toxicidade aguda do sulfato de cobre e do triclorfon para três spp de daphnias em presença e...

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

CENTRO DE AQUICULTURA

CAMPUS DE JABOTICABAL

TOXICIDADE AGUDA DO SULFATO DE COBRE E DO TRICLORFON PARA TRÊS ESPÉCIES DE DAPHNIAS EM PRESENÇA E AUSÊNCIA DE

SEDIMENTO

LUIS RICARDO ROMERO A RAUCO

Dissertação apresentada ao Centro de Aquicultura da Universidade Estadual Paulista Câmpus de laboticabal, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Aquicultura de Águas Continentais.

Jaboticabal – SP Outubro de 2002

A Deus,

A meus irmãos, Miriam, Waldo, Ivan e primos Rugo e Miguel

Obrigado pelo grande apoio

Dedico este trabalho

Agradecimento

Ao Centro de Aquicultura da UNESP de Jaboticabal pela estrutura

oferecida;

Ao Prof Dr. Joaquim Gonçãlves Machado Neto por aceitar minha

orientação;

Aos membros da banca examinadora Prof Dr. Flábio Ruas de Moraes

e Dr. Julio Lombardi pelas sugestões e correção deste trabalho;

A todos os professores do Caunesp que amim trasmiteram

seusconhecimentos, em especial ao Prof Edivaldo Pezzato, Elisabeth Criscuolo

Urbinati, Elisabete Maria Macedo Viegas, Marta Vemardino De Stéfani, Lúcia Reina

Sipaúba Tabares, Francisco Manuel de Souza Braga, Roberto Goitein, Newton

Castagnolli, Wagner Cotroni Valenti, Gilson Luiz Valpato, Antônio de Pádua Sousa,

Mauiricio LaterçaMartins;

Agradeço especialmente as amigas colegas do Caunesp. Rachei e

Carla, pela ajuda na correção da aula de qualificação e dissertação;

Aos amigos colegas do Caunesp Adriana Sacioto, Adriana Mufioz,

Denise, Rosangela, Sonia, Virginia, Claudia Franco, Daniaela, Fabiana, Janessa,

Karina, Lusiene, Leda, Maria Isabel, Ana Isabel, Ana Paula, Ana Eliza, Antonio,

Claudinei, Eduardo, Flávio, GilbertoMarcel, Marcelo, Marcos, Rodrigo, Ronald,

Adriano, Antonio Femando, Atomu, Camilo Ernesto, Érico, Faviano, Jaime,

Leonardo, Lot, Marcelo Assano, Newton e Nilton por terem compartilhado bons

momentos e amizade;

Aos amigos e colegas do Departamento de Fitosanidade da FCA V:

Glaucia,

Marcelo, Adriano, Maurício e Daniele pela amizade e convivência;

Aos amigos administrativos do Caunesp Veralice, Fatima, Juliana,

Ana, Simone, Mônica, Suerli, Alta, Valdecir, Marcio, Mauro, Silvinha, por tenn sido

tão prestativos.

Aos amigos administrativos do Departamento de Fitosanidade da

FCAV Unesp- Jaboticabal Gilson, Reinaldo, Dionisio, Luiz Carlos, José Valdeci,

Raquel, Maria Isabel, Natalina e Rosangela pela amizade e convivência;

Resumo O objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade aguda CE50-48 h do sulfato

de cobre e trichlorfon, comparar a sensibilidade e avaliar o risco de intoxicação ambiental

para três espécies de daphnias (D. similis, D. magna e D. laevis) na ausência e presença de

sedimento. Os testes de toxicidade aguda foram realizados em condições de laboratório, em

sala climatizada de acordo com metodologias normatizadas com algumas adaptações. Os

valores de CE50-48h calculados para D. magna foram de 0,345 mg de sulfato de cobre /L com

sedimento e 0,045 sem sedimento; para D. similis, 0,282 com sedimento e 0,042 sem

sedimento e para D. laevis, 0,140 com sedimento e 0,107 sem sedimento. Os valores de CE50-

48h calculados para D. magna foram de 299,70 ηg de trichlorfon /L com sedimento e 0,70

sem sedimento; para D. similis, 381,62 com sedimento e 0,52 sem sedimento e para D. laevis,

282,72 com sedimento e 0,92 sem sedimento. O trichlorfon foi mais tóxico que o sulfato de

cobre para as três espécies de daphnias. O sedimento reduziu significativamente a

biodisponibilidade do trichlorfon e do sulfato de cobre na água de cultivo para as três

espécies de daphnias. Em ausência de sedimento, a Daphnia magna e a Daphnia similis não

apresentam diferença de sensibilidade aos dois agrotóxicos, mas a Daphnia laevis foi

significativamente mais sensível que as outras duas espécies. Na presença do sedimento

houve diferença de sensibilidade entre as espécies de daphnia, sendo a Daphnia magna mais

sensível, seguida pela Daphnia similis e Daphnia laevis, que apresentou a menor

sensibilidade ao sulfato de cobre. Na ausência do sedimento, as três espécies de daphnia não

apresentam diferença de sensibilidade ao trichlorfon. Na presença do sedimento, a Daphnia

magna e a Daphnia laevis não apresentam diferença de sensibilidade ao trichlorfon. O uso do

sulfato de cobre e trichlorfon na piscicultura foi classificado como de alto risco de intoxicação

ambiental para as três espécies de daphnias.

1 INTRODUÇÃO

A utilização de agrotóxicos, indiscutivelmente, tem contribuído para o

aumento da produção agrícola e agropecuária mundial. Contudo, o uso indiscriminado destes

compostos tóxicos tem causado impactos negativos ao meio ambiente (RAND e

PETROCELLI, 1985).

Os lançamentos mais comuns de poluentes na rede hidrográfica envolvem a

entrada de determinados elemento tóxico em períodos de tempo de curta duração e em alta

concentração, o qual é transportado no meio aquático como um pulso, reduzindo a

concentração e aumentando a extensão da distribuição. Diante de toda esta problemática

surgiu, nos últimos anos, uma nova linha de pesquisa denominada de toxicologia aquática.

Segundo RAND e PETROCELLI (1985), a toxicidade aquática compreende o estudo

quantitativo e qualitativo do efeito tóxico de substâncias químicas e de outras substâncias

antropogênicas sobre os organismos aquáticos.

A contaminação do ambiente aquático por agrotóxicos pode ocorrer por

diversas vias, sendo as mais comuns a aplicação direta visando o controle de elementos

patogênicos e de doenças dos organismos e de plantas aquáticas, e indireta: como

conseqüência de pulverizações agrícolas, em que os contaminantes de são carregados com

partículas de solo, lixiviação com a água e por lavagem de equipamentos utilizados nas

aplicações (BAPTISTA, 1988).

O sulfato de cobre e o tricholorfon são agrotóxicos usados na aqüicultura

para o controle de agentes com potencial patogênicO e doenças de peixes. Entretanto, esses

usos podeM alterar a composição natural da flora e fauna aquática. Além disso, a

deterioração e a poluição dos recursos hídricos naturais têm como conseqüência importante a

impossibilidade de aproveitamento das águas para uso humano (FONSECA, 1991), ou de

animal.

Além da intoxicação aguda, resultante da exposição a substâncias tóxicas,

os organismos aquáticos podem sofrer intoxicação crônica quando expostos por prolongados

períodos de tempo a concentrações subletais. Este problema é agravado devido à tendência de

metais pesados, como o cobre, se acumularem no sedimento, onde poderão ser translocados

através dos diversos componentes da cadeia biológica, ocasionando sua bioconcentração

(RAND e PETROCELLI, 1985) e biomagnificação.

O estudo da biota é uma das maneiras de se avaliar e detectar possíveis

mudanças no corpo de água como conseqüência do lançamento de substâncias poluidoras. Os

bioensaios aquáticos fornecem dados de toxicidade que podem ser utilizados na formulação

de padrões de qualidade de água para compostos cujos contaminação ambiental que

representam riscos de intoxicação potencial risco. Os bioensaios de avaliação de toxicidade

dos compostos tóxicos realizados em diferentes laboratórios podem fornecer resultados que

poderão ser comparativos. Esforços têm sido realizados para padronização de procedimentos

de tais testes, determinar boas espécies de indicadoras e boa reprodutibilidade em laboratório,

além dos envidados para estabelecer padrões de qualidade de água, temperatura e de todos os

parâmetros conhecidos como modificadores da toxicidade (PASCOE, 1977).

Os objetivos do presente trabalho foram:

1) avaliar a toxicidade aguda (CE50-48h) do sulfato de cobre e do inseticida trichlorfon

para três espécies de daphnias (Daphnia similis, Daphnia magna e Daphnia laevis) na

ausência e presença de sedimento;

2) comparar a sensibilidade destas três espécies de microcrustáceos ao sulfato de cobre,

ao trichlorfon e dicromato de potássio (substância de referência);

3) estimar o risco de intoxicação ambiental devido à contaminação resultante do uso

desses dois agrotóxicos em piscicultura, na ausência e presença do sedimento em

condições de laboratório.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Teste de avaliação da toxicidade aguda de substâncias tóxicas

2.1.1. Histórico

O primeiro trabalho no país sobre avaliação de toxicidade de agrotóxicos

para organismos aquáticos foi realizado por ALMEIDA (1987), na tentativa de determinar a

toxicidade do DDT para fêmeas de Phallocero caudimaculatus. Nesta época não existia

qualquer padronização quanto aos procedimentos laboratoriais e ao estabelecimento de

parâmetros biológicos e físico-químicos para a realização dos testes.

BRANCO (1960) estudou a ação de sulfato de zinco, cloreto de zinco,

sulfato de cobre e dimetiltiocarbato de zinco sobre “guarú-guarú”. Verificou que os efeitos da

exposição deste peixe à solução de cloreto de zinco poderiam ser alterados pela utilização de

aeradores na solução. De fato, a solução arejada foi mais tóxica para os organismos, embora

as concentrações fossem as mesmas.

No final da década de 70 foi constituído um grupo de pesquisadores com o

objetivo de padronizar metodologias e editar normas nacionais sobre testes de avaliação de

toxicidade aguda e crônica utilizando-se organismos-testes já eleitos nas normas

internacionais e nativos. Foram realizados testes de toxicidade com os peixes das seguintes

espécies: Hemigramus marginaltus (nativo), Tilapia melanopleura e Cyprinus carpio, Salmo

gairdneri, Poecilia reticulata e Brachyodaphnia dubia (exótico). Também foram realizados

testes de toxicidade com cladóceros das espécies: Daphnia similis, Ceriodaphnia dubia

(exóticas). Estes organismos foram expostos a efluentes industriais, soluções de compostos

metálicos e detergentes com a finalidade de se avaliar a concentração letal 50 % (PEREIRA et

al., 1987). Testes de toxicidade crônica foram realizados com o Geophagus brasiliensis

(espécie nativa), exposto a íons cúpricos. PEREIRA et al. (1987) verificaram que exposição

crônica a ions cúpricos pode provocar degeneração nas células do baço, fígado e intestinos,

enquanto que nas brânquias ocorreu apenas o acúmulo de sais de cobre.

Poucas espécies de organismos nativos utilizadas em testes de toxicidade no

Brasil, sejam agudos ou crônicos. Este fato deve-se à maior facilidade na interpretação dos

resultados quando se utilizam espécies já padronizadas, à possibilidade de estabelecer

comparações com estudos já feitos em diferentes países, às dificuldades decorrentes da

ausência de estudos minuciosos sobre a biologia e ecologia de espécies nativas que possam

ser utilizadas (FONSECA, 1991).

No Brasil, os órgãos governamentais responsáveis pela regulamentação e

edição de diretrizes e normas são os Ministérios da Saúde e do Meio Ambiente, e a CETESB,

no Estado de São Paulo, entre outras, essas instituções têm demostrado a necessidade da

avaliação de riscos de intoxicação ambiental decorrentes do uso dos agrotóxicos

(GUIMARÃES, 1996).

2.1.2. Conceituação e metodologias dos testes de avaliação de toxicidade de substâncias

tóxicas.

Os bioensaios com organismos aquáticos em condições de laboratório

possibilitam a qualificação e a mensuração dos efeitos dos compostos orgânicos tóxicos sobre

a biota e a estimativa dos riscos de intoxicação ambiental. Os bioensaios, aplicados ao

controle da poluição da água, permitem estimar os efeitos dos principais poluentes do meio

ambiente, frente a organismos aquáticos (marinhos ou dulcícolas), pertencentes a diferentes

níveis tróficos destes ecossistemas (Soares, 1985, apud. ALMEIDA, 1987).

A toxicologia clássica estuda, em condições de laboratório, os efeitos de

tóxicos sobre organismos individuais, sistemas, órgãos, tecidos e células, objetivando

extrapolar os resultados obtidos para a população humana. A toxicologia do ecossistema é

limitada a dados disponíveis sobre espécies de interesse. A ecotoxicologia é uma ciência

complexa e multidisciplinar, que se preocupa com a avaliação do risco que determinada

perturbação pode trazer a determinado ecossistema, bem como o desenvolvimento de método

que contribua para a determinação desse risco. Assim, a ecotoxicologia estuda os efeitos dos

agentes tóxicos sobre a estrutura e a função de comunidades bióticas e sobre sua integração

com os componentes abióticos (GUIMARÃES, 1996).

O universo de testes de toxicidade é grande e, por razões práticas e

econômicas, a escolha deve atender as exigências científicas, de modo que as técnicas sejam

reconhecidas ou padronizadas nacional ou internacionalmente (Cabidenc, 1980 apund

ZAGATTO e GOLDTEIN, 1991). Com esta finalidade, para o ambiente aquático, foram

desenvolvidos e utilizados principalmente testes com peixes, microcrustáceos, algas e

bactérias, sendo que alguns métodos já foram padronizados e outros estão em vias de

padronização.

