se

utilizam sistemas automáticos de controle qualitativo e quantitativo da produção.

Assim, a principal aplicação da cromatografia liquida de alta eficiência, tem sido

encontrada predominantemente nas áreas de química fina, síntese orgânica,

bioquímica, biologia, farmácia, biotecnologia, alimentos, pesticidas e outras. [4]

A CLAE utiliza pequenas colunas cheias de materiais especialmente

preparados e fase móvel submetida a altas pressões. [1]

Vantagens: rapidez de análise, alta eficiência, reprodutibilidade,

sensibilidade possibilidade de automação, praticamente não existe restrição quanto

ao tipo de substância a analisar, separa substâncias polares, iônicas, ionizáveis e

apolares, com uma mesma coluna modificando-se apenas a composição da fase

móvel. [1] – [3]

7

Limitações: custo do equipamento, necessidade de operador experiente,

ausência de detector universal, emprega solventes de alta pureza e materiais de

consumo de custo elevado. [1]

Aplicações: é utilizada principalmente para análises qualitativas e

quantitativas de ácidos nucléicos, pesticidas, aromáticos polinucleares, polímeros,

lipídeos, drogas e farmacêuticos, herbicidas, análises clínicas, aminoácidos, etc. [1]

Figura 1 – Sistema de um equipamento de CLAE

Reservatório da fase móvel

Como reservatório de fase móvel utiliza-se recipientes de vidro com

capacidade de 0,5 a 2 litros. Na maioria dos casos, para evitar contaminação ou

degradação dos solventes, prepara-se volume suficiente para um dia de operação.

A tomada de solvente se faz através de um filtro com malha de aço com 1-2 m de

porosidade; este filtro tem como finalidade remover partículas sólidas que possam

obstruir o sistema de bombeamento e a coluna. [2] – [5]

A fase móvel é uma das variáveis que mais influenciam numa separação

cromatográfica, e cumpre um papel fundamental, já que por si mesma pode

modificar completamente a seletividade das separações e é o verdadeiro propulsor

da separação. [2] – [5]

Suporte dos frascos

de fase móvel

Degaseificador

Bomba

Autosampler

Compartimento

de coluna

Detector

Micro (Sistema

Computacional)

Monitor

8

Os solventes da fase móvel podem ser de natureza aquosa ou orgânica e, para

serem usados na CLAE, devem cumprir alguns pré-requisitos como compatibilidade

com o detector utilizado, alto poder solubilizante da amostra, baixa viscosidade, não

alterar as características da coluna, ser comercialmente viável e seguro, ponto de

ebulição adequado, alto grau de pureza. [2] – [5]

Degaseificador

Permite a remoção dos gases das fases móveis de maneira contínua. Em

cromatografia líquida, todos os solventes devem se degaseificados e filtrados. O ar

dissolvido na fase móvel pode formar bolhas na cabeça da bomba o que

consequentemente, faz com que a pressão caia e não exista fluxo. A presença de

bolhas no detector pode gerar ruídos de linha de base tão altos que torna

impraticável a utilização do sistema. Em ambos os casos, há oscilações na linha de

base e influencia sobre tempos de retenção ou aparecimentos de picos adicionais.

Os métodos de degaseificação são, geralmente, por aquecimento (refluxo com

agitação), vácuo, aborbulhamento de gás inerte (hélio), ultrassom, etc. [2] – [5]

Bomba

A vazão da fase móvel líquida, essencial para qualquer separação em CLAE

é mantida por uma, ou mais bombas de alta pressão. A alta pressão é necessária

para que o fluxo possa sobrepor à resistência das micropartículas da fase

estacionária empacotadas na coluna, assim como impedir a formação de

microbolhas no sistema, oriundas da mistura de solventes. [2] – [5]

Injetor

Como o nome sugere, o injetor é a parte do equipamento por onde se

introduz a amostra, sem alterar a vazão do sistema. As principais características de

um injetor referem-se ao fato de não provocar alargamentos da banda do

cromatograma, devido à diluição da solução injetada não ser atacado por solventes,

apresentar reprodutibilidade e precisão, quando a quantidade injetada é operada a

altas pressões. [2] – [5]

9

Compartimento de coluna

Local que se encontra a coluna estacionária. A coluna é o “curacao” de um

sistema cromatográfico. O sucesso de uma análise cromatográfica depende

fundamentalmente da coluna, na qual é escolhida conforme a natureza das

substâncias que se deseja determinar. Também no sistema de compartimento de

coluna, é onde se controla a temperatura da coluna durante a análise, fator

importante para o desenvolvimento de um método, visto que altera a viscosidade do

produto pela variação da temperatura, influenciando no tempo de retenção da

amostra na coluna. [2] – [5]

Detector

O detector cromatográfico é a parte do equipamento que recebe e fornece o

sinal que representa a quantidade do componente de interesse no eluente da

coluna. É o mais complexo e o mais caro dos módulos em CLAE. [2] – [5]

Não existe um detector ideal único ou universal para cromatografia líquida,

mas qualquer que seja, deve apresentar como características: alta sensibilidade,

baixo ruído (quanto maior o ruído pior será o valor de limite de detecção), resposta

a grande número de solutos, larga faixa de linearidade, não ser afetado pela

temperatura da fase móvel, ter resposta rápida (isto é, constante de tempo baixa) e

não ser destrutivo em relação à amostra. Alguns tipos de detectores são: UV ou

UV/Visível, Índice de refração, Condutividade elétrica, Fluorescência, Eletroquímico

e Amperométrico. [2] – [5]

Sistema computacional/ Monitor

Os computadores convertem os dados através de softwares específicos de

gerenciamento de sistemas de CLAE. Determinam a concentração da amostra em

questão através de cálculos de área dos picos cromatográficos ou também

utilizando a altura dos picos como base para fazer os cálculos. [2] – [5]

10

2.2. Cromatografia Gasosa

Técnica de cromatografia que tem como característica principal a utilização

de amostras na fase vapor ou gasosa. [6]