O termo teste de toxicidade aquática foi proposto por RAND e

PETROCELLI (1985), por acharem que o termo bioensaio seria aplicado apenas às indústrias

farmacêuticas, que deles se utilizam para avaliar a potência de vitaminas e outros compostos

farmacologicamente ativos.

O teste de toxicidade aquática é um procedimento no qual as respostas de

organismos aquáticos são usadas para detectar ou medir a presença ou efeito de uma ou mais

substâncias, resíduos ou fatores ambientais, sozinhos ou em combinação. Estes testes são

utilizados para avaliar a poluição do corpo de água quando os testes químicos e físicos não

são suficientes para avaliar os efeitos potenciais sobre a biota aquática e, conseqüentemente,

estabelecer procedimentos para protegê-la (GOLTEIN et al, 1983).

Por meio dos testes de avaliação da toxicidade determina-se o tempo e as

concentrações em que o agente químico é potencialmente prejudicial para determinado

organismo. Para qualquer produto, o contato com a membrana celular ou sistema biológico

pode não produzir efeito adverso se a concentração do produto for baixa ou o tempo de

contato for insuficiente. Por outro lado, concentrações e tempo de exposição poderão não ter

efeitos prejudiciais em tempo de exposição extremamente curtos (RAND e PETROCELLI,

1985).

Os testes de toxicidade são realizados para estudar a toxicidade aguda,

crônica, a bioacumulação e a biodegradação das substâncias tóxicas, além dos testes subletais,

que podem ser reunidos em três grupos básicos: bioquímicos e fisiológicos, comportamentais

e histológicos. Existem ainda os testes realizados em condições onde os organismos são

expostos dentro de gaiolas nas águas dos rios ou lagos, que eventualmente estejam

contaminadas (RAND e PETROCELLI, 1985).

Os testes de avaliação da toxicidade das substâncias tóxicas obedecem a um

modelo geral de procedimento, que consiste na exposição de organismos-teste a diferentes

concentrações do agente tóxico em recipientes sob rigoroso controle das condições ambientais

como temperatura, pH e alcalinidade (RAND e PETROCELLI, 1985).

Para efeito de monitoramento de um corpo da água receptor de efluentes

contaminados contendo substâncias tóxicas, os testes de toxicidade mais utilizados em

laboratório são os de avaliação da toxicidade aguda e crônica. Nos testes agudos, os

organismos são expostos aos agentes tóxicos em curto período de tempo, e nos testes crônicos

o tempo de exposição envolve períodos bem mais longos, podendo incluir todo o ciclo de vida

do organismo. Assim, o impacto dos agrotóxicos sobre os organismos do ambiente aquático

pode ser estimado e monitorado por testes de toxicidade conduzidos em condições de

laboratório (RAND e PETROCELLI, 1985).

Nos testes de avaliação da toxicidade aguda das substâncias tóxicas estima-

se, por meios de modelos matemáticos e/ou estatísticos, a CL50 concentração letal 50%

(CE50), definida como a concentração estimada que produz mortalidade em 50% da

população exposta ao agente tóxico por determinado período de tempo. Este período é

variável com a espécie teste utilizada, mas geralmente situa-se entre 24 e 96 horas (RAND e

PETROCELLI, 1985).

Os testes de avaliação da toxicidade aguda são freqüentemente conduzidos

em o sistema estático, ou seja, sem renovação de água no decorrer do experimento. Este

sistema é muito utilizado por ser mais simples e menos dispendioso quanto comparado ao

sistema semi-estático (renovação parcial) ou ao sistema de fluxo contínuo (renovação

contínua) (RAND e PETROCELLI, 1985).

O valor CE50 ou CL50 pode ser calculado por diferentes métodos estatísticos,

entre os quais o da interpolação “Moving Average” (BENNET, 1952), o “Probit” (FINNEY,

1971), o método Binomial (STEPHAN, 1977) e o método “Treimed Sperman Karber”

(HAMILTON et. al., 1977). LOMBARDI (1999), estudando a toxicidade aguda de diferentes

agrotóxicos para o camarão de água doce, verificou resultados estatisticamente semelhantes

com esses diferentes métodos de cálculo da CE50.

2.3. Seleção dos organismos – teste para avaliação de toxicidade aguda.

Os resíduos de compostos químicos introduzidos num ecossistema aquático

podem provocar efeitos tóxicos em várias espécies, principalmente quando a descarga é alta,

em termos de concentração, em área relativamente pequena (FONSECA, 1991).

Para a escolha de organismos-teste visando ensaios de toxicidade aquática,

em condições de laboratório, vários critérios poderão ser utilizados. BAUDO (1987) cita que

para a United States Enviromental Protection Agency – USEPA são considerados os

seguintes aspectos:

- que o organismo seja representativo de um importante grupo ecológico, em termos de

taxonomia ou nível trófico, ocupando, portanto, uma importante posição na cadeia

alimentar;

- a disponibilidade para execução dos testes, implicando, em fácil cultivo e manutenção em

laboratório, além de estabilidade genética; e

- a existência de informações em relação à biologia e à ecologia da espécie.

RAND e PETROCELLI (1985) enumeram algumas características básicas

que devem ser observadas em relação aos organismos-teste, e são as seguintes:

- usar espécies representativas de várias sensibilidades à substância-teste;

- dar preferência a espécies abundantes e facilmente disponíveis;

- sempre que possível, estudar espécies nativas, ou representativas dos sistemas que irão

receber o impacto;

- dar preferência às espécies econômica e ecologicamente importantes;

- as espécies utilizadas devem ser facilmente adaptáveis às condições de laboratório; e

- preferencialmente utilizar espécies de comportamento fisiológico e genética conhecida.

Segundo TRARWEL e DOUDOROFF (1952) e SPRAGUE (1969), os

cientistas que trabalham com testes de toxicidade aquática seguem três diferentes tendências

para a seleção de espécies a serem testadas. Tais tendências são complementares, dependendo

principalmente do objetivo do trabalho. A primeira delas consiste em testar várias espécies.

Isto seria o desejável, mas normalmente não é feito devido à demanda de tempo e esforço.

Freqüentemente, as espécies mais sensíveis são testadas inicialmente e detalhadamente. A

segunda consiste na escolha da espécie local mais importante e a terceira é o uso de espécie

padrões. Entretanto, não existem espécies testes padrões que possam ser utilizadas como

representante de diferentes tipos de ecossistemas (BUIKEMA e CAIRS., 1980).

Certamente a detecção e reações tóxicas torna-se mais precisa com o

conhecimento detalhado da fisiologia, histologia e comportamento da espécie teste. Os

resultados obtidos com espécies padrões devem ser comparados com os de espécies locais,

visando contribuir para a identificação e a quantificação dos efeitos tóxicos (SPRAGUE,

1969).

2.4. Testes de avaliação da toxicidade aguda com daphnia

Os testes de avaliação da toxicidade, de compostos químicos

tradicionalmente têm sido realizados com ampla variedade de espécies aquáticas

representantes de diferentes níveis tróficos, como os mais diversos grupos de invertebrados e

peixes e, dentro de cada grupo taxonômico, são selecionados os organismos mais sensíveis

(FONSECA, 1991). As daphnias são abundantes no meio aquático, possuem papel importante

na cadeia alimentar (como presa e predador), ocupam diferentes níveis tróficos e, quando

cultivadas em laboratório, apresentam sensibilidade definida (Soares,1985 apud ALMEIDA.,

1987).

A Daphnia magna é um microcrustáceo comum no meio aquático usado

como alimento na criação de alevinos de peixes (PAUW et al., 1981). É a espécie-teste mais

usada no mundo em testes de toxicidade devido à sua sensibilidade e eficiência nos testes. Foi

selecionada e adaptada nas metodologias normatizadas por instituições internacionais (ISO,

USEPA, OECD, DIN, AFFNOR) e nacionais (CETESB, ABNT, IBAMA). Seu ciclo

biológico é curto, reproduz-se por partenogênese e é de fácil manejo no laboratório (IBAMA,

1987; ABNT, 1993; CETESB, 1991; KOVISTO, 1995; USEPA, 1985; BUIKEMA e CAIRS.,

1982), Prestando-se para a execução de testes de toxicidade crônica e aguda.

Daphnia magna e Daphnia similis ocorrem em diversos ecossistemas da

Europa e Estados Unidos (BROOKES, 1957; SCOURFIELD e HARDING, 1966; PENNAK,

1953). A Daphnia laevis é uma espécie nativa que ocorre em diversos ecossistemas aquáticos

nos Estados Unidos (BROOKES, 1957), Brasil (ELMOOR, 1997), Argentina (PAGGI, 1977),

Colômbia (SINGERLIN, 1914) e América Central (VANDE VELDE, et al., 1978).

Assim, verifica-se que as espécies Daphnia magna e Daphnia similis são

utilizadas em testes de toxicidade no Brasil, mesmo não sendo nativas do país. Por outro lado,

a Daphnia laevis ocorre naturalmente no país, mas não está incluída nas normas brasileiras de

testes de avaliação da toxicidade aguda e ainda não foi utilizada neste tipo de estudo.

Portanto, a avaliação da possibilidade de usar esta espécie como organismo-teste em ensaios

de toxicidade aguda de agrotóxicos atende às premissas básicas para a seleção de tais

organismos- teste (SPRAGUE, 1969; BUIKEMA e CAIRS., 1982; RAND e PETROCELLI,

1985; BAUDO, 1997).

As daphnias podem ser cultivadas em água natural com pH entre 7,2 e 7,6;

dureza entre 40 mg/L a 48 mg/L CaCO3 ; condutividade 160 µS/cm ou água natural

superficial ou subterrânea, filtrada em rede de zooplâncton com 30 ou 45 µm e pH próximo

da neutralidade (IBAMA, 1987; CETESB, 1991; ABNT, 1993). As daphnias também podem

ser cultivadas no meio denominado de M4, com pH 7,0 ± 0,2, dureza total de 250 ± 15 mg/L

de CaCO3 (DEUUSCHES INSTITUT FUR NORMUNG, 1982).

2.5. Característica das espécies de daphnias selecionadas para estudo neste trabalho

Segundo ELMOOR (1997) as daphnias pertencem à Ordem Anomopoda

(Sars, 1865); à Família Daphniidae (Straus, 1820); e ao Gênero Daphnia (MULLER, 1785).

Na Figura 1 verifica-se um exemplar de cada uma das espécies de Daphnia utilizadas nesse

trabalho.

Figura 1. Espécimes das três espécies de daphnias Daphnia similis (A) Daphnia magna (B)

Daphnia laevis (C).

A

B C

A Família Daphniidae apresenta antênulas pequenas e nove setas olfativas

na fêmea. Antenas cilíndricas, com setas. Olhos grandes e ocelos geralmente pequenos ou

ausentes. Estes organismos têm o pós-abdômen geralmente comprido, sempre com espinhos

anais, setas natatórias não colocadas em projeção ou papila. As garras não têm espinhos,

sendo sempre denticuladas e algumas vezes pectinada. Têm cinco pares de patas, sendo os

dois primeiros prênseis; o quinto par tem uma grande seta recurvada, estendendo-se ao saco

branquial. O intestino é simples, com dois cecos hepáticos. O macho, em geral, tem um

gancho no primeiro par de patas (ELMOOR, 1997).

O gênero Daphnia tem forma oval ou elíptica, exceto quando modificada

pelo elmo e o corpo comprido lateralmente. Os organismos têm valvas reticuladas, com

espinho no ângulo posterior-dorsal e espículas nas margens ventral e dorsal. O rostro é

desenvolvido e pontiagudo na fêmea adulta. As antênulas são pequenas ou rudimentares, não

móveis e situadas sob o rostro. Estes organismos têm três ou quatro processos abdominais,

geralmente todos bem desenvolvidos, sendo o primeiro mais longo e em forma de língua.

Apresentam efipios com ovos quando as condições ambientais são desfavoraveis. Os machos

têm rostro, antênulas longas e moveis, normalmente com flagelo e o primeiro par de patas

com longo flagelo e gancho (ELMOOR, 1997).

A Daphnia magna é um microcrustáceo utilizado em testes de toxicidade

por serem de fácil e econômica manutenção em condições em laboratório, pois são

relativamente pequenos, tem ciclo de vida curto, alta fecundidade e reproduzem-se por

partenogênese (IBAMA, 1987; CETESB, 1991; KOVISTO, 1995).

A Daphnia laevis (BIRGE, 1878) tem o espinho da carapaça longa,

freqüentemente com 2/3 ou mais do comprimento da valva; tem cerca de ½ da margem

ventral e parte da margem dorsal da carapaça com espículas; cabeça alongada, nunca

formando um elmo pontiagudo; rostro pontiagudo direcionado posteriormente e, em geral,

com a extremidade entre as margens anteriores ventrais da carapaça. Ocelo presente. As

antenas são curtas, com cerdas que não alcançam a margem posterior da carapaça. Têm garras

com três pectens de espículas finas e iguais em tamanho. O segundo processo abdominal

cerca ¼ do comprimento do primeiro e aproximadamente igual ao terceiro; comprimento total

do animal é entre 1,0 e 2,0 mm (ELMOOR, 1997).

2.6. Uso dos agrotóxicos selecionados para estudo neste trabalho

O trichlorfon é um inseticida organofosforado muito para o controle de

pragas como lagartas, brocas, cigarras, percevejos, moscas da fruta e mariposa que ocorre nas

culturas de algodão, amendoim, arroz, banana, cacau, café, cana-de-açúcar, citros, feijão,

girassol, goiaba, mangueira, milho, pastagem, seringueira, soja, tomate, trigo e videira

(ANDREI, 1996). Este inseticida também é recomendado para o controle de parasitos de

peixes em piscicultura (KUBITZA e KUBITZA, 1998).

O trichlorfon (metrifonato) pode ser usado para o tratamento de

girodactilídeos, dactilogirídeos na dose de 0,5 mg/L de água, durante três dias. Também pode

ser usado para o controle de copépodos ergasilidae em banhos de imersão rápida, de cinco a

dez minutos, no concentração de 2,5 g/L de água usa-se quatro vezes por semana a

temperatura não superior de 32 ºC. Para o controle de Lernea sp., banhos de imersão rápida,

cinco a dez minutos na concentração de 25 g/L quatro vezes por semana ou banhos

prolongados de 0,5 mg/L de água, durante três dias. Para tratamento de Argulus foliaceus, 20

ml/L de água, em banhos de imersão de apenas dois minutos (PAVANELLI et al., 1999).

O trichlorfon é um inseticida organofosforado bastante usado no controle de

crustáceos parasitos de peixes (Lernaea sp., Argulus sp. e Ergasilus sp.), tremátodos

monogêneos e sanguessugas, bem como na erradicação de ninfas aquáticas em forma de

tratamentos indefinidos com concentrações de 0,13 a 0,25 mg/L; banhos prolongados com 1 a

2,5 mg/L e banho 1 a 3 minutos com 10 mg/L (KUBITZA, 1999).

O sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) e recomendado na aquicultura para o

controle de protozoários, tremátodos monogênios, fungos e baterias externas. Nos Estados

Unidos é usado como algicida e sem restrição para uso em cultivos de peixes de mesa

(KUBITZA e KUBITZA, 1998).

É um potente algicida, herbicida, eliminando o fitoplâncton e plantas

aquáticas, podendo causar drástica redução na concentração de oxigênio dissolvido na água

(KUBITZA, 1998).

O artigo 21 da Resolução CONAMA n° 020, de 18 de julho de 1986

estabelece que o valor máximo admissível é de 1,0 mg de sulfato de cobre /L de água e de 1,0

µg de inseticidas organofosforados /L de água (IBAMA, 1987).

O sulfato de cobre pode ser usado para o controle de protozoários em peixes

na dose de 0,33 a 2 mg/L por tempo indefinido (REICHENBACH-KLINKE, 1982; POST,

1987; KINKLELIN et al., 1991; NOGA , 1996).

2.7. Características principais dos agrotóxicos selecionados para estudo neste trabalho

2.7.1. Trichlorfon

O trichlorfon (dimetil-hidroxi-2,2,2,-tricloroel) é um inseticida não

sistêmico com ação de contato e ingestão. Atua inibindo a enzima acetilcolinesterase no

sistema colinérgico do sistema nervoso dos organismos vivos (TOMLIN, 1995). De acordo

com seus dados de toxicidade aguda, está classificado na classe toxicológica II, altamente

tóxico (ANDREI, 1997).

No homem, os inseticidas organofosforados podem causar transtornos

sensoriais marcantes como imagens confusas, agravadas pela miose, salivação intensa,

lacrimejamento, cólica, diarréia, tenesmo vesical e intestinal, micção dificultada e dolorosa,

secreção bronquiolar seguida de tosse e dificuldades respiratórias, ansiedade, confusão mental

seguida de alteração depressiva ligado ao sistema neurovegetativo com repercussão sobre os

sistemas circulatório e respiratório, convulsões, transtornos na circulação periférica. O

paciente intoxicado apresenta cãimbra, dores musculares agudas, palidez e episódios de

hipertensão arterial e, quando não tratado a tempo, vai a óbito (SAMPAIO e GUERRA,

1998).

No organismo do peixe, o trichlorfon se liga à enzima acetilcolinesterase,

formando um complexo irreversível. A acetilcolinesterase é responsável pela hidrólise da

acetilcolina nas sinapses entre as células nervosas e musculares. Unidas ao trichlorfon, a

acetilcolinesterase é incapaz de cumprir esta função, fazendo com que as fibras musculares

fiquem em constante estado de contração. Portanto, os peixes expostos à concentração

excessiva de trichlorfon ou submetidos a tratamentos freqüentes com este inseticida, mesmo

que nas doses recomendadas, podem apresentar o corpo deformado, com sinais similares a

escoliose e lordose (desvio na coluna), devidos à contração muscular. O peixe perde o

equilíbrio e a habilidade natatória, tem dificuldades para encontrar alimento, evitar predadores

e acaba morrendo. O trichlorfon apresenta baixa persistência ambiental na água, sendo

degradado em menos de uma semana (KUBITZA e KUBITZA, 1998).

Os organosfosforados, quando aplicados em tanques, reduzem a população

de crustáceos, copépodos e cladóceros planctônicos, mas não afetam rotíferos e fitoplâncton

(Mccraaen e Philips, 1977, apud MARTINS, 1998).

2.7.2. Sulfato de cobre

O sulfato de cobre é um dos produtos mais utilizados atualmente para

tratamento de parasitoses dos peixes (protozoários, tremátodos, monogênio, fungos e bactérias

externas) (Griffn, 1994 apud MARTINS, 1998). Porém estudos devem ser feitos para

analisar sua ação sobre o ambiente e o tempo residual em peixe cultivado (MARTINS, 1998).

Quanto ao impacto ambiental do sulfato de cobre, em experimentos

realizados no Laboratório de Patologia de Organismos Aquáticos do Caunesp foi verificado

por MARTINS (1998) que, aos dez dias após a aplicação na água, a fauna e flora voltam ao

normal. Na análise residual desse produto na carne do peixe foi verificado que somente após

30 dias da exposição o nível de cobre já estava próximo ao observado em peixes não

expostos.

Devido à formação do íon cúprico Cu+2, durante a sua dissolução na água, o

sulfato de cobre é bastante tóxico aos peixes, principalmente em águas com baixa alcalinidade

total.

Doses excessivas de sulfato de cobre, quando não matam, podem causar

injúrias e excessiva produção de muco nas brânquias, distúrbios nervosos e redução da

eficieência do sistema imune dos peixes (KUBITZA, 1998).

2.7.3. Dicromato de potássio

Nos testes de toxicidade usados para o controle da poluição hídrica,

substâncias consideradas como referência são utilizadas para avaliar e controlar a manutenção

da sensibilidade de organismos aquáticos ao longo do tempo. Assim, a utilização de uma

substância de referência como o dicromato de potássio (K2Cr2O7) num método padronizado

aumenta a confiabilidade (Peltier, e Weber, 1985, Bukema et al., 1982 apud BERTOLETTI

et. al., 1989).

O dicromato de potássio (K2Cr2O7) é utilizado como substância de

referência nos testes padronizados de toxicidade para microcrustáceos (IBAMA, 1987), em

que a sensibilidade da daphnia varia com a dureza da água de cultivo (DEUUSCHES

INSTITUT FUR NORMUNG, 1982).

A faixa aceitável da CE50-24 h de dicromato de potássio para Daphnia similis

é de 0,04 mg/L a 0,17 mg/L na água do meio de cultivo com pH 7,6, condutividade 160

µS/cm e dureza de 40 a 48 mg/L em CaCO3 (IBAMA, 1987; CETESB, 1991; ABNT, 1993).

Esse método pode ser aplicado a outras espécies do gênero daphnia, desde que sejam

conhecidas as condições básicas para sua manutenção e cultivo em laboratório e também sua

sensibilidade às substâncias de referência (CETESB, 1991; ABNT, 1993).

Outro método utilizado para se fazer o controle da sensibilidade da cultura

de daphnia é o que estabeleceu o intervalo de aceitação da CE50-24 h calculado por média ± 2

S, sendo o valor do limite inferior igual a X - 2S e o limite superior do intervalo igual a X+ 2S

(USEPA 1985), onde X = média e S = desvio padrão da média.

2.8. Toxicidade aguda de agrotóxicos e da substância de referência para daphnias

Em testes de toxicidade aguda de trichlorfon para Daphnia magna, cultivada

em meio M4, com dureza de 250 ± 15 mg/L em CaCO2, foram calculados os valores de CE50-

48 h de 0,00096 mg/L (TOMLIN, 1995); 0,01 mg/L (EXOTOXNET, 1996) e 0,000586 mg/L

(FERREIRA, 1998).

Em testes de toxicidade aguda de sulfato de cobre a Daphnia magna

cultivada em meio M4, com dureza 250 ± 15 mg/L em CaCO3 estudadas por SECO-

GORDILLO et al. (1998), KANGAROT e RAY (1989) e ELNABARAWY e ROBIDEN.

(1986) calcularam CE50-48 h, respectivamente de 0,21mg/L, 0,54 mg/L e 0,017 mg/L,

0,054mg/L e 0,041 mg/L. Nestas mesmas condições, MOUNT e NORBERG (1984)

encontraram valores respectivos para D. pulex e C. dubia de 0,053 mg/L e 0,017 mg/L e

ELNABARAWY e ROBIEN., (1986) encontraram, para os mesmos organismos, valores de

CE50 - 48h, respectivos de 0,031 mg/L e 0,023 mg/L. BERTOLETTI et al. (1992),

encontraram valores de CE50-24 h para Daphnia similis de 0,022 mg/L; 0,019 mg/L; 0,024

mg/L; 0,034 mg/L; 0,023 mg/L, também para esse o sulfato de cobre.

Na norma DIN 38.412 (1982), a faixa aceitável de CE50-24 h do dicromato

de potássio para Daphnia magna, cultivada em meio M4, com dureza 250 ± 15 mg/L em

CaCO3, é de 0,9 a 2,0 mg/L, Na norma ISO 6341 (1983), a faixa aceitável de CE50-24 h para

D. magna é de 0,9 a 2,4 mg/L.

Em testes de avaliação de toxicidade aguda com Daphnia magna,

FERREIRA (1998) calculou valores de CE50-48 h de 0,07 mg de K2Cr2O7 /L em água de mina

ajustada com pH 7,6, condutividade 160 µS/cm e dureza de 40 a 48 mg/L em CaCO3

SORVARI e SILLAMPAA (1996) calcularam valores de 0,34 mg/L do

dicromato de potássio para D. magna, cultivada em M4, com dureza 250 ± 15 de carbonato de

cálcio. BASSFELD (2001) encontrou valores de 0,19 mg/L do dicromato de potássio, para D.

magna, cultivada em M4 com dureza 118 ± 12 em CaCO3.

Para Daphnia similis, BERTOLETTI et al. (1992) calcularam valores de

CE50-24h em 0,023 mg/L de CuSO4. 5H2O.

Para Dahnia laevis não foi encontrado nenhum trabalho sobre a

sensibilidade desta espécie ao dicromato de potássio.

2.9. Efeito do sedimento sobre a toxicidade de agrotóxicos para organismos aquáticos

O sedimento é um material particulado natural, orgânico ou mineral, que

pode ser transportado e depositado normalmente no fundo de ecossistemas aquáticos,

(SETAC, 2001). O próprio solo do fundo dos corpos da água também pode ser denominado

de sedimento. A função primordial do sedimento é agir como filtro para contaminantes da

água, fixando e removendo elementos nocivos ao homem e à natureza (CIHACEK et. al.,

1996).

Os compostos químicos podem existir sobre três formas de disponibilidade

preferenciais em ecossistemas aquáticos: dissolvidos ou adsorvidos em um componente

biótico ou abiótico, suspenso na coluna de água ou depositado no fundo, e acumulado nos

organismos (MURILO, 2000).

A taxa de adsorção de substâncias químicas na água depende de fatores como

a temperatura, o pH, a concentração de material em suspensão, a dureza, a alcalinidade, o

fluxo, a profundidade e o tamanho das partículas presentes e dos compostos químicos

(MURILO, 2000).

Os herbicidas, assim como os demais agrotóxicos, podem sofrer partição

entre a fase aquosa e o sedimento no ambiente aquático. Este fenômeno depende das

propriedades físicas e químicas do sedimento, da água e da natureza da molécula. Portanto,

assume-se que a biodisponibilidade dos herbicidas para os organismos aquáticos, o potencial

destes produtos em manifestar efeitos adversos sobre a biota, são afetados pela partição das

moléculas entre as fases aquosas e sólida (JONSSON e MAIA, 1999). Estes autores

verificaram também que na ausência de sedimento, o herbicida clamozone é

aproximadamente 175 vezes mais tóxico que o quimclorac na presença de sedimento. Para o

glyphosate, a maior valor da CL(I)50 na presença de sedimento deveu-se à imobilização do

herbicida no sedimento. Por tanto, há necessidade de maior concentração, ou quantidade do

herbicida para causar o mesmo efeito na Daphnia pulex. Portanto, o sedimento imobiliza e

deixou disponível para atingir a Daphnia pulex apenas 59,5% da concentração do herbicida

adicionado na água.

KUSK (1996) estimou valores de CE50-48 h do piramicarb para Daphnia

magna de 16 µg/L em ausência de sedimento e de 24 µg/L em presença de sedimento. Este

autor concluiu que o sedimento imobiliza 33,3 % do piramicarb da água, tornando-o menos

biodisponivel para a Daphnia magna.

JONSSON e MAIA (1999) calcularam valores de CE50–48 h do herbicida

clamazone para Daphnia similis equivalentes a 1,51 mg/L em sistema sem sedimento e 11,28

mg/L em sistema com sedimento. Nestes resultados, verifica-se que o sedimento imobilizou

86,6% do herbicida na água.

Os metais pesados, nos processos de infiltração e percolação, são bem retidos

pela maioria dos solos, principalmente quando ricos em matéria orgânica e com pH > 7.

Quando o pH é muito ácido, o solo não tem capacidade de reter os metais pesados e, por

lixiviação, acabam sendo encaminhados aos corpos da água abaixo mais próximo (NUCCI et

al., 1978).

Na bibliografia consultada não for encontrado estudos sobre os efeitos do

sedimento na a toxicidade aguda de sulfato de cobre e trichlorfon para as três espécies de

daphnias consideradas.

2.10. Risco de intoxicação da contaminação ambiental causado pelo uso de sulfato de

cobre e trichlorfon na piscicultura

A recomendação de uso de agrotóxicos resulta em uma concentração

ambiental estimada (CAE) que é definida como uma estimativa da exposição de organismos

não alvos aos agrotóxicos, resultante da aplicação direta no ambiente (SETAC, 1994).