É muito empregada na medição de eficiência de colunas de retificação (por

porcentagem da área do componente principal), determinação de contaminantes

orgânicos voláteis (solventes) em efluente. Outra aplicação utilizada é a análise

residual de pesticidas em produtos formulados, conhecida como contaminação

cruzada na troca de produto através de um detector de massa. [6]

Diverge da cromatografia líquida em vários aspectos, mas principalmente

pelo fato de que na fase móvel do processo utilizam-se gases, como Hélio e

Nitrogênio, analisando substâncias necessariamente voláteis. [6]

A amostra é vaporizada e introduzida em um fluxo de gás adequado,

denominado fase móvel ou gás de arraste. Este fluxo de gás com a amostra

vaporizada passa através da fase estacionária (coluna cromatográfica), onde ocorre

a separação dos componentes da amostra. Quanto mais volátil a substância, maior

a sua tendência de permanecer vaporizada e mais rapidamente caminha pelo

sistema. [6]

As substâncias separadas saem da coluna dissolvidas na fase móvel e

passam pelo detector, gerando sinal proporcional à quantidade de material em

eluição. Esse sinal é registrado, emitindo o cromatograma em função do tempo,

através do qual é possível fazer a análise quantitativa da amostra, calculando pela

área dos picos. [6]

Figura 2 – Cromatógrafo Gasoso

11

3. Metodologia

O desenvolvimento da metodologia será feito através de testes, tanto na

parte do preparo da amostra, como em testes para a otimização do método no

aparelho de CLAE.

No preparo da amostra, deve ser considerada a solubilidade do produto na

fase móvel escolhida, na qual deve ser totalmente solúvel para a extração do ativo

presente na formulação. Para a extração do ativo, será utilizado aparelho de

ultrassom, que agita as moléculas presentes no produto, auxiliando na solubilização.

No equipamento, serão testadas várias variáveis do processo, para a

obtenção da metodologia mais econômica, e também eficiente:

- Fase móvel: componente essencial e fundamental para a separação do ativo

presente na formulação dos interferentes. Normalmente, são utilizados

solventes como acetonitrila, metanol, hexano, água deionizada com baixo pH,

etc.

- Fase estacionária: a coluna cromatográfica, junto com a fase móvel, é que

efetivamente faz a separação do ativo de interferentes. Também, altera o

tempo de análise com a variação do diâmetro interno da coluna,

comprimento, diâmetro das partículas da coluna, etc.

- Fluxo: deve regulado para que tenha um tempo curto de análise, mas que

esteja com pressão interna no equipamento suportável.

- Temperatura da coluna: altera a viscosidade do produto e sua passagem pela

fase estacionária. Está diretamente ligada à separação do ativo.

- Comprimento de onda: cada ativo e também os interferentes possuem

absorção diferentes e, como o detector utilizado será o UV, deverá ser

escolhido um comprimento de onda ótimo para a quantificação do ativo.

- Volume de injeção: deve ser injetada uma quantidade suficiente para a

detecção do ativo, mas também não muito grande, pois pode saturar a cela

do detector (UV), prejudicando a quantificação.

- Tempo de análise: o tempo de análise é definido como o tempo total para que

o analito possa percorrer todo o equipamento, até o descarte final.

12

Os dados coletados serão analisados e, após definidas as melhores

condições do método, é iniciado o processo de validação do método. A validação

será feita seguindo norma ABNT para Validação de Métodos.

Na validação, estão presentes os testes de seletividade, linearidade,

recuperação, repetitividade, precisão intermediária e robustez. Com esses testes,

pretende-se comprovar a eficácia, a separação total de ativos e interferentes, a

exatidão e precisão do método, entre outros.

Depois de validado, o novo método será comparado com o anterior, do

mesmo produto, para contabilizar a real economia do projeto, e a sua viabilidade.

Os cálculos deverão levar em consideração o gasto com solventes, o gasto de

padrões analíticos, além do tempo de cada análise.

13

4. Análise e Discussão de Resultados

De acordo com a proposta inicial, o trabalho foi desenvolvido em etapas,

como testes em preparo de amostra, preparo do equipamento (CLAE), validação do

método, e cálculo comparativo com metodologia anterior. Foi necessária a divisão

em partes, uma vez que o processo consistia em várias variáveis citadas

anteriormente, e muito distintas entre si, dificultando assim a visualização e

conclusão dos resultados obtidos, caso ocorressem simultaneamente.

Somente ao final do projeto, foi possível obter algum resultado concreto e

significativo, pois a proposta do trabalho somente seria satisfatória se todos os

objetivos demonstrassem êxito. Isso devido ao fato de que não seria interessante

desenvolver um método extremamente rápido e com baixo custo, mas que não

tivesse sua validação concluída e dentro das normas ABNT, por exemplo.

4.1. Testes com o preparo da amostra

A primeira etapa consistia em definir uma boa relação entre quantidade de

amostra, padrões analíticos, solventes, e também os tipos de solventes a serem

utilizados para que a amostra do produto, junto com os padrões, fosse totalmente

solubilizada, para a extração do ativo no produto.

Por se tratar da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência, as

amostras em análise precisam apresentar-se na fase líquida e, além disso, ao ser

injetado no equipamento (CLAE), o analito (ativo) deve estar totalmente solubilizado,

para que se possam obter resultados mais confiáveis e próximos dos reais.

Primeiramente, foi definida a quantidade do produto Opera® a ser

quantificado em cada análise, buscando minimizar a quantidade de solventes,

padrões, entre outros consumíveis, ainda assim satisfazendo as normas de

validação de métodos da Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT).