As decisões em avaliações de risco que envolvem organismos aquáticos são

baseadas na taxa de uma única CAE para uma única referência do nível do efeito do

agrotóxico. Esta inter-relação é conhecida como o quociente de risco. O quociente máximo

aceitável de risco é 0,1; 0,5 e 1 (SETAC, 1994).

O critério de aceitação do risco na CAE equivalente a 0,1 x CE50 é a

concentração regulatória atual. Esta concentração é baseada na suposição de que uma

intoxicação aguda significativa não ocorrerá neste nível de exposição (SETAC, 1994).

As concentrações ambientais estimadas (CAEs) nos ecossistemas aquáticos

dependem diretamente da quantidade de produto que os atingem após o processo de

degradação e mobilidade para fora do local de aplicação. Estes fatores, por sua vez, dependem

de outras variáveis como propriedades físico-químicas do agrotóxico, característica do solo,

cobertura vegetal e regime pluviométrico entre outras (SETAC, 1994; SOLOMON, 1995).

De acordo com o procedimento proposto pela SETAC (1994), os riscos de

intoxicação ambiental, devido à contaminação com os agrotóxicos, podem ser classificados

em função da comparação da CE50 com a CAE. O critério de classificação do risco de

intoxicação ambiental das CAEs é o seguinte:

Alto risco de intoxicação da espécie se CAE � 0,5 x CE50

Moderado risco de intoxicação da espécie se 0,1 X CE50 � CAE < 0,5 x CE 50

Baixo risco de intoxicação da espécie se CAE < 0,1 x CE50

3. MATERIAL E MÉTODO

Todo o material e a metodologia utilizados nesse trabalho seguiram as

recomendações estabelecidas nas normas e metodologia da APHA (1991), MURTY (1988) e

RAND e PETROCELLI (1985), IBAMA (1987) CETESB (1991), ABNT (1993) e

DEUTSCHES INSTITUT FUR NORMUNG DIN 38.412 (1982), mas com ligeiras

modificações, e estão descritos nos itens a seguir.

3.1. Local da realização dos testes

Os testes de avaliação da toxicidade aguda do sulfato de cobre e do

trichlorfon para as três espécies de daphnias foram conduzidos no Laboratório de

Ecotoxicologia dos Agrotóxicos e Sanidade Ocupacional, do Departamento de Fitossanidade,

da FCAV/Unesp – Câmpus Jaboticabal, associado ao Centro de Aqüicultura da

Unesp/Caunesp.

3.2. Organismos-teste

3.2.1 Espécies de daphnias estudadas

Os exemplares de Daphnia similis (Figura 1 A) foram provenientes de uma

cultura mantida em recipientes de vidro com dois litros de água, em uma estufa incubadora,

tipo BOD, mod. 347 FANEM, na temperatura de 20 ± 2°C, no Laboratório de Ecotoxicologia

do Departamento de Defessa Fitossanitária da FCAV / Unesp – Câmpus de Jaboticabal, SP. O

fotoperíodo utilizado foi de 12 horas, com intensidade luminosa em torno de 1000 lux,

Os exemplares de Daphnia magna (Figura 1 B) foram obtidos de culturas

mantidas na Universidade Federal do Paraná (UFP) no Centro de Estudos do Mar,

reproduzidos e mantidos em condições de laboratório.

Os exemplares de Daphnia laevis (Figura 1 C) foram coletados em tanques

de cultivo de peixes no Centro de Aqüicultura da Unesp – Jaboticabal – SP e adaptados as

condições de laboratório, usando as mesmas condições de criação das outras duas espécies,

mencionadas acima.

3.2.2. Cultivo das daphnias

3.2.2.1. Água de cultivo

As daphnias foram cultivadas em água natural de mina filtrada em rede de

zooplâncton com 30 µm, de acordo com as normas do IBAMA (1987), CETESB (1991);

ABNT (1993), com condutividade de 160 µS/cm, pH 7,6 e dureza de 45 mg/L em CaCO3,

previamente aerada por 48 horas, com aerador de aquário modelo TROPICAL 11.

A água de cada cristalizador (Figura 2) foi renovada completamente toda

semana, com repicagem e descarte dos organismos mais velhos, no momento da troca de

água.

Uma vez por semana as daphnias foram selecionadas e passadas para novos

recipientes de cultivo, com água nova. Os organismos mais velhos e a maioria dos neonatos

foram descartados nas trocas de água. No meio da semana os recipientes de cultivos foram

limpados com sifoneamento das sujeiras dos fundos.

Figura 2. Vista geral da câmara de cultivo das três espécies de daphnias.

3.2.2.2. Alimentação das daphnias

A alimentação das daphnias foi realizada com uma suspensão de células de

alga da espécie Scenedesmus subspicatus, na concentração de 5x106 células de alga por

daphnia, fornecida uma vez por dia, segundo recomendações da CETESB (1991). Juntamente

com a suspensão algácea também foi fornecida diariamente ração de peixe fermentada na

quantidade de 0,5 mL para cada 2 L de água de cultura, mais leveduras. Juntamente com a

suspensão algácea foi administrado 1 mg de complexo vitamínico Vit. B1(7mg), Vit. B2

(7mg), Vit. B6 (5mg), Vit.B12 (33mg) e Vit. H (1mg) de acordo com as recomendações de

SIPAUBA-TAVARES (2001).

3.2.2.2.1. Cultivo de alga

A alga utilizada na alimentação das daphnias foi cultivada em erlenmeyer de

2 L provido de aeração dentro de uma câmara BOD (Figura 3), na temperatura de 20 ± 2°C,

luminosidade de 500 lux de intensidade e fotoperíodo de 15 h. O meio utilizado para

manutenção da cultura de algas foi o LC – OLIGO autoclavado, recomendado pela CETESB

(1991).

Figura 3. Vista geral da câmara de cultivo de alga Scenedesmus subspicatus utilizadas

na alimentação das daphnias.

3.2.2.2.2.2. Ração fermentada

A ração fermentada foi preparada misturando-se 5 g de ração para peixe

AlconColours em um litro de água destilada, mantida com aeração constante durante uma

semana. Depois de uma semana de fermentação, o caldo foi filtrado com rede de zooplâncton

de 350 µm e misturada com fermento biológico seco instantâneo na proporção de 0,5 g por

100 mL do filtrado (CETESB, 1991).

3.3. Características físico-químicas do solo utilizado como sedimento

O sedimento utilizado foi da camada superficial de 0 a 20cm do solo de

uma área isenta de resíduos tóxicos, localizada no Centro de Pesquisas em Sanidade Animal

(CPPAR) da FCAV/Unesp Campus de Jaboticabal. O solo foi peneirado e sua composição

química e granulométrica foi analisada antes de ser usada nos experimentos e estão contidos

na Tabela 1.

Tabela 1. Análises químicas e granulométricas do solo usado como sedimento nos testes de

toxicidade aguda.

Elementos

Valores

pH (em Ca) 5,8 MO (g/dm3) 24,0 P (g/dm3) 46,0 K (mmlcd/dm3) 4,3 Ca (mmlcd/dm3) 47,0 Mg (mmlcd/dm3) 16,0 H + AL (mmlcd/dm3) 25,0 SB (mmlcd/dm3) 67,3 T (mmlcd/dm3) 92,3 V (%) 73,0 Argila (g/kg) 440,0 Limo (g/kg) 226,0 Areia fina (g/kg) 100,0 Areia grosa (g/kg) 200,0 Classe textural Argilosa

3.4. Preparo das soluções-estoque dos agrotóxicos

As soluções-estoque utilizadas em todos os testes foram preparadas por meio

da adição de alíquotas da formulação comercial Diterex®, contendo 500 g de trichlorfon/ L,

produzido pela empresa BAYER Brasileira S.A O sulfato de cobre (CuSO4.5H2O), produzido

pela CYRQ Ind. Brasileira. O dicromato de potássio, produzido pela Chimie Test Ind.

Brasileira, com grau analítico, foi utilizado como substância de referência, para o controle da

sensibilidade dos organismos-teste IBAMA (1987), CETESB (1991) e ABNT (1993).

3.5. Controle da sensibilidade dos organismos-teste com a substância de referência

dicromato de potássio

Foram realizados testes de sensibilidade para as três espécies de daphnias ao

dicromato de potássio (K2Cr2O7) de acordo com as metodologias normatizadas por IBAMA

(1987), CETESB (1991) e ABNT (1993).

Os testes foram realizados uma semana antes, durante e após a realização

dos testes com os dois agrotóxicos em estudo. Os valores da CL(I)50–24 h foram calculados

em cada teste e todos os valores foram utilizados no cálculo da media durante o período. O

critério da média ± 2 desvios padrões foi utilizado para fazer o controle da sensibilidade dos

organismos cultivados, de acordo com o controle de qualidade estabelecido na metodologia

do IBAMA (1991) e da CETESB (1991).

Os testes de sensibilidade foram realizados a partir de soluções estoques

com concentrações de 0,1; 1 e 10 mg/L, em uma série de frascos de vidro com capacidade de

50 mL, utilizando-se 30 mL, contendo soluções-teste de K2Cr2 O7, diluídas em água natural

ajustada. Cada teste foi realizado com cinco concentrações crescentes da substância de

referência e um controle, e todos com quatro repetições, totalizando 24 frascos de vidro

(Figura 4).

Figura 4. Frascos de vidro utilizados nos testes de sensibilidade das três espécies de daphnia

à substância de referência dicromato de potássio.

As concentrações nominais do dicromato de potássio utilizadas nos testes

definitivos foram selecionadas de acordo com os dados dos testes preliminares, onde se

estabeleceu a faixa de sensibilidade de cada espécie de daphnia. Em cada frasco de vidro

foram colocados cinco organismos neonatos, com idade entre seis e 24 horas (Figura 5) e

mantidos em BOD por 24 horas, na temperatura a 20 ± 2 °C e no escuro. Após as 24 horas

foram realizadas avaliações da mobilidade dos organismos-teste. Os valores da CE50- 24 h

foram calculados pelo método de Sperman Karber (HAMILTON et al., 1977).

Figura 5 Espécimes de Daphnia similis: adulto (A) e neonato (B) com idade entre seis e 24

horas.

3.6. Testes de toxicidade aguda do sulfato de cobre e do trichlorfon para as daphnias

Os testes preliminares e definitivos com o sulfato de cobre e trichlorfon

foram realizados de acordo com a metodologgia estabelecida pelo IBAMA (1987), CETESB

(1991) e ABNT (1993). Entretanto, nos primeiros testes instalados com trichlorfon ocorreu

morte de todos os organismos, inclusive nas parcelas sem o agrotóxico. Para solucionar este

problema, os testes com trichlorfon foram realizados em frascos de vidro fechados com tampa

de plástico, conforme observa-se na Figura 6. Esta modificação na metodologia viabilizou a

realização dos testes com o trichlorfon, pois o fechamento dos frascos–teste evitam a

volatilização do ingrediente ativo durante os testes e não afetam a sobrevivência dos

organismos-teste.

A B

Figura 6. Frascos de vidro fechados utilizados nos testes definitivos com trichlorfon na

ausência e presença de sedimento.

3.6.1. Testes preliminares com as três espécies de daphnias

As fêmeas ovadas das três espécies de daphnias foram colocadas

separadamente em recipiente de vidro (cristalizador) limpo, contendo água natural filtrada

modificada, com pH 7,6; dureza de 45 mg/L em CaCO3 e condutividade de 160 µS/cm. Após

a separação, estas fêmeas foram alimentadas como descrito no item 3.2.2.2. Depois de 24

horas e seis horas antes do início dos testes, as fêmeas ovígeras foram retiradas e os neonatos

foram utilizados nos testes de toxicidade (CETESB, 1991).

O preparo de todas as soluções e das etapas de montagem e condução dos

testes foram realizadas em salas climatizadas, sem a presença de vapores ou poeiras tóxicas,

na temperatura de 20 ± 2 °C (CETESB, 1991).

3.6.2. Soluções estoques de sulfato de cobre e trichlorfon

Antes de começar os testes as soluções estoque de trichlorfon , foram

preparadas pipetando 2 mL de Dipterex 500, contendo 500 g de ingrediente ativo/ L e

transferido diretamente para balão volumétrico de 1000 mL. O volume do balão foi

completado com água destilada agitando com movimentos circulares, obtendo-se solução

estoque de 1000 mg/L. Esta solução foi diluída e soluções estoques com concentrações de

0,0001 e 0,00001 mg/L foram obtidas. A partir destas se obteve as soluções-teste (Tabelas

Anexos).

Para o dicromato de potássio dilui-se um grama e completado para um litro de

água destilada, em balão volumétrico de 1000 mL. Esta solução foi diluída obtendo-se

solução estoque de 1000 mg/L com concentrações de 1,0 e 10 mg/L. A partir destas soluções

se obteve as soluções-teste (Tabelas Anexo).

Para obtenção das soluções estoques e soluções-teste, utilizou-se a seguinte

formula:

C1 x V1 = C2 x V2, onde:

C1 = Concentração inicial

C2 = Concentração Final

V1 = Volume inicial

V2 = Volume final

3.6.3. Testes sem sedimento

Numa série de recipientes de vidros com 30 mL de capacidade, foram

preparados volumes conhecidos de soluções estoque de sulfato de cobre nas concentrações de

1 e de 10 mg/L ou de trichlorfon, nas concentrações de 0,0001 e de 0,00001 mg/L,

completando-se para 9 mL de água de cultivo previamente aerada por 48 horas, para garantir

a saturação mínima de oxigênio nas soluções–teste desejadas. Em seguida, para completar o

volume das soluções-teste, foi adicionado 1,0 mL com água de cultivo contendo cinco

neonatos coletados nos recipientes das fêmeas ovígeras.

3.6.4. Testes com sedimento

Em uma série de recipientes de vidro foram colocados 3,0 g de solo,

utilizado como sedimento, e sobre esse foram colocados cuidadosamente 8 mL de água de

cultivo previamente aerada por 48 horas, para garantir a saturação mínima de oxigênio.