Através de vários testes com os solventes metanol, acetonitrila,

tetrahidrofurano (THF), hexano, e água deionizada (pH 2.5), os dados da tabela

foram obtidos:

14

Resultado da Solubilização

Acetonitrila muito solúvel

Água Deionizada parcialmente solúvel

Metanol parcialmente solúvel

Hexano pouco solúvel

THF parcialmente solúvel

Acetonitrila + Água Deionizada parcialmente solúvel

Acetonitrila + Metanol muito solúvel

Metanol + Água Deionizada parcialmente solúvel

Acetonitrila + Metanol + Água Deionizada

muito solúvel

Tabela 1 – Solubilidade do produto

Por se tratar de um solvente com características mais agressivas e tóxicas

tanto ao equipamento, quanto ao analista, e por não ter apresentado uma diferença

significativa na melhora da solubilização do produto e dos padrões, o THF foi

descartado.

Assim, com os resultados, a mistura escolhida para o restante do

desenvolvimento do método, foi a acetonitrila com água deionizada com pH 2.5

(acidificada com Ácido Sulfúrico 97.9%), na proporção de 50% para cada solvente.

Para auxiliar na extração do ativo e na sua completa solubilização, as amostras,

tanto do produto quanto dos padrões, foram submetidos ao equipamento de

ultrassom, que aperfeiçoa este processo.

4.2. Testes com o equipamento

4.2.1. Fase Estacionária

A coluna cromatográfica (fase estacionária), por se tratar de um dos

principais, ou até mesmo o principal componente para uma boa metodologia

analítica, com pico bem definido, separado dos outros componentes do produto,

maximizando a quantificação e confiabilidade, foi escolhida como a mesma do

método que já era utilizado na quantificação do produto.

Características da fase estacionária utilizada: tipo C18, com 4,6mm de

espessura e 250mm de comprimento, e diâmetro interno de 5μm. Sua utilização é

justificada por possuir boas características para o produto analisado, baixo preço

15

(comparada com outras mais modernas), e com bastante disponibilidade no

laboratório em que era desenvolvido o método.

4.2.2. Fase móvel

Após a definição dos solventes, iniciaram-se os testes para o

desenvolvimento do método analítico em equipamento CLAE. Esta foi a etapa mais

trabalhosa e que necessitou de mais tempo para sua definição, uma vez que o

CLAE é composto de vários módulos, que necessitam de ajustes individuais e

coletivos, e dentro dos limites do equipamento (pressão, fluxo, etc.).

Para a fase móvel do equipamento, foram feitos diversos testes com

solventes mais comumente utilizados, como água deionizada, acetonitrila e metanol.

Como, para as amostras e padrão, foi utilizada água deionizada acidificada em pH

2.5 com Ácido Sulfúrico 97.9%, a mesma foi utilizada para o equipamento, pois

assim reduziria o tempo de preparo de água em outro pH, podendo utilizar a mesma

usada no preparo das amostras.

Depois de muitos testes para a separação do ativo do restante da formulação

do produto, e também definição de pico, foi constatado que a utilização de água

deionizada pH 2.5, acetonitrila e metanol compuseram a melhor fase móvel para o

objetivo proposto.

Do tempo 6,0 – 7,0 minutos, o sistema permanece nas mesmas condições

iniciais, para garantir a composição original a cada injeção no equipamento.

Tabela 2 – Composição da fase móvel do equipamento

4.2.3. Fluxo

Como mostrado na tabela acima, foi necessário a criação de um gradiente de

fluxo de fase estacionária, para melhorar a definição do pico do ativo a ser

quantificado, melhorar a seletividade do analito, e também para controlar a

16

quantidade de cada solvente durante o processo de análise, sem aumentar muito a

pressão interna do sistema, principalmente da coluna.

4.2.4. Temperatura da Fase Estacionária

Foi controlada a temperatura de 25ºC da fase estacionária (coluna

cromatográfica), durante toda a análise. Assim, a pressão manteve-se controlada e

em um valor bem abaixo do limite do equipamento (400bar), visto que com a

variação da temperatura da coluna, varia também a viscosidade da amostra no

interior da coluna, alterando a pressão.

4.2.5. Comprimento de Onda

Com a característica de absorção de raios UV do ativo sendo observada no

equipamento (CLAE), foi definido o comprimento de onda que satisfizesse as

condições propostas, como boa absorção a raios UV, sem ultrapassar o limite de

detecção por parte do detector do CLAE, e sendo possível fazer a quantificação e

identificação do ativo.

Observou-se então que o comprimento de onda ideal seria de 230nm, durante todo

o processo de análise.

4.2.6. Volume de injeção

Também com os dados do comprimento de onda do equipamento, e através

de testes, obteve-se o volume de injeção para que o ativo pudesse ser qualificado e

quantificado, mas tomando o cuidado de não saturar o detector do equipamento.

Assim, o volume de injeção foi definido como 15μL.

4.2.7. Tempo da análise

Pelo cromatograma obtido na análise do Opera® e também dos padrões, foi

determinado o tempo total necessário para que a amostra percorresse todo o

equipamento, sendo quantificado, indo posteriormente para seu descarte. Ou seja, o

tempo total necessário para esta análise são 7 minutos. Assim, foi garantido que

toda a amostra injetada no equipamento fosse analisada.

17

4.3. Validação do Método

Por questões de acordo de confidencialidade empresarial entre o responsável

pelo projeto e a empresa BASF S.A., não foi possível demonstrar algumas

informações, como composição de produto.

Seguindo norma da Associação Brasileira de Normas Técnicas, NBR-14029,

para Agrotóxicos e afins – Validação de métodos analíticos, o método desenvolvido

foi validado, conforme os itens que seguem.

4.3.1. Seletividade

Com os testes de seletividade, foi possível determinar o pico cromatográfico

referente ao analito de interesse, separando-se de outros componentes da matriz da

amostra. Isso foi possível adicionando-se primeiro apenas o branco da amostra

(matriz dos componentes sem o ativo), e o branco dos solventes (injeção dos

solventes utilizados tanto na extração quanto na dissolução), e verificando o sinal

obtido no equipamento. Todos os testes foram feitos em triplicata, ou seja,

preparando-se três amostras diferentes dos brancos e do produto em questão.