Volumes conhecidos da solução-estoque de sulfato de cobre 10 e 100 mg/L ou de trichlorfon,

0,1 e 0,01 mg/L, foram depositadas nos recipientes de vidro e completado para 9,0 mL com

água de cultivo. Imediatamente após a colocação das soluções-teste sobre o sedimento foram

colocados 1,0 mL da água de cultivo com cinco neonatos de daphnia coletados dos recipientes

das fêmeas ovígeras.

Foram conduzidos experimentos com cinco tratamentos para cada uma das

três espécies de daphnia com sulfato de cobre ou trichlorfon, em presença e ausência do

sedimento. Cada tratamento foi composto por quatro repetições e um controle para

tratamento. As daphnias neonatas dos testes permaneceram na sala de bioensaios durante 48

h na temperatura de 20 ± 2 °C, em ambiente escuro, sem alimentação. Depois de 24 e 48

horas de exposição foi realizada a contagem dos organismos imóveis de cada recipiente. Os

organismos que não conseguiam nadar por 15 segundos após leve agitação do frasco foram

considerados imóveis (CETESB, 1991).

3.7. Testes definitivos com as três espécies de daphnia

Com os intervalos das concentrações estabelecidos nos testes preliminares,

foram conduzidos os testes definitivos, seguindo-se o mesmo procedimento do teste

preliminar para cada uma das três espécies de daphnia, sem e com sedimento (Figura 7;

Figura 8; Figura 9 e Figura 10). Estas figuras são dos testes com sulfato de cobre,

identificados pela ausência de tampas nos frascos de vidro, pois nos testes com trichlorfon,

todos os frascos de vidro foram fechados com tampa de plástico (Figura 6)

Figura 7. Frascos de vidro utilizados nos testes definitivos com sulfato de cobre em ausência de sedimento.

Figura 8. Frascos de vidro utilizados nos testes definitivos com sulfato de cobre em presença

de sedimento.

Figura 9. Vista da sala climatizada com os frascos-teste contendo os neonatos de daphnia.

Figura 10. Vista do local das avaliações e contagem dos neonatos após os períodos de

exposição dos neonatos de daphnia aos agrotóxicos.

3.8. Cálculo da CE50 –48h

Com os dados de imobilidade das daphnias às 48 h de exposição foram

calculados os valores de CE50–48 h utilizando-se o método “Treimed Sperman Karber”

(HAMILTON et. al., 1977), definido por RAND & PETROCELLI (1985) como sendo a

concentração estimada que produz 50% de mortalidade, no caso , imobilidade, da população

exposta a um agente tóxico por determinado período de tempo. Nos resultados dos testes com

a substância de referência dicromato de potássio foram calculados os valores de CE50-24 h

apenas.

3.9. Avaliação do risco de intoxicação ambiental das daphnias devido à contaminação

proporcionada pelo uso de sulfato de cobre e trichlorfon em piscicultura

As avaliações dos riscos de intoxicação ambiental das três espécies de

daphnias devido à contaminação proporcionada pelo uso de sulfato de cobre e trichlorfon

foram realizadas de acordo com a proposta da SETAC (1994). Os riacos de intoxicação

ambiental foram avaliados por meio das comparações dos valores de CE50-48 h calculados nos

testes de toxicidade aguda, sem e com sedimento, com os valores das concentrações

ambientais estimadas (CAE) das recomendações de uso destes dois agrotóxicos em

piscicultura (SETAC (1994).

Os cálculos das CAEs foram realizados com a dosagem recomendada dos

dois agrotóxicos em estudo para o controle de insetos predadores aquáticos, parasitos e

patógenos de peixes em piscicultura em geral.

A CAE do sulfato de cobre utilizada foi de 0,33 mg/L, de acordo com as

recomendações de POST (1987), MARTINS (1998), KUBITZA e KUBITZA (1999) e

PAVANELLI et al., (1999). A CAE do trichlorfon utilizada foi de 0,13 mg/L, de acordo com

as recomendações de REICHENBACH-KLINKE (1982), POST (1987), KINKLELIN et al.,

(1991), NOGA (1996), MARTINS (1998), KUBITZA e KUBITZA (1999) e PAVANELLI et

al., (1999).

O critério utilizado para classificar os riscos ambientais dos agrotóxicos para

as daphnias baseia-se na comparação dos valores da CE50–48 h e das CAE, de acordo com a

SETAC (1994) e é o seguinte:

Alto risco de intoxicação da espécie se CAE � 0,5 x CE 50

Moderado risco de intoxicação da espécie se 0,1 x CE50 � CAE < 0,5 x CE50

Baixo risco de intoxicação da espécie se CAE < 0,1 x C50

3.10. Análise estatística

Para o cálculo do coeficiente de variação dos resultados dos testes de

toxicidade aguda com dicromato de potássio (K2Cr2O7), para as três espécies de daphnias, foi

utilizada a seguinte fórmula:

C.V.= S.100 / X

Onde :

C.V.= coeficiente de variação em %;

S = desvio-padrão dos valores de CE50-24h, em mg/L;

X= Média das CE50–24 h, em mg/L.

Os valores das CE50–48 h calculados para cada repetição de cada um dos testes definitivos

realizados com o dicromato de potássio foram analisados estatisticamente, de acordo com

GOMES (2000), por meio do delineamento inteiramente ao acaso considerando-se como

tratamento as três espécies de daphnias e cada um dos seis testes como repetições.

Os valores das CE50–48 h calculados para cada repetição dos tratamentos

utilizados nos testes definitivos com sulfato de cobre e trichlorfon, com as três espécies de

daphnias, foram analisados estatisticamente, de acordo com GOMES (2000), por meio do

delineamento inteiramente ao acaso e os tratamentos dispostos no esquema fatorial 3x2, sendo

os fatores:

E= Espécies de daphnias (D. magna, D. similis e D. laevis); e

S= Sedimento (ausente e presente)

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Testes de controle da sensibilidade das daphnias com dicromato de potássio

Os valores calculados de CE50-24 h dos seis testes de toxicidade aguda com a

substância de referência dicromato de potássio, para as três espécies de daphnias, estão

apresentados na Tabela 2, com os respectivos valores de intervalo de confiança, médias do

teste (X), desvio padrão (S) e coeficiente de variação (C.V.).

Os resultados da análise de variância dos valores de CE50-24h h calculados

nos testes com dicromato de potássio encontram-se na Tabela 2. Verifica-se nestes dados que

não existe diferença de sensibilidade entre as três espécies de daphnias ao dicromato de

potássio.

Tabela 2. Valores médios de CE50-24 h (mg de K2Cr2O7/L) calculados para os testes de

toxicidade aguda e do intervalo de confiança (95%) em água natural ajustada,

para as três espécies de daphnias.

Daphnia magna Daphnia similis Daphnia laevis

Data do

teste

CE50-24h

(mg/L)

Intervalo de

confiança (95%)

CE50-24h

(mg/L)

Intervalo de

confiança (95%)

CE50-24h

(mg/L)

Intervalo de confiança

(95%)

20/02/02 0,06 0,05 – 0,09 0,08 0,08 – 0,09 0,07 0,06 – 0,10 27/02/02 0,06 0,04 – 0,07 0,06 0,04 – 0,09 0,03 0,02 – 0,06 07/03/02 0,07 0,05 – 0,09 0,08 0,07 – 0,10 0,04 0,03 – 0,07 11/03/02 0,13 0,11 – 0,17 0,14 0,12 – 0,17 0,12 0,09 – 0,18 18/03/02 0,13 0,17 – 0,19 0,16 0,15 – 0,17 0,15 0,14 – 0,17 25/03/02 0,10 0,09 – 0,12 0,10 0.09 – 0.13 0,09 0,08 – 0,12

X 0,09 A 0,10 A 0,09 A S 0,03 0,04 0,04

C.V.(%) 36,11 39,42 52,05 F espécie de daphnia = 0,38 NS ; DMS (%) = 0,0596 mg/L

Médias seguidas por mesma letras maiúsculas nas linhas não diferem estatisticamente entre si, pelo teste de

Tukey, ao nível de 5% de probabilidade.

Considerando-se o critério de media ± 2 S para determinar o intervalo de

aceitação dos valores de CE50-24 h , para o controle da sensibilidade das daphnias (USEPA,

1985), verifica-se nas Figuras 10, 11 e 12 que as três espécies também o atendem.

Figura 11. Controle de qualidade dos organismos-teste e estabelecimento da faixa aceitável,

de CE50-24 horas do dicromato de potássio a Daphnia magna (LS = limite superior;

LI = limite inferior; x = média e s = desvio padrão)

0

0,09

0 1 2 3 4 5 6 7

Numero do teste

CL(

I)50-

24h

( m

g/L)

D. magna

Figura 12. Controle de qualidade dos organismos-teste e estabelecimento da faixa aceitável,

de CE50-24 horas do dicromato de potássio a Daphnia similis (LS = limite superior; LI

= limite inferior; x = média e s = desvio padrão).

Figura 13 Controle de qualidade dos organismos-teste e estabelecimento da faixa aceitável,

de CE50-24 horas do dicromato de potássio a Daphnia laevis (LS = limite superior; LI

= limite inferior; x = média e s = desvio padrão).

0

0,1

0 1 2 3 4 5 6 7

Numero do teste

CL(

I) 50

-24h

(mg/

L)D. similis

0

0,09

0 1 2 3 4 5 6 7

Numero do teste

CL(

I) 50

-24h

(mg/

L)

D. laevis

Observa-se na Tabela 2 que os valores de CE50–24 h do K2Cr2O7 para as três

espécies de daphnias, comparados com os resultados de outros pesquisadores (Tabela 3) para

Daphnia similis estiveram dentro do intervalo estabelecido como controle de qualidade pelo

CETESB (1991), ABNT (1993) e IBAMA (1987). Nestas metodologias, o intervalo de

aceitabilidade da CE50-24h está entre 0,04 e 0,17 mg/L de K2Cr2O7 para D. similis. Estes

dados também concordam com os resultados obtidos por BERTOLETTI et al., (1992). Para

D. magna, o valor de CE50–24 h calculado para o dicromato de potássio (K2Cr2O7) está

próximo aos resultado obtido por FERREIRA (1998).

Os valores calculados neste trabalho para D. magna estão muito inferiores

aos calculados por SORVARI e SILLAMPAA (1996) e BASSFELD (2001). Os maiores valores

calculados por estes dois autores podem ser devidos á maior dureza da água de cultivo que

utilizaram, de 250 e 118 mg/L em CaCo3, respectivamente. Assim, as diferenças de

sensibilidade podem ser atribuídas ao método utilizado para o cultivo das daphnias, visto que

ela varia em função da dureza da água de cultivo (DEUUSCHES INSTITUT FUR

NORMUNG, 1982).

Tabela 3. Valores médios de CE50-24 h (mg de K2Cr2O7/ L) calculados para as três espécies de daphnias neste trabalho e por outros autores.

FONTE RESULTADOS em (mg/L) Este trabalho Água de cultivo dureza 40-48 mg/L em CaCO3

D.m.= 0,09; D.s.= 0,10; D.l = 0,09 FERREIRA (1998) Água de cultivo dureza 40-48 mg/L em CaCO3

D.m = 0,07 BERTOLETTI et al. (1998) Água mole dureza 40-48 mg/L em CaCO3

D. s = 0,13; 0,15; 0,07; 0,05; 0,09; 0,17; 0,11; 0,09 0,06; 0,05

CETESB (1991); IBAMA(1987); ABNT (1993) Água mole dureza 40-48 mg/L em CaCO3 D. s = 0,04 – 0,17

I.S.O. 6.341 (1983) Meio M4 dureza 250 ± 15 mg/L em CaCO3 D. m = 0,9 – 2,4

DIN 38.412 (1982) Meio M4 dureza 250 ± 15 mg/L em CaCO3 D. m = 0,9 - 2,0

SORVARI e SILLAMPAA (1996) Meio M4 dureza 250 ± 15 mg/L em CaCO3 D. m = 0,34

BASSFELD (2001) Meio M4 dureza 118 ± 12 mg/L em CaCO3 D. m = 0,21; 0,20; 0,18; 0,18

D. m = Daphnia magna, D. s = Daphnia similis, D. l = Daphnia laevis

Para D. laevis na bibliografia consultada, não foi encontrado qualquer artigo

sobre a sensibilidade desta espécie ao dicromato de potássio

Os valores da CE50-24 h calculados do dicromato de potássio para as três

espécies de daphnia demostra que o cultivo destes organismos-teste atenden ao controle de

qualidade estabelecido nas normas da ABNT (1993), CETESB (1991) e do IBAMA (1987),

cujo valor de CE50-24 horas deve estar entre 0,04 e 0,17 mg/L. e também ao critério do

intervalo correspondente à X = ± 2 S (Figura 10,11 e 12).

4.2. Testes de toxicidade aguda do sulfato de cobre para três espécies de daphnias na

ausência e presença de sedimento

Os resultados da análise de variância dos valores de CE50-48 h calculados

nos testes com sulfato de cobre encontram-se na Tabela 4. Verifica-se nestes dados os efeitos

altamente significativos dos dois fatores estudados e da interação entre ambos. As análises

dos desdobramentos dos graus de liberdade dos níveis dos fatores e da interação estão

apresentados na Tabela 5

Tabela 4. Análise de variância dos valores de CE50-48 h do sulfato de cobre para as três

espécies de daphnias na ausência e presença de sedimento.

Causas de variação G.L. S. Q. Q. M. F

Espécies (E) Sedimento (S) Interação E x S

2 1 2

0,211 0,2204 0,799

0,0105 0,2204 0,0400

12,3** 257,6** 46,6**

**significativo ao nível de 1% de probabilidade

C.V. = 18,2(%)

G.L= Grau de liberdade; S.Q.= Soma dos quadrados; Q.M.= Quadrado médio.

Tabela 5. Desdobramento dos graus de liberdade dos fatores do teste de toxicidade aguda de

sulfato de cobre para as três espécies de daphnias na ausência e presença do

sedimento.