Após, injetou-se o analito somente, para verificação do sinal de resposta,

sem preocupar-se na quantificação do mesmo. Com os sinais dos brancos (amostra

e solventes) e do ativo, puderam ser sobrepostos para analisar se haverá

interferência de algum componente no sinal do ativo analisado, quando estiverem

todos na mesma formulação (produto final).

Foi observado que não houve interferência de nenhum componente da

amostra no sinal obtido do analito e, portanto, o método foi considerado seletivo.

Caso houvesse alguma interferência, alteraria o sinal do elemento em análise,

alterando e dando um resultado diferente do real na quantificação do produto.

Pelo cromatograma do Opera® (Figura 3), é observada a seletividade do ativo

(analito) de interesse.

18

Minutes

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0

mA

U

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

mA

U

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

5500

.79

0

0.8

97

1.0

80

1.8

20

Ep

oxi

con

azo

le

3.0

53

Pira

clo

stro

bin

3.4

30

3.5

30

5.0

37

5.6

03

DAD-A:230nm

QA_V_BAS512_04_F_SEL_PRODUTO_311011

Retention Time

Name

Figura 3 – Cromatograma obtido da análise do produto Opera®

4.3.2. Linearidade

Este teste tem como objetivo determinar a faixa linear de trabalho que será

utilizada na validação da metodologia.

Para se realizar uma quantificação, necessita-se conhecer a dependência

entre a resposta medida e a concentração do analito. A equação da reta que

relaciona as duas variáveis é:

y = a + bx

Sendo:

Y = resposta medida (Área do pico [mAU*s]);

X = massa [mg];

a = coeficiente linear;

b = inclinação da reta obtida.

A linearidade de um método pode ser observada pelo gráfico criado a partir

da área obtida na analise em função da massa nominal e verificada pela equação

da regressão linear, determinada pelo método dos mínimos quadrados.

Analito de

interesse

19

Calculou-se o modelo através da regressão linear, os resíduos e o coeficiente

de correlação linear (R). Este é frequentemente utilizado para indicar o quanto a reta

pode ser considerada adequada como modelo para o estudo de caso. O valor

esperado para o coeficiente de correlação (R) deve estar entre o intervalo 1 - 0.99,

provando desta forma a linearidade do modelo.

Foram preparados nove níveis de concentrações, para construir a curva

analítica. Cada nível foi analisado em triplicata.

Linearidade - Opera®

Padrão Massa Nominal

[mg]

Massa

Corrigida [mg] Área [mAu*s]

Área Média

[mA*s]

1 6.09 6.08 970992.0

973031.0 973031.0

973539.0

2 6.69 6.68 1080265.0

1081224.0 1081224.0

1082291.0

3 7.88 7.86 1263099.0

1263688.0 1263688.0

1264705.0

4 8.97 8.95 1435280.0

1435280.0 1434743.0

1436481.0

5 9.58 9.56 1518345.0

1519043.0 1519043.0

1519263.0

6 10.47 10.45 1672384.0

1673185.0 1673185.0

1673958.0

7 11.73 11.71 1872219.0

1873923.0 1873923.0

1874517.0

8 12.99 12.96 2071863.0

2074343.0 2074343.0

2075185.0

9 14.62 14.59 2318339.0

2319561.0 2319561.0

2321203.0

Tabela 3 - Resultados da linearidade

20

Gráfico 1 – Curva da linearidade

Coeficiente angular: 158129

Coeficiente linear: 18305

R²: 0.9998

Demonstra-se de acordo com o valor de correlação de 0,9998 que o método

desenvolvido produz uma resposta linear para o analito, na faixa de trabalho

desejado.

4.3.3. Recuperação

A recuperação do analito pode ser estimada pela análise de amostras

fortificadas com quantidades conhecidas do mesmo. As amostras devem ser

fortificadas com o analito em pelo menos três diferentes concentrações: baixa,

média e alta, da faixa de uso do método.

A recuperação é calculada da seguinte forma:

Sendo:

M1 = Massa do analito encontrada pelo equipamento

M2 = Massa nominal

y = 158129x + 18305 R 2 = 0.9998

800000.0

1000000.0

1200000.0

1400000.0

1600000.0

1800000.0

2000000.0

2200000.0

2400000.0

2600000.0

5.00 7.00 9.00 11.00 13.00 15.00 17.00 Massa [mg]

Área [mAu*s]

21

A porcentagem de recuperação para o ativo deve ser entre 97,0% – 103,0 %,

de acordo com sua concentração.

A curva de calibração foi montada com os padrões 1,5 e 9 da linearidade. Na

validação foi realizada uma recuperação utilizando-se o placebo (matriz de

composição) do Opera®, e tendo os analitos nas seguintes concentrações:

Componente Placebo Ativo

Massa teorica 173,99 7,11

%(m/m) 3,55


%(m/m) 4,74


%(m/m) 5,92

Tabela 4 - Valores Teóricos para Recuperação com Placebo

Para a realização do teste de recuperação, foi preparada outra curva de calibração.

Os resultados da calibração encontram-se na tabela 5 e no gráfico 2. Os resultados

da recuperação encontram-se na tabela 6.