Espécies CE50 – 48h (mg/L)

Agrotóxico

Sedimento D. magna CE50-48h

D. similis CE50-48h

D. laevis CE50-48h

Médias

sulfato de cobre

Ausente

Presente

0,045 b B

0,347 a A

0,042 b B

0,282 b A

0,107 a A

0,140 c A

0,065 B

0,257 A

Médias seguidas seguidas por letras minúsculas diferentes, na linha, indica diferenças significativas entre espécies. Médias seguidas por letras maiúsculas diferente na coluna, indica diferenças entre presença e ausência de sedimento DMS (5%) Espécies = 0,4 mg/L; DMS (5%) Sedimento = 0,02 mg/L Na Tabela 5 verifica-se que na ausência de sedimento, a Daphnia magna e a

Daphnia similis não apresentaram diferenças de sensibilidade ao sulfato de cobre, enquanto

que a Daphnia laevis foi significativamente menos sensível que as outras duas espécies. A

maior tolerância de Daphnia laevis ao sulfato de cobre pode ser devida ao fato de ser uma

espécie nativa e, conseqüentemente, mais rústica.

Poucos estudos de avaliação da sensibilidade constataram similar

sensibilidade entre membros da família Daphnidae. Esta constatação podem ser devida a

comparações de pequeno número de dados de toxicidade aguda (CANTON e ADEMA, 1978;

HIECKEY, 1989, MARCHINI et al.; 1993; LILIUS et al, 1995; VESSTEEG, et al, 1996).

Estas pesquisas evidenciam uma comparação sistemática da história de vida, distribuição

geográfica e métodos de testes de toxicidade com Ceriodaphnia sp. e Daphnia magna.

Na Tabela 5 verifica-se que a presença do sedimento reduziu

significativamente a biodisponibilidade do sulfato de cobre na água de cultivo para D. magna,

e D. similis. A maior diferença de CE50-48 h ocoreu com a D. magna, demostrando maior

imobilidade do sulfato de cobre no sedimento que foi 7,7 vezes a concentração na água de

cultivo. A segunda maior imobilidade do sulfato de cobre pelo sedimento foi verificado com a

D. similis, que foi de 6,7 vezes a concentração na água de cultivo. Por outro lado, verifica-se

que não houve diferença significativa entre os valores de CE50-48 h calculados para D. laevis

na ausência e presença de sedimento. Este resultado pode ser devido a maior tolerância desta

espécie nativa ao sulfato de cobre, entre as três espécies estudadas.

Considerando-se estes resultados, verifica-se que a presença de sedimento

imobiliza as moléculas do sulfato de cobre da água de cultivo das daphnias imediatamente

após o contato inicial. Acredita-se que este processo de imobilização deve ser crescente ao

longo do tempo, dentro de certos limites, dependendo de diversos fatores relacionados ao

próprio sedimento e à molécula tóxica.

As diferenças entre as valores de CE50-48 h na ausência e presença de

sedimento podem estar relacionadas ao efeito de absorção, floculação e oxidação do sulfato

de cobre na presença de sedimento. JONSON e MAIA (1999) citam que, na maioria dos

estudos, o sedimento influencia a intoxicação aguda ou bio-concentração de agentes químicos,

de modo que a redução do efeito é causada pelo fenômeno de adsorção ao material

particulado, que, por sua vez, diminui a bio-disponibilidade para os organismos-teste.

MARTINS (1998) verificou que o aumento no teor de matéria orgânica na

água diminuiu a ação tóxica do permanganato de potássio e do sulfato de cobre para peixes, e

pode inativar a formalina. Verifica-se também que a baixa alcalinidade também aumenta a

intoxicação de peixes com o sulfato de cobre e a salinidade diminui a ação da formalina e do

sulfato de cobre.

Na Tabela 6 observa-se que os resultados obtidos neste experimento estão

de acordo com os dados obtidos por BERTOLETTI et al. (1992), que calcularam valores da

CE50–24 h similares de sulfato de cobre para D. similis cultivada em água mole. Os resultados

obtidos com D. magna corroboram os de ELNABARAWY et al. (1986) que calcularam valores

similares da CE50-48 h para D. magna criadas em meio M4, bem como os de SECO-

GORDILLO et al. (1998), MOUNT e NORBERG (1984), KHANGAROT e RAY (1989). Os

resultados obtidos com D. similis estão de acordo com os de BERTOLETTI et al. (1992).

Tabela 6. Valores médios de CE50–48 h de sulfato de cobre calculados para as três espécies de

daphnias neste trabalho e por outros autores.

Pesquisador ou norma Resultados em (mg/L) Neste trabalho Àgua do cultivo, dureza 45 mg em CaCO3

D. m. = 0,045; D. s. = 0,043; D. l. = 0,10

SECO et al. (1998) Meio M4, dureza 250 ± 15 mg/L em CaCO3

D. m. = 0,21 MOUNT e NORBERG (1984) Meio M4, dureza 250 ± 15 mg/L em CaCO3

D. m. = 0,054; D. p = 0,053.

ELNABARAWY et al. (1986) Meio M4, dureza 250 ± 15 mg/L em CaCO3

D. m. = 0,041; D. p = 0,031.

KHANGAROT e RAY (1989) Meio M4, dureza 250 ± 15 mg/L em CaCO3

D. m. = 0,54. BERTOLETTI et al. (1992) Água mole, dureza 40 – 48 mg em CaCO3

D. s. = 0,022; 0, 019; 0,020; 0,024; 0,034; 0,023 D. m = Daphnia magna; D. s = Daphnia similis; D. l = Daphnia laevis; D. p = Daphnia pulex.

As diferenças dos resultados obtidos podem estar relacionadas com o meio

usado para o cultivo e a exposição das daphnias ao sulfato de cobre, ou com o método da

norma utilizado para realizar os testes de toxicidade.

Na revisão bibliográfica não foram encontrados resultados de CL(I)50-48 h

para D. laevis para serem comparados com os dados obtidos.

4.3. Testes de toxicidade aguda do trichlorfon para três espécies de daphnias em

ausência e presença do sedimento

Na Tabela 7 encontram os resultados da análise de variância dos valores de

CL(I)50 - 48h calculados nos testes com trichlorfon. Nestes resultados são claros os efeitos

altamente significativos do fatores estudados e da interação entre ambos. As análise com

desdobramentos dos graus de liberdade dos níveis dos fatores e da interação estão

apresentados na Tabela 8

Tabela 7. Análise de variância dos valores de CE50-48 h do trichlorfon para as três

espécies de daphnias na ausência e presença de sedimento.

Causas de variação G.L. S. Q. Q. M. F

Espécie (E) Sedimento (S) Interação ExS

2 1 2

11.110,58 616.834,40 11.264,49

5.555,29 616.834,40 5.632,24

12,33 ** 1.370,00 ** 12,51 **

**significativo ao nível de 1% de probabilidade

C.V. = 13,2 (%)

G.L= Grau de liberdade; S.Q.= Soma dos quadrados; Q.M.= Quadrado médio.

Na Tabela 8 observa-se que na ausência do sedimento as três espécies de

daphnias não apresentam diferença de sensibilidade ao trichlorfon . Esta sensibilidade similar

entre as três espécies de daphnias possivelmente seja explicada pelo fato de pertenceram ao

mesmo gênero, pois geralmente as daphnias não apresentam diferença da sensibilidade entre

espécies. Todavia, podem apresentar diferenças quanto a família e outros microcrustáceos.

Todavia, VESSTEEG et al., (1996) verificaram que muitos membros da família Daphnidae

apresentam sensibilidades semelhantes à toxicidade aguda e crônica de compostos químicos

tóxicos.

CANTON e ADEMA (1978) reportam que D. magna, D. cucullata e D.

pulex apresentam similar sensibilidade. HICKEY (1989), comparando a toxicidade de aguda e

crônicas varias substâncias puras e águas poluídas para a sensibilidade de cinco espécies de

cladóceros (D. magna D. carinata, S. vetulus, C. dubia, e C. cf. pulchella) verificam que, no

geral, os valores das diferenças são pequenos.

Tabela 8. Desdobramento dos graus de liberdade dos fatores testados no teste de toxicidade

aguda de trichlorfon para as três espécies de daphnias na ausência e presença do

sedimento

Espécies CE50 – 48h (ηg/L)

Agrotóxico

Sedimento D. magna CE50-48h

D. similis CE50-48h

D. laevis CE50-48h

Médias

Trichlorfon

Ausente

Presente

0,70 a B

299,70 b A

0,53 a B

381,62 a A

0,92 a B

282,73 b A

0,72 B

321,35 A

Médias seguidas seguidas por Letras minúsculas diferentes, na linha, indica diferenças significativas entre espécies. Médias seguidas por letras maiúsculas diferente na coluna, indica diferenças entre presença e ausência de sedimento DMS (5%) Espécies = 27,1 mg/L; DMS Sedimento = 18,2 mg/L.

Na Tabela 8 observa-se que na presença do sedimento a Daphnia magna e a

Daphnia laevis não apresentam diferença de sensibilidade ao trichlorfon, sendo que ambas

apresentam sensibilidade significativamente superior à Daphnia similis.

Em média, houve a necessidade de concentrações 446,3 vezes maiores na

água de cultivo para causar o mesmo efeito nas três espécies de daphnias (CE50-48 h).

Nestes resultados verifica-se o efeito da alta adsorção do trichlorfon no sedimento, que é um

solo de textura argilosa (Tabela 1), imediatamente após o seu contato com a água de cultivo

contendo agrotóxico. Isto porque os organismos–teste foram expostos imediatamente a

deposição da água de cultivo com o trichlorfon nos recipientes de vidro com o sedimento no

fundo.

Este fato merece consideração pois se os organismos–teste forem expostos

em diferentes períodos após o contato do agrotóxico com o sedimento, pode–se ter adsorção

crescente com o passar do tempo e, conseqüentemente, menor biodisponibilidade na água de

cultivo e maiores valores de CL(I)50-48 h poderão ser calculados.

JONSON e MAIA (1999) citam que, na maioria dos estudos, o sedimento

influencia a toxicidade aguda ou a bio-concentração de agentes químicos, de modo que a

redução do efeito tóxico é causada pelo fenômeno de adsorção ao material particulado, que,

por sua vez, diminui a bio-disponibilidade para o organismo – teste, concordando com os

resultados deste trabalho.

Com relação à precisão dos testes com as três espécies de daphnias,

verifica-se nas Tabelas 2, 4 e 7 que, independentemente dos agentes tóxicos testados, os

coeficientes de variação obtidos concordam com os dados obtidos por BERTOLETTI et al.

(1992) para o sulfato de cobre (C.V.= 21,7%) e o determinado pela Norma ISO (1982) que

aceita valores até 39%.

Segundo a definição do “Standard Methods” (APHA, 1989), a precisão

refere-se à medida do grau de concordância entre análises em réplica de uma amostra,

enquanto que a exatidão diz respeito à proximidade do valor médio em relação a um valor

verdadeiro.

A exatidão dos resultados de testes de toxicidade não pode ser determinada,

pois existem, normalmente, variações biológicas entre indivíduos de mesma espécie. Este

aspecto dificulta a identificação de erros sistemáticos inerentes ao procedimento analítico

como a sensibilidade individual dos organismos, não possibilitando obter concentrações

efetivas após vários ensaios. Conseqüentemente, não existe um valor (ou concentração) exato

(ou de referência) de determinado agente químico que cause efeito tóxico específico

(BERTOLETTI et al., 1992). Os resultados de testes de toxicidade com organismos aquáticos

permitem estimar apenas a precisão do método utilizado (BERTOLETTI et al., 1992).

Na Tabela 9 observa-se que os dados obtidos da CE50-48 h para as três

espécies de daphnias são muito inferiores ao dado citados por TOMLIN (1995), e

EXOTOXNET (1996) e calculado por FERREIRA (1998). As diferenças dos resultados

obtidos podem ser atribuída à modificação na metodologia utilizada para a obtenção da

CE50–48 h no teste de toxicidade com trichlorfon.

A diferença entre os dados obtidos neste ensaio com os dados obtidos por

outros pesquisadores pode ser devido ao fato de que o trichlorfon é altamente volátil e os

frascos de vidro utilizados como parcelas experimentais foram mantidos tampados durante

todo o tempo de duração do teste impidindo a volatilização de moléculas do inseticida para

fora dos recipientes. A pressão de vapor do trichlorfon e 0.21 mPa (EXTOXNET, 1996) que

caracteriza o inseticida como de alta volatilidade.

Com esta modificação, todas as moléculas do inseticida ficaram em

condições de entrar em contato com os organiamos-testes e, conseqüentemente, causar

intoxicação. Desta forma, acredita-se ter quantificado o potencial máximo de toxicidade

aguda do trichlorfon para as daphnias, pois com o fechamento dos frascos de vidro impide-se

a volatilidade de moléculas do inseticida. Assim esta modificação metodológica, fechamento

do frascos de vidro, é a explicação para que os valores de CE50-48h calculados neste trabalho

foram tão inferiores aos citados por TOMLIN (1995) e EXOTOXNET (1996) e calculados

por FERREIRA (1998), Tabela 9 Estes dados foram obtidos em recipientes abertos, com

provável volatilização de parte das moléculas adicionadas, durante o período de exposição.

verifica-se também na Tabela 9 há diferença entre os valores de CE50-48h citados ou

calculados nas referencias bibliográficas citadas.

Tabela 9 Valores médios de CE50–48 h de trichlorfon calculados para as três espécies de

daphnias neste trabalho e por outros autores.

Pesquisador ou norma Resultados Neste trabalho Água natural, 45 de dureza em CaCO3

D.m = 0,70; D.s. = 0,53; D. l. = 0,92 em (ηg/L).

TOMLIN (1995) Meio M4, dureza 250 ± 15 mg/L em CaCO3 D. m = 960,0 em (mg/L).

EXOTOXNET (1996) Meio M4, dureza 250 ± 15 mg/L em CaCO3 D.m = 10,000 (mg/L)

FERREIRA (1998)

Água natural, 40 – 48 mg/L em CaCO3

D. m = 586,0 (mg/L). D. m = Daphnia magna; D. s = Daphnia similis; D. l = Daphnia laevis

4.4. Risco de intoxicação da contaminação ambiental das aplicações de sulfato de cobre

para as daphnias

Na Tabela 10 estão apresentados os valores das concentrações ambientais

estimadas (CAEs) e a classificação dos riscos de intoxicação de D. magna, D. similis e D.

laevis devido à contaminação ambiental resultante do uso do sulfato de cobre na piscicultura,

em ausência e presença de sedimento.

Tabela 10. Valores das CAEs e classificação do risco de intoxicação da contaminação

ambiental devido ao uso do sulfato de cobre nas doses recomendadas em

piscicultura na ausência e na presença do sedimento para Daphnia magna,

Daphnia similis e Daphnia laevis.

Espécie sedimento CAE (mg/L)

CE50-48h (mg/L)

Classificação do risco de Intoxicação

ausente 0,33 0,045 Alto Daphnia

magna presente 0,33 0,347 Alto


similis presente 0,33 0,282 Alto


laevis presente 0,33 0,140 Alto

Na Tabela 10 observa-se que os riscos de intoxicação devido a

contaminação ambiental causada pelo uso do sulfato de cobre, aplicado na menor dose

recomendada em piscicultura, na ausência e presença do sedimento, clasificam-se como altos

riscos para D. magna, D. similis e D. laevis Estes resultados estão de acordo com os de

BOYD e MASSAUT (1999), que reportam o uso do algicida sulfato de cobre, nas

concentrações, recomendadas para os diversos organismos alvos de controle de 0,33 a 2

mg/L, como de alto risco para as três espécies de daphnias. Como pode ser observado na

Tabela 10, se o risco para a menor concentração 0,33 mg/L foi classificado como alto, que

deve ser mais alta ainda para a maior concentração de 2 mg/L.

A CAE do sulfato de cobre utilizada foi de 0,33 mg/L, de acordo com as

recomendações de POST (1987), MARTINS (1998), KUBITZA e KUBITZA (1999) e

PAVANELLI et al., (1999).

O sulfato de cobre é recomendado para o controle de protozoários,

tremátodos, monogênia, fungos e bactérias externas e é também um potencial algicida,

herbicida eliminando o fitoplâncton e as plantas aquáticas respectivamente, cujas doses

recomendadas são calculadas pela relação alcalinidade total/100 e expressa em mg/L

(KUBITZA e KUBITZA., 1999).

Não obstante ao alto risco de intoxicação ambiental devido ao uso do

sulfato de cobre na piscicultura, MARTINS (1998) cita que aos 10 dias após da aplicação na

água a flora e fauna voltam ao normal e que, após 30 dias de exposição, os resíduos de cobre

na carne dos peixes expostos estão próximos ao normal.

O sulfato de cobre é um dos produtos mais utilizados atualmente para

tratamento de parasitoses (GRIFIN, 1994), porém (MARTINS, 1998) cita estudos devem ser

feitos para analisar sua ação sobre o ambiente e o tempo residual no peixe. O sulfato de cobre

pode ser usado para o controle de protozoários em peixes na dose de 0,33 a 2 mg/L por tempo

indefinido (REICHENBACH-KLINKE, 1982; POST, 1987; KINKLELIN et al., 1991;

NOGA , 1996). Tais concentrações, entretanto, são muito altas e proporcionarão altos riscos

de intoxicação ambiental, conforme os resultados encontrados no presente trabalho.

O sulfato de cobre pode ser usado para o tratamento de saprolegnia em

peixes na diluição de 15 mg/L ou 25 mg/L dependendo do estado da brânquia, durante uma

hora (PAVANELLI et al., 1999). Pelos resultados obtidos, estas concentrações tambem

proporcionarão altos riscos. Por tanto, este tratamento deve ser realizado em tanques de banho

de forma a não atingir o ambiente aquático.

4.5. Risco de intoxicação da contaminação das aplicações de trichlorfon para as daphnia

Na Tabela 11 estão apresentados os valores das concentrações ambientais

estimadas (CAEs) e a classificação dos riscos de intoxicação da D. magna, D. similis e

D. laevis devido à contaminação ambiental resultante do uso do trichlorfon em ausência

e presença de sedimento.

Tabela 11. Valores de CAEs e classificação do risco de intoxicação ambiental devido uso do

trichlorfon na menor doses recomendadas em piscicultura na ausência e na

presença do sedimento para Daphnia magna, Daphnia similis e Daphnia laevis

Espécie Sedimento CAE (mg/L)

CE50-48h (ηηηηg/L)

Classificação do risco de Intoxicação

ausente 0,13 0,70 Alto Daphnia magna

presente 0,13 299,70 Alto

ausente 0,13 0,53 Alto Daphnia similis


ausente 0,13 0,92 Alto Daphnia laevis


Na Tabela 11 observa-se que o risco de intoxicação devido à contaminação

ambiental com trichlorfon na dose de 0,13 mg/L recomendada para o tratamento de doenças

de peixes em ausência e presença de sedimento é de alto risco para D. magna, D. similis e D.

laevis.

O valor da concentração ambiental estimada (CAE) para o trichlorfon de

0,13 mg/L, é o valor mais baixo de concentração na qual é recomendado para o controle de

Lernea sp., Argulus sp. e Ergasilus sp.; todos parasitos de peixes REICHENBACH-KLINKE

(1982), POST (1987), KINKLELIN et al., (1991), NOGA (1996), MARTINS (1998),

KUBITZA e KUBITZA (1999) e PAVANELLI et al., (1999). As aplicações de trichlorfon,

de acordo com recomendações da menor dose usada na piscicultura, foram classificados

como de alto risco de intoxicação para as três espécies de daphnias, pois todas as CE50– 48

horas em ausência ou presença de sedimento são bem menores que CAE considerada.

O trichlorfon foi classificado como de alta periculosidade ambiental quanto

à toxicidade aguda as espécies de peixes tambaqui e tambacu, segundo o critério de

classificação de periculosidade citado por GUIMARÃES (1996), enquadrando-se na classe II

(CE50–96 h entre 0,1 – 10 ppm). Esta classificação tambem foi realizada por FERREIRA

(1998), que classificou a recomendações do trichlorfon como de alta periculosidade ambiental

para peixes da espécie guaru (Poecilia reticulata). O trichlorfon também foi classificado

como de alta perigosidade ambiental por MIYAZAKI (1998), que avaliou a toxicidade aguda

do trichlorfon para o pacu (Calossoma macropomus) e para o tambaqui (Calossoma

macropomus X Piaractus mesopotamicus).

O triclorfon (Diterex®) pode ser usado para o controle de monogenas e

crustáceos nas doses de 0,13 a 0,15 mg/L por tempo indefinido (REICHENBACH-KLINKE,

1982; POST, 1987; KINKLELIN, et al., 1991; NOGA , 1996).

Os riscos da utilização do trichlorfon nas piscigranjas não se restringem

apenas a morte dos peixes, mas também há a possibilidade de se encontrar resíduos nos peixes

de consumo humano (MIYASAKI, 1998).

O trichlorfon é um inseticida organofosforado bastante usado no controle de

crustáceos parasitas (Lernea sp., Argulus sp. e Ergasilus sp.), tremátodos monogênos e

sanguessugas, bem como na erradicação de ninfas e insetos aquáticos. A quantidade do

produto comercial Diterex®, a ser aplicada corresponde à concentrações entre 0,13 a 0,25 mg

i.a./L em banhos indefinidos, de 1 a 2,5 mg i.a. /L em banhos prolongados, e 10g i.a./L em

banhos de 1 a 3minutos (KUBITZA e KUBITZA, 1999). As águas onde o trichlorfon for

utilizado em dilações igual ou superior ã CAE considerado de 0,13 mg/L devem ser

descartadas de forma a não atingirem os ambientes aquáticos, pois classificam-se como de

alto risco de intoxicação ambiental.

O trichlorfon pode ser usado para o tratamento de girodactilídeos,

dactilogirídeos na dose de 0,5 mg/L de água, durante três dias, para controle de copépodos

ergasilidae em banhos de imersão rápida, de 5 a 10 minutos, na concentração de 2,5 g/L de

água quatro vezes por semana, na temperatura não superior de 32ºC. Para controle de Lernea

sp., banhos de imersão rápida, cinco a 10 minutos a concentrações de 25 g/L quatro vezes por

semana, ou banhos prolongados de 0,5 mg/L de água, durante três dias. Para tratamento de

Argulus foliaceus a recomendação e de 20 ml/L de água em banhos de imersão de apenas 2

minutos (PAVANELLI et al., 1999)

O artigo 21 da Resolução CONAMA n°. 020, de 18 de julho de 1986,

estabelece que os efluentes de qualquer fonte poluidora somente poderão ser lançados,

diretamente e indiretamente nos corpos de água com os valores máximos admissíveis de

sulfato de cobre de 1,0 mg/L e organofosforados de 1,0 µg/L.

As doses recomendadas de sulfato de cobre e de trichlorfon para os

tratamentos de doenças de peixes estão acima dos limites aceitáveis pelo Instituto Brasileiro

de Meio Ambiente (IBAMA), na Resolução CONAMA n° 20, de 18 de Julho de 1986, para

serem lançadas nas águas no ambiente. Por tanto, estas concentrações recomendadas devem

ser realizadas em águas contidas e não devem ser descartadas de modo a atingir a rede

hidrográfica local.

5. CONCLUSÕES

Considerando-se as condições em que os testes foram realizados e os

resultados obtidos, pode-se concluir que:

1) o trichlorfon é mais tóxico que o sulfato de cobre para as três espécies de

daphnias (D. magna D. similis e D. laevias) na presença ou ausência de sedimento;

2) o sedimento diminui a biodisponibilidade do trichlorfon na água para as

três espécies de daphnias;

3) as três espécies de daphnias apresentaram sensibilidades específicas para

o dicromato de potássio e para sulfato de cobre e trichlorfon;

4) a Daphnia laevis é menos sensível ao sulfato de cobre na ausência de

sedimento em relação à Daphnia magna e a Daphnia similis, que não diferiram sensibilidade

entre si;

5) a Daphnia similis é mais sensível ao trichlorfon na presença de

sedimento em relação à Daphnia magna e Daphnia laevis, que são menos sensíveis e não

diferem entre si na presença de sedimento;

6) como não existe diferença de sensibilidade entre as três espécies de

daphnias na ausência de sedimento, a Daphnia laevis, espécie nativa do Brasil, pode ser usada

como organismo teste em testes de toxicidade aguda e crônica de compostos tóxicos, exceto

para o sulfato de cobre; e

7) o sulfato de cobre e o trichlorfon, nas doses recomendadas em

piscicultura apresentam alto risco de intoxicação ambiental para as daphnias devido à

contaminação ambiental na presença ou ausência de sedimento.

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7. ABSTRACT

The aim of this study was to determine the acute toxicity, LE50-48h, of

copper sulfate and of trichlorfon, to compare sensitivities and to evaluate the risk of

environmental poisoning for three species of daphnias (Daphnia similis, Daphnia magna and

Daphnia laevis), in the presence and absence of sediment. The tests for acute toxicity were

performed under laboratory conditions, in a climatized room according to standardized

methods with some adaptations. The LE50-48h values of copper sulfate calculated for D.

magna were 0.345 mg/L with sediment and 0.045 mg/L without sediment; for D. similis,

0.282 mg/L with sediment and 0.042 mg/L without sediment; and for D. laevis 0.140 mg/L

with sediment and 0.107 mg/L without sediment. The LE50-48h values of trichlorfon

calculated for D. magna were 299.70 ng/L with sediment and 0.70 without sediment; for D.

similis, 381.62 with sediment and 0.52 ng/L without sediment; and for D. laevis, 282.72

ng/L with sediment and 0.92 ng/L without sediment. Trichlorfon was more toxic than copper

sulfate for the three species of daphnias. Sediment diminished the toxicity of both trichlorfon

and copper sulfate for the three species of daphnias. In the absence of sediment, D. magna

and D. similis did not show any difference in sensitivity to the two agrochemicals. However,

D. laevis was significantly more sensitive than the other two species. In the presence of

sediment, there was a difference in sensitivity among the species of daphnias, with D. magna

being the most sensitive, followed by D. similis and D. laevis, showing less sensitivity to

copper sulfate. In the absence of sediment, the three species of daphnias did not show any

difference in sensitivity to trichlorfon. In the presence of sediment, D. magna and D. laevis

showed no difference in sensitivity to trichlorfon. The use of copper sulfate and trichlorfon in

pisciculture was classified as being of high risk of environmental poisoning for species of

daphnias.

8. APÊNDICE

Apêndice 1. Dados de imobilidade de Daphnia magna com dicromato de potássio por

repetição nas avaliações de 24 e 48 horas (20/02/02).

A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,2 7,6 0,01 0 0 0 1 1 1 1 2 2 5 7,2 7,6 0,05 1 2 1 2 2 2 2 3 6 10 7,2 7,6 0,07 1 2 3 3 2 4 4 4 9 12 7,2 7,6 0,09 3 3 3 4 2 4 4 5 12 15 7,2 7,6 0,12 5 5 4 5 4 4 4 5 17 20 7,2 7,6

dados acumulados



A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,2 7,6 0,01 0 0 1 1 0 0 0 1 1 2 7,2 7,6 0,05 1 1 1 3 2 2 2 3 7 10 7,2 7,6 0,10 3 4 3 4 3 3 3 3 12 15 7,2 7,6 0,13 3 4 4 5 4 4 4 4 15 17 7,2 7,6 0,17 4 5 5 5 5 4 5 5 19 20 7,2 7,6

dados acumulados



A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 7,1 7,6 0,01 0 2 0 1 0 1 1 1 0 5 7,1 7,6 0,05 2 3 2 2 0 2 3 3 5 10 7,1 7,6 0,10 3 4 3 3 2 4 11 4 11 15 7,1 7,6 0,13 4 5 4 5 3 5 15 5 15 20 7,1 7,6 0,17 5 5 5 5 5 5 15 5 20 20 7,1 7,6

dados acumulados



A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,2 7,6 0,01 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,2 7,6 0,05 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 7,2 7,6 0,10 2 3 1 2 2 3 1 2 6 10 7,2 7,6 0,13 2 3 2 3 3 4 3 4 10 14 7,2 7,6 0,17 4 4 3 3 3 4 3 4 13 16 7,2 7,6

dados acumulados


repetição nas avaliações de 24h e 48 horas (18/03/02).