Linearidade Recuperação

Padrão Massa Nominal

[mg]

Massa Corrigida

[mg]

Area

[mAu*s]

Area média

[mAu*s]

Padrão 1 6.09 6.08 977151.0

977474.3 977505.0

977767.0

Padrão 5 9.58 9.56 1537055.0

1537901.3 1538031.0

1538618.0

Padrão 9 14.62 14.59 2316134.0

2316298.7 2316903.0

2315859.0

Tabela 5 - Calibração - Recuperação

22

Gráfico 2 – Curva de calibração

Coeficiente angular: 157091.2055

Coeficiente linear: 27632.7675

R2: 0.9999

Recuperação - Opera® com placebo

Amostra Massa

Nominal [mg]

Massa

Corrigida [mg]

Área

[mAu*s]

Área Média

[mAu*s]

Massa

encontrada [mg]

Recuperação

[%]

Amostra 75

% 7.01 7.00

1126247.0 1126178.0 6.99 99.96%

1126178.0

1126132.0

Amostra

100 % 9.36 9.34

1501135.0 1500925.0 9.38 100.40%

1500714.0

1500925.0

Amostra

125 % 14.14 14.11

2256440.0 2256440.0 14.19 100.54%

2257143.0

2256146.0

Tabela 6 - Resultados da recuperação do produto

Como descrito na norma utilizada para o estudo da validação de metodologia

analítica, os limites de ensaio são de 97 – 103% de recuperação para o ativo

analisado e os resultados variaram de 99,96% – 100,54%, portanto foi verificada a

capacidade do método de recuperar a massa adicionada de padrão e verificou-se a

exatidão do método utilizado.

Linearidade - Padrão

y = 157091.2055x + 27632.7675 R 2 = 0.9999

700000.0

900000.0

1100000.0

1300000.0

1500000.0

1700000.0

1900000.0

2100000.0

2300000.0

2500000.0

5.00 7.00 9.00 11.00 13.00 15.00 17.00 Massa [mg]

Área [mAu*s]

23

4.3.4. Repetitividade

As condições de repetitividade podem ser caracterizadas utilizando-se:

- Mesmo procedimento de medição;

- Mesmo analista;

- Mesmo instrumento usado sob mesmas condições;

- Repetição no menor espaço de tempo possível.

Calculou-se a média, desvio-padrão, teste de Grubbs para verificar valores

dispersos e o coeficiente de variação, verificando os cálculos em Anexo.

Para o teste de Grubbs com 12 amostras, o valor critico (Gc) tabelado é de 2,412,

com nível de significância de 5%.

Os valores limites para os coeficientes de variação que a norma da ABNT

14029 estabelece devem ser menor que 2,0%.

Na validação foram realizadas 12 pesagens de amostra Opera® e cada

amostra foi analisada em triplicata. Pesou-se para cada amostra 200mg de Produto

Final e o preparo foi realizado de acordo com o desenvolvimento do método.

Para a realização do teste de repetitividade, foi preparada outra curva de

calibração. Os resultados da calibração encontram-se na tabela 7 e no gráfico 3. Os

resultados da repetitividade encontram-se na tabela 8.

Calibração

Padrão Massa

Corrigida (mg) Área [mAu*S]

Área Média

[mAu*S]

3 7.86 1264780.0

1266101.0 1264819.0 1268379.0 1266426.0

5 9.56 1530573.0

1532226.5 1532221.0 1533570.0 1532542.0

7 11.71 1872580.0

1875164.0 1875730.0 1876477.0 1875869.0

Tabela 7 - Calibração do Padrão – Repetitividade

24

Gráfico 3 – Curva de calibração da Repetitividade


Coeficiente linear: 18011,0490

R2: 1.0000

y = 158571.9693x + 18011.0490 R 2 = 1.0000

1100000.0

1200000.0

1300000.0

1400000.0

1500000.0

1600000.0

1700000.0

1800000.0

1900000.0

2000000.0

7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00

Massa [mg]

Área [mAu*s]

25

Repetividade Opera®

Solução Massa Nominal

(mg)

Área

[mAu*S]

Área Média

[mAu*S]

Concentração

[%mm]

Concentração

média [%mm]

AMOSTRA 1 204.59 1544337.0

1543220.7 4.70

4.71

1543300.0

1542025.0

AMOSTRA 2 193.24 1460686.0

1460199.3 4.71 1460225.0

1459687.0

AMOSTRA 3 203.28 1533405.0

1532125.7 4.70 1531909.0

1531063.0

AMOSTRA 4 197.33 1488998.0

1488828.7 4.70 1488895.0

1488593.0

AMOSTRA 5 196.62 1485696.0

1486223.0 4.71 1487031.0

1485942.0

AMOSTRA 6 207.56 1562183.0

1561366.3 4.69 1560312.0

1561604.0

AMOSTRA 7 188.22 1420313.0

1420400.3 4.70 1420188.0

1420700.0

AMOSTRA 8 189.08 1431246.0

1431709.7 4.72 1431889.0

1431994.0

AMOSTRA 9 193.19 1463518.0

1463349.7 4.72 1463190.0

1463341.0

AMOSTRA10 185.28 1405195.0

1404455.3 4.72 1403408.0

1404763.0

AMOSTRA11 192.64 1454828.0

1454911.3 4.70 1454760.0

1455146.0

AMOSTRA12 186.41 1410067.0

1409784.0 4.71 1409709.0

1409576.0

Tabela 8 - Resultados Repetitividade

Média (%m/m): 4.71

Desvio Padrão: 0.0089

Valor Máximo: 4.7190

Valor Mínimo: 4.6892

Grubbs - maior valor: 1.5013

Grubbs – menor valor: 1.8328

Grubbs – valor crítico: 2.4120

CV (%): 0.1900

26

Com os resultados apresentados verificou-se que o grau de concordância

entre as medições da amostra está de acordo com o esperado utilizado para o

estudo de validação da metologia analítica.

4.3.5. Precisão Intermediária

A precisão Intermediária refere-se à avaliação sobre a mesma amostra,

utilizando o mesmo método, no mesmo laboratório, mas definindo exatamente quais

as condições a se variar tais como:

- Diferentes analistas;

- Diferentes equipamentos;

- Diferente tempo.

Os resultados obtidos no teste de precisão intermediária foram analisados em

conjunto com os resultados da repetitividade da mesma amostra. Para o teste de

Grubbs com 24 amostra, o valor critico (Gc) tabelado é de 2,802, com nível de

significância de 5%. O valor limite que os coeficientes de variação devem apresentar

para o analito deve ser menor que 0,2%.


amostra analisada em triplicata. Foi pesada para cada amostra 200mg de produto

final e preparado de acordo com o desenvolvimento do método.

Para a realização do teste de precisão intermediária, foi preparada outra curva de

calibração. Os resultados da calibração encontram-se na tabela 9 e no gráfico 4. Os

resultados da precisão intermediaria encontram-se na tabela 10.

Curva de Calibração

Padrão Massa Corrigida (mg) Área [mAu*S] Área Média [mAu*S]

3 7.86

1268695.0

1270773.0 1269591.0 1271416.0 1273390.0

5 9.56

1539779.0

1542443.0 1541418.0 1544001.0 1544574.0

7 11.71

1875645.0

1879674.5 1879622.0 1881412.0 1882019.0

Tabela 9 – Calibração da Precisão Intermediária

27

Gráfico 4 – Curva de Calibração



R²: 1.000

Linearidade – Precisão Intermediária

y = 158416.5645x + 25986.4472 R 2 = 1.0000

1100000.0

1200000.0

1300000.0

1400000.0

1500000.0

1600000.0

1700000.0

1800000.0

1900000.0

2000000.0

7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00

Massa [mg]

Área [mAu*s]

28

Precisão Intermediaria

Solução Massa

Nominal (mg) Área [mAu*S]

Área Média

[mAu*S]

Concentração

[%mm]

Concentração

média [%mm]

AMOSTRA 1 189.72 1460909.0

1460815.0 4.77*

4.70

1461072.0

1460464.0

AMOSTRA 2 194.87 1474685.0

1474048.7 4.69 1473747.0

1473714.0

AMOSTRA 3 189.68 1436543.0

1435394.0 4.69 1434796.0

1434843.0

AMOSTRA 4 184.94 1396907.0

1395982.0 4.68 1396270.0

1394769.0

AMOSTRA 5 181.81 1372694.0

1372863.0 4.68 1373421.0

1372474.0

AMOSTRA 6 189.84 1436286.0

1436891.7 4.69 1437462.0

1436927.0

AMOSTRA 7 194.69 1472891.0

1473325.0 4.69 1473581.0

1473503.0

AMOSTRA 8 183.13 1386301.0

1385352.3 4.69 1384920.0

1384836.0

AMOSTRA 9 187.30 1420029.0

1419069.3 4.70 1418949.0

1418230.0

AMOSTRA 10 194.75 1474897.0

1475266.0 4.70 1475337.0

1475564.0

AMOSTRA 11 185.05 1404185.0

1403507.7 4.70 1403210.0

1403128.0

AMOSTRA 12 188.52 1428496.0

1428676.7 4.70 1428553.0

1428981.0

Tabela 10 – Resultados da Precisão Intermediaria

* Resultado descartado pelo teste de Grubbs.

Média (%m/m): 4.68







CV (%): 0.2423

29

Com os resultados apresentados verificou-se que em todos os testes de

precisão intermediaria, o grau de concordância entre as medições da amostra está

de acordo com o esperado utilizado para o estudo de validação de metologia

analítica.

4.3.6. Robustez

O objetivo deste teste é identificar variáveis no processo analítico que

possam ter efeito significativo no desempenho do método. Executar um novo teste

de precisão modificando-se um parâmetro significativo no método de analise, como

por exemplo: lote da coluna cromatográfica, temperatura do forno de coluna, pH da

fase móvel. Para o teste de Grubbs com 24 amostra, o valor critico (Gc) tabelado é

de 2,802, com nível de significância de 5%.

O valore limite que os coeficientes de variação devem apresentar para o

analito deve ser menor que 2,0%.

Robustez – Troca do Lote da Coluna

Trocou-se o lote da coluna cromatográfica e executou-se um teste de

precisão para a amostra testada na validação.


amostra foi analisada em triplicata. Pesou-se 200 mg de produto final e o preparo foi

realizado de acordo com o desenvolvimento do método.

Para a realização do teste de robustez, foi preparada outra curva de

calibração. Os resultados da calibração encontram-se na tabela 11 e no gráfico 5.

Os resultados da robustez encontram-se na tabela 12.

30

Resultados - Calibração

Padrão Massa

Corrigida (mg) Área [mAu*S]

Área Média

[mAu*S]

3 7.86

1286564.0

1283546.3 1280451.0

1283525.0

1283645.0

5 9.56

1558727.0

1558456.0 1559736.0

1557173.0

1558188.0

7 11.71

1897664.0

1898766.0 1900927.0

1897819.0

1898654.0

Tabela 11 – Calibração – Robustez

Gráfico 5 – Curva de Calibração da Robustez



R²: 1.000

Linearidade - Robustez

y = 160051.8751x + 26065.9484 R 2 = 1.0000

1100000.0

1200000.0

1300000.0

1400000.0

1500000.0

1600000.0

1700000.0

1800000.0

1900000.0

2000000.0

7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00

Massa [mg]

Área [mAu*s]

31

Teste de Robustez

Solução Massa

Nominal (mg)

Área

[mAu*S]

Área Média

[mAu*S]

Concentração

[%mm]

Concentração

média [%mm]

AMOSTRA 1 196.04 1485073.0 1484497.7 4.65

4.69

1484772.0 1483648.0

AMOSTRA 2 210.02 1590110.0 1590551.7 4.65 1591145.0 1590400.0

AMOSTRA 3 182.71 1388641.0 1388801.0 4.66 1389107.0 1388655.0

AMOSTRA 4 213.71 1624227.0 1624430.3 4.67 1624210.0 1624854.0

AMOSTRA 5 212.46 1596171.0 1595510.3 4.62* 1595514.0 1594846.0

AMOSTRA 6 189.22 1444054.0 1444768.3 4.68 1445362.0 1444889.0

AMOSTRA 7 190.03 1449020.0 1448207.3 4.68 1447498.0 1448104.0

AMOSTRA 8 186.86 1421408.0 1421343.7 4.67 1421808.0 1420815.0

AMOSTRA 9 195.06 1483399.0 1484732.3 4.67 1486283.0 1484515.0

AMOSTRA

10 184.56 1403421.0 1403225.7 4.66

1404176.0 1402080.0

AMOSTRA

11 187.59 1430331.0 1430918.3 4.68

1430647.0 1431777.0

AMOSTRA

12 192.47 1468800.0 1468840.0 4.68

1468768.0 1468952.0

Tabela 12 – Resultados da Robustez

* Resultado descartado pelo teste de Grubbs.