A

B

C

D

imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,2 7,6 0,10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,2 7,6 0,13 0 1 1 0 0 2 0 1 1 4 7,2 7,6 0,14 1 2 1 3 2 2 3 4 7 11 7,2 7,6 0,17 2 4 3 4 4 5 4 5 13 18 7,2 7,6 0,19 4 5 5 5 5 5 5 5 19 20 7,2 7,6

dados acumulados


repetição nas avaliações de 24h e 48 horas (25/03/02)

A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,1 7,6 0,06 1 2 1 1 0 1 0 2 2 6 7,1 7,6 0,09 2 3 3 4 2 3 1 2 8 12 7,1 7,6 0,13 3 3 3 4 3 4 2 3 11 14 7,1 7,6 0,17 4 5 5 5 4 5 5 5 18 20 7,1 7,6

0,20 5 5 5 5 5 5 5 5 20 20 7,1 7,6 dados acumulados.

Apêndice 7. Dados de imobilidade de Daphnia similis com dicromato de potássio por

repetição nas avaliações de 24 e 48 horas (20/02/02)

A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,1 7,6 0,01 0 0 1 2 0 1 0 1 1 4 7,1 7,6 0,05 0 1 1 2 1 1 0 1 2 5 7,1 7,6 0,07 2 3 2 3 1 2 2 3 7 11 7,1 7,6 0,09 2 3 2 3 2 3 3 4 9 13 7,1 7,6 0,12 5 5 5 4 5 5 4 5 18 20 7,1 7,6

dados acumulados



A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,1 7,6 0,01 0 0 1 1 1 1 0 0 2 10 7,1 7,6 0,05 2 2 1 2 3 3 2 3 7 35 7,1 7,6 0,09 3 3 3 4 3 3 3 5 11 55 7,1 7,6 0,12 3 4 3 4 4 4 4 5 14 70 7,1 7,6 0,15 5 5 5 5 5 5 5 5 20 100 7,1 7,6

dados acumulados



A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 7,1 7,6 0,01 0 1 1 2 0 0 0 2 1 6 7,1 7,6

0,05 1 2 0 3 1 3 1 3 3 11 7,1 7,6 0,09 3 4 2 4 3 3 3 4 11 16 7,1 7,6 0,12 4 5 4 5 3 4 3 5 14 19 7,1 7,6 0,15 5 5 4 5 4 5 5 5 18 20 7,1 7,6

dados acumulados



A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,1 7,6 0,01 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 7,1 7,6 0,05 1 1 0 0 1 1 1 1 3 3 7,1 7,6 0,09 1 2 1 1 1 1 1 1 4 15 7,1 7,6 0,12 2 3 1 2 1 2 2 3 6 10 7,1 7,6 0,15 3 4 2 3 3 3 3 3 11 13 7,1 7,6

dados acumulados



A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,1 7,6 0,09 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,1 7,6 0,12 0 1 0 0 1 2 0 1 1 3 7,1 7,6 0,15 1 2 2 3 2 3 1 1 6 9 7,1 7,6 0,18 3 4 4 5 4 5 3 4 14 18 7,1 7,6 0,23 5 5 5 5 5 5 5 5 20 20 7,1 7,6

dados acumulados



Tratamentos

A

B

C

D

Imobilidade final

OD mg/L

pH

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,0 7,6

0,05 0 0 1 1 1 2 1 1 3 4 7,0 7,6 0,09 1 2 2 2 2 3 3 3 8 10 7,0 7,6 0,12 3 4 3 4 3 3 3 4 12 15 7,0 7,6 0,17 3 4 3 4 4 5 3 5 13 18 7,0 7,6 0,20 5 5 5 5 5 5 5 5 20 20 7,0 7,6

dados acumulados

Apêndice 13. Dados de imobilidade de Daphnia laevis com dicromato de potássio por


A

B

C

D

imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,2 7,6 0,001 0 0 2 3 0 1 0 0 2 4 7,2 7,6 0,005 1 2 1 1 1 1 1 2 4 6 7,2 7,6 0,02 1 2 1 3 2 3 2 2 6 10 7,2 7,6 0,6 1 2 1 3 2 3 2 3 6 11 7,2 7,6 010 3 4 3 4 4 5 4 3 14 18 7,2 7,6

dados acumulados



A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,2 7,6 0,001 0 0 0 0 1 1 0 1 1 2 7,2 7,6 0,006 1 1 1 2 1 2 0 1 3 6 7,2 7,6 0,03 1 2 2 3 1 2 1 3 5 10 7,2 7,6 0,09 4 5 3 5 3 4 5 5 15 19 7,2 7,6 0,14 4 5 5 5 5 5 5 5 19 20 7,2 7,6

dados acumulados


repetição nas avaliações de 24e 48 horas (07/03/02).

A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,1 7,6 0,001 0 1 0 2 0 1 0 1 0 5 7,1 7,6 0,006 0 2 0 2 1 2 1 2 2 7 7,1 7,6 0,03 2 3 1 3 1 3 2 4 6 13 7,1 7,6 0,09 4 5 3 4 3 4 3 5 13 18 7,1 7,6 0,14 5 5 5 5 5 5 4 5 19 20 7,1 7,6

dados acumulados



A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,1 7,6 0,001 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,1 7,6 0,006 0 0 0 1 0 0 1 1 1 2 7,1 7,6 0,03 0 1 0 0 1 1 1 2 2 4 7,1 7,6 0,09 1 2 1 2 2 3 2 3 6 10 7,1 7,6 0,14 2 3 3 3 3 4 3 4 11 14 7,1 7,6

dados acumulados



A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,1 7,6 0,03 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,1 7,6 0,09 0 0 0 0 1 1 0 1 1 2 7,1 7,6 0,14 1 1 1 1 0 1 1 1 3 4 7,1 7,6 0,18 3 4 4 4 2 4 3 4 17 16 7,1 7,6 0,21 5 5 5 5 4 5 5 5 19 20 7,1 7,6

dados acumulados



A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,1 7,6 0,03 0 2 0 1 1 2 0 2 1 7 7,1 7,6 0,07 1 2 2 3 1 3 1 2 5 10 7,1 7,6 0,10 3 3 2 2 2 4 2 3 9 12 7,1 7,6 0,14 3 4 3 5 4 5 3 5 15 19 7,1 7,6 0,18 5 5 4 5 5 5 5 5 19 20 7,1 7,6

dados acumulados

Apêndice 19. Dados de imobilidade de Daphnia magna com sulfato de cobre por repetição

nas avaliações de 24 e 48 horas (25/02/02).

A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,2 7,6 0,01 0 1 0 1 1 2 0 2 1 6 7,2 7,6 0,03 0 3 0 2 1 2 0 3 1 10 7,2 7,6 0,23 1 4 1 4 0 3 1 3 6 14 7,2 7,6 0,33 3 5 3 4 2 3 3 4 11 16 7,2 7,6 0,48 5 5 5 5 5 5 5 5 20 20 7,2 7,6

dados acumulados

Apêndice 20. Dados de imobilidade de Daphnia magna com sulfato de cobre em presencia

de sedimento, por repetição nas avaliações de 24 e 48 horas (04/03/02).

A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 7,3 7,6 0,1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 7,3 7,6 0,3 2 2 2 2 1 1 2 2 7 7 7,3 7,6 0,5 3 3 3 3 4 4 4 4 14 14 7,3 7,5 0,8 5 5 5 5 4 4 4 4 18 18 7,3 7,6

1,0 5 5 5 5 5 5 5 5 20 20 7,3 7,5 dados acumulados

Apêndice 21. Dados de imobilidade de Daphnia similis com sulfato de cobre por repetição


A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,2 7,6 0,01 0 0 1 1 1 2 0 1 2 4 7,2 7,6 0,07 2 3 2 3 3 3 2 3 9 12 7,2 7,6 0,14 3 4 3 3 3 3 3 4 12 14 7,2 7,6 0,21 4 4 4 4 4 4 4 5 16 17 7,2 7,6 0,28 5 5 5 5 5 5 5 5 20 20 7,2 7,6

dados acumulados

Apêndice 22. Dados de imobilidade de Daphnia similis com sulfato de cobre em presença de

sedimento, por repetição nas avaliações de 24 e 48 horas (04/03/02).

A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 24 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 7,2 7,6 0,1 1 1 1 1 0 0 1 1 3 3 7,2 7,5 0,3 2 2 2 2 2 2 3 3 9 9 7,2 7,5 0,5 5 5 3 3 4 4 4 4 16 16 7,2 7,5 0,7 5 5 5 5 5 5 4 4 19 19 7,2 7,5 0,9 5 5 5 5 5 5 5 5 20 20 7,2 7,5

dados acumulados

Apêndice 23. Dados de imobilidade de Daphnia laevis com sulfato de cobre por repetição


A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,2 7,6 0,01 0 1 1 2 1 1 0 1 2 5 7,2 7,6

0,06 0 1 1 2 1 2 1 1 3 6 7,2 7,6 0,12 1 3 1 2 1 2 1 2 4 9 7,2 7,6 0,18 2 4 2 4 4 2 5 4 13 16 7,2 7,6 0,24 5 5 4 4 4 4 5 5 18 18 7,2 7,6

dados acumulados

Apêndice 24. Dados de imobilidade de Daphnia laevis com sulfato de cobre em presença de

sedimento, por repetição nas avaliações de 24 e 48 horas (04/03/02).

A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,2 7,6 0,05 1 1 1 1 0 0 1 1 3 3 7,2 7,5 0,08 2 2 1 1 1 1 2 2 6 6 7,2 7,5 0,1 2 2 2 2 2 2 2 2 8 8 7,2 7,5 0,3 5 5 4 4 3 3 3 3 15 15 7,2 7,5 0,5 5 5 5 5 5 5 5 5 20 20 7,2 7,5

dados acumulados

Apêndice 25. Dados de imobilidade de Daphnia magna com trichlorfon (ηg/L) por repetição


A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,3 7,6 0, 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,3 7,5 0,5 0 1 0 2 0 1 0 0 0 4 7,3 7,6 0,9 2 3 3 4 4 5 3 3 12 15 7,3 7,6 3,0 4 5 4 5 5 5 5 5 18 20 7,3 7,6 7,0 5 5 5 5 5 5 5 5 20 20 7,3 7,6

dados acumulados

Apêndice 26. Dados de imobilidade de Daphnia magna com trichlorfon (ηg/L) em presença


Tratamentos

A

B

C

D

Imobilidade final

OD mg/L

pH

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,0 7,5

150,0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 2 7,0 7,5 250,0 1 1 1 1 1 1 1 1 4 4 7,0 7,6 300,0 1 1 2 2 3 3 4 4 10 10 7,0 7,6 400,0 3 3 4 5 5 5 4 4 16 17 7,0 7,6 500,0 5 5 5 5 5 5 5 5 20 20 7,0 7,6

dados acumulados

Apêndice 27. Dados de imobilidade de Daphnia similis com trichlorfon (ηg/L) por repetição


A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,2 7,6 0,2 0 1 0 0 1 2 0 0 1 3 7,2 7,6 0,6 2 3 1 2 2 3 3 3 8 11 7,2 7,6 1,0 3 4 3 4 4 5 3 4 13 17 7,2 7,6 4,0 4 4 4 5 4 5 5 5 17 19 7,2 7,6 9,0 5 5 4 5 5 5 5 5 19 20 7,2 7,6

dados acumulados

Apêndice 28. Dados de imobilidade de Daphnia similis com trichlorfon (ηg/L) em presença


A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,2 7,6 250,0 1 1 1 1 1 1 0 0 3 3 7,2 7,5 300,0 1 1 1 1 1 1 1 1 4 4 7,2 7,5 350,0 2 2 1 1 2 2 1 2 6 7 7,2 7,6 450,0 3 3 4 4 5 5 4 4 16 16 7,2 7,6 600,0 5 5 5 5 5 5 5 5 20 20 7,2 7,5

dados acumulados

Apêndice 29. Dados de mortalidade de Daphnia laevis com trichlorfon (ηg/L) por repetição


A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

DO mg/L

pH

Testemunha 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 7,0 7,6 0,2 0 1 0 0 1 2 1 1 2 4 7,0 7,6 0,6 1 1 1 2 1 2 1 2 4 7 7,0 7,6 1,0 2 3 2 2 3 4 2 3 9 12 7,0 7,6 5,0 3 4 3 5 4 5 3 4 13 18 7,0 7,6 8,0 5 5 5 5 5 5 5 5 20 20 7,0 7,6

dados acumulados

Apêndice 30. Dados de imobilidade de Daphnia laevis com trichlorfon (ηg/L) em presença


A

B

C

D

Imobilidade final

Tratamentos

24 48 24 48 24 48 24 48 24 48

OD mg/L

pH

Testemunha 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 7,2 7,6 100,0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 7,2 7,6 150,0 2 2 1 1 0 0 0 0 3 3 7,2 7,6 350,0 3 3 3 3 3 3 2 2 11 11 7,2 7,6 450,0 4 4 3 3 4 5 4 4 15 16 7,2 7,6 600,0 4 5 5 5 4 5 5 5 18 20 7,2 7,6

dados acumulados

toxicidade aguda do sulfato de cobre e do triclorfon para três spp de daphnias em presença e...

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