Média (%m/m): 4.69







CV (%): 0.4548

32

No teste de robustez os dados foram tratados estatisticamente com os

respectivos testes de repetitividade previamente apresentados e o C.V. está abaixo

do limite previsto pela norma, portanto o método se mostra robusto para a variação

do equipamento.

4.4. Cálculos do projeto

Como proposto na apresentação do trabalho, foram feitos cálculos sobre a

vantagem do desenvolvimento e utilização de uma nova metodologia para a análise

do produto Opera®, da empresa BASF S.A.

Valores dos solventes utilizados:

Acetonitrila = R$125,00/4L

Metanol = R$60,00/4L

- Preparo da amostra

Como no laboratório em que o projeto foi desenvolvido havia o equipamento

para deionizar a água, e levando em conta o baixo custo do uso e preparação da

água deionizada pH 2.5, esta não será levada em consideração em todos os

cálculos de economia.

Comparação entre o método antigo, e o método desenvolvido durante o projeto:

Tabela 13 – valores e quantidades pelo método anterior

Quantidade Utilizada (L)

Valor Unitário (R$/L)

Valor Gasto (R$)

Acetonitrila 0,055 31,25 1,72

Água Deionizada pH 2.5 0,045 - -

Tabela 14 – valores e quantidades pelo método desenvolvido

Quantidade Utilizada (L)

Valor Unitário (R$/L)

Valor Gasto (R$)

Acetonitrila 0,0525 31,25 1,64

Água Deionizada pH 2.5 0,0475 - -

33

Para a análise de uma amostra, eram pesadas três concentrações de padrão,

mais a amostra em triplicata. Portanto, eram preparados seis balões de vidro de

100mL cada.

Assim: Gasto Total antigo = 1,72 x 6 = R$10,32

Gasto Total novo = 1,64 x 6 = R$9,84

Redução = 4,65%

Tendo em vista que o preparo da amostra teve uma mudança pequena na

quantidade de solventes utilizados, e também porque os solventes eram os mesmo,

não houve uma redução significativa de custos em pequena escala.

- Gastos com solventes no equipamento

Tabela 15 - Configuração do gradiente de solventes pelo método anterior

Tempo Frasco A (%) Frasco B (%) Frasco C (%) Fluxo

(mL/min)

0.0 41.0 22.0 37.0 1.400

11.0 41.0 22.0 37.0 1.400

14.5 53.0 22.0 25.0 1.400

17.0 53.0 22.0 25.0 1.400

18.0 41.0 22.0 37.0 1.400

18.5 100 0.00 0.00 2.000

19.0 100 0.00 0.00 2.000

20.0 100 0.00 0.00 2.000

30.0 41.0 22.0 37.0 1.400

Onde: A = 1000mL de Acetonitrila grau HPLC

B = 1000mL de Metanol grau HPLC

C= 1000mL de Água deionizada + 25mL de Ácido Sulfúrico 0,5M.

Calculando o gasto anterior com solventes para a análise de uma amostra:

Quantidade = % x tempo x fluxo

A = (0,41 x 11 x 1,4) + (0,53 x 6 x 1,4) + (0,41 x 1 x 1,4) + (1 x 2 x 2) + (0,41 x 10 x

1,4) = 21,08mL

B = (0,22 x 11 x 1,4) + (0,22 x 6 x 1,4) + (0,22 x 1 x 1,4) + (0 x 2 x 2) + (0,22 x 10 x

1,4) = 8,62mL

34

C = (0,37 x 11 x 1,4) + (0,25 x 6 x 1,4) + (0,37 x 1 x 1,4) + (0 x 2 x 2) + (0,37 x 10 x

1,4) = 13,50mL

Portanto:

Gasto anterior =(21,08mL x 0,03125R$/mL) + (8,62mL x 0,015R$/mL) =

R$0,79/análise

Como por produto são analisados três padrões (duas injeções) e uma amostra em

triplicata (três injeções cada):

Gasto Total anterior = 0,79R$/injeção x 15injeções = R$11,85

Tabela 16 - Configuração do gradiente de solventes pelo método desenvolvido

Tempo Frasco A (%) Frasco B (%) Frasco C (%) Fluxo (mL/min)

0.0 25.0 67.0 8.0 2,50

3.3 25.0 67.0 8.0 2,50

4.0 10.0 90.0 0.0 3,50

5.5 10.0 90.0 0.0 3,50

6.0 25.0 67.0 8.0 2,50

7.0 25.0 67.0 8.0 2,50

Onde: A = 1000mL de Água deionizada + 25mL de Ácido Sulfúrico 0,5M.

B = 1000mL de Acetonitrila grau HPLC

C= 1000mL de Metanol grau HPLC

Calculando o gasto anterior com solventes para a análise de uma amostra:

Quantidade = % x tempo x fluxo

A = (0,25 x 3,3 x 2,5) + (0,10 x 2,7 x 3,5) + (0,25 x 1 x 2,5) = 3,63mL

B = (0,67 x 3,3 x 2,5) + (0,90 x 2,7 x 3,5) + (0,67 x 1 x 2,5) = 15,71mL

C = (0,08 x 3,3 x 2,5) + (0,0 x 2,7 x 3,5) + (0,08 x 1 x 2,5) = 0,86mL

Portanto:

Gasto atual =(15,71mL x 0,03125R$/mL) + (0,86mL x 0,015R$/mL) = R$0,50/análise

35

Como por produto são analisados três padrões (duas injeções) e uma amostra em

triplicata (três injeções):

Gasto Total anterior = 0,50R$/injeção x 15injeções = R$7,5

REDUÇÃO TOTAL = R$4,35/análise = 36.71%

Gráfico 6: Redução de custo de solvente

- Tempo de análise

Fator importante em qualquer laboratório analítico, e na maioria dos setores

da economia, o tempo foi considerado como fator de alta importância nos objetivos

do projeto, junto com o custo.

Como visto, o método desenvolvido apresenta um tempo total muito inferior

ao gasto anteriormente na análise de uma amostra.

Tempo de análise anterior:

30 minutos/injeção x 15 injeções = 450 minutos

Pelo método novo:

7 minutos/injeção x 15 injeções = 105 minutos

REDUÇÃO = 76,67%

36

Total de tempo de análise (min)

Gráfico 7: Total de tempo por análise

Verificou-se que a redução de tempo foi bastante significativa, devido

principalmente à constante evolução de equipamentos, colunas cromatográficas

(apesar de se ter utilizado a mesma para ambos os métodos), consumíveis, entre

outros.

Redução de tempo

76,67%

37

5. Conclusão

O projeto apresentado consistia em reduzir custos de análise, propondo e

desenvolvendo uma nova metodologia, do produto Opera®, da empresa BASF

S.A., em equipamento de cromatografia líquida de alta eficiência.

O desenvolvimento do método foi feito através de experimentação e, após

definidas as melhores condições do processo, a metodologia foi validada

seguindo normas da Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT).

Durante o desenvolvimento do método, vários testes foram feitos, e vários

resultados foram descartados, buscando a excelência, necessitando assim de

muito tempo e com certo investimento por parte do Laboratório Analítico.

Com os resultados obtidos, a metodologia foi validada, realizando testes de

seletividade, linearidade, repetitividade, recuperação, precisão intermediária, e

robustez, com resultados dentro dos definidos pela ABNT. Após validação, foram

realizados os cálculos para estimar o real benefício do projeto, quantificando as

melhorias do processo.

Através dos cálculos, verificou-se que o projeto atingiu seu objetivo principal,

que era a redução de custos, e também de tempo, na análise do Opera®. A

redução de custos, mas também a economia de tempo é de alta importância

para um Laboratório de Análises, visto que qualquer laboratório necessita de

maior lucro (menos gasto), e maior rapidez na entrega de resultados, com

análises mais rápidas. As reduções do processo estão relacionadas ao consumo

de solventes utilizados no preparo da amostra, no equipamento, e também

grande redução de tempo de análise.

Como sugestão para projetos futuros, deve-se procurar o desenvolvimento de

novos métodos, aplicados a outros produtos da empresa, visto que se trata de

uma das maiores indústria do ramo de Agrotóxico, com muitos produtos, e os

métodos utilizados encontram-se em contínua desatualização, devido à melhoria

contínua de equipamentos, solventes, e produtos formulados. Proponho também

o uso de colunas cromatográficas de tamanhos menores, mais avançadas, que

permitem a análise de produtos em tempo reduzido.

38

6. Referências Bibliográficas

[1] VALENTE, A.L.P.; COLLINS, C.H.; MANFREDI, J.E. Conceitos básicos de cromatografia líquida de alta eficiência. Química Nova, São Paulo, 1983.

[2] SKOOG, K.A.; HOLER, F.J.; NIEMAN, T.A. Cromatografia líquida de alta eficiência. Princípios de análise instrumental. 5.ed. Porto Alegre: Bookman, 2002, p. 641-677.

[3] MALDANER, L.; JARDIM, I.C.S.F. O estado da arte da cromatografia líquida de

ultra eficiência. Química Nova, São Paulo, 2009, v.32, n.1, p.214-222.

[4] CIOLA, R. Fundamentos da Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho. 1.ed. São Paulo:Editora Edgard Blucher Ltda. 2000. 179p.

[5] AQUINO-NETO, F.R; NUNES, D.S.S. Cromatografia: princípios básicos e técnicas afins. Rio de Janeiro: Interciência, 2003, 187p.

[6] COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BONATO, P.S. Introdução a métodos

cromatográficos. 5ªed. Campinas: Editora da Unicamp, 1993.

ABNT NBR 14029:2005 – Agrotóxicos e afins – Validação de métodos analíticos Ed.

02

39

7. Anexos

7.1. Média aritmética ( x )

A média aritmética ( x ) é determinada pela seguinte equação:

n

xnxxx

...21=

n

xin

i

1

onde:

x é a média aritmética dos valores;

x é o valor obtido;

n é o número de resultados obtidos;

xi é o índice de valor de x

7.2. Estimativa do desvio padrão ( s )

A estimativa do desvio-padrão é determinada pela seguinte equação:

onde:

s é a estimativa do desvio padrão.

x é a média aritmética dos valores;

xi é o valor obtido;

n é o número de resultados obtidos;

7.3. Teste de GRUBBS

O teste de Grubbs é determinado pelas equações a seguir.

Teste para o maior valor:

40

Teste para o menor valor:

s

xxmG

)(

s

xxG

)1(

onde:

xm é o maior valor de resultado obtido

1x é o menor valor de resultado obtido

x é o valor médio do resultado obtido

Um valor observado será considerado disperso quando o valor de G calculado for

maior que o valor crítico Gc (tabelado).

7.4. Cálculo do coeficiente de correlação (r)

onde e são os valores medidos de ambas as

variáveis. Além disso:

e são as médias aritméticas de ambas as

variáveis.

7.5. Cálculo do coeficiente de variação (CV)

O coeficiente de variação é determinado pela seguinte equação:

CV = Coeficiente de Variação (%);

DP = é o desvio padrão absoluto entre os resultados;

med = é a média aritmética dos resultados.

trabalho de conclusÃo de curso ii -...

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